Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Cincias Agrrias Departamento de Fitotecnia Disciplina: Biotecnologia Dra. Adriana Cibele de Mesquita Dantas acmdantas@cca.ufsc.br

PROTOCOLOS - MARCADORES MOLECULARES

MARCADORES GENTICOS

Marcador uma caracterstica capaz de detectar diferenas entre dois ou mais indivduos ou organismos. Assim, podemos considerar como marcador gentico, toda caracterstica fenotpica ou qualquer segmento de DNA que sejam transmitidas pelos pais para as prognies e que permitam a anlise de similaridade e diversidade gentica entre indivduos. Apesar das caractersticas morfomtricas (marcadores morfolgicos) apresentarem resultados que possibilitam a anlise da diversidade e a vantagem de indicar o valor adaptativo dos gentipos em um determinado ambiente; so em geral altamente influenciadas por fatores ambientais, alm de suscetveis pleiotropia e controle por vrios genes simultaneamente. Outro fator limitante desses marcadores que somente podem ser avaliadas na planta aps vrios anos de seu desenvolvimento em campo (ALFENAS et al., 1991; SHIMIZU et al., 2000). Os marcadores isoenzimticos so uma importante ferramenta para os estudos genticos, obtidos atravs de uma tcnica simples, acessvel e de custo relativamente baixo. Essa tcnica permite anlises diretas pela identificao das bandas em gel de amido. Contudo, esses marcadores representam uma baixa parcela do genoma (pequeno nmero de locos e de alelos por loco). Alguns sofrem interferncias ambientais e modificaes ps-traduo e podem apresentar especificidade para diferentes tecidos, fatos esses que so limitantes para alguns estudos (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). Dessa forma, a utilizao de marcadores moleculares baseados na anlise direta do DNA indicada para complementar os estudos com marcadores morfolgicos e isoenzimticos. Variaes da molcula de DNA que no codificam para um produto final ou simplesmente no codificam, s podem ser detectadas atravs de tcnicas que identifiquem RFLPs (Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrio do DNA), RAPDs (Polimorfismo no comprimento de DNA amplificado ao acaso), AFLPs (Polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados de DNA), minissatlites e microssatlites, ou a partir do seqenciamento do DNA (CHENG et al., 1997). O conhecimento dessas variaes em plantas essencial para a compreenso de diversos aspectos

relacionados seu ciclo na natureza. Todavia, o seqenciamento do DNA e a tcnica RFLP, baseada na anlise de polimorfismo de DNA digerido com enzimas de restrio, so ferramentas caras e trabalhosas para o desenvolvimento de anlises de rotina em laboratrios de gentica vegetal.

MARCADORES RAPD (WELSH e McCLELLAND, 1990; WILLIAMS et al., 1990)

Marcadores genticos baseados em DNA polimrfico amplificado ao acaso, mais conhecidos como RAPD, baseiam-se na amplificao de DNA, via PCR utilizando-se iniciador nico de seqncia arbitrria, capaz de amplificar um ou mais segmentos de DNA em uma poro desconhecida do genoma, podendo ser essa poro de cpia nica ou mesmo repetitiva. Alm disso, a tcnica apresenta a vantagem de no necessitar conhecimento prvio a respeito da biologia molecular do organismo a ser estudado Para serem realmente eficientes e permitirem uma reao reprodutvel, os iniciadores utilizados na amplificao RAPD devem ter um comprimento mnimo de 9 bases com ao menos 40% de bases C e G. Outro fator de extrema importncia na reao RAPD a temperatura dos ciclos PCR. Altas temperaturas (alta estringncia) permitem o anelamento de iniciadores somente com seqncias da amostra que sejam totalmente complementares, enquanto baixas temperaturas (baixa estringncia) permitem o pareamento com seqncias que no sejam totalmente complementares. Devido s facilidades e capacidade multiplex (vrias bandas numa mesma reao) que apresentam, marcadores RAPD tm sido utilizados em diversas linhas de pesquisa, como a produo de impresses digitais genmicas (fingerprints), anlise de variabilidade g entica entre populaes e entre indivduos, diagnsticos mdicos, programas de melhoramento de plantas, programas de reproduo animal, identificao de genes de interesse agronmico, entre outras (WELSH e McCLELLAND, 1990; WILLIAMS et al., 1990; FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).

MARCADORES BASEADOS NA AMPLIFICAO DE MICROSSATLITES Os marcadores baseados em Seqncias Simples Repetidas (SSRs) ou microssatlites, so os que mais se aproximam do marcador ideal para estudos genticos, por detectarem atravs de seqncias repetidas com um a quatro nucleotdeos, maior polimorfismo. Estas seqncias repetidas e adjacentes, so compostas de mono, di , tri e tetra nucleotdeos repetidos em nmero varivel de vezes (SHARMA et al., 1995; RAFALSKI et al., 1996). Esses segmentos so amplificados via PCR, com iniciadores especficos de 20 a 30 bases, complementares a seqncias que flanqueiam a regio repetitiva (JONES et al, 1997; FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). O polimorfismo encontrado nesses marcadores diz respeito ao nmero de vezes que o ncleo de bases se repete. SSRs so marcadores amplamente distribudos no genoma, de expresso co-dominante (permite diferenciar indivduos homozigotos e heterozigotos), multivarivel, multiallico e de grande contedo informativo. Tendo em vista a expresso co-dominante e o multialelismo, os marcadores SSRs so os que possuem o mais elevado contedo de informao. Devido a sua freqncia e distribuio ao longo de todo o genoma, permitem uma ampla cobertura gentica de qualquer organismo eucarioto. Devido a seu carter co-dominante, so um dos mais indicados para o estudo de diversidade gentica, fluxo gnico, mapeamento gentico e identificao de parentesco. De um lado os marcadores microssatlites apresentam um grande nmero de alelos. De outro, cada reao possibilita acessar somente um loco (baixa capacidade multiplex). Contudo, em geral, apresentam uma alta proporo de locos polimrficos (FERREIRA, 1996). A produo de iniciadores para a amplificao de microssatlites uma etapa trabalhosa e onerosa do processo. Considerando que no existem iniciadores comercialmente disponveis desenhados para todas as espcies vegetais, conta-se com a possibilidade de utilizar iniciadores desenhados para plantas de txons relacionados (ECHT et al., 1999), sendo essa uma forma de tornar mais barata e mais rpida a anlise de microssatlites de uma nova espcie. Trabalhos recentes revelaram a capacidade de transferibilidade desses iniciadores. Por transferibilidade entende-se a capacidade que os iniciadores desenvolvidos para uma espcie tm em tambm amplificar segmentos de DNA em outra(s) espcie(s).

MARCADORES AFLP (VOS et al., 1995)

A anlise de polimorfismo de comprimentos de fragmentos amplificados (AFLP) combina a especificidade da digesto com enzimas de restrio e a velocidade e praticidade da deteco de polimorfismo pela amplificao do DNA via PCR. Esses fragmentos so conseguidos a partir da digesto do DNA total com duas enzimas de restrio: uma de corte raro (EcoRI: um corte a cada 22,5 kb em Arabidopsis sp) e uma de corte freqente ( seI: um corte a cada 300-400 pb em M Arabidopsis sp) (LISCUM e OELLER, 2000). Essa digesto produz trs tipos diferentes de fragmentos: corte raro-corte raro (cortado pela EcoRI nas duas extremidades), corte freqente-corte freqente (cortado pela MseI nas duas extremidades) e corte raro-corte freqente (cortado pela EcoRI em uma extremidade e pela MseI na outra). Uma vez feita a digesto, oligonucleotdeos (25-30 pb) adaptadores so ligados s extremidades de cada fragmento e a amplificao via PCR desenvolvida com iniciadores complementares aos adaptadores, porm com 1 a 3 bases arbitrrias de extenso na sua extremidade 3 (VOS et al., 1995.; JONES et al., 1997). Com essa extenso arbitrria, somente os fragmentos com bases complementares poro 3 dos iniciadores sero amplificados, pois a Taq DNA polimerase no realiza a extenso da molcula de DNA se o anelamento na extremidade 3 do iniciador no for perfeita. Assim, os AFLPs apresentam uma grande capacidade multiplex. A tcnica AFLP tem as vantagens de ser relativamente barata, fcil e rpida, capaz de gerar centenas de marcadores genticos informativos, porm apresenta a desvantagem de ser dominante, no possibilitando a identificao de indivduos heterozigotos (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998; MUELLER e WOLFENBARGER, 1999).

A REAO DA POLIMERASE EM CADEIA (PCR) MULLIS et al. (1986)

A partir de repetidos ciclos de desnaturao, anelamento e extenso com DNA polimerase, MULLIS et al. desenvolveram uma tcnica capaz de produzir fragmentos-alvo de DNA que aumentam sua concentrao de maneira exponencial. A reao em cadeia da polimerase permite um acrscimo de mais de 105 vezes na quantidade de DNA alvo a ser amplificado. Para a ocorrncia dessa reao, requerida uma quantidade relativamente pequena da molcula dupla-fita de DNA a ser, podendo tambm se utilizar uma molcula simples- fita de DNA, ou mesmo uma molcula de RNA. O processo de amplificao do DNA pela reao em cadeia da polimerase consta de dissolver o DNA a ser amplificado, em uma soluo tampo especfica contendo NaCl, MgCl2 , Tris-Cl pH 7,6, cada um dos quatro desoxirribonucleotdeos (dNTPs), dois iniciadores (primers) e uma DNA polimerase termoestvel (Taq DNA polimerase). A soluo passa ento por um processo de desnaturao do DNA (92 a 94C por 1 min), ligao dos iniciadores (35 a 45C por 1 min) e extenso da cadeia (72C por 2 min). A criao desta importante ferramenta para a gentica molecular permitiu o desenvolvimento de marcadores moleculares baseados na amplificao do DNA, os quais tiveram seu desenvolvimento mais rpido e fcil, alm de requererem menor quantidade de DNA do indivduo a ser estudado.

PROTOCOLO DE REAO PCR - RAPD Vrias modificaes tem sido introduzidas nesses protocolos de acordo com vrias necessidades. Por exemplo, o tempo de desnaturao pode ser reduzido para 30-40 seg, assim como o de anelamento (para 30 seg) e o de extenso (60 seg). Essas modificaes visam principalmente reduzir o tempo de reao (reduo de cerca de 4 ou 4,5 horas para 3 horas de ciclos) sem afetar os resultados. O ciclo tem sido encerrado por uma fase de extenso e 7 minutos a 72o C de modo a permitir a finalizao da amplificao de produtos no acabados. Tambm tem sido introduzido um ciclo de 3 minutos a 94o C (conhecido como hot start) de modo a evitar o anelamento no especfico e amplificao que ocorre durante a preparao da reao. O hot start pode ser conduzido sem a adio da enzima Taq polimerase para evitar a perda de atividade dessa enzima. Enzimas Taq polimerase modificadas tem sido introduzidas no mercado, e que toleram melhor esse tratamento a 94o C, e que at necessitam atingir essa temperatura para permitir a liberao da atividade da enzima. Outras modificaes incluem alterao da temperatura de anelamento (no nosso caso usamos 37o C ao invs do 36o C proposto). Em certos casos, tem-se optado baixar a temperatura de anelamento inicialmente (por 3 ciclos) para at 35o C, e nos ciclos restantes aumentase a temperatura de anelamento para 40o C de modo a reduzir o nmero de fragmentos amplificados, restringindo para aqueles mais especficos. Em termos das condies de reao, necessita-se ajustar a concentrao de DNA nas reaes,de acordo com a espcie analisada. O nmero de genomas haplide-equivalente (1C) varia de acordo com o tamanho do genoma das plantas. O tampo da enzima usado depende do fornecedor da Taq usado. A concentrao de MgCl2 afeta a qualidade dos produtos obtidos e depende do tipo de anlise conduzida, e utiliza-se entre 1,5 e 4 mM. A concentrao de enzima depende do balano entre as falhas na amplificao devido a falta de enzima, e o excesso causando amplificaes sem definio de bandas. Preparo das reaes: Na prtica vrias reaes so preparadas ao mesmo tempo em que um componente alterado (tais como o gentipo ou o primer). Prepara-se uma mistura principal com todos os componentes, exceto aquele que varia e est em comparao. A ordem de colocao dos componentes na mistura principal deve seguir uma certa lgica. Inicia-se pela gua mQ estril, seguida de tampo da enzima e dNTPs. Normalmente o ltimo componente a ser adicionado a enzima. Essa mistura principal dividido em tubos, onde o componente que varia adicionado. Esse componente a ser comparado pipetado em cada tubo de reao separadamente. Tradicionalmente, estoques com concentraes convenientes so preparados e mantidos congelados a -20o C. Os estoques que usamos so: 1. Estoque de 1 mM de dNTPs em mistura 1 mM de dATP, TTP, dCTP e dGTP Comercialmente esses dNTPs so fornecidos em estoques de 10 ou 100 mM. Prepara-se uma mistura de 1 mM ou 1,25 mM de cada dNTP em gua mQ estril. A reao de PCR RAPD utilizada no LGV consta de um coquetel com volume final de 13 uL, conforme o quadro abaixo, porm deve ser otimizada de acordo com trabalho a ser realizado.

Componente Tampo

[ ] estoque 10x

Volume 1,30 L

[ ] final 1x

MgCl2 BSA dNTPs gua ultra pura Taq DNA Polimerase1

50 mM 2,5 mg/mL 2,5 mM --5 U/L

0,65 L 1,04 L 1,14 L 3,22 L 0,20 uL

2,5 mM 0,8 mg/mL 0,4 mM --1U

Primer 2 2,0 M 3,00 L 0,4 M DNA 2 3,0 ng/L 3,00 L 0,7 ng/L Total --13,00 L --1 A enzima Taq DNA polimerase o ltimo componente a ser adicionado no coquetel2

Dependendo do estudo, o DNA, o primer ou ambos so pipetados diretamente no microtubo e no

no coquetel.

Tampo de PCR (10x): esse componente fornecido juntamente com a enzima Taq DNA polimerase e normalmente no necessita ter sua concentrao final (=1x) alterada. MgCl2 : o magnsio co- fator da enzima Taq DNA polimerase e por isso, essencial para a reao. Sua concentrao deve ser otimizada, pois baixas concentraes originam padres com poucas bandas, enquanto uma concentrao essessiva origina padres com muitas amplificaes marginais, dificultando ou at mesmo impedindo a anlise. BSA: esse componente age como estabilizador da Taq DNA polimerase e pode ser excludo em algumas reaes. Sua concentrao final pode ser otimizada, dependendo da reao (0,5 a 1,0 mg/mL). dNTPs: so os nucleotdeos utilizados pela Taq DNA polimerase na fase de extenso da cadeia de DNA. Podem ter sua concentrao otimizada. So fornecidos separadamente e prepara-se uma

soluo estoque com os quatro desoxirribonucleotdeos (A, C, T e G) com concentrao de 2,5 mM.360 uL de TE + 10 uL de cada dNTP Armazenar a 20C

gua ultra pura: sempre deve-se utilizar gua mili-q autoclavada para as reaes de PCR. O volume de gua equivale quantidade necessria para completar o volume de 13uL. Se algum componente da reao tiver seu volume alterado, automaticamente o volume de gua ser alterado. Taq DNA polimerase: a enzima termoestvel que realiza a amplificao do DNA. Deve ser sempre mantida no freezer, a 20C e adicionada no coquetel somente no momento de pipet- lo nos microtubos. Se possvel, pipete a Taq no coquetel, sem tir- la para a bancada, realizando essa etapa rapidamente ainda dentro do freezer. Primer: os primers so oligonucleotdeos que variam em sua composio nucleotdica e em seu comprimento. Primers para reaes RAPD apresentam 10 bases de comprimento e nico. Primers

para reaes microssatlites apresentam comprimento por volta de 20 bases e so sempre utilizados em pares, conhecidos como F (forward) e R (reverse). Para reaes AFLP, os primers so fornecidos diretamente no kit da reao. Sua concentrao fator importante para a otimizao da reao de PCR (0,2 a 0,3 uM). Alm da concentrao, sua composio nucleotdica (quantidade de C, G, A e T) est diretamente relacionada com a temperatura de anelamento da reao PCR. A temperatura de anelamento de um primer pode ser calculada pela frmula abaixo:T = 22 + 1,46.[2.(G + C) + (A + T) Essa frmula vivel para oligonucleotdeos com comprimento entre 20 e 35 bases (+- 2-5C)

Os primers de RAPD so fornecidos liofilizados e devem ser dissolvidos para uma soluo estoque, seguindo o processo abaixo: 1. dar um spin para que todo o contedo do tubo desa. 2. Diluir os primers para uma concentrao de 50 uM, utilizando a seguinte frmula: [ ] nM x 1000 / 50 = V T E onde: [ ] nM = concentrao do primer, determinada pelo fornecedor; 1000 = fator de converso (nM 50 = concentrao desejada (50 uM); V T E = volume de TE (em uL) a ser adicionado. 3. guardar a 20C. DNA: a concentrao de DNA utilizada deve ser otimizada em funo da diferena na pureza das amostras e nas caractersticas peculiares a cada planta. uM);

Gel para eletroforese (padro 300 ml de TBE 1X) Gel (%) 0,8 1,5 3,0 Agarose (gramas) 2,4 4,5 9,0 Destinado para: Quantificao DNA Eletroforese de produtos de RAPD Eletroforese de produtos de SSR

A quantidade de agarose em gramas obtida atravs da concentrao do gel em %, multiplicado pelo volume de gel desejado: EX : volume de 600 ml x 1,5% (eletroforese) = 9 gramas de agarose em 600 ml de TBE 1X.

PROGRAMA DE REAO PCR RAPD NO TERMOCICLADOR

Essa etapa tambm deve ser otimizada para cada espcie a se trabalhar, porm pode-se iniciar a otimizao com o programa abaixo descrito, o qual apresenta uma baixa estringncia e portanto possibilita a amplificao de fragmentos diversos. Temperatura Tempo 92C 35C 72C 72C 1 min. 1 min. 2 min. 5 min. 1 35 a 40 Ciclos Etapa Desnaturao Anelamento de baixa estringncia Extenso Extenso final

A partir desse ciclo bsico, possvel aumentar a estrigncia, buscando uma amplificao mais especfica, como no exemplo abaixo:

Temperatura Tempo 94C 94C 35C 72C 94C 40C 4 min. 1 min. 1 min. 2 min. 1 min. 1min.

Ciclos 1

Etapa Desnaturao inicial Desnaturao

3

Anelamento de baixa estringncia Extenso Desnaturao

35

Anelamento de estringncia mais alta

72C 72C

2 min. 5 min. 1

Extenso Extenso final

Programa de PCR otimizado para amplificao de locos RAPD em A. angustifolia

Gel de Agarose Os produtos de amplificao sero visualizados aps serem carregados num gel 1,5% num tampo TAE, com um gradiente de 6 V cm-1, por cerca de 3 horas. Aps essa corrida o gel ser corado com uma soluo de brometo de etdeo CANCERGENO E MUTAGNICO USE LUVAS DE LTEX. 1. Pesar 1,4 g de agarose por 100 ml de tampo de corrida 1 x TAE (estoque 50x) num erlenmeyer e cobrir 2. Aquecer por cerca de 4 minutos em forno de microondas at ferver 3. Misturar com cuidado, pois a soluo ferve para for a do frasco 4. Esperar a soluo esfriar at cerca de 50o C (ponto que tolere encostar na sua pele), para evitar danos forma do gel 5. Verter o gel na forma fechada nas extremidades e com o pente em posio. 6. Esperar esfriar e remover bolhas com ponteiras. 7. Remover o pente com cuidado (levantar um lado primeiro com cuidado!) 8. Colocar o gel na cuba e completar o volume do tampo at cobrir o gel 9. Enquanto isso, preparar as amostras a serem carregadas no gel 10. Adicionar em cada tubo com 25 ? l de reao, 3 ? l do tampo de amostra (contendo azul de bromofenol). O azul de bromo fenol corre no gel com tamanho equivalente a 300 pares de base. 11. Transferir essa amostras para os poos do gel 12. Conectar os eletrodos fonte e ligar. Os cidos nucleicos encontram-se no pH do tampo TAE carregados negativamente e migram para o positivo correm para o vermelho! 13. Aps a corrida, transferir o gel para uma bandeja contendo brometo de etdeo em gua (10 ? l de uma soluo 10 mg/ml de brometo de etdeo em 500 ml de gua) e agitar com cuidado por 20 minutos BROMETO DE ETDEO CARCINOGNICO E MUTAGNICO USE LUVAS SEMPRE QUANDO MANIPUL-LO. 14. Observar sob luz ultravioleta no transiluminador

PREPARAO DO GEL DE POLIACRILAMIDA

PROCEDIMENTOS

Separar duas placas diferindo em cm de comprimento. A placa maior deve ser reservada para o Repel, sendo lavada duas vezes com lcool, antes de espalhar o Repel, em um volume de 1 ml; a soluo bem como a lavagem devem ser efetuados com papel toalha seco e limpo. Aps cinco minutos, lavar com gua destilada para retirar o excesso. Na placa menor ser aplicado o Bind, que dever ser previamente preparado em cmara de fluxo laminar devido a sua toxicidade. Antes da aplicao a placa deve ser lavada trs vezes com gua destilada ou duas vezes com lcool. O Bind deve ser espalhado rapidamente sobre a placa em

cmara de fluxo laminar, visto sua volatilidade. Aguardar cinco minutos e proceder nova lavagem com lcool absoluto. importante salientar que aps o manuseio de cada placa efetue-se a lavagem das mos e troca das luvas, para no haver contaminao das placas ou de preferncia a troca das luvas. A montagem das placas deve ser de forma que os lados onde encontram-se as pelculas de Repel e Bind estejam voltadas para dentro. Ajustar e prender os espaadores entre as placas e posicionar a borracha de vedao de forma a no permitir va zamentos. Preparar a poliacrilamida (70 ml), homogeneizar e vert- lo entre as placas com auxlio de uma seringa com capacidade para o volume de gel a ser aplicado. Para evitar a formao de bolhas e distribuio adequada do gel, enquanto aplica-se o gel deve-se promover pequenas batidas sobre a placa para perfeita distribuio do mesmo. Aps colocar o pente com o lado da base no gel at que este solidifique (aproximadamente uma hora), invertendo-o quando da pipetagem das amostras. Adicionar tampo a cuba (cuba vertical de eletroforese) inferior. Posicionar o gel com a placa menor voltada para o interior. Fechar travas e dreno e adicionar tampo na parte superior at cobrir o gel.

Pr-corrida: ? Interromper a pr-corrida quando as placas atingirem 50C, ou quando o gel j tiver sido submetido a corrida por aproximadamente uma hora. Inverter o pente e aps lavar os poos borrifando o prprio tampo sobre eles. ? Corrida ? Aplicar 10? l da amostra, 8? l de Ladder e aps submeter o gel a 60 W, por um tempo de corrida de uma hora para amostras de SSR e duas para AFLP.

Aps o trmino da eletroforese, separa-se as placas com auxlio de uma esptula, e coloca-se a parte com Bind, onde o gel deve estar aderido, em um bandeja plstica contendo a primeira soluo fixadora (etanol 10% e cido actico 1%). Deixar a placa submersa e em agitao durante 10 minutos. Aps retirar a soluo, que poder ser reaproveitada at trs vezes, e lavar a placa uma vez durante 20 segundos com gua destilada. Submergir a placa na soluo fixadora nmero 2 (cido ntrico 1%), durante trs minutos em agitao constante. Proceder a retirada da soluo que poder ser reaproveitada por cinco vezes, e lavar a placa duas vezes durante 20 segundos cada, com gua destilada.

Deixar a paca em soluo de colorao (nitrato de prata 0,2%) por 20 minutos em agitador; verter a soluo para vasilha escura. Pode ser utilizada duas vezes. Lavar o gel duas vezes com gua destilada durante 10 segundo cada lavagem. O passo para revelao consiste na adio de formaldedo a soluo e o parcelamento desta, sendo colocado cerca de 300 ml na placa com o gel para o incio da revelao, deixando que esta sature e escurea, at que possam ser visualizadas as bandas do ladder, aps deve ser troca a soluo e acrescido o restante at que todas as bandas de interesse tenham aparecido, este perodo geralmente no ultrapassa 10 minutos. Aps, colocar o gel em soluo stop (cido actico 5%), durante cinco minutos e efetuar uma lavagem rpida em gua destilada. Deixar secar por no mnimo 12 horas antes de nausear a placa com o gel

AFLP O DNA deve ser digerido com duas enzimas de restrio, sendo uma de corte frequente (stio de reconhecimento de 4 bases) e outra de corte raro (stio de reconhecimento de 6 bases). Os kits comerciais empregam as enzimas de restrio EcoRI e MseI simultaneamente, seguido da ligao com os adaptadores especficos. Ver instrues do manual tcnico do kit da Life Technologies "AFLP Analysis System I" (Life Technologies, Gaithersburg, MD, EUA). Os DNAs digeridos e ligados ao adaptadores so utilizados em reaes de pr-amplificao, utilizando primer com uma base seletiva para cada stio de restrio nas condies sugeridas no manual tcnico do kit. Os produtos pr-amplificados so ento diludos e, ento utilizados para as diversas reaes de amplificao seletiva, com as 64 combinaes possveis de primers especficos para os stios de EcoRI e MseI. As amplificaes so conduzidas em termociclador (ex. GeneAmp PCR System 9700), programado com 13 ciclos de 30 s a 94o C, 30 s a 65o C, com decrscimo gradual 0,7C por ciclo, at atingir 56C, e 60 s a 72C, seguido de 23 ciclos 30 s a 94o C, 30 s a 56o C e 60 s a 72o C. Os produtos das amplificaes podem ser analisados em gel de acrilamida 6% em tampo TBE (89 mM Tris-base; 2 mM EDTA; 89 mM cido brico), correndo a 6 V cm-1 por cerca de 4 h, sendo as bandas visualizadas por colorao com prata de acordo com protocolo de Sanguinetti et al. (1994). Para alguns casos, possvel visualizar os fragmentos com colorao com brometo de etdeo. Sugere-se a utilziao de separao dos produtos em gel d poliacrilamida desnaturante. Digesto: Reao Tampo 5x (kit Gibco) EcoRI HpaII dH2 O mQ DNA (25 ng ? l) TOTAL

5 l 0,3 l 0,3 l 9,4 l 10 l 25 l

Incubar a 37C por 2 a 3 horas Inativar as enzimas a 70C por 15 minutos e dar choque em gelo Ligao Adaptador EcoRI Adaptador HpaII ATP Tampo 5x (kit Gibco) T4 DNA ligase dH2 O mQ TOTAL Estoque 5 M 50 M 10 mM Reao 1 l 1 l 1 l 5 l 1 l 16 l 25 l

25 l de mix a cada amostra j digerida, num volume final de 50 l e incubar a 20C por 2 horas Aps a ligao fazer uma diluio1:10 em TE. Reao de Pr -Amplificao Estoque 10 mM Reao 200 l 0,1 M Volume 1 reao 1,02 l 0,55 l 0,1 M 0,6 l 1x 5,1 l 38,13 l 0,6 l 5 l 51 l

dNTPs Primer EcoRI 9,2 M Primer HpaII 8,67 M Tampo 10x (kit Gibco) 10 X dH2 O mQ Taq polimerase DNA diludo TOTAL

Reao de Amplificao Estoque 10 mM 27,8 ng/ l 6,7 ng/ l 10 X Reao 100 M 0,1 l 1x Volume 1 reao 1,02 l 0,5 l 0,6 l 2,0 l 7,3 l 0,5 l 5 l 20 l

dNTPs Primer EcoRI Primer HpaII Tampo 10x dH2 O mQ Taq polimerase DNA pr-amplifiado TOTAL

ESQUEMA DA REAO DE AFLP

GEL DE ACRILAMIDA PARA DNA Usado para separao sequenciamento etc. de fragmentos amplificados de microssatlites, AFLP, CAPS,

Preparar soluo de 30% de acrilamida. ATENO ACRILAMIDA TXICA E DEVE SER MANIPULADA COM CUIDADO. USAR LUVAS E MSCARA AT A POLIMERIZAO. Soluo 30% de acrilamida TXICO POTENTE NEUROTOXINA Acrilamida 29 g N,N metilenebisacrilamida 1 g H2 O para 100 ml Aquecer a 37o C para dissolver Manter a soluo sob penumbra (evitar luz direta) 5 x TBE H2 O mQ 700 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 20 ml Tris Base 54 g cido Brico 27,5 g Completar o volume para 1 litro de gua Usar 1 x TBE com pH aproximado de 8,3 para Gel de Acrilamida. Solues concentradas (5x) de TBE formam um precipitado quando so armazenadas por longos perodos. Para evitar problemas, armazena-se o estoque 5 x TBE em garrafas de vidro temperatura ambiente e descarte solues com precipitado. Originalmente, TBE era utilizado na concentrao de 1 x (isto uma diluio de 1:5 do estoque concentrado) para gel de agarose. Entretanto, a concentrao de 0,5 x prov poder tampo mais que suficiente, hoje em dia utiliza-se eletroforese em gel de agarose a 0,5 x de TBE (diluio 1:10). Para gis de acrilamida, usa-se a concentraod e trabalho de 1 x. O reservatrio de tampo superior de cubas verticais usdas para gis de acrilamida so pequenso e a quantidade de corrente que passa atravs do gel cosnidervel, requerendo TBE 1x para ter pdoer tampo suficiente. Persulfato de Amnia: fazer fresco no dia 50 mg/500 ? l

P ROTOCOLO DE GEL N O -D ESNATURANTE:Gel de Poliacrilamida gel Protean pequeno 6% H2 O mQ 9 ml Acrilamida 30% 3 ml TBE 5X 3 ml Persulfato de Amnia 10% 80 l TEMED 40 l TOTAL 15 ml

Gel de Poliacrilamida gel Protean grande 6% H2 O mQ 30 ml Acrilamida 30% 10 ml TBE 5X 10 ml Persulfato de Amnia 10% 210 l TEMED 82 l

6% 18 ml 6 ml 6 ml 150 l 50 l

9% 15 ml 9 ml 6 ml 100 l 50 l

TOTAL 50 ml 30 ml 30 ml A soluo de acrilamida solidifcada pela polimerizao devido a adio de TEMED e de persulfato de amonia. Aps a solidificao, carregar normalmente empregando um tampo de carregamento com azul de bromofenol. Correr o gel a 120 V por 4 horas para AFLP.

P ROTOCOLO DE GEL D ESNATURANTE :Eletroforese em cuba de sequenciamento: Tratamento das placas de vidro para facilitar a manipulao e colorao do gel: As placas de vidro devem ser tratadas, sendo a maior (42 x 42 cm) com 1 ml de Repel Plus One (. Aps a secagem, o excesso do produto deve ser retirado com leno de papel umedecido em gua destilada. A outra placa de vidro (menor) de 39 x 42 cm deve receber soluo de 4 ? l de Bind Silane PlusOne em 1 ml de 0,5% cido actico em 95% etanol. Aps secagem, o excesso deve ser retirado com leno de papel umedecido em etanol 95%. Preparo do gel: O gel de poliacrilamida 6% em 1x TBE 1X, e 7 M uria, 10% persulfato de amnia, Temed preparado na seguinte proporo.

Soluo 30% de acrilamida TXICO POTENTE NEUROTOXINA Acrilamida 29 g Bis N,N metilenebisacrilamida 1g H2 O para 100 ml Soluo de acrilamida e 7 M urea em TBE para gel de sequenciamento

Soluo de Acrilamida 30% 100 ml TBE 5 x 100 ml Urea 210 g H2 O para 500ml Gel de Poliacrilamida de Sequenciamento Soluo de Gel (Acrilamida com urea 7 M) Persulfato de Amnia 10% TEMED TOTAL 6% 50 ml 200 ? l 84 ? l 6% 70 ml 250 l 100 l

50 ml 70 ml (gel 0.2 mm) (0.5 mm)

Carregar no gel com cuidado de modo a evitar a formao de bolhas. A espessura do gel de 0,2 a 0,5 mm! Preparo das amostras : adicionar nas amostras de PCR antes de carregar no gel, um volume na proporo de 1:1/2 de tampo de carregamento (95% formamida, 0,05% xylene cyanol, 0,05% bromophenol blue, 12,5% sacarose, 10mM NaOH). Adicionar 7 ? l de tampo de carregamento em 10 ? l de reao de PCR. As amostras so desnaturadas a 94o C por 5 minutos e mantidos em gelo at o carregamento. Eletroforese: Pr-corrida: 65 W por 40 a 60 minutos (at aquecer o gel a 50-55C); Corrida: 50-60 W em tampo 1 x TBE por 2 horas para AFLP e 1 hora e 50 minutos para microssatlite. Colorao de Prata Silver Staining baseado em Sanguinetti et al., (1994) 1 soluo fixadora 10% etanol, 0,5 % cido actico por 3 minutos 2 soluo fixadora + 0,2% de nitrato de prata (2 g/l) por 5 minutos 3 Lavar uma vez, por 20 segundos e 1 vez por 1 minuto em gua mQ 4 soluo reveladora (3% NaOH + 0,5% formaldedo) at aparecer bandas (cerca 5 minutos) 5 soluo fixadora pro 5 minutos 6- H2 O por 10 minutos

Soluo Fixadora (500 ml) 50 ml etanol 2,5 ml de cido actico glacial 447,5 ml de H2 O mQ Soluo Fixadora + Prata (250 ml) 25 ml de etanol 1,25 ml de cido actico 223,7 ml H2 O mQ 0,5 g de AgNO3 (prata) - adicionar por ltimo Soluo Reveladora 7,5 g NaOH 248,75 ml de H2 O mQ 1,25 ml de formaldedo colocar por ltimo Tampo de Carregamento da Amostra - usar LB feito com TE ou 0,25% Bromophenol Blue 0,25% Xyleno cyanol 15% Ficoll COLORAO COM PRATA - PROTOCOLO DE B EIDLER ET AL. (1982)

Soluo fixadora I: 10% Etanol; 1% cido actico por 10 minutos, seguida de 1 lavagem em gua. Soluo fixadora II: 1% cido ntrico por 3 minutos, seguido de 2 lavagens em gua. Soluo de Nitrato de Prata: 2g/litro de AgNO3 por 20 minutos, seguido de 2 la vagens em gua. Soluo reveladora: 30g/litro de Na2 CO3 , 540 ? l de formaldedo/litro, por 3 a 5 minutos. Soluo bloqueadora: cido actico 5% Notas: - As solues, preferencialmente devem ser preparadas no mesmo dia. - O formaldeido adicionado somente no momento de usar as solues - O developer deve estar, no momento do uso, na faixa de temperatura de 4 a 10C. Procedimento: 1- Soluo Fixadora 1 por 10 min; 2- Lavar em gua 1 x por 20 segundos, 3- Soluo fixadora 2 por 3 minutos 4- Lavar em gua destilada 2x por 20 segundos cada, 5- Soluo de NITRATO DE PRATA por 30 min.;

6- gua destilada por 10 a 20 segundos; 7- DEVELOPER at as amostras tornarem-se visveis ( normalmente at 5 min.) 8- FIX/STOP por 5min.; 9- Lavar com gua destilada por 20 segundos. PROTOCOLO DE REAGENTES ? TBE (soluo estoque) Trizma base cido brico EDTA(0,5M, pH8,0) gua para 5x 54g 27,5g 20ml 10x 108g 55g 40ml 1000ml

? EDTA 1M 372,24 g/litro 0,5 M 186,12 g/litro - Ajustar o pH com NaOH at pH 8,0. ? Tampo de carregamento para gel de poliacrilamida/prata Formamida 98% em EDTA 0,5M 20ml (19,6ml form. + 400? l EDTA) Azul de Bromofenol 5 mg Xileno Cianol 5 mg ? TE Tris-HCl (1, pH 8,0) EDTA (0,5M, pH 8,0) gua para Obs: Autoclavar. ? TRIS-HCL 1M, pH 8,0 Trizma base gua destilada para Ajustar o pH com cido clordrico (HCl). 10 ml 2 ml 1000 ml

121,1 g 1000 ml

? TAMPO DE CARREGAMENTO PARA GEL DE AGAROSE Sacarose 8g Azul de Bromofenol 0,02 g TE (pH 8,0) 20 ml Brometo de Etdio (10mg/ml) 40 ? l ? LADDER 1KB Ladder 1Kb (1? g/? l) Tampo de carregamento(agarose) TE (pH 8,0) ? dNTPs

33? l 167? l 800 ? l

dATP dGTP dTTP dCTP gua miliqui

25 ? l 25 ? l 25 ? l 25 ? l 900 ml

? Clorofrmio: lcool Isoamlico (CIA 24:1) Clorofrmio 24 ml lcool Isoamlico 1 ml Total 25 ml ? NaCl 1M NaCl gua miliqui para ? BIND (Soluo adesiva) lcool absoluto cido Actico Glacial Bind Solution

58,44 g 1000 ml 995 ? l 5 ?l 4 ?l

? REPEL ( Soluo repelente) Usar diretamente o contedo do frasco.

SOLUES PARA COLORAO COM NITRATO DE PRATA ? Soluo fixadora 1: Etanol 10% + cido actico 1%

100 ml de etanol + 10 ml de cido actico, completar com gua para um litro ?

Soluo fixadora 2: cido ntrico 1%

11,55 ml de cido ntrico 65% + 750 ml de gua ?

Soluo de colorao: Nitrato de prata 0,2%

duas gramas em um litro de gua, deixar dissolver no agitador, por no mnimo 20 minutos para evitar manchas no gel.

?

Soluo reveladora: Carbonato de sdio 30%

30 gramas de carbonato de sdio + 540? l de formaldedo, este ltimo, acrescido somente na hora do uso. ?

Soluo stop: cido actico 5%

50 ml de cido actico, completar com gua para um litro.

PROTOCOLO DE PREPARAO DE GEL DE POLIACRILAMIDA Solues necessrias: Gel de poliacrilamida 30% Acrilamida Bis 29 gramas 1 grama

H2 O para 100 ml Obs: Soluo com grande toxicidade, devendo ser preparada em cmara de fluxo laminar. Gel de poliacrilamida 6% - Soluo de trabalho Acrilamida 30% TBE 5X Uria 100 ml 100 ml 210 gramas Depois de dissolver (aquecer a 37C), completar o volume com H2 O para 500 ml, filtrar e armazenar na geladeira em recipiente escuro. Obs: Soluo com grande toxicidade, devendo ser preparada em cmara de fluxo laminar. Para cada 50 ml de soluo de poliacrilamida 6%, acrescer 84? l e 200? l de APS. Persufato de amnio 20 mg/ 200 ? l

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS CHENG, F. S.; BROWN, S. K.; WEEDEN, N. F. A DNA Extraction Protocol from Various Tissues in Woody Species. HortScience, v. 32, n. 5. p. 921-922, 1997. FERREIRA, M. E. Caracterizao da Biodiversidade e Oportunidades tecnolgicas. In: Workshop Biodiversidade: perspectivas e oportunidades tecnolgicas, I, Campinas, SP, Anais..., Brasilia: EMBRAPA-CENARGEM. 12 p., 1996. FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introduo ao uso de Marcadores Moleculares. 3 ed. Braslia: EMBRAPA-CENARGEN. 220 p, 1998. LISCUM, M., OELLER, P. AFLP: not only for fingrprinting, but for positional cloning. 10 p, 2000. disponvel em: http://carnegiedpb.standford.edu/methods/aflp MUELLER, U. G.; WOLFNBARGER, L. L. AFLP genotyping and fingerprinting. Tree, v. 14, n. 10, p. 389-394, 1999. MULLIS, K.; FALOONA, F.; SCHARF, S.; SAIKI, R.; HORN, G; ERLICH, H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, v. 1. p. 263-273, 1986 . ROMANO, E.; BRASILEIRO, A. C. M., Extrao de DNA de plantas: solues de problemas comumente encontrados. Disponvel em: http://www.biotecnologia.com.br/bio/9_f.htm. 2001.

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