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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
CARLOS ALBERTO DE ALMEIDA GADELHA
CRISTALIZAÇÃO, ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL E ATIVIDADE
BIOLÓGICA DE UMA LECTINA DE SEMENTES DE Canavalia maritima
FORTALEZA – CE
2005
CARLOS ALBERTO DE ALMEIDA GADELHA
CRISTALIZAÇÃO, ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL E ATIVIDADE BIOLÓGICA
DE UMA LECTINA DE SEMENTES DE Canavalia maritima
TESE APRESENTADA À COORDENAÇÃO DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
BIOQUÍMICA, COMO REQUISITO PARCIAL PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM BIOQUÍMICA PELA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ.
FORTALEZA – CE
2005
G12c Gadelha, Carlos Alberto de Almeida
Cristalização, estrutura tridimensional e atividade biológica de uma
lectina de sementes de Canavalia maritima / Carlos Alberto de Almeida
Gadelha. 163 f.: il., color. enc.
Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2005.
Orientador: Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada Área de concentração: Bioquímica
l. Lectinas – Cristalização, estrutura tridimensional e atividades
biológicas 2. Canavalia maritima I. Cavada, Benildo Sousa II. Universidade Federal do Ceará, Pós-graduação em Bioquímica III. Título
CDD 574.192
CDU 678.562:66.065
Esta tese foi apresentada como parte dos requisitos necessários à
obtenção do grau de Doutor em Bioquímica, outorgado pela Universidade
Federal do Ceará e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca
Central da referida Universidade.
A transcrição de qualquer trecho desta dissertação é permitida, desde que
sejam respeitadas as normas da ética científica.
Carlos Alberto de Almeida Gadelha
TESE APROVADA EM 24 / 02 / 2005
Professor Dr. Benildo Sousa Cavada
Orientador de Tese
Presidente
Prof. Dr. Valder Nogueira Freire Prof. Dr. Jorge Luiz Martins
Co-orientador Conselheiro
Prof. Dr. Marcos Hikari Toyama Prof. Dr. Vicente de Paulo Teixeira Pinto
Conselheiro Conselheiro
A Deus pela vida, existência e orientação espiritual,
Aos meus pais Moacir e Maria Inês, pela orientação para a vida,
A minha querida esposa Tatiane Santi e a minha amada filha Ana,
Ao meu orientador, Dr. Benildo S. Cavada pela orientação científica,
Aos meus amigos e companheiros de profissão,
Dedico
AGRADECIMENTOS
De modo muito especial ao Professor Doutor Benildo Sousa Cavada
pela orientação criteriosa desse trabalho, pela dedicação, compreensão,
amizade e pela oportunidade que me proporcionou para crescer
cientificamente e profissionalmente. Mas, sobretudo, pela visão futurística,
humildade e pelo exemplo de criatura humana que sempre soube demonstrar
nos momentos mais difíceis de nossa caminhada de inquietação científica.
Ao Professor, amigo e companheiro de guerra Plínio Delatorre, sem a
qual não seria possível a realização das etapas de cristalização, difração de
raios-X e resolução da estrutura tridimensional da lectina de sementes de
Canavalia maritima; sobretudo, pelo exemplo de humildade e por ter
acreditado, estimulado e tido paciência no transcorrer das etapas
supracitadas. E como não poderia jamais esquecer, a todos os membros do
grupo de cristalografia do BioMol-Lab: Bruno Anderson Mathias da Rocha,
Emmanuel Prata e Beatriz Tupinambá Freitas, pelas inúmeras contribuições
à realização deste trabalho.
Aos professores Valder Nogueira Freire (“lâmpada científica”), Jorge
Luiz Martins (“auto-ajuda”), Walter Filgueira de Azevedo Jr. (“raiz de apoio
científico”), Alexandre Holanda Sampaio (“amigo de fé”) e José Luis de Lima
Filho (“raciocínio crítico”) por tudo que já citei e pelas valiosas sugestões e
discussões apresentadas, no intuito de engrandecer este trabalho científico.
Aos Professores Juan Calvete (Instituto de Biomedicina de Valência-
Espanha), Walter Filgueira de Azevedo Jr. (Universidade Estadual Paulista
Júlio de Mesquita Filho - SP) e André Luiz Herzog (Universidade Estadual do
Ceará – CE) pelo apoio e incessantes contribuições ao BioMol-Lab nas linhas
de pesquisa de química, cristalografia e estrutura de proteínas.
Aos mais que irmãos João Batista Cajazeiras e Ricardo Pires dos
Santos pelas incessantes contribuições em todo o desenrolar deste trabalho
de tese ... Fica uma dívida de gratidão cujo valor é incalculável no universo
meramente físico.
Perdi alguns familiares (in memorian) e amigos (in vivo) durante a
realização desta nova etapa de crescimento profissional, mas também Deus
propiciou o surgimento de novos amigos dos quais jamais poderia esquecer
neste momento, como: Dárcio Ítalo Alves Teixeira, Renato Isidro, Edson
Holanda Teixeira, Rolando Rivas Castellón, Plínio Delatorre, Celso Shiniti
Nagano e Luciano da Silva Pinto.
Pelo trabalho conjunto e integrado na cristalização e resolução de
estrutura tridimensional de lectinas vegetais, meu sincero agradecimento aos
amigos e colegas do grupo de Biocristalografia: Dra. Fernanda Candury e
MSc. Frederico Bruno Mendes Batista Moreno. Este último, que tive a
oportunidade de acompanhar e conviver ao longo de sua passagem pela
iniciação científica, mestrado e ingresso no doutorado e que, semeou em
mim a idéia de trabalhar com cristalografia de proteínas e bioinformática.
Ao Prof. José Auri Pinheiro pelos valiosos ensinamentos na área de
química orgânica, que muito me facilitaram o entendimento dos mecanismos
de reação encontrados nas diversas práticas cotidianas do laboratório de
bioquímica.
Agradeço a Deus pela oportunidade de estar presente nos momentos
de crescimento de velhos e valiosos amigos como: Vicente de Paulo Teixeira
Pinto, Eder Almeida Freire, Wladimir Ronald Lobo, Creuza Maria Silveira de
Araújo Farias, Claúdia Ferreira dos Santos e Kátia Bonfim Leite.
Aos mestrandos e amigos Emmanuel Marinho e Kyria Nascimento dos
Santos pela ajuda, amizade, convivência e companheirismo demonstrados ao
longo dessa jornada.
Aos bolsistas, ex-bolsitas, estagiários e ex-estagiários da iniciação
científica do BioMol-Lab: Liazinha, Tayaná, Raquel, Karla, Cecília, Gustavo,
Victor, George, Lucas e demais novatos, pela participação silenciosa, mas
não menos importante para o desenvolvimento deste e de outros trabalhos
científicos do BioMol-Lab.
Agradeço a todos os professores e funcionários do Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular da UFC, em especial aos Professores José
Tadeu Abreu de Oliveira e Ilka Maria de Vasconcelos pelas sempre abertas
portas do conhecimento científico, no esclarecimento de dúvidas e utilização
“semi-completa” de materiais e equipamentos de seus laboratórios. Sou grato
ainda ao Departamento de Engenharia de Pesca, na pessoa dos Professores
Alexandre Holanda Sampaio, Silvana Saker Sampaio e Wladimir Ronald
Lobo, pelo apoio que também tive quando da utilização de materiais e
equipamentos de seus laboratórios.
De modo especial à Chefia do Departamento de Biologia Molecular,
Centro de Ciências Exatas e da Natureza e Pró-Reitoria de Pesquisas e Pós-
Graduação da Universidade Federal da Paraíba através do PICDT (Programa
de Incentivo à Capacitação de Docentes e Técnicos) - CAPES, pelo
empenho, confiança, ajuda e incentivo demonstrados durante meu
afastamento para capacitação docente.
As minhas primeiras professoras, Sras. Neves, Penha e Luzinete pelos
primeiros passos no aprendizado e aos mestres, em geral, que abriram novos
horizontes em minha vida. E aos eternos amigos Pe. Rafael Gasperoni, Ana
Maria de Sousa Isidro, Tio Rafael, Tio José e Tia Bibi, meus saudosos
agradecimentos pelos exemplos e ensinamentos em vida.
De modo muito especial e particular, gostaria de compartilhar e
comemorar este momento especial com as pessoas que mais amo, minha
esposa Tatiane, minha filha Ana Carolina, meus pais, Moacir e Maria Inês, e
meus sogros, Expedito e Terezinha, que nos bastidores da família tornaram
possível minha chegada ao final de mais essa etapa de crescimento
profissional e emocional. Da mesma forma, sou grato ao apoio espiritual e
emocional dos meus entes queridos Márcia, Luiza e Fernando, minha
cunhada Silvane e do amigão Nieto e demais parentes, amigos e familiares.
A todas as pessoas amigas, colegas ou não, que não foram citadas
anteriormente, mas que participaram direta ou indiretamente com ajuda
ocasional, sugestões, críticas ou conforto espiritual para a realização deste
trabalho. Minha mais especial gratidão !!!
A realização deste trabalho científico só foi possível graças ao
auxílio das seguintes instituições:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), pelos constantes auxílios de pesquisa concedidos ao BioMol-Lab
(Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas do Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular do Centro de Ciências da Universidade
Federal do Ceará).
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pelos convênios estabelecidos com o Curso de Pós-Graduação em
Bioquímica do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular do Centro
de Ciências da Universidade Federal do Ceará.
Fundação Cearense de Amparo à Pesquisa (FUNCAP), pelos
constantes auxílios de pesquisa concedidos ao BioMol-Lab.
Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
através do projeto SMOLBNet, 01/07532-0 do Prof. Dr. Walter Filgueira de
Azevedo Jr.
Ministério da Ciência e Tecnologia (MCT) através de convênio com o
Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) de Campinas-SP, para coleta
dos dados de difração de raios-X dos cristais de proteínas.
Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(PADCT/CNPq), pelos constantes auxílios de pesquisa concedidos ao
BioMol-Lab.
Universidade Federal do Ceará pelo apoio oferecido durante a
realização deste Curso de Pós-Graduação.
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BioMol-Lab), onde
grande parte deste trabalho foi realizado.
Laboratório de Sistemas Biomoleculares do Departamento de Física
da Universidade Estadual de São Paulo (UNESP), São José do Rio Preto,
São Paulo, onde parte deste trabalho foi realizado.
Laboratório de Farmacologia dos Canais Iônicos (LAFACI) do
Departamento de Fisiologia da Universidade Estadual do Ceará, onde foram
realizados os experimentos de atividade anti e pró-inflamatório, nocicepção e
contractilidade do músculo cardíaco.
“Nunca se vence uma guerra
lutando sozinho.”
RAUL SANTOS SEIXAS
“Só devemos fazer uso da palavra
para melhorar o silêncio.”
MONGE DESCONHECIDO
“Meditai se só as nações fortes podem fazer ciência...
ou se é a ciência que as fazem fortes.“
OSWALDO CRUZ
RESUMO
Cristais da lectina de sementes de Canavalia maritima (ConM) nativa
foram obtidos pelo método da difusão de vapor em gota suspensa com
solução do reservatório contendo tampão Hepes 0,1M pH 8.43 com 4% v/v
de polietilenoglicol 400 e 2M de sulfato de amônio. Através de “soaking” dos
cristais com ligantes glicídicos foram produzidos cristais da lectina
complexada aos açucares maltose e trealose. Os cristais obtidos de ConM
nativa difrataram a uma resolução máxima de 1,56 Å, pertencendo ao grupo
primitivo ortorrômbico, P21212 com parâmetros de célula de a=67.9, b=71.0,
c=97.6 Å e apresentando um dímero na unidade assimétrica (VM = 2,4 A3 Da-
1). Com base nas densidades eletrônicas dos resíduos da estrutura
tridimensional resolvida, constatou-se que a sequencia de Perez et al (1991)
apresentava erros, que quando corrigidos e comparados com a seqüência de
ConA, aumentaram para 98% o grau de similaridade entre as duas lectinas. A
estrutura de ConM nativa exibe um alto grau de enovelamento terciário, típico
das lectinas de leguminosas, com visível conservação do sítio de ligação a
metais e loops envolvidos na oligomerização molecular. Embora a
especificidade e o número de pontes de hidrogênio formadas na interação
com os dissacarídeos maltose e trealose seja a mesma, estruturalmente
ocorrem diferenças no padrão de formação de pontes de hidrogênio,
principalmente na distribuição do número de pontes de hidrogênio entre os
dois resíduos de glicose dos dissacarídeos. Os ensaios de atividade biológica
mostraram que o efeito relaxante concentração-dependente da lectina de
sementes de Canavalia maritima em anéis de aorta isolados ocorre
provavelmente através da interação com um sítio de ligação lectina-
específico presente no endotélio, resultando em liberação de óxido nítrico.
Palavras-chave: Lectina, Canavalia maritima, cristalografia.
ABSTRACT
Crystals of Canavalia maritima seeds lectin (ConM) were obtained
using the vapor diffusion method in hanging drop by sparse matrix with
reservatory solution containing 0,1 M HEPES, pH 8,43, 4% Polyethylene
Glycol 400 and 2 M ammonium sulfate. The soaking technic was used to
produce lectin crystals complexed with the carbohydrates maltose and
trehalose. ConM native crystals diffracted to 1.56 Å resolution, belonging to
the primitive orthorhombic space group P21212, with unit-cell parameters
a=67.9, b=71.0, c=97.6 Å, consisting in a dimer in the asymmetric unit (VM =
2,4 A3 Da-1), with two metal binding sites per monomer, and loops involved in
the molecular oligomerization. The structure was solved by standard
molecular replacement techniques. The wrong amino acids residues
previously suggested by manual sequencing by Perez et al. (1991) are now
determinated as I17, I53, S129, S134, G144, S164, P165, S187, V190, S169,
T196 and S202. These modifications confer 98% of similarity between ConM,
ConA and ConBr. ConM structure presents a high level of tertiary protein
folding, typically of legume lectins. Despite the specificity and the numbers of
hydrogen bonds formed in the interaction with the disaccharides maltose and
trehalose be the same, structurally changes occurs in the pattern of formation
of the hydrogen bonds, especially in the distribution in the number of
hydrogen bonds between the two glucose residues of the disaccharides. Our
biological activity data show that the relaxant concentration-dependent effect
of the seed lectin of Canavalia maritima on isolated aortic rings probably
occurs via interaction with a specific lectin-binding site on the endothelium,
resulting in a release of nitric oxide.
Key-words: Lectin, Canavalia maritima, crystallography.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 Cristais de proteínas e suas diferentes formas. (A) -
lactamase, (B) miosina V, (C) gp 120 de HIV e (D)
lisozima...................................................................................
24
FIGURA 2 Mecanismo da cristalização de macromoléculas....................
25
FIGURA 3 Diagrama de fases da solubilidade de uma proteína.............
31
FIGURA 4 Técnicas da gota suspensa e gota sentada do método de
difusão por vapor. A baixa pressão de vapor da solução do
reservatório R retira água da solução da amostra S, para
reduzir o volume da amostra Vs ao seu volume inicial Vo.
Consequentemente, a concentração da solução da amostra
[S], aumenta para um valor maior do que o da sua
solubilidade intrínseca So........................................................
37
FIGURA 5 Componentes de um cristal. A unidade assimétrica é a parte
do cristal que não apresenta simetria. Um operador de
simetria (como por exemplo, um eixo rotacional C2) gera o
motivo da rede. A repetição deste motivo por translação
gera a célula unitária, que é a unidade básica repetitiva do
cristal.......................................................................................
43
FIGURA 6 As 14 redes de Bravais em cristalografia [Adaptado de
G.H.STOUT & L.H.JENSEN (1989), X-Ray Structure
Determination, a Practical Guide, 2ed., JOHN WILEY &
SONS].....................................................................................
45
FIGURA 7 Analogia da formação da imagem por raios de luz e raios-X.
47
FIGURA 8 Efeitos do refinamento da estrutura. Mapa de densidade
eletrônica de um nucleotídeo guanina, de um fragmento de
DNA, antes (A) e depois do refinamento (B)...........................
56
FIGURA 9 Fotos de Canavalia marítima Thouars. Planta (A), flores (B),
vargens e sementes (C)..........................................................
60
FIGURA 10 Foto de exsicata com folhas, flores e frutos de Canavalia
maritima Thouars do Herbário Prisco Bezerra do
Departamento de Biologia da UFC.........................................
62
FIGURA 11 Diferentes cristais obtidos a partir da realização do
screening de cristalização da lectina de sementes de
Canavalia maritima. Cristais obtidos nas condições 4 (A), 14
(B), 16 (C) e 39 (D) do “Crystal Screen I” da Hampton
Research (Hampton Research, Riverside, CA, USA).............
75
FIGURA 12 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e
2-mercaptoetanol de farinha de sementes de Canavalia
maritima (A) e da lectina ConM obtida durante duas
diferentes cromatografias de afinidade (B). Poço 1:
marcadores de peso molecular (Citocromo C, 12.4 KDa;
Inibidor de Tripsina, 20.1 KDa; Anidrase Carbônica, 29 KDa,
Ovoalbumina, 45 KDa e Albumina sérica bovina, 66 KDa);
poço 2: farinha de sementes de Canavalia maritima (20
mg/ml) e poços 3 e 4: ConM (1 mg/ml)...................................
76
FIGURA 13 Cristal da lectina de Canavalia marítima obtido por
otimização da condição 39 (Tampão Hepes 0,1M pH 7,5
com 2% v/v de polietilenoglicol 400 e 2M de sulfato de
amônio) do Crystal Screen I da Hampton Research
(Hampton Research, Riverside, CA, USA).............................
77
FIGURA 14 Padrão de difração de raios-X de cristal de ConM nativo....... 78
FIGURA 15 Detalhe dos resíduos corrigidos na sequência manual de
ConM a partir dos dados do mapa de densidade eletrônica.
Os resíduos modificados foram os seguintes: (A) V17 por
I17, (B) S53 por I53, (C) M129 por S129, (D) T134 por
S134, (E) S144 por G144, (F) P164 por S164, (G) S165 por
P165, (H) G169 por S169, (I) T187 por S187, (J) T190 por
S190, (K) A196 por T196 e (L) P202 por S202. .....................
83
FIGURA 16 Uma visão geral da estrutura tetramérica da lectina de
sementes de Canavalia maritima (ConM). Nos "loops"
superficiais em cada um dos monômeros podem ser vistos
os sítios de ligação a Ca2+ (bolas verdes) e Mn2+ (bolas
violetas)...................................................................................
86
FIGURA 17 Alinhamento de seqüências de algumas lectinas de
sementes de espécies pertencentes a subtribo Diocleinae.
Lectinas de Canavalia ensiformis (ConA), C. brasiliensis
(ConBr), C. gladiata (CGL), C. maritima (ConM), D.
guianensis (Dguia) e Cratylia mollis (Cra) As cores
vermelhas representam os aminoácidos pequenos e os
hidrofóbicos (AVFPMILW); o azul marca os resíduos
acídicos (DE); o magenta os resíduos básicos (RHK); o
verde representa os que possuem cadeias laterais com
hidroxilas, aminas e básicas, além da glutamina
(STYHCNGQ); e o cinza refere-se aos demais. Os símbolos
“*” significam que os resíduos na coluna indicada são
idênticos em todas as seqüências; “:” indica que foram
observadas substituições conservativas e “.” indica
modificações semi-conservativas...........................................
87
FIGURA 18 Contatos entre monômeros. (A); Visão lateral dos contatos
entre os dímeros canônicos (B); Contato tipo “cross-link”
entre os dímeros canônicos (C); O círculo vermelho (C1)
representa pontes de hidrogênio que estabilizam o
tetrâmero em interação do tipo “cross-link”; os círculos
vermelhos (C2 e C3) mostram interações por ponte de
hidrogênio nos cantos dos dímeros (D)..................................
89
FIGURA 19 Densidades Densidades eletrônicas das regiões de loops da estrutura da
lectina de sementes de Canavalia maritima (ConM). Loop N-
terminal (A), Loop 159-164 (B), Loop 148-153 (C) e Loop
116-124 (D).............................................................................
91
FIGURA 20 O duplo sítio de ligação a metais do monômero de ConM
nativa.......................................................................................
92
FIGURA 21 Potencial de superfície da estrutura tetramérica de ConM
nativa. Os potenciais eletrostáticos negativos dos sítios de
ligação a carboidratos estão destacados por uma seta
amarela...................................................................................
93
FIGURA 22 Detalhe da densidade eletrônica do dissacarídeo maltose no
sítio de ligação a carboidratos da ConM.................................
95
FIGURA 23 Detalhe da densidade eletrônica do dissacarídeo trealose
no sítio de ligação a carboidratos da ConM............................
96
FIGURA 24 Detalhe do sítio de ligação a carboidratos da ConM
complexada com o dissacarídeo maltose...............................
97
FIGURA 25 Detalhe do sítio de ligação a carboidratos da ConM
complexada com o dissacarídeo trealose...............................
98
FIGURA 26 Gráfico de Ramachandran da estrutura final de ConM nativa
calculada pelo programa PROCHECK (LASKOWASKI et al.,
1993).......................................................................................
100
FIGURA 27 Desvio médio padrão na distância espacial entre as cadeias
A (azul) e D (vermelho) de ConM nativa e seus respectivos
monômeros no modelo 3ENR (BOUCKAERT et al., 2000;
BERMAN et al., 2000).............................................................
101
FIGURA 28 Gráfico de Ramachandran da estrutura final de ConM
complexada com o dissacarídeo maltose calculada pelo
programa PROCHECK (LASKOWASKI et al., 1993)..............
102
FIGURA 29 Gráfico de Ramachandran da estrutura final de ConM
complexada com o dissacarídeo trealose calculada pelo
programa PROCHECK (LASKOWASKI et al., 1993)..............
103
FIGURA 30 Desvio médio padrão na distância espacial entre as cadeias
A (azul) e D (vermelho) de ConM complexada com o
dissacarídeo maltose e seus respectivos monômeros no
modelo 3ENR (BOUCKAERT et al., 2000; BERMAN et al.,
2000).......................................................................................
105
FIGURA 31 Desvio médio padrão na distância espacial entre as cadeias
A (azul) e D (vermelho) de ConM complexada com o
dissacarídeo trealose e seus respectivos monômeros no
modelo 3ENR (BOUCKAERT et al., 2000; BERMAN et al.,
2000).......................................................................................
106
FIGURA 32 Indução do relaxamento em aorta isolada de ratos
dependente de óxido nítrico pela ConM. Os gráficos
mostram os efeitos da adição de ConM (1-100 µg/mL) em
anéis de aorta de rato pré-contraídos com 0,1 µM de
fenilefrina (PE) com endotélio intacto (A), sem endotélio
intacto (B) e com endotélio intacto previamente tratado com
L-NAME (C). W indica lavagem da preparação com solução
de Tyrode................................................................................
110
FIGURA 33 Dados médios dos experimentos comparando as respostas
nos tecidos com (●, n =7) e sem (■, n = 6) endotélio intacto
e com endotélio intacto previamente tratado com L-NAME
(□, n=5). Os valores foram expressos em percentagem (%)
de mudanças a partir da contração induzida por fenilefrina
(PE) e foram considerados como significativamente
diferentes entre tecidos com endotélio intacto e desnudo
quando p<0.05........................................................................
111
FIGURA 34 Imagens de microscopia de fluorescência de cortes
histológicos de anéis de aorta de rato. Controle (A) e tecidos
incubados com ConM marcada com fluoresceína (B)............
112
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Ensaio de Inibição por açúcaresa da atividade
hemaglutinante das lectinas de Canavalia maritima (ConM)
e Dioclea grandiflora (DGL) realizado por Ramos et al.
(1996).....................................................................................
9
TABELA 2 Fatores que afetam a cristalização de proteínas.................... 26
TABELA 3 Alguns tampões usados na cristalização de proteínas........... 39
TABELA 4 Precipitantes usados na cristalização de proteínas................ 40
TABELA 5 Os 7 sistemas cristalinos........................................................ 44
TABELA 6 Os 65 grupos espaciais possíveis em cristais de proteínas... 46
TABELA 7 Dados estatísticos finais do refinamento da estrutura da
lectina nativa de sementes de Canavalia maritima (ConM)....
79
TABELA 8 Dados estatísticos finais do refinamento da estrutura de
ConM complexada com o dissacarídeo maltose....................
80
TABELA 9 Dados estatísticos finais do refinamento da estrutura de
ConM complexada com o dissacarídeo trealose....................
81
TABELA 10 Diferenças entre resíduos de ConM seqüenciada
manualmente por Perez et al., (1991) e sequência de
ConM* determinada com base nas densidades eletrônicas
da estrutura tridimensional resolvida por cristalografia de
raios-X.....................................................................................
84
ABREVIATURAS
Resíduos de aminoácidos (código protéico – IUPAC – IUB, 1972)
Código de 1 letra Código de 3 letras Aminoácido
A ALA Alanina C CYS Cisteína D ASP Ácido aspártico E GLU Ácido glutâmico F PHE Fenilalanina G GLY Glicina H HIS Histidina I ILE Isoleucina K LYS Lisina L LEU Leucina M MET Metionina N ASN Asparagina P PRO Prolina Q GLN Glutamina R ARG Arginina S SER Serina T THR Treonina V VAL Valina W TRP Triptofano Y TYR Tirosina
PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida
SDS Dodecil sulfato de sódio
Tris Tris-hidroxiaminometano
MALDI “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization
TOF “Time of Fligth” (tempo de vôo)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................... 1
1.1 Considerações gerais................................................................. 1
1.2 A família Leguminosae............................................................... 2
1.3 O gênero Canavalia................................................................... 4
1.4 Canavalia maritima Thouars...................................................... 5
1.5 Lectinas vegetais........................................................................ 6
1.6 Lectinas de leguminosas............................................................ 6
1.6.1 Especificidade por carboidratos................................................. 8
1.6.2. Função biológica........................................................................ 9
1.6.3 Atividade biológica..................................................................... 10
1.6.4 Estrutura molecular.................................................................... 11
1.6.4.1 O monômero das lectinas de leguminosas................................ 12
1.6.4.2 Sítio de ligação a carboidratos das lectinas de leguminosas.... 13
1.6.4.3 Sítio de ligação a íons metálicos das lectinas de leguminosas.. 15
1.6.4.4 Sítios hidrofóbicos das lectinas de leguminosas........................ 16
1.6.4.5 Estrutura quaternária das lectinas de leguminosas................... 17
1.7 Cristalização e estrutura tridimensional de proteínas................ 18
1.7.1 Breve histórico e contexto atual da cristalização de proteínas.. 19
1.7.2 O que é um cristal?.................................................................... 21
1.7.3 Cristalização de proteínas.......................................................... 22
1.7.3.1 Fatores que afetam a cristalização............................................ 25
1.7.3.1.1 Pureza........................................................................................ 27
1.7.3.1.2 Solubilidade................................................................................ 27
1.7.3.1.3 Supersaturação.......................................................................... 29
1.7.3.1.4 Diagrama de fases de uma proteína.......................................... 29
1.7.3.1.5 Temperatura............................................................................... 31
1.7.3.1.6 pH............................................................................................... 32
1.7.3.1.7 Precipitantes e força iônica........................................................ 32
1.7.4 Soaking e crioproteção de cristais de proteínas........................ 34
1.7.5. Técnicas de cristalização de proteínas...................................... 35
1.7.5.1 Cristalização por difusão de vapor............................................. 36
1.7.6 O método da matriz esparsa...................................................... 37
1.7.7 Simetria e grupos espaciais....................................................... 41
1.7.8 Difração de raios-X..................................................................... 47
1.7.8.1 Índices de Miller......................................................................... 49
1.7.8.2 Fator de espalhamento atômico................................................. 50
1.7.8.3 Fator de estrutura....................................................................... 50
1.7.8.4 Espalhamento de raios-X de um cristal...................................... 51
1.7.8.5 Densidade eletrônica.................................................................. 52
1.7.8.6 O problema da fase.................................................................... 52
1.7.9 Substituição molecular............................................................... 52
1.7.9.1 Função de Patterson.................................................................. 53
1.7.9.2 Função de rotação..................................................................... 54
1.7.9.3 Função de translação................................................................. 54
1.7.10 Refinamento............................................................................... 55
1.7.10.1. Refinamento de corpo rígido...................................................... 57
1.7.10.2 Refinamento posicional.............................................................. 58
2. OBJETIVOS............................................................................... 59
2.1 Objetivo geral............................................................................. 59
2.2 Objetivos específicos................................................................. 59
3. MATERIAIS................................................................................ 60
3.1 Material vegetativo..................................................................... 60
3.1.1 Descrição botânica de Canavalia maritima Thouars.................. 61
3.2 Animais....................................................................................... 62
3.3 Materiais para purificação de proteínas..................................... 63
3.4 Materiais para cristalização e soaking de cristais...................... 63
3.5 Material para resolução da estrutura tridimensional.................. 64
3.6 Avaliação da resposta contrátil de ConM................................... 64
3.7 Experimento histológico com lectina marcada........................... 64
3.8 Outros materiais......................................................................... 64
4. MÉTODOS................................................................................. 65
4.1 Obtenção da lectina pura (ConM) de sementes de C. marítima 65
4.2 Cristalização de ConM............................................................... 66
4.3 Soaking de cristais de ConM com carboidratos......................... 67
4.4 Coleta de dados e difração de raios-X....................................... 68
4.5 Substituição molecular e refinamento........................................ 69
4.6 Avaliação da resposta contrátil de ConM................................... 69
4.7 Interação de FITC-ConM com endotélio e músculo liso da
aorta de rato...............................................................................
71
4.7.1 Processamento das amostras e obtenção de cortes
histológicos.................................................................................
71
4.7.2 Marcação da lectina com FITC.................................................. 72
4.7.3 Tratamento dos cortes histológicos com FITC-ConM................ 72
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................. 74
5.1 Cristalização da ConM nativa..................................................... 74
5.2 Difração de raios-X..................................................................... 77
5.3 Substituição molecular e refinamento........................................ 82
5.3.1 ConM nativa............................................................................... 82
5.3.2 ConM complexada com dissacarídeos...................................... 84
5.4 Estrutura tridimensional de ConM nativa................................... 85
5.5 Estrutura tridimensional de ConM complexada à maltose e
trealose.......................................................................................
94
5.6 Avaliação da qualidade das estruturas...................................... 99
5.6.1 ConM nativa............................................................................... 99
5.6.2 ConM complexada aos dissacarídeos maltose e trealose......... 101
5.7 Atividade biológica..................................................................... 107
6. CONCLUSÃO............................................................................ 113
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................... 114
8. APÊNDICE................................................................................. 138
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais
Proteínas que interagem não covalentemente com carboidratos são
muito comuns na natureza. Um exemplo disso são enzimas carboidrato-
específicas e anticorpos anti-carboidratos. Nos últimos anos uma dada classe
dessas proteínas, as lectinas, conquistou definitivamente a vanguarda da
pesquisa científica (LIS & SHARON, 1998).
Lectinas têm sido encontradas em muitos organismos, desde vírus e
bactérias até plantas e animais. São mais frequentemente purificadas por
cromatografia de afinidade em ligantes imobilizados e, mais recentemente,
através de técnicas de DNA recombinante. Em plantas, as lectinas
purificadas de espécies da família Leguminosae, formam o grupo mais
estudado de proteínas que se ligam a carboidratos (VAN DAMME et al.,
1998).
As lectinas representam um grupo heterogêneo de proteínas
oligoméricas que variam amplamente em tamanho, estrutura, organização
molecular, bem como na constituição de seus sítios de interação. No entanto,
muitas delas pertencem a famílias de proteínas distintas que compartilham
semelhanças de seqüência e características estruturais. Estas semelhanças
encontradas nas seqüências de aminoácidos de lectinas já conhecidas
facilitam a detecção e identificação de novas lectinas.
Apesar das lectinas terem sido descritas pela primeira vez na virada
do século XIX, seu estudo só começou a tomar impulso nos anos 60
(SHARON & LIS, 1989a; SHARON & LIS, 1987; KOCOUREK, 1986). Naquele
momento elas se mostraram como inestimáveis ferramentas para
investigações estruturais e funcionais de carboidratos complexos, e no
exame das transformações que ocorrem na superfície celular durante os
processos fisiológicos e patológicos, desde a diferenciação celular ao câncer
(GOLDSTEIN et al., 1997). No presente, lectinas tem sido foco de intensa
atenção devido ao fato de agirem como determinantes de reconhecimento
em vários processos biológicos (SHARON & LIS, 1989b; SHARON & LIS,
2
1993) como: limpeza de glicoproteínas do sistema circulatório; controle do
tráfego intracelular de glicoproteínas; adesão de agentes infecciosos as
células hospedeiras; recrutamento de leucócitos para os locais de
inflamação; bem como na interação entre células do sistema imune, na
doença e nas metástases. Investigações das lectinas e de sua função no
reconhecimento celular, bem como a aplicação destas proteínas para o
estudo dos carboidratos em solução e nas superfícies celulares, têm
produzido notável contribuição para os avanços da glicobiologia (DWEK,
1996). O desenvolvimento nesta última área está tendo um significante
impacto na pesquisa sobre as lectinas, de maneira que as duas estão
seguindo adiante lado a lado.
Durante a década que se passou, houve um incrível progresso na
elucidação das características que são importantes na ligação a carboidratos
das lectinas. Isto foi possível graças ao refinamento de velhas técnicas e ao
desenvolvimento de novas. Em particular, a cristalografia de raios X de alta
resolução de lectinas complexadas com seus ligantes permitiu a identificação
de grupos químicos na proteína e no carboidrato e de tipos de ligações
envolvidas nestas interações. Uma informação adicional sobre a contribuição
individual dos aminoácidos na atividade da lectina tem sido obtida a partir dos
experimentos de mutagênese sítio-dirigida e também a partir dos estudos de
modelamento molecular de proteínas. De especial interesse são os estudos
dos complexos lectina-oligossacarídeos, uma vez que fornecem a base para
o entendimento de como as lectinas reconhecem seus ligantes naturais (LIS
& SHARON, 1998).
1.2 A família Leguminosae
A família Leguminosae ou Fabaceae é composta por 650 gêneros e
18000 espécies sendo, portanto, uma das maiores famílias de plantas
floríferas do reino vegetal, juntamente com as famílias Compositae e a
Orchidaceae (BURKART, 1979; POLHILL et al., 1981). Segundo Schultz
(1968) esta família de plantas é extraordinariamente rica em plantas úteis
para o homem, boa parte pertencente originariamente à flora brasileira.
3
Quando comparadas com outras famílias, as leguminosas são
notavelmente "generalistas", apresentando desde gigantescas espécies
florestais até efêmeros e diminutos exemplares, com grande diversidade em
suas formas de desenvolvimento, modos de reprodução e defesa.
Apresentam dispersão universal, pois se estendem por todos os habitats
terrestres, do Equador aos confins de desertos secos e gelados, sendo que
muito desta diversidade encontra-se centralizada em áreas de topografia
variada com climas sazonais.
De acordo com Hymowitz (1990), os grãos de leguminosas possuem
uma grande gama de variações e estas variações estão silenciosamente
aguardando por exploração comercial. Graham e Vance (2003) citam que
apesar de ter um maior número de espécies, desempenharem funções
críticas nos ecossistemas naturais, agricultura e agroindústria, as
leguminosas continuam no segundo lugar, perdendo apenas para as
gramíneas, em importância para a alimentação humana. Milhares de
espécies de leguminosas existem, mas somente algumas, como os feijões
(Phaseolus vulgaris L. , por exemplo) e a soja (Glycine max), são utilizadas
para alimentação. O que limita o uso dos grãos de leguminosas na
alimentação humana são os fatores antinutricionais presentes nas sementes
de muitas leguminosas. Dentre eles, destacam-se os inibidores de -amilase,
arcelinas, lectinas, fitatos, substâncias fenólicas e taninos (KIGELL, 1999),
entre outros. Aliado a isso, outros problemas como baixa resistência a
doenças, intolerância à salinidade, qualidade protéica e produtividade,
limitam a utilização dos grãos de leguminosas. Apesar disso, em países
como Brasil e México, o feijão continua sendo a principal fonte de proteínas
da alimentação. Pensando na solução de alguns destes problemas, foi criado
recentemente por pesquisadores, um consórcio Internacional denominado
Phaseomics, englobando transcriptomas genômicos e proteômicos aplicados
à cultura do feijão (BROUGHTON et al., 2003).
4
1.3 O gênero Canavalia
O gênero Canavalia possui aproximadamente 60 espécies pantropicais
com predominância neotropical, já que em torno de 37 destas espécies estão
distribuídas na área neotropical e cerca 15 espécies na área paleotropical,
principalmente na parte oriental do Oceano Índico e porção ocidental do
Oceano Pacífico; umas poucas espécies são encontradas no Hawaii e
somente uma espécie, Canavalia maritima, é comum nas praias e litorais das
costas tropicais e subtropicais de ambos os hemisférios. Pelo menos 4
espécies de Canavalia são cultivadas como forrageira e alimento. Em Cuba,
C. ensiformis e C. gladiata são espécies geralmente cultivadas enquanto que
as demais espécies, são silvestres em seus respectivos habitats naturais
(MATOS et al., 2004). Canavalia ensiformis foi cultivada na América como
alimento na era pré-colombiana (SAUER, 1964; SAUER & KAPLAN, 1979;
D’ARCY, 1980; AYMARD & CUELLO, 1991) e ainda hoje é utilizada como
adubo verde. A importância do gênero Canavalia para a alimentação animal
se concentra no alto conteúdo de proteínas assimiláveis (27-29%) que
possuem nas folhas, flores, frutos e sementes (WOLFF & KWOLEX, 1971) e
por seus diversos usos dados em épocas muito antigas (NAS, 1979; SAUER
& KAPLAN, 1979). O gênero Canavalia foi classificado junto com o gênero
Galactia como promiscuo e efetivo devido ao fato de nodularem de forma
efetiva com um espectro amplo (DATE & HALLIDAY, 1980). Por outro lado,
as espécies de Canavalia estão incluídas entre as poucas sementes de
leguminosas, junto com Lathyrus sativus e espécies de Mucuna que possuem
toxinas tais como alcalóides e aminoácidos não protéicos em níveis que
podem representar um problema para a humanidade. De sorte, que nenhum
destes cultivos é de importância econômica fundamental, sendo que as
mesmas servem como forragem, cobertura verde e são usadas na
alimentação humana somente nos casos de pobreza extrema, no qual as
propriedades venenosas unem-se a outros problemas e o efeito combinado
pode ser severamente nocivo ou mesmo letal (JOHNS, 1994).
O gênero Canavalia se distingue dentro da tribo Diocleinae, a qual
pertence, por diversos caracteres morfológicos. A Classificação do gênero
5
Canavalia dentro da subtribo Diocleinae é sustentada por diversas
características tais como: folíolos e cálix eglandulares; inflorescências no
geral nodosas; presenças de bractéolas; sementes com hilo linear; presença
do aminoácido não-protéico canavanina; e número de cromossomos 2n=22
(LACKEY, 1981). Estes caracteres definem Canavalia como uma entidade
taxonômica homogênea, a qual serve de referência para sua rápida
identificação entre os demais gêneros que fazem parte desta subtribo
(MATOS et al., 2004).
O Gênero Canavalia está dividido em 4 subgêneros: Catodonia,
Wenderotia, Canavalia e Maunaloa. Catadonia e Wenderotia são próprios do
Novo Mundo; Canavalia é comum ao Velho e ao Novo Mundo; e Maunaloa é
um subgênero endêmico do Hawaii (SAUER, 1964; GILLETT et al., 1971;
FANTZ, 1976; AYMARD & CUELLO, 1991).
1.4 Canavalia maritima Thouars
Esta espécie é vulgarmente conhecida como feijão de praia e
apresenta como sinônimos botânicos Canavalia rosea (SW.) e Dolichos
maritimus Aublet. Embora seja mais comum à denominação C. maritima
Thouars desde o ano de 1813, em alguns países utiliza-se mais a
denominação Canavalia rosea (SW.), que data de 1825. Distribui-se
universalmente pelo Novo Mundo: Estados Unidos (Flórida); México; América
Central (Guatemala, Honduras, Belice, El Salvador, Nicaragua, Costa Rica,
Panamá); Antilhas Maiores (Cuba, República Dominicana, Bermudas, Haiti,
Jamaica, Porto Rico, Ilhas Virgens, Barramas, Ihas Caiman, Ilha Swan, San
Andrés); Antilhas Menores; Trinidad e Tobago; América do Sul (Brasil,
Colômbia, Venezuela, Equador, Galápagos, Peru, Guianas Francesas,
Guianas, Suriname). Velho Mundo: África (Mauritânia, Senegal, Guinea
Portuguesa, República da Guinea, Serra Leoa, Libéria, Costa do Marfim,
Ghana, Togo, Dahomey, Nigéria, Camarões, São Thomé, Gabão, República
do Congo, Angola, Moçambique, Tanganyika, Kenya, Zanzibar, Madagascar,
Rodriguez, Seychelles); Ásia (Índia, Ilha Nicobar, Burma, Malaia, Singapura,
6
Tailândia, Camboja, Vietnam, China, Formosa); Oceania (Filipinas, Norte de
Borneo, Indonésia, Nova Guínea Ocidental, Noroeste de Nova de Guínea;
Papua, Ilha Salomão, Nova Caledônia, Ilha Hawaii); Austrália (MATOS et al.,
2004).
Canavalia maritima é uma espécie comum em ambientes marinhos,
sobretudo nas praias e costas tropicais e subtropicais de ambos os
hemisférios. Nestes locais aparece sobre rochas ou matagais, onde é
pioneira nos solos arenosos das dunas e praias (D’ARCY, 1980). Canavalia
maritima e provavelmente outras espécies cultivadas de Canavalia, formam
parte da flora que se situa à deriva continental, sujeitas a serem dispersas
pelas correntes marinhas. De acordo com Matos et al. (2004) no caso de
Canavalia maritima isto é favorecido pelo fato das sementes serem flutuantes
e indefinidamente impermeáveis à água, por pelo menos um ano.
1.5 Lectinas vegetais
Muitas plantas possuem proteínas que se ligam-se a carboidratos,
vulgarmente conhecidas como lectinas. Estas proteínas são definidas
atualmente, como proteínas e/ou glicoproteínas de origem não imune que
apresentam pelo menos um sítio de ligação reversível a carboidratos ou
glicoconjugados (PEUMANS & VAN DAMME, 1995).
1.6 Lectinas de leguminosas
A família das lectinas de leguminosas compreende o maior número de
lectinas, tanto do ponto de vista de caracterização química, físico-química e
biológica como do ponto de vista estrutural (SHARON & LIS, 2003). As
lectinas de leguminosas formam uma família de proteínas que se liga a
carboidratos, encontradas em sementes, e em menor extensão em caule e
folhas, de plantas pertencentes à família Leguminosae (SHARON & LIS,
1990; LORIS et al., 1998). Há décadas são usadas como modelo para o
estudo de interações proteína-carboidrato, devido a surpreendente variedade
7
de especificidades por carboidratos, fácil obtenção e purificação
(HAMELRYCK et al., 1998). As lectinas de leguminosas apresentam em
comum uma grande similaridade de seqüência de aminoácidos que parecem
contribuir para a manutenção da estrutura tridimensional da cavidade
hidrofóbica e das folhas -pregueadas, como é o caso dos resíduos de
aminoácidos envolvidos no sítio de ligação a metais e, em menor proporção,
dos resíduos de aminoácidos envolvidos no sítio de ligação a carboidratos
(CUNNINGHAM et al., 1975).
As lectinas de sementes de leguminosas de espécies representantes
da sub-tribo Diocleinae como: Canavalia ensiformis, Canavalia brasiliensis,
Canavalia bonariensis, Canavalia gladiata, Canavalia maritima, Dioclea
grandiflora, Dioclea guianensis, Dioclea violacea, Dioclea virgata, Cratylia
floribunda e Cratylia mollis são proteínas com especificidade por glicose,
manose e seus derivados, oligoméricas, geralmente tetraméricas formadas
por subunidades iguais com massa variando de 25 a 30 KDa, cada
subunidade contendo pelo menos um sítio de ligação a carboidratos e um
sítio de ligação aos íons metálicos Ca2+ e Mn2+ (DAM et al., 1998).
Concanavalina A (ConA), isolada por James Sumner em 1919 (LIS &
SHARON, 1998) e extraída de sementes de Canavalia ensiformis, onde
chega a perfazer mais de 15% do conteúdo de proteínas totais da semente
(LORD, 1985; CARRINGTON et al., 1985), é a lectina de leguminosa mais
estudada e caracterizada. A lectina é tetramérica e cada subunidade ou
monômero apresenta massa de 27 KDa (WANG et al., 1975; LORD, 1985).
Cada subunidade é formada por um sítio de ligação a carboidratos numa
cavidade próxima aos resíduos de aminoácidos que se ligam aos íons
metálicos Ca2+ e Mn2+. ConA interage com glicose e manose através de
pontes de hidrogênio e forças de van der Waals (DEREWENDA et al., 1989;
NAISMITH & FIELD, 1996). ConA pode ainda, alterar sua estrutura
quaternária de acordo com o pH. Desta forma, em pH maior que 7,0 a lectina
é predominantemente tetramérica, enquanto que em pH inferior a 6,0 ocorre
uma predominância da forma dimérica (CUNNINGHAM et al., 1975).
8
1.6.1 Especificidade por carboidratos
A lectina mais estudada no mundo, ConA, purificada da farinha
de sementes de Canavalia ensiformis (BITTIGER & SCHNEBLI, 1976),
pertence a subtribo Diocleinae (família, Leguminosae; sub-família,
Papilionoideae; tribo, Phaseoleae). Nesta subtribo, várias espécies
pertencentes aos gêneros Canavalia (CAVADA, 1980), Dioclea (CAVADA et
al., 1996a), Cratylia (OLIVEIRA et al., 1991), Cymbosema (ROCHA, 1998),
Cleobulia (GUIMARÃES, 1998) e Galactia (ALMANZA et al., 2004), já tiveram
lectinas isoladas de suas sementes. As lectinas isoladas de espécies dessa
subtribo geralmente apresentam especificidade por glicose/manose. Todavia,
na tribo Phaseoleae foram encontradas lectinas com diferentes
especificidades, como as lectinas galactose-específicas de sementes de
Glycine max (Allen & Neuberger, 1975) e de Erythrina velutina (MORAES et
al., 1996) e as isolectinas de sementes de Phaseolus vulgaris (LEAVITT et
al., 1977), que apresentam especificidade por oligossacarídeos complexos
contendo galactose. A subtribo Diocleinae, pertencente a esta mesma tribo,
possui um grupo de lectinas com alto grau de similaridade de seqüências
(mesmos resíduos nas mesmas posições ou resíduos com substituições
conservativas) mas com diferentes potencias com relação a várias atividades
biológicas (CAVADA et al., 2001). Devido a este fato, estas lectinas, também
conhecidas como lectinas “ConA-like”, constituem um modelo fantástico para
estudos de relações estruturas/funções de proteínas. Torna-se
evidentemente claro o quanto é importante estabelecer o refinamento
estrutural do maior número destas lectinas, tanto delas na forma pura como
co-cristalizadas com diferentes carboidratos e glicoconjugados.
Estudando a especificidade por carboidratos da lectina de Canavalia
maritima e de Dioclea grandiflora, Ramos et al. (1996) encontraram que
ambas as lectinas reagem de forma similar com açucares simples e seus
derivados, inclusive com ácido N-acetilmurâmico e N-acetilneuramínico
(Tabela 1). Entretanto, os mesmos autores relataram que algumas
discrepâncias ocorreram para alguns dos açucares checados, como rafinose,
glicose e frutose.
9
Tabela 1 - Ensaio de Inibição por açúcaresa da atividade hemaglutinante das
lectinas de Canavalia maritima (ConM) e Dioclea grandiflora
(DGL) realizado por Ramos et al. (1996).
Açucares Lectinas
ConM DGL
-D(-) frutoseb 4,2 16,7
maltoseb 1,0 4,2
L(-) sorboseb 8,3 16,7
D(+) trealoseb 1,0 2,1
-D(+) melibioseb 2,1 2,1
sacaroseb 8,3 16,7
D(+) rafinoseb 16,7 NI
Ácido N-acetilmurâmicoc 4,2 4,2
Ácido N-acetilneuramínicoc 8,3 8,3
-D(+) galactoseb NI NI
Ácido Poligalacturônicod NI NI
P-nitrofenil-6-O--D(+)
galactopiranosídeoe
NI NI
-D(+) manoseb 2,1 2,1
-D(+) glicoseb 4,2 16,7
a:concentração mínima requerida para inibir 1 unidade de hemaglutinação;
NI: não inibiu mesmo nas seguintes concentrações: 33,3mMb, 8,3mMc,
0,33%d e 3,3mM e.
1.6.2 Função biológica
Apesar das lectinas de plantas terem sido descobertas há mais
de um século, e de hoje algumas destas moléculas terem se tornado tão
importantes que possam ser consideradas como insumos básicos em
biotecnologia, a função ou funções destas proteínas dentro das plantas onde
ocorrem permanecem ainda obscuras. Entretanto, muitas funções têm sido
10
propostas para as lectinas, tais como: proteção contra patógenos e insetos,
transporte e armazenamento de carboidratos, reconhecimento celular (dentro
da célula, entre células ou entre organismos), proteínas de reserva ou
reguladores de crescimento (PUSZTAI, 1991). Especula-se ainda, com fortes
evidências científicas, que estas proteínas possam estar envolvidas na
mediação de processos simbióticos entre leguminosas e bactérias do gênero
Rhizobium (MARTINEZ et al., 2004). Mais uma vez, fica nítida a idéia de
quanto maior o número de estrutura tridimensional de lectinas de
leguminosas for estabelecido, maior suporte existirá para se especular sobre
a(s) função(ões) destas proteínas dentro dos organismos onde ocorrem.
1.6.3 Atividade biológica
Apesar do desconhecimento da real função das lectinas dentro das
plantas onde ocorrem, é impressionante a versatilidade de aplicações que
têm sido estabelecidas para estas macromoléculas biológicas, existindo,
atualmente um amplo e crescente mercado de comercialização destas
proteínas. Sem querer fazer aqui uma revisão exaustiva sobre o tema, já que
não é o foco do presente estudo, e se atendo somente as lectinas “ConA-
like”, purificadas de sementes de espécies da sub-tribo Diocleinae, que são,
como dito anteriormente, altamente similares entre si, é incrível a
variabilidade de aplicações biológicas e de diferenças de potência de uma
dada atividade biológica quando se comparam os efeitos de várias destas
lectinas entre si. Assim têm sido obtidos resultados importantes quanto a
atividade linfoproliferativa (BARRAL NETTO et al., 1992), indução da síntese
de interferon gama in vitro (BARRAL NETTO et al., 1992) e in vivo (BARRAL
NETTO et al., 1996), indução de edema de patas (BENTO et al., 1993),
ativação de macrófagos (RODRIGUEZ et al., 1992), indução da secreção de
histamina por basófilos e mastócitos (GOMES et al., 1994), atividade pro- e
anti-inflamatória (ALENCAR et al., 1999; ASSREUY et al., 1999), diferentes
efeitos renais em experimentos ex vivo (TEIXEIRA et al., 2001; HAVT et al.,
2002; HAVT et al., 2003), indução da síntese de várias citocinas tanto in vitro
como in vivo (CAVADA et al., 2001), efeito anti-cariogênico (NAPIMOGA et
11
al., 2005), efeito de reconhecimento de células neoplásicas (PINTO, 2001),
indução da síntese de NO (ANDRADE et. al., 1999), indução de apoptose
(BARBOSA et al., 2001) entre outros. Não é exagero reafirmar que estas
lectinas apresentam alto grau de similaridade (mais de 95 % em alguns
casos) entre suas seqüências de aminoácidos, mas mesmo assim
apresentam comportamento diferenciado entre si quando testados em um
mesmo modelo de atividade biológica. Evidentemente que para explicar estas
diferenças se fazem necessários estudos estruturais finos tanto destas
proteínas purificas como delas complexadas com diferentes carboidrados e
glicoconjugados.
1.6.4 Estrutura molecular
Apesar da necessidade de se estabelecer a estrutura das lectinas de
sementes de espécies da subtribo Diocleinae, tanto na forma pura como
complexadas com diferentes carboidratos e glicoconjugados, e com isso se
tentar esclarecer as diferenças encontradas com relação a diferentes
atividades biológicas, poucos estudos existem acerca destas proteínas. Do
ponto de vista de estudos de estrutura molecular, a única proteína que tem
sido estudada de uma forma mais ou menos exaustiva é a ConA (SHARON &
LIS, 2003), além de alguns estudos pontuais com as lectinas de sementes de
Dioclea grandiflora (AINOUZ et al., 1987), Canavalia brasiliensis (SANZ-
APARICIO, 1997), Dioclea guianensis (WAH et al., 2001) e Cratylia mollis
(CORREIA & COELHO, 1995). Esta constatação deixa patente a
necessidade de se estabelecer a estrutura tridimensional de várias destas
lectinas, resolvendo-se cristais tanto das proteínas puras como de co-cristais
delas com diferentes monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos e
glicoproteínas para aumentar o volume de informações estruturais sobre as
mesmas e tentar, então, formular hipóteses sobre os mecânismos
moleculares de ação destas proteínas nos diferentes modelos biológicos que
atuam. Além disto, e não menos importante, estes estudos permitirão
correlações importantes de estruturas versus função e estruturas versus
atividades biológicas deste grupo de lectinas.
12
1.6.4.1 O monômero das lectinas de leguminosas
As lectinas de leguminosas no geral, são compostas por 2 ou 4
subunidades, iguais ou diferentes e com massa molecular em torno de 25 a
30 kDa. Freqüentemente, estas subunidades são constituídas por um único
esqueleto polipeptídico estabilizado por ligações não covalentes do tipo
pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e eletrostáticas, podendo ou
não formar dímeros canônicos. As lectinas da tribo Vicieae (gêneros Pisum,
Vicia, Lathyrus, e Lens) são dímeros onde cada subunidade igual é formada
por 2 cadeias polipeptídicas diferentes, uma cadeia polipeptídica leve (cadeia
α) com massa de 5-7 kDa e uma cadeia polipeptídica pesada (cadeia β) com
massa de 15-19 kDa, estabilizadas por ligações não covalentes (ROUGÉ et
al., 1987; SHARON & LIS, 1989a). Já as lectinas de espécies pertencentes a
sub-tribo Diocleinae são tetrâmeros compostos por uma mistura de
subunidades intactas formadas por uma cadeia polipeptídica (cadeia ) com
237 resíduos de aminoácidos e de subunidades fragmentadas, nas quais a
mesma cadeia polipeptídica está dividida em dois fragmentos ( e ), devido
ao fato de não ter havido a formação de uma ligação peptídica entre os
resíduos 118 e 119 (CHRISPEELS et al., 1986). Apesar de não estarem
unidos covalentemente, os fragmentos são mantidos juntos por ligações não
covalentes e formam um protômero cuja estrutura tridimensional é a mesma
da subunidade formada pela cadeia integra (cadeia ), sem descontinuidade
da estrutura primária (BECKER et al., 1975; SHARON & LIS, 1989ª).
Os diferentes monômeros ou subunidades de lectinas de leguminosas
são extremamente semelhantes e suas estruturas podem ser descritas como
um sanduíche , plano, formado por seis fitas pregueadas (a folha traseira)
e sete fitas curvadas pregueadas (a folha frontal). Uma terceira pequena
folha pregueada, consistindo de cinco fitas, mantém juntas as duas folhas
maiores (BANERJEE et al., 1996). O sítio de ligação a carboidratos é mantido
no lado côncavo do sanduíche , formado pela folha curvada (a folha da
frente), próxima ao duplo sítio de ligação a metais. A topologia do monômero
está relacionada a um enovelamento de mão direita tipo “jellyroll” (STIRK et
al., 1992), mas este contém três inserções, uma das quais está diretamente
13
envolvida na ligação a carboidratos e metais. Muitas proteínas de
processamento ou que se ligam a carboidratos possuem topologia
relacionada ao enovelamento do tipo “jellyroll” (como -D-glucanase, KEITEL
et al., 1993), galectinas, lectinas de leguminosas, proteína soro amilóide,
PNGase F (NORRIS et al., 1994, KUHN et al., 1994), celobiohidrolase I
(DIVNE et al., 1994) e dois membros da família das espermadesinas
(ROMAO et al., 1997; VARELA et al., 1997 , ROMERO et al., 1997) e o sítio
de ligação a carboidratos parece sempre ocorrer no lado côncavo do
sanduíche , na folha frontal das lectinas de leguminosas. (NORRIS et al.,
1994; LEONIDAS et al., 1995). Norris et al. (1994) sugeriram que a interação
dessa folha curvada com os “loops” de conexão que se enovelam sobre a
folha é especialmente adaptada ao sítio de ligação a carboidratos. A
similaridade entre a topologia das lectinas de leguminosas, proteína soro
amilóide e as galectinas pode ser resultado de um processo de evolução
convergente. Além disso, a arquitetura em sanduíche é especialmente
adaptada para gerar uma grande variedade de estruturas quaternárias, que
são importantes para a ligação de epitopos multivalentes ou ligantes “cross-
linkados” (HAMELRYCK et al., 1998).
Segundo Cunningham et al. (1975) é na região N-terminal de ConA
onde estão concentrados os resíduos de aminoácidos carregados, enquanto
na região C-terminal há uma predominância de resíduos hidrofóbicos,
envolvidos na ligação da lectina ao carboidrato.
1.6.4.2 Sítio de ligação a carboidratos das lectinas de leguminosas
As lectinas de leguminosas desenvolveram um conservado sítio de
ligação a carboidratos, no qual quatro resíduos conservados em sua estrutura
conferem afinidade de ligação, um “loop” variável confere especificidade e
alguns sub-sítios, ancoram resíduos adicionais de carboidratos ou grupos
hidrofóbicos (HAMELRYCK et al., 1998).
14
De acordo com Sharma e Surolia (1997), o sítio de reconhecimento a
carboidratos é formado de diversos “loops” com diferentes graus de
variabilidade. As conformações destes “loops” são determinadas pela
presença na estrutura de íons de metais de transição, como o Ca2+ e o Mg2+,
(BOUCKAERT et al., 1995; LORIS et al., 1998; BOUCKAERT et al., 2000;
LESCAR et al., 2002), cuja ausência resulta em instabilidade local e na perda
da capacidade de ligar-se a carboidratos (LORIS et al., 2004).
O sítio de ligação a carboidratos da ConA, está localizado numa
depressão na superfície da proteína e distante de 10 a 14 Å do íon Mn+2
(ALTER & MAGNUSON, 1974; HARDMAN & AINSWORTH, 1976). Os
resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação a carboidratos são TYR12,
ASN14, ASP16, LEU99, TYR100, ASP208 e ARG228 (HARDMAN &
AINSWORTH, 1976). De todos eles, somente ASP208 é conservado em
todas as lectinas de leguminosas já seqüenciadas (KONAMI et al., 1991).
Lectinas de leguminosas podem ser divididas em cinco grupos, de
acordo com a especificidade do sítio de ligação a monossacarídeos
(SHARON & LIS, 1990): Fucose específicas; GlcNAc/GlcNAc(b1-4)GlcNAc
específicas; Glc/Man específicas; Gal/GalNAc específicas e aquelas que não
se ligam a monossacarídeos simples. Dentro desses grupos, alguns
representantes idiossincráticos podem ser encontrados, como por exemplo a
DBL (Dolichos biflorus lectin), que se liga a GalNac, mas não a Gal (ETZLER
& KABAT, 1970). No sítio de ligação a carboidratos desta lectina, três dos
quatro resíduos conservados (a tríade GLY-ASN-ASP) fazem pontes de
hidrogênio com o carboidrato, enquanto que o quarto resíduo aromático
empilha-se sobre a porção hidrofóbica do carboidrato. Estes quatro resíduos
estão organizados na posição correta por dois íons metálicos ligados (um íon
Ca2+ e um íon metálico de transição), diretamente ou via moléculas de água.
Mais importante ainda é o fato de que os íons metálicos estabilizam uma
pouco usual ligação cis-peptídica entre um resíduo de alanina (ALA) e um
resíduo de ácido aspártico (ASP), posicionando assim a cadeia lateral de
ASP na correta posição para a ligação ao carboidrato (BOUCKAERT et al.,
1995). Galactose e Glicose podem ambos interagir favoravelmente com os
quatro conservados resíduos, mas devem adotar diferentes orientações
relativas para esses resíduos devido as diferentes conformações do O4.
15
Consequentemente, em lectinas de leguminosas glicose específicas como a
ConA (lectina de sementes de Canavalia ensiformis) e as lectinas de
leguminosas da tribo Vicieae, O4 e O6 interagem com a tríade GLY-ASN-
ASP (BOURNE et al., 1990; LORIS et al., 1994; NAISMITH et al., 1994),
enquanto que nas lectinas de leguminosas galactose específicas como EcorL
(Erythrina coralodendron lectin), SBA (Soybean agglutinin) ou PNA (Peanut
agglutinin), O3 e O4 interagem (BANERJEE et al., 1996; SHAANAN et al.,
1991; DESSEN et al., 1995).
Próximo ao sítio de ligação a carboidratos, sub-sítios podem estar
presentes ancorando ligantes adicionais como agliconas hidrofóbicas ou
monossacarídeos específicos. As interações produzidas por estes sub-sítios
são muito fracas para se ligar a esses grupos independentemente, sendo que
somente a função de fixação de um resíduo de açúcar central ligado no sítio
de ligação a carboidratos se torna importante. Três diferentes sub-sítios já
foram descritos. A exata especificidade destes sub-sítios pode variar de
lectina para lectina (HAMELRYCK et al., 1998). O primeiro deles se liga a
grupos hidrofóbicos, conforme descrito por Kanellopoulos et al. (1996) para a
ConA; o segundo liga-se tanto a monossacarídeos como a grupos
hidrofóbicos [(Fuc em ECorL (MORENO et al., 1997)], apenas grupos
hidrofóbicos como nas lectinas da tribo Vicieae (LORIS et al., 1994;
KORNIFELD et al., 1981; BOURNE et al., 1994a) e grupo N-acetil de GalNac
como na lectina de Dolichos biflorus (IMBERTY et al., 1994); e o terceiro tipo
de sub-sítio, se liga a monossacarídeos, como Man em ConA (NAISMITH &
FIELD, 1996; LORIS et al., 1996), Fuc nas lectinas da tribo Vicieae (BOURNE
et al., 1994b; SOKOLOWSKI et al., 1997) e na lectina de Dolichos biflorus
(IMBERT et al., 1994; CASSET et al., 1996).
1.6.4.3 Sítio de ligação a íons metálicos das lectinas de leguminosas
Nas lectinas da sub-tribo Diocleinae, cada subunidade possui um sítio
de ligação aos íons metálicos Mn2+ e Ca2+. Na ConA, o sítio de ligação a
Mn2+ é denominado S1 e o sítio de ligação a Ca2+, denominado S2, sendo
ocupados por estes íons metálicos na proteína nativa (HARDMAN &
16
AINSWORTH, 1972). O sítio de ligação ao Mn2+ é formado pelos resíduos de
aminoácidos GLU8, ASP10, ASP19, HIS24 e duas moléculas de água. Os
resíduos de aminoácidos VAL32 e SER34 estão envolvidos de forma indireta
na ligação do íon Mn2+, pois cada um desses resíduos estabelece uma ponte
de hidrogênio com uma das duas moléculas de água que estão interagindo
direto com o íon. O sítio de ligação ao Ca2+ é formado pelos resíduos de
aminoácidos ASP10, ASN14, ASP19, TYR12 e duas moléculas de água
(diferentes das moléculas de água do sítio de ligação ao Mn2+). Da mesma
forma que no sítio de ligação a Mn2+, existem dois resíduos de aminoácidos,
ASP208 e ARG228, que estão envolvidos indiretamente na ligação ao íon
Ca2+; cada um dos resíduos estabelece uma ponte de hidrogênio com uma
das duas moléculas de água do sítio de ligação ao Ca2+. Dois outros
resíduos, ASP10 e ASP19, são compartilhados pelos dois cátions
(HARDMAN & AINSWORTH, 1972; BECKER et al., 1975). Wang et al. (1975)
estudando a estrutura tridimensional da lectina de Canavalia ensiformis
(ConA), revelaram que os resíduos de aminoácidos de 1 a 42 estão
diretamente envolvidos com ligação aos metais Ca2+ e Mn2+, enquanto que os
resíduos 43 a 129 estão envolvidos nas interações das subunidades para
formarem dímeros e tetrâmeros.
Segundo Brewer et al. (1983), a ligação do Mn2+ ao sítio S1 da apo-
ConA (ConA desmetalizada) induz uma mudança conformacional na proteína
que resulta na formação do sítio S2. A ligação do Ca2+ ao sítio S2 induz a
formação do sítio de ligação a carboidratos.
1.6.4.4 Sítios hidrofóbicos das lectinas de leguminosas
Algumas lectinas de leguminosas possuem ainda sítios hidrofóbicos
que não interferem com os sítios de ligação a carboidratos (ROBERTS &
GOLDSTEIN, 1982, ROBERTS & GOLDSTEIN, 1983a,b). A função in vivo
desses sítios de ligação permanece obscura, mas o fato de estarem
presentes em lectinas de leguminosas de diferentes espécies sugere que
apresentam uma importante função biológica (HAMELRYCK et al., 1998). Um
17
desses sítios apresenta alta afinidade (106 M-1) por adenina e certos
derivados da adenina (ROBERTS et al., 1986).
Este sítio já foi encontrado em lectinas tetraméricas e lectinas
diméricas de leguminosas. Estudos de ligação sugerem que um ou dois sítios
por molécula estão presentes em lectinas tetraméricas que se ligam a
adenina. Nas lectinas de leguminosas, estes sítios são de dois tipos, os que
ocorrem dentro da subunidade ou os que se estabelecem no centro do
tetrâmero. Na ConA, o sítio da subunidade liga-se ao hormônio vegetal ácido
indolacético do grupo das auxinas (EDELMAN & WANG, 1978) e o outro
sítio, existe como uma cavidade única por tetrâmero, que se liga a adenina e
também citocinas, que são hormônios derivados da adenina (SHARON & LIS,
1990).
1.6.4.5 Estrutura quaternária das lectinas de leguminosas
Uma das características mais marcantes das lectinas de leguminosas
é a sua variabilidade de estrutura quaternária; embora a estrutura de seus
monômeros seja altamente similar, eles podem se associar em números
diferentes de tetrâmeros e dímeros (HAMELRYCK et al., 1998). O tão
conhecido dímero canônico consiste de dois monômeros que se associam
através da formação de uma folha contínua com doze fitas voltados para
fora de duas folhas traseiras planas, ao longo do comprimento do dímero.
ConA, a primeira estrutura de lectina de leguminosa reportada (BECKER et
al., 1975), consiste de dois dímeros canônicos que se empacotam entre si
com as partes centrais de suas contínuas doze fitas de folha . As fitas dos
dois dímeros estão num ângulo de quase 90o, e a interface consiste
principalmente de interações eletrostáticas. O tetrâmero da ConA foi
cristalizado em diferentes grupos espaciais, demonstrando que se trata de
um tetrâmero totalmente flexível, onde pequenas rotações e/ou translações
das subunidades são possíveis (NAISMITH et al., 1994). Isto pode também
ser ilustrado através do “mutante natural” da ConA, a ConBr (lectina de
sementes de Canavalia brasiliensis), cuja estrutura quaternária difere muito
18
pouco daquela da ConA, presumivelmente devido a uma mutação (ASP
58GLY 58) na interface dímero-dímero (SANZ-APARICIO et al., 1997).
1.7 Cristalização e estrutura tridimensional de proteínas
Se uma figura vale mais que milhares de palavras, uma estrutura
macromolecular não tem preço para um físico-bioquímico. Não existe melhor
caminho para entender a função das macromoléculas na célula que possuir
uma imagem a nível atômico de suas partes e compreender como estas
interagem com outras moléculas. Na busca pela determinação dessa imagem
ou estrutura da macromolécula em resolução atômica, embora um grande
número de novos microscópios de alta resolução tenham sido desenvolvidos,
o único método que resulta em estruturas tridimensionais confiáveis das
macromoléculas biológicas a níveis atômicos de resolução é a difração de
raios X de cristais simples (VAN HOLDE et al., 1998; DRENTH, 1994;
BUNDELL & JOHNSON, 1976).
A cristalografia, ou estudo da geometria dos cristais foi um dos tópicos
que mais interesse despertou nos primórdios da investigação das
propriedades macroscópicas dos sólidos. Esta especialidade teve sua grande
impulsão no início do século passado, com a descoberta dos raios-X. No
entanto, ainda hoje os cristalógrafos são numerosos e os problemas com que
se defrontam não perderam a atualidade, sobretudo no que se relaciona as
estruturas cristalinas extremamente complexas formadas por compostos
orgânicos, sistemas biológicos ou pelos novos materiais artificialmente
sintetizados (CULLITY, 1998).
A cristalografia de proteínas objetiva o estudo estrutural tridimensional
das proteínas através de experimentos de difração de raios-X de um cristal
protéico, tornando possível a determinação espacial da posição atômica de
todos os átomos que constituem a proteína. Esta técnica é realizada em três
etapas distintas: 1) Crescimento do cristal, 2) Coleta do padrão de difração de
raios-X do cristal, e 3) Construção e refinamento de um modelo estrutural que
se ajuste ao padrão de difração de raios-X obtido para a macromolécula
19
estudada. Nenhuma destas etapas é mais importante que as outras, e todas
as três etapas devem ser completadas para determinação da estrutura final
da macromolécula.
1.7.1 Breve histórico e contexto atual da cristalização de proteínas
A cristalização de proteínas foi desenvolvida na segunda metade do
século XIX por três razões, (a) fornecia meio para purificação de proteínas
específicas numa mistura impura num tempo em que poucos outros meios
existiam, (b) servia como demonstração de que uma proteína tinha sido
purificada, e (c) era uma interessante curiosidade de laboratório. No início, a
cristalização de vários tipos de hemoglobina não era nada além disso
(HANSEN et al., 2002), apesar da tentativa de relacionar a forma do cristal da
hemoglobina com sua evolução já ter sido feita por volta do ano 1900
(REICHERT & BROWN, 1909). As duas primeiras razões eram dominantes
no final do século XIX e bioquímicos como Osborne usaram-nas
extensivamente no isolamento e caracterização de proteínas, particularmente
das proteínas de sementes. O significado dessas primeiras pesquisas para
nós hoje é que quaisquer proteínas específicas podem ser purificadas de
uma preparação bastante impura, mas o mais importante é que estes
pioneiros foram cruciais para o estabelecimento de muitos dos fundamentos
do crescimento de cristais de proteínas que se encontram hoje em uso
(McPHERSON, 2004).
Entre 1900 e 1940 a ênfase estava no estudo das enzimas, e
novamente, a cristalização, agora nas mãos de Summer, Northrup, Kunitz,
Herriott e seus colegas (SUMNER, 1926; SUMNER & DOUNCE, 1937;
SUMNER & SOMERS, 1943; NORTHROP et al., 1948) provou ser uma
importante ferramenta no estabelecimento das propriedades e natureza das
macromoléculas catalíticas. A partir dos anos 30, uma nova aplicação para a
cristalização de proteínas surgiu como resultado dos estudos de Bernal e
Crowfort (1934), Perutz (1964), e outros, usando análise por difração de
raios-X. Atualmente, ainda que a cristalização continue sendo um
procedimento admirado e respeitado por enzimologistas e químicos de
20
proteínas, a cristalografia de raios-X e a determinação da estrutura de
macromoléculas e seus complexos permanecem como o principal objetivo
daqueles envolvidos em cristalização.
Uma mudança fundamental na investigação e aplicação da
cristalização de proteínas ocorreu na década de 80. Isto ocorreu devido ao
desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante que permitiu, pela
primeira vez aos pesquisadores, preparar grandes quantidades de proteínas
raras e indefiníveis. Hoje, a maior parte das proteínas enviadas para difração
em raios-X é de fontes recombinantes. Como conseqüência desse fato,
trabalha-se agora com amostras de proteínas mais homogêneas e com
grande reprodutibilidade, o que tem acelerado o progresso da cristalografia
de raios-X, expandindo suas aplicações e atração por bioquímicos e
biologistas moleculares (McPHERSON, 1982, 1994).
No presente, e num futuro previsível, a única técnica capaz de produzir
imagens a nível atômico das macromoléculas biológicas é a análise por
difração de raios-X de cristais simples. E, como o seu próprio nome sugere, a
aplicação da cristalografia de raios-X é absolutamente dependente dos
cristais de macromoléculas, não somente de cristais simples, mas de cristais
de suficiente tamanho e qualidade que permitam uma exata coleta de dados.
A qualidade da imagem da estrutura final é diretamente determinada pela
perfeição, tamanho e propriedades físicas da espécie cristalina, e,
consequentemente, o cristal passa a ser a o elemento-chave do processo
como um todo e o determinante definitivo de seu sucesso (McPHERSON,
2004).
O objetivo comum dos centros e consórcios de genômica estrutural é
de decifrar o mais rápido possível as estruturas tridimensionais de uma
gigantesca variedade de proteínas recombinantes derivadas de seqüências
genômicas conhecidas. Embora a cristalografia de raios-X continue sendo o
principal método necessário para se obter informações a nível de resolução
atômica de macromoléculas, tendo contribuído com cerca de 20000 das
26059 estruturas resolvidas e depositadas no Protein Data Bank até junho de
2004, seu passo limitante permanece sendo a obtenção de cristais que sejam
úteis na determinação de estruturas. Existem muitos métodos que descrevem
como cristalizar proteínas de forma satisfatória para difração de raios-X
21
(DUCRUIX & GIEGÉ, 1999; McPHERSON, 1982, 1999; BERGFORS, 1999)
mas não existe até então nenhuma abordagem completa para cristalização
de proteínas. Métodos de elevada velocidade de processamento foram
desenvolvidos nos últimos anos para clonar, expressar, purificar, cristalizar e
determinar a estrutura tridimensional de uma proteína produzida a partir de
um gene usando dispositivos automatizados, kits comercializados e
protocolos consolidados. Contudo, o número médio de estruturas de
proteínas determinadas tem sido baixo quando comparado com o número
total de proteínas purificadas (PUSEY et al., 2005).
Quando se cristaliza proteínas para análise por difração de raios-X,
necessita-se, usualmente, de macromoléculas homogêneas, altamente
puras, e o objetivo é de produzir cristais grandes e perfeitos. É importante
enfatizar que embora o número de cristais necessários seja pouco, quase
sempre a quantidade de proteína disponível é muito limitada. O que traz
graves limitações nos procedimentos e estratégias que devem ser utilizados
para a obtenção desses cristais. Embora novas metodologias, como radiação
síncrotron (HELLIWELL, 1992) e criocristalografia (GARMAN & SCHNEIDER,
1997), tenham conduzido para baixo o tamanho necessário dos cristais, não
aliviaram a necessidade de perfeição do cristal. É também bom lembrar que a
análise por raios-X é um evento singular confinado ao laboratório de pesquisa
e o produto final é o conhecimento científico básico. Os cristais, por si
mesmos, não possuem valor medicinal ou farmacêutico, mas funcionam
como soluções intermediárias no processo cristalográfico, pois fornecem
padrões de difração de raios-X que servem como dados brutos, que ao final
permitirão a visualização direta das macromoléculas ou de seus complexos
(McPHERSON, 2004).
1.7.2 O que é um cristal ?
Cristais são sólidos que, apresentam uma exata repetição de motivos
simétricos. Num cristal as moléculas estão arranjadas de maneira ordenada
ou seja, de forma regular, simétrica e repetitiva. Um cristal pode, no entanto,
ser especificamente quebrado a fim de se obter fragmentos que são versões
22
menores do cristal original. Isto pode ser feito indefinidamente, até que se
chegue à unidade básica que descreve um cristal, a célula unitária. Desse
modo, um cristal pode ter sido gerado de uma molécula através da repetição
indefinida de alguns ajustes translacionais e rotacionais. Isto é de grande
utilidade; para determinar a estrutura de um cristal, precisa-se somente
determinar a estrutura de pelo menos um componente simétrico da célula
unitária. Assim, para descrever um cristal, precisa-se pelo menos descrever a
unidade simétrica e a simetria dada pelo cristal (VAN HOLDE et al., 1998).
Segundo Ducruix e Giegé (1999), cristais são geralmente regulares com
formas e faces definidas (Figura 1), o que indica que possuem alta pureza e
perfeição em relação às moléculas que o compõe.
Cristais de proteínas são frágeis devido às fracas interações (pontes
de hidrogênio e interações hidrofóbicas) que mantém sua rede cristalina e ao
elevado conteúdo de solvente presente em seu interior (20-75%); como
conseqüência disso, são mantidos em repouso num ambiente
hermeticamente fechado e saturado com o solvente, a fim de que se possa
evitar a desidratação do cristal, que poderia acarretar o rompimento das
interações fracas da rede cristalina, resultando na desintegração do cristal. O
elevado conteúdo de solvente de alguns cristais permite a difusão de
pequenas moléculas, o que pode ser usado em estudos de cristalização de
proteínas complexadas com seus ligantes, através do soaking de cristais.
A propriedade de desviar a luz polarizada de alguns cristais de
proteínas os diferencia dos cristais de sal. Isto é possível porque cristais de
proteínas são formados por L-aminoácidos. Este é o motivo de só existirem
65 grupos espaciais em cristais de proteínas, dos 230 possíveis (BLUNDELL
& JOHNSON, 1976).
1.7.3 Cristalização de proteínas
Uma das etapas mais críticas na resolução da estrutura de uma
proteína é a sua cristalização. Ao contrário do que qualquer um poderia
esperar quando se considera a complexidade do processo de cristalização,
23
na prática a montagem do “screening” de cristalização de proteínas é
relativamente simples. Uma solução fracamente tamponada de proteína é
combinada em proporção 1:1 com um “cocktail” de cristalização, colocada em
um local mais ou menos fechado, e deixada em repouso até se aproximar de
um ponto de equilíbrio cinético. Neste contexto, as principais variáveis são a
solução de proteína, as condições químicas do “screening”, o método de
cristalização e a maneira usada para avaliar os resultados. Somente estas
fontes de variação já são suficientes para introduzir no experimento muita
incerteza e dificuldades. Isto porque os experimentos de cristalização não
são tão triviais quanto eles aparentam, o “dever de casa” em cristalização
envolve um pouco mais que pipetar soluções e fechar placas (RUPP &
WANG, 2004). Existe, então, uma grande quantidade de variáveis que devem
ser controladas para que os experimentos de cristalização tornem-se
possíveis, dentre elas, podem ser citadas: pureza das moléculas, solubilidade
e supersaturação, temperatura, pH, sais, etc (BERGFORS, 1999).
Do ponto de vista fenomenológico, cristalização é uma separação de
fase em sistema termodinamicamente metastável, supersaturado, sob
parâmetros cinéticos controlados, tendo como resultado favorável à formação
de um cristal. O cumprimento desse critério termodinâmico somente implica
que a cristalização é possível, ou seja, que é necessário mas não é condição
suficiente para a cristalização (RUPP & WANG, 2004).
A cristalização é um processo de ordenação, no qual os átomos e
moléculas assumem posições regulares no estado sólido. Em geral, o
processo de cristalização, em seu estágio inicial envolve o fenômeno de
nucleação, onde um núcleo de crescimento é formado, através da deposição
de faces cristalinas (Figura 2). Este processo pode ser considerado como um
equilíbrio dinâmico entre as partículas no estado líquido e no estado sólido.
Desta maneira o cristal cresce quando o equilíbrio é deslocado no sentido da
solidificação (STOUT & JENSEN, 1989).
24
Figura 1 - Cristais de proteínas e suas diferentes formas. (A) -lactamase,
(B) miosina V, (C) gp 120 de HIV e (D) lisozima.
Para formar um cristal, macromoléculas têm que sair de solução ou
precipitar, de uma maneira ordenada. Uma molécula sai de solução quando
sua solubilidade ultrapassa a solubilidade intrínseca So (Figura 2), que
depende de alguns fatores externos como temperatura, pressão e solvente.
Assim, como estratégia para cristalização pode-se aumentar a concentração
da proteína, por remoção do solvente; diminuir a temperatura para diminuir a
solubilidade intrínseca ou modificar a força iônica do solvente. Para haver
crescimento de cristais é necessário levar a concentração do material em
solução a uma condição de supersaturação. O passo inicial é a nucleação de
25
uma rede cristalina mínima, uma etapa de baixa probabilidade de ocorrer
num meio supersaturado. O cristal cresce por adição de moléculas a
superfície da semente (núcleo), e ocorre em concentrações próximas a
solubilidade intrínseca da molécula (VAN HOLDE et al., 1998).
Figura 2 - Mecanismo da cristalização de macromoléculas.
1.7.3.1 Fatores que afetam a cristalização
Existem muitos fatores que afetam a cristalização de macromoléculas
(McPHERSON, 1982; McPHERSON, 1999). A Tabela 2 resume alguns deles.
Estes fatores parecem, no geral, afetar a possibilidade de nucleação, grau de
crescimento do cristal e o tamanho e a qualidade dos cristais protéicos
formados (McPHERSON, 2004).
26
Assim, para um planejamento racional das condições de cristalização
é necessário o controle dos parâmetros físicos, químicos e bioquímicos. Num
experimento de cristalização de proteínas é importante controlar fatores como
pureza, solubilidade e supersaturação, temperatura, pH e força iônica, para
evitar o crescimento de núcleos pequenos e indesejáveis (DRENTH, 1994).
Tabela 2 - Fatores que afetam a cristalização de proteínas.
Físicos Químicos Bioquímicos
Temperatura
pH
Purezas ou impurezas das
macromoléculas
Superfície Tipo de precipitante Ligantes, inibidores e efetores
Metodologia Concentração do precipitante Estado de agregação das
macromoléculas
Gravidade Força iônica Modificações pós-translacionais
Pressão Íons específicos Origem da macromolécula
Tempo Grau de supersaturação Proteólise/hidrólise
Vibração/som/pertubações
mecânicas
Ambiente oxidante ou redutor Modificações químicas
Campos magnéticos e eletrostáticos Concentração de macromoléculas
Modificações genéticas
Propriedades dielétricas do meio Íons metálicos Simetria inerente da macromolécula
Viscosidade do meio Crosslinkers e poli-íons Estabilidade da macromolécula
Grau de equilíbrio Detergentes, surfactantes e
amfólitos
Ponto isoelétrico
Nucleantes homogêneos ou
heterogêneos
Impurezas não macromoleculares
Histórico da amostra
Fonte: McPHERSON (2004) Introduction to Protein Crystallization, Methods 34, 254-265.
27
1.7.3.1.1 Pureza
Extrações protéicas possuem vários reagentes e aditivos como
lipídios, ligantes ou cofatores que permanecem ao longo do processo de
purificação e só são descobertos quando a estrutura é determinada (LUECKE
et al., 1999; LAMERS et al., 2000; KLAHOLZ & MORAS, 2000). Estes
contaminantes podem influenciar de forma crucial o processo de cristalização
(RUPP & WANG, 2004). Segundo Ducruix & Giegé (1999), proteínas
desnaturadas ou amostras com micro-heterogeneidades afetam severamente
o processo de nucleação e crescimento de cristais. Assim, a purificação da
macromolécula que se deseja cristalizar é um passo limitante para a
formação de cristais. Pureza, entretanto, não é uma condição primordial para
a cristalização, visto que, cristais de proteínas podem ser obtidos de misturas
de proteína com contaminantes. Mas, tais cristais, são na maioria das vezes
bem pequenos, ou então, crescem como massas policristalinas, que não são
adequadas para estudos cristalográficos por difração de raios X. Para o uso
de técnicas de difração de raios X é necessário o uso de cristais com
próximas a 0,2mm, contudo com o aparecimento de fontes de raios X mais
intensas, tais como síncrotrons, tem sido possível a resolução de estruturas
de macromoléculas biológicas cujos cristais apresentavam dimensões
menores que 0,1mm. Como regra geral, pode-se dizer que, a baixa pureza da
macromolécula biológica é a causa bioquímica mais comum da falta de
sucesso na cristalização da mesma. Investir na completa purificação de uma
proteína é uma prioridade, cujo retorno é garantido. Quando todos os
esforços para cristalizar uma proteína falharem, o melhor recurso para
obtenção de sucesso é a sua completa purificação (McPHERSON, 2004).
1.7.3.1.2 Solubilidade
A solubilidade de um composto químico em um solvente, a uma dada
temperatura, é definida como a quantidade de composto dissolvida numa
solução em equilíbrio com um excesso de composto não dissolvido. Para
facilitar o entendimento da solubilidade de uma substância, considere-se o
28
exemplo do sal sulfato de amônio a 25 oC, que se dissolve até que sua
concentração atinja 4,1 moles por litro de água, o excesso permanece não
dissolvido. Mais sal pode ser dissolvido quando se eleva a temperatura, e
quando a temperatura é trazida de volta a 25 oC, a solução atinge à
supersaturação. O excesso de sal cristalizará, até que a concentração do sal
atinja seu valor de solubilidade a 25 oC (4,1 moles por litro de água).
No caso das proteínas, a solubilidade também é definida pelas
características do solvente, usualmente a água. Como a água é o solvente
universal de diversas substâncias químicas usadas na dissolução da solução
protéica até um dado pH (tampão), força iônica (sais), etc; estes compostos
podem afetar diretamente ou indiretamente sua solubilidade. Isto se dá por
interação direta com diferentes grupos funcionais ou de forma indireta,
através da alteração das propriedades físico-químicas do solvente,
modificando a carga líquida da proteína e consequentemente, resultando em
mudanças das forças que estabilizam a estrutura tridimensional das proteínas
(interações dipolo-dipolo, pontes de hidrogênio, interações de van der Waals
e eletrostáticas). A estabilidade das macromoléculas biológicas em solução
baseia-se na competição das interações solvente-soluto com interações
intramoleculares, as quais são necessárias para manter a estrutura da
macromolécula. O balanço das interações que controlam a solubilidade e/ou
a conformação de uma macromolécula podem ser modificadas por
temperatura, pH, sais, competidores de pontes de hidrogênio, aditivos
hidrofóbicos e solventes orgânicos (VON HIPPEL & SCHLEICH, 1969).
Conhecer a solubilidade da proteína que se deseja trabalhar é pré-
requisito para o melhor controle das condições de cristalização. Embora as
bases teóricas da solubilidade das macromoléculas biológicas ainda sejam
controversas, especialmente no que tange aos efeitos dos sais, os dados
sobre a solubilidade quase sempre se originam de determinações
experimentais. Nos últimos anos, métodos quantitativos permitiram tais
determinações, usando pequenas quantidades de proteína (MIKOL & GIEGÉ,
1989; RIES-KAUTT & DUCRUIX, 1989). O principal resultado destes
métodos foi a demonstração experimental da complexidade do
comportamento da solubilidade, enfatizando a importância da determinação
29
de diagramas de fase para o planejamento racional de experimentos de
crescimento de cristais de macromoléculas biológicas.
1.7.3.1.3 Supersaturação
Para se cristalizar uma macromolécula biológica em um dado solvente,
é necessário levar a solução a um estado de supersaturação.
Supersaturação é a aadição de mais quantidade de uma dada substância do
que pode ser dissolvida. Quanto mais supersaturada a solução protéica maior
a probabilidade que um núcleo crítico se forme e menores são os núcleos
necessários para induzir a formação do cristal. A força necessária para
conduzir a nucleação consiste em elevar a concentração da macromolécula
bem acima de sua solubilidade intrínseca. Este é um estado
termodinamicamente instável. A supersaturação pode ser atingida através da
evaporação lenta do solvente ou pela variação de alguns parâmetros como
temperatura, pH e força iônica. Em cristalografia de proteínas este estado se
consegue pelas técnicas de difusão de vapor ou por evaporação lenta (VAN
HOLDE et al., 1998).
Uma macromolécula biológica segue as mesmas leis da
termodinâmica, como qualquer outro tipo de molécula (inorgânica ou
orgânica) no que se refere à supersaturação, nucleação, e crescimento de
cristais (BOISTELLE & ASTIER, 1988). Todavia, macromoléculas biológicas
apresentam peculiaridades, porque as interações necessárias para solubilizá-
las num solvente são similares, e podem ser competitivas com as interações
intermoleculares que são responsáveis pela estrutura tridimensional da
macromolécula.
1.7.3.1.4 Diagrama de fases de uma proteína
Como a solubilidade de uma macromolécula biológica depende de
diversos parâmetros, podemos avaliar a importância de um dado parâmetro a
30
partir de uma representação bidimensional. Assim, a solubilidade de uma
proteína pode ser plotada em um gráfico chamado diagrama de fases onde a
concentração da proteína é grafada num eixo e no outro eixo, é indicado um
parâmetro a sofrer variação, normalmente a concentração de um precipitante.
Um diagrama deste tipo está representado na Figura 3, e compreende as
seguintes regiões: (1) Curva S, que separa as zonas supersaturadas e
hiposaturadas. Em um experimento onde as concentrações do agente de
cristalização e da macromolécula biológica correspondem às condições da
curva S, a solução saturada da macromolécula está em equilíbrio com a
macromolécula cristalizada. Isto corresponde à situação final do processo de
crescimento do cristal a partir de uma solução supersaturada, ou da
dissolução de cristais em uma solução hiposaturada. (2) Região
hiposaturada, situada abaixo do limite de solubilidade, nesta a solução está
hiposaturada e a macromolécula biológica nunca irá cristalizar. (3) Região
supersaturada, situada acima do limite de solubilidade, a concentração da
macromolécula biológica é maior que a concentração no equilíbrio para uma
dada concentração de precipitante. Dependendo da cinética para se atingir o
equilíbrio e do nível de supersaturação, esta região pode ser dividida em três
áreas: Área 1 ou zona metaestável, onde uma solução supersaturada pode
não nuclear, ou seja, pode não gerar cristais, por um longo período de tempo,
a menos que a solução seja mecanicamente pertubada ou uma semente (um
pequeno cristal) seja introduzida, processo conhecido como semeadura
(seeding); Área 2 ou zona de nucleação, onde o excesso da macromolécula
biológica se separa sob a forma cristalina e Área 3 ou zona de precipitação,
onde o excesso de macromolécula imediatamente se separa da solução em
um estado amorfo.
Na prática, a zona metastável (área 1) corresponde à zona ideal para
o crescimento dos cristais sem nucleação de novos cristais; a zona de
nucleação (área 2) é onde os cristais nucleiam e crescem, e zona de
precipitação (área 3) é a zona onde as proteínas não nucleiam e precipitam
saindo da solução.
31
Figura 3 – Diagrama de fases da solubilidade de uma proteína.
1.7.3.1.5 Temperatura.
A temperatura altera a solubilidade das macromoléculas biológicas em
um determinado solvente, baixas temperaturas favorecem o processo de
cristalização. Ao contrário, um aumento da temperatura aumenta a cinética
entre as macromoléculas, desfavorecendo a sua ordenação para a formação
de cristais. Na formação de bons cristais, que sirvam para a coleta de dados
de difração de raios-X, deve-se ter no meio o mínimo de perturbação possível
favorecendo um melhor empacotamento das moléculas e baixa mosaicidade.
Dessa forma, a temperatura é um fator que deve ser primordialmente
controlado nos experimentos de cristalização (DRENTH, 1994).
32
1.7.3.1.6 pH
O pH é um fator químico fundamental para o crescimento de cristais
de proteínas. Uma variação do pH modifica a carga líquida da proteína e
desta forma sua natureza do polieletrólito. Além disso, se pontes salinas
estão envolvidas na estrutura tridimensional, estas podem se quebrar e a
macromolécula pode modificar sua conformação, dificultando o processo de
ordenação das moléculas para formação de cristais (DRENTH, 1994;
McPHERSON, 2004).
Estudando modelos preditivos para a cristalização de proteínas com
base nos tipos e concentrações de reagentes de cristalização e valores de
pH e pI de proteínas já cristalizadas e resolvidas, Rupp e Wang (2004)
observaram que o pH 6,5 é o que apresenta melhor propensão significativa à
cristalização de proteínas e que os pH 4,5 e 8,5 são aqueles que menos
apresentam propensão à cristalização de proteínas.
1.7.3.1.7 Precipitantes e força iônica
A maioria dos kits comerciais de cristalização de proteínas possui
reagentes precipitantes como sulfato de amônio e polietilenoglicol. Estes
precipitantes objetivam criar uma condição de supersaturação e, atualmente
são classificados em quatro grandes categorias: saís, solventes orgânicos,
polímeros e solventes orgânicos não-voláteis (McPHERSON, 2004).
A solubilidade de macromoléculas em soluções salinas concentradas
é complicada, mas pode ser vista como simplesmente uma competição entre
os íons do sal, principalmente os ânions, e as macromoléculas pela ligação
as moléculas de água, que é essencial para a manutenção da solubilidade
(COHN & EDSALL, 1943; COHN & FERRY, 1943). Em suficientemente altas
concentrações de sal as macromoléculas ficam incomodamente privadas de
solvente, de modo que buscam fazer associações entre si para satisfazer
33
suas necessidades eletrostáticas. Neste ambiente, tanto cristais ordenados,
como precipitados amorfos desordenados podem ser formados. Alguns íons
salinos, principalmente cátions, são necessários para garantir a solubilidade
das macromoléculas. Em condições de força iônica muito baixa, a
disponibilidade de cátions é insuficiente para manter a solubilidade
macromoléculas, e nestas condições, pode também, haver formação de
cristais (McPHERSON, 2004).
A dependência de solubilidade da proteína pela concentração de saís
no meio foi estudada em termos dos fenômenos de “salting-in” e “salting-out”
foi estudada pela primeira vez por Green (1932). O aumento da solubilidade
de uma macromolécula biológica a baixa concentração salina (< 0,5M) é
chamada “salting-in”. Este fenômeno é explicado pelas interações
eletrostáticas não específicas entre a macromolécula carregada e as
espécies iônicas do sal. Segundo a teoria de Debye-Hückel para soluções
iônicas, um aumento na força iônica reduz a atividade dos íons em solução e
aumenta a solubilidade do composto iônico. Uma forma alternativa de se
tratar este fenômeno é considerar o “salting-in” como o resultado da
competição entre grupos carregados na superfície da macromolécula e íons
na solução. Na ausência de íons de solvente a macromolécula precipita
devido à atração de Coulomb entre cargas opostas em diferentes partes da
macromolécula. Se os íons são adicionados à solução eles blindam os
grupos carregados na macromolécula e aumentam a sua solubilidade. Outra
forma de precipitar uma macromolécula é feita pela adição de sal (“salting-
out”), que serve para imobilizar as moléculas de água, desta forma
aumentando a concentração efetiva da proteína, ou seja, diminuindo a sua
solubilidade. No fenômeno de “salting-out” a solubilidade da macromolécula
biológica se deve principalmente aos efeitos hidrofóbicos (McPHERSON,
2004).
Solventes orgânicos reduzem a constante dielétrica do meio,
consequentemente a blindagem dos campos elétricos que mediam as
interações macromoleculares em solução. À medida que a concentração do
solvente orgânico é aumentada, a atração entre as macromoléculas aumenta
e o solvente torna-se menos efetivo, deixando o estado sólido favorecido.
(ENGLARD & SEIFTER, 1990).
34
Alguns polímeros, como os polietilenoglícois produzem efeitos de
exclusão por volume que induzem a separação de macromoléculas em
solução. Diferentemente das proteínas os precipitantes poliméricos não
possuem conformação consistente, estorcendo-se e retorcendo-se
randomicamente em solução, ocupando mais espaço do que deviam. Isto
resulta em menos espaço de solvente disponível para as macromoléculas
que então segregam-se, agregam-se e por fim, formam cristais (INGHAM,
1990; McPHERSON, 1976). Uma das maiores vantagens do polietilenoglicol
(PEG) sobre outros precipitantes é que muitas proteínas cristalizam numa
razoavelmente estreita faixa de concentrações (4-18%) de PEG
(McPHERSON, 2004).
Estudando modelos preditivos para a cristalização de proteínas com
base nos tipos e concentrações de reagentes de cristalização e valores de
pH e pI de proteínas já cristalizadas e resolvidas, Rupp e Wang (2004)
confirmaram a evidência empírica de que o PEG, como composto com pH
próximo ao fisiológico é o reagente com maior propensão significativa à
cristalização de proteínas.
1.7.4 Soaking e crioproteção de cristais de proteínas
Quando se necessita determinar a estrutura de uma proteína
complexada a um ligante, uma das alternativas disponíveis é o “soaking”. O
“soaking” de cristais consiste em banhar o cristal já formado numa solução
contendo um excesso do ligante; podendo ser feito ao mesmo tempo do
tratamento de crioproteção, antes da coleta de dados. Geralmente, o ligante
é diluído na própria condição de cristalização. O “soaking” por 10-30 minutos
é suficiente para popular à proteína no cristal se o sítio de ligação estiver
accessível na rede cristalina. Se as moléculas de proteínas estão arranjadas
de forma que dificultem a ligação do ligante ao sítio, ou se os cristais não
toleram “soaking” por muito tempo ou ainda se ocorrer de dissolverem-se,
então a co-cristalização com o ligante deve ser tentada (McPHERSON,
2004).
35
A maior parte dos experimentos de coleta de dados de cristais é feito a
baixa temperatura (100 K) para minimizar a degradação dos cristais pelos
radicais livres gerados pela exposição aos raios-X. Isto é especialmente
importante quando se usa fontes de raios-X síncrotron. Para evitar que
cristais quebrem ao serem congelados, é necessário tratar os cristais de
proteína com um crioprotetor antes de serem submetidos ao congelamento.
Na presença do crioprotetor, a proteína e sua fina camada de solvente
circundante formaram um vidro amorfo na qual o cristal sofrerá o mínimo de
danos e manterá suas propriedades de difração (McPHERSON, 2004).
Se na condição de cristalização tiver boas concentrações de
polietilenoglicol (PEG), muito pouco ou nenhuma crioproteção será
necessária. Assim, a escolha pelo crioprotetor dependerá da composição da
solução da condição de cristalização. Se na condição de cristalização da
proteína já tiver um crioprotetor, é quase sempre ideal que se aumente sua
concentração até o valor ideal. Isto é particularmente conveniente para
soluções contendo polietilenoglicol. Entretanto, polietilenoglicois possuem
baixa solubilidade em soluções contendo altas concentrações de saís; nestes
casos, outros crioprotetores como glicerol, glicose ou sacarose são mais
suaves para a maioria das proteínas, apresentam solubilidade alta numa
grande variedade de soluções e são uma excelente escolha. Na maioria dos
casos, recomenda-se dissolver os crioprotetores numa concentração de 30 %
v/v ou w/v, somente para os PEGs 400-20000 é que a concentração pode
variar na faixa de 25-40 v/v ou w/v. Qualquer que seja a escolha de
crioproteção, é importante observar se o cristal não quebra, desintegra ou
racha durante o “crio-soaking” (McPHERSON, 2004).
1.7.5 Técnicas de cristalização de proteínas
Várias técnicas já foram desenvolvidas para facilitar o processo de
cristalização de proteínas. As duas técnicas mais amplamente utilizadas são
à difusão de vapor e a micro-diálise, ambas projetadas para variar o ambiente
da solução de forma a reduzir a solubilidade da molécula de maneira
36
controlada. Em ambos os casos, a macromolécula é inicialmente dissolvida
em uma solução tamponada, usualmente contendo uma mistura de saís e
solventes. Esta solução da amostra é fisicamente separada de um grande
volume de solvente depositado num local denominado reservatório. A
amostra e a solução do reservatório são colocadas em um sistema fechado
(Figura 4), e o solvente ou saís são removidos da solução da amostra
visando deixar as macromoléculas menos solúveis. Na técnica da micro-
diálise, o solvente é transferido por equilíbrio entre as pressões osmóticas da
amostra e do reservatório através de uma membrana semipermeável (VAN
HOLDE et al., 1998).
1.7.5.1 Cristalização por difusão de vapor
Nos métodos de cristalização baseados na difusão por vapor, os
solventes são transferidos de acordo com a pressão de vapor da amostra
versus a pressão de vapor do solvente no reservatório. A técnica foi utilizada
pela primeira vez na cristalização da tRNA (HAMPEL et al., 1968). Neste
sistema, água é retirada da amostra, que sistematicamente diminue seu
volume até que a pressão de vapor da água na amostra entre em equilíbrio
com a pressão de vapor da água presente na solução do reservatório. As
duas mais comuns técnicas de difusão por vapor são os métodos da gota
suspensa (“hanging drop”), onde a gota literalmente fica pendurada sobre o
reservatório, e o da gota sentada (“sitting drop”), onde a gota fica sentada
num poço circundado pela solução do reservatório. Um outro método que usa
a técnica de difusão por vapor é a gota sanduíche (“sandwich drop”). Destes,
o método da gota suspensa é um dos mais usuais e consiste no preparo de
gotas em lamínulas de vidro, com volume variando de 1 a 10 L de solução
da amostra acrescidas de igual quantidade da solução do reservatório (VAN
HOLDE et al., 1998; RUPP & WANG, 2004).
37
Figura 4 – Técnicas da gota suspensa e gota sentada do método de difusão
por vapor. A baixa pressão de vapor da solução do reservatório R
retira água da solução da amostra S, para reduzir o volume da
amostra Vs ao seu volume inicial Vo. Consequentemente, a
concentração da solução da amostra [S], aumenta para um valor
maior do que o da sua solubilidade intrínseca So.
1.7.6 O método da matriz esparsa
Existem hoje no mercado, disponíveis para comercialização por diversas
empresas, uma grande variedade de kits de “screening” de cristalização. Por
exemplo, a Hampton Research comercializa os “crystal screens” I e II
baseados no método da matriz esparsa de Jancarik e Kim (1991); a Decode
Biostructures comercializa os ““screenings Wizard I e II” baseados numa
38
matriz esparsa randômica e a Jena Bioscience comercializa os “screenings”
JB Screen 1-10 e o JB Screen Mixed com 240 condições (HUI & EDWARDS,
2003). Estes kits podem ser usados em conjunto com as diversas técnicas de
cristalização atualmente existentes, tornando-os a primeira e melhor escolha,
para quem deseja tentar iniciar a cristalização de uma nova proteína. Com
esses kits, nada mais é requerido além de combinar uma série de potenciais
soluções de cristalização com uma proteína de interesse com o auxílio de
uma micropipeta, selar o sistema e esperar pelo sorriso do sucesso. Às vezes
isso ocorre, às vezes não, e é neste momento que o cristalografo de
proteínas deve começar a usar própria inteligência para diagnosticar o
problema e inventar o remédio (McPHERSON, 2004).
O desenvolvimento desses práticos kits, onde um número limitado de
condições de cristalização é tentado usando-se pequenas quantidades de
proteínas, só foi possível à medida que aumentavam o número de proteínas
cristalizadas com sucesso, uma vez que as condições de cristalização se
assemelhavam e o número de precipitantes, tampões e aditivos mostrava-se
limitado. A partir da observação dos resultados preliminares destes
experimentos, tanto nas tentativas com sucesso ou não na primeira vez, foi
possível determinar quais tampões, aditivos e agentes precipitantes seriam
os mais favoráveis e a partir daí procederam-se sucessivos melhoramentos
até se conseguir cristais adequados (CARTER & CARTER, 1979).
Com base nessas observações, e considerando como apenas três os
principais fatores que afetam a cristalização (pH e materiais tampões, aditivos
e agentes precipitantes) a Dra. Jaru Jancarick, propôs o método da matriz
esparsa (JANCARICK & KIM, 1991), onde várias condições diferentes são
tentadas ao mesmo tempo para se cristalizar proteínas. Assim foram
escolhidas apenas as principais variáveis que afetam o processo de
cristalização, já que considerar todas as possibilidades para cristalização
seria inviável dado ao elevado número de variáveis físicas, químicas e
bioquímicas (Tabela 2) e a sua natureza combinatória.
No que diz respeito a variável pH e tampões, foram escolhidas cinco
diferentes condições de pH 4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5; e para cada valor de pH
foi escolhido o tampão químico que havia mostrado ser o mais adequado
para a cristalização de proteínas. A escolha de aditivos também foi baseada
39
na experiência de muitos laboratórios. Para os agentes precipitantes foram
escolhidos quatro tipos: 2-propanol, como agente volátil, 2-metil-2,4-
pentanediol (MPD) e polietileno glicol (PEG) como agentes não-voláteis, além
de vários agentes de salting-out (JANCARICK & KIM, 1991). Os principais
tampões e suas faixas de pH, bem como os precipitantes utilizados na
cristalização de proteínas encontram-se nas Tabelas 3 e 4, respectivamente.
Por tentativa e erro a matriz multidimensional de Jancarick e Kim
(1991) foi simplificada de uma proposta original de 58 condições de
cristalização para 50 condições, a forma como é comercializada atualmente
pela Hampton Research.
Tabela 3 - Alguns tampões usados na cristalização de proteínas.
Tampão
Faixa de tamponamento
Citrato de Sódio
3,0 – 6,2
Acetato de sódio
3,7 - 5,6
MES
5,5 - 6,7
Cacodilato de Sódio
~ 6,5
Imidazol
~ 6,5
HEPES
6,8 – 8,2 Tris
7,0 - 9,0
Fonte: McPHERSON (2004) Introduction to Protein Crystallization, Methods 34, 254-265.
40
Tabela 4 – Precipitantes usados na cristalização de proteínas.
Saís
Polímeros
Solventes
orgânicos
Voláteis
Solventes
orgânicos
não voláteis
Fosfato ou Sulfato de
Amônio
Polietilenoglicol (PEG)
400, 4000,...etc
Etanol
2-Metil-2,4-
Pentanediol
Sulfato de Lítio Jeffamine T Propanol e
Isopropanol
2,5-Hexadendiol
Citrato de Sódio ou de
Amônio
Jeffamine M 1,3-Propanediol Etileno Glicol 400
Fosfato de Sódio ou
Potássio
Monoetilésteres de
Polietilenoglicol
2-Metil-2,4-
Pentanediol
Cloreto de Sódio,
Potássio ou Amônio
Monoesteratos de
Polietilenoglicol
Dioxano
Acetato de Sódio ou
Amônio
Poliaminas Acetona
Sulfato de Cálcio ou
Magnésio
Butanol
Cetil-trietil Saís de
Amônio
Acetonitrila
Cloreto de Cálcio
Dimetil Sulfóxido
Nitrato de Amônio ou
Sódio
Metanol
Formato de Sódio ou
Magnésio
1,3-Butirolactona
Tartarato de Sódio ou
Potássio
Etileno Glicol 400
Sulfato de Cádmio
Fonte: McPHERSON (2004) Introduction to Protein Crystallization, Methods 34, 254-265.
41
1.7.7 Simetria e grupamentos espaciais
Existem dois níveis de simetria nos sólidos cristalinos. O mais
diretamente associado ao conceito de cristal é o da simetria translacional.
Isto significa que existem 3 vetores básicos, a1, a2 e a3 tais que uma
operação de translação do tipo
l=n1a1+n2a2+n3a3,
Onde n1, n2 e n3 são números inteiros quaisquer, positivos e
negativos, que conectam dois pontos do cristal que possuam vizinhança
absolutamente idêntica. O segundo nível de simetria se manifesta numa
escala local e diz respeito às várias operações de rotação e reflexão que
podem ser executadas com a unidade cristalina sem deslocá-la
translacionalmente. Ou seja, trata-se da chamada simetria do ponto.
A rede cristalina é um conceito geométrico empregado para
caracterizar o arranjo microscópico de um cristal. A cada ponto da rede
cristalina é agregado um átomo ou um conjunto de átomos. Se for imposta a
condição de simetria translacional expressa pela equação supracitada,
resultará num número muito limitado de redes cristalinas possíveis: são as
chamadas redes cristalinas de Bravais. As redes de Bravais são entidades
geométricas que podem ser precisamente definidas. A duas definições dadas
a seguir são equivalentes:
(i) Uma rede de Bravais é um conjunto infinito de pontos que ocupam
posições no espaço de tal forma que se nos colocarmos sobre qualquer um
deles, observaremos exatamente o mesmo arranjo e orientações dos demais
pontos. Isto significa que qualquer um dos infinitos pontos pode ser
equivalentemente tomado como origem de um sistema de referência ligado
ao cristal;
(ii) Uma rede de Bravais (tridimensional) consiste de todos os pontos
cujos vetores de posição l se apresentam nos moldes da equação
supracitada. Nesta, a1, a2, a3 são três vetores básicos, denominados vetores
42
primitivos e n1, n2, n3, conforme já foi dito, assumem todos os valores inteiros,
positivos ou negativos (ni=0, 1, 2,...).
Diz-se que os vetores primitivos são geradores da rede cristalina. A
superfície definida pelos vetores primitivos é chamada de cela unitária
primitiva ou sela primitiva, simplesmente. Uma cela primitiva preenche todo o
espaço sob a ação de operações de translação. Assim como os vetores
primitivos não são unicamente definidos, as celas primitivas também não o
são. No entanto, toda a cela primitiva contém exatamente um ponto de rede
(AZAROFF, 1990).
O empacotamento dos átomos em função de um mínimo de energia
proporciona um posicionamento simétrico entre as moléculas formando uma
rede cristalina ordenada. A menor unidade que através de rotação e
translação pode gerar toda uma célula unitária (menor unidade de repetição
possível) é denominada unidade assimétrica, que pode ser constituída de
uma única molécula ou de várias. Portanto a combinação de operações de
simetria a partir de uma unidade assimétrica leva a formação de um cristal,
ou seja, os átomos podem se posicionar em planos que através de
operações de simetria como translação, rotação, reflexão ou inversão pode-
se gerar toda uma rede cristalina (Figura 5) com repetição ordenada da célula
unitária (DRENTH, 1994).
Embora os pontos de uma rede cristalina sejam necessariamente
encontrados com maior freqüência nos cantos da célula unitária, não são
restritos a esse único posicionamento. Outros pontos da rede cristalina
podem ser encontrados no centro das faces ou no centro de massa da célula
unitária. Se pontos da rede forem encontrados apenas nos cantos a célula
unitária é primitiva e a rede (Tabela 5, Figura 6) de Bravais é designada P. Se
pontos da rede forem encontrados em cada face de lados opostos, a célula
unitária é centralizada e a rede de Bravais é designada C. Se forem
encontrados em todas as seis faces, define-se como face-centralizado e a
rede de Bravais é designada F. Por último, uma célula unitária contendo um
ponto da rede no centro de massa é corpo-centralizada e a rede de Bravais é
designada I. Existe uma correspondência entre a localização dos pontos de
rede e a simetria dos eixos. Por exemplo, se uma célula unitária é
ortorrômbica, pode possuir pontos de rede nos cantos, nos centros das faces
43
Figura 5 - Componentes de um cristal. A unidade assimétrica é a parte do
cristal que não apresenta simetria. Um operador de simetria
(como por exemplo, um eixo rotacional C2) gera o motivo da rede.
A repetição deste motivo por translação gera a célula unitária,
que é a unidade básica repetitiva do cristal.
44
Tabela 5 – Os 7 sistemas cristalinos.
Sistema
Redes de Bravais
possíveis
Métrica da Célula Unitária
Triclínico P a ≠ b ≠ c ≠ ≠
Monoclínico P, C a ≠ b ≠ c = = 90º ≠
Ortorrômbico P, C, I, F a ≠ b ≠ c = = = 90º
Tetragonal P, I a = b ≠ c = = = 90º
Trigonal P
(ou R) a = b ≠ c a = b = c
= = 90º, =120º
= = <120º, ≠ 90º
Hexagonal P a = b ≠ c = = 90º, ≠ 120º
Cúbico P, I, F a = b = c = = = 90º
Fonte: STOUT & JENSEN (1989) X-Ray Structure Determination, a Practical Guide 2ed., John Wiley & Sons
ou no centro da célula unitária, definindo P, C, I ou F como possíveis redes
cristalinas. Juntos, o tipo de rede e a simetria da célula unitária definem o
grupo espacial de um cristal. A abreviação taquigráfica para os grupos
espaciais incorpora o tipo de rede de Bravais (L) e a simetria da célula
unitária (RT onde R é a rotação e T designa o elemento translacional) na
forma L RT RT RT. Assim, o grupo espacial P 21 21 21 é uma célula primitiva
possuindo três eixos de ordem 2 paralelos entre si (VAN HOLDE et al., 1998).
45
Figura 6 – As 14 redes de Bravais em cristalografia [Adaptado de
G.H.STOUT & L.H.JENSEN (1989), X-Ray Structure
Determination, a Practical Guide, 2ed., JOHN WILEY &
SONS].
46
As operações de simetria podem ocorrer através de rotação de eixo de
simetria, de rotação de eixo de simetria seguido de translação, através de
reflexão e de inversão. A combinação das operações de simetria (rotação de
eixo, inversão e reflexão) leva a formação possível de 32 grupos simétricos
que quando combinados com as 14 redes de Bravais (que pertencem aos 7
sistemas cristalinos – Tabela 5) geram uma possibilidade de 230
grupamentos espaciais. Em cristais de proteínas não existe a possibilidade
de operações de simetria do tipo reflexão e inversão, pois as moléculas
protéicas são compostas de L-aminoácidos e, portanto, o número de
combinações possíveis fica restrito a apenas 65 grupamentos espaciais
(Tabela 6) dos 230 possíveis (DRENTH, 1994).
Tabela 6 – Os 65 grupos espaciais possíveis em cristais de proteínas.
Sistema
Classe
Símbolo do Grupo Espacial
Triclínico
1
P1
Monoclínico 2 P2, P21, C2
Ortorrômbico 222 C222, P222, P212121, P21212, P2221, C2221, F222, I222, I212121
Tetragonal 4
422 P4, P41, P42, P43, I4, I41 P422, P4212, P4122, P41212, P4222, P42212 P43212, P4322, I422, I4122
Trigonal 3 32
P3, P31, P32, R3 P312, P321, P3121, P3112, P3212, P3221, R32
Hexagonal 6 622
P6, P65, P64, P63, P62, P61
P622, P6122, P6222, P6322, P6422, P6522
Cúbico 23
432 P23, F23, I23, P213, I213
P432, P4132, P4232, P4332, F432, F4132, I432, I4132
Fonte: VAN HOLDE et al. (1998) Principles of physical biochemistry. New Jersey: Prentice
Hall. 657 p. il.
47
1.7.8 Difração de raios-X
Devido à natureza eletromagnética dos raios-X, é possível fazer uma
analogia da formação de uma imagem deste com a formação de imagem por
raios de luz (Figura 7). No microscópio ótico o objeto é iluminado por feixes
de luz, que ao serem espalhados, são coletados por uma lente objetiva, que
recombina todos os raios de luz para formar a imagem do objeto. Da mesma
forma, quando um cristal é exposto a feixes de raios-X, que após serem
espalhados são coletados por uma placa de imagem; a imagem também
pode ser reconstruída, mas para isso é necessário o conhecimento do padrão
de difração, a fase e a intensidade de cada feixe difratado, que funcionam
como a lente objetiva do microscópio ótico. Porém, num experimento de
difração de raios-X toda a informação relativa à fase é perdida, só obtemos
informações sobre as intensidades e a posição relativa dos feixes difratados
(BLUNDELL & JOHNSON, 1976).
Figura 7 – Analogia da formação da imagem por raios de luz e raios-X.
48
O comprimento de ondas dos raios-X serve perfeitamente para a
determinação de átomos separados entre si por uma ligação covalente. A
energia dos quantums para esse tipo de radiação é de cerca de 8000 eV, que
é aproximadamente a energia dos elétrons em seus orbitais. Esta
equivalência de energia leva à interações onde os elétrons de um átomo
serão os principais responsáveis pelo espalhamento dos raios-X. O número
de elétrons em um determinado volume de espaço (a densidade eletrônica)
determina quão forte um átomo espalha os raios-X. A interferência do
espalhamento de raios-X é responsável pelo fenômeno geral da difração
(VAN HOLDE et al., 1998). Durante a difração de raios-X por um cristal, o
que é medido é o conjunto de intensidades Ihkl Fhkl2, onde a intensidade é
proporcional ao quadrado do fator de estrutura. A difração de raios-X por
cristais ocorre como resultado da interação dos raios-X com a distribuição
eletrônica da carga do retículo cristalino. A natureza ordenada da distribuição
eletrônica das cargas, onde mais elétrons estão distribuídos em torno do
núcleo atômico, um arranjo regular e uma periodicidade translacional, faz
com que a superposição de espalhamentos de raios-X formem regiões de
interferências construtivas e destrutivas conforme a diferença de fase,
produzindo um padrão de difração.
Um feixe de raios X quando interage com os elétrons da matéria é
espalhado por dois processos distintos: o espalhamento Thomson e o
espalhamento Compton. No espalhamento Thomson, o campo elétrico
oscilante associado ao feixe de raios X que incide sobre um elétron, obriga
este elétron a oscilar em torno da sua posição de equilíbrio. Sabemos que
toda partícula carregada acelerada emite radiação. Assim o elétron,
submetido a um campo elétrico oscilante, emite uma onda eletromagnética,
que possui o mesmo comprimento de onda da radiação incidente, mas
defasada de 180o em relação à radiação incidente. Este espalhamento é
também denominado espalhamento elástico (BLUNDELL & JOHNSON
1976). O espalhamento Compton é uma forma completamente diferente de
espalhamento e ocorre devido ao comportamento de partícula da radiação.
Os fótons incidentes são desviados de sua trajetória pelo átomo com perda
de energia. O espalhamento Compton é também denominado espalhamento
49
inelástico. Experimentalmente, a radiação espalhada pelos materiais consiste
de duas partes. A primeira é aquela associada ao espalhamento de Thomson
e possui o mesmo comprimento de onda da radiação incidente, a segunda
parte tem comprimento de onda maior que a radiação incidente, com o
aumento do comprimento de onda sendo dependente do ângulo de
espalhamento (CULLITY, 1956).
1.7.8.1 Índices de Miller
Cristais apresentam alto grau de ordenação interna, ou seja, são
formados por repetições translacionais de moléculas ou átomos em todas as
direções. Esta periodicidade interna é descrita por uma pequena unidade de
volume uniforme da qual o cristal pode ser considerado um derivado,
chamada celula unitária. Cada célula unitária é caracterizada por três vetores
denominados a, b e c que definem suas arestas pelos ângulos , e
(DELATORRE et al., 2000).
A lei dos índices racionais estabelece que cada uma das faces de um
cristal pode ser descrita com relação a três eixos coplanares, através de três
inteiros pequenos, que são designados por h, k, l. A importância destes
índices deve-se ao fato de que estes não só descrevem as faces de um
cristal, como também, os grupos de planos paralelos do reticulo cristalino.
Portanto, os feixes de difração de um cristal, podem ser descritos pelos
mesmos, como feixes refletidos por estes planos. Estes inteiros são
denominados índices de Miller (STOUT & JANSEN, 1989). Sob as condições
da equação de von Laue, os índices de Miller definem um número inteiro de
comprimentos de onda que resultam numa reflexão observada de um cristal
tridimensional (VAN HOLDE et al., 1998).
50
1.7.8.2 Fator de espalhamento atômico
Em um átomo, o elétron não é uma carga livre. Ele está ligado ao
núcleo e ocupa uma região limitada do espaço. Portanto, sua carga deve ser
representada por uma distribuição espacial de carga (r). Quando incidi-se
um feixe de radiação com direção s0 no centro de um sistema de
coordenadas, a radiação espalhada por um átomo numa direção s é:
onde f(S) é o fator de espalhamento atômico, S é igual a (s-s0) e r é a
posição da densidade de carga espalhadora r(r)dv.
Como usualmente assume-se que a densidade de carga de todos os
átomos é esfericamente simétrica, e consequentemente centro simétrico, o
fator de espalhamento atômico também é esfericamente simétrico e real. O
fator de espalhamento atômico da maioria dos átomos existentes foram
calculados e encontram-se tabelados na International Tables of
Crystallography, Volume III (BUNDELL & JOHNSON, 1976; DRENTH, 1994).
1.7.8.3 Fator de estrutura
Numa célula unitária composta por n átomos, com seu próprio núcleo
como origem, os átomos difratarão de acordo com o seu fator de
espalhamento atômico (ƒ). Se a origem for transferida para a origem da
célula unitária, o espalhamento total pode ser escrito em termos de uma
somatória sobre as contribuições individuais dos átomos, dependendo do
arranjo dos mesmos na célula unitária (GLUSKER & TRUEBLOOD, 1985;
AZAROFF, 1990). Este espalhamento é chamado de fator de estrutura e é
dado por:
51
1.7.8.4 Espalhamento de raios-X de um cristal
Na obtenção do espalhamento de raios-X de um cristal é necessário
somar o fator de estrutura F (S) de cada célula unitária a partir de uma única
origem. O espalhamento só será notado quando a diferença de fase entre as
ondas espalhadas por células unitárias sucessivas for um múltiplo inteiro.
Sob estas circunstâncias as ondas se somam para formar uma onda
espalhada mais intensa. De maneira suscinta, numa rede unidimensional, só
é observado espalhamento quando a.S = h. Quando se leva o problema para
o plano tridimensional, com uma célula unitária definida pelos vetores a, b e
c, a condição para ocorrer difração é que as condições a.S=h, b.S=k e c.S=l
sejam satisfeitas. Cada reflexão encontrada em um padrão de difração de um
cristal pode ser ordenada como um conjunto único de índices de Miller a
partir das condições de von Laue para a difração (BUNDELL & JOHNSON,
1976; VAN HOLDE et al., 1998).
A equação do fator de estrutura, F(hkl), representa uma amostragem
da transformada do espalhamento de raios-X de uma molécula G(S) nos
pontos hkl do retículo recíproco:
Se a posição de todos os átomos da cela unitária é conhecida então o
correspondente padrão de difração pode ser calculado. Quando se coleta
dados de raios-X difratados por um cristal, a atual tecnologia em uso somente
permite que seja que se tenha acesso a intensidade I(hkl) da radiação
espalhada, todo o resto de informação a respeito da fase da radiação
espalhada é perdida (BUNDELL & JOHNSON, 1976).
52
1.7.8.5 Densidade eletrônica
O padrão de difração é a transformada de Fourier da densidade
eletrônica da estrutura e inversamente a densidade eletrônica da estrutura é
a transformada de Fourier do padrão de difração. Desta forma se os fatores
de estrutura, F(h,k,l), são conhecidos para todas as reflexões, h,k,l, então a
densidade eletrônica, (x,y,z) que representa a estrutura do cristal, pode ser
calculada para cada ponto x,y,z, na célula unitária (DRENTH, 1994).
1.7.8.6 O problema da fase
Para calcular a densidade eletrônica é necessário o conhecimento do
módulo, F(hkl), e da fase, (hkl), do fator de estrutura. Durante um
experimento de difração de raios X, só se registram as intensidades ou seja,
o módulo F(hkl), sendo que toda a informação sobre a fase é perdida.
Portanto é impossível determinar a estrutura diretamente das medidas do
padrão de difração, visto que parte da informação está perdida (DRENTH,
1994; MCREE, 1993). Assim, o problema da determinação da fase é o
problema básico em qualquer determinação de estrutura. Há quatro principais
métodos para resolução do problema da fase: substituição molecular,
substituição isomórfica múltipla, dispersão anômala múltipla e métodos
diretos (DRENTH, 1994).
1.7.9 Substituição molecular
Após a coleta dos dados de difração de raios-X de um cristal simples,
obtêm-se as diferentes intensidades referentes a cada um dos índices de
reflexões. Para que a estrutura da macromolécula biológica seja determinada
por cristalografia, é necessário conhecer não somente as intensidades devido
a cada uma das reflexões, como também à fase relativa a cada uma delas.
Entretanto, neste momento, surge um problema, nenhuma informação acerca
53
das fases pode ser obtida no experimento de difração. Partindo da
observação de que moléculas com seqüências primárias homólogas
possuem enovelamentos similares, é possível simular um modelo inicial do
cristal a ser resolvido, e deste modelo obter as informações necessárias
sobre a fase da radiação difratada pelo cristal real. Esta forma de resolver o
problema da fase é denominada método da substituição molecular, cujo
objetivo é encontrar uma primeira estrutura, passível de refinamento, da
proteína desconhecida. O método é limitado pois pressupõe a existência de
alguma estrutura resolvida, que tenha algum grau de similaridade com a
estrutura que se deseja resolver. De sorte, a limitação deste método vem
desaparecendo com o crescente número de novas estruturas depositadas no
Protein Data Bank, transformando o método numa potente ferramenta na
resolução da estrutura tridimensional das macromoléculas biológicas,
principalmente pela capacidade de resolver estruturas de proteínas de uma
mesma família (DRENTH, 1994; DELATORRE, 2000).
Na prática a maior dificuldade do método é colocar o modelo
empregado na mesma posição que a molécula real ocupa na sua rede
cristalina. Este procedimento implica em movimentos de rotação e translação
do modelo, cujas coordenadas espaciais de seus átomos referem-se ao seu
posicionamento no próprio cristal.
1.7.9.1 Função de Patterson
Espalhado dentro das intensidades observadas nos dados de difração
de raios-X está à informação da fase para cada um dos átomos individuais, e
também informação sobre as posições relativas dos átomos na célula
unitária. Quando se tenta resolver a estrutura de um cristal, por que não se
usa simplesmente as intensidades observadas para construir uma
transformada de Forrier que seja uma função das posições atômicas? Esta é
à base da função de Patterson (P). A função de Patterson possui picos nos
mapa de contorno de Patterson que correspondem às diferenças dos vetores
entre posições atômicas. A partir disso, observa-se que há uma perda de
informação à medida que se vai dos átomos no espaço real até as diferenças
54
dos vetores derivados da função de Patterson. Um bom indicador dessa
perda de informação é encontrado na simetria de um mapa de Patterson. A
simetria da célula unitária de um cristal pode ser descrita como sendo um dos
230 diferentes grupos espaciais. Contudo, a simetria do mapa de Patterson, é
limitada a somente 24 grupos, que podem ser gerados por remoção de todos
os elementos de translação dos operadores simétricos do grupo espacial do
cristal original. Assim, a função de Patterson é um mapa vetorial de
distâncias inter-atômicas da estrutura e pode ser calculada a partir de um
conjunto de dados de difração (VAN HOLDE et al., 1998; FADEL, 2000).
1.7.9.2 Função de rotação
A função de rotação é usada para encontrar a orientação correta do
modelo na rede cristalina. Isto pode ser obtido por um teste de concordância
entre as funções de Patterson calculadas do modelo e os vários dados
relativos das orientações observadas diretamente no experimento de difração
(DRENTH, 1994).
1.7.9.3 Função de translação
De posse da correta orientação da molécula na unidade assimétrica, o
próximo passo é encontrar os parâmetros translacionais para posicionar o
modelo corretamente no eixo de simetria. A melhor maneira para isso é
através do método da tentativa e erro. O modelo é transladado para dentro
da unidade assimétrica, os fatores de estrutura são calculados para esta
nova posição (Fcalc) e comparados com os fatores de estrutura observados
(Fobs). A qualidade da translação é monitorada através do cálculo de fatores
de controle. Os fatores usualmente utilizados são: o fator R (Rfactor) e o
coeficiente de correlação (CC). Para concordâncias perfeitas no processo de
substituição molecular, os valores de Rfactor devem ser 0% e do coeficiente de
correlação (CC) 100%. Na prática, valores de Rfactor inferiores a 40% e de
55
coeficiente de correlação (CC) superiores a 50% indicam que a substituição
molecular encontrou um modelo passível de refinamento (DRENTH, 1994).
De posse das rotações e translações necessárias para posicionarmos o
modelo corretamente na célula unitária, estas transformações são aplicadas
e os fatores de estrutura F(hkl) são calculados. As fases obtidas para cada
reflexão são assumidas como as fases correspondentes aos fatores de
estrutura observados, e esta informação será utilizada como ponto de partida
de um processo de refinamento, para obtenção da estrutura da molécula
difratada (DRENTH, 1994).
1.7.10 Refinamento
Refinamento é o processo de encontrar uma melhor concordância
entre o modelo proposto para a estrutura da molécula e a sua estrutura real.
Esta concordância deve refletir numa igualdade entre os fatores de estrutura
calculados (Fcalc) e os fatores de estrutura observados (Fobs). O
acompanhamento da qualidade deste processo se faz através do cálculo do
fator R (Rfactor) durante o processo. Como R pode ser minimizado
artificialmente, e considerando-se a redundância dos dados de raios-X
(BRÜNGER, 1992), uma pequena porcentagem das reflexões (em geral entre
5 e 10%) é excluída do refinamento e utilizada como um conjunto de teste no
cálculo de um novo fator R chamado Rfree, que será isento de minimização
artificial. Desta forma existem dois parâmetros de controle, o Rfactor e o Rfree.
Assim, partindo-se de um modelo com Rfactor por volta de 50%, um bom
refinamento é aquele que reduz este valor para 20% ou menos, com Rfree de
até 10% acima de Rfactor. Isto garante um bom ajuste do modelo aos dados
(Figura 8). Para macromoléculas, uma regra geraI é que o modelo refinado
para um Rfactor menor que 20% (0,2) indica um bom ajuste, e dessa forma
pode ser apresentado como uma solução para a estrutura (VAN HOLDE et
al., 1998).
56
Figura 8 – Efeitos do refinamento da estrutura. Mapa de densidade eletrônica
de um nucleotídeo guanina, de um fragmento de DNA, antes (A)
e depois do refinamento (B).
A minimização, que consiste da modificação das coordenadas
posicionais x, y e z e dos fatores de temperatura (B-factor) de cada átomo da
molécula a ser refinada, é um trabalho que apresenta uma grande quantidade
de parâmetros a serem ajustados. Para exemplificar isso, considere uma
molécula de proteína hipotética que, possuindo aproximadamente 4500
átomos (excetuando-se os hidrogênios que por possuírem somente um
elétron, usualmente são desconsiderados nos processos de refinamento)
exige o refinamento de 18.000 variáveis (x, y, z, B). Para isso, se tem como
informação, aproximadamente 54.000 reflexões medidas. Três para um é
uma relação parâmetros/variáveis muito pobre para solucionar este
problema. Um bom procedimento de refinamento necessita em média de um
número de parâmetros conhecidos 10 vezes superior ao número de variáveis
a serem refinadas (GIACOVAZZO et al., 1992). Se o número de reflexões
independentes (parâmetros), que depende da resolução, não for
suficientemente maior que o número de coordenadas a serem calculadas
(variáveis), a relação parâmetros/variáveis pode ser melhorada através de
57
informações estereoquímicas (distâncias, ângulos e outros parâmetros
geométricos entre os átomos nos resíduos de aminoácidos e nas cadeias
polipeptídicas dos aminoácidos). Simetrias não cristalográficas também
podem ser utilizadas. Estas informações podem ser aproveitadas de duas
maneiras diferentes, por procedimentos de refinamento denominados de
“constraint” e de “restraint” (DRENTH, 1994; BRÜNGER, 1992).
Se estas informações fixam ligações e ângulos, e permitem que partes
da molécula sejam consideradas como corpos rígidos, o número de variáveis
é então reduzido, melhorando a relação parâmetros/variáveis pelo processo
chamado “constraint”. Por outro lado, se as informações estereoquímicas são
utilizadas permitindo variações de parâmetros em torno de valores padrão, o
número de observações aumenta, melhorando assim a relação
parâmetros/variáveis pelo processo chamado “restraint” (DRENTH, 1994).
Na prática, um refinamento completo é feito em etapas distintas.
Primeiro o refinamento de corpo rígido e depois o refinamento posicional.
1.7.10.1 Refinamento de corpo rígido
O refinamento de corpo rígido é um tipo de refinamento que usa o
procedimento “constraint”, onde partes da estrutura ou ela toda, são refinados
como parâmetros individuais. Este procedimento é realizado como passo
inicial do refinamento, após a substituição molecular, possibilitando um
melhor posicionamento da molécula na unidade assimétrica. As coordenadas
de saída do refinamento de corpo rígido são usadas como coordenadas de
entrada para o refinamento posicional (AZEVEDO, 1997).
58
1.7.10.2 Refinamento posicional
O refinamento posicional é um tipo de refinamento que usa o
procedimento “restraint”. Neste, a função a ser minimizada consiste do termo
cristalográfico clássico S somado a vários outros termos estereoquímicos
dentre os quais: minimização clássica (S1),das distâncias atômicas (S2), dos
desvios planares (S3), dos volumes chirais (S4), dos contatos de van der
Waals (S5), dos ângulos de torsão (S6), dos desvios do modelo (S7), dos
desvios na fase (S8).
Alternativamente, alguns programas de refinamento minimizam uma
somatória composta pelo termo de raios-X (S1) e termos de energia potencial
relacionados aos parâmetros restringidos. O programa X-PLOR é um
exemplo disso, pois ao termo de raios-X podem ser adicionados, dentre
outros, os termos de energia wbondEbond, wanglEangl, wdiheEdihe, wimprEimpr,
wvdwEvdw, welecEelec, wpvdwEpvdw, wpeleEpele, onde w são os pesos de cada energia
E e os índices correspondem a energia das ligações covalentes, dos ângulos
de ligação, ângulos de torção, dos ângulos de torção usados para imposição
de planalidade e chiralidade, intramolecular de van der Waals (calculada pelo
potencial de Lennard-Jones), de repulsão ou atração eletrostática
intramolecular, de van der Waals para interações oriundas de simetrias
cristalográficas e não cristalográficas, eletrostática para interações oriundas
de simetrias cristalográficas e não cristalográficas, respectivamente
(DRENTH, 1994; BRÜNGER, 1992).
59
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O principal objetivo deste trabalho foi a cristalização e resolução da
estrutura tridimensional da lectina de sementes Canavalia maritima (ConM),
tanto na forma pura (nativa) como complexada com carboidratos visando um
melhor entendimento da interação proteína-carboidrato e das bases
estruturais de possíveis diferenças encontradas em ensaios de atividade
biológica quando comparada a outras lectinas da sub-tribo Diocleinae.
2.2 Objetivos específicos
- Obtenção de cristais da lectina pura (nativa) e complexada com
carboidratos de sementes de Canavalia maritima (ConM);
- Análise dos dados de difração de raios-X de ConM nativa e
complexada com carboidratos;
- Resolução da estrutura tridimensional de ConM nativa e complexada
com carboidratos;
- Estabelecer correlações entre estrutura e função que contribuam
para elucidar a razão de proteínas tão similares estruturalmente,
apresentarem consideráveis diferenças em sua atividade biológica;
- Avaliar as respostas de contractibilidade e efeito de relaxamento da
lectina em vasos da aorta torácica de ratos;
- Relacionar as características estruturais da lectina com as respostas
de contractibilidade e efeito de relaxamento em vasos da aorta torácica de
ratos.
60
3. MATERIAIS
3.1 Material vegetativo
O presente trabalho foi desenvolvido com sementes quiescentes de
Canavalia maritima Thouars, coletadas na Praia da Bessa, município de João
Pessoa, estado da Paraíba. As sementes foram usadas para extração da
lectina de Canavalia maritima (ConM) e as demais partes vegetativas,
estudadas, identificadas, herbarizadas e depositadas, sob a forma de
exsicata, no Herbário Prisco Bezerra (EAC), Departamento de Biologia da
UFC, sob número EAC 34708. Fotos da planta “in loco” e herbarizada são
mostradas nas Figuras 9 e 10, respectivamente. Uma descrição botânica da
espécie é feita em seguida.
Figura 9 - Fotos de Canavalia marítima Thouars. Planta (A), flores (B),
vargens e sementes (C).
61
3.1.1 Descrição botânica de Canavalia maritima Thouars
Planta com ramas rasteiras ou então trepadeiras perenes, robustas
medindo de 1,8-10 m de comprimento. Talos seríceo-pubescentes com pelos
brancos quando jovens, mas posteriormente glabros. Folhas pinadas,
trifoliadas. Folíolos de 5-10 (12) X 4-10 cm, amplamente obovados, ovados
ou orbiculares, ocasionalmente curtos, acuminados, mucronados,
amplamente cuneados, arredondados ou então truncados na base,
coríaceos, esparsamente puberulentos com curtos pelos brancos sobre
ambas as superfícies ou moderadamente densa sobre a superfície inferior e
sobre os peciólulos; pecíolo medindo de 2-7 (10) cm de comprimento; ráquis
de 1,3-3,7 cm de comprimento; peciólulos com 3-5 (9) mm de comprimento;
estípulas decíduas, lanceoladas medindo 4 mm de comprimento.
Inflorescências axilares, pendentes ou retas, prostadas porém
ascendentes no ápice, medindo de 4-18 (30) cm de comprimento sobre um
pedúnculo de 10-21 cm de comprimento, com 6-30 flores; pedicelos de 3 mm
de comprimento; bracteolas obtusas de 1,5-2 mm de comprimento.
Flores rosadas, púrpuras ou malva-azuladas. cálice tubular, medindo
de 10-12 mm de comprimento; pubescência curta, branca, esparsada a
moderadamente densa; lábio superior muito mais curto que o tubo, borda
superior constrita por detrás, não apiculada no ápice; dente mais inferior de 2
mm de comprimento, agudo, ligeiramente excedendo os lóbulos laterais
agudos. Estandarte arredondado ou elíptico, de 2,5-3 cm de comprimento e
1,5-2,1 cm de largura, emarginado; asas e quilha de cor fucsia pálida.
Vargens lineares, oblongas, moderadamente compridas medindo de 7-
15 X 2-2.5 cm, no início são apresso-pubescentes, posteriormente glabras,
as vezes com pregras, espiralmente deiscentes ou as vezes com deiscência
esplosiva, cor tostado-pálida, cada valva com bordos suturais e um bordo
extra a 3 cm do bordo ventral.
Sementes medindo de 12-18 X 7-12 (13) mm, em número de 4-9,
ovóides a subglobosas, não obliquas com a base não bruscamente afinada;
pardas com rachaduras mais escuras ou listas variando de amarelo pálido a
quase negro, elipsoidais, ligeiramente compridas, hilo de 7-8,5 (10) mm de
comprimento.
62
Figura 10 – Foto de exsicata com folhas, flores e frutos de Canavalia
maritima Thouars do Herbário Prisco Bezerra do
Departamento de Biologia da UFC.
3.2 Animais
Foram utilizados ratos (Rattus novergicus) machos da linhagem Wistar
(200-300g) procedentes do Biotério Central do Campus do Pici da
Universidade Federal do Ceará (UFC). Estes animais receberam ração e
63
água ad libitum sob condições adequadas de luz e temperatura e foram
manipulados de acordo com os padrões estabelecidos pelo Comitê de Ética
da Universidade Estadual do Ceará (UECE).
3.3 Materiais para purificação da proteína
Moinho elétrico do tipo Wiley com peneira de 60 mesh, moinho de café
(Moulinex 843), câmara fria (12ºC), centrífuga refrigerada, bomba peristáltica,
agitador magnético, massa magnética, coluna cromatográfica contendo gel
de Sephadex® G-50, espectrofotômetro UV/VIS, cloreto de sódio (NaCl),
cloreto de cálcio (CaCl2), cloreto de manganês (MnCl2), sacos de diálise e
água desionizada ultrapura tipo Mili-Q. Todos os reagentes utilizados foram
de grau analítico.
3.4 Materiais para cristalização e soaking de cristais
Pipetas automáticas de 0-10 L e 100-100L, ponteiras descartáveis
de 0-10 L e 100-100L, kits de cristalização I e II da Hampton Research
(Hampton Research, Riverside, CA, USA), placas de Linbro®, corante Izit
Crystal Dye™, lamínulas, graxa de silicone, microscópio tipo lupa com
aumento de até 10x, câmara de cristalização à 20oC, microcentrífuga,
HEPES, sulfato de amônio ((NH4)2SO4), polietileno glicol 400, D-glicose, D-
glicose 6-fosfato, D-manose, metil--D-glicopiranosídeo, N-acetil-
manosamina, D-frutose, D-galactose, D-rafinose, D-melibiose, D-trealose, L-
sorbose, maltose, sacarose, lactose e água desionizada ultrapura tipo Mili-Q.
Os carboidratos, bem como os demais reagentes usados apresentavam alto
grau de pureza certificado pelo fabricante (Sigma Co. USA).
64
3.5 Material para resolução da estrutura tridimensional
Supercomputadores com matriz gráfica avançada e sistema
operacional Linux, contendo pacote de programas CCP4 (Collaborative
Computational Project, Number 4, 1994).
3.6 Avaliação da resposta contrátil de ConM
Solução de Tyrode (NaCl 136 mM, KCl 5 mM, NaHCO3 11,9 mM,
MgCl2 0,98 mM, CaCl2 2 mM, NaH2 PO4 0,36 mM, glucose 5,5 mM); gás
oxigênio, gás carbônico, aerador, transdutor de força conectado a um sistema
de aquisição de dados computadorizados (Chart 4.2; PowerLab
ADInstruments, Inc., Espanha), acetilcolina (ACh), fenilefrina (PE) e metil
éster de L-nitro arginina (L-NAME).
3.7 Experimento histológico com lectina marcada
Formaldeído, álcool etílico absoluto, xilol, lâminas histológicas,
parafina histológica, micrótomo Olympus, modelo CUT 4055 II, microscópio
de fluorescência Olympus com câmera digital acoplada, fluoresceína
isotiocianato (FITC), glicose, o carbonato de sódio, bicarbonato de sódio,
etilenoglicol, N-butanol e coluna PD 10 (Pharmacia LKB).
3.8 Outros materiais
Acrilamida, N,N'- Metileno Bisacrilamida e Coomassie Brilliant Blue R
foram obtidos da Sigma Chemical Co., St. Louis, USA. Beta-mercaptoetanol e
Dodecil Sulfato de Sódio, da Merck, Darmstadt, Alemanha.
Os demais reagentes utilizados foram de grau analítico.
65
4. MÉTODOS
4.1 Obtenção da lectina pura (ConM) de sementes de Canavalia
maritima.
Sementes maduras de Canavalia maritima foram coletadas na praia do
Bessa, município de João Pessoa, estado da Paraíba, região nordeste do
Brasil. As sementes foram trituradas em moinho elétrico do tipo Wiley,
acoplado com peneira de 60 mesh e o material obtido foi repassado em
moinho de café (Moulinex 843), resultando em uma farinha bastante fina que
foi estocada em frascos hermeticamente fechados mantidos em câmara fria
(12ºC).
A metodologia usada para a obtenção da lectina pura de sementes de
Canavalia maritima foi a mesma utilizada para Canavalia bonariensis,
conforme descrito por Cavada et al. (1996). Para tanto, a farinha fina de
sementes foi submetida à extração protéica (1:10, m/v) com solução de NaCl
0,15 M por 1 hora sob agitação constante à temperatura ambiente (25 ºC),
após o que as suspensões foram centrifugadas a 10.000 x g durante 20
minutos a 4ºC. O sobrenadante obtido foi filtrado em papel de filtro qualitativo
e o extrato protéico resultante foi aplicado a uma coluna de Sephadex® G-50
(5 x 25 cm), previamente equilibrada com solução de NaCl 0,15 M contendo
5mM de CaCl2 e 5mM de MnCl2. O extrato protéico permaneceu em contato
com a matriz de afinidade por 12 horas sob fluxo contínuo de 60 mL/hora. O
material não retido foi eluído com a mesma solução de equilíbrio (NaCl 0,15
M contendo 5mM de CaCl2 e MnCl2) num fluxo de 120 mL/hora até que a
absorbância em comprimento de onda de 280 nm chegasse próximo a zero.
O material retido (lectina) na coluna foi eluído com tampão glicina 0,1M pH
2.6, contendo 0.15 M de NaCl e em seguida, dializado exaustivamente em
água Milli-Q, congelado e liofilizado.
A pureza das preparações de ConM foi monitorada por eletroforese em
gel de poliacrilamida na presença de SDS e 2- mercaptoetanol, seguindo de
perto a metodologia descrita por Laemli (1970), adaptada para o uso de géis
de separação em placas. O gel de aplicação (contendo 3,5% de
66
poliacrilamida) foi montado em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 e SDS a 1 %.
O gel de separação com um gradiente de 5 a 20 % de poliacrilamida foi
montado em tampão Tris-HCl 3 M, pH 8,8 contendo SDS a 1 %. As amostras
submetidas à eletroforese (farinha de sementes de Canavalia maritima e pico
retido dializado e liofilizado contendo a lectina) foram suspensas em tampão
Tris-HCl 0,0625 M, pH 8,3 contendo SDS a 1 %. Para a farinha de sementes
foi utilizada uma concentração de 20 mg/mL e para lectina (ConM) foi
utilizada uma concentração de 1 mg/mL. Após ter sido adicionado 10 L de 2-
mercaptoetanol, as amostras foram incubadas a 100ºC por 10 minutos e
centrifugadas em centrífuga de Eppendorf a 15.000 x g por 5 minutos. Azul
de bromofenol (para marcação da frente da corrida eletroforética) a 0,02 % e
cristais de sacarose (para tornar as amostras mais densas) foram
acrescentados às amostras antes de serem aplicadas ao gel. Alíquotas de10
L foram aplicadas nos poços do gel. A corrida eletroforética foi feita à
corrente constante (20 mA) por um período médio de 2 horas. Logo a seguir
o gel foi colocado para corar com solução de Coomassie Brilliant Blue R-250
0,05%, preparado com metanol, ácido acético e água (1:3,5:8, v/v/v), sendo o
excesso retirado com a mesma solução na ausência de corante, permitindo a
visualização das bandas protéicas.
Posteriormente, a preparação lectínica também foi avaliada por
espectrometria de massa (MS) em espectrômetro Applied Biosystems
Voyager STR. O aparelho foi previamente calibrado com a proteína
mioglobina, atuando em modo linear e ajustado para uma voltagem de
aceleração de 25kV, usando ácido sinapínico como matriz.
4.2 Cristalização de ConM
A lectina de Canavalia maritima (ConM) foi diluída homogeneamente
em tampão Tris-HCl 1 mM pH 7,0 contendo 5 mM CaCl2 e 5 mM de MnCl2
numa concentração de 40 mg/ml e utilizada em todos os experimentos.
Todas as soluções foram preparadas com água deionizada ultra pura do tipo
Milli-Q, previamente submetida a tratamento por osmose reversa.
67
Para encontrar a melhor condição de cristalização para ConM, a
lectina foi inicialmente submetida a um screening de cristalizacão pelo
método de difusão de vapor em gota suspensa (Jancarik & Kim, 1991) em
placas Linbro® de 24 poços, utilizando-se os kits “Crystal Screens I e II”
comercializados pela Hampton Research (Hampton Research, Riverside, CA,
USA) nas condições de temperatura ambiente (293K) da Unidade de
Cristalização do BioMol-Lab. Na preparação do screening, as gotas foram
montadas em lamínulas siliconizadas utilizando-se iguais volumes da lectina
e da solução do poço (2 µL), encaixadas com a gota voltada para baixo no
respectivo poço da placa Linbro®, que foi previamente adicionado de 200 μL
da solução do poço e teve sua abertura lubrificada com graxa de silicone
para manutenção da vedação do poço.
Cristais de tamanho exagerado foram obtidos em quatro condições do
screen I. Após análise mais criteriosa dos cristais, feita por meio de
verificação do desvio da luz polarizada em microscópio óptico e coramento
do cristal com Izit Crystal Dye™; foi tentada a otimização da condição 39
(Tampão Hepes 0,1M pH 7,5 com 2% v/v de Polietileno Glicol 400 e 2M de
sulfato de amônio), através de variações de pH na faixa de 5,5 a 9,5 e na
concentração do precipitante, desde sua ausência até uma concentração de
10% v/v.
4.3 Soaking de cristais de ConM com carboidratos
Visando a obtenção de cristais de ConM complexados com açúcares
específicos, alguns dos melhores cristais, obtidos conforme metodologia
descrita no item anterior (item 4.2), tiveram suas gotas banhadas com 1 L
de uma solução com concentração de 1mM de diferentes carboidratos
específicos para lectina, diluídos no mesmo tampão da condição
anteriormente otimizada. Os açúcares utilizados foram escolhidos com base
nos resultados do ensaio de inibição da atividade hemaglutinante por
açúcares da lectina de sementes de Canavalia maritima publicado por Ramos
et al. (1996) da lectina e pela própria disponibilidade para uso de alguns
68
carboidratos. Os açúcares usados no screening de soaking foram os
seguintes: D-glicose, D-glicose 6-fosfato, D-manose, metil--D-
glicopiranosídeo, N-acetil-manosamina, D-frutose, D-galactose, D-rafinose,
D-melibiose, D-trealose, L-sorbose, maltose, sacarose e lactose.
4.4 Coleta de dados e difração de raios-X
Os dados de difração de raios-X em cada caso (lectina pura ou lectina +
açúcar) foram coletados a partir de um único cristal, mantido a uma
temperatura de 100 K com nitrogênio. Para prevenir a formação de gelo, o
cristal, previamente laçado no “loop”, foi banhado numa solução de
crioproteção contendo 75 % da solução de cristalização (Tampão Hepes
0,1M pH 8,43 com 4% v/v de polietilenoglicol 400 e 2M de sulfato de amônio)
e 25 % de glicerol e só então, instalados na cabeça do goniômetro para
serem submetidos à coleta de dados na linha de raios-X. A coleta de dados
foi feita num comprimento de onda de 1,4727 Å usando-se fonte de radiação
Sincrotron proveniente da estação CPr do Laboratório Nacional de Luz
Sincrotron (LNLS) situado no município de Campinas-SP. A coleta de dados
de difração de raios-X foi feita numa placa detectora de imagem MAR de
34,5cm (MAR research), com tempo de exposição de 42,5 segundos por
imagem, com os cristais variando numa distância de 60-90 mm do detector
(CCD). Foram coletadas 120 imagens do cristal contendo a lectina pura de
ConM a uma resolução de 1,56 Å, 120 imagens do cristal de ConM
complexada com o açúcar maltose a uma resolução de 1,87 Å e 160 imagens
do cristal de ConM complexada com o açúcar trealose a uma resolução de
2,00 Å, todas numa amplitude de oscilação de 1,0o. Os conjuntos de dados
completos foram indexados, integrados e escalados usando os programas
MOSFLM (Leslie, 1994) e SCALA do pacote de programas CCP4
(Collaborative Computational Project, Number 4, 1994). Os índices de Miller k
e l foram invertidos por l e k, respectivamente.
69
4.5 Substituição molecular e refinamento
A estrutura do cristal da ConM nativa foi determinada por substituição
molecular utilizando-se como modelo de busca a estrutura resolvida da
lectina de Canavalia ensiformis complexada com Zinco e Cálcio a pH 6,15
(Bouckaert et al., 2000), depositada no Protein Data Bank (PDB) código
3ENR (Berman et al., 2000). Depois de serem calculadas as funções de
rotação e translação, os melhores resultados usando o programa MolRep
(Vargin & Taplyakov, 1997) indicaram um coeficiente de correlação de 65,2%
e um Rfactor of 53,2 %.
A estrutura inicial foi submetida a refinamentos de corpo rígido (rigid
body) e restrito (restrained) usando o programa REFMAC5 do pacote de
programas CCP4 (Collaborative Computational Project, Number 4, 1994),
tendo Rfactor e Rfree convergido para 23.38 % e 27.36 %, respectivamente. Os
resíduos I17 V17, I53S53, A70G70, S134K134, G144S144,
S164P164, P165S165, S169T169, V187T187, S190G190,
E192D192 e T196K196 foram substituídos e a conformação de suas
cadeias laterais ajustadas de modo a satisfazer as necessidades do mapa de
densidade eletrônica. Posteriormente outros resíduos da seqüência de
aminoácidos foram trocados com base, também, no mapa de densidade
eletrônica. Ao final, foram adicionadas 285 moléculas de água ao modelo
com o uso do programa XtalView (McRee, 1999) do pacote de programas
CCP4, que submetido a um segundo refinamento restrito (restrained) resultou
em valores de Rfactor de 19,83% e Rfree de 24,82%.
4.6 Avaliação da resposta contrátil de ConM
Os experimentos de avaliação da resposta contrátil de ConM foram
realizados na Universidade Estadual do Ceará para isso, foi necessário uma
prévia aprovação do protocolo experimental pelo Comitê de Ética Institutional
da Universidade Estadual do Ceará. Para o desenvolvimento do experimento,
ratos machos da linhagem Wistar com peso na faixa de 200-300g foram
70
sacrificados por deslocamento cervical inconsciente. A aorta torácica foi
rápidamente cortada e depositada em solução de Tyrode (composition in:
NaCl 136 mM, KCl 5 mM, NaHCO3 11,9 mM, MgCl2 0,98 mM, CaCl2 2 mM,
NaH2 PO4 0,36 mM, glucose 5,5 mM). Os tecidos foram então retirados do
tecido conectivo e cortados em aneis de cerca de 3 mm. Em determinados
experimentos, o endotélio foi removido por esfregaço mecânico da superfície
interna.
Para medida das respostas contráteis, os anéis de aorta foram fixados
numa câmara de banho de orgãos, preenchida com solução 10 mL de
solução de Tyrode, aerada com uma mistura de 95% de oxigênio e 5% de
dióxido de carbono, mantida a 37°C. Uma tensão de repouso de 2 g foi
aplicada e os tecidos foram deixados em equilíbrio durante 60 minutos. A
tensão ativa foi desenvolvida isometricamente por meio de um transdutor de
força, conectado a um sistema de aquisição de dados computadorizados
(Chart 4,2; PowerLab ADInstruments, Inc., Espanha). A presença de
endotélio foi determinada pela adição de acetilcolina (ACh, 1µM) e de
fenilefrina (PE, 0,1µM) aos anéis de aorta pré-contraídos. Consideraram-se
os tecidos possuidores de endotélio intacto como sendo aqueles na qual a
acetilcolina foi maior que 75% do tônus induzido.
Na avaliação dos efeitos relaxantes sob anéis de aorta, ConM foi
adicionada aos tecidos em concentrações cumulativas na faixa de 1 a 100
µg/mL. Com ou sem endotélio, pré-contraídos com fenilefrina (0,1µM).
Adicionalmente, foi feito em seguida uma investigação do possível
envolvimento de fator de relaxação derivado endotélio (NO) no efeito da
lectina. Para isso, um inibidor da óxido nítrico sintase, o metil éster de L-nitro
arginina (L-NAME), foi adicionado numa concentração de 100µM ao tecidos
pré-contraídos e com endotélio intacto, antes de proceder uma resposta
cumulativa a concentração de ConM. A análise estatística dos dados foi
apresentada como a média de n experimentos. As comparações de média
foram feitas usando-se o teste t de Student (emparelhado ou não, conforme
fosse apropriado) ou pela análise simples de variância (ANOVA) seguida pelo
teste de múltiplas comparações de Tukey. Os valores foram considerados
como significativamente diferentes dos controles quando p < 0.05.
71
4.7 Interação de FITC-ConM com endotélio e músculo liso da aorta de
rato
Visando verificar as alterações histológicas do endotélio e aorta de rato
submetida à incubação com ConM fluoresceinada, bem como visualizar a
interação da lectina com os tecidos constituintes da aorta, foi realizado um
experimento de avaliação da interação de FITC-ConM com endotélio e
músculo liso de aorta de rato. Para isso, a metodologia foi dividida em três
etapas consecutivas: (a) processamento das amostras e obtenção dos cortes
histológicos; marcação da lectina com FITC e tratamento (incubação) dos
cortes histológicos com a lectina fluoresceinada. Uma descrição detalhada
destas etapas é dada a seguir.
4.7.1 Processamento das amostras e obtenção dos cortes histológicos
As amostras de aorta de ratos foram inicialmente fixadas em
formaldeído a 10% tamponado durante 24 horas, desidratadas em série
alcoólica de concentração crescente (70% por 1 hora, 80% por 1 hora, 90%
por uma hora, 95% por uma hora e álcool absoluto em dois banhos de uma
hora cada), diafanizadas em xilol (duas passagens de duas horas),
impregnadas em parafina histológica (duas passagens de duas horas em
estufa a 60oC) e incluídas em blocos de parafina. Os blocos foram cortados
em micrótomo Olympus, modelo CUT 4055 II, em seções com 5 m de
espessura. Por fim, as amostras seccionadas foram desparafinizadas em xilol
(2 3 minutos) e hidratadas em série de soluções alcoólicas de concentração
decrescente (álcool absoluto 2 minutos, 95% 2 minutos, 70% 2 minutos
e água destilada).
72
4.7.2 Marcação da lectina com FITC
O processo de marcação da lectina com fluoresceína isotiocianato
(FITC) obedeceu ao protocolo estabelecido por Pinto (2001). Para isso,
alíquotas contendo 1 mg de lectina acrescida do monossacarídeo inibidor
(1,0 M) foram dissolvidas em 2,0 mL de solução de conjugação (1,5 mL de
tampão carbonato/bicarbonato de sódio 0,2M; pH 9,3, contendo 0,5 mL de
etilenoglicol). Apos rápida agitação em vortex, 500µl de uma solução de FITC
(0,05mg, em etilenoglicol) foram adicionados e a mistura submetida à
agitação contínua durante 5h a 4°C e ao abrigo da luz. Após incubação, a
fração contendo o complexo lectina/FITC foi separada da FITC não
conjugada por meio de cromatografia de exclusão molecular em coluna PD
10 (Pharmacia LKB – 9,0ml), previamente equilibrada com água Milli Q
saturada com N-butanol 5%, com fluxo continuo mantido por força da
gravidade. Imediatamente antes da cromatografia, 450µl da solução de
equilíbrio foram adicionados à amostra, a qual foi, em seguida, aplicada à
coluna. O pico I, correspondente à fração lectina/FITC, foi retirado com 3,5
mL de solução N-butanol 5%, enquanto a FITC não conjugada foi eluída no
Pico II com 10mL da mesma solução.
A lectina fluoresceinada (ConM) foi conservada sob forma liofilizada
até que, imediatamente antes da sua utilização, foi diluída em solução de
NaCl 0,15 M a uma razão de 1:10 (p/v) e mantida sob proteção da luz.
4.7.3 Tratamento dos cortes histológicos com FITC-ConM
As lâminas contendo secções de transversais de aorta de rato foram
submetidas ao tratamento com a lectina fluoresceinada (FITC-ConM) de
acordo com o seguinte protocolo: Inicialmente, 5 a 6 gotas da solução de
ConM fluoresceinada (diluída 1:10 em NaCl 0,15M) foram distribuídas sobre
os cortes histológicos desparafinizados e hidratados (volume suficiente para
cobrir completamente os cortes histológicos) e estes foram incubados em
estufa a 37,0 oC por 1 hora. Terminado o período de incubação, as amostras
73
foram lavadas com suaves esguichos de solução NaCl 0,15M para remoção
do excesso de lectina e eliminação de ligações inespecíficas, e procedeu-se
a observação dos cortes por microscopia de fluorescência em microscópio de
fluorescência Olympus com câmera digital acoplada.
74
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Muitas lectinas já foram cristalizadas e suas estruturas tridimensionais
determinadas. Existem mais de 50 entradas de lectinas da subtribo
Diocleinae que podem ser acessadas no Protein Data Bank (BERMAN et al.,
2000); a bastante conhecida e estudada lectina de sementes de Canavalia
ensiformis, Concanavalina A (ConA), representa aproximadamente 90%
desses dados.
5.1 Cristalização de ConM nativa
Cristais de ConM cresceram em diversas condições pelo método de
difusão de vapor em gota suspensa (JANCARIK & KIM, 1991). Os cristais
foram obtidos nas condições 4 (Tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8,5 com sulfato de
amônio 2,0 M), 14 (Tampão HEPES-Na 0,1 M pH 7,5 com 0,2 M cloreto de
cálcio dihidratado e 28% v/v de Polietilenoglicol 400), 16 (Tampão HEPES-Na
0,1 M pH 7,5 com 1,5M de sulfato de lítio) e 39 (Tampão Hepes 0,1M pH 7,5
com 2% v/v de polietilenoglicol 400 e 2M de sulfato de amônio) do Screen I
da Hampton Research (Hampton Research, Riverside, CA, USA) nas
condições de temperatura ambiente (293K) da Unidade de Cristalização do
BioMol-Lab (Figura 11). É possível que a grande variedade de condições
onde foram encontrados cristais esteja associada ao elevado grau de pureza
da amostra de proteína usada em todos os experimentos, o que pode ser
comprovado no padrão de bandas encontrado na eletroforese em gel de
poliacrilamida (Figura 12) e também através de análise por espectrometria de
massa (dados não mostrados).
Os experimentos de otimização das condições de cristalização
demonstraram que os melhores cristais para difração de raios-X foram
aqueles obtidos em Tampão Hepes 0,1M pH 8,43 com 4% v/v de
polietilenoglicol 400 e 2M de sulfato de amônio, onde constatou-se uma
redução no tamanho dos cristais para dimensões de aproximadamente 0,8 x
0,4 x 0,4 mm em 7 dias (Figura 13).
75
Figura 11 - Diferentes cristais obtidos a partir da realização do screening de
cristalização da lectina de sementes de Canavalia maritima.
Cristais obtidos nas condições 4 (A), 14 (B), 16 (C) e 39 (D) do
“Crystal Screen I” da Hampton Research (Hampton Research,
Riverside, CA, USA).
76
Figura 12 - Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e 2-
mercaptoetanol de farinha de sementes de Canavalia maritima
(A) e da lectina ConM obtida durante duas diferentes
cromatografias de afinidade (B). Poço 1: marcadores de peso
molecular (Citocromo C, 12.4 KDa; Inibidor de Tripsina, 20.1 KDa;
Anidrase Carbônica, 29 KDa, Ovoalbumina, 45 KDa e Albumina
sérica bovina, 66 KDa); poço 2: farinha de sementes de
Canavalia maritima (20 mg/ml) e poços 3 e 4: ConM (1 mg/ml).
77
O “soaking” de cristais de ConM nativa com carboidratos específicos
funcionou apenas para a formação de cristais complexados com os
dissacarídeos maltose e trealose. Isto ocorreu devido à presença de canais
de solvente que propiciaram a difusão do ligante até o sítio de ligação a
carboidratos; a acessibilidade do sítio de ligação na rede cristalina e a
tolerância do cristal ao “soaking” prolongado sem haver quebra ou
dissolução.
Figura 13 - Cristal da lectina de Canavalia marítima obtido por otimização da
condição 39 (Tampão Hepes 0,1M pH 7,5 com 2% v/v de
polietilenoglicol 400 e 2M de sulfato de amônio) do Crystal
Screen I da Hampton Research (Hampton Research, CA, USA).
5.2 Difração de raios-X
Os padrões de difração de raios-X (Figura 14) obtidos a partir do cristal
de ConM nativo foram escalonados numa faixa de 24,40 - 1,95 Å com um
total de 34308 reflexões únicas, revelando 97,9 % (97,9 %) de completeza.
Quando os dados do cristal foram indexados, mostraram pertencer ao grupo
de Laue primitivo ortorrômbico. Feita a integração das imagens, foi
78
determinado que os cristais pertencem ao grupamento espacial P21212.
Considerando a presença de duas moléculas (474 resíduos; 25,5 KDa por
molécula) na unidade assimétrica, o coeficiente de Matthews (VM;
MATTHEWS, 1968) foi de 2,4 Å3 Da-1, indicando um conteúdo de solvente de
47,3%. A Tabela 7 mostra um resumo detalhado das estatísticas para os
dados coletados do cristal de ConM nativo.
Figura 14 – Padrão de difração de raios-X de cristal de ConM nativo.
79
Tabela 7 – Dados estatísticos finais do refinamento da estrutura da lectina
nativa de sementes de Canavalia maritima (ConM).
Parâmetro Valores
Difração de raios-X
Grupo espacial P21212
Parâmetros da célula unitária (Å)
a 67.9164
b 71.0205
c 97.6173
Limites de resolução (Å) 24.4 – 1.95
Conteúdo da unidade assimétrica Um dímero
Total de reflexões únicas 34308
Completeza (%) 97.9 (97.9)
Rmerge (%) 12.2 (18.4)
<I/σ(I)> 3.4 (3.0)
Substituição Molecular
Correlação (%) 65,2
Rfactor (%) 53.2
Refinamento
Rfactor (%) 19.83
Rfree (%) 24.82
Distribuição dos resíduos no gráfico de Ramachandran (%)
Regiões mais permitidas 88.2 (365 resíduos)
Regiões adicionalmente permitidas 10.9 (45 resíduos)
Regiões generosamente permitidas 1.0 (4 resíduos)
Regiões não permitidas 0 (nenhum resíduo)
Desvio médio padrão
Para comprimento de ligações (Å) 0.021
Para ângulo de ligação (º) 1.925
80
As Tabelas 8 e 9 apresentam um resumo detalhado das estatísticas
para os dados coletados de cristais de ConM complexada com os
dissacarídeos maltose e trealose.
Tabela 8 – Dados estatísticos finais do refinamento da estrutura de ConM
complexada com o dissacarídeo maltose.
Parâmetro Valores
Difração de raios-X
Grupo espacial P21212
Parâmetros da célula unitária (Å)
A 66.6736
B 71.7148
C 97.2345
Limites de resolução (Å) 31.57 – 1.71
Conteúdo da unidade assimétrica Um dímero
Total de reflexões únicas 43953
Completeza (%) 99.9 (99.9)
Rmerge (%) 6.5 (30.0)
<I/σ(I)> 8.8 (2.3)
Substituição Molecular
Correlação (%) 48,3
Rfactor (%) 63.0
Refinamento
Rfactor (%) 20.73
Rfree (%) 26.10
Distribuição dos resíduos no gráfico de Ramachandran (%)
Regiões mais permitidas 89,4 (370 resíduos)
Regiões adicionalmente permitidas 9,7 (40 resíduos)
Regiões generosamente permitidas 1,0 (4 resíduos)
Regiões não permitidas 0 (nenhum resíduo)
Desvio médio padrão
Para comprimento de ligações (Å) 0,021
Para ângulo de ligação (º) 1,932
81
Tabela 9 – Dados estatísticos finais do refinamento da estrutura da lectina de
ConM complexada com o dissacarídeo trealose.
Parâmetro Valores
Difração de raios-X
Grupo espacial P21212
Parâmetros da célula unitária (Å)
a 67.0327
b 71.0860
c 97.3321
Limites de resolução (Å) 35.57 – 1.78
Conteúdo da unidade assimétrica Um dímero
Total de reflexões únicas 32114
Completeza (%) 98.4 (98.4)
Rmerge (%) 6.6 (26.3)
<I/σ(I)> 7.7 (2.3)
Sustituição Molecular
Correlação(%) 54,8
Rfactor (%) 58,0
Refinamento
Rfactor (%) 19.27
Rfree (%) 24.42
Distribuição dos resíduos no gráfico de Ramachandran (%)
Regiões mais permitidas 87.2 (361 residuos)
Regiões adicionalmente permitidas 11.8 (49 resíduos)
Regiões generosamente permitidas 0.7 (3 resíduos)
Regiões não permitidas 0.2 (1 resíduo)
Desvio médio padrão (r.m.s.d.)
Para comprimento de ligações (Å) 0.021
Para ângulo de ligação (º) 1.940
82
Os dados de difração de raios-X do cristal de ConM complexada com
maltose foram escalonados numa faixa de 31.57 – 1.71 Å com um total de
43953 reflexões únicas, revelando 99,9 % (99,9 %) de completeza. Já os
dados de difração de raios-X do cristal de ConM complexada com trealose
foram escalonados numa faixa de 35.57 – 1.78 Å com um total de 32114
reflexões únicas, revelando 98,4 % (98,4 %) de completeza.
5.3 Substituição molecular e refinamento
5.3.1 ConM nativa
A estrutura do cristal de ConM nativa foi determinada por substituição
molecular utilizando-se como modelo a estrutura resolvida da lectina de
Canavalia ensiformis complexada com Zinco e Cálcio a pH 6,15, tendo sido
retiradas as moléculas de água. A estrutura encontra-se depositada no
Protein Data Bank (PDB) código 3ENR (BOUCKAERT et al., 2000; BERMAN
et al., 2000). Depois de serem calculadas as funções de rotação e translação,
os melhores resultados usando o programa MolRep (VARGIN &
TEPLYAKOV, 1997) indicaram um coeficiente de correlação de 65,2% e um
Rfactor de 53,2 % (Tabela 7).
A estrutura inicial foi submetida a refinamentos de corpo rígido (“rigid
body”) e posicional (“restrained”) usando o programa REFMAC5 do pacote de
programas CCP4 (COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT,
NUMBER 4, 1994), tendo Rfactor e Rfree convergido para 23,38 % e 27,36 %,
respectivamente. Após a substituição dos resíduos que diferem do modelo
3ENR, ajuste manual das cadeias laterais com base no mapa de densidade
eletrônica, foi observado que alguns resíduos da seqüência publicada por
Perez et al. (1991) não correspondiam as densidades eletrônicas observadas
no mapa. Os resíduos modificados com base no mapa de densidade
eletrônica foram os seguintes: V17 por I17, S53 por I53, M129 por S129,
T134 por S134, S144 por G144, P164 por S164, S165 por P165, G169 por
S169, T187 por S187, T190 por S190, A196 por T196 e P202 por S202
(Figura 15 e Tabela 10). Feitas as devidas modificações e a adição das
moléculas de água, o modelo submetido a um segundo refinamento
83
posicional (“restrained”) resultou em valores de Rfactor de 19,83% e Rfree de
24,82%.
Figura 15 - Detalhe dos resíduos corrigidos na sequência manual de ConM a
partir dos dados do mapa de densidade eletrônica. Os resíduos
modificados foram os seguintes: (A) V17 por I17, (B) S53 por I53,
(C) M129 por S129, (D) T134 por S134, (E) S144 por G144, (F)
P164 por S164, (G) S165 por P165, (H) G169 por S169, (I) T187
por S187, (J) T190 por S190, (K) A196 por T196 e (L) P202 por
S202.
84
Tabela 10 - Diferenças entre resíduos de ConM seqüenciada manualmente
por Perez et al., (1991) e sequência de ConM* determinada
com base nas densidades eletrônicas da estrutura
tridimensional resolvida por cristalografia de raios-X.
Resíduo
ConM
ConM*
17
V
I
53 S I
129 M S
134 T S
144 S G
164 P S
165 S P
169 G S
187 T S
190 T V
196* A T
202
P
S
* Resíduo não determinado por Perez et al. (1991) durante o sequenciamento.
5.3.2 ConM complexada com dissacarídeos
A estrutura dos cristais de ConM complexada com os dissacarídeos
maltose e trealose foi determinada por substituição molecular utilizando-se
como modelo a estrutura resolvida da lectina de Canavalia maritima (ConM)
nativa. Calculadas as funções de rotação e translação, os melhores
resultados usando o programa MolRep (VARGIN & TEPLYAKOV, 1997) para
maltose e AMoRe (NAVAZA, 1994) para trealose, indicaram um coeficiente
de correlação de 48,3% e um Rfactor de 63,0 % (Tabela 8) para maltose e 54,8
% e 58,0 % para trealose (Tabela 9).
85
A estrutura inicial foi submetida a refinamentos de corpo rígido (“rigid
body”) e posicional (“restrained”) usando o programa REFMAC5 do pacote de
programas CCP4 (COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT,
NUMBER 4, 1994). Ao final foram adicionadas 245 moléculas de água ao
modelo de ConM complexada com maltose e 253 moléculas de água ao
modelo de ConM complexada com trealose com o uso do programa XtalView
(McREE, 1999), que submetido a um segundo refinamento restrito
(restrained) resultou em valores de Rfactor de 20,73% e Rfree de 26,10% para
ConM complexada com maltose, e Rfactor de 19,27% e Rfree de 24,42% para
ConM complexada com trealose.
5.4 Estrutura tridimensional de ConM nativa
A estrutura tridimensional completa de ConM nativa é mostrada na
Figura 16. O tetrâmero consiste de dois dímeros canônicos de lectinas de
leguminosas, sendo cada monômero formado por uma cadeia polipeptídica
de 237 resíduos de aminoácidos.
A Figura 17 mostra o alinhamento de seqüências primárias de
algumas lectinas da sub-tribo Diocleinae, onde observa-se um alto grau de
similaridade da ConM quando comparado a sua seqüência com a de outras
lectinas da mesma sub-tribo. A seqüência sugerida por Perez et al. (1991)
mostrava 91% de similaridade entre ConA e ConM, mas como alguns
resíduos da sequência de ConM foram corrigidos neste trabalho, com base
na densidade eletrônica da estrutura resolvida, esta similaridade entre ConA
e ConM aumentou para 98%.
A seqüência manual de aminoácidos publicada por Perez et al. (1991)
para ConM possui 12 resíduos de aminoácidos que não estão corretos. Os
resíduos de aminoácidos determinados com base na densidade eletrônica da
estrutura tridimensional resolvida de ConM (Figura 15) são isoleucina (I17),
isoleucina (I53), serina (S129), serina (S134), glicina (G144), serina (S164),
prolina (P165), serina (S169), serina (S187), serina (S190), treonina (T196) e
serina (S202). Com base na seqüência de aminoácidos determinada por
densidade eletrônica, 14 dos 19 tipos de aminoácidos encontrados na
86
composição de ConM (a proteína não possui resíduos de cisteína)
correspondem em quantidade aqueles previamente calculados por Perez et
al. (1991) através de análise da composição de aminoácidos.
Figura 16 – Uma visão geral da estrutura tetramérica da lectina de sementes
de Canavalia maritima (ConM). Nos "loops" superficiais em cada
um dos monômeros podem ser vistos os sítios de ligação a Ca2+
(bolas verdes) e Mn2+ (bolas violetas).
87
Figura 17 - Alinhamento de seqüências de algumas lectinas de sementes de
espécies pertencentes a subtribo Diocleinae. Lectinas de Canavalia
ensiformis (ConA), C. brasiliensis (ConBr), C. gladiata (CGL), C.
maritima (ConM), D. guianensis (Dguia) e Cratylia mollis (Cra) As
cores vermelhas representam os aminoácidos pequenos e os
hidrofóbicos (AVFPMILW); o azul marca os resíduos acídicos (DE); o
magenta os resíduos básicos (RHK); o verde representa os que
possuem cadeias laterais com hidroxilas, aminas e básicas, além da
glutamina (STYHCNGQ); e o cinza refere-se aos demais. Os símbolos
“*” significam que os resíduos na coluna indicada são idênticos em
todas as seqüências; “:” indica que foram observadas substituições
conservativas e “.” indica modificações semi-conservativas.
88
Os monômeros são formados por 16 fitas β interconectadas por voltas
e “loops” e por três α-helices. Dois dímeros canônicos associados por fitas β
em contato cruzado (cross-link) formam a estrutura quaternária da ConM. Os
contatos da interface beta-beta e as pontes de hidrogênio estabilizam os
dímeros canônicos, conforme mostrado na Figura 18. Oito resíduos nos sítios
C1 e C2 (Figura 18A,B) interconectam os dímeros canônicos. A interação em
C1 é uma ligação cruzada entre ácido aspártico (ASP78) e arginina (ARG60)
nas cadeias A e D (Figura 18C), e nas cadeias B e C. Outras interações na
mesma linha ocorrem entre resíduos treonina (TRE49) e serina (SER119)
estabilizam a estrutura (Figura 18D).
A presença de um tetrâmero no cristal indica que a associação dos
dímeros da ConM não é estericamente proibida e pode ocorrer em condições
favoráveis. Existe presumivelmente um equilíbrio dinâmico entre dímero e
tetrâmero em solução. Numerosos outros exemplos de formação de
multímeros em estruturas de cristais de lectina (HAMELRYCK et al., 2000) e
em solução já foram relatados (CHO et al., 1995).
A habilidade das lectinas de formarem tetrâmeros pode dessa forma
ser fisiologicamente relevante no contexto de formação de ligações cruzadas
com o receptor, o qual frequentemente ocorre em sistemas de transdução de
sinal. Isto pode permitir uma hábil regulação, baseada nas concentrações
locais de lectinas na superfície celular, o pH local e outros fatores (BUTS et
al., 2001). Estruturas já determinadas da ConA apresentam regiões de
densidade eletrônica fraca nos resíduos N-terminais e em “loops” de
superfície nos resíduos 118-122, 149-151, 160-163 (NAISMITH et al., 1994;
DEACON et al., 1997; BOUCKAERT et al., 1999). A densidade eletrônica
para os “loops” de ConM é fraca ou simplesmente não aparece em duas
dessas regiões 118-121 e 160-163. Algumas estruturas refinadas a nível de
resolução atômica não mostram, também, densidades eletrônicas em seus
“loops”, mas outras estruturas resolvidas a nível de resolução atômica
possuem melhor densidade eletrônica do que estruturas de alta resolução,
como foi observado por Kantardjieff et al. (2002) no “loop” formado entre duas
serinas (SER161 e SER164).
89
Figura 18 – Contatos entre monômeros. (A); Visão lateral dos contatos entre
os dímeros canônicos (B); Contato tipo “cross-link” entre os
dímeros canônicos (C); O círculo vermelho (C1) representa
pontes de hidrogênio que estabilizam o tetrâmero em interação
do tipo “cross-link”; os círculos vermelhos (C2 e C3) mostram
interações por ponte de hidrogênio nos cantos dos dímeros (D).
90
Isto é possível devido à existência de arranjos individuais multi
conformacionais que não permitem a criação de densidade eletrônica
suficientemente localizada para discernir qualquer “loop” definido
(KANTARDJIEFF et al., 2002). A lectina de sementes de Canavalia gladiata
(CGL) difere de outras lectinas ConA-like nos “loops” a nível de resolução
atômica (1,9 Å) (dados não mostrados), pois sua estrutura apresenta uma
excelente densidade eletrônica nos “loops” 149-151 e 160-163. Esta ausência
de densidade eletrônica nas regiões de loop da ConM (Figura 19) ocorre em
muitas outras estruturas.
Na ConM nativa, os aminoácidos envolvidos na ligação a metais são
conservados, e a estrutura dos sítios de ligação a Mn2+ e Ca2+ mostra
similaridade com aqueles determinados em outras lectinas de leguminosas.
Os monômeros da ConM contém os ions mangânes e cálcio nas
proximidades do sítio de ligação a carboidratos (Figura 20). A ligação do íon
metálico cálcio induz à isomerização trans para cis da ligação peptídica entre
a alanina (ALA207) e o ácido aspártico (ASP208), que é conservada em
todas as estruturas de cristais de lectinas de leguminosas. Esta ligação cis-
peptidíca contribui para a estabilização do bolsão de ligação através da
orientação das posições dos resíduos asparagina (ASN14) e a arginina
(ARG228). Cada um dos ions metálicos é coordenado por quatro cadeias
laterais de aminoácidos e duas moléculas de água: ácido glutâmico (GLU8),
ácido aspártico (ASP10), ácido aspártico (ASP19) e histidina (HIS24) com
Mn2+ e ácido aspártico (ASP10), tirosina (TYR12), asparagina (ASN14) e
ácido aspártico (ASP19) com Ca2+. No caso do íon cálcio, uma das moléculas
de água forma uma ponte entre o metal e o grupo carbonil da cadeia principal
do resíduo de ácido aspártico (ASP 208), estabilizando desse modo a pouco
usual ligação cis-peptídica entre alanina (ALA207) e ácido aspártico
(Asp208).
Como já havia sido descrito nas lectinas ConA-like, o sítio de ligação a
carboidratos de ConM apresenta potencial eletrostático negativo (Figura 21),
conforme calculado pelo programa Swiss PdbViewer 3.7. Uma vez ligado o
carboidrato, esta superfície negativa é coberta pela carga neutra do
carboidrato (HAMODRAKAS, 1997).
91
Figura 19 – Densidades eletrônicas das regiões de loops da estrutura da
lectina de sementes de Canavalia maritima (ConM). Loop N-
terminal (A), Loop 159-164 (B), Loop 148-153 (C) e Loop 116-
124 (D).
A B
C D
92
Figura 20 - O duplo sítio de ligação a metais do monômero de ConM nativa.
93
Figura 21 – Potencial de superfície da estrutura tetramérica de ConM nativa.
Os potenciais eletrostáticos negativos dos sítios de ligação a
carboidratos estão destacados por uma seta amarela.
94
5.5 Estrutura tridimensional de ConM complexada à maltose e trealose
As Figuras 22 e 23 apresentam detalhes das densidades eletrônicas
dos dissacarídeos maltose e trealose no sítio de ligação a carboidratos da
ConM. Observa-se que a densidade eletrônica está presente para ambos os
dissacarídeos, embora seja mais intensa para o dissacarídeo trealose.
Nas Figuras 24 e 25 encontram-se detalhes do sítio de ligação a
carboidratos da ConM complexada com os dissacarídeos maltose e trealose,
com destaque para os resíduos envolvidos na formação de pontes de
hidrogênio com o açúcar e sua orientação com relação ao sítio de ligação a
íons metálicos.
Ramos et al. (1996) construíram um modelo tridimensional da ConM a
partir do alinhamento de seqüência com a ConA e utilizaram este modelo
para simulação de encaixe dos açúcares glicose e manose no sítio de ligação
a carboidratos. Como resultado, encontraram que o sítio de ligação a
carboidratos da ConM é bastante similar ao da ConA. De fato, os sítios de
ligação a carboidratos de ConM complexada com os dissacarídeos maltose e
trealose são formados por uma rede de pontes de hidrogênio idênticas
aquelas descritas para a ConA por Derewenda et. al. (1989). Tanto para a
estrutura tridimensional de ConM complexada com maltose como por
trealose (Figuras 24 e 25), são 8 as pontes de hidrogênio que conectam o
dissacarídeo aos resíduos de aminoácidos que formam o sítio de ligação a
carboidratos. Os resíduos de aminoácidos envolvidos na formação de pontes
de hidrogênio com o dissacarídeo maltose são leucina (LEU99), tirosina
(TIR100) e arginina (ARG228), que formam, cada um, a partir de sua cadeia
principal, duas pontes de hidrogênio. Além desses resíduos, tirosina (TIR12)
e asparagina (ASN14), pertencentes ao sítio de ligação a íons metálicos
bivalentes, formam, cada um, uma ponte de hidrogênio entre suas cadeias
laterais e a molécula da maltose.
As pontes de hidrogênio formadas entre a ConM e a molécula de
trealose no sítio de ligação a carboidratos, assim como na interação com a
maltose, envolvem os resíduos leucina (LEU99), tirosina (TIR100) e arginina
(ARG228), sendo que as interações diferem em quantidade e origem (cadeia
lateral ou principal) para cada um deles. De um total de 8 pontes de
95
hidrogênio, nenhuma delas é formada por resíduos pertencentes ao sítio de
ligação a íons metálicos bivalentes. As pontes de hidrogênio foram formadas
entre a trealose e as cadeias laterais da treonina (TRE226), da arginina
(ARG228) e do aspártico (ASP218), sendo que este último resíduo é
responsável pela formação de duas pontes de hidrogênio com o açúcar. Os
resíduos glicina (GLI224), arginina (ARG228), leucina (LEU99) e tirosina
(TIR100) formam, cada um deles, uma ponte de hidrogênio entre o açúcar e
sua cadeia principal.
Figura 22 - Detalhe da densidade eletrônica do dissacarídeo maltose no sítio
de ligação a carboidratos da ConM.
96
Figura 23 - Detalhe da densidade eletrônica do dissacarídeo trealose no sítio
de ligação a carboidratos da ConM.
97
Figura 24 - Detalhe do sítio de ligação a carboidratos da ConM complexada
com o dissacarídeo maltose.
98
Figura 25 - Detalhe do sítio de ligação a carboidratos da ConM complexada
com o dissacarídeo trealose.
99
Embora a especificidade de ConM seja a mesma para ambos os
dissacarídeos (RAMOS et al., 1996; Tabela 1), estruturalmente apresenta
diferenças no padrão de formação de pontes de hidrogênio, principalmente
na distribuição do número de pontes de hidrogênio entre os dois resíduos de
glicose dos dissacarídeos (Figuras 24 e 25). Enquanto ConM complexada a
maltose forma sete pontes de hidrogênio com um dos resíduos de glicose e
apenas uma ponte com o outro, ConM complexada a trealose forma cinco
pontes de hidrogênio com um dos resíduos de glicose e três pontes com o
outro. Isto pode está relacionado à configuração da ligação glicosídica dos
dissacarídeos, pois enquanto maltose apresenta dois resíduos de glicose
unidos por ligação (14), trealose apresenta seus resíduos unidos por
(11).
Para ambas as estruturas, nota-se que os resíduos leucina (LEU99),
tirosina (TIR100) e arginina (ARG228), são conservados no sítio de ligação a
carboidratos, sendo que arginina (ARG228) apresenta-se como um resíduo
fundamental no estabelecimento da afinidade entre a ConM e carboidratos
(LORIS et al., 1998; LORIS et al., 2004).
5.6 Avaliação da qualidade das estruturas
5.6.1 ConM nativa
Feita uma análise da qualidade estereoquímica da estrutura final da
ConM através do programa PROCHECK (LASKOWSKI et al., 1993),
verificou-se que o modelo final apresentou boa configuração estereoquímica
(Figura 26); com 88,2 % dos resíduos nas regiões mais permitidas, 10,9 %
nas regiões adicionalmente permitidas, 1 % nas regiões generosamente
permitidas e nenhum resíduo em regiões não permitidas. Como uma das
saídas deste programa é o gráfico de Ramachandran (RAMACHANDRAN &
SASISKHARAN, 1968), que afere as medidas dos ângulos diédricos e ,
portanto trata-se de um bom indicador da qualidade do modelo.
100
Figura 26 – Gráfico de Ramachandran da estrutura final de ConM nativa
calculada pelo programa PROCHECK (LASKOWASKI et al.,
1993).
Diferenças mais significativas entre a estrutura da ConM e o modelo
da ConA estão nas regiões 68-70, 119-122, 135-137, 149-153, 161-163 e
170-171 (Figura 27). Sendo que algumas dessas diferenças estruturais entre
as subunidades de ConM, ocorrem principalmente nas regiões dos loops.
Estas regiões ou estão envolvidas nos contatos do cristal ou possuem
pequenos contatos com outras partes da proteína. As diferenças
apresentadas entre os modelos provavelmente são reais uma vez que os
átomos envolvidos possuem baixos fatores de temperatura.
101
Figura 27 - Desvio médio padrão na distância espacial entre as cadeias A
(azul) e D (vermelho) de ConM nativa e seus respectivos
monômeros no modelo 3ENR (BOUCKAERT et al., 2000;
BERMAN et al., 2000).
5.6.2 ConM complexada aos dissacarídeos maltose e trealose
No gráfico de Ramachandran (RAMACHANDRAN & SASISKHARAN,
1968) para ConM complexada ao dissacarídeo maltose (Figura 28) constata-
se que 89,4 % dos resíduos estão nas regiões mais permitidas, 9,7 % nas
regiões adicionalmente permitidas e 1 % nas regiões generosamente
permitidas. Já para o modelo final de ConM complexada ao dissacarídeo
trealose o gráfico de Ramachandran (Figura 29) mostra que 87,2 % dos
resíduos estão nas regiões mais permitidas, 11,8 % nas regiões
adicionalmente permitidas, 0,7 % nas regiões generosamente permitidas e
0,2 % nas regiões não permitidas.
102
Figura 28 – Gráfico de Ramachandran da estrutura final de ConM
complexada com o dissacarídeo maltose calculada pelo
programa PROCHECK (LASKOWASKI et al., 1993).
103
Figura 29 – Gráfico de Ramachandran da estrutura final de ConM
complexada com o dissacarídeo trealose calculada pelo
programa PROCHECK (LASKOWASKI et al., 1993).
104
Observando-se os gráficos (Figuras 30 e 31 para maltose e trealose,
respectivamente) de desvio médio padrão (r.m.s.d.) na distância espacial
entre as cadeias de ConM complexada com os dissacarídeos maltose e
trealose com relação aos seus respectivos monômeros no modelo, constata-
se alterações nas regiões dos resíduos de aminoácidos do sítio de ligação à
íons metálicos bivalentes. É evidente ainda, variações nas regiões C-
terminais (partindo do resíduo 180) das estruturas de ConM complexada a
ambos os dissacarídeos, principalmente nas áreas onde são encontrados
resíduos envolvidos na formação de pontes de hidrogênio no sítio de ligação
a carboidratos.
Da mesma forma que para a estrutura da ConM nativa, algumas
diferenças estruturais entre as subunidades de ConM complexadas com os
dissacarídeos maltose e trealose foram observadas na região dos loops.
Entretanto, a região dos resíduos 115-124 foi a única região de loop que
divergiu do modelo para a estrutura de ConM complexada com o açúcar
trealose. Já na estrutura de ConM complexada com maltose as regiões dos
loops 117-123 e 160-166 foram as que mais divergiram do modelo.
105
Figura 30 - Desvio médio padrão na distância espacial entre as cadeias A
(azul) e D (vermelho) de ConM complexada com o dissacarídeo
maltose e seus respectivos monômeros no modelo 3ENR
(BOUCKAERT et al., 2000; BERMAN et al., 2000).
106
Figura 31 - Desvio médio padrão na distância espacial entre as cadeias A
(azul) e D (vermelho) de ConM complexada com o dissacarídeo
trealose e seus respectivos monômeros no modelo 3ENR
(BOUCKAERT et al., 2000; BERMAN et al., 2000).
107
5.7 Atividade Biológica
A fenilefrina (0.1 µM) induziu contrações estáveis do tônus de anéis de
aorta nas preparações com endotélio intacto da ordem 0,58 ± 0,1 g (n=5;
Figura 32A, Figura 33) e de 1,07 ± 0,09 g em anéis de aorta no qual o
endotélio foi mecanicamente removido (n=6; Figura 32B, Figura 33). A adição
cumulativa de ConM aos tecidos pré-contraídos induziram um significante,
relaxamento concentração-dependente nas preparações com endotélio
preservado, começando em 10 µg/mL, com completa reversão evidente na
dose de 30 µg/mL (IC50 of 9,8 ± 0,6 µg/mL; Figura 32A, Figura 33). Contudo,
nenhum efeito relaxante foi observado nos tecidos em que o endotélio foi
previamente removido (Figura 32B, Figura 33).
O efeito relaxante da ConM em anéis de aorta com endotélio intacto foi
totalmente bloqueado pelo inibidor da óxido nítrico sintase L-NAME (100 µM;
n=5; Figura 32C, Figura 33). Mais importante ainda, foi à observação de que
o relaxamento induzido por ConM em tecidos pré-contraídos por uso de
fenilefrina, foi estritamente dependente da presença de um endotélio intacto,
tendo sido completamente inibido pela remoção mecânica da camada de
tecido endotelial ou pelo uso de um inibidor (L-NAME) da óxido nítrico sintase
(NOS). O óxido nítrico (NO), o principal mediador de relaxamento endotélio-
dependente na aorta de ratos, é produzido a partir do aminoácido arginina
pelas isoformas endoteliais da óxido nítrico sintase (eNOS) em resposta a
agonistas como acetilcolina, bradiquinina e substância P (FLEMING &
BUSSE, 1999). Esses agonistas provocam elevação intracelular das
concentrações de cálcio e uma conseqüente ativação da calmodulina que
estimula as isoformas endoteliais da óxido nítrico sintase (eNOS). Porém, as
isoformas endoteliais da óxido nítrico sintase (eNOS), também podem ser
ativadas por mecanismos dependentes de cálcio (FLEMING et al., 1998;
VENEMA, 2002). Uma característica geral dos eventos mediados pelo óxido
nítrico (NO) nos vasos sangüíneos é a sua inibição por análogos da L-
arginina, como o metil éster de L-nitro arginina (L-NAME) (MONCADA et al.,
1991; TARE et al., 2000). Uma vez que no presente estudo, L-NAME mostrou
capacidade tanto para inibir como para reverter o relaxamente induzido pelas
concentrações cumulativas administradas de ConM, é provável que óxido
108
nítrico esteja sendo liberado como resultado da interação da lectina com
células endoteliais. Isto ativa a guanilato ciclase do músculo liso, com
conseqüente relaxamento do vaso (KARAKI et al., 1997; MONCADA et al.,
1991). A possibilidade de ligação de lectinas à células do endotélio vascular
já foi anteriormente observada e relatada por diversos autores (SIMIONESCU
et al., 1982; MILLS & HAWORTH, 1986). Da mesma forma, já foi
demonstrado que a lectina de germen de trigo (WGA) e a concanavalina A
(ConA) podem liberar fatores de relaxamento endotélio-derivados em aorta
de coelho (KLEHA et al., 1991); e mais recentemente, que a lectina da alga
Bryothamnion triquetrum indux relaxamento em aortas de rato através de
liberação de óxido nítrico (NO) (LIMA et al., 2004). Além disso, Cavada e
colaboradores (2001) hipotetizaram que as lectinas com especificidade de
ligação para os mesmos ligantes possuem efeitos biológicos similares.
Porém, algumas atividades biológicas, como liberação de histamina, podem
ser úteis na agregação das lectinas em grupos. Estudos de microcalorimetria
por titulação isotérmica feitos por Dam e colaboradores (1998) mostraram
que as lectinas estudadas da subtribo Diocleinae podem ser divididas em
dois grupos: aquelas com relativamente altos K e -∆H de Canavalia
ensiformis (ConA), C. brasiliensis, D. guianensis e D. virgata, todas elas com
boa atividade de liberação de histamina; e aquelas com significativamente
baixos K e -∆H ao complexo oligossacarídeo biantenário como as lectinas
de sementes de D. grandiflora, Cratylia floribunda, D. rostrata e D. violacea,
que possuem baixas atividades de liberação de histamina. Assim, ConM
parece pertencer ao ultimo grupo de lectinas da sub-tribo Diocleinae, e como
se poderia esperar, apresenta baixa atividade de liberação de histamina,
conforme previamente relatado por Gomes e colaboradores (1994) e Ferreira
e colaboradores (1996) em ensaios de produção de mastócitos na cavidade
peritoneal de ratos. As lectinas de C. brasiliensis, D. rostrata e D. virgata
lectins induzem liberação de histamina em mastócitos na cavidade peritoneal
de ratos semelhante à de concanavalina A (ConA). Uma menos potente e
eficaz liberação de histamina foi observada para as lectinas de C. maritima,
D. guianensis e D. violacea enquanto que mais baixas atividades de liberação
109
de histamina foram observadas para as lectinas de D. grandiflora, C.
bonariensis e Cratylia floribunda (GOMES et al., 1994).
Uma evidencia da interação da lectina com estruturas vasculares pode
ser visualizado no corte histológico transversal de aorta de rato (Figura 34).
Quando comparada ao controle (Figura 34A), a imagem do tecido tratado
com a lectina marcada com fluoresceína (Figura 34B) mostra um
espessamento das fibras elásticas na túnica média, além de uma sensível
maior fluorescência no lado interno do anel de aorta, que corresponde ao
endotélio do vaso.
110
Figura 32 – Indução do relaxamento em aorta isolada de ratos dependente de
óxido nítrico pela ConM. Os gráficos mostram os efeitos da
adição de ConM (1-100 µg/mL) em anéis de aorta de rato pré-
contraídos com 0,1 µM de fenilefrina (PE) com endotélio intacto
(A), sem endotélio intacto (B) e com endotélio intacto
previamente tratado com L-NAME (C). W indica lavagem da
preparação com solução de Tyrode.
111
Figura 33 – Dados médios dos experimentos comparando as respostas nos
tecidos com (●, n =7) e sem (■, n = 6) endotélio intacto e com
endotélio intacto previamente tratado com L-NAME (□, n=5). Os
valores foram expressos em percentagem (%) de mudanças a
partir da contração induzida por fenilefrina (PE) e foram
considerados como significativamente diferentes entre tecidos
com endotélio intacto e desnudo quando p<0.05.
112
Figura 34 – Imagens de microscopia de fluorescência de cortes histológicos
de anéis de aorta de rato. Controle (A) e tecidos incubados com
ConM marcada com fluoresceína (B).
113
6. CONCLUSÃO
Foi estabelecida a estrutura tridimensional completa por refinamento
cristalográfico da lectina purificada de sementes de Canavalia maritima
(ConM) com atividades relaxantes sobre anéis de aorta. As estruturas
refinadas, resolvidas por meio de técnicas de substituição molecular, foram
obtidas tanto de cristais da lectina nativa (1,95 Å) como de cristais da
proteína complexada com os dissacarídeos maltose (1,71 Å) e trealose (1,78
Å). A estrutura nativa consiste de um dímero na unidade assimétrica, com
dois sítios de ligação a metais por monômero e contatos por pontes de
hidrogênio que através de interação do tipo “cross-link” participam na
oligomerização molecular. Os resultados de atividade biológica da ConM
indicam que a lectina exerce ação relaxante concentração-dependente em
anéis isolados de aorta, ocorrendo provavelmente por meio de interação com
um sítio lectina-específico presente no endotélio, resultando na liberação de
óxido nítrico.
114
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8. APÊNDICE
APÊNDICE A – Artigo Publicado
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