clase4 marcadores moleculares1
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Marcadores Moleculares
Marcadores MolecularesADN
ARNProteínas
Polipéptidos Enzimas
Fenotipo
Marcadores Moleculares1) Marcadores proteicos
a) Basados en amplificación molecular PCR
2) Marcadores de ADN
a) Proteínas de reserva
b) Isoenzimas
b) Basados en hibridación molecular RFLP
c) Basados en amplificación + hibridación molecular AFLP
Principales aplicaciones de los marcadores moleculares en fitomejoramiento
1) Identificación genética (genetic fingerprinting).
a) Evaluación de la variabilidad genética preexistente.b) Clasificación por grupos heteróticos (predicción de la
heterosis).c) Determinación de la "core collections" en los bancos de
germoplasmad) Certificación de pureza de semillas.e) Identificación y protección legal de variedades.f) Caracterización e identificación de patógenos.
3) Otras aplicaciones.
a) Construcción de mapas genéticos.b) Determinación de homología entre especies relacionadas
por mapeo comparativo.
2) Apoyo a los programas de mejoramiento.
a) Selección asistida por marcadores moleculares.b) QTLs o "Quantitative Trait Loci" loci de rasgos
cuantitativos.c) Backcross asistido (introgresión rápida de caracteres de
interés).d) Backcross avanzado desde genotipos "no agronómicos" o
especies silvestres
Contenido de ADN de algunos organismos y organelas
Contenido de ADNPicogramos Pares de KilobasesOrganismo u organela
(pg) (pKb)E.coli 0,0047 4,2 x 103
Cloroplasto (Zea mays) 0,0002 1,6 x 102
Mitocondria (Zea mays) 0,0007 5,7 x 102
Arabidopsis thaliana 0,07 7x 104
Oryza sativa 0,6 5,8 x 105
Lycopersicum esculentum 0,7 7,1 x 105
Zea mays 7,5 7,2 x 106
Homo sapiens 3,2 3,9 x 106
1 pg= 0,965 x 109 pares de bases (pb) = 29 cmGenoma haploide del hombre = 3,9 x 10 6 pbCada célula humana contiene 1,8 m de ADN
Extracción de ácidos nucleicosTipos de ácidos nucleicos a extraer: ADNss, ADNds,ARNs Características del ADN: alto peso molecular y alta calidad.
Pasos generales de un protocolo de extracción a partir de cualquier tejido y especie:
2) Extracción de ácidos nucleicos del macerado celular e inactivación de compuestos degradantes
1) Lisis celular Macerado con nitrógeno líquido
Buffer de extracción (pH 8-9) Disminuye la acción de ADNasas
Antioxidantes Disminuye la formación de compuestos fenólicos p.e. BSA, -mercaptoetanol
Detergente + alta concentración salina acomplejamiento del ADN y desnaturalización de proteínas
p.e. CTAB +ClNa
3) Purificación y lavado Combinaciones de extracción y precipitación
Lavado para remover carbohidratos y proteínas solventes orgánicos puros o en mezcla (p.e. fenol o cloroformo:alcohol isoamílico )
Centrifugación separación del ADN en suspensión de los contamientesPrecipitación isopropanol o etanol
Puede realizarse un tratamiento con ARNasas o purificación en gradiente de ClCs para eliminar ARNs y obtener ADN de mayor pureza.
4) Secado y resuspención en el buffer de stock
Método CTAB
5) Cuantificación del ADN extraído
Fluorómetro: el valor leído se intercala sobre una curva de calibración previa, y se extrapola la concentración de las muestras.Espectrofotómetro de luz UV
Mediciones de absorbancia a longitudes de onda de A 230, A 260, A280, y A 310
A 260 / A 280 < 1,8 Contaminación con proteínas A 260 / A 280 > 1,8 < 2 Buena calidad A 260 / A 280 > 2 Contaminación con fenoles, cloroformo,
etc,Alta precisión, pero pueden verse afectadas por la presencia de contaminantes como proteínas, polisacáridos y ARNs.
Diluciones con un estándar de ADN comercial de concentración conocida, con bromuro de etidio. Se observan las diluciones a la luz UV en forma conjunta con los ADN incógnitas y se estima la concentración por comparación.
Geles de cuantificación (agarosa 0,8%) con marcadores de peso molecular conocido para cuantificar los ADN extraídos por comparación de bandas.
Marcadores moleculares de ADN basados en la hibridación
RFLP
Enzimas de restricción
Endonucleasas
Capaces de cortar el ADN en sitios de secuencias de bases específicas Sitios de restricción
Tipos de corte En el centro de simetría de la secuencia de reconocimiento
Produce fragmento de ADN con extremos “romos” o“rasurados
En diferentes posiciones del eje de simetría de la secuencia de reconocimiento
Produce fragmento de ADN con extremos “cohesivos” o“pegajosos”
Origen y secuencias de reconocimiento de algunas endonucleasas de restricción
Organismo de origen Nombre Secuencia de reconocimientoArthrobacter luteus AluI
5́ A G C TT C G A 5́
Haemophilus influenzae HindIII5́ A A G C T T T T C G A A 5́
Escherichia coli EcoRI5́G A A T T CC T T A A G5́
Providencia stuarti PstI5́C T G C A GG A C G T C5́
Se conocen más de 400 enzimas de restricción
Acción de la enzima de restricción EcoRI:
Digestión de ADN con enzimas de restricciónSe generan fragmentos de diferente tamaño llamados
segmentos de restricción
El tamaño de los fragmentos refleja la distribución de los sitios de restricción en el ADN
Estos fragmentos cargados negativamente migran hacia el ánodo en un campo eléctrico
Durante la electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida, migran en el gel a una tasa proporcional a sus pesos moleculares
Un ADN pequeño como el de un cloroplasto puede generar 40 segmentos de restricción cuando se digiere con EcoRI
Electroforesis de ADN Los geles usados en la separación de ácidos nucleicos son matrices de agarosa o poliacrilamida, con tramas de dimensiones moleculares.
Los ácidos nucleicos están cargados negativamente, ellos emigran hacia el polo positivo en un campo eléctrico.
Cuando el campo eléctrico se aplica a través del gel, las cadenas más cortas se mueven más rápidamente que las más largas. Así, las cadenas se extienden en el gel según su tamaño.
El ADN doble cadena puede ser visualizado agregando bromuro de etidio, un químico aromático que se intercala entre los pares de bases de la hélice doble. Cuando el bromuro de etidio se halla ligado al ADN produce, al irradiarse con UV,una fluorescencia naranja.
La diferencia en los tamaños de los fragmentos obtenida por la digestión con enzimas de restricción del ADN nuclear, de una organela o el ADN total, se denomina “RFLP”
RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphisms
Gel de agarosa coloreado con BrEt
Calles 1y5: Marcador de peso molecular
Calles 2,3,4: ADN de tres plantas de Solanum tuberosum digerido con EcoRI
Los RFLP del ADN nuclear no pueden ser directamente visualizados.
Para ello se usan pequeños fragmentos de ADN como sondas o “probes” para detectar fragmentos de restricción individuales Análisis por Southern
blot del ADN de tres plantas de Solanum tuberosum. La sonda utilizada es un fragmento del gen nptII
Confección de bibliotecas de sondas o “library”
El ADN purificado de la especie de interés es digerido con enzimas de restricción
Los fragmentos de restricción individuales son unidos a plásmidos, y el plásmido es incorporado a una célula bacteriana (p.e. E.coli)
Las sondas se marcan radioactivamente con P32 (2-5 Kb)
También puede usarse tinción no radiactiva basada en la quimioluniniscencia (p.e.dioxigenina)
Aislamiento de los fragmentos de restricción de los plásmidos transformados. Se obtiene un gran número de copias para ser usados como sondas
Se multiplican las células bacterianas transformadas. Los cultivos pueden mantenerse por largo tiempo
Detección de RFLPs por la técnica de Southern Blot
Aislamiento y purificación del ADN
Digestión con enzimas de restricción (10-15 u/µg de ADN)
Es conveniente hacer un minigel para verificar la digestión total del ADN previo a la corrida
Fracciónamiento y separación de los fragmentos de restricción mediante electroforesis en gel de agarosa (1%)
La migración de los fragmentos debe ser lenta (de 6 hasta 48 horas)
Desnaturalización del ADN por inmersión del gel en solución desnaturalizante (OHNa + ClNa)
Se forman cadenas simples de ADN que permiten la posterior hibridación de las sondas.
Southern Blot: el ADN monohebra es transferido del gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa.
Desmontado el Southern se lava la membrana para eliminar restos de agarosa y se incuba envuelta en papel de filtro a 80°C para fijar el ADN a la membrana
Procesamiento de la sonda•La sonda, inserta en un plásmido, es separada mediante digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión y purificada mediante columnas.
Tratamiento de prehibridización•La membrana es tratada con solución de prehibridización para evitar hibridaciones inespecíficas de la sonda
•Cuantificación, ajuste de la concentración de la sonda y marcaje
La sonda desnaturalizada se agrega a la solución de prehibridización. La sonda hibrida con los fragmentos de restricción homólogos a ella. Revelado por autoradiografía
Esquema de la técnica de Southern Blot
Herencia de los RPLPs
Siempre que los fragmentos reconocidos por la sonda sean de longitudes no-idénticas, decimos que las bandas son polimorficas.
Para esta combinación particular de enzima de restricción y sonda de hibridación, se obtiene este modelo de hibridación de bandas
Flor celeste Flor blanca
Padres homocigotas
Color de flor celeste dominante
RR rr
Rr
RR Rr Rr rr
6 Kb8 Kb
F1
6 Kb8 Kb6 Kb
8 Kb6 Kb
8 Kb
F2
Los RFLPs son codominantes
Marcadores genéticos convencionales vs RFLP
Mayor variación de RFLP se adaptan mejor a la construcción de mapas genéticos.
Los RFLPs no dependen del estado de desarrollo ni de las condiciones ambientales en las que crece determinado genotipo
Los RFLPs poseen bajo efecto fenotípico
Los RFPLs son codominantes y se comportan de esta manera en diferentes fondos genéticos
RFLP Isoenzimas
Elevado número de polimorfismos. Menor variabilidad.Permiten crear mapas genéticossaturados de marcadores.
No existen suficientes marcadores paraun mapa a intervalos pequeños.
Esta mejor cobertura del genomapermite determinar adecuadamenterelaciones genéticas entre genotipos.
No se ha encontrado una adecuadacorrelación entre distancias genéticasdeterminadas por isoenzimas yrelaciones genéticas entre genotipos.
Pueden detectarse en principio todas lasdiferentes mutaciones.
Sólo resuelve aquellas mutaciones quesustituyan un aminoácido que afecte lamovilidad de la proteína.
Detección de la variabilidad norestringida a regiones codificantes.
Cubre variabilidad en genesestructurales solamente.
No depende del estadío de desarrollo. Depende del estadío de desarrollo.No depende del tejido. Depende del tejido.
Herencia codominante.Herencia codominante pero se complicacuando la enzima estudiada no es unmonómero.
Si se usan sondas genómicas no seesperan efectos pleiotrópicos pues engeneral es variabilidad fuera del gen.
Por tratarse de genes estructuralespodrían presentar efectos pleiotrópicos.
Estudio directamente el genotipo. Estudio el fenotipo.