vitiligo: anÁlise de marcadores linfocitÁrios e do...

VITILIGO:

ANÁLISE DE MARCADORES LINFOCITÁRIOS E

DO ANTÍGENO CUTÂNEO LINFOCITÁRIO (CLA)

Daniela Pereira Antelo

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Dermatologia,

Faculdade de Medicina, da Universidade Federal

do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de Mestre em

Dermatologia.

Orientadores: Prof . Dr Absalom Lima Filgueira

Prof. Dr José Marcos Telles Cunha

Rio de Janeiro

Agosto de 2006

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ii

VITILIGO: ANÁLISE DE MARCADORES LINFOCITÁRIOS E

DO “CUTANEOUS LYMPHOCYTE ANTIGEN” (CLA )


Orientadores: Prof. Dr. Absalom Lima Filgueira

Prof. Dr José Marcos Telles Cunha

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em

Dermatologia, Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro -

UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em

Medicina (Dermatologia).

Aprovada por:

__________________________________________ Presidente, Profª. Drª.

_________________________________________ Prof. Dr.

_________________________________________ Prof. Dr.

Rio de Janeiro

Agosto de 2006

iii

Antelo, Daniela Pereira Vitiligo: análise de marcador linfocitário e do antígeno cutâneo linfocitário (CLA) / Daniela Pereira Antelo. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2006. xvi, 163 f. : il. ; 29,7 cm. Orientadores: Prof. Dr. Absalom Lima Filgueira, Prof. Dr. José Marcos Telles Cunha Dissertação (Mestrado) – UFRJ / Faculdade de Medicina / Dermatologia, 2006. Referências Bibliográficas: f. 135-159. 1. vitiligo 2. linfócitos 3. antígeno cutâneo linfocitário 4. Fotoquimioterapia. I. Filgueira, Absalom Lima; Cunha, José Marcos Telles. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina. III. Título.

iv

A Deus, que me deu a vida, me ilumina e tornou possível

todos os passos da minha jornada.

Aos meus amados pais, Sarah e Jorge, pelo amor

incondicional, pelo carinho e apoio incansável em todos

os momentos e por todas as oportunidades da minha

vida.

Aos meus queridos avô Abelardo e avó Mercedes, pelo

amor, pela perseverança e por serem exemplos de vida,

mesmo a distância.

Aos meus lindos irmãos Alexandre e Gabriela, meus

companheiros de todas as horas, meus melhores

amigos, pela compreensão e pelo carinho.

A minha querida Tia Martha, minha querida madrinha,

exemplo de dermatologista, mãe, tia e amiga.

Ao meu querido Leonardo, que sempre valorizou a

necessidade do saber e busca pelo conhecimento, pelo

apoio e pelo seu amor.

v

AGRADECIMENTOS

Ao orientador Prof. Dr. Absalom Lima de Filgueira, verdadeiro mestre e pequisador,

pela sua inesgotável e contagiante energia na busca do conhecimento na

Fotodermatologia. Por todos os ensinamentos e a orientação extremamente

enriquecedora durante a realização deste projeto.

Ao orientador Prof. Dr. José Marcos Telles da Cunha, professor que une, com

extrema facilidade e extraordinária competência, a clínica e o laboratório, a

dermatologia e a imunologia, a bancada e o paciente; pela atenção, orientação e

dedicação durante a realização desta tese.

Ao Curso de Pós-Graduação em Dermatologia da Universidade Federal do Rio de

Janeiro, que tornou este projeto possível.

A todos os meus professores da Graduação na UFRJ, professores da Residência

em Dermatologia na UERJ e professores da Pós-Graduação em Dermatologia:

muitos exemplos de mestres, pela dedicação, pelos ensinamentos e por terem me

mostrado, que com força e vontade, é possível atingir nossos sonhos e proporcionar

aos pacientes uma medicina mais eficiente e humana mantendo a busca do

conhecimento.

Á CAPES, agradeço pelo suporte.

vi

Às amigas Clarice de Oliveira Martins, Ana Paula Sá Earp e Flávia Pretti pela

amizade, carinho e pela ajuda durante a dissertação.

À Rosângela Aparecida Martins Noé, excelente profissional, membro do Comitê de

Investigação Científica do HUCFF/UFRJ, responsável pela análise estatística dos

dados desta tese, que acompanhou este trabalho desde a sua criação, pelo seu

apoio, orientação e dedicação, sempre com muito prazer.

À Maria de Fátima Mello, competente responsável pelo laboratório de pesquisas da

DIP, pela atenção, auxílio e gentileza em disponibilizar o laboratório e o citômetro de

fluxo para realização dos experimentos.

Ao doutorando Jorge Ricardo da Silva Machado e mestrandos Alba Palermo Neves,

Luciana O. Lima e Daniel Obadia, pelo encaminhamento dos pacientes, pelo reforço

bibliográfico, pelo apoio e conversas em busca de soluções quando os problemas

surgiam.

À Claudete R. Lima, chefe da coleta de sangue no Laboratório Central do HUCFF,

que se mostrou extremamente gentil e atenciosa para coleta do sangue dos

pacientes desta tese.

À Rosângela Souza, enfermeira do SME da PUVA do HUCFF, pelo apoio durante a

pesquisa, pelo seu espírito humano ao lidar com os pacientes, pela preocupação em

me ajudar no projeto.

vii

Às secretárias Gilsara e Daisy, sempre competentes e dispostas a ajudar.

Aos voluntários para o grupo controle, pela cooperação e pronta disponibilidade ao

contribuir para este estudo.

Aos pacientes do setor de Fotodermatologia, pela adesão ao projeto e pelas

palavras de ânimo quando as dificuldades apontavam. Sem eles, meu aprendizado

não seria possível.

viii

“Se não queres cansar os olhos e os

sentidos, segue o sol pela sombra”

Friedrick Nietzche, A Gaia Ciência,

1882

ix

RESUMO

VITILIGO:

ANÁLISE DE MARCADORES LINFOCITÁRIOS E

DO ANTÍGENO LINFOCITÁRIO CUTÂNEO (CLA)



Prof. Dr. José Marcos Telles Cunha

Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Medicina (Dermatologia), Faculdade de Medicina, da Universidade

Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção

do título de Mestre em Medicina (Dermatologia).

Vitiligo é uma doença adquirida, hereditária, freqüente, caracterizada por

máculas acrômicas devido à ausência de melanócitos. Diferente dos preceitos

anteriores, quando o anticorpo anti-melanócito exercia papel patogênico

fundamental, evidências recentes têm enfatizado o papel do linfócito T citotóxico

CD8+ na destruição dos melanócitos. Quinze porcento das células T periféricas

expressam um antígeno denominado CLA (antígeno cutâneo linfocitário), que orienta

a migração dos linfócitos T para a pele, onde irão constituir o infiltrado inflamatório

cutâneo. A primeira indicação terapêutica é a fototerapia nos portadores de vitiligo

x

generalizado, capaz de alterar os linfócitos T-CLA+ em outras dermatoses. Objetivo:

Descrever os aspectos quantitativos e qualitativos das células T e a expressão do

antígeno cutâneo linfócitário (CLA) nos linfócitos do sangue periférico de pacientes

com vitiligo não segmentar e em atividade, antes e após a fotoquimioterapia (PUVA).

Pacientes e métodos: 22 pacientes, com vitiligo não segmentar, em progressão,

foram submetidos a 30 sessões de PUVA. A imunofenotipagem foi realizada através

da citometria de fluxo, utilizando-se os anticorpos monoclonais anti-CD3-PerCP, anti-

CD8-PE e anti-CLA-FITC. Para o grupo controle, pareado por sexo e idade, foram

incluídos 15 indivíduos saudáveis. Resultados: Os pacientes apresentaram níveis

percentuais de linfócitos TCD8-CLA+ significativamente menor que o grupo controle

(p=0,008) e maior intensidade média de fluorescência (p=0,028). Entretanto estes

dados não se modificaram com a PUVA. Ao se comparar os doentes e os controles,

não houve diferença estatística na relação CD4/CD8 e linfócitos T CD4-CLA+, bem

como no grupo de doentes antes e após o tratamento. Conclusões: Os linfócitos T

CD8-CLA+ do sangue periférico estão reduzidos nos pacientes com vitiligo não

segmentar em atividade.

Palavras-chave: Vitiligo; linfócitos; antígeno cutâneo linfocitário; Fotoquimioterapia

Rio de Janeiro

Agosto de 2006

xi

ABSTRACT

VITILIGO: LYMPHOCYTE MARKERS AND CUTANEOUS-LYMPHOCYTE-

ASSOCIATED ANTIGEN (CLA) EVALUATION



Prof. Dr. José Marcos Telles Cunha

Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em

Medicina (Dermatologia), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de

Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de

Mestre em Medicina (Dermatologia)

Vitiligo is a frequent acquired, hereditary disease, characterized by achromic

macules due the absence of melanocytes. Different from earlier studies, which the

main pathogenic role was attributed to anti-melanocyte antibodies, recent papers

have emphasized cytotoxic lymphocyte T CD8+ function on melanocyte destruction.

Fifteen percent of peripheral T cells express cutaneous-lymphocyte associated

antigen (CLA), responsible for skin-homing T cell. Phototherapy is the first choice for

patients with generalized vitiligo and it can modulate CLA+ T cell in other skin

diseases. Objective: To describe quantitative and qualitative aspects of T cell and

skin homing CLA molecule expression in patients with non segmental vitiligo, before

and after photochemotherapy (PUVA). Patients and Methods: 22 patients with

xii

generalized and active spreading vitiligo were submitted to thirty PUVA-8MOP

sessions. Immunophenotyping of lymphocytes was performed using anti-CD3, anti-

CD8 and anti-CLA monoclonal antibodies and flow cytometry. Fifteen healthy

volunteers, sex-, and age-matched, were included as the control group. Results:

Reduced numbers of CD8-CLA T cells were found with statistical significance

(p=0,008) when compared to controls and higher mean intensity fluorescence

(p=0,028). These figures did not change after PUVA treatment. When treated

patients were compare to controls, no significant difference was noticed in CD4/CD8

ratio nor in CD4-CLA+ T cells, as it was the case when comparing patients before and

after treatment. Conclusions: CD8-CLA+ T cell levels are reduced in peripheral blood

of patients with non segmental vitiligo.

Key-words: Vitiligo; lymphocytes; cutaneous-lymphocyte associated antigen;

photochemotherapy

Rio de Janeiro

August, 2006

xiii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 2.1. O comportamento migratório da célula T CLA+ 35

FIGURA 2.2. A. O melanócito. B. Biossíntese da melanina 41

FIGURA 4.1. Anticorpos monoclonais utilizados no estudo 88

FIGURA 4.2. Citômetro de fluxo BD Biosciences FACScanTM 89

FIGURA 5.1História Familial (em %) 92

FIGURA 5.3.1 Padrão de repigmentação perifolicular (ilhotas de repigmentação)

95

FIGURA 5.3.2 Localização da lesão e grau de repigmentação com a terapia PUVA.

95

FIGURA 5.3.3. Boa resposta à terapia PUVA na face e colo. 96

FIGURA 5.3.4. Efeitos colaterais da terapia PUVA 97

FIGURA 5.3.5. Exemplos de efeitos colaterais pela terapia PUVA. 98

FIGURA 5.4.1. Paciente com vitiligo no tronco e axilas, com 8 anos de doença, evoluiu com repigmentação completa das lesões.

99

FIGURA 5.4.2. Imunofenotipagem de linfócitos T. Gráficos da citometria de fluxo utilizando anticorpos monoclonais anti-CD8 PE e anti-CLA-FITC.

100

FIGURA 5.4.3. Paciente com vitiligo generalizado e que abandonou o protocolo.

101

FIGURA 5.4.4. Paciente com vitiligo generalizado, de 40 anos de idade e 34 anos de doença.

102

FIGURA 5.4.5. Imunofenotipagem de linfócitos T.

103

FIGURA 5.4.6. Paciente com vitiligo universal.

104

FIGURA 5.4.7. Paciente de 45 anos de idade, com 14 anos de evolução de vitiligo, com mãe e irmã portadoras da doença.

105

xiv

FIGURA 5.4.8. Imunofenotipagem dos linfócitos T. Gráficos da citometria de fluxo da paciente da figura 5.4.7.

106

FIGURA 5.4.9. Fotos ilustrativas de algumas pacientes mostrando boa resposta clínica no colo e face.

107

FIGURA 5.4.10. Dificuldade de repigmentação. 108

FIGURA 5.4.11 Análise obtida na citometria de fluxo.

109

FIGURA 5.5.1.3. Gráfico de barras demonstrando a relação CD4/CD8 dos pacientes e indivíduos controles.

110

FIGURA 5.5.2.1. Gráfico de barras demonstrando o percentual dos linfócitos T CD3-CLA+ periféricos dos pacientes e controles.

111

FIGURA 5.5.2.2. Gráfico de barras demonstrando a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD3-CLA+ dos pacientes e controles.

112

FIGURA 5.5.3.1. Gráfico de barras demonstrando o percentual de linfócitos T CD4-CLA+ periféricos dos pacientes e controles.

113


114

FIGURA 5.5.4.1. Gráfico de barras demonstrando o percentual de linfócitos T CD8-CLA+ periféricos dos pacientes e controles.

115


116

FIGURA 5.6.1.1. Gráfico de barras demonstrando a relação CD4/CD8 dos pacientes antes e após o tratamento.

117

FIGURA 5.6.1.2. Gráfico de barras demonstrando o percentual de linfócitos T CD3-CLA+ periféricos dos pacientes antes e após o tratamento.

118

FIGURA 5.6.1.3. Gráfico de barras demonstrando a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD3-CLA+ dos pacientes antes e após o tratamento.

119

FIGURA 5.6.3.1. Gráfico de barras demonstrando o percentual circulante de linfócitos TCD4-CLA+ dos pacientes antes e após o tratamento.

120

xvi

LISTA DE TABELAS

TABELA 2.1. Critérios de doença auto-imune

TABELA 2.2. Perfis descritos dos linfócitos T periféricos dos pacientes com vitiligo

27 54

TABELA 2.3. Radiação ótica e comprimento de onda

63

TABELA 2.4. Absorção percentual da RUV na pele de acordo com o comprimento de onda TABELA 2.5. Unidades básicas no estudo da RUV TABELA 5.1 . Caracterização da Amostra TABELA 5.2. Caracterização do grupo controle, por sexo e idade

63 64 91 93

TABELA 5.3. Características da evolução dos pacientes submetidos à terapia PUVA

94

TABELA 5.5.1.3 . RELAÇÃO CD4/CD8 dos pacientes e controles

110

TABELA 5.5.2.1. Percentual dos linfócitos T CD3-CLA+ dos pacientes e controles TABELA 5.5.2.2. Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD3-CLA+ dos pacientes e controles TABELA 5.5.3.1 Percentual dos linfócitos T CD4-CLA+ dos pacientes e controles TABELA 5.5.3.2. Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD4-CLA+ periféricos dos pacientes e controles

111 112 113 114

TABELA 5.5.4.1. Percentual dos linfócitos T CD8-CLA+

dos pacientes e controles

115

xvii

TABELA 5.5.4.2. Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD8-CLA+ periféricos dos pacientes e controles TABELA 5.6.1.1. RELAÇÃO CD4/CD8 dos pacientes antes e após a terapia PUVA TABELA 5.6.1.2. Percentual dos linfócitos T CD3-CLA+ dos pacientes pré e pós tratamento TABELA 5.6.1.3. Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD3-CLA+ periféricos dos pacientes antes e após o tratamento

116 117 118 119

TABELA 5.6.3.1 Percentual circulante de linfócitos TCD4-CLA+ dos pacientes antes e após o tratamento TABELA 5.6.3.2. Intensidade Média de Fluorescência (MFI) da população de linfócitos TCD4-CLA+ dos pacientes antes e após o tratamento

120 121

TABELA 5.6.4.1. Percentual circulante de linfócitos TCD8-CLA+ dos doentes, antes e após o tratamento.

122

TABELA 5.6.4.2. Intensidade Média de Fluorescência (MFI) da população de linfócitos TCD8-CLA+ dos pacientes antes e após o tratamento

123

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

a.C. antes de Cristo

CAA célula apresentadora de antígeno

CAC Citotoxicidade associada ao complemento

CD grupo de diferenciação (clusters of differentiation)

CD1a grupo de diferenciação da célula de Langerhans

CD3 linfócitos T (CD3+)

CD4 linfócitos T CD4 +

CD8 linfócitos T CD8 +

CD45RA+ linfócito T virgem (naive)

CD45RO+ linfócitos T de memória

CF citometria de fluxo

CLA antígeno cutâneo linfocitário

CLTA-4 antígeno associado ao linfócito T citotóxico

d.C. depois de Cristo

DNA ácido desoxirrubonucleico

ECA enzima conversora de angiotensina

EGFR receptor de fator de crescimento epidérmico

E-selectina selectina endotelial

EUA Estados Unidos da América

4-F-GlcNac 4-fluorada-D-glicosamina-N-acetilglicosaminaparacetilada

GM-CSF Fator estimulador de colônia de granulócitos e monócitos

GVHD doença do enxerto-verus-hospedeiro

HAART terapia antiretroviral de alta eficácia

(Highly active antiretroviral therapy)

HIV vírus da imunodeficiência humana

(Human immunodeficiency vírus)

HLA antígeno leucocitário humano

ICAM-1 molécula de adesão intercelular 1

IF imunofluorescência

2

IL interleucina

MCHR1 melanin-concentrating hormone receptor 1

MHC complexo principal de histocompatibilidade

NK célula citotóxica natural (natural killer cell)

PSGL-1 glicoproteína ligante de P-selectina

PUVA fotoquimioterapia com psoraleno e radiação UVA

RUV radiação ultravioleta

RUV-A radiação ultravioleta A

RUV-B radiação ultravioleta B

TRP-1 proteína relacionada a tirosinase (tirosinase related-protein)

S100 proteína S 100

SALT tecido linfóide associado a pele(skin-associated lymphoid tissue)

Th linfócito T auxiliar (helper)

TNF-alfa Fator de necrose tumoral alfa

Tr célula T regulatória

Ts célula T supressor

TUNEL Terminal deoxynucleotide transferase-mediated dUTP-biotin

nick-end labelling

VCAM-1 molécula de adesão celular vascular

VLA-4 antígeno de expressão muito tardia(very late-activation antigen)

;

3

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 6

2. REVISÃO DA LITERATURA 8

2.1 - Vitiligo: Definição 8 2.2 - O melanócito 8 2.3 – Histórico 9 2.4 - A importância social e psicológica da melanina e o estigma da doença 9 2.5 – Incidência 12 2.6 - Manifestações clínicas 13

2.6.1 - Doenças associadas 15 2.6.2 - Hereditariedade e Fatores Genéticos 18 2.6.3 - Classificação clínica 20

2.7 – Histopatologia 22 2.8- Patogênese 25

2.8.1- Teoria Imunológica/Auto-imune 25 2.8.1.1 - Um breve passeio no Sistema Imune Cutâneo 28 2. 8.1.2 - Imunidade Inata e Adquirida 29 2.8.1.3 - O antígeno cutâneo linfócitário (CLA) 32 2.8.1.5- O CLA nas doenças cutâneas 36 2.8.1.6 - Imunidade Humoral e vitiligo 38 2.8.1.7 - Imunidade Celular e a relevância do CLA no vitiligo 44 2.8.2 - Teoria Neural 56 2.8.3 -Teoria da auto-destruição ou autotoxicidade 56 2.8.4 -Apoptose dos melanócitos 58 2.8.5 -Descolamento melanocítico 59 2.8.6– Melanocitorragia 59 2.8.7 -Defeito intrínseco do Melanócito 59 2.8.8 - Alteração local das citocinas produzidas 60 2.8.9 -Teoria convergente 60 2.8.10 -Teoria viral 61

2.9 - Um breve passeio na fotobiologia e a Radiação Ultravioleta 62 2.9.1 – A radiação ultravioleta 64

2.9.2 - A fotoquimioterapia (PUVA) e fotoimunomodulação 66 2.9.3.-Outros tratamentos fototerápicos para vitiligo 73 2.9.3.1 –RUV-B de Banda Larga (290-320nm) 73 2.9.3..2 -RUV-B de banda estreita(311-312nm) 73 2.9.3.3 – Microfototerapia 74 2.9.3.4 - 308nm-EXCIMER LASER 74

2.10 - Outras terapêuticas para o vitiligo 74 2.10.1 –Corticosteróides 75 2.10.2 –Inibidores da Calcineurina 75 2.10.3 -Calcipotriol 76 2.10.4 –Pseudocatalase 76

4

2.10.5-Kellina e RUV-A 77 2.10.6 –Aspirina 77 2.10.7 –Vitaminas 77 2.10.8 -Gingko-biloba 78 2.10.9 -Extrato de placenta 78 2.10.10 –Levamisole 78 2.10.11 -Extrato de polypodium leucotomos 79 2.10.12 –Despigmentação 79 2.10.13 -Tratamento cirúrgico do vitiligo 79

2.11 – Tratamentos em estudo 79 2.11.1 - Piperina 80 2.11.2 – Fenitoína 80

3. OBJETIVOS 81

3. 1 – Geral 81 3. 2 – Específicos 81

4. PACIENTES E MÉTODOS 82

4.1 - Desenho geral do estudo 82 4.2 – Pacientes e controles 83

4.2.1- Critérios de inclusão dos pacientes 83 4.2.2- Critérios de exclusão dos pacientes 83 4.2.3 – Critérios de inclusão dos controles 84 4.2.4- Critérios de exclusão dos controles 84

4.3 – Avaliação inicial dos pacientes 84 4.4 – Acompanhamento dos pacientes 85 4.5 - Métodos 85

4.5.1- Fotoquimioterapia (PUVA) 85 4.5.1 - A Citometria de Fluxo 86 4.5.2.1- Coleta de sangue 86 4.5.2.2 - Marcadores utilizados 87 4.5.2.3 - Protocolo para marcação de linfócitos de sangue periférico 87

4.6 - Cálculo amostral 89 4.7 - Análise Estatística 90 4.8 - Critério de determinação de significância 90

5. RESULTADOS 91

5.1 - Caracterização dos Pacientes 91 5.2 - Caracterização dos Controles 93 5.3- Acompanhamento clínico e resposta dos pacientes à terapia PUVA 94 5.4 – Ilustração de casos 99 5.5 – Comparação aos doentes de vitiligo e os indivíduos saudáveis (momento inicial do estudo) 110

5.5.1 Análise dos marcadores CD4 e CD8 dos linfócitos T periféricos 110 5.5.2 Comparação dos linfócitos T CLA+ (CD3-CLA+) 111

5

5.5.3 Comparação dos linfócitos T CD4-CLA+ 113 5.5.4 Comparação dos linfócitos T CD8-CLA+ 115

5.6 - Comparação entre os doentes de vitiligo antes e após a terapia PUVA 117 5.6.1 Análise dos marcadores CD4 e CD8 dos linfócitos periféricos 117

5.6.2 Comparação dos linfócitos T CLA+ (CD3-CLA+) 118 5.6.3 Comparação dos linfócitos T CD4-CLA+ 120 5.6.4 Comparação dos linfócitos T CD8-CLA+ 122

6. DISCUSSÃO 124

7. CONCLUSÕES 133

8. SUGESTÕES 134

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 135

10. ANEXOS 160

6

1 INTRODUÇÃO

A pele é o mais visível órgão do corpo. Ela exerce um papel importante na

aparência e nas relações sociais. A aparência é valorizada na medida em que o

indivíduo é percebido pelos outros membros da sociedade. Doenças cutâneas

crônicas podem alterar este aspecto e levar a conflitos psíquicos e sociais para seus

portadores. (ONGENAE, 2006)

O vitiligo é a hipomelanose adquirida mais freqüente, causada pela

destruição dos melanócitos (TAIEB, 2003; BELLET, 2005). Dentro da dermatologia,

sem dúvida, é uma das dermatoses com efeito psicológico mais devastador

(GRIMES,2004).

O fator que leva à destruição dos melanócitos permanece desconhecido. É

uma doença multifatorial, onde estão envolvidos fatores genéticos, hereditários,

imunológicos e ambientais.

A morte dos melanócitos, evidenciada nos pacientes com vitiligo, induz uma

resposta imune humoral a partir da liberação dos antígenos intracelulares e há

muitos dados inconclusivos sobre este tipo de resposta. Entretanto, evidências mais

recentes têm feito referência ao papel da célula T citotóxica na eliminação dos

melanócitos da camada basal da epiderme. A questão sobre a forma como a

resposta citotóxica é iniciada permanece sem respostas. (LE POOLE, 2004;

GUNDUZ, 2004)

Os trabalhos que correlacionam o papel da célula T citotóxica no vitiligo

apontam para resultados divergentes.

7

Persiste indefinido se as alterações imunológicas são a causa ou a

conseqüência da doença. Se elas representam um epifenômeno interessante, porém

irrelevante, ou são, de fato, responsáveis pela injúria ao melanócito in vivo.

Admitindo-se que as alterações imunológicas podem ser a principal causa da lesão

ao melanócito, como elas ocorrem? (BYSTRYN,1997)

De qualquer forma, a descoberta e descrição dos fenômenos imunológicos

são importantes para se entender o surgimento do vitiligo. Muitas terapêuticas

existem para esta doença, com resultados variáveis, diversas com embasamento

científico; outras nem tanto.

A fotoquimioterapia (PUVA) é uma terapêutica bem estabelecida para o

vitiligo, entretanto não são conhecidas todas as etapas da imunomodulação que a

mesma provoca nestes pacientes. Desta forma, a necessidade de trabalhos

originais, como este, é evidente.

8

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Vitiligo: Definição

Vitiligo é uma doença adquirida, geralmente hereditária, freqüente,

caracterizada por máculas hipocrômicas ou acrômicas devido à ausência de

melanócitos (ORTONNE et al., 2003). Vitiligo é uma entidade clínica que muitos

autores acreditam ser uma doença sistêmica com manifestações extracutâneas

envolvendo o sistema endócrino e o sistema nervoso, embora com um dano

altamente seletivo, quase totalmente restrito ao melanócito (BYSTRYN,1997). Quase

um quarto dos pacientes apresentam destruição das células pigmentadas oculares,

denotando uma atividade autoimune generalizada. (BYSTRYN,1997)

2.2 - O melanócito

O melanócito, que é o alvo de destruição no vitiligo, corresponde de 3 a 5%

da população da epiderme. Sua função é produzir a melanina, que irá proteger a

pele da radiação ultravioleta (RUV). Entretanto, recentemente foi reconhecido seu

papel como agente no sistema imune, pois expressam moléculas de adesão (ICAM-

1 e VCAM-1), antígenos do complexo de histocompatibilidade classe I e II (MHC I e

MCH II), produzem diversas citocinas (IL-1,IL-6, IL-8 e TGF-beta); realizam

fagocitose, processam antígenos e os apresentam às células T (ORTONNE et al.,

1997; VAN DEN WIJNGAARD et al., 2001).

As diferenças de pigmentação entre as diferentes raças se devem ao número

distinto de melanossomos e ao conteúdo de melanina dentro deles, mas não há

9

variações da densidade de melanócitos. (ORTONNE et al., 2003; VAN DEN

WIJNGAARD et al., 2001).

2.3 - Histórico

O uso do termo vitiligo foi documentado no primeiro século depois de Cristo

(d.C.) quando o médico romano Celsius escreveu De Medicina em 30 d.C. A

literatura indiana de 1500 a 1000 a.C. fez referência à doença que cursava com

manchas brancas na pele (NAIR, 1978). No livro sagrado indiano Atharva Veda, de

1400 a.c, há descrição da doença “Kilas” que cursava com leucodermia e que era

curada com certas sementes escuras. Acredita-se que a planta mencionada no livro

seja uma espécie contendo psoralenos (ORTONNE et al., 2003).

A origem da palavra vitiligo apresenta controvérsias entre dermatologistas e

lexicógrafos. Acredita-se que a palavra vitiligo derive do latim vitium, um defeito ou

mancha, seguido do suffixo igo. (KOVACS, 1998; LEIDER et al.,1968 apud NAIR,

1978).

Em escritos indianos de 200 a.C., há relatos de que membros da sociedade

que sofriam de manchas brancas progressivas não eram respeitados (NAIR, 1978).

2.4 - A importância social e psicológica da melanin a e o estigma da doença

Sabe-se que há uma correlação entre fatores psicológicos e doenças

dermatológicas. O estresse pode precipitar ou exacerbar doenças da pele através de

mecanismos psicossomáticos. (ONGENAE et al., 2006).

Neste contexto, o efeito psíquico do vitiligo, que na maioria dos casos leva a

lesões nas áreas expostas como face e mãos, não deve ser subestimado. Esta

doença tem implicações psicossociais facilmente observadas através de tensão

10

psíquica, exclusão social, nervosismo, estresse emocional e depressão, detectados

em muitos pacientes (MOSHER et al., 2003).

O estigma associado ao vitiligo vem de longa data, quando a doença era

confundida com hanseníase e permanece até hoje. Hipócrates, em 460-355 a.C.,

não fazia distinção entre ambas (NAIR, 1978).

No sistema hindu de casamentos arranjados, em época remota, era

impossível que uma moça com vitiligo conseguisse se casar. (ORTONNE, 2003).

Hoje podemos observar que muitos portadores de vitiligo sofrem de efeitos

que estão para além da doença. Há dificuldades de acesso a empregos, limitações

no convívio social, pensamentos suicidas, diminuição da auto-estima e transtornos

familiares. Mais de 50% dos pacientes com vitiligo dizem sofrer algum tipo de

discriminação social (PORTER et al., 1987). Existe um impacto negativo nas

relações sexuais dos pacientes (PORTER, 1990). Os impactos social e psicológico

trazido por esta enfermidade levam os doentes a se reunirem em associações,

procurarem acompanhamento psicoterápico e recorrerem a uma ampla gama de

tratamentos e recursos, muitas vezes de origem duvidosa (AUSTIN, 2004).

Quem acredita que o vitiligo seja apenas uma doença de cunho cosmético,

certamente negligencia a totalidade do indivíduo como um ser doente. Na nossa

experiência, o grau de impacto psicológico e a exclusão social vivenciados por

muitos pacientes transcende o aspecto meramente estético atribuído a doença.

Estima-se que um terço dos pacientes com doença dermatológica possua

aspectos emocionais associados. Uma doença crônica e inestética como o vitiligo

traz o maior grau de sofrimento psíquico aos pacientes quando comparada com

outras dermatoses, como psoríase, talvez porque o tratamento exija disciplina e

dedicação, além do fato do paciente lidar muitas vezes com terapêuticas de

11

resultados frustrantes. Sendo que o sofrimento independe do tempo de evolução da

doença (ONGENAE et al., 2005; TABORDA et al., 2005).

Há que se considerar os distintos contextos sócio-culturais dos diferentes

países, mas a comorbidade psiquiátrica ocorre nos pacientes com vitiligo em

qualquer parte do globo.

Na Índia a prevalência de doença psiquiátrica entre os portadores de vitiligo é

16-34%, enquanto na Itália é 25% e na Inglaterra é 35% (PARSAD et al., 2003 apud

ONGENAE et al, 2006; PICARDI et al., 2000). As doenças descritas foram variadas,

em um grupo indiano: depressão (10%), distimia (7-9%), episódio depressivo (18-

22%), distúrbios do sono (20%), pensamentos suicidas (10%), tentativas suicidas

(3,3%) e ansiedade (3,3%). (PARSAD et al, 2003 apud ONGENAE et al, 2006)

12

2.5 - Incidência

Vitiligo tem prevalência variável na literatura de 0,14 a 8,8%, sendo descrita

geralmente de 1-2% da população mundial (ORTONNE et al., 2003). Steiner et al ,

em 2004, o descreveram como tendo prevalência de 0,5-2%. Castanet et al , em

1997, referem como 1-4%. Acomete homens e mulheres de forma equivalente,

embora alguns estudos descrevam prevalência maior em pacientes do sexo

feminino, talvez pela mulher buscar com maior freqüência o auxílio médico (KURTEV

et al., 2004; MORELLI 2000; ZHANG et al., 2004). Ele acomete todas as etnias,

todas as raças e ambos os sexos, embora seja mais desfigurante nos pacientes com

fototipos mais elevados (GRIMES, 2004). A prevalência da doença varia entre os

diferentes grupos étnicos, sendo estimada em 2% no Japão, 1% nos EUA e 0,14%

na Rússia (STEINER et al., 2004).

Em uma investigação epidemiológica na ilha de Borholm, na Dinamarca, com

população estável e homogênea de 47.033 pessoas, foi encontrada a prevalência de

vitiligo de 0,38% (diferente do referido na literatura de 1-2%), sendo semelhante nos

sexos feminino (0,40%) e masculino (0,36%) (HOWITZ et al., 1977).

13

2.6 - Manifestações clínicas

O vitiligo ocorre principalmente nas áreas fotoexpostas e em fototipos mais

elevados, podendo surgir em qualquer idade (há casos descritos desde o

nascimento até 81 anos de idade). Entretanto, a maioria dos casos surge entre os 10

e 30 anos de idade (adolescentes e adultos jovens), com maior prevalência entre os

10 e 14 anos (ORTONNE et al., 2003; ZHANG et al., 2004). Cinqüenta por cento

dos pacientes apresentam as lesões antes dos 20 anos de idade e 25% antes dos

10 anos (KURTEV et al., 2004; MORELLI, 2000). Foi observado que o vitiligo com

história familial positiva geralmente se inicia mais precocemente (LABERGE et al.,

2005).

A lesão típica de vitiligo consiste em máculas inicialmente hipocrômicas,

depois acrômicas, marfínicas, de limites bem definidos, não pruriginosas, de

dimensões variáveis. Em alguns casos as lesões exibem uma hipopigmentação

tricômica – com a tez de coloração intermediária (hipocrômica) entre a área

acrômica e pele sã, geralmente no tronco de pacientes com vitiligo em atividade.

(FITZPATRICK, 1964 apud HANN et al., 2000; KOVACS, 1998). As lesões,

caracteristicamente, apresentam fenômeno de Koebner, descrito inicialmente para

pacientes com psoríase (SWEET, 1978). Eventualmente as lesões podem

apresentar uma borda elevada, eritematosa correspondendo ao vitiligo inflamatório.

Entretanto, o eritema da mácula de vitiligo pode ser desencadeado pela exposição

solar e nesse caso não deve ser considerada como uma alteração inflamatória. O

eritema nas máculas em áreas expostas ocorre com freqüência no Brasil (COSTA,

1947). As lesões podem ser únicas ou bem numerosas e as máculas podem crescer

e coalescer (ORTONNE, et al., 2003). Pode ocorrer inicialmente de forma rápida e

progressiva ou evoluir de forma intermitente durante anos (MORELLI, 2000).

14

No Brasil, Costa descreveu dois casos raros de vitiligo palmo-plantar

(COSTA, 1947).

Anormalidades oculares também podem ocorrer: alterações na íris (irite) e na

retina (coriorretinite). Alterações hipopigmentares ocorrem, em até 40% dos

pacientes, no epitélio pigmentar da retina (que deriva da porção cefálica da crista

neural) e na coróide (cujos melanócitos derivam da porção espinhal da crista neural)

(KOVACS, 1998).

O vitiligo pode estar associado a outras alterações cutâneas como

leucotríqua, poliose, observada em 9-45% dos pacientes, embranquecimento

prematuro dos cabelos (37%), nevo-halo e alopecia areata (16% dos casos)

(ORTONNE et al.,2003).

O início do quadro geralmente é atribuído a eventos específicos ou momentos

de “crise” na vida dos pacientes (perda de emprego, morte na família, doença grave

etc). Em um trabalho cubano, foi constatado que 70% dos pacientes referem um

evento estressante antes do início da doença (LÓPEZ 1995 apud GONZÁLEZ,

2000). Foi sugerido que o estresse eleva os níveis de hormônios neuroendócrinos,

altera o nível de neuropeptídeos e neurotransmissores no sistema nervoso central

além de afetar o sistema imune. Os neuropeptídeos circulantes alterados interferem

com a atividade das células Natural Killer; sendo encontrados níveis elevados de

catecolaminas (norepinefrina circulante) nos pacientes com vitiligo. Estes fatores

poderiam levar ao início ou exacerbação do vitiligo (O´LEARY, 1990).

Traumas locais (acidentes ou cirurgias) também podem ser considerados

fatores precipitantes do vitiligo, já que o fenômeno de Koebner é característico dessa

doença.

15

Medicamentos como cloroquina e clofazimina também foram descritos como

possíveis desencadeares de vitiligo (KOVACS,1998).

2.6.1 - Doenças associadas

Doenças endócrinas são freqüentemente encontradas nos pacientes com

vitiligo. A principal associação é com doença tireoideana, hipotireoidismo,

hipertireoidismo, doença de Graves, bócio tóxico e tireoidite, que ocorre em 30-40%

dos pacientes (MASON et al., 2005), embora alguns autores questionem a validade

desta associação (ORTONNE et al., 2003). A prevalência da tireoidite auto-imune,

por exemplo, é de 30% entre os pacientes com vitiligo e de 1% na população em

geral (KEMP et al., 2001). Em uma coorte de pacientes com vitiligo, observou-se que

ele ocorre antes ou simultaneamente com a doença tireoideana auto-imune

(ZETTINIG et al., 2003). No Brasil, encontrou-se a ocorrência de doenças da

tireóide em 11,9% de 261 pacientes com vitiligo, valor inferior aos dados relatados

(CASTRO,2005). Anticorpos antimicrossomais e antitireoglobulina são geralmente

encontrados nos portadores de vitiligo. Em crianças observou-se 13% de doença

tireoideana e 50% positividade de anticorpos antitireoideanos (antimicrossomal e

antitireoglobulina) (KURTEV et al.,2004). Três casos de sarcoidose foram relatados

em associação com vitiligo, dois destes com tireoidite auto-imune associada

(TERUNUMA et al., 2000).

Outras moléstias associadas são diabetes mellitus, 1-7% dos pacientes com

vitiligo; doença de Addison, 2%; anemia perniciosa e síndrome da poliendocrinopatia

múltipla. Esta última ocorre particularmente nos pacientes com vitiligo extenso

(KOVACS,1998; ORTONNE et al., 2003). A associação com doenças auto-imunes

ocorre principalmente nos pacientes com vitiligo familial (LABERGE et al., 2005).

16

Sendo o vitiligo uma doença comum, não é de se surpreender que várias

doenças tenham sido associadas a ela. Há muitos relatos de caso. Entretanto, para

se estabelecer uma verdadeira associação são necessários estudos epidemiológicos

com uma amostra grande suficiente para validar a associação (NORDLUND et al.,

1997). Os relatos de casos serão importantes na medida em que permitirem uma

discussão dos mecanismos patogênicos das doenças envolvidas.

Na China, encontrou-se maior freqüência de artrite reumatóide, ictiose e

urticária crônica entre os pacientes com vitiligo quando comparados com a

população sadia (LIU et al.,2005).

A associação de psoríase e vitiligo é conhecida desde 1890 e a relação entre

as duas doenças não é bem conhecida (NEUMANN, 1936 apud SANDHU et al.,

2004). São descritas com prevalência semelhantes, de 1-2% (ORTONNE et al, 2003;

CASTRO, 2005). Embora alguns autores descrevam maior ocorrência de psoríase

entre os pacientes de vitiligo, em uma coorte de 4700 pacientes com psoríase

observaram-se apenas 38 casos de vitiligo. Neste estudo, o curso clínico do vitiligo

independia da evolução da psoríase, inclusive a distribuição topográfica das lesões

era distinta (SANDHU et al., 2004).

No Brasil, em um estudo retrospectivo com 740 pacientes submetidos à

fototerapia, foi encontrado 3,06% de prevalência da associação de vitiligo e

psoríase. (CASTRO,2005).

Em pacientes com infecção pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV),

está relatada o ocorrência de vitiligo após o início da infecção. Sabe-se que o vírus

HIV leva à imunodepressão além de desregulação do Sistema Imune que pode se

manifestar como reatividade autoimune. Já foram relatados casos de pacientes que

17

apresentaram repigmentação das lesões de vitiligo apenas após o início da terapia

antiretroviral HAART (ANTONY et al., 2003).

O vitiligo também pode ocorrer como manifestação auto-imune em pacientes

pós-transplante que apresentam doença do enxerto-verus-hospedeiro (GVHD). As

biópsias destes pacientes demonstram infiltrado inflamatório dérmico, que pode

corresponder ao vitiligo em evolução ou à lesões vitiligóides de GVHD bem

estabelecida (SILVA et al.,2006).

18

2.6.2 -Hereditariedade e Fatores Genéticos

Embora o vitiligo seja caracterizado como uma entidade clínica singular, sua

etiologia é complexa. Estão envolvidos fatores hereditários e uma gama de fatores

precipitadores potenciais. Embora o padrão de herança não tenha sido estabelecido,

o vitiligo é uma doença hereditária.

A agregação familiar é observada desde 1933 (MAJUNDER, 2000 apud

ZHANG et al., 2004; LIU et al.,2005). Mais de 30% dos pacientes relatam outros

casos de vitiligo na família (ORTONNE et al., 2003). Quanto maior o grau de

parentesco, maior a chance de desenvolver a doença. Parentes de 1º grau de

doentes com vitiligo tem um risco 3 a 13 vezes maior de desenvolver a doença; os

de 2º grau, 2 a 4 vezes maior e os de 3º grau, apresentam a mesma chance de

desenvolver todos os subtipos de vitiligo (exceto o vulgar) que a população geral. Os

parentes podem observar embranquecimento prematuro dos cabelos. Alguns

estudos demonstram certos marcadores de HLA em grupos específicos (HLA-A2,

HLA-Dw7, HLA-DR4, B13, Bw35, Cw7,DR6), mas são dados inconsistentes . Os

trabalhos que tentam determinar HLAs específicos geram resultados variáveis

devido ao pequeno número de pacientes em cada estudo (KOVACS,1998).

Embora tenha sido descrita anteriormente como doença de herança

autossômica recessiva com apenas 3 ou 4 loci controlando a doença, sabe-se hoje

que doença está associada com loci genéticos em distintos cromossomos (pelo

menos 7), evidenciando a natureza poligênica desta moléstia (DAS et al., 1995;

MAJUNDER et al., 1993; ZHANG et al., 2004).

Em modelos animais para estudos dos melanócitos e controle da

pigmentação, a quantidade de loci genéticos que afetavam a pigmentação

19

ultrapassava o número 100. Sendo que todos estes loci, ou virtualmente todos,

apresentam equivalente humano (BENNET, 2003).

É possível que o locus de maior suceptibilidade ao vitiligo esteja localizado no

cromossomo 1p (chamado AIS1). Este confere um fenótipo autoimune, levando a

doenças autoimunes como tireoidopatias e endocrinopatias, além do vitiligo. Outros

sete loci nos cromossomos 1,7,8,11,19 e 22 atuariam como “sinais” adicionais

(SPRITZ, 2003)

O polimorfismo do gene da enzima conversora de angiotensina (ECA),

estudado nas doenças auto-imunes, foi também avaliado no vitiligo. Viu-se que a

distribuição genotípica do gene da ECA era diferente nestes pacientes, quando

comparados ao controle. Desta forma inferiu-se sua relação com o surgimento do

vitiligo (JIN et al., 2004)

Recentemente, o vitiligo foi descrito como doença com modo de herança não

mendeliana, multifatorial, poligênica aditiva, isto é, deve-se considerar, além da

influência de fatores ambientais, os fatores genéticos para cada subtipo de vitiligo.

As variações genéticas são responsáveis por 50% das variações fenótipicas do

vitiligo, sendo o restante atribuído aos fatores ambientais (GRIMES, 2004; ZHANG et

al., 2004).

20

2.6.3 - Classificação clínica

O vitiligo é classificado em quatro subtipos: focal, segmentar, generalizado e

universal, de acordo com o grau de acometimento do tegumento cutâneo

(ORTONNE et al., 2003; KOVACS,1998).

• Focal: uma mácula isolada ou escassas lesões, limitadas em tamanho, em

distribuição que não corresponde a um dermátomo. Vinte por cento das crianças

com vitiligo apresentam esse subtipo.

• Segmentar: caracterizado por uma mácula unilateral com distribuição

correspondente a um dermátomo, assimétrico. É um subtipo especial, de curso

estável e que não está associado a doenças auto-imunes ou história familial de

vitiligo. A koebnernização não é característica. Corresponde a 5% dos casos de

vitiligo em adultos e mais de 20% dos casos em crianças (LIU et al.,2005). Em mais

de 50% dos casos há acometimento trigeminal e 50% dos casos estão associados

com poliose.

• Generalizado ou vulgar: é o subtipo mais comum. Caracteriza-se por várias

lesões acrômicas, de distribuição geralmente simétrica e que acomete as superfícies

extensoras dos membros (articulações interfalangeanas, articulações

metatarsianas/metacarpianas, cotovelos e joelhos) além dos punhos, maléolos, área

periumbilical, axilar e regiões periorificiais. O vitiligo acrofacial é aquele em que há

acometimento dos dedos distalmente e das áreas faciais periorificiais.

• Universal: ocorre quando o vitiligo é tão generalizado de forma que

encontramos apenas pequenas áreas de coloração normal da pele. Este subtipo

está associado à síndrome da poliendocrinopatia múltipla.

Numa grande coorte de 3742 indivíduos com vitiligo, 54% dos que tinham a

forma focal evoluiram para os outros subtipos clínicos (LIU et al.,2005).

21

Outras classificações são encontradas. Hann classifica a doença em

localizada, generalizada ou universal (HANN et al., 2000 apud ZHANG, 2004).

Zhang estabeleceu a classificação da doença em focal (que inclui a forma mucosa),

vulgar, universal, acrofacial e segmentar, encontrando as prevalências de 25,9%,

46,1%, 2,9%, 10,8% e 14,2% respectivamente para cada uma das formas (ZHANG

et al., 2004).

O envolvimento mucoso pode ocorrer, acometendo genitália, mamilos, lábios

e gengiva.

Foi também proposta uma classificação dividindo o vitiligo em apenas duas

formas: segmentar e generalizado, já que o vitiligo segmentar apresenta

características clínicas, evolutivas e de resposta aos tratamentos distintos da forma

generalizada (BELLET et al.,2005).

O diagnóstico diferencial de vitiligo inclui outros distúrbios da pigmentação:

pitíriase alba, hipopigmentação pós-inflamatória, piebaldismo, morféia, hanseníase,

esclerose tuberosa e líquen esclero-atrófico, além do vitiligo induzido quimicamente

(leucodermia vitiligo-símile) por catecóis, fenóis alquilados e aldeído cinâmico

usados em germicidas, inseticidas e resinas e o monobenzil éter de hidroquinona

usado na indústria da borracha (BELLET et al.,2005; STEINER et al, 2004).

22

2.7 - Histopatologia

O exame histopatológico das lesões de vitiligo não identifica a presença de

melanócitos. Essa ausência de melanócitos pode ser confirmada por anticorpos

monoclonais, anticorpos policlonais dirigidos contra as células melanocíticas e

exame ultraestrutural (LE POOLE,1993). Embora todas as descrições

anatomopatológicas de vitiligo tenham como foco a conhecida destruição dos

melanócitos e o desaparecimento do pigmento na epiderme, graus variados de

processo inflamatório foram descritos na pele perilesional ou mesmo lesional em

fase inicial (GOKHALE et al., 1983; HANN et al., 2000; HORN et al., 1997; MONTES

et al., 2003).

Além de infiltrado inflamatório mononuclear dérmico (perivascular e

perifolicular) em lesões acrômicas e hipocrômicas, espongiose focal também foi

observada na pele marginal em 48% dos pacientes com lesões ainda hipocrômicas,

em fase inicial de despigmentação (SHARQUIE et al.,2004)

Foram relatadas alterações inflamatórias inicialmente sugestivas de linfoma T

cutâneo (infiltrado inflamatório perivascular, perifolicular e intersticial de linfócitos

TCD4+, porém sem clonalidade evidenciada pelo estudo do rearranjo de receptor de

célula T) em pacientes com lesões hipocrômicas de diagnóstico incerto que

evoluíram para total ausência de melanócitos e lesões francamente acrômicas,

características de vitiligo (HORN et al.,1997). Estes achados indicam uma reação

mediada pelo sistema imune, através da qual os linfócitos teriam papel importante na

destruição dos melanócitos.

A análise histológica e imunoistoquímica (com os marcadores S100 e CD1a)

do vitiligo tricrômico demonstrou alterações inflamatórias epidérmicas e dérmicas

principalmente na área intermediária hipocrômica e na pele perilesional, comparadas

23

com pele lesada e pele sã. Os achados encontrados foram: degeneração vacuolar

da camada basal, infiltrado mononuclear e presença de melanófagos na derme e

redução de melanócitos na área hipopigmentada em relação à pele sã. Além disso,

alguns melanócitos estavam presentes até mesmo na própria lesão de vitiligo e

houve aumento das células de Langerhans na área hipopigmentada e perilesional

comparadas com pele sã e lesão de vitiligo. Desta forma, pode-se observar que a

área hipocrômica demonstra atividade intensa da doença e o aumento das células

de Langerhans pode ocorrer no vitiligo ativo. A área perilesional, embora com clínica

normal, apresenta também alterações inflamatórias (HANN et al.,2000).

A análise ultraestrutural, além de confirmar a ausência de melanócitos,

destruídos por vacuolização, demonstra aumento das células de Langerhans e

alterações vacuolares dos queratinócitos (MONTES et al.,2003).

Panuncio et al observaram, através de análise ultraestrutural de lesões

estáveis de vitiligo, alterações nos melanócitos, sinais de degeneração nos

queratinócitos e alterações nas células de Langerhans que indicaram atividade

macrofágica intensa. Além disso, foram vistos elementos compatíveis com linfócitos

na epiderme e derme e macrófagos na derme, sendo que em certas áreas havia

desaparecimento da camada basal. Esse estudo sugeriu que mesmo no vitiligo

estável, a acromia implicou em atividade citológica intensa, provavelmente devido à

citotoxicidade mediada por células pois os achados ultraestruturais lembram uma

reação liquenóide (PANUNCIO et al., 2003).

A análise dos dois tipos de melanina (eumelanina e feomelanina), através de

cromatografia líquida de alta performance, das lesões de vitiligo demonstrou que as

lesões acrômicas e repigmentadas apresentavam os dois tipos de melanina, mas a

proporção entre elas diferia. Assim, manchas acrômicas apresentaram uma maior

24

quantidade de feomelanina e lesões repigmentadas preferencialmente eumelanina.

De qualquer forma, melanina foi detectada mesmo em lesões com 5 anos de

evolução. Isto está de acordo com alguns trabalhos que demonstraram poder haver

melanócitos viáveis em lesões com longo tempo de evolução (PARSAD et al.,2003).

Atividade residual da tirosinase também podem ocorrer nas lesões, sendo que esta

enzima é exclusiva dos melanócitos (LE POOLE et al.,1997)

Todas estas alterações histológicas encontradas, além da conhecida

ausência de melanóticos, sugerem uma atividade inflamatória presente na qual os

linfócitos teriam como alvo os melanócitos e uma atividade subclínica em potencial,

visto que linfócitos foram encontrados na área perilesional. Embora a quantidade de

linfócitos seja pequena nas biópsias de vitiligo, poucas células são necessárias para

induzir citoxicidade celular dependente de anticorpos. (NORRIS et al., 1988).

25

2.8- Patogênese

A causa precisa da destruição dos melanócitos é desconhecida.

A patogênese do vitiligo é complexa e há o fato irrefutável da ausência de

melanócitos nas lesões de vitiligo. Assim mecanismos etiológicos são propostos

para explicar a destruição melanocítica.

A comparação do quadro do vitiligo segmentar e do generalizado sugerem

diferenças clínicas fundamentais e correlação com mecanismos patogenéticos

distintos. Pacientes com vitiligo segmentar geralmente são mais jovens, a doença

estabiliza-se no primeiro ano, não há fenômeno de Koebner, nem história familiar e

associação com doenças auto-imunes.

Tradicionalmente existem três hipóteses básicas para explicar o vitiligo:

hipótese neural, da auto-destruição e imunológica. Outros possíveis fatores

etiológicos, como deficiência de fatores de crescimento dos melanócitos, defeito

intrínseco na estrutura e função dos melanócitos ou fatores genéticos, estresse

oxidativo por alteração mitocondrial, um fenômeno descrito como melanocitorragia,

também foram propostos para explicar o processo de despigmentação (AL´ABADIE

et al., 1994; GAUTHIER et al., 2003; PICARDO, 2003;).

2.8.1- Teoria Imunológica/Auto-imune

Estudos recentes fornecem evidências a favor da hipótese auto-imune, de

forma que ela se tornou o objetivo desta dissertação. A associação com doenças

auto-imunes, a presença de alterações inflamatórias na pele e a detecção de auto-

anticorpos nos pacientes de vitiligo demonstram uma base imunológica para a

etiopatogenia dessa doença.

Diversos esquemas terapêuticos que envolvem imunomodulação e

imunossupressão são eficazes para o vitiligo e confirmam a autoimunidade envolvida

26

nessa doença. Incluem-se, neste grupo, a fotoquimioterapia (PUVA) e o uso de

corticóides tópicos que levam à repigmentação através da supressão da resposta

imunológica local responsável pelo dano ao melanócito.

Para que ocorra uma doença auto-imune é necessária uma ruptura da

homeostase normal do sistema imunológico, levando à destruição tecidual. Em

pessoas normais, o sistema imune mantém a habilidade de reconhecer 25 milhões

de antígenos diferentes (ARSTILA et al., 1999 apud LEE et al., 2004).

Existem dois mecanismos básicos que levam à tolerância ou irresponsividade

a autoantígenos. O primeiro é o da tolerância central ou deleção central: as células B

e T deletam, no timo e na medula óssea, as células auto-reativas. Mesmo com este

mecanismo, alguns destes precursores irão escapar à deleção, irão amadurecer e se

dirigirão para os tecidos periféricos, mas sem causar lesão. O outro mecanismo é o

da tolerância periférica, que envolve a regulação das células auto-reativas através

de muitas etapas regulatórias. Uma hipótese para explicar o vitiligo seria a quebra da

tolerância à auto-antígenos (LEE et al.,2004).

Hoje em dia, conhecem-se as “Tregs” como sendo uma subpopulação de

linfócitos T com propriedades imunoregulatórias. A depleção ou disfunção destas

células, que são CD4+ expressando, na sua maioria, CD25, pode levar ao

surgimento de doença auto-imune. Ao se comparar indivíduos sadios com pacientes

de vitiligo, viu-se que eles apresentavam níveis elevados do marcador de superfície

CD25, sugerindo o envolvimento destas células nos pacientes com vitiligo

(MAHMOUD, 2002).

O polimorfismo do CTLA-4 (antígeno associado ao linfócito T citotóxico)

também foi relatado, mas apenas em pacientes com vitiligo associado a outra

27

doença auto-imune. O CTLA-4 controla a apoptose da célula T e está envolvida

negativamente na ativação da célula T. (KEMP et al., 1999)

A auto-imunidade é definida como a responsividade do Sistema Imune

Adquirido (ou Adaptativo ou Adaptável) para auto-antígenos que ocorre quando os

mecanismos de auto-tolerância falham. Neste contexto, definiremos como doença

auto-imune aquela causada pela perda da auto-tolerância, de forma que o Sistema

Imune Adquirido responde aos auto-antígenos, levando à lesão celular e tecidual.

(ABBAS et al., 2003).

Existem critérios estabelecidos para classificar uma doença como auto-imune

(Tabela 2.1).

TABELA 2.1. Critérios de doença auto-imune Critérios de doença auto-imune

1. Ocorrência de auto-anticorpos

2. Especificidade de auto-anticorpos contra antígenos, que se correlacionam com

a atividade da doença

3. Habilidade dos auto-anticorpos em causar injúria e destruição celular in vitro

4. Modelos animais demonstrando in vivo o papel dos anticorpos como prova

definitiva do seu papel na gênese da doença Extraído de Jérome Castanet and Jean-Paul Ortonne IN: Skin Immune System (SIS) Second Edition, 1997 edited by Jan D.

Bos.

Desta forma, observamos no vitiligo: presença de autoanticorpos,

especificidade dos autoanticorpos, capacidade de destruição dos melanócitos pelos

autoanticorpos e utilização de modelos animais (CASTANET et al., 1997; KEMP et

al., 2001).

Diversas anormalidades na imunidade humoral e celular também foram

descritas nesses pacientes. Provavelmente, a concomitância das ações imunitárias

do tipo humoral e celular atuam de forma sinérgica na destruição dos melanócitos. A

presença de vitiligo em animais como as galinhas da linhagem Smith, gato siamês,

28

cachorros belgas, cavalos árabes e porcos possibilitou o uso de modelos

experimentais (BYSTRYN, 1997). Em modelos animais de vitiligo, usando galinhas

da linhagem Smith, observou-se que a bursectomia, que prejudica a formação de

anticorpos e o uso de ciclosporina A, que inibe seletivamente a resposta imune

mediada por células T levaram ao retardo na ocorrência e reduziram a gravidade da

despigmentação, sugerindo o papel dos dois tipos de resposta imune na patogênese

da doença (LAMONT et al., 1981 apud CASTANET et al.,1997). Nestes mesmos

modelos animais de vitiligo, observou-se anticorpos séricos contra os melanócitos

destas, mas não no soro de galinhas com pigmentação normal (AUSTIN et al., 1992

apud KEMP et al., 2001).

2.8.1.1 - Um breve passeio no Sistema Imune Cutâneo

A palavra imunologia é derivada do Latim immunis ou immunitas cujo

significado é “isento de carga”, sendo que a carga pode referir-se a uma taxa

monetária imposta ao cidadão, uma regra ou lei de restrição de direitos e liberdade,

ou uma enfermidade. Indivíduos que não sucumbem a uma doença quando

infectados são ditos imunes e o status de uma resistência específica a uma

determinada doença é chamado de imunidade.

Desde o início do século, muitos foram os prêmios Nobel de Medicina dados a

imunologistas ou pesquisadores deste assunto, denotando ser este um campo em

constante evolução que leva a avanços na patogenia das doenças imuno-mediadas,

contribuindo para a terapêutica destas moléstias.

A pele é o primeiro órgão de defesa aos insultos do ambiente, assim não é de

se surpreender que a pele apresente uma grande capacidade de gerar uma resposta

imune. Todos os seus componentes celulares e solúveis podem ser englobados em

um verdadeiro parênquima cutâneo, em constante dinamismo. Denomina-se SALT

29

(skin-associated lymphoid tissue) os componentes do sistema imune cutâneo

(SCHWARZ, 2003).

O conhecimento dos princípios da imunologia são importantes para o estudo

de muitas doenças cutâneas como por exemplo: psoríase, dermatite atópica e

vitiligo.(ROBERT et al.,1999).

Nesta dissertação, estudou-se um dos aspectos do papel da célula T no

vitiligo.

2. 8.1.2 - Imunidade Inata e Adquirida

Dois conceitos são importantes ao se estudar Imunologia: a resposta da

Imunidade Inata e a da Imunidade Adquirida (SCHWARZ, 2003).

A Imunidade Inata representa uma resposta rápida, inespecífica, primitiva,

porém eficaz. É composta por neutrófilos, eosinófilos, células Natural Killer,

mastócitos, citocinas, complemento e peptídeos microbianos. Não há memória para

este tipo de resposta (SCHWARZ, 2003).

Já a Imunidade Adquirida é caracterizada pela especificidade e pela memória

(a cada encontro com o mesmo antígeno, a resposta será mais eficaz). É composta

pelas células apresentadoras de antígeno e pelas células T.

No caso da pele, temos, na epiderme, as células de Langerhans e na derme,

as células dendríticas dérmicas, atuando como células apresentadoras de antígenos

(SCHWARZ, 2003). As células de Langerhans da epiderme, embora representem

menos de 1% da população celular ocupam mais de 25% da área da superfície da

epiderme (ABBAS et al.,2003).

As células T de memória são recrutadas em caso de inflamação cutânea

(esta, em resposta a um insulto). Estas células, que sofreram previamente expansão

30

clonal como resposta ao encontro com o antígeno, são importantes para a vigilância

imunológica da pele (ROBERT et al.,1999).

As células T não reconhecem macromoléculas, como fazem os anticorpos, e

sim fragmentos de macromoléculas ligados a peptídeos específicos expressos na

superfície da célula apresentadora de antígeno (ROBERT et al.,1999).

As células T efetoras podem ser CD4+ ou CD8+. As células T CD4+ irão

reconhecer o antígeno na superfície das células apresentadoras de antígeno (CAA)

quando ligado à molécula de histocompatibilidade tipo II ao passo que as células T

CD8+ irão reconhecer o antígeno quando ligado ao MHC classe I da CAA (ABBAS et

al.,2003).

As células T-helper CD4+ estão principalmente envolvidas na resposta contra

antígenos externos enquanto que as células T-citotóxicas CD8+ participam das

respostas antitumorais e antivirais.

As células T helper (Th) podem ser divididas em Th1 ou Th2, de acordo com

seu padrão de secreção de citocinas: as Th1 produzem interferon-gama, TNF-alfa e

IL-2 (gerando resposta imune mediada por células, como vista nas lesões

granulomatosas de hanseníase) e as Th2 produzem IL-4, -5, -6, -9, -10 e -13

(induzindo produção de anticorpos, como ocorre na dermatite atópica). Desta forma

as células Th1 e Th2 produzem diferentes respostas.

As células T CD8+ são citotóxicas para as células que possuem o antígeno. O

papel destas células tem sido reconhecido em diversas doenças como dermatite de

contato alérgica (SCHWARZ, 2003). Assim como as células Th1 e Th2 têm padrões

diferentes de secreção de citocinas, as células Tcitotóxicas (Tc)-1 e Tc-2 também

podem ser diferenciadas (MOSSMAN et al., 1997 apud SCHWARZ , 2003).

31

Recentemente foi descrita a célula T regulatória (Tr), com importante papel na

inibição da resposta imune. A maioria destas células expressa CD4 e CD25 e seu

papel anteriormente era atribuído às células Tsupressor (Ts). A alteração da sua

função pode estar relacionada ao surgimento das doenças auto-imunes (SCHWARZ,

2003).

33

IL-1 e TNF-alfa, têm sua expressão aumentada (ROBERT et al.,1999). Além da E-

selectina outros mediadores facilitam a localização cutânea das células T CLA+

como citocinas e receptores de quimiocinas. Além da interação CLA/E-selectina,

também são descritas as interações VLA-4/VCAM-1 e LFA-1/ICAM-1 entre os

linfócitos e o endotélio, respectivamente, para a migração transendotelial das células

T-CLA+ (SANTAMARÍA-BABÍ, 2004).

A população de linfócitos T circulantes que expressa o CLA (que corresponde

a 10-20%, média de 15%, do total de linfócitos no sangue) e que migrará para a pele

constituirá mais de 85%-90% do infiltrado linfocitário das doenças inflamatórias

cutâneas (HUNGER et al., 1999; SIGMUNDSDOTTIR et al., 2003).

As células T de memória (CD45RO+) que expressam o CLA são geradas nos

linfonodos que drenam a pele e são recrutadas para a pele durante o processo

inflamatório. Embora o papel inicial destas células T de memória seja vigilância

imunológica, elas estão envolvidas em muitas doenças como dermatite de contato

alérgica, alopecia areata, psoríase, dermatite atópica, vitiligo, farmacodermias,

líquen plano, doença do enxerto-contra-hospedeiro e linfoma cutâneo de células T

(ROBERT et al.,1999; SANTAMARÍA-BABÍ, 2004).

As células T naive (CD45RA+) são aquelas que nunca entraram em contato

com o antígeno e estão continuamente recirculando entre o sangue e os órgãos

linfóides, sendo que é a expressão da L-selectina por estas células que permite sua

entrada nos linfonodos. Quando esta célula T naive encontra o antígeno, específico

para seu receptor, expresso na célula apresentadora de antígeno no linfonodo que

drena a pele, ela se torna ativada e se torna uma célula T de memória (CD45RO+)

que expressa o CLA. Com a expressão do CLA, ela adquire o elemento-chave para

migrar para a pele, deixando os linfonodos pelos linfáticos eferentes e indo atingir a

34

pele, local onde inicialmente o antígeno foi apresentado à célula apresentadora de

antígeno. (ROBERT et al.,1999) .

A distribuição dos linfócitos T-CLA+ no organismo foi estudada. Evidenciou-se

que, em condições basais, 98% das células T residentes da pele expressam o CLA,

sendo células T de memória (CD45RO+). Menos que 5% das células T de sítio

extracutâneos são CLA+. As células T de memória podem ser funcionalmente

divididas em: células T de memória central CCR7+L-selectina+ e células T de

memória efetora. As células T de memória central (CCR7+L-selectina+) recirculam

entre o sangue e os linfonodos, e as células T de memória efetoras (CCR7-L-

selectina-), entre o sangue e a pele, sem passar pelos linfonodos. Na pele, apenas

20% das células T tem o perfil de célula T de memória central (CCR7+L-selectina+),

assim a grande maioria do infiltrado de células T residentes na pele é de célula T de

memória efetora. Foi analisada a polarização das células T CD4+ residentes na pele

e constatou-se que 95% destas são produtoras de citocinas do tipo Th1 e há apenas

uma pequena proporção de células produtoras de citocinas Th2. Neste estudo fez-se

uma estimativa da subpopulação de células T da pele e do sangue e constatou-se

que a pele apresenta duas vezes mais a quantidade de células T residentes do que

a presente na circulação sistêmica. Desta forma, diferentemente do que se

acreditava anteriormente, as células T-CLA+ estavam presentes na circulação e

somente atingiam a pele, através do endotélio, em caso de inflamação, há uma

grande quantidade de células T residindo na pele em condições basais (CLARK et

al., 2006).

O comportamento migratório destas células T-CLA+ é importante para a

compreensão de como elas exercem o papel de vigilantes imunológicos e na

35

patogenia das doenças cutâneas mediadas por célula T. Sendo esta migração, um

evento controlado (SANTAMARÍA-BABÍ, 2004)

Extraído de ROBERT, C.; KUPPER, T.S. Inflammatory skin diseases, T cells and immune surveillance. New Eng J Med, v.341:1817-1828,1999.

As células T-CLA+ podem ser CD4+ ou CD8+ e uma vez ativadas podem levar

à produção das citocinas conforme o perfil citado anteriormente (ROBERT et

al.,1999).

Para entender a dinâmica das células T-CLA+, estudou-se também, através

de citometria de fluxo usando anticorpos anti-HECA 452, as células de linfa de pele

normal de indivíduos sadios, e observou-se que grande parte das células da linfa

(TCD8+; TCD4+; CD56+ que marca a célula NK; CD1a, marcador da célula de

Langerhans) expressavam o CLA de forma intensa. Após radiação destes

FIGURA 2.1. O comportamento migratório da célula T CLA+

36

indivíduos, com fonte de Radiação ultravioleta B (RUV-B)/Radiação ultravioleta A

(RUV-A) e indução de dermatite de contato alérgica com dinitroclorobenzeno

(DNCB), a expressão do CLA não se alterou, embora tenha aumentado o fluxo da

linfa após o estímulo inflamatório. Desta forma confirmou-se o CLA como marcador

do SALT (HUNGER et al., 1999)

2.8.1.5- O CLA nas doenças cutâneas

A presença do CLA, um determinante contendo ácido siálico, pode ser

demonstrada através da reação com o anticorpo monoclonal anti-HECA 452, que

também reconhece um tetrassacarídeo sialyl-Lewisx (S-Lex) em neutrófilos e

monócitos (SANTAMARIA BABÍ,2004).

Estudos demonstraram que linfócitos T citotóxicos autoreativos melanócito-

específico que expressam o CLA, causam a destruição dos melanócitos vista no

vitiligo auto-imune (OGG et al., 1998; VAN DEN WIJNGAARD et al., 2000;). Eles se

encontram justapostos aos melanócitos em destruição na área perilesional

(GRIMES, 2004).

Em outros modelos de doença, como a psoríase, o tratamento com RUV-B

por três semanas levou à redução na expressão do CLA pelos linfócitos, o que

coincidiu com a melhora clínica dos pacientes. Inclusive, previamente a este estudo,

viu-se que a freqüência de células T que expressavam o CLA estava diretamente

relacionada à atividade e extensão da doença (SIGMUNDSDOTTIR et al., 2003).

Assim, os níveis de CLA ou o grau de ativação das células se correlaciona com a

atividade clínica da doença (SANTAMARÍA-BABÍ, 2004). Os novos tratamentos com

agentes biológicos como alefacept e efalizumab estão relacionados à função das

células T-CLA+. Alefacept depleta as células T de memória circulantes e efalizumab

inibe a migração cutânea via LFA-1, já que a interação LFA-1 do linfócito T CLA+ e a

37

molécula de ICAM-1 do endotélio permite a chegada da célula T à pele (GOTTLIEB

et al., 2002).

Estudou-se linfoma cutâneo de células T (micose fungóide) e sua forma

leucêmica, a Síndrome de Sézary, e viu-se que que há expansão clonal de células

TCD4-CLA+ , sendo que nos pacientes com Síndrome de Sézary encontrou-se

elevada relação CD4/CD8 (de 6 a 93) e alta expressão de CLA pelas células T-CD4+

(média de 46%), o que não foi observado nos pacientes de micose fungóide (média

de 23%, discretamente elevada expressão de CLA pelas células T-CD4+) e

voluntários sadios (média de 10%) (SOKOLOWSKA-WOJDYLO et al., 2005).

Expansão de células T-CD4-CLA+ (25% de células do sangue periférico), com

produção de citocinas tipo Th2 e redução de células CLA+ com padrão Th1 de

produção de citocinas foi demonstrada em pacientes com dermatite atópica (TERAKI

et al.,2000).

Na forma cicatricial do lupus eritematoso discóide (crônico), observou-se

através de estudo de imunoistoquímica da pele lesada, presença de células T CD8-

CLA+ de forma mais intensa do que em pacientes com lupus subagudo e controles

sadios. Assim, estas células citotóxicas poderiam desempenhar papel importante na

forma cicatricial desta doença crônica autoimune (WENZEL et al., 2005).

A inibição da síntese do CLA pode constituir um caminho para se obter

atividade anti-inflamatória in vivo. Viu-se que o análogo fluorado da 4-fluorada-D-

glicosamina-N-acetilglicosaminaparacetilada (4-F-GlcNac), um metabólito inibidor da

síntese do CLA, evita a fase efetora da dermatite de contato alérgica em

camundongos. Desta forma, a inibição do CLA pode constituir um alvo terapêutico

para as dermatoses mediadas por célula T (DIMITROFF et al.,2003). De forma

análoga, os controles das variáveis que controlam a glicosilação da PSGL-1 para

38

sua transformação em CLA poderiam representar outro sítio para tratamento destas

doenças (FUHLBRIGGE et al.,1999).

2.8.1.6 - Imunidade Humoral e vitiligo

A associação com doenças auto-imunes e presença de anticorpos

circulantes no soro de pacientes com vitiligo dão fundamento à participação da

imunidade humoral na patogênese da doença. Confirmam um dos critérios para

doença auto-imune (critério 1 da tabela 2.1.) ( GRIMES et al.,1983).

Na realidade, não se sabe o papel verdadeiro dos autoanticorpos no vitiligo:

se eles levariam à destruição dos melanócitos ou se seriam secundários à

destruição destas células (CASTANET et al., 1997).

Como citado previamente, o vitiligo está associado a diversas doenças auto-

imunes, inclusive endocrinopatias, como a doença tireoideana com presença de

autoanticorpos. A freqüência de autoanticorpos órgão-específicos é variável:

anticorpos anti-célula parietal, anti-adrenal, anti-músculo liso, anti-nuclear e anti-

tireoideanos. Geralmente estes podem ser encontrados sem que haja doença auto-

imune clinicamente manifesta naquele órgão (MANDRY et al.,1996; MORGAN et al.,

1986; ORTONNE et al., 2003). Acredita-se que, de todos os auto-anticorpos

encontrados em pacientes com vitiligo, apenas os anti-tireoglobulina, anti-peroxidase

e anti-microssomal estariam elevados de forma consistente (encontrados em 10-

17% dos pacientes com vitiligo); sendo os outros auto-anticorpos apenas

marcadores de possibilidade de desenvolvimento de doença auto-imune

(CASTANET et al., 1997). Sendo que, inclusive nos parentes de 1º e 2º grau de

indivíduos com vitiligo, há aumento estatístico considerável na freqüência dos

anticorpos antitireoglobulina e antimicrossomal (MANDRY,1996). O achado desses

39

anticorpos, especialmente na ausência de doença clínica, não explica, isoladamente,

a injúria específica ao melanócito.

Em virtude destes achados, deve-se solicitar anualmente a dosagem de TSH e

anticorpo anti-tireoglobulina (anti-TPO) nos adultos e crianças com vitiligo, embora

não exista um protocolo estabelecido para acompanhamento destes indivíduos

(GRIMES, 2006; KURTEV et al., 2004).

Autoanticorpos contra melanócitos também foram encontrados no soro de

pacientes com vitiligo, demonstrando assim a especificidade dos anticorpos nesta

doença (critério 2 da doença auto-imune - vide Tabela 2.1.). Diversas técnicas foram

utilizadas para detectá-los: imunoprecipitação, imunofluorescência indireta,

immunoblotting e ELISA. Usando técnicas de imunoprecipitação, antígenos

imunodominantes foram inicialmente caracterizados com peso molecular de 40-45,

75, 90 e 150 Kd, designados VIT40, VIT75 e VIT90 (BYSTRYN,1997). Alguns desses

antígenos (35 e VIT90) são exclusivos das células pigmentadas (SEGHAL et

al.,2005). Mas a identidade desses antígenos permanece indefinida. Não se sabe se

estes, especificamente, correspondem a tirosinase ou TRP-1 ou à proteína S100

(BYSTRYN,1997; ONGENAE et al.,2003). Alguns dos anticorpos parecem reagir com

múltiplos antígenos presentes, não apenas nos melanócitos, como também em outros

tecidos; assim observa-se uma heterogeneidade na resposta de anticorpos. Embora

haja essa heterogeneidade de anticorpos, não se sabe porque ocorre destruição

seletiva dos melanócitos e não de outros tipos celulares. Talvez porque os

melanócitos sejam tipos celulares mais sensíveis a injúria tóxica e imunitária

(ONGENAE et al.,2003)

Oitenta por cento dos pacientes com vitiligo tem anticorpos circulantes contra

antígenos de superfície dos melanócitos, esses anticorpos são citotóxicos para os

40

melanócitos normais e células de melanoma in vitro e in vivo (FISHMAN et al., 1993;

ORTONNE et al., 2003). Alguns trabalhos encontraram estes anticorpos em 50% dos

pacientes com escassas lesões e em 93% dos pacientes com doença extensa

(NAUGHTON et al., 1986). Num estudo de caso-controle iraniano, encontrou-se 30%

de anticorpos antimelanócitos nos pacientes com vitiligo, e ausência deste nos

indivíduos sãos, além de redução de complemento C3 e C4 entre os doentes. Esta

redução do complemento pode estar relacionada ao seu consumo durante o processo

auto-imune (FARROKHI et al., 2005). Esses anticorpos citotóxicos se correlacionam

com a extensão e atividade da doença (NAUGHTON et al., 1986).

Imunoglobulina G purificada de pacientes com vitiligo quando injetada em

camundongos com pele humana transplantada resultou em redução do número de

melanócitos no enxerto e tem efeito destrutivo contra células de melanoma in vitro e

em camundongos (FISHMAN et al.,1993). Estes resultados foram confirmados por

Gilhar et al, que em 1995, demonstraram que IgG de pacientes com vitiligo, quando

injetadas em camundongos transplantados com pele humana, levava à destruição

dos melanócitos, evidenciada por IF direta, imunoistoquímica e microscopia

eletrônica (GILHAR et al., 1995). Sendo que esta citólise dos melanócitos pelo soro

de pacientes com vitiligo ocorria especialmente no vitiligo ativo (CUI et al., 1993).

Definiu-se assim a citotoxicidade mediada por anticorpos.

Foi observado que na ocorrência simultânea de vitiligo e melanoma, a

progressão do melanoma em modelos animais (porcos e cavalos) é mais lenta

provavelmente porque anticorpos antimelanoma destroem os melanócitos em

pacientes com metástase (CUI et al.,1995 apud KOVACS,1998).

Anticorpos anti-tirosinase (proteína de 69-kDa/75kDa), uma enzima-chave na

síntese da melanina, catalisando as duas primeiras reações (ver fig 2.2), portanto um

41

antígeno intracelular, foram identificados, através de Western Blot, em 77% dos

pacientes com vitiligo e em 12% dos pacientes com doença endócrina auto-imune

sem vitiligo.

FIGURA 2.2. – A. O melanócito . B. Biossíntese da melanina - Os melanócitos sintetizam a

tirosinase e quando incorporadas em organelas especiais (melanossomos) são iniciados uma série de eventos que levam à

síntese e deposição da melanina. A tirosinase(*) (monofenol; L-dopa) catalisa a primeira reação da biossíntese da

eumelanina: a hidroxilação da tirosina a DOPA (3,4 dihidrofenilalanina quinona). A DOPA será oxidada a DOPAquinona pela

tirosinase até formar dopacromo. Ele se descarboxilará espontaneamente para formar DHI, que será rapidamente oxidado para

produzir 5,6 indolequinona. Na presença de cátions divalentes, um intermediário carboxilado DHICA será formado e quando

oxidado formará ácido carboxílico 5,6 indole-quinona , que será autooxidado para formar a eumelanina. Quando a

DOPAquinona encontra compostos sulfidrílicos, será formada cisteinilDOPA e subseqüentemente, feomelanina.

Dois tipos de tirosinase foram isoladas dos melanócitos: uma intracelular ligada

à membrana, e outra solúvel (BARAHAV et al.,1996). Sendo que estes estudos

demonstraram inicialmente que os títulos se correlacionavam com a atividade da

doença, sugerindo também que os pacientes com doença mais extensa

apresentariam títulos mais elevados do que pacientes com a doença focal

(BARAHAV et al.,1996; NAUGHTON et al., 1986). Acredita-se também que estes

autoanticorpos não sejam dirigidos contra o sítio catalítico da enzima (BARAHAV et

al.,1996). Entretanto são necessárias evidências mais substanciais para poder

afirmar esta correlação de forma irrefutável (CASTANET et al.,1997).

T cisteinilDOPA Feomelanina

TIROSINA * DOPA DOPAquinona Dopac romos

D

DHICA DHI

Ácido carboxílico 5,6 indolequi nona 5,6 indolequinona

B

E Eumelanina

A

42

Outro grupo encontrou uma freqüência de 40% de pacientes com anticorpos

anti-tirosinase. (OKAMOTO et al., 1998) Xie et al. não encontrou anticorpos anti-

tirosinase nos pacientes com vitiligo (XIE et al.,1999) Mesmo com dados conflitantes,

muitos autores sugerem que a tirosinase é o principal antígeno do vitiligo auto-imune

(SONG et al.,1994).

Os resultados possivelmente diferem pois o soro de pacientes com vitiligo

reage contra múltiplos epítopos da tirosinase, além de duas proteínas relacionadas à

ela (TRP-1 e TRP-2: proteína relacionada a tirosinase 1 e 2 respectivamente) (KEMP

et al.,1999).

Estes anticorpos anti-tirosinase, além de serem encontrados em pacientes

com vitiligo, foram encontrados em pacientes com melanoma, especialmente na

forma metastática e pacientes em imunoterapia para melanoma. Este dado pode ter

implicações terapêuticas (FISHMAN et al., 1997).

Outros antígenos de diferenciação melanocítica, além da TRP-1 e TRP-2,

foram reconhecidos: gp100/Pmel17 (glicoproteina de matriz melanossômica), os quais

se localizam nos melanossomos . Entretanto, esses anticorpos dirigidos a Pmel17 e

TRP- possuem baixa freqüência, o que reflete um papel secundário na destruição dos

melanócitos no vitiligo auto-imune (KEMP et al., 1998).

Recentemente foi descoberto o autoanticorpo contra o receptor de superfície

melanin-concentrating hormone receptor 1 (MCHR1), de alta especificidade em

pacientes com vitiligo, usando-se IgG do soro de pacientes com vitiligo através da

técnica de radioimunoensaio. Sendo que permanece a discussão se este anticorpo

seria fundamental na gênese da doença ou se surgiriam secundariamente ao

processo de destruição dos melanócitos. Mesmo porque o receptor MCHR1 também

foi encontrado em outros elementos celulares como queratinócitos e células do

43

sistema nervoso central, embora os melanócitos realmente pareçam mais sensíveis

à injúria imune-mediada (KEMP et al.,2002).

Alguns estudos de imunidade celular demonstraram atividade de linfócitos

citotóxicos dirigida contra Melan A (MART1), uma proteína específica dos

melanócitos, mas autoanticorpos contra Melan A não foram encontrados no soro de

pacientes com vitiligo, em estudos controlados sobre o papel da imunidade humoral

(WATERMAN et al., 2002).

Enquanto anticorpos contra melanócitos têm papel importante na destruição

dos mesmos, a destruição dos queratinócitos é provavelmente secundária a

inflamação. O soro de pacientes com vitiligo é citotóxico para melanócitos, mas não

para queratinócitos in vitro.

A citólise mediada pelo complemento dos melanócitos humanos pelo soro do

paciente com vitiligo está aumentada nos pacientes J295.374 0 Td[(f)-12.1703(o)-

44

2.8.1.7 - Imunidade Celular e a relevância do CLA n o vitiligo

Estudos sobre imunidade celular também foram realizados com pacientes de

vitiligo. Durante muito tempo o infiltrado de células T no vitiligo foi menosprezado

talvez por estar presente, de forma mais intensa, apenas nas margens das lesões de

pacientes com a doença em atividade (LE POOLE et al., 2004)

Os primeiros relatos do envolvimento da imunidade celular na patogênese do

vitiligo se originaram nos estudos do infiltrado inflamatório observado ocasionalmente

nas biópsias dos doentes. Investigação histológica da área perilesional sugeria o

envolvimento de linfócitos no processo de acromia. Estudos imunoistoquímicos

confirmaram a presença de células T no infiltrado inflamatório, bem como sua

freqüente localização próxima aos melanócitos perilesionais. Estes infiltrados foram

estudados em pacientes com vitiligo generalizado, o que corresponde à grande

maioria dos mesmos, assim ainda permanece a necessidade de investigação dos

infiltrados de doentes com vitiligo segmentar ou ocupacional (LE POOLE et al., 1996;

OGG et al., 1988)

O fato do vitiligo vulgar se apresentar com lesões localizadas, simétricas,

acometendo os mesmos sítios anatômicos de forma bilateral, bem demarcadas, ao

invés de uma perda de coloração generalizada, gerou a inferência de que clones de

linfócitos com predileção por determinadas áreas (algo parecido com o que ocorre no

linfoma) fossem importantes para a destruição dos melanócitos, mais do que a ação

dos autoanticorpos (GOUDIE et al., 1990 apud AL BADRI et al., 1993).

Al Badri et al. demonstraram, através de estudos de imunoistoquímica das

margens de lesões de vitiligo, presença de células T CD4+ e CD8+, sem aparente

45

alteração na relação entre elas, e um número maior de células T HECA-452+ do que

a pele de controles sem vitiligo ou de pele não acometida de pacientes com vitiligo.

Sendo que muitos destes linfócitos T direcionados para a pele encontravam-se

ativados (MHC-II+ e IFN-gama+). Esse fato contribui para a hipótese de que as células

T lesionais estão envolvidas na destruição auto-imune dos melanócitos. Os autores

inclusive especulam que as células T lesionais sejam mais importantes para a

destruição auto-imune dos melanócitos do que os autoanticorpos antimelanocíticos

(AL BADRI et al., 1993).

A sugestão de Al Badri et al. sobre o papel da célula T no vitiligo foi reforçada

com os achados de Van den Wujngaard et al. e Le Poole et al. Através de estudos de

imunoistoquímica da área perilesional no vitiligo generalizado em atividade,

detectaram-se principalmente células TCD4+ e TCD8+ no infiltrado celular, geralmente

com um alto número de linfócitos T CD8+/CD45RO+ na área marginal da lesão e uma

relação CD4/CD8 reduzida (aproximadamente 0,48). (VAN DEN WUJNGAARD et al.,

2000). Sendo que estas células T perilesionais expressaram moléculas de adesão

(ICAM-1) e moléculas de ativação como o receptor de interleucina 2 (IL-2R (CD25));

HLA-DR e o complexo maior de histocompatibilidade II (MHC II) (AHN et al., 1994; LE

POOLE et al., 1997).

Estas células T citotóxicas, adjacentes à melanócitos em destruição na pele

perilesional, eram CLA+. (VAN DEN WIJNGAARD et al., 2000).

Expandido-se os linfócitos da parte marginal das lesões de pacientes com

vitiligo associado ao melanoma, viu-se que eles eram constituídos

predominantemente por linfócitos TCD8+, que reconheciam antígenos de

diferenciação melanocítica, sendo que a grande maioria (97%) expressava o CLA.

46

Vinte e seis porcento dos mononucleares periféricos autólogos expressavam o

antígeno cutâneo linfocitário (LE GAL et al., 2001).

O aumento da população TCD8+ na pele de pacientes com vitiligo é diferente

do que ocorre em outras dermatoses inflamatórias como psoríase, dermatite atópica e

de contato e líquen plano, nas quais os linfócitos T que infiltram a pele são

predominantemente células T CD4+ de memória (BARKER et al., 1992).

Diferentes dos trabalhos realizados sobre vitiligo, Ahn et al. encontraram,

através de imunoistoquímica, uma maior proporção de células T CD4+ na periferia das

lesões em atividade e número normal de T CD8+ (AHN et al., 1994). Estes dados

estavam de acordo com os resultados de A´l Badri et al., que encontraram expressão

elevada de MHC-II e ICAM-1 pelos melanócitos perilesionais em 13 de 21 pacientes

estudados. Uma vez que estas moléculas desempenham papel importante na

ativação da célula T helper e na apresentação do antígeno (AL BADRI et al., 1993).

Foi analisado também o perfil de citocinas in vitro produzidos por clones de

células T perilesionais estimuladas. Com a análise de todo espectro de citocinas

produzidas pelas células T CD4+ e TCD8+, tanto da área perilesional como não

lesada, houve tendência a um padrão tipo 1. Sendo que em dois pacientes foi

demonstrada citotoxicidade dos clones de células TCD8+ contra melanócitos

autólogos, sendo específicos para MART-1 (WANKOWICZ-KALINSKA, 2003).

Através da medida sérica dos níveis de IL-1, IL-1beta, IL-6, IL-8, TNF-alfa e GM-

CSF, observou-se apenas elevação dos níveis de IL-6, GM-CSF e IL1-beta,

especialmente nos pacientes com vitiligo generalizado e em progressão (TU et al.,

2003).

47

Além de células T no infiltrado celular, macrófagos CD68+ são abundantes na

derme e não foram encontradas células B no infiltrado inflamatório destes pacientes

(LE POOLE et al.,1996)

O papel das células de Langerhans, que agem com células apresentadoras

de antígenos e ativadoras das células T no vitiligo não é bem definido. Acredita-se

que a célula de Langerhans tenha um papel importante na interação melanócito-

queratinócito, embora não tenha sido esclarecida sua função. A escolha do local de

biópsia, tipos de vitiligo e técnicas utilizadas explicam os resultados divergentes

sobre estas células na pele de pacientes com vitiligo. Foram encontradas alterações

degenerativas das células de Langerhans, além de sua depleção em lesões ativas e

em repigmentação e ressurgimento destas células quando as lesões estabilizam

(KAO et al., 1990). Sua depleção no momento da atividade da doença pode ocorrer

em conseqüência aos fatores citotóxicos liberados durante o processo imunológico.

Entretanto, outros encontraram aumento destas células e retorno à normalidade

quando ocorre a repigmentação (WESTERHOF et al., 1986)

Outras evidências do papel da imunidade celular na patogênese do vitiligo

surgiram a partir de estudos com melanoma. A destruição seletiva das células

pigmentadas é o objetivo terapêutico no melanoma (BYSTRYN, 1997). Viu-se que a

presença de vitiligo, dentro das lesões de melanoma, circundantes ou distal à lesão

tumoral, estava relacionada com o aumento da sobrevida de pacientes com

melanoma. Em estudos com imunoterapia com IL-2, observou-se que os pacientes

que apresentavam regressão do melanoma desenvolviam, em 20% dos casos,

simultaneamente, lesões de vitiligo. Presume-se que a IL-2 estimule a resposta

imune pré-existente contra os melanócitos, levando à morte dos melanócitos

normais (BYSTRYN,1997) Assim, a despigmentação foi tida, por alguns como um

48

fator prognóstico para pacientes com melanoma, embora outros não demonstrem

aumento da sobrevida em pacientes com melanoma (BYSTRYN et al., 1987;

BYSTRYN; 1997).

A contribuição do estudo de pacientes com melanoma também veio elucidar

contra quais antígenos melanocíticos os linfócitos T citotóxicos se dirigiam. As

células T do infiltrado tumoral reconhecem antígenos de diferenciação melanocítica

que também são expressos por melanócitos normais como tirosinase, gp100, MART-

1, TRP-2, proteína P e TRP-1. Estes alvos são a base da terapia imunológica para

melanomas (ENGELHARD et al., 2002 apud LE POOLE et al., 2004; YEE et al.,

2000). A infusão de clones de T CD8+ específicos para MART1, acompanhados de

IL-2, em um paciente com melanoma metastático levou ao surgimento de eritema

seguido de alterações vitiligóides. A biópsia desta pele inflamada, após a infusão,

revelou a presença de células névicas degeneradas e um infiltrado inflamatório

intenso. Neste infiltrado, após imunoistoquímica, demonstrou-se que 28% dos

linfócitos tratava-se de células T CD8+-específicas para MART1, presentes também

no sangue (correspondendo a 1,2% de todas as células TCD8+). Caracterizou-se

desta forma o componente migratório das células, que saíram do sangue para a

pele, atraídas pelo antígeno MART-1 (YEE et al., 2000).

Outros estudos envolvendo antígenos que estimulariam linfócitos T CD8+ com

ação antitumoral, foram realizados em modelos animais e humanos. Viu-se que a

vacinação com plasmídeo expressando TRP-2, em camundongos, estimulou

linfócitos TCD8+ levando à destruição das células tumorais, mas não ocasionou

vitiligo. Assim, sugeriu-se que a proteção imunológica poderia ocorrer sem agressão

autoimune difusa. Além disso, a patogênese do vitiligo em pacientes com melanoma

estaria mais relacionada com a ação dos anticorpos contra antígenos melanocíticos

49

do que a atividade da célula T citotóxica (BRONTE et al., 2000). Embora achados

anteriores, in vivo, tenham demonstrado que a vacinação com TRP-2 leva ao

surgimento de anticorpos anti-TRP-2, cujos títulos se correlacionariam com o

surgimento de vitiligo e melhora do prognóstico (OKAMOTO et al., 1998)

Por outro lado, em outra pesquisa com camundongos, apenas a vacinação

com TRP-1 e não com outros antígenos como TRP-2, gp100, MART-1 e tirosinase,

levou à despigmentação e destruição das células de melanoma. Além disso, a ação

“imunogênica” do TRP-1 estava, surpreendentemente, associada ao recrutamento

dos linfócitos T CD4+ e presença de linfócitos T CD4+ anti-TRP1, além dos

anticorpos IgG antiTRP1, demonstrando ter um papel importante no processo de

despigmentação. Este dado foi discordante de todos os outros estudos em que o

foco de atenção era o linfócito T CD8+ citotóxico (OVERWIJK et al., 1999).

Avaliando-se o tratamento com interferon-alfa2b para 200 pacientes com

melanoma avançado, viu-se que a autoimunidade era um fator de bom prognóstico,

relacionado ao aumento de sobrevida destes pacientes. Entre os pacientes,

observou-se uma ocorrência de 6% de vitiligo e 10% de outras manifestações auto-

imunes como tireoidopatias com autoanticorpos positivos (GOGAS et al., 2006).

Uma outra estratégia, na imunoterapia em pacientes com melanoma, é

estimular a ativação da célula T através do bloqueio do CLTA-4 (um antígeno

associado ao linfócito T citotóxico), um receptor crucial para a redução da ativação

da célula T. Como durante a imunoterapia, alguns pacientes desenvolvem vitiligo, a

contribuição para o entendimento do mecanismo imunológico do vitiligo a partir de

modelos com melanoma é óbvia (LEE et al.,2004).

Acredita-se que as mesmas células T do infiltrado adjacente a um melanoma

sejam as células T encontradas nas biópsias das lesões em despigmentação.

50

Restando, então, a pergunta se as células T são as responsáveis pelo processo de

despigmentação em pacientes sem neoplasia e sem nenhuma causa aparente para

a perda da tolerância a auto antígenos (BECKER et al., 2002)

Quando estas células T CD8+ Melan-A-específicas eram infundidas em

pacientes com melanoma metastático, eles desenvolviam lesões inflamatórias e

máculas acrômicas, além de regressão do melanoma.

51

molécula que a qual o anticorpo fluorescente se liga. As suspensões das células são

incubadas com o anticorpo fluorescente e a quantidade de fluorescência de cada

célula e o número de células são medidas quando estas células passam no

fluorímetro com um feixe incidente de Laser (ABBAS et al., 2003), O Laser utilizado

é o argônio que possui comprimento de onda de 488nm e emite luz azul-esverdeada

(COON et al.,1991). O feixe de argônio de 488nm promove boa excitação para os

fluorocromos como ficoeritrina (PE) e fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –

FITC).

Em 1978, já se estudava as subpopulações linfócitárias do sangue periférico

através de imunofluorescência, pois se suspeitava da ação das células linfocitárias

com os antígenos melanocíticos, mas nenhuma alteração significativa foi encontrada

na época (ORTONNE et al., 1978). Posteriormente alguns estudos de caso-controle,

ainda envolvendo imunofluorescência, demonstraram que pacientes com vitiligo,

estável por mais de um ano, apresentaram elevada relação CD4/CD8, com aumento

percentual e absoluto das células T CD4+,o que ocorre freqüentemente nas doenças

autoimunes com produção de autoanticorpos. O foco então, tornou-se nestes

estudos, o papel da célula T CD4+ e seu desempenho como agente de

imunoregulação. Estes achados também foram encontrados nos pacientes de

primeiro grau dos doentes. (D’AMELIO et al., 1990; SOUBIRAN et al., 1985).

O fato desta relação TCD4+/TCD8+ ter sido elevada em pacientes de 1o grau

de portadores de vitiligo sugere que ela possa ser um marcador da doença, mesmo

em um estado latente ou subclínico. A expansão das células T CD4+ circulantes é

um fenômeno comum em várias doenças auto-imunes e a relação CD4/CD8 é

regulada por uma série de mecanismos homeostáticos. Uma perturbação nesse

52

sistema finamente regulado pode levar à uma desordem auto-imune como o vitiligo

(D’AMELIO et al., 1990).

Entretanto, Grimes et al. encontraram redução dos linfócitos CD3+ e CD4+ e

redução da relação CD4/CD8, em estudos de imunofluorescência, em pacientes com

vitiligo em atividade e menos de um ano de evolução. Especulou-se que esta

redução dos linfócitos T CD4+ poderia estar relacionada com a migração destas

células da circulação periférica para a pele com vitiligo (GRIMES et al., 1986). Além

disso, esta redução de linfócitos totais pode estar relacionada com ativação mediada

pelo antígeno e subseqüente morte celular (SEHGAL et al.,2005)

À semelhança de Grimes et al., Halder et al., no mesmo ano, também

evidenciou redução dos linfócitos T totais e da células T CD4+ em pacientes com

vitiligo de curta evolução (HALDER et al., 1986). Posteriormente, esta redução de

linfócitos T CD4+ e da relação CD4/CD8 foi descrita em pacientes turcos (GUNDUZ

et al., 2004).

Crianças foram também avaliadas. Em estudos feitos sobre imunidade celular

encontrou-se redução dos níveis periféricos de linfócitos T citotóxicos, aumento de

linfócitos T ativados e redução de células com atividade natural Killer (KURTEV et

al.,2004).

Foi demonstrado, em seres humanos, que as células T apresentam um ritmo

circadiano e uma modulação sazonal. Assim, foram realizados estudos para

determinar se havia alteração no ritmo circadiano das células T em pacientes com

vitiligo. Viu-se que pacientes com a doença em atividade perderam o ritmo

circadiano das células T CD4+, enquanto que nos pacientes com a doença estável

não ocorria. Neste mesmo estudo viu-se que as células T CD4+ estavam reduzidas

nos pacientes com vitiligo ativo e as células T CD8+ estavam diminuídas tanto nos

53

pacientes com a doença estável como na doença ativa. Desta forma, parece que um

percentual baixo de células TCD4+ associa-se com a atividade da doença e a

redução das células TCD8+, com a existência do vitiligo. (MOZZANICA et al., 1990).

Em 1992, Abdel-Naser et al., estudaram 16 pacientes com vitiligo, incluindo a

forma estável e ativa, tendo encontrado valores normais para as subpopulações

linfocitárias (ABDEL-NASER et al., 1992) Estes foram os mesmos resultados de

Mahmoud et al., que estudou 34 pacientes com vitiligo em atividade. Entretanto eles

encontraram expressão elevada de CD25 e HLA-DR pelos linfócitos nos pacientes

com vitiligo, indicando ativação das células T (GUNDUZ et al., 2004; MAHMOUD et

al., 1998).

Todas estas alterações discrepantes, entre os diferentes autores, podem ter

sido ocasionadas por inclusão de grupos heterogêneos em relação à atividade, e

evolução do vitiligo, diferentes etnias, além de técnicas de coleta e processamento

distintos (ver tabela 2.2) Foi descrito, inclusive, que as populações de linfócitos

periféricos podem sofrer influência de fatores como estresse, tabagismo, drogas,

atividades esportivas e envelhecimento. (WESTERMANN et al., 1990 apud ABDEL-

NASER et al., 1992).

54

TABELA 2.2. – Perfis descritos dos linfócitos T periféricos dos pacientes com vitiligo AUTOR Número de

Pacientes

Controles

pareados

Atividade

Da doença

Contagem

de Linfócitos

T TOTAIS

Contagem

de Linfócitos

T CD4+

Contagem

de Linfócitos

T CD8+

RELAÇÃO

CD4/CD8

Técnica

Utilizada

ORTONNE,

1978

38 Não Não

informada

normal Não

avaliado

Não

avaliado

Não

avaliado

Roseta de

hemácias

de carneiro

SOUBIRAN,

1985

32 Não estável normal elevado normal Elevada IF

GRIMES,

1986

20 Sim Não

informado

reduzidos redução Redução IF e

Citox assoc

Ao complem

HALDER,

1986

25 SIM Ambos

Incluídos

reduzidos reduzidos elevado Tende

a redução

CF

D’AMELIO,

1990

22 Sim Estável normal elevado Tende a

redução

Elevada IF

MOZZANICA,

1990

12 Sim Ambos

Incluídos

Não

informado

Reduzido

na forma

ativa

Reduzido

na forma

estável e

ativa

Não

informado

CF

ABDEL-

-NASER,

1992

16 Sim Ambos

Incluídos

normal normal normal Normal CF

HANN, 1993 50

Coreanos

Sim Ativo normal reduzido elevado 40% relaçao

Invertida

(<1)

CF

MAHMOUD,

1998

34

kwaitianos

Sim Ativo Não

informado

Normal

(tende a

Redução)

normal Normal

(tende a

Redução

CF

GUNDUZ,

2004

45

turcos

Não

informado

Ambos

Incluídos

normal reduzidos normal Reduzida CF

CAC= Citotoxicidade associada ao complemento; IF=imunofluorescência; CF=citometria de fluxo

Desta forma, em 1993, estudou-se um grupo homogêneo de cinqüenta

pacientes coreanos com vitiligo em atividade, generalizado, nos quais foi detectada

redução dos linfócitos TCD4+ e aumento dos linfócitos T CD8+, além de inversão da

relação CD4/CD8 em 40% destes indivíduos (HANN et al., 1993).

Além desses achados, a ativação de linfócitos T circulantes também foi

observada. A ativação de células T foi confirmada no vitiligo através da detecção de

níveis elevados de receptores de interleucina 2 solúveis (sIL2-R) especialmente na

forma generalizada e no vitiligo de curta duração. Sabe-se que os níveis de receptor

solúvel de interleucina 2 no soro indicam ativação de células imunocompetentes,

55

especialmente linfócitos, uma vez que a IL-2 é uma citocina que age com fator de

crescimento para a célula T. Uma correlação significante do nível elevado de sIL2-R

com a atividade da doença e período menor que 1 ano de evolução foi observada

(GALADARI, 2005; HONDA et al., 1997).

Ogg et al. e Mantovani et al. demonstraram, através de complexos

tetraméricos de HLA, a presença de linfócitos T CD8+ Melan-A-específicos no

sangue de pacientes com vitiligo auto-imune. Melan-A é um antígeno de

diferenciação melanocítica e estas células correlacionaram-se com a extensão e

atividade da doença. Neste estudo, essas células, reconhecedoras do Melan-A,

expressavam o CLA, o que não ocorria no grupo controle. (MANTOVANI et al., 2003;

OGG et al., 1998). Utilizando esta mesma técnica, observou-se também reatividade

das células TCD8+ para outros antígenos, além do Melan-A, tendo sido encontrada

para os peptídeos gp-100, mas não para tirosinase. Sendo que esta reatividade era

maior nos pacientes com a doença em atividade (MANDELCORN-MONSON et al.,

2003). Desta forma definiu-se um papel consistente das células T melanócito-

específicas no vitiligo, sendo a imunidade celular dependente de TCD8+ um possível

alvo de intervenção terapêutica. (MANDELCORN-MONSON et al., 2003;

MANTOVANI et al., 2003; OGG et al., 1998).

Utilizando avançadas técnicas genéticas de imunização para indução de

resposta imune antígeno-específica em modelos animais, sem indução de células

TCD4+ e anticorpos, foi evidenciado que as células pigmentares da epiderme eram

destruídas por linfócitos TCD8+, que se dirigiam contra TRP-2, uma enzima

melanossômica envolvida na síntese da melanina (STEITZ et al., 2004; STEITZ et

al., 2005).

57

ocorre a liberação dos melanossomos no citosol. Os melanócitos possuem um

mecanismo protetor intrínseco que elimina os precursores melanotóxicos

(ORTONNE, et al., 2003). Existem variantes desta hipótese:

A primeira hipótese sugere uma desrregulação desse mecanismo que levaria

a produção de radicais livres (peróxido de hidrogênio) e compostos tóxicos que são

destrutivos para os melanócitos. Talvez ocorra deficiência em inativar certas

enzimas e os intermediários tóxicos (MOELLMAN et al., 1982). A ocorrência de

leucodermia química que induz lesões semelhantes ao vitiligo devido destruição de

melanócitos por compostos fenólicos de estrutura similar a tirosina apóia esta

hipótese. Os melanócitos vacuolizam e retraem seus dendritos na presença de

produtos fenólicos (LE POOLE et al.,1997)

A segunda aponta para defeitos na enzima catalase. Uma alteração da

atividade da catalase e na síntese de tetrahidrobiopterina e de catecolamina na

epiderme poderia levar a níveis tóxicos de peróxido de hidrogênio resultando em

dano melanocítico (SCHALLREUTER et al., 1991 apud BYSTRYN 1997)

A terceira aponta para a ocorrência de estresse oxidativo por alteração

mitocondrial nestes doentes. Sabe-se que as mitocôndrias são consideradas umas

das principais fontes de radicais livres intracelulares. As mitocôndrias de linfócitos de

pacientes com vitiligo em atividade foram estudadas e encontraram-se alterados o

processo apoptótico, expressão de algumas enzimas do ciclo de Krebs, o potencial

transmembrana mitocondrial associados à elevada geração de radicais livres

intracelulares. Assim as mitocôndrias poderiam estar envolvidas no processo

patogênico, alterando o estado redox do indivíduo (DELL´ANA et al., 2003)

É importante ter em mente que o melanócito é extremamente sensível a

injúria. O limiar tóxico para a morte dos melanócitos pelo peróxido é 100 vezes

58

menor que do que a morte dos fibroblastos e consideravelmente inferior ao limite dos

queratinócitos. Isto pode tornar o melanócito particularmente sensível aos

intermediários tóxicos e ação dos radicais livres que ele produz (BYSTRYN,1997).

Foram encontrados elevados níveis teciduais de superóxido dismutase,

glutationa peroxidase e malondialdeído na biópsia de pacientes com vitiligo. Este

achado reforça o envolvimento dos radicais livres nesta doença (YILDIRIM et al.,

2004)

Através desta teoria, justificar-se-ia a suplementação de antioxidantes no

tratamento desta doença (DELL´ANA et al., 2003).

2.8.4 -Apoptose dos melanócitos

Outra hipótese levantada para explicar a destruição dos melanócitos no

vitiligo é a indução de apoptose. Os argumentos relevantes pró-apoptose advêm do

fato de citocinas como IL-1, IFN-gama ou TNF-alfa liberadas por linfócitos,

queratinócitos e melanócitos poderem iniciar apoptose. Uma alteração no balanço

das citocinas no microambiente epidérmico da pele perilesional de vitiligo poderia

alterar a vida normal e a função dos melanócitos (HUANG et al., 2002)

Embora alguns autores acreditem que a morte dos melanócitos ocorra por

apoptose sem componente inflamatório importante (NORIS 1994 apud LE POOLE

2004), observou-se que tanto os melanócitos de pacientes com vitiligo como os

melanócitos de indivíduos controles apresentam mesmo nível de morte celular

quando submetidos a um estímulo apoptótico como a RUVB (VAN DEN

WIJNGAARD et al., 2000). Assim acredita-se que os melanócitos de pacientes com

vitiligo não sejam mais susceptíveis a apoptose do que os melanócitos de pessoas

sadias. (LE POOLE, 2004).

59

2.8.5 - Descolamento melanocítico

Em 2003 foi estudado o efeito da fricção repetida da pele na adesão e

sobrevivência dos melanócitos na pele não lesada de indivíduos com vitiligo e as

biópsias seqüenciais após o trauma inicial sugeriram um destacamento (ou

descolamento) dos melanócitos seguido de sua eliminação transepidérmica. Isto

poderia explicar a resposta isomórfica (fenômeno de Koebner) e também ocorrer

secundariamente a outros mecanismos de lesão celular (GAUTHIER et al.,2003)

2.8.6 -Melanocitorragia

Esta teoria tende a integrar todos os conceitos anteriores e propõe que o

vitiligo não segmentar seja uma desordem melanocitorrágica primária com

melanócitos alterados pela fricção ou outras formas de stress que sofreriam

eliminação transepidérmica. Esta teoria é baseada no pobre sistema de adesão dos

melanócitos, diferente do que ocorre com os queratinócitos e na perda da

dendriticidade dos melanócitos, na presença de radicais livres (teoria do stress

oxidativo) ou de epinefrina (teoria neural) o que levaria ao destacamento dos

melanócitos e sua morte. Isto explicaria o fato das lesões ocorrerem em áreas de

fricção contínua, como pálpebras e extremidades. A liberação de autoantígenos

pelos melanócitos degenerados levariam a perda da tolerância imunológica, gerando

uma resposta imune que amplificaria o dano melanocítico (GAUTHIER et al., 2003).

2.8.7 -Defeito intrínseco do Melanócito

Melanócitos de vitiligo cultivados em cultura não apresentam diferenças na

síntese de DNA, atividade da tirosinase e resposta a RUV-B quando comparados

com melanócitos controle. Apenas em culturas de longa duração, eles irão

60

apresentar alterações no retículo endoplasmáticos detectadas com microscopia

eletrônica, entretanto estas alterações não são letais (BOISSY 1991 apud

CASTANET et al., 1997).

2.8.8 - Alteração local das citocinas produzidas

Além das teorias citadas, também foi descrito um aumento local na produção

de citocinas, entre elas: TNF-alfa, interferon-gama e interleucina 10 na pele lesada e

adjacente dos pacientes com vitiligo. Sabe-se que TNF-alfa e interferon-gama são

mediadores de apoptose, um potencial mecanismo para a destruição dos

melanócitos. O TNF-alfa inibe a proliferação dos melanócitos e a melanogênese. Se

esta alteração local das citocinas é um evento primário ou secundário, permanece

em aberto. No entanto, todas as terapêuticas visam controlar o processo

imunológico local, através de sua supressão ou modulação (GRIMES et al., 2003

apud GRIMES,2004).

2.8.9 -Teoria convergente

Através da teoria convergente, acredita-se que todos os mecanismos citados

anteriormente possam simultaneamente contribuir para a destruição dos melanócitos

(ONGENAE et al.,2003; ORTONNE et al., 1983 apud BYSTRYN 1997). Desta

forma, uma injúria ao melanócito, ou estímulo neural, poderia estimular seu

metabolismo e uma superprodução dos intermediários tóxicos, o que levaria à lesão

celular e liberação de antígenos das células pigmentadas. Estes antígenos liberados

poderiam gerar uma resposta imune contra antígenos dos melanócitos, o que

amplificaria a lesão destas células (ORTONNE et al., 1983 apud BYSTRYN 1997).

61

2.8.10 -Teoria viral

A presença direta de DNA de citomegalovírus, através de PCR, em pacientes

com vitiligo, tanto na área lesada como na pele não comprometida e relação da sua

presença na biópsia com a atividade de doença levou a uma especulação de

possível infecção viral na gênese da doença (GRIMES et al., 1996 apud YAMAUCHI

et al., 2002). Reforçando esta hipótese, encontrou-se expressão de genes virais em

galinhas da linhagem Smith, que é o modelo animal para estudo do vitiligo (OGG et

al., 1998).

62

2.9 - Um breve passeio na fotobiologia e a Radiação Ultravioleta

John Ritter descobriu em 1801, a região ultravioleta do espectro solar,

demonstrando a existência de uma ação química causada por um tipo de energia

oriunda da parte visível do espectro subseqüente ao violeta (DIFFEY,2002).

63

TABELA 2.3. – Radiação ótica e comprimento de onda Radiação Comprimento de onda (em nm)

(1nm=10 -9m) Luz visível De 400nm (roxa) a 700nm (vermelha) Ultravioleta UVC UVB UVA

100nm-280nm* 280-315nm* 315-400nm*

Infravermelha 760nm-1mm Obs.: * Modo de classificação da RUV recomendado no Second International Congresso on Light, em Copenhagen (1932). Entretanto, fotobiologistas comumente utilizam UVA:400-320nm;UVB:320-290nm e UVC: 290-200nm

A radiação UVC não atinge a superfície da Terra, pois é bloqueada pela

camada de ozônio, embora exposição acidental possa ocorrer com as lâmpadas

germicidas (MATSUMURA et al., 2004).

O marco divisor de 320nm entre as faixas radiação UVA (RUV-A) e RUV-B é,

possivelmente, mais arbitrária. Avanços na fotobiologia molecular indicam que a

subdivisão entre 330-340nm seja mais apropriada, assim dividiu-se a RUV-A em

UVA I (340-400nm) e UVA II (320-340nm). Uma vez que a UVAII é mais

eritemogênica, sendo semelhante a RUVB na sua capacidade de causar

queimaduras, bem como no seu potencial carcinogênico e ação no sistema imune

(DIFFEY,2002; OKUNO et al.,2005).

A transmissão percentual da RUV através da pele varia de acordo com o

comprimento de onda (OKUNO et al., 2005).

TABELA 2.4. – Absorção percentual da RUV na pele de acordo com o comprimento de onda Comprimento

de onda 290nm 297nm 313nm 365nm

Topo da epiderme

100%

100%

100%

100%

Base da camada

córnea

6,5% 15% 33% 50%

Base da epiderme 0,27% 2,4% 9,5% 19%

(OKUNO, E; VILELA MAC, 2005. Temas atuais de física: Radiação Ultravioleta: Características e Efeitos, pág 16, 1ª Ed, Ed. Livraria da Física)

64

A RUV-A atinge a epiderme, derme superficial e média, sendo que a RUV-B

atinge principalmente a epiderme (DUARTE et al., 2006).

As moléculas que absorvem a luz na pele são os cromóforos. São eles: a

melanina (que absorve RUV-A e RUV-B), DNA (que absorve RUV-A e RUV-B),

triptofano, 7-deidrocolesterol, ácido urocânico, colágeno e elastina (estes 5 últimos,

cromóforos para RUV-B). Nem todos os cromóforos são capazes de iniciar uma

reação fotoquímica na pele (DUARTE et al.,2006).

Algumas unidades básicas devem ser consideradas no estudo da RUV.

Temos a quantidade de energia transmitida, transferida ou recebida, como forma de

radiação. É transportada por uma onda eletromagnética e é medida em Joules (J). O

fluxo (tempo para transferência da energia) radiante é a potência, medida sob a

forma de Watt (W), sendo 1W=1J/s.

TABELA 2.5. – Unidades básicas no estudo da RUV Grandeza Unidade

Energia radiante J

Fluxo radiante W

(OKUNO, E; VILELA MAC, 2005. Temas atuais de física: Radiação Ultravioleta: Características e Efeitos, pág 21, 1ª Ed, Ed. Livraria da Física)

2.9.1 - A radiação ultravioleta

Além dos efeitos benéficos sobre algumas doenças e seu uso na medicina

(fototerapia, fotoquimioterapia, terapia fotodinâmica e laserterapia), A RUV,

componente da radiação ótica, causa bem estar, ilumina, aquece, participa da

fotossíntese e da síntese da vitamina D (OKUNO et al., 2005).

65

A exposição inadvertida, sem proteção adequada, pode levar a

actinossenescência, carcinogênese cutânea, depressão imunológica e lesões

oculares como catarata e pterígio. (OKUNO et al.,2005).

O padrão esperado de resposta a exposição a RUV da pele é bronzeamento

(aumento da melanogênese) e espessamento do estrato córneo, da epiderme e da

derme, o que irá prevenir dano futuro pela RUV, além de edema intercelular e

infiltrado perivascular (MATSUMURA et al., 2004; OKUNO et al.,2005).

A exposição aguda a RUV levará a lesões do DNA como os dímeros de

pirimidinas e os outros fotoprodutos, que podem levar a mutações do DNA se não

reparados. Para evitar as mutações, as células apresentam mecanismos de reparo

ou induzem apoptose para evitar a transmissão das mutações do DNA as células

filhas. Esta exposição induzirá imunossupressão, por depletar as células de

Langerhans da pele, suprimindo a hipersensibilidade de contato e tardia.

Clinicamente haverá bronzeamento e imunomodulação (MATSUMURA et al., 2004).

A longo prazo, a RUV deteriora a estrutura cutânea, provavelmente por dano

cumulativo ao DNA: fotoenvelhecimento e indução de câncer cutâneo não

melanoma. Embora os fótons de RUV-B sejam mais energéticos os que de RUV-A,

causando mais eritema, bronzeamento e fotocarcinogênese, a RUV-A também

participa da senescência da pele por induzir a formação de radicais livres que

reagem com as estruturas celulares, levando a ativação dos genes responsivos a

RUV (MATSUMURA et al., 2004).

O uso terapêutico da RUV é demonstrado através da terapia PUVA e

fototerapia com RUV-B. Usadas para outras dermatoses, além do vitiligo.

66

2.9.2 - A fotoquimioterapia (PUVA) e fotoimunomodul ação

A fotoquimioterapia (PUVA) consiste na combinação de psoraleno e RUV-A

(320-400nm) que traz benefício terapêutico que não é obtido quando se usa apenas

a droga ou a radiação separadamente. O relato do uso de plantas contendo

psoralenos associado à exposição solar são encontrados na literatura indiana antiga.

No Egito antigo, o uso da planta Amni majus, encontrada no delta do Nilo foi feito por

séculos entre os egípcios para o tratamento de vitiligo (NAIR, 1978). Os relatos do

uso de psoralenos orais e tópicos na medicina moderna são a partir de 1947, com El

Mofty, na universidade do Cairo usando psoraleno purificado para vitiligo.

(MATSUMURA et al., 2004; MORISON, 2001).

Os psoralenos são compostos de ocorrência natural e muitos deles são

encontrados em plantas, onde provavelmente funcionam como inseticidas. Em

contato com a pele humana e exposição solar resulta em fitofotodermatose. O

psoraleno mais usado é o metoxsalen ou 8-MOP (8-metoxipsoraleno), uma droga

originária das sementes do Amni majus, introduzido nos EUA, em 1951. O trioxsalen

(4,5,8 trimetilpsoraleno), um composto sintético, foi introduzido em 1964.

Ele pode ser administrado através da via oral ou de forma tópica, a depender

da extensão da doença. O ideal é que o pico de nível sérico do psoraleno, um

composto lipofílico, coincida com o momento de exposição a RUV-A. Sua eliminação

é hepática e a excreção, predominantemente, renal (MORISON, 2001).

Outros agentes fotossensibilizadores via oral foram utilizados como a

fenilalanina, mas sem vantagem adicional sobre os compostos existentes

(ROELANDTS, 2003).

Fontes de RUVA comumente utilizadas na terapia PUVA são lâmpadas

fluorescentes ou lâmpadas halógenas metálicas de alta pressão. As típicas

67

lâmpadas fluorescentes de UVA têm um pico de emissão de 352nm e emitem

aproximadamente 0,5% no comprimento de RUVB. Outros tipos de lâmpada

utilizados são os de pico de emissão de 370nm e menos de 0,1% de RUV-B e mais

recentemente, tubos com pico de emissão de 325nm e contaminação maior de RUV-

B também têm sido demonstrados benéficos na terapia PUVA (DIFFEY,2002).

O objetivo da PUVA é induzir remissão das dermatoses através de reações

fototóxicas repetidas e controladas. Estas ocorrem quando o psoraleno é fotoativado

por RUV-A. Além da absorção de fótons pela pele, o PUVA exerce efeitos sistêmicos

através das células circulantes. Uma superdosagem poderia levar ao surgimento de

bolhas e necrose cutânea (MATSUMURA et al., 2004).

As moléculas do psoraleno se intercalam entre as bases de DNA sem a

radiação ultravioleta e quando ocorre a absorção de fótons de RUVA há ativação

para o estado singleto e com o passar do tempo, o estado singleto decai para o

estado tripleto, e como este é mais longo, ele é responsável pela maior parte dos

efeitos fotoquímicos (MORISON, 2001) . Há formação de um produto de 3,4 ou 5,6

ciclobutano com a ligação 5-6 de bases pirimidínicas de DNA nativo (é a reação

fotoquímica tipo I ou direta). Ocorre também a formação de compostos adutos

monofuncionais de timidina ou citosina. O 8-MOP pode absorver um segundo fóton

que leva à formação de um composto bifuncional de 5,6 dupla ligação de bases

pirimidínicas do lado oposto, produzindo um cross-link na dupla hélice. Esta junção

do psoraleno com o DNA epidérmico leva à supressão da síntese de DNA e da

divisão celular. Além disso, ocorre a reação fotoquímica tipo II (ou indireta), através

da qual os psoralenos reagem com RNA, proteínas e outros componentes celulares,

modificando proteínas e lipídios e gerando radicais livres. Estes radicais reativos

podem danificar o DNA através da quebra de ligação nas hélices (MORISON, 2001;

68

ORTONNE et al, 2003). Não está indicado para indivíduos com idade inferior a 12

anos (MORELLI,2000).

Acredita-se que se encontrem melanócitos sem atividade melanogênica nas

lesões de vitiligo. Tobin et al. demonstraram melanócitos presentes na epiderme

despigmentada de paciente com lesões de vitiligo estáveis por 25 anos (TOBIN et

al., 2000 apud PARSAD et al., 2004). A PUVA leva a repigmentação das lesões de

vitiligo através da estimulação dos melanócitos inativos da bainha externa do folículo

piloso (porções inferior e média), através de migração radial e ativação. Essa

estimulação é seguida de proliferação, divisão, migração e maturação dos

melanócitos através da movimentação destes a partir da superfície da bainha

externa em direção à junção dermo-epidérmica, onde se tornam melanócitos ativos

(MONTES et al.,2003; ORTONNE, 1979; ORTONNE et al., 2003). Estes melanócitos

inativos não produzem pigmento e não são reconhecidos pelo processo vitiliginoso

auto-imune. Não se sabe, detalhadamente, quais os processos de sinalização que

levam à ativação destes melanócitos. Uma das hipóteses seria de que a RUV levaria

a liberação de fatores de crescimento melanocítico pelos queratinócitos e outras

células inflamatórias que iriam estimular os melanócitos inativos do reservatório

folicular (PARSAD et al., 2004). É possível que esta sinalização e ativação até

ocorra de forma espontânea, já que muitos pacientes apresentam ilhotas de

repigmentação sem tratamento específico (MORELLI, 2000). Além da migração

folicular, os melanócitos ativos da pele normal circundante seriam atraídos para o

centro das lesões de vitiligo, onde se encontrariam fatores de crescimento,

ocupando progressivamente aquela área e produzindo melanina (CUI, 1995 apud

PARSAD et al., 2004).

69

Quando o melanócito é ativado e produz normalmente o pigmento, ele é

capaz de sofrer a agressão imunológica (MORELLI, 2000).

A PUVA poderia não apenas resgatar as stem cells melanocíticas do

reservatório folicular, que podem ser acometidas em uma fase mais tardia (TAIEB,

2003). Foram descritos outros reservatórios de melanócitos, além dos folículos, já

que marcadores de melanócitos foram detectados, através de reação da polimerase

em cadeia, em pele acrômica de pacientes, inclusive nas amostras desprovidas de

pêlos, sobre os quais a fototerapia poderia atuar (GOTTSCHALK et al., 2003).

Outro fator que contribui para a repigmentação é a liberação de citocinas e

mediadores inflamatórios liberados na pele, principalmente pelos queratinócitos em

resposta a PUVA. Os queratinócitos liberam prostaglandina E, diminuindo a

expressão das moléculas de adesão e conseqüentemente a ativação das células T

(DUARTE et al., 2006).

Além disso, PUVA leva à imunossupressão seletiva através da redução do

número de células de Langerhans, dos antígenos OKT6 e HLA-DR, receptores de Fc

e C3b na superfície das células de Langerhans, alterando sua função nas reações

imunológicas (REE, 1982; BANDEIRA-WERBER, 2003). Estes efeitos podem levar

ao bloqueio da participação das células de Langerhans na apresentação de

antígenos e citotoxicidade dependente de anticorpos. Outra observação feita é a

depleção do antígeno associado ao melanócito após tratamento com PUVA, o que

poderia contribuir para o bloqueio da citotoxicidade (mediada por células e

dependente de anticorpos) aos melanócitos no vitiligo (MORISON, 2001;ONGENAE

et al., 2003).

Além de induzir fatores solúveis (citocinas, neuropeptídeos) com ações anti-

inflamatórias e imunossupressivas, a RUV reduz a expressão e função das

70

moléculas de superfície, incluindo moléculas de adesão (ICAM-1), receptores de

citocinas (receptor de interleucina I e II) e receptores de fatores de crescimento

(receptor de fator de crescimento epidérmico - EGFR) (MATSUMURA et al., 2004;

ONGENAE et al., 2003).

Uma vez que foi demonstrado aumento na produção local de citocinas

mediadoras da apoptose (TNF-alfa, IFN-gama e interleucina 10) em pacientes com

vitiligo, sabe-se que a PUVA resulta em inibição da transcrição gênica e significante

redução da proteína do TNF-alfa e “TNF-alfa-specific transcripts”, além de causar

downregulation de IL-1 e IL-6 (NEUNER,1994). Assim, a RUV também induz

apoptose das células T que infiltram a pele, levando a ação anti-inflamatória (

MATSUMURA et al., 2004; ONGENAE et al., 2003). Os marcadores de controle

apoptótico foram estudados em pacientes com micose fungóide tratados com PUVA,

observando-se redução das células marcadas pelo p53 e Bcl-2 (MANHAES, 2004).

Outro efeito observado no tratamento com PUVA é a redução do títulos de

autoanticorpos em pacientes de vitiligo tratados com sucesso (ONGENAE et al.,

2003).

Uma ação da PUVA em pacientes com vitiligo, recentemente descrita, foi a

reversão de parâmetros de disfunção simpática após a fotoquimioterapia. A atividade

eletrodérmica foi medida como uma alteração da condutância da pele, controlada

pelos sistema nervoso simpático através da reação sobre as glândulas sudoríparas.

Os pacientes com vitiligo apresentavam inicialmente condutância da pele aumentada

em relação aos controles e esta normalizou com a PUVA (DOLU et al., 2005).

São necessárias de duas a três sessões semanais inicialmente por 4 a 6

meses até dois anos (150-300 sessões) para alcançar bons níveis de repigmentação

(MORELLI, 2000; MORISON, 2001). A área de melhor resposta é a face, seguida do

71

tronco e decresce até as extremidades, onde os resultados são precários

(MORISON, 2001). Os resultados são melhores em pacientes com fototipo mais

elevado (ROELANDTS, 2003).

A PUVA leva à repigmentação em mais de 50% dos pacientes com vitiligo. A

repigmentação com a PUVA varia muito e em poucos casos atinge 100%. Em geral

os pacientes de pele mais escura apresentam melhor repigmentação que os

pacientes de pele clara (BELLET et al.,2005). Se não ocorrer resposta após 6 meses

ou aproximadamente 50 tratamentos, a PUVA deve ser suspensa (KRUTMANN et

al., 2003). A responsividade é definida através de máculas perifoliculares de

repigmentação. Estas áreas repigmentadas podem permanecer estáveis após uma

década ou mais sem recidiva. Em um estudo observou-se que 60% dos pacientes

apresentaram recidiva das lesões após 6 meses a um ano do término do tratamento

(KWOK et al., 2002).

O padrão de repigmentação perifolicular foi encontrado em 83% das lesões

submetidas à terapia PUVA tópica ou sistêmica. Sendo que este padrão de

repigmentação foi tido como mais estável, permanecendo após 6 meses da

suspensão do tratamento, se comparados com o padrão de repigmentação marginal

(visto com a terapia PUVA associada a calcipotriol) ou o padrão difuso (observado

com o uso de corticóides) (PARSAD et al., 2004).

A PUVA apresenta alta taxa de efeitos adversos como náuseas, intolerância

gastrintestinal, vômitos, reações fototóxicas, catarata e um risco teórico aumentado

de câncer da pele a longo prazo (BELLET et al.,2005). É bem documentada a

ocorrência de carcinoma epidermóide nos pacientes submetidos a PUVA por longo

prazo, entretanto, contrário ao que muitos dermatologistas acreditam, não há risco

aumentado de melanoma (KOO et al., 2001 apud BANDOW et al., 2004). Por isto

72

este método não tem sido a primeira escolha de tratamento para vitiligo

generalizado, sendo indicado geralmente a terapia com RUV-B de banda estreita

(311-312nm), especialmente nos Estados Unidos (BELLET et al.,2005).

Uma vez que a base imunitária é fundamental para o vitiligo, não é de se

surpreender que todos os tratamentos não-cirúrgicos que se mostraram eficazes no

vitiligo são baseados na imunossupressão e imunomodulação (terapia PUVA

sistêmica e tópica, corticóides tópicos e orais, inibidores da calcineurina tópicos). Até

mesmo a imunoglobulina intravenosa para tratamento de um paciente com ataxia-

telangectasia levou à repigmentação de suas lesões de vitiligo, denotando o papel

do sistema imune (TAIEB,2000).

Recomenda-se que os pacientes com vitiligo evitem exposição solar

intencional e usem fotoprotetores nas áreas acometidas, pois desprovidas de

melanina elas seriam mais susceptíveis para o câncer da pele. Embora isto seja

sensato, surpreendentemente há pouca evidência de que a área despigmentada

seja mais susceptível a RUV-B e ao desenvolvimento de neoplasia maligna

(SCHALLREUTER et al., 2003).

Em estudos de pacientes com psoríase citados anteriormente (ver seção

patogênese), o tratamento com RUV-B levou à redução da expressão do CLA pelos

linfócitos o que coincidiu com a melhora clínica dos pacientes. Desta forma, há de se

supor que o tratamento com PUVA leve também a uma redução da expressão do

CLA concomitante com a repigmentação nos pacientes com vitiligo. Uma vez que os

linfócitos citotóxicos que expressam o CLA estão envolvidos na destruição dos

melanócitos no vitiligo auto-imune. Mas isto é uma hipótese que necessita

confirmação, uma vez que trabalho desta natureza ainda não foi relatado na

literatura (SIGMUNDSDOTTIR et al., 2003)

73

2.9.3.-Outros tratamentos fototerápicos para vitili go

2.9.3.1 – RUV-B de Banda Larga (290-320nm)

Ela atua através da indução de apoptose e imunossupressão sistêmica. Não há

necessidade de fotossensibilizador. Devido a sua inabilidade em penetrar na derme,

seu efeito biológico é devido à ação na epiderme. A imunossupressão sistêmica

ocorre pela liberação de mediadores solúveis como IL-1alfa, IL-10, TNF e ácido cis-

urocânico, a partir da epiderme irradiada, que entram na circulação. A expressão do

antígeno Ki-67, do ciclo celular, é reduzida, levando a ação anti-proliferativa.

(MATSUMURA et al., 2004).

2.9.3.2 – RUV-B de banda estreita (311-312nm)

Recentemente tem sido utilizada a RUV-B de 311-312nm para o tratamento de

diversas dermatoses, com algumas vantagens em relação a PUVA: maior facilidade

de execução, maior aderência ao tratamento, ausência da necessidade de

medicação oral e seus efeitos colaterais, além possibilidade de uso em crianças e

gestantes (KANWAR et al., 2005; NJOO et al., 2000). A utilização desta radiação em

vitiligo foi descrita inicialmente, em 1997, por Westerhof e Nieuweboer-Krobotoa,

com bons resultados (ROELANDTS, 2003; WESTERHOF et al.,1997). Ela atuaria

através da indução de imunossupressão local, redução das citocinas pró-

inflamatórias pelas células T, alteração das moléculas de adesão, estimulação do

MSH, aumentaria a proliferação dos melanócitos e da melanogênese (GRIMES,

2006; SIGMUNDSDOTTIR et al, 2005). Há depleção das células T que infiltram a

pele, através da apoptose, identificada por ensaio com TUNEL. A vantagem da

banda estreita sobre a banda larga, seria a menor freqüência de episódios de

queimadura para um mesmo esquema terapêutico (MATSUMURA et al., 2004)

74

Alguns estudos referem como o tratamento de escolha para pacientes com vitiligo

moderado a extenso (GRIMES et al., 2004). Embora seja uma terapia eficaz e

segura, com melhora da qualidade de vida, a estabilidade da pigmentação requer

acompanhamento a longo prazo (HARTMANN et al., 2005; KANWAR et al., 2004).

2.9.3.3 – Microfototerapia

Com a microfototerapia com RUV-B, ao invés do corpo todo ser irradiado, um

feixe de RUV-B de banda estreita, emitindo luz de alta intensidade, atua

exclusivamente nas máculas hipopigmentadas. Pode ser usado no vitiligo segmentar

e não segmentar. Gera 75% de área de repigmentação em 70% dos pacientes

(MENCHINI et al., 2003) Os resultados terapêuticos são rápidos, o que facilita a

terapêutica por reduzir a dose cumulativa de RUV (LOTTI et al., 1999).

2.9.3.4 - 308nm-EXCIMER LASER

Com emissão próxima à RUV-B de banda estreita, o uso do Laser de 308nm

está indicado para lesões localizadas e permite um resultado rápido, com alto grau

de repigmentação, embora ainda com custo elevado. Sua associação com

tacrolimus tópico, inibidor de calcineurina, acelera os resultados (KAWALEK et al.,

2004). Uma outra possibilidade de uso recente é a luz monocromática excimer de

308nm, com resultados semelhantes ao laser, mas com a vantagem de tratar áreas

maiores e com maior adesão do paciente. Com a luz, 95% dos pacientes

apresentam repigmentação em 8 sessões. (LEONE et al., 2003;

ROELANDTS,2003).

2.10 - Outras terapêuticas para o vitiligo

75

2.10.1 –Corticosteróides

É, eventualmente, a primeira escolha para a forma localizada do vitiligo

(STEINER et al., 2004) Os corticosteróides potentes tópicos levam a repigmentação

dos pacientes, especialmente da face e tronco. Uma metanálise , realizada em 1988,

demonstrou que o uso do corticóides de classe 3 e 4 resultou em mais de 75% de

repigmentação em vitiligo segmentar e 55% daqueles com vitiligo generalizado

(NJOO et al., 1998). Podem ser alternados esquemas com corticóides de alta, média

e baixa potência (GRIMES, 2006). Não são necessários corticóides de alta potência,

pois são igualmente eficazes, porém com mais efeitos colaterais. Podem ser

utilizados corticóides intramusculares ou via oral, em curtos ciclos, porém com maior

ocorrência de eventos adversos (KOVACS, 1998; PASRICHA et al., 1993). Em um

estudo com 121 crianças, o tratamento com PUVASOL tópico se mostrou superior

ao uso de corticóide tópico de baixa potência (CAVALCANTI, 1998).

2.10.2 – Inibidores da Calcineurina

Tacrolimus e pimecrolimus são agentes inibidores da calcineurina e inibem a

ativação da célula T, portanto bloqueiam a produção e a liberação de citocinas pró-

inflamatórias. Os relatos do seu uso mostrando eficácia no vitiligo são desde 2002

(CAELLES et al., 2005; GRIMES et al., 2002; SMITH et al., 2002). Os melhores

resultados são observados na face e áreas fotoexpostas (SILVERBERG et al., 2004;

TRAVIS et al., 2003). Acredita-se também que o tacrolimus leve à redução da

supressão de TNF-alfa, o que colaboraria na repigmentação (GRIMES et al., 2002;

GRIMES, 2004). Foi comparado com clobetasol, corticóide de alta potência, em

termos de eficácia (LEPE et al., 2003). A vantagem é ser bem tolerado por crianças

76

e adultos, podendo ser usado por longo prazo sem os efeitos indesejáveis da

corticoterapia como atrofia e telangectasia (KANWAR et al., 2004). Pelo fato de ser

imunomodulador tópico e ter uma controversa e discutível associação com a

carcinogênese, convém utilizar um esquema rotatório a cada 6 meses. (GRIMES,

2006). A segurança a longo prazo é desconhecida (SMITH et al., 2002). A grande

maioria dos trabalhos é com o uso do tacrolimus, embora o pimecrolimus seja

mencionado em alguns relatos de casos (MAYORAL et al., 2003).

2.10.3 -Calcipotriol

Este pode ser usado em combinação com RUV-B de banda estreita, PUVA ou

exposição solar. Acredita-se que os melanócitos expressem receptores para 1-alfa-

25-dihidroxivitamina D3. Assim, o calcipotriol estimularia a melanogênese assim

como modificando a homeostase do cálcio nos pacientes com vitiligo

(GRIMES,2004). Embora outros autores não tenham encontrado benefício do

calcipotriol associado a PUVA, em pacientes com vitiligo (BAYSAL et al., 2003).

2.10.4 -Pseudocatalase

Os baixos níveis de catalase na epiderme e a teoria do estresse oxidativo

sustentaram o uso da pseudocatalase tópica. Um estudo feito com a climatoterapia e

exposição solar no Mar Morto, sabidamente benéfica para o vitiligo, demonstrou que

a pseudocatalase associada a climatoterapia era mais eficaz do que a

pseudocatalase ou a climatoterapia isoladamente (SCHALLREUTER et al.,2002).

Entretanto, outros autores não observaram eficácia no seu uso (PATEL, 2002).

77

2.10.5 -Kellina e RUV-A

A kelina é um agente mitótico e estimulador da melanogênese, que pode ser

associado a RUV-A. Foi usado de forma tópica com exposição à RUV-A, com

resultados comparáveis a PUVA sistêmica, embora seja um tratamento longo

(VALKOVA et al. 2003). Outros autores encontraram resultados favoráveis apenas

na face (DU TOIT, 2003).

2.10.6 -Aspirina

São conhecidos os efeitos antiinflamatórios da aspirina. Desta forma, foi

realizado ensaio clínico controlado com pacientes com vitiligo submetidos à terapia

oral com 300mg de aspirina por 12 semanas. O grupo tratado com aspirina

apresentou parada de progressão das lesões associado a repigmentação e

laboratorialmente, redução dos níveis de IL-1beta, IL-6,IL-8 e TNF-alfa, que se

encontravam elevadas nos pacientes de vitiligo no início do tratamento (ZAILAIE,

2005).

2.10.7 -Vitaminas

Pacientes com vitiligo são sensíveis aos agentes peroxidativos e radicais

livres. Desta forma, está indicada a terapia antioxidante oral, como por exemplo, com

ácido fólico, ácido ascórbico e vitamina B12. Embora os estudos apontem que uma

suplementação vitamínica seja útil para estabilizar o vitiligo, os trabalhos não são

controlados e os pacientes são orientados a exposição solar (GRIMES, 2006).

78

2.10.8 -Gingko-biloba

Devido ao seu poder antioxidante e considerando a teoria do stress oxidativo,

o extrato de gingko-biloba oral foi utilizado em pacientes com vitiligo, mostrando

repigmentação. Entretanto foram tratados pacientes com vitiligo localizado e com

pouca atividade de doença (PARSAD et al., 2003).

2.10.9 -Extrato de placenta

A melagenina é um extrato hidroalcoólico de placenta humana, cujo agente

ativo é a alfa-feto-proteína, usado na terapêutica do vitiligo em Cuba em 1970.

Embora os resultados iniciais dos pesquisadores cubanos tenham sido promissores,

eles não foram reproduzidos nos trabalhos realizados em outras partes do mundo

(NORDLUND et al., 1990 apud STEINER et al., 2004).

2.10.10 -Levamisole

A ação imunomodulatória do levamisole foi considerada na terapêutica do

vitiligo. É uma droga que suprime a resposta Th2 por inibir a IL-4, desviando o pólo

para uma resposta Th1. Embora um estudo aberto, não controlado, realizado em

1994 envolvendo pacientes com vitiligo localizado, tenha verificado que após 2-4

meses de uso de levamisole oral, 94% apresentaram repigmentação, um outro

estudo, desta vez, controlado foi realizado com resultados distintos (PASRICHA et

al., 1994; AGARWAL et al., 2005). Um trabalho duplo-cego, randomizado,

demonstrou falta de eficácia do levamisole em controlar a progressão do vitiligo

(AGARWAL et al., 2005) .

79

2.10.11 -Extrato de polypodium leucotomos

O extrato de polypodium leucotomos (PL) apresenta propriedades

fotoprotetoras e imunomodulatórias. Foi realizado um trabalho duplo-cego,

randomizado, placebo-controlado, com o extrato de PL utilizado de forma adjuvante

a PUVA. Observou-se normalização dos marcadores de ativação dos linfócitos T

com PUVA e extrato de PL, o que não foi confirmado apenas com a PUVA

isoladamente (REYES et al., 2003). Entretanto, são necessários outros estudos

para assegurar sua eficácia.

2.10.12 -Despigmentação

Para pacientes com poucas áreas de coloração normal, como ocorre em

alguns casos de vitiligo generalizado e extenso, pode ser usada a despigmentação

com monobenzil-éter-hidroquinona ou solução de fenol a 88% nas escassas áreas

de pele não acometida. (ZANINI et al.,2005)

2.10.13 -Tratamento cirúrgico do vitiligo

Indicado para vitiligo segmentar e lesões estáveis de vitiligo, não responsiva a

fototerapia ou aos agentes tópicos e imunomoduladores e (NJOO et al., 1999).

São utilizadas cinco técnicas: enxertos finos obtidos por dermátomos, enxerto

epidérmicos obtidos por bolha de sucção, minienxertos obtidos por punch,

suspensão de melanócitos em cultura e epiderme cultivada in vitro e transplante de

folículos pilosos (FALABELLA, 2006; NA et al., 1998; OLSSON et al., 1995). Os

resultados são favoráveis quando o procedimento é bem indicado. As complicações

constam de hiperpigmentação pós-inflamatória, cicatrizes, fenômeno de Koebner na

área doadora e infecção (FALABELLA, 2006).

80

2.11 – Tratamentos em estudo

2.11.1 - Piperina

O alcalóide da pimenta negra, piperina, estimula seletivamente in vitro, a

proliferação dos melanócitos em camundongos. Existem mais de 30 análogos de

piperina sintetizados, mas apenas metade apresenta esta ação. O tratamento com

piperina tópica e seus derivados levou a repigmentação dos camundongos,

confirmado por biópsia e imunoistoquímica. Mas esta droga ainda não foi usada em

humanos (RAMAN et al., 2003).

2.11.2 - Fenitoína

Foi avaliada a ação imunomodulatória deste anticonvulsivante que suprime a

ativação de linfócitos T, especialmente da célula T citotóxica, polariza a resposta

imune para o pólo Th2, aumenta a relação Th/Ts e em altas doses, inibe a liberação

de norepinefrina que se encontra aumentada nos pacientes com vitiligo. Mas são

necessários ensaios clínicos controlados (NAMAZI, 2005)

81

3. OBJETIVOS

3. 1 - Geral:

Analisar o efeito imunomodulador da Puvaterapia em pacientes com vitiligo não

segmentar

3. 2 - Específicos:

• Descrever os aspectos quantitativos e qualitativos das células T e a expressão do

antígeno cutâneo linfócitário (CLA) nos linfócitos do sangue periférico de

pacientes com vitiligo não segmentar e em atividade, comparando-os com

indivíduos saudáveis.

• Comparar a expressão do CLA (antígeno cutâneo associado ao linfócito) nos

linfócitos do sangue periférico antes e após 30 sessões de Puvaterapia em

pacientes com vitiligo não segmentar.

82

4. PACIENTES E MÉTODOS

4.1 - Desenho geral do estudo

Estudo experimental, ensaio clínico, do tipo “antes-depois”, comparando a

relação dos linfócitos T CD4+ e T CD8+ e a expressão do CLA por estes linfócitos do

sangue periférico de pacientes com vitiligo antes e após 30 sessões de PUVA.

Foram utilizados para comparação a expressão do CLA e relação CD4 e CD8 de 15

indivíduos controles (PEREIRA, 1995).

Esta tese faz parte da linha de pesquisa em Fotodermatologia, idealizada pelo

Professor Absalom Lima Filgueira, Coordenador do curso de Pós-Graduação em

Dermatologia da UFRJ e responsável pelo setor de Fotodermatologia há dezesseis

anos.

Durante o período de junho de 2005 a janeiro de 2006, foram 22 incluídos

pacientes com o diagnóstico clínico de vitiligo não segmentar, sem tratamento prévio

por três meses, que foram encaminhados para o ambulatório de Fotodermatologia

do Serviço de Dermatologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho.

A forma não segmentar compreendeu as formas: generalizada, acrofacial e

universal. Considerou-se como vitiligo em progressão o surgimento de novas lesões

nos últimos seis meses.

Estes pacientes foram informados da natureza da pesquisa e assinaram,

voluntariamente, o termo de consentimento livre e esclarecido, após o que foram

submetidos à coleta de sangue para citometria de fluxo e iniciaram a

fotoquimioterapia (PUVA). Após 30 sessões de PUVA, foram submetidos à nova

83

coleta de sangue. Foram incluídos 15 indivíduos controles que foram submetidos à

coleta de sangue no momento inicial do estudo, após assinatura do termo de

consentimento livre e esclarecido.

4.2- Pacientes e Controles

4.2.1 - Critérios de inclusão dos pacientes

Pacientes com vitiligo não segmentar, em progressão, não submetidos a tratamento

prévio por três meses, com idade superior a 18 anos, de ambos os sexos, com

exames laboratoriais e exame oftalmológico pré-fototerapia normais.

4.2.2- Critérios de exclusão dos pacientes

1. pacientes com vitiligo estável, isto é, sem o surgimento de novas manchas nos

últimos seis meses

2. pacientes submetidos a tratamento prévio para vitiligo por três meses

3. pacientes com outras dermatoses inflamatórias concomitantes como psoríase e

dermatite atópica, que pudessem interferir com a marcação dos linfócitos

circulantes

4. pacientes com incapacidade de comparecer ao hospital para realizar da PUVA,

por questões de deficiência física ou incapacidade de permanecer de pé ou

sentado na cabine de PUVA

5. gestantes

6. mulheres em período de lactação

7. pacientes menores de 18 anos de idade

84

4.2.3. – Critérios de inclusão dos controles

Indivíduos pareados por sexo e idade de acordo com os doentes e sem os critérios

de exclusão.

4.2.4- Critérios de exclusão dos controles

1. Doenças autoimunes

2. História pessoal ou familial de vitiligo

3. Dermatoses de natureza inflamatória, inclusive atópica

4. Gestantes

4.3 - Avaliação Inicial dos pacientes

Cada paciente foi submetido inicialmente a anamnese, exame clínico, exames

bioquímicos laboratoriais, exame oftalmológico e documentação fotográfica antes do

tratamento fotoquimioterápico (PUVA).

Anamnese : De cada paciente foram avaliados os seguintes dados: idade do

indivíduo, idade de início e tempo de evolução da doença, sexo, fototipo da pele,

cor, presença de doenças comumente associadas, tratamentos prévios e localização

das lesões. Todos os dados referentes à história clínica e exame físico foram

coletados e registrados em fichas individuais (vide ANEXO).

Exames bioquímicos : Hemograma completo, uréia, creatinina, VHS, glicemia, TSH,

T4 livre, anti-tireoperoxidase, transaminase glutâmica oxalacética (TGO),

transaminase glutâmica pirúvica (TGP), gama-glutamiltransferase (GGT) e fosfatase

alcalina.

Exame oftalmológico : constou de fundoscopia com lâmpada de fenda e acuidade

visual.

85

Documentação fotográfica : foram realizadas fotografias, com a mesma máquina

digital NIKON 7.1 megapixels, com mesmo padrão de iluminação fornecido pelo

ambiente, no pré-tratamento, com 15 sessões e ao final das 30 sessões propostas.

Foram realizadas fotografias extras para documentar eventos adversos.

4.4 -Acompanhamento dos pacientes

Os pacientes foram acompanhados semanalmente pela médica assistente.

Nas visitas semanais, a pesquisadora verificou o eritema da lesão e progrediu a

dose da radiação; registrou e tratou, consoante a necessidade, efeitos como prurido,

queimação, ardência, náuseas, vômitos, tonteiras e ressecamento da pele. Foram

analisados o grau de repigmentação (surgimento de ilhotas de máculas

normocrômicas ou hipercrômicas) e resposta clínica de cada paciente. Estes dados

foram registrados nas fichas dos pacientes no Setor de Fotodermatologia e na ficha

do estudo (ver anexo).

4.5 - Métodos

4.5.1 - Fotoquimioterapia (PUVA)

Os pacientes ingeriram o 8-metoxipsoraleno (OXSORALEN®), doado pelo

laboratório ICN, lotes 001/03 e 002/03, na dose de 0,6mg/kg/dia e duas horas após

foram submetido à RUV-A, com fotoproteção ocular (óculos com proteção para

RUVA) e proteção da genitália, (com roupa íntima). A dose inicial foi de 0,5J/cm2. O

paciente permaneceu no centro da cabine, expondo toda a área do corpo, exceto a

área genital e com proteção ocular, mantendo os braços em repouso, durante o

tempo estabelecido pela pesquisadora e controlado pela cabine. Foram asseguradas

as condições de segurança, como a utilização da proteção ocular durante a

exposição à radiação e após 18-24h da sessão. Além do uso de fotoprotetor FPS15

86

em loção nas áreas após a exposição a RUV-A. Os pacientes foram orientados

quanto a possíveis complicações como queimaduras, prurido e intolerância

gastrintestinal ao psoraleno.

Todos os pacientes fizeram duas sessões semanais até completarem 30

sessões.

O protocolo de aplicação de PUVA é o adotado no Setor de Fotodermatologia

do Departamento de Dermatologia/Faculdade de Medicina/Universidade Federal do

Rio de Janeiro/Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, de acordo com a

literatura (GRIMES, 1997; ZANOLLI, 2000).

As dosimetrias de RUV-A das unidades foram aferidas uma vez por semana,

de acordo com a orientação do fabricante de cada unidade, para assegurar a dose

de radiação.

A dose inicial de RUV-A foi de 0,5J/cm2, considerando o fototipo da

mancha de vitiligo (sempre tipo I). A progressão semanal da dose, pela

pesquisadora, foi de acordo com a intensidade do eritema. Nos casos sem eritema

na mancha, o aumento foi de 0,5J/cm2 por semana; na mácula com eritema rosado

claro ou rosa-chá, a dosagem era mantida e nos casos de eritema violáceo, a

dosagem era reduzida em 0,5J/cm2.

4.5.2 - A Citometria de Fluxo

4.5.2.1 - Coleta de sangue

Foi realizada a coleta de sangue dos pacientes, em jejum, no laboratório de

do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, entre as 7:30 e 9:00 da manhã,

com os cuidados universais. Foram colhidos 5ml de sangue de veia periférica, com

sistema VacutainerTM, sendo armazenado em tubos de coleta com EDTA,

87

homogeneizados delicadamente, mas sem agitá-los. Os tubos foram mantidos em

temperatura ambiente e protegidos da luz solar.

O material foi processado 2h após a coleta no Laboratório da DIP, localizado

no 3º andar do HUCFF/UFRJ, onde foi realizada a citometria de fluxo.

4.5.2.2- Marcadores utilizados

O anticorpo CD3-PERCP foi utilizado para marcação dos linfócitos T; o

anticorpo monoclonal anti-CLA-FITC (HECA-452) foi utilizado para determinar a

expressão do CLA e o anticorpo CD8-PE foi utilizado para marcação dos linfócitos T

CD8+. Estes três anticorpos monoclonais foram produzidos pelo laboratório BD

Biosciences PharmigenTM. Através da subtração dos linfócitos TCD3+ e TCD8+,

obtivemos a contagem dos linfócitos TCD4+. As células coradas foram submetidas

imediatamente a citometria de fluxo no aparelho BD Biosciences FACScanTM para

análise quantitativa e qualitativa da expressão do antígeno CLA.

4.5.2.3 - Protocolo para marcação de linfócitos de sangue per iférico

a) Identificar os tubos com caneta (paciente, marcadores)

b) Colocar, em cada tubo, 100 µl de sangue total, aplicando a amostra no fundo do

tubo de citometria.

c) Sobre a amostra de sangue, adicionar o (s) anticorpo (s) monoclonal (is)

adequados com uma ponteira, homogeneizando com a própria ponteira (geralmente

2-10 µl de anticorpo). Descartar a ponteira após o procedimento.

d) Após a adição dos anticorpos, incubar em temperatura ambiente

(25o C) pôr 20 a 30 minutos, protegendo da luz (incubar toda a estante numa gaveta

ou armário, ou envolver a estante em papel alumínio)

e) Após a incubação, adicionar solução hemolítica a cada tubo (1-2 ml por tubo).

Tampar os tubos e homogeneizar cada um no Vortex

88

f) Após a adição de solução hemolítica, incubar em temperatura ambiente (25o C)

por 20 minutos, protegendo da luz.

g) Centrifugar por 10 minutos a 300xg.

h) Descartar o sobrenadante de todos os tubos, conservando o depósito ("pellet")

onde estão os leucócitos.

l) ressuspender o "pellet" em 0,5 ml de solução fixadora (paraformaldeído a 1% em

tampão fosfato PBS).

As amostras marcadas foram submetidas à análise no citômetro de fluxo BD

Biosciences FACScanTM, utilizando-se o programa CELL QUESTTM.

FIGURA 4.1 – Anticorpos monoclonais utilizados no estudo

89

FIGURA 4.2. - Citômetro de fluxo BD Biosciences FACScanTM

4.6 - Cálculo amostral

Tendo como objetivo principal verificar se existiu diferença estatística na

variação da expressão do CLA entre dois momentos (antes e após o

tratamento), foram consideradas as seguintes suposições para o cálculo

amostral:

• Nível de significância de 5%

• Poder do teste estatístico de 80%

• Variação esperada relativamente grande (no mínimo de 50%)

De acordo com Jacob, o número de casos necessários foi de 20

pacientes com vitiligo e 15 controles.

90

4.7 - Análise Estatística

A análise estatística foi feita pelos seguintes métodos:

i) Para comparação dos dados quantitativos entre os pacientes e o grupo controle

(momento inicial do estudo) foi utilizado o teste de Mann-Whitney.

ii)Para comparação dos dados quantitativos pré e pós-tratamento, foi utilizado o

teste dos postos sinalizados de Wilcoxon.

4.8 - Critério de determinação de significância

Para que os resultados das comparações estatísticas fossem considerados

significativos, o valor de prova (p) deveria ser menor que 0,05. Foi considerado como

não significativo p maior que 0,1; como próximo ao significativo, p de 0,1 a 0,05 e

significativo, p valor menor que 0,05.

91

5. RESULTADOS

5.1 - Caracterização dos Pacientes

Inicialmente, o grupo constou de 22 pacientes, sendo dois casos excluídos

(abandono do projeto por razões não relacionadas ao estudo). A idade dos

pacientes variou de 24 a 64 anos (média de 42,3 anos+11,3anos), sendo 16 (80%)

do sexo feminino e 4 (20%) do sexo masculino. O tempo mediano de evolução da

doença foi de 15 anos.

TABELA 5.1 – Caracterização da amostra de acordo com idade, sexo e tempo de evolução do vitiligo

PACIENTE IDADE SEXO TEMPO DE DOENÇA (anos)

AML 25 F 5

ETN 64 F 10

VLSM 48 F 37

AESM 52 F 47

SML 34 F 27

FAM 31 M 6

MASM 62 F 50

EAS 58 F 4

FCM 24 F 14

AMSB 45 F 8

JAS 45 F 14

MFC 55 M 30

MMC 46 F 15

GGC 31 M 13

ALPS 40 F 34

SD 51 F 48

DCC 43 F 33

JMS 53 F 1

NDP 40 F 15

UDC 30 M 3

SRBES 35 F 15

LCNRB 45 F 10

92

Cinco (20%) pacientes apresentavam fototipo III de Fitzpatrick; 11 (50%),

fototipo IV de Fitzpatrick e 6 (30%), fototipo V.

Um paciente, ao exame oftalmológico (retinografia) apresentava áreas de

rarefação pigmentada de epitélio, o que foi interpretado com pigmentação das

células da retina que pode ocorrer em pacientes com vitiligo.

Cinco (22,7%) dos 22 pacientes apresentavam anticorpo antitireoideano

positivo, com títulos que variaram de 101 a 672, considerado reagente acima de 35.

Dos 22 pacientes, 14% (3) tinham doença autoimune associada, incluindo

doença tireoideana (2 casos) e diabetes mellitus (1 caso). Em relação à história

familial, 27% dos pacientes (6 casos) tinham história familial de vitiligo, sendo todos

em pacientes de 1º grau; 14% (3 casos) de alopecia areata, em pacientes de 1º

grau; 36% (8 casos) de diabetes mellitus e 31% (7casos) de doença tireoideana.

FIGURA 5.1. História familial (em %)

A duração do vitiligo foi menor que cinco anos em 3 casos, de 5 a 10 anos em

5 casos e maior que 10 anos em 14 pacientes.

HISTÓRIA FAMILIAL

6 3

8 7

0 2 4 6 8

10 12 14 16 18 20 22

vitiligo (27%) alopecia areata (14%) diabetes mellitus (36%) doença tiroideana (31%)

93

5.2 - Caracterização dos controles

O grupo controle pareado constou de 15 indivíduos com idade que variou de

24 a 65 anos (média de 44,7 anos+12,7anos), sendo 13 (86,6%) indivíduos do sexo

feminino e 2 (13,3%) do sexo masculino.

TABELA 5.2. Caracterização do grupo controle, por sexo e idade

Caracterização do Grupo Controle PACIENTE IDADE SEXO

LOA 30 M APSE 29 F LLSG 24 F

NS 52 F ZNS 35 F JVPV 59 M ACF 45 F LBSS 48 F EMVC 64 F CRL 48 F VLN 54 F RCA 43 F NSS 65 F

FMNPA 35 F AAPN 40 F

94

5.3- Acompanhamento clínico e resposta dos paciente s à PUVA

Os pacientes realizaram de 22 a 31 (mediana de 30) das 30 sessões

propostas, sendo a dose inicial de RUVA de 0,41J/cm2+0,05 J/cm2 e a dose total de

43J/cm2.

A repigmentação, observada através da documentação das ilhotas de

repigmentação, ocorreu com média de 9 sessões (vide tabela 5.3).

TABELA 5.3. Características da evolução dos pacientes submetido s à terapia PUVA. Início da repigmentação, dosagem cumulativa de RUV-A até r epigmentação, número de sessões do protocolo e dose cumulativa de RUV-A durante o proj eto . Variável N Média Desvio

Padrão

Mediana Mínimo Máximo

Tempo de doença (anos) 20 21,70 15,23 15 3 50

Repigmentação(sessões) 20 9,5 4,86 9 4 25

Quantidade de RUVA até

repigmentação (J/cm2)

20 11,37 20,48 6,93 2,84 97,5

Número de sessões 20 29,35 2,78 30 22 34

Dose acumulada de

RUVA (J/ cm2)

20 47,52 25,83 43,03 11,36 117

Nas lesões observadas detectamos ilhotas de repigmentação (repigmentação

perifolicular) nas lesões de vitiligo em 100% dos pacientes, embora em 3 pacientes

tenham sido observados alguns aspectos relevantes. Em 2 pacientes verificou-se o

surgimento de algumas lesões novas, mesmo com a repigmentação das lesões

iniciais. Ao final do estudo, foi observado que as lesões repigmentadas eram em

número e extensão superior às lesões novas. Uma das pacientes, com lesões

predominantemente nos membros inferiores, apresentou escassas ilhotas e

repigmentação mínima com o tratamento (ver fig 5.3.2).

95

LOCALIZAÇÃO DA LESÃO E GRAU DE REPIGMENTAÇÃOCOM A TERAPIA PUVA

18 1820

15

20 19 18

12

17

14 15

10

17

9 9 9

0

5

10

15

20

25

Face

Tronc

o

Mem

bros S

uperio

res

Mem

bros I

nferio

res

Mão

sPés

Genitá

lia

Região

Cervi

cal

Núm

ero

de P

acie

ntes

(n=

20)

Lesões

Repigmentação

FIGURA 5.3.1 Padrão de repigmentação perifolicular (ilhotas de repigmentação)

FIGURA 5.3.2 – Localização da lesão e grau de repigmentação com a terapia PUVA.

Presença de repigmentação perifolicular (ilhotas de repigmentação) em cada área acometida

após 30 sessões de terapia PUVA. Observa-se melhor resposta na face e pior nos pés.

96

B

Os efeitos colaterais observados durante o tratamento estão demonstrados

na figura 5.3.4.

A

FIGURA 5.3.3. Boa resposta à terapia PUVA na face e colo. A. antes

do tratamento; B. após 15 sessões; C. após 30 sessões; D. detalhe do

colo

B

C

D

C

97

FIGURA 5.3.4. Efeitos colaterais da terapia PUVA

EFEITOS COLATERAIS DA TERAPIA PUVA

14

2

65

2 2

17

15

13

3

1

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Náuse

as

Cefalé

ia

Tont

eira

Vômito

s

Diarréia

Queim

adura

s

Eritem

a Ace

ntuado

Resse

cam

ento

Prurid

o

Insô

nia

Depre

ssão

Núm

ero

de P

aci

ente

s (n

=20)

99

5.4 – Ilustração de casos

Alguns casos, pré e pós tratamento, foram documentados, a seguir:

A

FIGURA 5.4.1. Paciente com vitiligo no tronco e axilas, com 8 anos de doença (A e B), evoluiu com repigmentação completa das lesões após 30 sessões de fotoquimioterapia (C e D). Relação CD4/CD8 pré=3,0 e pós=3,6. Percentual de Linfócitos T-CLA+=3,8% sendo TCD8-CLA+=1,0% e após 30 sessões: 2,85% e 0,76% respectivamente. Queda de 25% dos linfócitos T-CLA+ circulantes e dos linfócitos TCD8-CLA+ após a terapia. A Citometria de fluxo está ilustrada na página seguinte.

A B

C D

100

FIGURA 5.4.2. Imunofenotipagem de linfócitos T. Gráficos da citometria de fluxo utilizando anticorpos monoclonais anti-CD8 PE e anti-CLA-FITC. Os linfócitos T CD8-CLA+ correspondem ao quadrante superior direito; os linfócitos T CD4-CLA+, ao quadrante superior esquerdo; os linfócitos T CD8+, à soma dos quadrantes superior e inferior direitos e os linfócitos T CD4+, à soma dos quadrantes superior e inferior esquerdos. Estes gráficos correspondem aos resultados da paciente da figura 5.4.1. que obteve repigmentação completa com o tratamento.

101

FIGURA 5.4.3. Paciente com vitiligo generalizado e que abandonou o protocolo. Antes (A, C

e E) e após 20 sessões de PUVA (B,D e E). Halo de hiperpigmentação marginal evidente

demonstrando resposta clínica. Relação CD4/CD8 pré=2,0 e pós=2,8. Percentual de

Linfócitos T-CLA+=2,0% sendo TCD8-CLA+=0,38% e após 20 sessões: 1,34% e 0,45%

A

C

E

B

F

D

102

FIGURA 5.4.4. Paciente com vitiligo generalizado, de 40 anos de idade, com 34 anos de doença, anti-TPO reagente (101UI/ml, sendo negativo até 35 UI/ml) evoluiu com surgimento de repigmentação perifolicular. As fotos da esquerda são pré tratamento e da direita, após. Os gráficos da citometria estão representados nas páginas seguintes.

Basal 15 sessões 30 sessões 1 ano

103

FIGURA 5.4.5. Imunofenotipagem de linfócitos T. Gráficos da citometria de fluxo utilizando anticorpos monoclonais anti-CD8 PE e anti-CLA-FITC. Os linfócitos T CD8-CLA+ correspondem ao quadrante superior direito; os linfócitos T CD4-CLA+, ao quadrante superior esquerdo; os linfócitos T CD8+, à soma dos quadrantes superior e inferior direitos e os linfócitos T CD4+, à soma dos quadrantes superior e inferior esquerdos. Estes gráficos correspondem aos resultados da paciente da figura 5.4.4. Paralelamente ao surgimento de repigmentação, houve aumento do percentual de linfócitos TCD4-CLA+ e redução dos linfócitos T CD8-CLA+

104

FIGURA 5.4.6. Paciente com vitiligo universal, de 31 anos de idade, com 6 anos de doença. Antes do início da doença (fotos A e D), correspondia ao fototipo III. Apresentou máculas levemente acastanhadas e ilhotas na face durante a fotoquimioterapia (B e E). Entretanto após o período de acompanhamento do protocolo, as lesões evoluíram (foto C) e após 6 meses, o tratamento foi suspenso. A dosagem de anticorpos antitireoperoxidase não foi reagente. O % de linfócitos T CD8-CLA+ inicial foi de 0,91 e elevou para 1,94, já o de CD4-CLA+ não apresentou grande variação (de 2,43% para 2,63%). A MFI dos linfócitos T CLA+ não alterou de forma importante.

A B C

D E

105

FIGURA 5.4.7. Paciente

de 45 anos de idade, com

14 anos de evolução de

vitiligo, com mãe e irmã

portadoras da doença,

apresentou ilhotas de

repigmentação em todas

as lesões, inclusive nas

extremidades (fotos pré:

A,C,E e fotos pós: B,D,F).

Previamente, no dorso do

antebraço (foto E),

realizou tatuagem para

camuflar a lesão.

A B

C D

E F

106

FIGURA 5.4.8. Imunofenotipagem dos linfócitos T. Gráficos da citometria de fluxo da

paciente da figura 5.4.7. Ela apresentou queda de 60% dos linfócitos T CD8-CLA+ e redução

dos linfócitos TCD4-CLA+ de 2,12 para 1,89.

107

FIGURA 5.4.9. Fotos ilustrativas de algumas pacientes mostrando boa resposta clínica

no colo e face. As fotos A,D,G correspondem ao momento inicial; as fotos B,E,H após

30 sessões e a foto C,F,I ao resultado após o protocolo.

A B. 30 sessões C . 6 m eses

D E . 30 sessões F . 1 ano

G H. 30 sessões I.1 ano

108

FIGURA 5.4.10. Dificuldade de repigmentação. Fotos ilustrativas de algumas pacientes

mostrando dificuldade de repigmentação das extremidades. Embora tenha sido observado

um leve eritema nas máculas das mãos e halo de pigmentação nas lesões das pernas.

Pré Pós

Pré Pós

109

FIGURA 5.4.11 Resultados obtidos na citometria de fluxo. O gráfic o A ilustra a janela ( gate ) com a população celular de interesse (linfócitos). Em B pode-se ver a imagem obtida após calibração (células não marcadas). Nos gráficos C e D estão representadas a distribuição das células marcadas com o anticorpo C D3. Em E podem-se ver as células marcadas com anti corpo anti-CD8 e anti-CLA, após compensação. Em F, vemos o controle de células sem anticorpo monoclonal.

110

5.5. COMPARAÇÃO ENTRE OS DOENTES DE VITILIGO E OS I NDIVÍDUOS

SAUDÁVEIS (MOMENTO INICIAL DO ESTUDO)

5.5.1 ANÁLISE DOS MARCADORES CD4 E CD8 DOS LINFÓCITOS

PERIFÉRICOS DOS PACIENTES E DOS CONTROLES

Não foi observada diferença significativa entre a relação CD4/CD8 entre os

pacientes e os controles (p=0,97), ao nível descritivo do teste de Mann-Whiteny.

TABELA 5.5.1.3 – RELAÇÃO CD4/CD8 dos pacientes e controles Variável Grupo n Média DP Mediana Mínimo Máximo p valor a

CD4/CD8 paciente 22 1,96 0,73 1,823 0,807 4,048controle 15 2,09 1,08 1,741 1,098 5,382

0,97

RELAÇÃO CD4/CD8 NOS PACIENTES COM VITILIGOE NOS INDIVÍDUOS CONTROLE

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Paciente Controle

Rel

ação

CD

4/C

D8

FIGURA 5.5.1.3 Gráfico de barras demonstrando a relação CD4/CD8 dos pacientes e indivíduos controles. A análise estatística indicou que não houve diferença significativa entre os dois grupos.

111

5.5.2 COMPARAÇÃO DOS LINFÓCITOS T-CLA + (CD3-CLA+) ENTRE OS

PACIENTES E O GRUPO CONTROLE NO MOMENTO INICIAL DO

ESTUDO

Em termos percentuais da população linfocitária:

Não foi observada diferença significativa entre o percentual circulante de linfócitos T-

CLA+ entre os pacientes e os controles (p=0,19), ao nível descritivo do teste de

Mann-Whiteny.

TABELA 5.5.2.1. Percentual dos linfócitos T CD3-CLA+ dos pacientes e controles

Variável Grupo n Média DP Mediana Mínimo Máximo p valor a

CD3/CLA % paciente 22 3,30 1,71 3,075 1,08 6,51controle 15 4,16 2,00 3,54 1,92 8,66

0,19

PERCENTUAL DE LINFÓCITOS T CD3 +- CLA+ PERIFÉRICOS NOS DOENTES DE VITILIGO

E NOS INDIVÍDUOS CONTROLE

0

1

2

3

4

5

6

7

Paciente Controle

% d

e lin

fóci

tos

T C

D3

+ - C

LA+

FIGURA 5.5.2.1. Gráfico de barras demonstrando o percentual dos linfócitos T CD3-CLA+ periféricos dos pacientes e controles. A análise estatística indicou que não houve diferença significativa entre os dois grupos.

112

Análise da Intensidade Média de Fluorescência (MFI) da população de

linfócitos T-CLA +

Não foi observada diferença significativa entre a Intensidade Média de

Fluorescência (MFI) da população de linfócitos TCD3-CLA+ periféricos entre os

pacientes e os controles (p=0,23), ao nível descritivo do teste de Mann-Whiteny.

TABELA 5.5.2.2. Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD3-CLA+ dos pacientes e controles


CD3/CLA MFI paciente 22 141,41 60,25 137,265 57,81 285,54controle 15 113,88 42,09 114,42 41,09 174,41

0,23

INTENSIDADE MÉDIA DE FLUORESCÊNCIA (MFI) DOS LINFÓCITOS T CD3+- CLA+ NOS DOENTES DE VITILIGO E

NOS INDIVÍDUOS CONTROLE

0

50

100

150

200

Paciente Controle

MF

I dos

linf

ócito

s T

CD

3+ -

CLA

+

FIGURA 5.5.2.2. Gráfico de barras demonstrando a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD3-CLA+ dos pacientes e controles. A análise estatística indicou que não houve diferença significativa entre os dois grupos.

113

5.5.3 COMPARAÇÃO DOS LINFÓCITOS T CD4-CLA + ENTRE OS

PACIENTES E O GRUPO CONTROLE


Não foi observada diferença significativa entre o percentual circulante de linfócitos

TCD4-CLA+ entre os pacientes e os controles (p=0,39), ao nível descritivo do teste

de Mann-Whiteny.

TABELA 5.5.3.1 – Percentual dos linfócitos T CD4-CLA+ dos pacientes e controles Variável Grupo n Média DP Mediana Mínimo Máximo p valor a


0,39

PERCENTUAL DE LINFÓCITOS T CD4 + - CLA+

PERIFÉRICOS NOS DOENTES DE VITILIGO E NOS INDIVÍDUOS CONTROLE

0

1

2

3

4

5

6

Paciente ControlePer

cent

ual d

e lin

fóci

tos

T C

D4

+ - C

LA+

FIGURA 5.5.3.1. Gráfico de barras demonstrando o percentual de linfócitos T CD4-CLA+ periféricos dos pacientes e controles. A análise estatística indicou que não houve diferença significativa entre os dois grupos.

114


linfócitos TCD4-CLA +

Não foi observada diferença significativa entre a Intensidade Média de Fluorescência

(MFI) da população de linfócitos TCD4-CLA+ periféricos entre os pacientes e os

controles (p=0,74), ao nível descritivo do teste de Mann-Whiteny.

TABELA 5.5.3.2. Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD4-CLA+ periféricos dos pacientes e controles



0,75

INTENSIDADE MÉDIA DE FLUORECÊNCIA (MFI) DOS LINFÓCITOS T CD4+ - CLA+ NOS DOENTES DE VITILIGO E

NOS INDIVÍDUOS CONTROLE

0

20

40

60

80

100

120

Paciente Controle

MF

I dos

linf

ócito

s T

CD

4+ -

CLA

+

FIGURA 5.5.3.2. Gráfico de barras demonstrando a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD4-CLA+ dos pacientes e controles. A análise estatística indicou que não houve diferença significativa entre os dois grupos.

115

5.5.4 COMPARAÇÃO DOS LINFÓCITOS T CD8-CLA + ENTRE OS

PACIENTES E O GRUPO CONTROLE


Observou-se que o grupo de pacientes apresentou níveis percentuais de linfócitos

TCD8-CLA+ pré-tratamento significativamente menor que o grupo controle

(p=0,008), ao nível descritivo do teste de Mann-Whiteny.

TABELA 5.5.4.1. Percentual dos linfócitos T CD8-CLA+ dos pacientes e controles Variável Grupo n Média DP Mediana Mínimo Máximo p valor a


0,008

PERCENTUAL DE LINFÓCITOS T CD8 + - CLA+ PERIFÉRICOS NOS DOENTES DE VITILIGO E NOS INDIVÍDUOS CONTROLE

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Paciente Controle

% d

e lin

fóci

tos

T C

D8

+ - C

LA+

FIGURA 5.5.4.1. Gráfico de barras demonstrando o percentual de linfócitos T CD8-CLA+ periféricos dos pacientes e controles. A análise estatística indicou que os pacientes apresentaram níveis percentuais de linfócitos TCD8-CLA+ pré-tratamento significativamente menor que o grupo controle (p=0,008).

116



Observou-se que os linfócitos TCD8-CLA+ pré-tratamento dos pacientes

apresentaram Intensidade Média de Fluorescência (MFI) significativamente maior

que no grupo controle (p=0,028), ao nível descritivo do teste de Mann-Whiteny.

TABELA 5.5.4.2. Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD8-CLA+ periféricos dos pacientes e controles



0,028

INTENSIDADE MÉDIA DE FLUORESCÊNCIA (MFI) DOS LINFÓCITOS T CD8+- CLA+ NOS DOENTES DE VITILIGO

E NOS INDIVÍDUOS CONTROLE

0

20

40

60

80

100

120

Paciente Controle

MF

I dos

linf

ócito

s T

CD

8+ -

CLA

+

FIGURA 5.5.4.2. Gráfico de barras demonstrando a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD8-CLA+ dos pacientes e controles. A análise estatística indicou que linfócitos TCD8-CLA+ dos pacientes pré-tratamento apresentaram Intensidade Média de Fluorescência (MFI) significativamente maior que os do grupo controle (p=0,028).

117

5.6 COMPARAÇÃO ENTRE OS DOENTES DE VITILIGO ANTES E DEPOIS DA

TERAPIA PUVA

5.6.1 Análise dos marcadores CD4 e CD8 dos linfócit os T periféricos

Não foi observada diferença significativa entre a relação CD4/CD8 entre os

pacientes antes e após a fotoquimioterapia, (p=0,59), ao nível descritivo do teste dos

postos sinalizados de Wilcoxon.

TABELA 5.6.1.1. RELAÇÃO CD4/CD8 dos pacientes antes e após a terapia PUVA Variável n Média DP Mediana Mínimo Máximo p valor a

CD4/CD8 pré 20 1,92 0,75 1,761 0,807 4,048CD4/CD8 pós 20 1,96 0,72 1,8125 0,962 3,85

Delta CD4/CD8 20 0,04 0,31 0,046 -0,513 0,6590,59

RELAÇÃO CD4/CD8 ANTES E APÓS A TERAPIA PUVA

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

CD4/CD8 pré CD4/CD8 pós

Rel

ação

CD

4/C

D8

FIGURA 5.6.1.1. Gráfico de barras demonstrando a relação CD4/CD8 dos pacientes antes e após o tratamento. A análise estatística indicou que não houve diferença significativa entre os dois momentos.

118

5.6.2. COMPARAÇÃO DOS LINFÓCITOS T-CLA +(CD3-CLA+) ENTRE OS

PACIENTES DE VITILIGO PRÉ E PÓS FOTOQUIMIOTERAPIA ( PUVA)


Não foi observada diferença significativa entre o percentual circulante de linfócitos T-

CLA+ entre os doentes antes e após o tratamento (p=0,45), ao nível descritivo do

teste dos postos sinalizados de Wilcoxon. Neste caso o delta se aproxima do valor

zero. Quando o delta é menor do que zero (pós-pré) indica queda daquele índice.

Embora ele tenha sido de -0,12, não houve significância estatística.

TABELA 5.6.1.2. Percentual dos linfócitos T CD3-CLA+ dos pacientes pré e pós tratamento

Variável n Média DP Mediana Mínimo Máximo p valor a

119


linfócitos T-CLA +


(MFI) da população de linfócitos TCD3-CLA+ periféricos entre os doentes antes e

após o tratamento (p=0,89), ao nível descritivo do teste dos postos sinalizados de

Wilcoxon.

TABELA 5.6.1.3. Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD3-CLA+ periféricos dos pacientes antes e após o tratamento


CD3/CLA MFI pré 20 144,75 61,03 137,265 57,81 285,54CD3/CLA MFI pós 20 142,31 52,89 144,34 63,21 238,19

Delta CD3/CLA MFI 20 -2,44 39,33 0,995 -103,04 50,850,89

INTENSIDADE MÉDIA DE FLUORESCÊNCIA (MFI) DOS

LINFÓCITOS T CD3-CLA + ANTES E APÓS A TERAPIA PUVA

0

50

100

150

200

CD3/CLA MFI pré CD3/CLA MFI pós

MF

I dos

Lin

fóci

tos

TC

D43

-CLA

+

FIGURA 5.6.1.3. Gráfico de barras demonstrando a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) dos linfócitos T CD3-CLA+ dos pacientes antes e após o tramento. A análise estatística indicou que não houve diferença significativa entre os dois momentos.

120

5.6.3. COMPARAÇÃO DOS LINFÓCITOS T CD4-CLA + ENTRE OS PACIENTES DE

VITILIGO PRÉ E PÓS FOTOQUIMIOTERAPIA (PUVA)



TCD4-CLA+ dos doentes antes e após o tratamento (p=0,36), ao nível descritivo do

teste dos postos sinalizados de Wilcoxon.

TABELA 5.6.3.1. Percentual circulante de linfócitos TCD4-CLA+ dos pacientes antes e após o tratamento


CD4/CLA % pré 20 2,24 1,21 2,19 0,6 4,58CD4/CLA % pós 20 2,23 1,90 1,825 0,33 8,72

Delta CD4/CLA % 20 -0,01 1,57 -0,115 -2,29 5,410,36

PRECENTUAL DOS LINFÓCITOS T CD4 - CLA +

ANTES E APÓS A TERAPIA PUVA

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

CD4/CLA % pré CD4/CLA % pós

% L

infó

cito

s T

CD

4 -

CLA

+

FIGURA 5.6.3.1. Gráfico de barras demonstrando o percentual circulante de linfócitos TCD4-CLA+ dos pacientes antes e após o tratamento. A análise estatística indicou que não houve diferença significativa entre os dois momentos.

121

Análise da Intensidade Média de Fluorescência (MFI) da população de linfócitos

TCD4-CLA+


(MFI) da população de linfócitos TCD4-CLA+ periféricos dos doentes, antes e após o

tratamento (p=0,38), ao nível descritivo do teste dos postos sinalizados de Wilcoxon.




Delta CD4/CLA MFI 20 -7,63 30,37 -2,82 -95,99 42,450,38



0

20

40

60

80

100

120


MF

I dos

Lin

fóci

tos

TC

D4-

CLA

+

FIGURA 5.6.3.2. Gráfico de barras demonstrando a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) da população de linfócitos TCD4-CLA+ dos pacientes antes e após o tratamento. A análise estatística indicou que não houve diferença significativa entre os dois momentos.

122

5.6.4. COMPARAÇÃO DOS LINFÓCITOS T CD8-CLA + ENTRE OS PACIENTES

DE VITILIGO PRÉ E PÓS FOTOQUIMIOTERAPIA (PUVA)



TCD8-CLA+ dos doentes, antes e após o tratamento (p=0,12), ao nível descritivo do

teste dos postos sinalizados de Wilcoxon. Neste caso, porém, o delta se aproxima

do valor zero. Quando o delta é menor do que zero (pós-pré) indica queda daquele

índice. Embora ele tenha sido de -0,12, não houve significância estatística.

TABELA 5.6.4.1. Percentual circulante de linfócitos TCD8-CLA+ dos doentes, antes e após o tratamento.


CD8/CLA % pré 20 0,97 0,55 0,88 0,26 2,31CD8/CLA % pós 20 0,86 0,53 0,755 0,19 2,06

Delta CD8/CLA % 20 -0,12 0,65 -0,21 -1,32 1,270,12

PERCENTUAL DOS LINFÓCITOS T CD8-CLA +

ANTES E APÓS A TERAPIA PUVA

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

CD8/CLA % pré CD8/CLA % pós

% L

infó

cito

s T

CD

8-C

LA+

FIGURA 5.6.4.1 Gráfico de barras demonstrando o Percentual circulante de linfócitos TCD8-CLA+ dos doentes, antes e após o tratamento. A análise estatística indicou que não houve diferença significativa entre os dois momentos.

123




(MFI) da população de linfócitos TCD8-CLA+ periféricos dos doentes, antes e após o

tratamento (p=0,40), ao nível descritivo do teste dos postos sinalizados de Wilcoxon.




Delta CD8/CLA MFI 20 5,19 30,98 3,655 -78,35 50,090,4



0

20

40

60

80

100

120

140


% M

FI d

os L

infó

cito

s T

CD

8-C

LA+

FIGURA 5.6.4.2. Gráfico de barras demonstrando a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) da população de linfócitos TCD8-CLA+ dos pacientes antes e após o tratamento. Não houve diferença significativa entre os dois momentos.

124

5 DISCUSSÃO

A patogenia do vitiligo é complexa e multifatorial. Embora evidências mais

atuais sugiram que a imunidade celular, em especial a célula T citotóxica,

desempenhe um papel importante no surgimento da doença em detrimento das

premissas anteriores, quando se admitia que o anticorpo contra o melanócito era o

principal “vilão” contra a célula pigmentada, muitas etapas do processo de destruição

melanocítica ainda não são conhecidas (GUNDUZ, 2004; SEHGAL, 2005).

Muitos são os fenômenos imunológicos descritos, mas não se definiram, até

o momento, quais seriam apenas epifenômenos e qual seria o principal determinante

da doença. O conhecimento da patogenia da doença é fundamental para se

estabelecer a conduta terapêutica adequada, especialmente em se tratando de uma

doença freqüente e com inúmeras implicações psicossociais, na qual os avanços

podem beneficiar grande número de pessoas.

A terapia PUVA é um tratamento, há muito conhecido e bem estabelecido,

para o vitiligo. Algumas ações da PUVA são conhecidas, outras estão por serem

descobertas. A análise de como a fotoquimioterapia leva à repigmentação dos

pacientes pode contribuir para o entendimento do mecanismo de doença do vitiligo.

Este trabalho estudou o papel da célula T circulante, dotada de capacidade

de entrar e sair da pele em condições basais, a célula T-CLA+, que corresponde a

98% das células T da pele em indivíduos normais e que é atraída para o parênquima

cutâneo em dermatoses inflamatórias (CLARK, 2006; ROBERT,1999).

125

Os estudos que versam sobre o vitiligo geram resultados controversos entre

si, talvez por metodologia inadequada ou por agrupar, em uma mesma amostra,

pacientes de vitiligo em progressão e vitiligo estável, lesões focais e lesões

generalizadas, ou ainda, por realização de biópsias em locais não padronizados. Há

que se considerar ainda a variabilidade genética entre as diferentes etnias.

Há que se considerar, também, a distinção patogenética entre o vitiligo

segmentar, não estudado neste trabalho, e as formas de vitiligo não segmentar.

Desta forma, o estudo realizado foi desenhado de forma a evitar, na medida

do possível, vieses. Foi reunido um grupo de pacientes com vitiligo não segmentar,

com lesões simétricas, em progressão, sem outras dermatoses, sem terapias

imunossupressoras ou imunomoduladoras de qualquer natureza, não submetidos a

tratamento prévio por seis meses, sendo que este grupo foi comparado com outro

pareado por sexo e idade.

Talvez o grupo controle ideal fosse o de pacientes com lesões

generalizadas, em progressão, simétricas, sem tratamento para o vitiligo. Neste caso

faríamos a mesma análise dos pacientes tratados após o tempo determinado para o

tratamento, com o objetivo de checar se as alterações linfócitárias encontradas

seriam decorrentes da história natural da doença. Entretanto, por questões éticas,

não poderíamos deixar pacientes sem tratamento.

A literatura mostra que não há variação da prevalência de vitiligo entre

mulheres e homens, embora alguns autores tenham encontrado freqüência maior

entre as mulheres. Já foi descrito que a maior procura da mulher ao médico poderia

gerar uma maior freqüência. No nosso estudo, houve maior freqüência entre as

mulheres, talvez por que elas tenham maior vontade e/ou interesse em obter

126

melhora das manchas. A demanda dos pacientes foi espontânea, de forma que não

houve busca ativa dos casos.

Outro aspecto observado foi uma rápida resposta dos pacientes ao

tratamento. Embora o objetivo deste trabalho não seja avaliar a eficácia da

terapêutica, uma vez que ela já está bem estabelecida para o vitiligo, há que se

considerar o grau de resposta obtido em 100% dos pacientes em curto tempo de

tratamento (início da repigmentação com média de nove sessões). Poderia a relação

médico-paciente abreviar o tempo de tratamento? Se fenômenos psicossociais

podem influenciar o sistema imune, é possível que intervenções psicossociais

possam alterar a função imunológica (O´LEARY, 1990).

A expansão das células T CD4+ circulantes é um fenômeno comum em várias

doenças auto-imunes e a relação CD4/CD8 é regulada por uma série de

mecanismos homeostáticos. Uma perturbação nesse sistema finamente regulado

pode levar a uma alteração auto-imune como o vitiligo. (D’AMELIO, 1990).

Ao estudar a presença e variação da célula T na patogenia do vitiligo, autores

encontraram células T CD4+ e CD8+ no infiltrado linfocitário nas áreas marginais das

lesões de vitiligo e outros encontraram variações destes linfócitos no sangue

periférico (ABDEL-NASSER, 1992; AHN, 1994; AL BADRI, 1993; D´AMELIO et al,

1990; GUNDUZ, 2004; LE POOLE, 1997; MAHMOUD, 1998; PARK, 1992;

SOUBIRAN et al, 1985; VAN DEN WIJNGAARD, 2000).

Para análise das características imunofenotípicas das subpopulações de

linfócitos T circulantes CD4+ e CD8+ e determinação da relação CD4/CD8, utilizamos

o grupo controle como valor de referência normal. Rotineiramente analisa-se a

relação CD4/CD8 dentro de valores de referência internacionais fornecidos pelo

laboratório. Uma vez que não há um padrão nacional, consensual, de análise destes

127

linfócitos, os do grupo controle foram utilizados como parâmetro de comparação.

Um estudo brasileiro encontrou, entre indivíduos sadios, relação CD4/CD8 de 1,73

com variação de +0,53 (SOUZA, 2003). Estes valores foram próximos aos

encontrados no nosso grupo controle, onde a mediana da relação CD4/CD8 foi de

1,74 com desvio padrão de 1,08.

A relação entre os linfócitos TCD4+ e T CD8+ periféricos, os chamados T

helper/inducer e T supressor/citotóxico, respectivamente, é utilizada na avaliação da

regulação imune e estão quantitativamente alteradas em muitas doenças com

disfunção imunológica como, por exemplo, na avaliação do grau de imunodeficiência

em pacientes com SIDA, nos quais ocorre depleção dos linfócitos T CD4+ e no

acompanhamento de pacientes com micose fungóide, dermatose neoplásica-reativa

em que há expansão de linfóticos CD4+ , nos quais a elevação desta relação indica

piora clínica (BACAL, 2003). Ao analisarmos a relação CD4/CD8 nos pacientes de

vitiligo e seu comportamento frente à terapia PUVA, tentamos inferir algum caráter

prognóstico, admitindo ser a célula T CD8+ a principal causadora da destruição

citotóxica dos melanócitos. Entretanto, este fenômeno não foi observado, já que a

relação CD4/CD8 não se modificou com a PUVA a despeito da repigmentação e do

bom padrão de resposta clínica observado na grande maioria dos pacientes.

No caso do vitiligo, esta relação foi analisada para se estudar a patogenia

da doença e foi descrita como elevada em pacientes de vitiligo estável (D´AMELIO et

al, 1990; SOUBIRAN et al, 1985) e normal ou reduzida em alguns dos pacientes

com vitiligo ativo (MAHMOUD et al., 1998; HANN et al. 1993). Alguns autores

incluíram, em um mesmo grupo de estudo, pacientes em momentos distintos de

atividade de doença e encontraram valores da relação CD4/CD8 normais ou

reduzidos (ABDEL-NASSER, 1992; GUNDUZ, 2004). Assim alguns autores

128

encontraram resultados controversos devido às distintas características do grupo de

pacientes estudado. Além disso, os estudos prévios foram pontuais, isto é, avaliaram

os linfócitos T circulantes em momentos isolados da doença. Nosso estudo avaliou o

efeito de uma intervenção (fotoquimioterapia PUVA) sobre estes linfócitos. A relação

CD4/CD8 encontrada foi normal (1,96+0,73) nos pacientes com vitiligo ativo

estudados, não apresentando diferença estatística com o grupo controle (2,08+1,08).

Estes achados estão de acordo com alguns autores (ABDEL-NASSER, 1992;

MAHMOUD, 1998; PARK, 1992). A fotoquimioterapia não alterou estes valores

durante 30 sessões. Este tempo de tratamento foi suficiente para induzir maior ou

menor grau de repigmentação, não apenas na face (que repigmenta com mais

facilidade, mas inclusive nas mãos e nos pés) em 100% dos pacientes, mas não

alterou seus linfócitos T CD4+ e CD8+ circulantes.

Estes resultados talvez não sejam os melhores parâmetros a serem

analisados, porque todos os linfócitos foram estudados e não apenas o subgrupo

específico de linfócitos circulantes, CLA+, que tem a capacidade de entrar na pele.

Desta forma, resolvemos estudar a subpopulação linfocitária, que tem a capacidade

de circular entre o sangue e a pele, e que sofre redução em pacientes com psoríase

submetidos à fototerapia com RUV-B (SIGMUNDSDOTTIR et al, 2003).

Para restaurar a tolerância nas doenças auto-imunes existem três formas:

induzir anergia (tornando a célula T não reativa ao auto-antígeno), deletar células T

autoreativas, através da apoptose, ou induzir células imunoregulatórias (Tregs)

específicas para os autoantígenos alvos das células T patogênicas (LEE,2004).

Assim, terapias que levassem a anergia das células T inflamatórias ou reduzissem o

recrutamento das células T para a pele seriam uma promessa futura de sucesso

para o tratamento do vitiligo (SEHGAL,2005).

129

Desta forma, tendo em vista que a fototerapia é capaz de, em outras

dermatoses, reduzir a subpopulação sanguínea de linfócitos T recrutados para a

pele, isto foi estudado no vitiligo. A indução da apoptose dos linfócitos T pela PUVA

já foi demonstrada na pele de pacientes com micose fungóide (MANHAES, 2004).

Sabemos que menos que 5% das células T de sítio extracutâneos são CLA+

(CLARK, 2006). Não foram observadas no nosso estudo diferenças significativas

entre o valor das células T CLA+ no sangue periférico dos pacientes com vitiligo e

dos controles, seja de forma quantitativa (3,3%+1,71 dos linfócitos circulantes dos

doentes e 4,2%+ 2,0 dos linfócitos periféricos dos controles), como quantitativa

(MFI=141,41 e MFI=113,88, respectivamente).

Alguns autores encontraram não apenas no sangue periférico de pacientes

com vitiligo ativo linfócitos T-CD8+CLA+ citotóxicos, dirigidos contra antígenos de

diferenciação melanocítica, como também in situ, através de estudos de

imunoistoquímica da pele acometida (LE GAL, 2001; MANDELCORN-MONSON,

2003; MANTOVANI, 2003; OGG, 1998; VAN DEN WIJNGAARD, 2000). Foi definido

um papel consistente das células T melanócito-específicas no vitiligo, sendo a

imunidade celular dependente de TCD8+ um possível alvo de intervenção

terapêutica. (MANDELCORN-MONSON, 2003; MANTOVANI, 2003; OGG, 1998).

Justifica-se desta forma o estudo desta subpopulação celular.

Nossos resultados evidenciaram que o grupo de pacientes apresentou níveis

percentuais de linfócitos TCD8-CLA+ pré-tratamento significativamente menor

(0,96% +0,5) que o grupo controle (1,36%+0,5 com p valor=0,008). Este dado está

de acordo com os resultados dos autores citados, pois mesmo sendo um população

celular minoritária no sangue dos doentes e nos indivíduos controles, devido ao seu

comportamento migratório entre o sangue e a pele, eles possivelmente estão

130

direcionados para o tecido cutâneo. Uma vez que a intensidade média de

fluorescência (MFI) da população celular estudada estima a quantidade de

antígenos expressos na sua superfície, ela seria uma medida do número de

moléculas CLA e CD8 que estão presentes naquele momento. É interessante poder

estimar o grau de expressão do antígeno através da imunofluorescência. Foi

observado que os linfócitos TCD8-CLA+ dos doentes antes do tratamento

apresentavam MFI significativamente maior que no grupo controle (p=0,028), o que

contribui para sugerir o fato de que as células T CD8-CLA+, que expressam o CLA

de forma intensa, estão sendo realmente atraídas para o sítio de destruição

melanocítica, atravessando o vaso e se dirigindo para a pele. A fotoquimioterapia

não alterou de forma significativa, durante o período estudado, no sangue periférico,

o perfil de linfócitos TCD8-CLA+. Embora tenha ocorrido uma queda, em torno de

12% (de 0,96%+0,5 para 0,86%+0,5), ela não foi estatisticamente significativa.

Como em relação à célula T CD4-CLA+, não foi observada variação alguma (de

2,24%+1,21para 2,23%+1,9) e como houve redução, embora sem significância

estatística, das células T-CLA+(CD3-CLA+) em torno de 12% (de 3,21%+1,6 para

3,09%+2,1), na mesma magnitude das células T CD8-CLA+ , acreditamos que a

redução nos linfócitos T tenham ocorrido devido às custas da ação sobre os

linfócitos T CD8-CLA+. Estas populações celulares são minoritárias no sangue

periférico e acreditamos não ter encontrado relevância estatística dos parâmetros

analisados após a intervenção clínica porque talvez a principal ação da PUVA seja a

redução das células T na pele e isto não possa ser mensurado através do sangue.

Outra possibilidade, ainda que improvável, é o fato de que o modo de ação da PUVA

não seja este nos pacientes de vitiligo, ou ainda, a célula T CD8-CLA+ não

desempenhe um papel patogênico determinante na doença, ainda que tenha sido

131

descrito por outros autores (MANDELCORN-MONSON, 2003; MANTOVANI, 2003;

MATSUMURA, 2004; OGG, 1998; ONGENAE, 2003). A metodologia realizada para

imunofenotipagem dos linfócitos é universalmente aceita e foi realizada de acordo

com os protocolos de citometria de fluxo. Outras possibilidades a serem

consideradas são: o número de pacientes estudados, que talvez seja inferior ao

necessário para se estabelecer uma inferência ou ainda, o tempo de tratamento

estabelecido não tenha sido suficiente para gerar esta imunomodulação. Isto parece

ser improvável uma vez que a ação da PUVA sobre a imunidade celular é verificada

em 48h após a sessão de PUVA (REE, 1982).

Em relação às células TCD4-CLA+, não foi observada diferença significativa

entre o percentual circulante dos pacientes e dos controles (p=0,39), nem na

Intensidade Média de Fluorescência (p=0,74). Estes dados são originais e estão de

acordo com o esperado uma vez que os linfócitos T CD4+ circulantes encontram-se

elevados apenas nos pacientes com vitiligo estável, sem lesões em progressão

(D´AMELIO, 1990; SOUBIRAN, 1985). Era de se esperar, com a terapia PUVA e

consoante a melhora clínica, uma elevação dos linfócitos T CD4+ e da relação

CD4/CD8. Embora ela tenha elevado, tal elevação foi discreta (de 1,92 para 1,96),

sem valor estatístico (p=0,59). Desta forma sugerimos que, diferentemente do que

ocorre em outras dermatoses, a aferição dos linfócitos totais TCD4+ e TCD8+ para o

prognóstico e acompanhamento dos pacientes de vitiligo não seja o ideal.

Outro efeito observado no tratamento com PUVA é a redução do títulos de

autoanticorpos em pacientes de vitiligo tratados com sucesso (ONGENAE, 2003).

Nos nossos pacientes, apenas cinco dos 22 apresentaram anticorpo anti-

tireoperoxidase positivo, constituindo um subgrupo muito reduzido, de forma que

nenhuma inferência sobre o efeito da PUVA sobre estes anticorpos pode ser feita.

132

Com os dados apresentados, reforçamos, ainda que de forma indireta, o

papel da célula T-CD8-CLA+ na gênese da doença, visto que esta subpopulação

estava significantemente reduzida no sangue dos doentes e foi a única

subpopulação, dentre as estudadas, a sofrer modificação com a PUVA. Sugere-se

que estes achados tenham implicação no estudo dos mecanismos patogenéticos do

vitiligo e não implicação prognóstica direta.

133

7. CONCLUSÕES

1. Os pacientes com vitiligo apresentaram níveis reduzidos de linfócitos T

CD8-CLA+ circulantes, de forma significativa, se comparados com os

indivíduos controles.

2. A relação dos linfócitos T CD4/CD8 no sangue periférico foi semelhante

entre os pacientes de vitiligo não segmentar e os indivíduos controles.

3. Os linfócitos T CD4-CLA+ e T CD8-CLA+ não apresentaram diferenças

quantitativas e qualitativas, com significância estatística, antes e após 30

sessões de puvaterapia, assim como a relação CD4/CD8.

134

8. SUGESTÕES

a. Um acompanhamento por longo prazo destes pacientes pode ser realizado.

Permitindo avaliar após um ano de fotoquimioterapia os parâmetros estudados, a fim

de observar se a duração do tratamento influenciou na imunomodulação.

b. Considerando o comportamento migratório das células T-CLA+, a presença

das células T-CLA+ frente à terapia PUVA poderia ser analisada através da

imunoistoquímica da pele. Elucidando se ocorre de fato deleção destas células,

especialmente da subpopulação TCD8-CLA+.

c. Marcadores de apoptose poderiam ser estudados na pele de pacientes com

vitiligo, visto que os linfócitos do infiltrado cutâneo de indivíduos submetidos a

fotoquimioterapia entram em apoptose,

d. Estas e outras etapas da imunomodulação poderiam ser analisadas com a

fototerapia com RUV-B de banda estreita, uma vez que se trata de uma nova terapia

para o vitiligo que carece de estudos a respeito de seus mecanismos controladores

da doença.

135

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160

10. ANEXOS

A seguir:

• Ficha clínica dos pacientes

• Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE)

• Parecer (Aprovação) do projeto de pesquisa pelo Comitê de Ética

161

FICFICHA DOS PACIENTES – PROJETO DE VITILIGO –

IDENTIFICAÇÃO: Número no projeto: __________________ __

Nome: _______________________________________________________IDADE: __________

PRONTUÁRIO: _________________ Endereço: _________________________ CEP: _______________

Telefone: __________________

Data de Nascimento: _____/_____/_____ Sexo: _______ Naturalidade: _____________________

Escolaridade: ________________________ Profissão: __________________________________

Data desta avaliação: ____ /____/____

Data na 1ª consulta na dermatologia: ___ /____ /_____

2. INFORMAÇÕES DE SAÚDE: Idade atual: _________

PARA MULHERES EM IDADE FÉRTIL DUM: ____/___/___

Método Aco em uso _______________________________________________

1. Início do vitiligo/ evolução das lesões : ______________________________________________ 2. Início de quadro (em que ano?)_______________________ Tempo de evolução_________________________________

Casos na família_____________________________________________________

3. Tratamentos prévios: ___________________________________________

Antes da Puvaterapia:

( )Viticromin oral Início____________Tempo de duração______________

Resposta clínica: ( )inalterado ( ) modificado ( )melhora discreta ( )melhora moderada ( )melhora intensa

( ) progressão da doença

( ) Viticromin tópico Início____________Tempo de duração______________



( ) Corticóide oral Início____________Tempo de duração______________



( ) Corticóide tópico Início____________Tempo de duração______________



( ) Oxsoralen tópico + sol Início____________Tempo de duração________



( ) Outros Citar: ________________________________________



3. História Familial (colocar grau de parentesco):

162

( ) Hipo ou hipertireoidismo___________________________________

( ) Diabetes mellitus_________________________________________

( )Anemia perniciosa________________________________________

( )Halo nevus_______________________________________________

( )Alopécia areata____________________________________________

( )Melanoma_________________________________________________

( ) Outras____________________________________________________

4. Outras doenças associadas nos familiares? (colocar grau de parentesco e respectiva doença se for o caso)

5.Comorbidades no pacientes: ________________________________________________

Outros medicamentos em uso? ________________________________________________

Alergias? _________________________________________________________________

4. Exame físico: A. Fototipo ___________________________ I – branco bem pálido – queima com muita facilidade , intensamente e NUNCA bronzeia

II – branco – queima facilmente, bronzeia pouquíssi mo E com muita dificuldade

III – branco – queima moderadamente, bronzeia moder adamente e uniformemente

IV- beige or lightly tanned – queima pouquíssimo, b ronzeia com facilidade e moderadamente

V – moderate Brown or tanned – fica muito bronzeada (marrom intenso) – raramente queima

VI – dark Brown or black – NUNCA queima e bronzeia i ntensamente (marrom forte ou negro)

B. Peso corporal _________ (minha balança) Altura: ________________

C. Lesões acrômicas: ( ) face ____________________________

( ) tronco ____________________ ( ) MMSS _________________________

( ) MMII _____________________

( ) mãos _____________________ ( ) pés ____________________________

( ) genitália ___________________________________________________________

( ) região cervical ____________________________________________________

área de superfície corporal : estimada em _______________(Current. Medical Diagnosis & Treatment, 1998)

Cabeça + pescoço 9% ____________

Parte superior e posterior do tronco 9% ________

Parte inferior e posterior do tronco 9%________

Parte superior e anterior do tronco 9%_________

Parte inferior e anterior do tronco 9%________

Cada braço com mão 9% (total 18%)_________

Parte anterior de perna e coxa com pé 9%_________

Parte posterior de perna e coxa com pé 9%________

Genitália 1%_____________

5. Exames laboratoriais: Data: ___ / __ / ___

hemoglobi hematocrito hemácias leucocitos Uréia creatinina VHS glicemia

A) Diferencial de leucócitos: ____________________________________________________

163

TSH T4livre ANTI-TPO

TGO TGP Fosf alc GGT Bil Dir Bil IND Bil total

6. Exame oftalmológico ( __/ __ /__): ____________________________________________

7. Documentação Fotográfica – Data: ___ /__ /___ máquina usada _____________________

8. PUVA: Dose de oxsoralem: __________ ( ) ICN lote __________________( ) manipulado

Data de início: ___ / ___ / ____

Número de Joules iniciais: ______________

Número e frequência de sessões:___________________

Incremento de Joules: ___________________________

9. 11. Relação CD4/CD8 : _________________________ Data: __ /__ / __

10. CD4 ABS _____________________ CD8 ABS _______________ DATA: ___/___/____

11. Expressão do CLA: _________________________ Data: __ /__ / __ 12. Biopsia inicial de pele n°__________________ data da biopsia:_________ Local biopsiado_________________________ Descrição da lâmina___________________________________

13. Biopsia após tratamento com PUVA- n° da biópsia_________________ Número de sessões de PUVA até a repigmentação_________________

Dose de PUVA até a repigmentação____________________________

Data da biopsia:_________ Local biopsiado_______________________________________

Rio de Janeiro, _________ de ___________________ de _______.

FICHA DE EVOLUÇÃO CLÍNICA (15 sessões)

Avalição clínica Data: ___/___/____

1. Exame clínico:

Lesões acrômicas COM SINAIS DE REPIGMENTAÇÃO

( ) face ( ) SIM ____________________________ ( ) Não

( ) tronco ( ) SIM ____________________________ ( ) Não

( ) MMSS ( ) SIM ____________________________ ( ) Não

( ) MMII ( ) SIM __________________________ ( ) Não

( ) mãos ( ) SIM ___________________________ ( ) Não

( ) pés ( ) SIM ___________________________ ( ) Não

( ) outros

2. Eventos adversos ( ) sim, especificar ___________________________

( ) náuseas ( ) cefaléia ( ) tonteiras ( ) Vômitos ( ) diarréia ( ) queimadura

( ) vermelhidão ( ) ressecamento da pele ( ) coceira ( ) insônia ( ) depressão

( ) urticária ( ) cãibras - outros ( ) _______________________________

164

conduta:

resultado da intervenção:

( ) Não

3. Dose cumulativa (NÚMERO DE JOULES TOTAIS ATÉ HOJE): _____________________________

4. Aderência ao tratamento

Aderência ( ) sim ( ) não

Abandono ( ) sim ( ) não

5. PROGRIDO JOULES HOJE? ( ) SIM, para ___ J ( ) Não

6. Foi prescrito adjuvante:

( ) emoliente tópico ( ) sim, ________________________________ ( ) Não

( ) anti-histamínico oral ( ) sim, ________________________________ ( ) Não

7. FOTOS Hoje ( ) Sim ( ) Não

8. Recoleta de sangue e pele em ___ /___/___

FICHA DE EVOLUÇÃO (APÓS 30 sessões de PUVA)

Avalição clínica

Lesões acrômicas COM SINAIS DE REPIGMENTAÇÃO

( ) face ( ) SIM ____________________________ ( ) Não Data: ___/____/_____

( ) tronco ( ) SIM ____________________________ ( ) Não Data: ___/____/_____

( ) MMSS ( ) SIM ____________________________ ( ) Não Data: ___/____/_____

( ) MMII ( ) SIM ____________________________ ( ) Não Data: ___/____/_____

( ) mãos ( ) SIM ____________________________ ( ) Não Data: ___/____/_____

( ) pés ( ) SIM ____________________________ ( ) Não Data: ___/____/_____

2. Eventos adversos ( ) sim, especificar ___________________________

( ) náuseas ( ) cefaléia ( ) tonteiras ( ) Vômitos ( ) diarréia ( ) queimadura

( ) vermelhidão ( ) ressecamento da pele ( ) coceira ( ) insônia ( ) depressão

( ) urticária ( ) cãibras

conduta:

resultado da intervenção

( ) Não

3. Relação CD4/CD8: _________________________ Data: __ /__ / __

4. Expressão do CLA: _________________________ Data: __ /__ / __ 5. Biopsia após tratamento com PUVA- n° da biópsia_________________

165

Número de sessões de PUVA até a repigmentação_________________

Dose de PUVA até a repigmentação____________________________

Data da biopsia:_________

Local biopsiado_______________________________________

Descrição da lâmina___________________________________

6. Aderência ao tratamento

Aderência ( ) sim ( ) não

Abandono ( ) sim ( ) não

Situação clínica no momento do abandono_________________________

Número de joules totais (acumulados) até momento da 2ª coleta do material _____________________

AVALIAÇÃO GLOBAL DO PACIENTE : ( ) ótimo ( ) bom ( ) –regular ( ) nulo

AVALIAÇÃO GLOBAL DO MÉDICO : ( ) ótimo ( ) bom ( ) -regular ( ) nulo

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