universidade regional integrada do alto uruguai e …metabólitos secundários como alcaloides,...
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UNIVERSIDADE REGIONAL INTEGRADA DO ALTO URUGUAI E DAS
MISSÕES
PRÓ-REITORIA DE ENSINO, PESQUISA E PÓS GRADUAÇÃO
CAMPUS ERECHIM
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
NATÁLIA WOLOSZYN
EXTRAÇÃO UTILIZANDO LÍQUIDOS PRESSURIZADOS E AVALIAÇÃO DE
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE POEJO
(Mentha pulegium), CAVALINHA (Equisetum giganteum) E MALVA
BRANCA (Sida cordifolia)
ERECHIM-RS
2019
NATÁLIA WOLOSZYN
EXTRAÇÃO UTILIZANDO LÍQUIDOS PRESSURIZADOS E AVALIAÇÃO DE
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIMICROBIANA DE POEJO (Mentha
pulegium), CAVALINHA (Equisetum giganteum) E MALVA BRANCA (Sida
cordifolia)
Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre, pelo curso de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Departamento de Ciências Agrárias da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões – Campus Erechim.
Orientadores: Dr. Alexander Junges e Dra. Natalia Paroul.
Erechim-RS
2019
NATÁLIA WOLOSZYN
EXTRAÇÃO UTILIZANDO LÍQUIDOS PRESSURIZADOS E AVALIAÇÃO DE
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIMICROBIANA DE POEJO (Mentha
pulegium), CAVALINHA (Equisetum giganteum) E MALVA BRANCA (Sida
cordifolia)
Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre, pelo curso de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Departamento de Ciências Agrárias da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões – Campus Erechim. Erechim, 15 de abril de 2019.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Prof. Dr. Alexander Junges (Orientador)
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões
___________________________________________
Prof. Dra. Natalia Paroul (Orientadora)
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões
____________________________________________
Prof. Dr. Rogério Luis Cansian
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões
____________________________________________
Prof. Dra. Luiza Pieta
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Sul
W866e Woloszyn, Natália Extração utilizando líquidos pressurizados e avaliação de atividade antioxi- dante e antimicrobiana de poejo (Mentha pulegium), cavalinha (Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) / Natália Woloszyn. - 2019. 56 f. Dissertação (mestrado) – Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões, Erechim, 2019.
“Orientação: Dr. Alexander Junges; Dra, Natália Paroul” 1. Plantas medicinais 2. Líquidos pressurizados 3. Atividade antioxidante 4. Atividade antimicrobiana I. Título
C.D.U.: 664 Catalogação na fonte: bibliotecária Sandra Milbrath CRB 10/1278
Dedico este trabalho aos meus pais, Loraci e Nico, por nunca terem desistido de mim, mesmo quando eu já tinha desistido.
Agradecimentos
À minha família, em especial aos meus pais pelos bons momentos, por nunca
terem desistido de mim, por todo o suporte, tanto emocional quanto financeiro.
Aos meus orientadores Alexander e Natalia, por todo o conhecimento repassado,
pela orientação e pela ajuda.
Aos amigos do mestrado, Patrícia, Suelen, Morgana, Simone, Vanessa, Liliane,
Karine, Anne, Thiago, Janine e Glaciela, os quais foram muito importantes desde
o início dessa árdua jornada.
Agradeço ao pessoal da turma 2017 do PPGEAL-URI, por toda a parceria, pelos
almoços, jantas e pela companhia.
Aos bolsistas do projeto Bruno, Renan e Eduardo pela parceria e ajuda.
À Sandy, por toda a ajuda e suporte no laboratório.
À Bruna pela ajuda nas análises antimicrobianas.
Aos amigos de infância, que foram muito importantes para que eu não desistisse,
por mais que não soubessem, obrigada por serem um ponto de paz, uma fuga,
uma inspiração, Júlia, Claudielli, Kelin e Luísa.
Ao Marcus, por ser meu companheiro, por me apoiar e pelos conselhos.
À CAPES pela concessão da bolsa.
Ao Ser Maior que nos guia, pelos momentos em que nada deu certo, por ser um
ponto de apoio para saber que nada é por acaso e que as coisas acontecem no
tempo que tem que acontecer.
Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos.
RESUMO
As plantas medicinais vêm sendo utilizadas há muito tempo na cura de doenças, por possuírem compostos com atividade farmacológica. Uma extração eficiente desses compostos se faz necessária uma vez que muitos deles são sensíveis à temperatura alta. Desta forma, a utilização da técnica de extração utilizando líquidos pressurizados se apresenta como um método eficiente, por permitir utilizar elevadas pressões e temperaturas mais brandas que não degradem os compostos de interesse, tais como os compostos fenólicos e flavonoides. Este trabalho teve por objetivo extrair compostos de três plantas medicinais – poejo (Mentha pulegium), cavalinha (Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) – empregando líquidos pressurizados (etanol, água e solução hidroalcoólica 50% (v/v)) e avaliar sua capacidade antioxidante e antimicrobiana, além do conteúdo fenólico total e o conteúdo de flavonoides totais. O melhor rendimento de extração encontrado foi para os extratos hidroalcoólicos e aquosos, com destaque para o extrato de poejo. Já os extratos que obtiveram a maior capacidade antioxidante foram o etanólico e hidroalcoólico de poejo (0,02 e 0,03 mg/mL de IC50, respectivamente), seguidos pelo extrato etanólico de cavalinha. O extrato hidroalcoólico de poejo obteve também maior quantidade de compostos fenólicos. No entanto, os extratos etanólicos de cavalinha com apenas 30 minutos de extração obtiveram 193,45 mg QE/g de extrato seco e de malva branca, 147,39 mg QE/g de extrato seco, mas no tempo de 90 a 180 minutos, sendo os maiores valores para flavonoides totais. Ainda, o extrato com maior capacidade antimicrobiana foi o etanólico de poejo. De forma geral extratos etanólicos e aquosos apresentaram uma extração mais eficiente e, o poejo foi a planta que obteve melhores capacidades antioxidantes e antimicrobianas. Palavras-chave: Plantas medicinais, extração, líquidos pressurizados, atividade antioxidante, atividade antimicrobiana.
Abstract of Dissertation presented to Food Engineering Program as a partial fulfillment of the requirements for the Degree of Master in Food Engineering
ABSTRACT
Medicinal plants have been used for a long time in curing diseases, because they contain compounds with pharmacological activity. Efficient extraction of these compounds is necessary since many of them are sensitive to high temperature. Thus, the use of the extraction technique using pressurized liquids is an efficient method, since it allows the use of higher pressures and milder temperatures that do not degrade the compounds of interest, such as phenolic compounds and flavonoids. The objective of this work was to extract compounds from three medicinal plants – pennyroyal (Mentha pulegium), horsetail (Equisetum giganteum) and white mallow (Sida cordifolia) – using pressurized liquids (ethanol, water and hydroalcoholic solution 50% (v/v)) evaluate its antioxidant and antimicrobial capacity, as well as the total phenolic content and the total flavonoid content. The best extraction yield was found for the hydroalcoholic and aqueous extracts, with emphasis on the pennyroyal extract. The extracts that obtained the highest antioxidant capacity were ethanolic and hydroalcoholic of poejo (0.02 and 0.03 mg/mL of IC50, respectively), followed by ethanolic extract of horsetail. The hydroalcoholic extract of pennyroyal also obtained a greater quantity of phenolic compounds. However, ethanolic horsetail extracts with only 30 minutes of extraction obtained 193.45 mg QE/g of dry extract and white mallow, 147.39 mg QE/g of dry extract, but in the time of 90 to 180 minutes, being the highest values for total flavonoids. Still, the extract with greater antimicrobial capacity was the ethanolic of pennyroyal. In general, ethanolic and aqueous extracts presented a more efficient extraction, and the pennyroyal was the plant that obtained better antioxidant and antimicrobial capacities. Keywords: Medicinal plants, extraction, pressurized liquids, antioxidant activity, antimicrobial activity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Curva global de extração ................................................................ 24
Figura 2 – Unidade experimental de extração com líquido pressurizado ......... 28
Figura 3 – Curva de calibração de ácido gálico. ............................................... 30
Figura 4 – Curva de calibração de quercetina .................................................. 31
Figura 5 – Curva global de extração de poejo (Mentha pulegium) frente a etanol,
solução hidroalcoólica 50% (v/v) e água .......................................................... 35
Figura 6 – Curva global de extração de cavalinha (Equisetum giganteum) frente
a etanol, solução hidroalcoólica 50% (v/v) e água ........................................... 36
Figura 7 – Curva global de extração de malva branca (Sida cordifolia) frente a
etanol, solução hidroalcoólica 50% (v/v) e água .............................................. 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Teor de umidade de poejo (Mentha pulegium), cavalinha (Equisetum
giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) .................................................... 34
Tabela 2 – Rendimentos de extração de poejo (Mentha pulegium), cavalinha
(Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) frente a etanol (EtOH),
solução hidroalcoólica 50% (EtOH/H2O) e água (H2O) .................................... 34
Tabela 3 - Conteúdo fenólico total de poejo (Mentha pulegium), cavalinha
(Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) frente a etanol (EtOH),
solução hidroalcoólica 50% (EtOH/H2O 50%) e água (H2O) ............................ 38
Tabela 4 – Conteúdo de flavonoides totais de poejo (Mentha pulegium),
cavalinha (Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) frente a etanol
(EtOH), solução hidroalcoólica 50% (EtOH/H2O 50%) e água (H2O) ............... 39
Tabela 5 – Resultados de IC50 de poejo (Mentha pulegium), cavalinha
(Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) frente à etanol (EtOH),
solução hidroalcoólica 50% (EtOH/H2O 50%) e água (H2O) ............................ 41
Tabela 6 – Valores médios de concentração inibitória mínima de poejo (Mentha
pulegium), cavalinha (Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia)
frente a etanol (EtOH), solução hidroalcoólica 50% (EtOH/H2O 50%) e água
(H2O) para Escherichia coli (E. coli), Listeria monocytogenes (L.
monocytogenes), Staphylococcus aureus (S. aureus) e Salmonella choleraesuis
(S. choleraesuis) .............................................................................................. 43
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 13
2 OBJETIVOS .............................................................................................. 15
2.1 Objetivo Geral .................................................................................... 15
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................... 15
3 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................... 16
3.1 Plantas Medicinais ............................................................................ 16
3.1.1 Cavalinha (Equisetum giganteum) ................................................ 17
3.1.2 Malva Branca (Sida cordifolia) ...................................................... 18
3.1.3 Poejo (Mentha pulegium) .............................................................. 19
3.2 Compostos Antioxidantes ................................................................ 19
3.3 Compostos Fenólicos ....................................................................... 20
3.4 Atividade Antimicrobiana ................................................................. 21
3.5 Extração com Líquido Pressurizado ............................................... 23
3.5.1 Cinética de Extração ..................................................................... 24
3.5.2 Solventes ...................................................................................... 25
4 METODOLOGIA ....................................................................................... 27
4.1 Obtenção da Matéria-Prima .............................................................. 27
4.2 Preparo da Matéria-Prima ................................................................. 27
4.3 Análise de Umidade .......................................................................... 27
4.4 Extração com Líquidos Pressurizados ........................................... 27
4.5 Determinação do Rendimento Global e Cinética de Extração ...... 29
4.6 Determinação do Teor de Compostos Fenólicos Totais................ 29
4.7 Determinação do Teor de Flavonoides Totais ................................ 30
4.8 Determinação da Atividade Antioxidante ........................................ 31
4.9 Determinação da Concentração Inibitória Mínima ......................... 32
4.10 Análise Estatística ............................................................................. 33
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 34
5.1 Teor de Umidade das amostras ....................................................... 34
5.2 Rendimentos e Curvas Globais de Extração .................................. 34
5.3 Conteúdo Fenólico Total .................................................................. 37
5.4 Conteúdo de Flavonoides Totais ..................................................... 39
5.5 Determinação da Atividade antioxidante ........................................ 40
5.6 Concentração Inibitória Mínima ....................................................... 43
6 CONCLUSÕES ......................................................................................... 45
7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ....................................... 46
8 REFERÊNCIAS......................................................................................... 47
13
1 INTRODUÇÃO
Plantas medicinais são uma fonte de compostos bioativos, os quais
podem ser usados no tratamento de doenças. Desde muito tempo, as plantas
são usadas na cura de doenças infecciosas. Os povos antigos utilizavam essas
plantas em enfermidades de animais, até que se descobriu que poderiam ser
também usadas em humanos.
A Equisetum giganteum, popularmente conhecida como cavalinha,
pertencente à família Equisetaceae, é uma planta que chega a 160 centímetros
de altura, é nativa de regiões pantanosas de quase todo o Brasil. Possui
metabólitos secundários como alcaloides, compostos fenólicos, flavonoides,
cumarinas e saponinas em sua composição e apresenta ação antifúngica,
antimicrobiana, antioxidante, entre outras. Por ser uma planta diurética pode ser
utilizada no tratamento de doenças renais, pulmonares e diabetes (LORENZI;
MATOS, 2002; MELLO; BUDEL, 2013; BERTALOT et al., 2010).
A Sida cordifolia, conhecida como malva branca, é uma planta da família
Malvaceae que cresce em regiões de altitude de até 1050 metros, nativa da Índia
e é utilizada principalmente na medicina indiana (JAIN et al., 2011). Possui
alcaloides, flavonoides, fenólicos, açúcares redutores, entre outros. Tem função
hepatoprotetora, antidiabética e anti-inflamatória (DINDA et al., 2015; MOMIN et
al., 2014). É utilizada nos tratamentos de doenças reumáticas, tuberculose e
doenças do trato urinário (GALAL; RAMAN; KHAN, 2015; SRINITHYA;
MUTHURAMAN, 2014).
A Mentha pulegium, popularmente conhecida como poejo, é uma erva
perene e endêmica, nativa da Europa (CHALCHAT et al., 2000). Possui
compostos fenólicos, flavonoides e terpenoides, e apresenta atividades
antioxidante, antimicrobiana, inseticida e analgésica (KAMKAR et al., 2010).
Pode ser utilizada no tratamento de náuseas, dores de estômago, diarreias, entre
outros (KHONCHE et al., 2017; ABDELLI et al., 2016).
Por estas plantas possuírem vários compostos com propriedades
biológicas, a extração dos mesmos deve ser eficiente e ocorrer sem degradação
dos princípios ativos. No entanto, as técnicas tradicionais de extração, como a
técnica de maceração e Soxhlet, utilizam grandes volumes de solvente, tempos
14
de extração longos e temperaturas elevadas, o que resulta em decomposição de
alguns princípios ativos (BELWAL et al., 2018; JACQUES, 2005).
Dentro desse contexto, a técnica de Extração com Líquidos Pressurizados
(PLE – Pressurized Liquid Extraction) surge como uma alternativa promissora
para obtenção de extratos com atividades biológicas e antioxidantes. O emprego
de pressões elevadas aumenta a solubilidade dos compostos termossensíveis
em um determinado solvente sem precisar aumentar a temperatura de extração
(MENDIOLA et al., 2007; SONAGLIO et al., 2007; FUJITA et al., 2013).
15
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Preparar extratos de três plantas medicinais (poejo, cavalinha e malva
branca) empregando líquidos pressurizados e avaliar a concentração de
compostos fenólicos e flavonoides e a capacidade antioxidante e antimicrobiana
dos extratos.
2.2 Objetivos Específicos
• Avaliar a cinética de extração das plantas frente a três diferentes solventes
(etanol, água e solução hidroalcoólica 50%);
• Avaliar o rendimento de extração dos extratos das três plantas frente aos
três diferentes solventes (etanol, água e solução hidroalcoólica 50%);
• Avaliar a atividade antioxidante dos extratos em diferentes tempos de
extração;
• Avaliar o conteúdo de compostos fenólicos dos extratos em diferentes
tempos de extração;
• Avaliar o conteúdo de flavonoides dos extratos em diferentes tempos de
extração;
• Determinar a concentração inibitória mínima de todos os extratos frente a
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella choleraesuis e Listeria
monocytogenes.
16
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Plantas Medicinais
Planta medicinal é toda planta consumida ou administrada sob qualquer
forma, que exerça algum tipo de ação farmacológica no homem ou animais. A
fitoquímica moderna tem por função a caracterização botânica das espécies
vegetais com atividade farmacológica e o estudo da composição química. Nas
últimas décadas as plantas medicinais têm sido submetidas a estudos químicos
e farmacológicos para confirmar a sua atividade medicinal e os seus constituintes
(CUNHA; RIBEIRO; ROQUE, 2007).
As plantas medicinais e seus extratos têm sido usados desde os tempos
pré-históricos para curar várias doenças, o que resultou na descoberta de alguns
fármacos muito importantes. Atualmente está bem estabelecido que as terapias
tradicionais de ervas contêm uma variedade diversificada de agentes
quimiopreventivos (AROUMA, 2003).
Aproximadamente 25% dos medicamentos prescritos no mundo são de
origem vegetal (RATES, 2001). Desde os tempos antigos se utilizam diversas
partes de plantas medicinais (flores, folhas, cascas, caules, frutos e extratos de
raízes) para curar doenças (NAIR; KALARIYA; CHANDA, 2005).
De acordo com Brasil (2006) 85% da população utiliza plantas medicinais
no tratamento de doenças. As plantas utilizadas no uso terapêutico devem
possuir moléculas bioativas e atividade biológica que tenha sido estudada
cientificamente para comprovar a eficácia e segurança (FERNANDES, 2010).
Metabólitos secundários têm sido estudados como fonte de agentes
medicinais em plantas, por possuírem fitoquímicos com eficácia antibacteriana e
antioxidante, compostos capazes de prevenir oxidação lipídica induzida por
radicais livres e também ser uma alternativa à resistência dos micro-organismos
a antibióticos sintéticos (KIVCAK; MERT, 2002; LEE; HWANG; LIM, 2004;
KARUNA et al., 2009).
As plantas medicinais são uma fonte natural de compostos bioativos como
os polifenóis, vitaminas, carotenoides, ácidos graxos insaturados e açúcares
redutores, que protegem os constituintes ativos de alterações, tais como
oxidações e hidrólises, permitindo uma melhor absorção pelo organismo,
17
podendo ainda serem utilizadas como aditivos alimentares. Assim, a ação
conjunta dos constituintes da planta tem maior efeito e atividade que um
constituinte ativo isolado, o que justifica o interesse por medicamentos à base de
plantas e ainda a utilização destas na formulação de alimentos funcionais e
nutracêuticos (CUNHA, 2006; LOZIENE et al., 2007).
A medicina ayurvérdica, criada na Índia há cerca de 5000 anos, tem por
objetivo a cura utilizando plantas medicinais, promovendo a saúde com base na
visão holística (LOPES et al., 2016).
No entanto, a concentração dos princípios ativos da mesma planta pode
variar em função das fases vegetativas e condições ambientais, bem como
variações sazonais e geográficas e em função da composição do solo (GOBBO
NETO; LOPES, 2007).
3.1.1 Cavalinha (Equisetum giganteum)
A Equisetum giganteum, popularmente conhecida como cavalinha,
pertencente à família Equisetaceae, pode atingir até 160 centímetros de altura,
sendo nativa de áreas pantanosas de quase todo o Brasil. É encontrada em
ambientes quentes e úmidos e cultivada muitas vezes como planta ornamental,
embora possa se tornar uma planta daninha. É amplamente usada na América
do Sul na medicina caseira (LORENZI; MATOS, 2002).
Em relação à composição química da cavalinha, esta pode conter
esteróis, como o betasitosterol, campesterol, isofucosterol, colesterol (traços) e
triglicerídeos; isoquercina; alcaloides, como a nicotina, equispermina e palustina;
saponinas (equisetonina); flavonas glicosadas, como isoquercitrina, equisetrina
e galuteolina; ácido ascórbico; compostos fenólicos; flavonoides (luteolina);
resinas; taninos; óleos voláteis; a enzima tiaminase e sais minerais (LORENZI;
MATOS, 2002; MELLO; BUDEL, 2013; MORAES, 2011; NGO et al., 2017).
A cavalinha é utilizada para fins medicinais como uma planta diurética,
hemostática e no tratamento de doenças renais, pulmonares e diabetes
(ANDRADE-CETTO; HEINRICH, 2005; WRIGHT et al., 2007). O grande
potencial diurético da planta pode estar relacionado ao seu teor elevado de
potássio, bem como de ácidos fenólicos e flavonoides (FRANCESCATO, 2012).
18
Ainda, de acordo com Kloucek et al. (2005) extratos hidroetanólicos de E.
giganteum apresentam boa capacidade antimicrobiana.
3.1.2 Malva Branca (Sida cordifolia)
A malva branca (Sida cordifolia) é tradicional da Índia e pertence à família
Malvaceae, cresce em regiões tropicais e subtropicais até uma altitude de 1050
metros (JAIN et al., 2011).
Na malva branca são encontrados alcalóides, flavonoides, ecdisteróides,
esteroides, fenólicos, açúcares redutores e saponinas (DINDA et al., 2015;
MOMIN et al., 2014). Estudos de Nunes et al. (2006) revelaram que o óleo de S.
cordifolia possui atividade antimicrobiana consideravelmente alta.
A malva branca tem sido utilizada na medicina tradicional indiana
(ayurvérdica), chinesa, americana e africana. Estudos revelaram que seus
extratos e compostos isolados possuem atividade antimicrobiana, anti-
inflamatória, analgésica, hepatoprotetora, antiulcerogênica, citotóxica,
cardioprotetora, neuroprotetora, antituberculose, nefroprotetora, antidiabética,
antiobesidade, abortiva e antipirética (GALAL; RAMAN; KHAN, 2015;
SRINITHYA; MUTHURAMAN, 2014; PRADHAN et al., 2013; AJITHABAI;
SUNITHA RANI; JAYAKUMAR, 2012; MAHESH; SATISH, 2008;
BALAKRISHNAN et al., 2006; FRANZOTTI et al., 2000). Além disso, outros
estudos evidenciaram que pode ser utilizada para o tratamento de câncer de
pulmão, do infarto do miocárdio, estomatite, bronquite asmática e congestão
nasal (AGYARE et al., 2018; KUBAVAT; ASDAQ, 2009; SILVA et al., 2006).
Também é utilizada para tratamento da sinusite, problemas menstruais,
estresse e dores articulares (DINDA et al., 2015). Na medicina ayurvérdica é
usada como ingrediente em medicamentos como 'Baladikwath', 'Baladya ghirt',
'Baladyarista', 'Chandanbala lakshadi taila', 'Sudarshan churna' e 'Kukuvadi
churna', para o alívio da dor e inchaço em distúrbios reumáticos, fraqueza
muscular, doenças cardíacas, tuberculose, bronquite, problemas neurológicos e
feridas no trato urinário (DHIMAN; KUMAR, 2006).
19
3.1.3 Poejo (Mentha pulegium)
Poejo (Mentha pulegium) é uma erva perene e endêmica que é nativa da
Europa, África do Norte, Ásia Menor e Oriente Médio, pertencente à família
Lamiaceae (CHALCHAT et al., 2000). As folhas de Mentha pulegium são usadas
na medicina tradicional para tratar distúrbios gastrointestinais, incluindo
dispepsia, náuseas, vômitos, inchaço, dor de estômago, infecções e diarreias
(KHONCHE et al., 2017).
Na fitoterapia, usa-se as partes aéreas para a falta de apetite, para facilitar
a digestão e para cólicas gastrointestinais (CUNHA; RIBEIRO; ROQUE, 2007).
Na cosmetologia, é considerada uma planta herbácea usada especialmente na
fragrância masculina pelo seu frescor e caráter tônico (BHAR; BALOUK, 2011).
Na medicina, é usado como anti-séptico e também como analgésico (BLANCOU;
VIN-NIVEAUX, 2006).
O seu óleo essencial pode ser utilizado como antibiótico, conservante de
alimentos e bio-inseticida (ABDELLI et al., 2016). Também demonstrou possuir
atividade antimicrobiana principalmente contra bactérias Gram-positivas
(ABDELLI et al., 2016), no entanto, o estudo de Bouyahya et al. (2017)
demonstrou atividade antimicrobiana tanto para bactérias Gram-positivas quanto
para bactérias Gram-negativas. Também se descobriu potencial atividade
antioxidante e contra bactérias que desenvolvem a doença leishmaniose.
Jain, Jain D. e Balekar (2012) demonstraram que o extrato etanólico das
folhas de M. pulegium possui atividade antioxidante in vivo e que reduzem e
melhoram os níveis de glutationa, SOD (Superóxido dismutase), catalase e
peroxidase. Extratos aquosos e metanólicos possuem alta atividade
antioxidante, o que pode ser atribuído ao conteúdo de fenólicos, flavonoides e
terpenóides (KAMKAR et al., 2010).
3.2 Compostos Antioxidantes
O processo respiratório e diversas reações oxidativas, que ocorrem nas
células aeróbicas, levam à formação de radicais livres, que causam danos ao
organismo e contribuem para o aparecimento de muitas doenças, tais como:
inflamações, tumores malignos, mal de Alzheimer e doenças cardiovasculares,
20
e ainda aceleram o processo de envelhecimento (SIKORA et al., 2008). Devido
a isso, as células humanas dependem da capacidade antioxidante para fornecer
proteção contra os efeitos prejudiciais de radicais livres e espécies reativas do
oxigênio, que são consequências inevitáveis da vida aeróbica. Para alcançar
uma proteção eficiente, os tecidos dispõem de um sistema antioxidante
integrado, que consiste em um arranjo de diversos componentes lipossolúveis
(vitamina E; carotenóides), hidrossolúveis (ácido ascórbico; glutatinona,
flavonóides) e enzimáticos (glutatinona peroxidase; superóxido dismutase;
catalase) (McLEAN et al., 2005).
Os compostos antioxidantes que estão presentes na nossa dieta têm
grande importância, pois atuam como agentes protetores, ajudando o corpo na
redução de danos oxidativos. Os fitoquímicos são classificados como compostos
bioativos provenientes de partes e plantas diferentes, como, cereais, sementes,
frutos, folhas, vegetais, especiarias, raízes e ervas (SKERGET et al. 2005;
FERREIRA; ABREU, 2007; LIU, 2003), e estão relacionados com a redução da
ocorrência de várias doenças crônicas.
3.3 Compostos Fenólicos
Um grande e complexo grupo de fitoquímicos são os compostos fenólicos,
encontrados em grande quantidade em plantas, frutas e vegetais. Os compostos
fenólicos presentes em plantas apresentam atividade farmacológica e podem
inibir a oxidação lipídica e proliferação de fungos (SPANOS; WROLSTAD, 1992;
FALCÃO, 2008).
Os compostos fenólicos possuem duas classificações (CARVALHO;
GOSMANN; SCHENKEL, 2007):
- compostos fenólicos amplamente distribuídos: derivados de ácidos
benzoicos e de ácidos cinâmicos, cumarinas, flavonoides, taninos e ligninas;
- compostos fenólicos de distribuição restrita: o qual abrange as classes
de substâncias que não foram citadas no item anterior.
A maioria dos compostos fenólicos é solúvel em água e em solventes
orgânicos polares (CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2007).
Os compostos fenólicos de fontes vegetais podem atuar como
antioxidantes através da eliminação de radicais lipídicos. Acredita-se que os
21
fenóis podem atuar tanto como eliminadores de radicais como para quelantes de
metais, além de serem importantes economicamente por contribuírem com o
sabor, odor e coloração de diversos vegetais, podendo ser utilizados como
corantes e flavorizantes (CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2007).
Flavonoides constituem uma importante classe de polifenóis, presentes
entre os metabólitos secundários de plantas (ZUANAZZI, 2001). Ocorrem
geralmente em todas as partes da planta, mas a quantidade é variável devido
aos fatores genéticos, maturidade, clima, localização na planta e práticas
agrícolas (MORAIS, 2009).
O interesse econômico dos flavonoides é decorrente de suas diferentes
propriedades, como por exemplo seu uso em pigmentos, suas contribuições na
nutrição e no sabor dos alimentos. Apresentam importância farmacológica
devido a suas propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes, anticarcinogênicas,
antialérgicas entre outras. Medicamentos com flavonoides são indicados para
tratamento de doenças circulatórias, hipertensão e age como cofator da vitamina
C (ZUANAZZI, 2001).
3.4 Atividade Antimicrobiana
As doenças infecciosas representam uma importante causa da
mortalidade em humanos, especialmente nos países em desenvolvimento.
Assim, as indústrias farmacêuticas têm sido motivadas para o desenvolvimento
de novas drogas antimicrobianas, especialmente em função da ocorrência de
resistência das bactérias a tais medicamentos (HAIDA et al., 2007).
Em geral, bactérias têm habilidade genética de transmitir e adquirir
resistência a drogas usadas como agentes terapêuticos (NASCIMENTO et al.
2000), pois são frequentes os relatos sobre isolamentos de bactérias que eram
reconhecidamente sensíveis às drogas de uso na rotina, mas que se tornaram
resistentes a todos, ou a quase todos, fármacos disponíveis no mercado
(SAKAGAMI; KAJAMURA, 2002). Inúmeras medidas são sugeridas para
resolver esse problema, sendo uma delas a busca por antimicrobianos a partir
de espécies vegetais (CECHINEL FILHO, 2000; SOUZA; LIMA; NARAIN, 2003).
A ação dos agentes antimicrobianos é, sobretudo, exercida na parede
celular da bactéria, provocando danos estruturais e funcionais. As substâncias
22
ativas das plantas são capazes de alterar a estrutura fosfolipídica da membrana
celular, interrompendo o sistema enzimático, comprometendo o material
genético da bactéria e formando compostos tóxicos (FOOD INGREDIENTS
BRASIL, 2010).
A utilização de óleos como aditivos alimentares pode ser utilizada para
retardar a deterioração dos alimentos ou para evitar o crescimento de patógenos
alimentares e micro-organismos resistentes aos antibióticos (BURT, 2004).
As doenças transmitidas por alimentos são conhecidas como toxinfecções
que ocorrem devido à ingestão de alimentos contaminados por microrganismos
patogênicos, objetos lesivos, substâncias químicas ou substâncias tóxicas
presentes naturalmente nos alimentos (RIEDEL, 2005). Tais doenças
apresentam características comuns como: curto período de incubação, náuseas,
vômitos, diarreia, dor abdominal e presença ou ausência de febre. Os pacientes
podem, num curto período de tempo apresentar melhora no quadro clínico,
entretanto em indivíduos imunocomprometidos, idosos ou muito jovens estas
doenças podem levar a complicações graves e consequentemente a morte
(RIEDEL, 2005; GERMANO; GERMANO, 2011).
Patógenos de origem alimentar são amplamente diversos na natureza e
são a maior causa de problemas mundiais de saúde pública em países
desenvolvidos e em desenvolvimento. Esses agentes são responsáveis por
considerável morbidade e mortalidade, além de resultar em custos com cuidados
médicos, perda de produtividade e controle pela indústria de alimentos
(FRANTAMICO; BHUNIA; SMITH, 2007; NEDOROSTOVA et al., 2009). Entre os
mais sérios patógenos de origem alimentar estão Salmonella sp., Listeria
monocytogenes e Escherichia coli, os quais são responsáveis pelo maior número
de casos de doenças e mortes (RICKE et al., 2005; OUSSALAH et al., 2007).
Para reduzir doenças e danos econômicos causados por microrganismos
patogênicos, o uso de produtos naturais como compostos antimicrobianos
parece ser uma boa maneira de controlar a presença de bactérias patogênicas
e estender a vida de prateleira de alimentos processados (FILOCHE; SOMA;
SISSONS, 2005; NEDOROSTOVA et al., 2009). Assim, a crescente demanda
do consumidor por produtos naturais efetivos e seguros tem levado a
investigações com relação aos efeitos de fitoquímicos (DORMAN; DEANS, 2000;
DRAUGHON, 2004; FILOCHE; SOMA; SISSONS, 2005).
23
3.5 Extração com Líquido Pressurizado
A técnica de extração com líquido pressurizado é utilizada por permitir que
o solvente permaneça em seu estado líquido, aplicando altas pressões e
temperaturas acima do seu ponto de ebulição. O uso de alta temperatura de
extração pode promover o aumento da solubilidade dos compostos de interesse
e aumentar a taxa de transferência de massa. Além disso, altas temperaturas
diminuem a viscosidade e a tensão superficial dos solventes, o que ajuda a
alcançar áreas das matrizes mais facilmente, melhorando a taxa de extração
(MENDIOLA et al., 2007). No entanto, o uso de altas temperaturas também pode
degradar alguns compostos de interesse que são termossensíveis, como os
compostos fenólicos (CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2007; SONAGLIO
et al., 2007; FUJITA, et al., 2013).
Em extrações com solventes pressurizados pode-se utilizar tanto o modo
estático, quanto o modo dinâmico da extração. O modo estático é o mais
utilizado, no entanto, o modo dinâmico permite o contato mais rápido entre a
matriz e o solvente não saturado bombeado através da célula de extração
(MENDIOLA et al., 2007).
A extração com líquido pressurizado permite utilizar solventes polares e
apolares em diversas condições de temperatura, pressão e vazão. Estas
condições experimentais visam aumentar a solubilidade e transferência de
massa e diminuir a viscosidade e a tensão superficial dos solventes permitindo
melhorar o processo de extração (DAWIDOWICZ; CZAPCZYNSKA;
WIANOWSKA, 2012). Permite ainda minimizar as alterações químicas e
degradação de compostos sensíveis ao calor, quando se utiliza temperaturas
adequadas (BOZAN; TEMELLI, 2002; YIN et al., 2005; SPARKS et al., 2006).
Uma desvantagem encontrada no processo é o alto custo para implementação
inicial, devido aos equipamentos robustos que suportem altas pressões que são
necessários; porém, seu custo operacional é baixo devido a utilização de
pequenas quantidades de solvente (PEREIRA, 2017).
Atualmente, existe uma demanda exponencial, por parte de indústrias de
ervas e nutracêuticas, de produtos e extratos fitoterápicos para aplicações mais
amplas e seguras em alimentos, que tenham alta qualidade e baixo custo de
24
processamento (BELWAL et al., 2018), como é o caso dos produtos obtidos por
PLE.
3.5.1 Cinética de Extração
Abaixo é apresentada uma curva global de extração para o estudo
cinético. Assim, se pode fazer um estudo melhor do comportamento das curvas.
Figura 1 – Curva global de extração
TCE – Taxa constante de extração; TDE – Taxa decrescente de extração; CD – Extração
controlada pela difusão.
Fonte: Adaptado de Nascimento (2017).
O comportamento cinético de uma extração é descrito por uma curva
global de extração (Figura 1). As curvas de extração são determinadas pela
massa total de extrato em função do tempo de extração. As curvas típicas são
divididas em três partes (MOURA, 2004; NASCIMENTO, 2017):
- Etapa da taxa constante de extração – TCE: na qual está sendo retirado
o soluto que está recobrindo a superfície externa das partículas. Esta etapa é
caracterizada pela extração do soluto de acesso fácil, aquele que recobre a
superfície externa das partículas ou daqueles liberados pelo rompimento das
paredes celulares no pré-tratamento (moagem, por exemplo). Neste período, a
transferência de massa por convecção predomina;
25
- Etapa da taxa decrescente de extração – TDE: neste período começam
a surgir falhas nas camadas de solutos que envolvem superficialmente as
partículas ou o número de células rompidas não é mais uniforme. Tanto a
convecção como a difusão são importantes nesta etapa;
- Etapa de extração controlada pela difusão – CD: na qual ocorre a retirada
do soluto que está na parte interna da partícula; nesta etapa, o soluto de acesso
livre ou o que recobria a superfície das partículas se esgotou. Assim, o processo
de extração é controlado pela difusão do solvente para o interior das partículas
e da difusão do conjunto soluto-solvente para a superfície das partículas.
3.5.2 Solventes
A natureza do solvente afeta os teores de metabólitos secundários e
atividade antioxidante dos extratos (REBEY et al., 2012; KCHAOU et al., 2013;
NGO et al., 2017). Assim, a escolha do solvente e da técnica de extração é
necessária para que a atividade farmacológica dos extratos seja a desejada.
Solventes polares são mais utilizados para extrair compostos fenólicos,
seus glicosídeos e saponinas, enquanto que os solventes apolares são usados
para extrair ácidos graxos, óleos essenciais e esteroides (DIRAR et al., 2019).
O etanol é frequentemente utilizado por ser um solvente potente e seguro
para o consumo humano, enquanto que a água é considerada um solvente de
baixo custo, não tóxico e universal (DAI; MUMPER, 2010). Segundo alguns
estudos (PRASAD et al., 2011), uma combinação de etanol com água é mais
eficaz para extração de polifenóis do que apenas o etanol, uma vez que a
extração e a separação dos mesmos dependem, em grande parte, de alta
polaridade dos solventes.
O maior problema relativo à extração com solventes orgânicos
caracteriza-se pela dificuldade de remoção total dos resíduos de solvente
presentes nos extratos. Na maioria das situações, tanto para fins sensoriais
quanto farmacológicos, o solvente residual pode ser indesejável devido à sua
toxicidade, à sua capacidade reagente ou mesmo pela interferência no sabor e
no aroma do extrato obtido (KITZBERGER, 2005; SOUZA, 2015).
As plantas medicinais possuem um importante potencial para aplicação
em fármacos e desenvolvimento de novos medicamentos na indústria
26
farmacêutica. Mas, para isso são necessárias informações técnicas de como
realizar as extrações destes compostos de interesse de forma rápida e eficiente
sem degradar os mesmos.
27
4 METODOLOGIA
4.1 Obtenção da Matéria-Prima
As três plantas (poejo, cavalinha e malva branca) desidratadas utilizadas
no presente estudo foram cedidas pela empresa Barão Comércio e Indústria de
Erva Mate LTDA da cidade de Barão de Cotegipe – RS, foram analisadas nos
experimentos o caule da cavalinha, as folhas da malva branca e a parte aérea
do poejo.
4.2 Preparo da Matéria-Prima
As amostras comerciais desidratadas foram moídas em moinho de facas
(MARCONI M 48) e peneiradas para separação das partículas de 20 – 30 mesh.
Após moídas as plantas foram acondicionadas em sacos de polietileno e
armazenadas a – 20 ºC até a extração.
4.3 Análise de Umidade
A análise de umidade foi realizada em analisador de infravermelho (Marte
ID-50) a 105°C, seguindo o manual de instruções do equipamento, onde foram
utilizadas 3 gramas da amostra moída e ajustado os parâmetros de análise no
próprio equipamento.
4.4 Extração com Líquidos Pressurizados
Os procedimentos da técnica de extração foram escolhidos se baseando
no estudo de Garcia-Mendoza et al. (2017), onde foi utilizada temperatura de
40°C, 10,4 MPa de pressão, 2 mL/min de vazão de solvente, extração estática
de 30 minutos e extração dinâmica de 180 minutos. Os solventes utilizados foram
etanol 96%, água e solução hidroalcoólica 50% (v/v).
A extração foi realizada na unidade experimental descrita na Figura 2, a
qual consiste em um banho de água, um reservatório que contém o solvente,
28
uma bomba, uma válvula de bloqueio, um manômetro, uma célula de extração,
uma válvula reguladora de pressão e um frasco coletor de extrato. A célula de
extração é encamisada, para possibilitar o controle da temperatura através do
banho de água. Depois de preencher a célula de extração com a amostra e
ajustar a temperatura do banho de água (40ºC), o experimento inicia-se com o
bombeamento do solvente, na vazão selecionada (2 mL/min), até completo
preenchimento do solvente na célula. Após, foi realizada a pressurização na
célula, até a pressão desejada (10,4 MPa) e então iniciou-se a extração estática
(30 minutos). Depois de passado esse tempo, abriu-se a válvula reguladora de
pressão e iniciou-se a extração dinâmica (180 minutos), com controle da pressão
e saída constante de extrato.
Figura 2 – Unidade experimental de extração com líquido pressurizado
FONTE: SECCO (2018).
(1) Banho de água
(2) Reservatório que contém o solvente
(3) Bomba de pressão
(4) Válvula de bloqueio
(5) Manômetro
(6) Célula de extração
(7) Válvula reguladora de pressão
29
4.5 Determinação do Rendimento Global e Cinética de Extração
O percentual de rendimento global dos extratos obtidos pela técnica PLE
foi calculado relacionando a massa total de extrato em base seca e a massa de
alimentação das plantas secas. Os frascos âmbar utilizados no
acondicionamento dos extratos foram previamente lavados, secos e pesados.
Após a extração os extratos etanólicos foram concentrados em estufa à vácuo
(Quimis, Q819v2) e os extratos aquosos e hidroalcoólicos (50%) foram
liofilizados até apresentarem peso constante.
O rendimento global (%) foi calculado pela Equação 1:
X0 =Mextrato
Minicial× 100
(1)
Onde: X0 é o rendimento global (%), Mextrato é a massa de extrato, obtida
a partir da subtração entre a massa do frasco vazio e a massa do frasco com
extrato seco e Minicial é a massa de planta seca moída adicionada na célula.
Para o estudo e construção da curva da cinética de extração (curvas
globais de extração), foram obtidos os dados de rendimento de cada alíquota de
extrato recolhida nos seguintes tempos 2, 4, 8, 12, 18, 24, 30, 40, 50, 70, 90, 120
e 180 minutos.
4.6 Determinação do Teor de Compostos Fenólicos Totais
O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo método
espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau (SINGLETON; ORTHOFER;
LAMUELA-RAVENTOS, 1999), utilizando o ácido gálico como padrão de
referência. O reativo, quando em presença de compostos fenólicos altera sua
coloração de amarela para azul.
As soluções das amostras (0,5 mL) foram misturadas com 2,5 mL do
reagente Folin-Ciocalteau (diluído 1:10 v/v) com 2,0 mL de Na2CO3 4 % (m/v) e
incubados por 2h na ausência de luz e a temperatura ambiente. Após esse
período de tempo, mediu-se a absorbância das amostras em espectrofotômetro
a 760 nm. Os resultados do teor de compostos fenólicos totais foram expressos
30
como equivalentes de ácido gálico (mg AG/g de extrato seco), calculados por
meio de uma curva padrão (Figura 3) construída com concentrações entre 0 e
0,1 mg/mL.
Figura 3 – Curva de calibração de ácido gálico.
4.7 Determinação do Teor de Flavonoides Totais
A determinação do teor de flavonoides totais foi realizada utilizando-se o
método descrito por Garrido, Ortiz e Pozo (2013). Inicialmente as alíquotas de
0,5 mL das amostras foram transferidas para tubos de ensaio e adicionados 4,3
mL de etanol a 70% (v/v), 0,1 mL de nitrato de alumínio a 10 % (m/v) e 0,1 mL
de acetato de potássio a 10% (m/v). O controle negativo (branco) foi feito
somente com etanol e nitrato de alumínio 10%.
As amostras permaneceram em repouso por 40 min na ausência de luz a
temperatura ambiente. As leituras da absorbância foram realizadas em
espectrofotômetro a 415 nm. A curva padrão (Figura 4) foi construída contendo
diluições de 10 a 200 μg/mL de quercetina. Os resultados foram expressos em
mg equivalente de quercetina por grama de extrato seco (mg QE/g extrato seco).
y = 11,941x + 0,1303R² = 0,9991
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
Ab
so
rbân
cia
(n
m)
Concentração (mg/mL)
31
Figura 4 – Curva de calibração de quercetina
4.8 Determinação da Atividade Antioxidante
A metodologia aplicada está baseada na medida da extinção da absorção
do radical 2,2-difenil-1-picril hidrazil (DPPH) em 515 nm (MIRANDA; FRAGA,
2006). A determinação da atividade antioxidante foi realizada em triplicata, por
espectrofotômetro (Pró Análise, Modelo: UV-1600).
A técnica consistiu na incubação por 10 minutos, de 2 mL de uma solução
etanólica de DPPH 0,1 mM com 2 mL de soluções contendo concentrações
crescentes de extrato em etanol. Procedeu-se da mesma forma para a
preparação da solução denominada “controle”, porém substituindo 2 mL da
amostra por 2 mL de solvente etanol. As soluções denominadas “branco” foram
preparadas usando diferentes concentrações do extrato em etanol, sem DPPH.
O percentual de captação do radical DPPH foi calculado em termos da
porcentagem de atividade antioxidante (AA %), conforme a Equação 2:
AA% = 100 −(Abs. amostra − Abs. branco) × 100
Abs. controle
(2)
Onde: AA é a porcentagem de atividade antioxidante, Abs. amostra é a
absorbância da amostra, Abs. branco é a absorbância do branco e, Abs. controle
é a absorbância do controle.
y = 0,0038x - 0,0426R² = 0,9947
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Ab
so
rbân
cia
(n
m)
Concentração (µg/mL)
32
Após a avaliação da faixa de crescimento linear, calculou-se a
concentração de extrato necessária para capturar 50% do radical livre DPPH
(IC50) por análise de regressão linear. Os resultados foram expressos pela média
aritmética dos valores em triplicata.
4.9 Determinação da Concentração Inibitória Mínima
Para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), foi utilizado o
método indireto de crescimento bacteriano, mediante a densidade ótica em meio
de cultura líquido (PIEROZAN et al., 2009), foram selecionados quatro micro-
organismos: duas bactérias Gram-positivas (Listeria monocytogenes – ATCC
7644 e Staphylococcus aureus – ATCC 25923); e duas bactérias Gram-
negativas (Escherichia coli – ATCC 25922 e Salmonella choleraesuis – ATCC
10708). As cepas foram cultivadas previamente em meio Luria Bertani (LB) (10
g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura e 5 g/L de NaCl) durante 24 h a 36
± 1 ºC em estufa bacteriológica (J. PROLAB JP 101).
O teste consistiu em microdiluições seriadas com caldo LB em
microplacas de ELISA, utilizando 150 µL de caldo LB e 150 µl de extrato. Em
seguida inoculou-se 10 μL de bactéria, efetuou-se a leitura (0 h) em leitor de
microplaca ELISA (Bio Tek Instruments EL 800) a 490 nm e incubou-se a placa
por 24 h a 36 ± 1 ºC em estufa bacteriológica. Após esse período realizou-se a
leitura (24 h) da microplaca em leitor microplaca ELISA a 490 nm e averiguou-
se a diferença da densidade da turbidez provocada pelo crescimento microbiano
após 24 h. A CIM foi definida como a menor concentração do extrato em mg/mL
capaz de inibir o crescimento microbiano.
Para as análises de atividade antioxidante, conteúdo fenólico total,
flavonoides e concentração inibitória mínima os extratos foram separados em
três tempos de extração, de 0 a 30 minutos, de 30 a 90 minutos e de 90 a 180
minutos para saber como se comportam essas análises em relação ao tempo de
extração.
33
4.10 Análise Estatística
Os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados foram
submetidos à análise estatística no software Statistica 7. Foi realizada a análise
de variância através do teste de Tukey com 5% de significância.
34
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Teor de Umidade das amostras
Na Tabela 1 são apresentados os teores de umidade das três plantas
(poejo, cavalinha e malva branca) depois de moídas.
Tabela 1 – Teor de umidade de poejo (Mentha pulegium), cavalinha (Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia)
Planta Umidade (%)
Poejo 10,1
Cavalinha 9,6
Malva Branca 11,8
De acordo com a legislação (BRASIL, 1998), a umidade de plantas não
deve ser maior que 12%, para evitar crescimento fúngico, então, todas as plantas
estão de acordo com a legislação.
5.2 Rendimentos e Curvas Globais de Extração
Na Tabela 2 são apresentados os valores de rendimento de extração das
plantas frente aos três solventes utilizados.
Tabela 2 – Rendimentos de extração de poejo (Mentha pulegium), cavalinha (Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) frente a etanol (EtOH),
solução hidroalcoólica 50% (EtOH/H2O) e água (H2O)
EtOH (%)
EtOH/H2O 50% (%)
H2O (%)
Poejo 9,18A,b ± 2,50 40,89A,a ± 4,67 35,09A,a ± 7,63
Cavalinha 4,48A,b ± 1,26 16,99B,a ± 0,56 15,69B,a ± 1,20
Malva Branca 7,04A,b ± 1,70 20,04B,a ± 1,83 19,58B,a ± 0,49
Valores expressos como média ± desvio padrão. Valores seguidos de letras distintas, maiúsculas
na coluna e minúsculas na linha, diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05).
Os extratos aquosos e hidroalcoólicos apresentaram o maior rendimento
de extração para as três plantas testadas provavelmente em função de baixa
seletividade e alta polaridade da água que extrai não apenas compostos
35
fenólicos, mas também outros metabólitos secundários polares tais como ácidos
carboxílicos de cadeia curta, taninos, saponinas e heterosídeos cardioativos
entre outros (SIMÕES et al., 2010). Segundo D’alessandro et al. (2012), para se
obter um maior rendimento de extração, é muito importante encontrar a melhor
relação de mistura de solventes.
Fatiha et al. (2015) obteve rendimento de 4,6% para poejo utilizando
maceração etanólica por 24 horas. Michielin et al. (2005) obteve 1,44% de
rendimento de extrato para cavalinha com extração supercrítica utilizando CO2
e Wang et al. (2017) obteve 11,15% de rendimento utilizando maceração com
metanol 70% por 72 horas. Benjumea et al. (2016) obteve rendimento de 3,1%
para Sida acuta utilizando soxhlet com etanol por 5 dias e Sutradhar et al. (2008)
obteve 1,81% utilizando maceração com clorofórmio por 72 horas para Sida
cordifolia. Estes resultados demonstram que o rendimento da extração depende
de vários fatores, tais como métodos de extração, tempo de extração, polaridade
do solvente utilizado, estágio de desenvolvimento da planta, época da colheita
entre outros.
A análise das curvas globais de extração é importante para avaliar como
o extrato se comporta no decorrer do tempo e suas etapas extrativas.
Na Figura 5 é apresentada a curva global de extração do poejo frente aos
três diferentes solventes.
Figura 5 – Curva global de extração de poejo (Mentha pulegium) frente a etanol, solução hidroalcoólica 50% (v/v) e água
36
Pode-se perceber que todos os solventes atingiram o rendimento máximo
após decorridos aproximadamente 120 minutos de extração, sendo que a
solução hidroalcoólica apresentou melhores resultados. Este fato pode estar
relacionado a polaridade intermediária do solvente, capaz de extrair tanto
compostos altamente polares como compostos com a polaridade intermediária.
Para a cavalinha (Figura 6), percebe-se a mesma tendência para os três
solventes. O comportamento da curva é semelhante para a solução
hidroalcoólica e a água, no entanto a taxa decrescente na água inicia primeiro.
Para o etanol o período difusional é maior, onde a extração é controlada pelo
fenômeno da difusão, em que já se esgotou o soluto de acesso livre, sendo então
mais difícil o solvente penetrar na matriz da amostra.
Figura 6 – Curva global de extração de cavalinha (Equisetum giganteum) frente a etanol, solução hidroalcoólica 50% (v/v) e água
Para malva branca (Figura 7) a taxa máxima de extração ocorre também
em 120 minutos para os três solventes estudados.
O comportamento da curva é similar para a água e a solução
hidroalcoólica onde o período crescente é maior. Já para o etanol, o
comportamento apresentou-se muito similar ao que ocorreu com as outras
plantas.
37
Figura 7 – Curva global de extração de malva branca (Sida cordifolia) frente a etanol, solução hidroalcoólica 50% (v/v) e água
5.3 Conteúdo Fenólico Total
Na Tabela 3 são apresentados os resultados de conteúdo fenólico total de
extrato seco das três plantas frente aos três diferentes solventes em diferentes
intervalos de tempos.
A amostra que obteve maior quantidade de extração de compostos
fenólicos totais foi a de poejo no tempo de 90 a 180 minutos com solvente água
(136,26 mg AG/g es). Para a cavalinha o melhor solvente também foi a água e o
melhor tempo foi de 30 a 90 minutos (99,33 mg AG/g es), não diferindo do tempo
de 90 a 180 minutos. Já para a malva branca o melhor foi a solução
hidroalcoólica 50% com tempo de 90 a 180 minutos (122,05 mg AG/g es).
Uma combinação de álcool com água é mais eficaz na extração de
polifenóis do que o álcool puro, porque a extração e a separação dos polifenóis
depende muito da polaridade dos solventes (PRASAD et al., 2011). No entanto
Antolovich et al. (2000) concluíram que não é uma tarefa fácil encontrar um
método único que seja adequado para a extração de um grupo determinado de
fenólicos devido à diversidade das estruturas químicas e variação de
sensibilidade dos compostos às condições de extração.
38
Tabela 3 - Conteúdo fenólico total de poejo (Mentha pulegium), cavalinha (Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) frente a etanol (EtOH),
solução hidroalcoólica 50% (EtOH/H2O 50%) e água (H2O)
Planta Tempo (min)
Conteúdo fenólico total (mg AG/g extrato seco)
EtOH EtOH/H2O 50% H2O
Poejo
0-30 41,97c,B ± 0,80 104,87a,B ± 0,55 90,84b,C ± 0,99
30-90 51,22c,A ± 0,59 107,17a,A ± 0,59 96,36b,B ± 1,39
90-180 43,25c,B ± 1,09 106,27b,A,B ± 0,96 136,26a,A ± 1,68
Cavalinha
0-30 92,56a,A ± 1,98 80,91b,A ± 0,26 46,21c,C ± 0,71
30-90 67,96c,B ± 1,17 75,73b,B ± 0,76 99,33a,A ± 1,16
90-180 36,76c,C ± 0,52 72,94b,C ± 0,16 95,42a,B ± 0,53
Malva Branca
0-30 34,09c,B ± 0,22 47,13b,C ± 1,79 59,23a,B ± 1,10
30-90 34,81c,A,B ± 0,66 63,39b,B ± 2,02 90,98a,A ± 0,48
90-180 37,44c,A ± 1,16 122,05a,A ± 1,78 91,98b,A ± 0,15
Valores expressos como média±desvio padrão. Valores seguidos de letras distintas, maiúsculas
na coluna e minúsculas na linha, diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05).
De acordo com a Tabela 3, pode-se observar que nos maiores tempos de
extração se tem maior conteúdo fenólico total com exceção da cavalinha com os
solventes etanol e solução hidroalcoólica 50%, que obteve maiores conteúdos
nos menores tempos. Ainda, extratos aquosos tem maiores conteúdos fenólicos
para as três espécies estudadas.
Fatiha et al. (2015) encontraram somente 6,1 mg AG/g de es de fenólicos
totais no extrato metanoico do poejo obtido por maceração. Já Hajlaoui et al.
(2009) obteve 37,4 mg AG/g no extrato seco também utilizando metanol. No
entanto, Mata et al. (2007) extraiu 71,7 mg AG/g de fenólicos totais por
maceração durante 3 horas de extração em etanol e 57,9 mg AG/g para o extrato
aquoso.
Mahato e Banerjee (2017) através de extração com Soxhlet, extraíram
para solvente metanol 0,995 mg AG/g de amostra e para água 0,348 mg AG/g
de amostra para malva branca.
Não foram encontrados dados de quantidade de fenólicos totais para
extrato de cavalinha (Equisetum giganteum).
Os extratos aquosos apresentaram alta concentração de compostos
fenólicos, provavelmente porque estes possuem alta polaridade e, portanto, são
hidrossolúveis (VIEIRA et al., 2011).
39
5.4 Conteúdo de Flavonoides Totais
A Tabela 4 apresenta o conteúdo de flavonoides totais de poejo, cavalinha
e malva branca frente aos três diferentes solventes estudados (etanol, solução
hidroalcoólica 50% (v/v) e água).
Tabela 4 – Conteúdo de flavonoides totais de poejo (Mentha pulegium), cavalinha (Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) frente a etanol (EtOH), solução hidroalcoólica 50% (EtOH/H2O 50%) e água (H2O)
Planta Tempo (min) Conteúdo de flavonoides totais (mg QE/g extrato seco)
EtOH EtOH/H2O 50% H2O
Poejo
0-30 68,45a,C ± 2,42 63,32a,B ± 0,01 65,29a,B ± 0,19
30-90 92,79a,A ± 0,01 65,68b,B ± 2,61 58,45b,C ± 2,05
90-180 79,11b,B ± 2,23 80,02b,A ± 0,19 92,92a,A ± 1,67
Cavalinha
0-30 193,45a,A ± 0,56 36,47c,B ± 1,86 47,92b,C ± 0,19
30-90 71,87a,B ± 0,56 42,79b,B ± 1,86 73,84a,A ± 0,01
90-180 25,82c,C ± 0,56 62,92a,A ± 0,56 58,84b,B ± 0,37
Malva Branca
0-30 76,47a,B ± 0,37 48,97c,C ± 0,19 52,92b,C ± 1,30
30-90 62,52b,C ± 0,74 61,87b,A ± 0,19 80,68a,A ± 1,49
90-180 147,39a,A ± 1,30 57,26c,B ± 0,01 68,97b,B ± 0,19 Valores expressos como média±desvio padrão. Valores seguidos de letras distintas, maiúsculas
na coluna e minúsculas na linha, diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05).
No que se refere aos teores de flavonoides totais, os três solventes
apresentaram a capacidade de extração semelhante, tendo as melhores
respostas para extratos etanólicos. O etanol possui polaridade menor que a da
água e pode extrair tanto compostos apolares como polares (MARTINS; LOPES;
ANDRADE, 2013). Pode-se observar que, de forma geral, foram encontrados
maiores resultados de conteúdo de flavonoides totais em maiores tempos de
extração, no entanto, a maior quantidade de flavonoides totais foi encontrada em
extratos etanólicos da cavalinha obtidos em 30 minutos de extração (193,45 mg
QE/g).
O extrato da malva branca em etanol obtido depois de 90 -180 minutos de
extração foi o segundo extrato com maior concentração de flavonoides totais
(147,39 mg QE/g). Já para o poejo o melhor resultado foi no tempo de extração
40
de foi 30-90 minutos chegando ao 92,79 mg QE/g de flavonoides totais para
etanol e de 90 a 180 minutos (92,92 mg QE/g es) para água.
Fernandes (2010) obteve 39,85 mg QE/g de flavonoides em extrato seco
para poejo (M. pulegium) obtido por maceração metanólica. Já Fatiha et al.
(2015) obteve 0,85 mg QE/g de extrato seco obtido por maceração etanólica
para a mesma planta.
Mahato e Banerjee (2017) em seus estudos obtiveram 0,726 mg QE/g
flavonoides totais em extrato seco obtido por extração em soxhlet com metanol
e 0,324 mg QE/g de extrato seco utilizando água para malva branca (S.
cordifolia).
Pallag et al. (2016) através de maceração com etanol 70% por 10 dias
obteve 0,71 mg QE/g de extrato seco de Equisetum arvense.
Como foi demonstrado, todos os valores de quantidade de flavonoides
totais foram superiores aos encontrados na literatura, o que demonstra que o
uso da técnica de extração utilizando líquidos pressurizados é eficiente para
extração de flavonoides.
5.5 Determinação da Atividade antioxidante
A Tabela 5 apresenta os resultados de IC50 para as três plantas estudadas
frente aos três diferentes solventes, divididas em intervalos de tempo de
extração.
Como pode ser observado (Tabela 5) os extratos obtidos com etanol e
solução hidroalcoólica foram os que apresentaram a maior concentração de
compostos com atividade antioxidante sendo o extrato alcoólico do poejo o mais
promissor apresentando IC50 de 0,02 mg/ml depois de 30 minutos de extração.
O IC50 está próximo do padrão sintético BHT, que de acordo com Rabelo et al.
(2014) é 0,017 mg/ml. Os extratos da cavalinha demonstraram menor
capacidade de sequestro de radical livre de DPPH em todos os solventes sendo
os extratos aquosos os que apresentaram menor atividade antioxidante, exceto
para o extrato etanólico, que apresentou IC50 próximo do poejo.
41
Tabela 5 – Resultados de IC50 de poejo (Mentha pulegium), cavalinha (Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) frente à etanol (EtOH),
solução hidroalcoólica 50% (EtOH/H2O 50%) e água (H2O)
Planta Tempo (min)
IC50 (mg/ml)
EtOH EtOH/H2O 50% H2O
Poejo
0-30 0,02 0,03 0,12
30-90 0,06 0,03 0,07
90-180 0,04 0,12 0,06
Cavalinha
0-30 0,04 0,21 0,67
30-90 0,03 0,41 0,7
90-180 0,13 0,36 0,58
Malva Branca
0-30 0,24 0,26 0,38
30-90 0,34 0,27 0,41
90-180 0,07 0,29 0,17
Segundo Rauha et al. (2000), os flavonoides são reconhecidamente
agentes antioxidantes capazes de inibir a oxidação de lipoproteínas de baixa
densidade.
No entanto, se percebe uma tendência ao se observar cada planta e cada
solvente. Os extratos aquosos apresentam melhor capacidade antioxidante nos
maiores tempos de extração, ao contrário dos extratos etanólicos com exceção
da malva branca, que obteve melhor capacidade com o maior tempo. Já os
extratos hidroalcoólicos tiveram comportamentos diferentes para cada planta;
para poejo, foi melhor e no menor tempo, já para cavalinha, a melhor capacidade
foi no menor tempo, no entanto para malva branca a capacidade antioxidante foi
praticamente a mesma.
Fernandes (2010) usou o método de maceração com agitação utilizando
solvente metanol, conseguiu um IC50 de 0,56 mg/ml para poejo. Fatiha et al.
(2015) com maceração etanólica utilizando agitação por 24 h obteve IC50 de
0,043 mg/ml para M. pulegium. Hajlaoui et al. (2009) observou que na extração
com metanol obteve 0,048 mg/ml como IC50. Dhalwal et al. (2005) encontrou
para extratos etanólicos da malva branca obtidos por maceração por 48 horas
um IC50 de 0,63 mg/ml. Para cavalinha (E. giganteum) obteve-se 0,123 mg/ml
como IC50 utilizando maceração com etanol 80% (JABEUR et al., 2017). Já
Yeganegi et al. (2018) em seus estudos, obteve um IC50 de 0,071 mg/ml para
42
extração supercrítica com CO2 e etanol, 0,096 mg/ml utilizando etanol através
de maceração e 0,425 mg/ml utilizando água para Equisetum telmateia. Como
pode-se observar, na técnica de extração utilizada, o IC50 foi melhor do que o
encontrado em dados da literatura.
43
5.6 Concentração Inibitória Mínima
Na Tabela 6 são apresentados os valores de concentração inibitória mínima de extratos de poejo, cavalinha e malva branca
frente a etanol, solução hidroalcoólica 50% e água.
Tabela 6 – Valores médios de concentração inibitória mínima de poejo (Mentha pulegium), cavalinha (Equisetum giganteum) e malva branca (Sida cordifolia) frente a etanol (EtOH), solução hidroalcoólica 50% (EtOH/H2O 50%) e água (H2O) para Escherichia
coli (E. coli), Listeria monocytogenes (L. monocytogenes), Staphylococcus aureus (S. aureus) e Salmonella choleraesuis (S. choleraesuis)
Planta Tempo (min)
CIM (mg/ml)
EtOH EtOH/H2O 50% H2O
E.
coli L.
monocytogenes S.
aureus S.
choleraesuis E.
coli L.
monocytogenes S.
aureus S.
choleraesuis E.
coli L.
monocytogenes S.
aureus S.
choleraesuis
Poejo
0-30 0,63 0,63 0,63 0,63 6,25 6,25 6,25 6,25 12,50 12,50 12,50 12,50
30-90 0,63 0,63 0,63 0,63 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25
90-180 0,63 0,63 0,63 0,63 6,25 6,25 6,25 6,25 12,50 6,25 12,50 6,25
Cavalinha
0-30 1,25 1,25 1,25 1,25 4,75 4,75 4,75 4,75 12,50 12,50 12,50 6,25
30-90 1,25 1,25 2,50 1,25 6,25 3,13 3,13 6,25 5,00 5,00 10,00 10,00
90-180 1,25 1,25 2,50 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 3,13 3,13 3,13 3,13
Malva Branca
0-30 3,50 3,50 3,50 3,50 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25
30-90 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 12,50 12,50 12,50 12,50
90-180 7,38 14,75 7,38 3,69 3,13 6,25 3,13 3,13 2,50 1,25 1,25 1,25
44
Como pode ser observado na Tabela 6, o extrato etanólico do poejo foi o
que apresentou maior atividade antimicrobiana contra as quatro bactérias
testadas seguido pelo extrato etanólico da cavalinha. Segundo Duarte et al.
(2005), inibidores bacterianos fortes possuem CIM de até 0,5 mg/ml, inibidores
moderados possuem CIM de 0,6 a 1,5 mg/ml e inibidores fracos acima de 1,6
mg/ml. Dessa forma os extratos etanólicos do poejo e da cavalinha podem ser
considerados como inibidores moderados e o extrato etanoico da malva branca
um extrato com inibição bacteriana fraca para as bactérias testadas.
De acordo com Simões et al. (2010) alguns flavonoides possuem
atividade antimicrobiana por penetrarem na membrana da bactéria e a destruir.
Então, como estes compostos estão presentes em maior quantidade nos
extratos etanólicos, os mesmos podem estar envolvidos em atividade
antimicrobiana.
Michelin et al. (2005) obteve valores maiores que 200 mg/mL para
concentração inibitória mínima de extrato de poejo contra E. coli, e para S.
aureus obteve concentração inibitória mínima de 200 mg/mL, sendo valores bem
maiores do que os obtidos nesse estudo para poejo.
Kloucek et al. (2005) obteve uma concentração inibitória mínima de 8
mg/ml para bactérias Gram-negativas e positivas com extrato hidroetanólico de
cavalinha (E. giganteum), já Alavarce (2014) obteve 16 mg/mL para S. aureus e
50 mg/mL para E. coli como concentração inibitória mínima, sendo valores
maiores do que os encontrados com extração com líquido pressurizado em todos
os tempos.
Pode-se observar que os extratos obtidos não possuem forte atividade
antimicrobiana, no entanto, extratos etanólicos de poejo e cavalinha possuem
moderada atividade antimicrobiana e todos os outros extratos possuem fraca
atividade antimicrobiana.
45
6 CONCLUSÕES
De forma geral, o etanol foi o melhor solvente para se obter extratos com
capacidade antioxidante a antimicrobiana e a solução hidroalcoólica foi melhor
na extração de compostos fenólicos e no rendimento de extração, e, para a
extração de flavonoides, a quantidade foi muito parecida para os três solventes,
mas apresentou resultados um pouco superiores nos extratos etanólicos.
Poejo apresentou melhores resultados de atividade antioxidante com
etanol e a solução hidroalcoolica 50%, para compostos fenólicos, o melhor
solvente foi a água e para extração de flavonoides e para a atividade
antimicrobiana o melhor solvente foi o etanol, sendo o melhor tempo de extração,
de 30 minutos.
Cavalinha apresentou comportamento parecido ao do poejo, sendo o
melhor solvente para extração de flavonoides, atividade antioxidante e atividade
antimicrobiana o etanol e para extração de compostos fenólicos a água. E, o
melhor tempo de extração foi também de 30 minutos.
Malva branca apresentou comportamento um pouco diferente dos demais,
sendo o melhor tempo de extração a faixa de 90 a 180 minutos e o melhor
solvente para extração de flavonoides e atividade antioxidante também o etanol,
no entanto o melhor solvente para extração de compostos fenólicos foi a solução
hidroalcoolica 50% e para atividade antimicrobiana foi a água.
Com o auxílio da cinética de extração foi possível verificar como o
rendimento de extração de comporta em relação ao tempo. É possível verificar
também o melhor tempo de extração para se obter maior quantidade de extrato.
Esse estudo contribui para a comunidade científica por ser inédita a
utilização dessa técnica nas plantas estudadas.
46
7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
➢ Realizar análise de toxicidade dos extratos obtidos;
➢ Utilizar outros solventes, com outras polaridades;
➢ Encapsular os extratos para posterior aplicação como aditivos
alimentares;
➢ Fazer um planejamento de experimentos para verificar a melhor condição
de extração para cada planta;
➢ Realizar análise de custos da técnica de Extração utilizando Líquidos
Pressurizados em relação a outros métodos convencionais
47
8 REFERÊNCIAS
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