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UNIVERSIDADE ANHANGUERA – UNIDERP
PROGRAMA DE MESTRADO PROFISSIONAL EM PRODUÇÃO
E GESTÃO AGROINDUSTRIAL
IDENTIFICAÇÃO HISTOQUÍMICA DE SAPONINAS EM FOLHAS DE Brachiaria spp. E Panicum maximum
Renato Nunes Toniasso
Médico Veterinário
CAMPO GRANDE – MATO GROSSO DO SUL 2014
UNIVERSIDADE ANHANGUERA – UNIDERP
PROGRAMA DE MESTRADO PROFISSIONAL EM PRODUÇÃO
E GESTÃO AGROINDUSTRIAL
IDENTIFICAÇÃO HISTOQUÍMICA DE SAPONINAS EM FOLHAS DE Brachiaria spp. E Panicum maximum
Renato Nunes Toniasso
Orientador: Prof. Dr. Marcos Barbosa Ferreira
Co-orientador: Prof. Dr. Wolff Camargo Marques Filho
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em nível de Mestrado Profissional em Produção e Gestão Agroindustrial da Universidade Anhanguera-Uniderp, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção e Gestão Agroindustrial.
CAMPO GRANDE – MATO GROSSO DO SUL Novembro – 2014
iii
DEDICATÓRIA
Aos meus pais e meus irmãos, pelo apoio
e incentivo em todos os momentos da
minha vida.
À Dayana, minha noiva, por toda a ajuda,
dedicação e carinho
Aos professores, técnicos, estagiários e
todos os demais que contribuíram para a
execução desta obra.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela oportunidade que me concedeu, de realizar este trabalho;
pelo incremento de ânimo, nas horas mais difíceis; pelo conforto espiritual,
quando eu achei que não conseguiria realizar o referido intento; e aos Espíritos
Superiores, por terem me atendido em todas as vezes que os invoquei nas
provações para que me iluminassem;
Aos meus pais, Renato Toniasso e Leide Celia Otoni Nunes Toniasso,
por terem lutado ao meu lado ao longo do caminho da vida, dando-me apoio no
desenvolvimento deste mestrado;
Aos meus irmãos, Eduardo Nunes Toniasso e Adriana Nunes Toniasso,
por terem contribuído com auxílio efetivo e apoio moral, reforçando a confiança
em minha capacidade perante os desafios a que me submeti durante a
realização deste trabalho;
À minha noiva, Dayana Calvis de Almeida, pelo amparo, em cada
momento dos estudos deste mestrado, pois sem a sua valorosa dedicação e
atenção esta conquista acadêmica teria sido bem mais difícil;
Aos colegas e professores do programa de mestrado, pela ajuda que me
dispensaram nos momentos decisivos, sem os quais eu não teria chegado ao
final do curso, completando mais essa etapa da minha vida - destaque especial
para o colega amigo Celso Cavalheiro, o qual sempre esteve colaborando com
seus conselhos, mesmo após o final das aulas;
Ao Prof. Dr. Marcos Barbosa Ferreira e ao Prof. Dr. Wolff Marques
Camargo Filho, respectivamente, meu orientador e co-orientador, pela
orientação prestada, confiança, apoio, amizade a mim dispensados e
necessários para a caminhada rumo à minha titulação;
À Prof.ª Dr.ª Rosemary Matias, à Prof.ª Mª Eloty Justina Dias Schleder e
à Prof.ª Dr.ª Denise Renata Pedrinho, pela disponibilidade, auxilio e
compromisso, a contribuir com o desenvolvimento e a realização da pesquisa
durante os estudos deste trabalho;
À Técnica de laboratório Sueli Marques de Mattos; à acadêmica do
curso de Ciências Biológicas Adriana Oliveira de Sousa; e aos demais
membros da rede de laboratórios da Universidade Anhanguera-Uniderp,
v
campus de Ciências Agrárias, pela contribuição na condução do experimento e
ajuda na parte técnico–prática dos estudos; e
À Universidade Anhanguera – Uniderp e à Coordenação do Programa
de Mestrado Profissional em Produção e Gestão Agroindustrial, pela
oportunidade de poder graduar-me Mestre.
vi
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................... viii
LISTA DE QUADROS.................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS...................................................................................... x
LISTA DE FIGURAS....................................................................................... xi
RESUMO GERAL.......................................................................................... xiv
ABSTRACT GERAL....................................................................................... xv
1. INTRODUÇÃO GERAL.............................................................................. 01
2. REVISÃO GERAL DE LITERATURA......................................................... 03
2.1. Brachiaria spp. e Panicum spp............................................................. 03
2.1.1. Anatomia Básica das Folhas das Poaceae.................................. 05
2.1.2. Célula Vegetal.............................................................................. 07
2.1.3. Aspectos fisiológicos das folhas................................................... 08
2.2. Os Metabólitos Secundários................................................................ 11
2.2.1. As saponinas................................................................................ 13
2.3. Brachiaria spp. e protodioscina........................................................... 18
2.4. Brachiaria spp. e fotossensibilização hepatógena................................ 19
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS........................................... 22
4. ARTIGO.... ................................................................................................ 29
RESUMO...................................................................................................... 29
ABSTRACT................................................................................................... 30
4.1. Introdução.......................................................................................... 31
4.2. Material e Métodos............................................................................ 32
4.2.1. Coleta de folhas de Brachiaria spp............................................ 32
4.2.2. Processamento Fitoquímico – Índice afrosimétrico................... 33
4.2.3. Processamento Histológico........................................................ 34
4.2.4. Processamento Histoquímico.................................................... 35
vii
4.3. Resultados e Discussão.................................................................... 36
4.4. Conclusões........................................................................................ 46
4.5. Referências Bibliográficas................................................................. 47
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
CCD – Cromatografia de camada delgada.
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência.
DELE – Detector evaporativo de luz espalhada.
RMN – Ressonância magnética nuclear.
RUBISCO – Ribulose-bisfosfato carboxilase oxigenase.
PEPcase – Fosfoenolpiruvato carboxilase.
ix
LISTA DE QUADROS Página
Quadro 1. Bateria com 10 tubos de ensaio utilizados para determinar o
índice afrosimétrico.................................................................... 34
x
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Valores do índice afrosimétrico de Brachiaria spp. e cultivares
de Panicum maximum obtidos após análise de persistência de
espuma em dez diluições diferentes............................................ 37
xi
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Fotomicrografia de corte de tecido vegetal de B. decumbens,
ilustrando os principais sistemas teciduais de uma folha. A40X.. 05
Figura 2. Ilustração esquemática de mecanismo fotossintético em plantas
C4 do tipo 2.................................................................................. 09
Figura 3. Exemplos de estrutura de uma saponina esteroidal neutra –
esqueleto básico das saponinas, espirostano e furostano........... 14
Figura 4. Vias metabólicas da biossíntese dos terpenos, mostrando as
saponinas..................................................................................... 16
Figura 5. Estrutura de um dos isômeros da protodioscina (25R- e 25S-) -
uma saponina esteroidal neutra................................................... 19
Figura 6. Mapa de canteiros de Brachiaria spp. EMBRAPA Gado de
Corte, contendo 14 espécimes com duas repetições (rep). - B.
decumbens cv. Basilisk (D62) e ecótipo D70; B. brizantha cv.
BRS Arapoty (Arapo), BRS Xaraés (Xar), BRS Piatã (Piatã),
Paiaguás (B6); B. humidicola cv. comum (H com) e BRS Tupi
(Tupi); B. ruziziensis cv. R124 (R124); P. maximus cv. Massai
(Massai), Tanzânia (Tanz.), Mombaça (Momb.) e Colonião
(Col).............................................................................................. 33
Figura 7. Ilustração representando a análise afrosimétrica realizada em
todos os espécimes avaliados. Esquerda: teste positivo para a
B.brizantha cv. BRS Paiaguás. Direita: teste negativo para
P.maximum cv. Mombaça............................................................ 36
Figura 8. Reação histoquímica para saponinas, evidenciando em
amarelo o conteúdo de saponinas nas células do mesófilo e da
bainha. A) e B) Brachiaria decumbens cv. Basiliski, AX10 e A
X40 respectivamente. C) e D) Brachiaria decumbens ecotipo
D70 AX10 e A~X50, respectivamente.......................................... 39
xii
Figura 9. Reação histoquímica para saponinas, seguida da imersão em
nitrato de prata, evidenciando desorganização celular e cristais
de saponina em vermelho, presentes na área do corte tecidual.
A) e B) Brachiaria decumbens D70 AX40 e A~X80,
respectivamente........................................................................... 39
Figura 10. Cortes histológicos de B. brizantha evidenciando o
conteúdo de saponina, em amarelo, à esquerda, e a reação
com nitrado de prata, evidenciando cristais vermelhos de
saponina. A e B: B. brizantha Marandu; C e D: B. brizantha
Xaraés. A e C X10. B~X 50 e D A~X80....................................... 40
Figura 11. Cortes histoquímicos de B. brizantha, após reação com
nitrato de prata, evidenciando cristais vermelhos de saponina
dentro de células buliformes da B. brizantha cv. Arapoti (A), e
na região da inserção de um tricoma em B. brizantha cv.
Paiaguás (B) AX40, A~X80 e A~X80, respectivamente. A figura
C ilustra a presença de precipitado vermelho marginando a
região abaxial de B. brizantha cv. Piatã. A~X60.......................... 41
Figura 12. Histoquímicas de B. ruziziensis, após reação com nitrato de
prata, evidenciando cristais vermelhos de saponina dentro de
célula buliforme (A) e, aparentemente, dentro de célula da
bainha (B) AX40 e A~X50............................................................ 42
Figura 13. Cortes histoquímicos de B. humidicola cv. Tupi, após
reação com nitrato de prata, evidenciando cristais vermelhos de
saponinas espalhados difusamente sobre o corte tecidual
AX40............................................................................................. 42
Figura 14. Cortes histológicos de Panicum maximum submetidos à
histoquímica para evidenciação de saponinas. Cultivares
colonião (A), Tanzânia (B), Mombaça (C) e Massai (D)............... 43
xiii
Figura 15 Fotomicrografia de corte histológico de Panicum maximum
cv. Massai submetido à histoquímica para evidenciação de
saponinas, com exposição posterior ao nitrato de prata
evidenciando-se imagem da nervura central contendo cristais
sugestivos de saponinas (setas). A~80X..................................... 43
Figura 16. Esquema de degradação da protodioscina em outros
metabólitos. Dentro dos círculos são evidenciadas as
moléculas de açúcares................................................................. 46
xiv
IDENTIFICAÇÃO HISTOQUÍMICA DE SAPONINAS EM
FOLHAS DE Brachiaria spp. E Panicum maximum
RESUMO: As espécies de Brachiaria são encontradas, principalmente, na
região Centro-Oeste do Brasil, constituindo fonte importante de alimento para
ruminantes a pasto. No entanto, há ocorrência de intoxicações em decorrência
da presença, nestas pastagens, da saponina protodioscina, a qual ocasiona
lesão hepática que, quando não é fatal, desencadeia processo de
hipersensibilidade à luz solar caracterizada por queimaduras de segundo grau,
que levam ao desprendimento da pele nas áreas expostas, as acometidas. O
Panicum maximum é outra espécie forrageira com cultivares presentes em todo
o Brasil. Existem relatos de que essas pastagens apresentam pequenas
quantidades de saponinas. Sabe-se que as B. decumbens são as mais tóxicas,
seguidas das B. brizantha e B. ruziziensis e, finalmente pelas B. humidicola,
praticamente isentas de saponinas. Até a realização deste trabalho não eram
conhecidas as estruturas histológicas onde as saponinas são armazenadas nas
folhas das Brachiaria spp. e de P. maximum. Assim, este estudo teve como
objetivo adaptar um protocolo histoquímico específico para saponinas e
evidenciar as células que as contêm. Foram utilizadas folhas maduras frescas
de cultivares de quatro espécies de braquiária e de quatro cultivares de P.
maximum. Além da análise histoquímica, realizaram-se testes de persistência
de espuma. Foram observados depósitos de saponinas nas células da bainha e
do mesófilo, responsáveis pelo metabolismo de carbono e a síntese de glicose;
nos tricomas; e nas células buliformes. Tais locais de observações possibilitam
sugerir que estes metabólitos secundários podem estar envolvidos no
armazenamento e transporte da glicose, até à defesa por exsudação como
ocorre na ação alelopática, corroborando com outros autores. Outros estudos
devem ser desenvolvidos para melhor se compreender a importância das
saponinas no metabolismo vegetal das Brachiaria spp. e P. maximum.
Palavras-chave: fotossensibilização hepatógena; metabólitos secundários;
histologia vegetal; protodioscina.
xv
HISTOCHEMISTRY IDENTIFICATION OF SAPONINS IN Brachiaria spp.
AND Panicum maximum LEAVES
ABSTRACT: Brachiaria spp. are important forage in tropical regions such as
Africa, Asia, Australia and South America. In Brazil they are found mainly in the
Midwest region constituting very important food for ruminants raised on pasture
source. However, there are occurrences of poisoning in these animals, due to
the presence of saponin protodioscin in these pastures causing liver damage
triggering a process of hypersensitivity to sunlight, causing death or second-
degree burns that lead to loss of skin in the area to the sun exposed. The
Panicum maximum is another forage with cultivars present throughout the Brazil
there are reports that these pastures have small amounts of saponins. The
identification and quantification of protodioscin in Brachiaria spp. leaves was
former performed and is known that B. decumbens are the most toxic, followed
by B. brizantha and B. ruziziensis and the last by B. humidicola. However is not
known which histological structures the saponins are stored in Brachiaria spp.
and P. maximum leaves. Thus, this study aimed to adapt a specific
histochemical protocol for saponins identification in Brachiaria spp. and P.
maximum leaves, pointing which are the cells that contain them. Fresh mature
leaves of cultivars from four Brachiaria species and four cultivars of Panicum
maximum were studied. Besides the histochemical analysis, there were
performed foam tests. Saponins deposits were observed in different cell
structures such as sheath cells responsible for local carbon metabolism to the
glucose synthesis and its transportation also, it was observed in excretion
structures as trichomes and in bulliform cells, which store water. The
observation sites of saponins allows suggests that it could be involved in
different mechanisms of plant metabolism, as glucose storage and
transportation, and in the plant defense being exuded as in allelopathy, as has
been previously proposed by other researchers. Further studies are being
developed to better understand the importance of saponins in plant metabolism
of Brachiaria spp. and P. maximum.
Keywords: hepatogenous photosensitivity; secondary metabolites; plant
histology; protodioscin.
1. INTRODUÇÃO GERAL
O Brasil é o maior produtor mundial de carne em sistemas de criação em
regime extensivo de pastejo, sendo que grande parte desses sistemas são
originalmente formados por vegetação do Cerrado, onde as pastagens
totalizam mais de 180 milhões de hectares (CARVALHO, 2006; IBGE, 2006).
Tais regiões são caracterizadas pela estacionalidade climática, temperaturas
elevadas e baixa fertilidade do solo (VALLE; EUCLIDES; MACEDO, 2001).
Sendo os materiais vegetais utilizados nessas áreas destinadas à
produção de forragens tropicais para alimentação animal nos dias atuais foram
obtidos por processos de introdução por centros de pesquisa e extensão
público-privados como o Instituto de Pesquisa e Experimentação Agropecuária
Norte (IPEAN) e a EMBRAPA. Dentre as forrageiras mais importantes,
destacam-se as Brachiaria brizantha e B. decumbens, esta última introduzida
no Brasil em 1952, pelo IPEAN (SEIFFERT, 1980, KISSMANN, 1997; ALVES
et al., 2000).
As Brachiaria spp. ocupam a metade da área destinada a pastagens na
região Centro-Oeste do Brasil (IBGE, 2006). Como são tolerantes a altos níveis
de alumínio, de produtividade razoável e compostas por um sistema radicular
que se adapta a solos pobres e profundos, encontram ambiente propício para
sua produção em regiões de cerrado. Associada ao exposto, a relevância da
forrageira para a economia e o manejo nutricional na pecuária nacional pode
ser observada também pelo elevado número de pesquisas e financiamentos
direcionados ao tema (SEIFFERT, 1980; KISSMANN, 1997; ALVES et al.,
2012).
Embora se trate de forrageira amplamente difundida, é relatada na
literatura a ocorrência de intoxicação em diversas espécies animais após a
ingestão de Brachiaria spp. Este distúrbio foi relacionado, recentemente, à
substância química denominada protodioscina, uma saponina esteroidal
(LEMOS et al., 1996; LEMOS et al., 1998; BARBOSA et al., 2006; BRUM et al.,
2007). Tais compostos de característica esteroidal estão presentes em maior
concentração nas folhas jovens (BARBOSA-FERREIRA et al., 2011a), parte
principal ingerida durante o pastejo, que ocasiona lesão hepática caracterizada
por colangite, entre outros que, quando não é fatal, desencadeia um processo
de hipersensibilidade à luz solar (fotossensibilização hepatógena),
2
caracterizados por queimaduras de segundo grau, que levam à perda da pele
nas áreas mais gravemente lesionadas (BRUM et al., 2007; BARBOSA-
FERREIRA et al., 2011a).
A detecção e a quantificação deste composto químico nas braquiárias
são essenciais para promover debates a cerca do tema, visando os processos
de seleção e melhoramento genético de forrageiras. Contudo, a forma de
análise laboratorial de saponinas em tecidos vegetais se mostra onerosa e
complexa por exigir equipamentos específicos e importados, disponíveis
somente em laboratórios restritos. Portanto, o presente estudo objetivou
adaptar um protocolo histoquímico específico de identificação de saponinas em
folhas de Brachiaria spp. e Panicum spp., com o intuito de caracterizar o tipo
celular que as contém predominantemente, independente de equipamentos
únicos e com baixo custo.
2. REVISÃO GERAL DE LITERATURA
2.1. Brachiaria spp. e Panicum spp.
Os gêneros Brachiaria spp e Panicum spp, ambos pertencentes à família
Poaceae, têm fornecido importantes espécies de forrageiras formadoras de
pastagens, que se adaptam às mais variadas condições culturais (SEIFFERT,
1980; KISSMANN, 1997; ALVES et al., 2012).
As braquiárias desenvolvem-se em áreas que possuem desde solos
úmidos e férteis, como a B. purpurascens, até os solos pobres de Cerrado
sujeitos a secas estacionais, como a B. decumbens (SEIFFERT, 1980; ALVES
et al., 2012). Já os P. maximum Jacq, em suas variedades ou cultivares, se
encontram presentes nas diversas regiões brasileiras (KISSMANN,1997), e em
geral possuem tolerância a solos ácidos e com boa drenagem, mas
apresentam alta exigência de fósforo (FAO, 2004; ALVES et al., 2012).
Quanto às folhas dos representantes dessas espécies, que são a parte
vegetal mais consumida pelos animais sob pastejo (EUCLIDES; MACEDO;
OLIVEIRA, 1992; SANTOS et al., 2004), tem-se em vista as seguintes
considerações:
A B. decumbens cv. Basilisk tem lâminas foliares rígidas e esparsamente
pilosas (SEIFFERT, 1980; KISSMANN, 1997; ALVES et al., 2012), de forma
linear-lanceolada, com 150-250 mm de comprimento e 20 mm de largura.
Genericamente, sua base é arredondada e o ápice acuminado, com pelos em
ambas as faces, margens espessas e em certos trechos crenuladas
(KISSMANN, 1997). Conhecidas por formar um relvado junto ao solo e,
também, pela sua capacidade de suportar considerável pressão de pastejo,
além de variações de umidade de solo, são as principais causadoras de
fotossensibilização hepatógena em ruminantes (SOUZA et al., 2010).
As B. humidicola tem suas folhas do estolão curtas e lanceoladas, com
25-120 mm de comprimento e 8-12 mm de largura (SEIFFERT, 1980;
KISSMANN, 1997; ALVES et al., 2012). As dos ramos floríferos são mais
estreitas e longas do que as dos estolões, com 70-170 mm de comprimento e
6-8 mm de largura. Já as dos ramos vegetativos são lineares, afiladas,
relativamente rígidas no ápice, de nervuras finas, com 100-300 mm de
comprimento e 5-10 mm de largura, glabras, semicoriáceas, com ápice
acuminado, às vezes ligeiramente denticulado; possuem as margens inteiras
4
ou serrilhadas (KISSMANN, 1997; ALVES et al., 2012). Tem a junção da
lâmina com a bainha na parte externa, não havendo saliência em forma de
cordão ondulado, por onde elas se destacam (SEIFFERT, 1980).
As B. brizantha possuem lâminas foliares glabras ou pilosas em forma
de canoa, linear-lanceoladas com 50 a 400 mm de comprimento e de largura 6
a 15 mm, de margens curtamente serrilhadas (SEIFFERT, 1980; KISSMANN,
1997). Segundo Kissmann (1997), os tricomas nas lâminas podem ser
inexistentes ou curtos em ambas as faces.
As B. ruziziensis tem as lâminas foliares lineares e lanceoladas,
acuminando para o ápice e atenuado para a base, com 100-200 mm ou 300
mm de comprimento e 6-15 mm de largura, com margens denticuladas e
ásperas, de nervura mediana evidente, sendo esparsamente papilhoso-pilosas
- pubescentes, verde amareladas (SEIFFERT, 1980; KISSMANN, 1997; ALVES
et al., 2012).
O P. maximum cv. Colonião, primeiro cultivar utilizado no Brasil e tido
como referência, possui bainhas muito longas, envolvendo o colmo, podendo
ser de comprimento menor, igual ou até maior que o dos entrenós. Suas
lâminas foliares são lanceoladas e acuminadas com 200-1000 mm de
comprimento por 10-35 mm de largura, planas ou de seção em V, margens
escabrosas, nervura mediana desenvolvida, coloração verde a verde-clara
sendo a nervura mais clara, pilosa e com cerosidade (KISSMANN, 1997;
ALVES et al., 2012).
O P. maximum cv. Mombaça possui folhas quebradiças ou eretas, com
largura média de 30 mm e sem serosidade; tendo poucos tricomas duros e
curtos, principalmente na superfície abaxial (VILLELA, 2009a; ALVES et al.,
2012).
O P. maximum cv. Tanzânia tem folhas menores que o cv. Colonião,
sendo decumbentes, com largura média de 26 mm, de lâminas e bainhas
glabras sem serosidade (VILLELA, 2009b; ALVES et al., 2012).
O P. maximum cv. Massai são híbridos espontâneos, suas lâminas
foliares são quebradiças e eretas, dobrando nas pontas; sem cerosidade,
apresentam média densidade de pelos curtos e duros na face adaxial, alta
densidade de pelos nas bainhas, com média de 9 mm de largura, tendo sua
5
bainha apresentada com densidade alta de pelos curtos e duros (VILLELA,
2009c; ALVES et al., 2012).
2.1.1. Anatomia básica das folhas das Poaceae
As folhas de Brachiaria spp. e P. maximum que tem apenas bainha e
limbo, denominam-se invaginantes (MENEZES; SILVA; PINNA, 2012), com
crescimento apical, como o resto da planta, apresentam crescimento
(intersticial) abaixo do seu ápice, por divisão de células de tecido meristemático
intercalar. Esses meristemas são caracterizados por terem células de paredes
delgadas com citoplasma abundante, núcleo grande e vacúolos ausentes ou
pequenos. Essas células, quando presentes, frequentemente estão em divisão
(FERRI, 1984).
Fora este conjunto, que forma o tecido meristemático, existem outros
três sistemas principais, de tecidos permanentes encontrados em todos os
órgãos das plantas forrageiras (Figura 1), sendo eles: o tecido dérmico, o
tecido fundamental e o tecido vascular ou condutor (FERRI, 1984; WILSON,
1993; TAIZ; ZEIGER, 2013).
Tecido dérmico
Tecido vascular
Tecido fundamental
Figura 1. Fotomicrografia de corte de tecido vegetal de B. decumbens,
ilustrando os principais sistemas teciduais de sua folha. A40X. (FONTE: Marcos Barbosa-Ferreira, 2014).
O tecido dérmico tem a função de revestimento e se divide em epiderme
e súber. Já o tecido fundamental, que serve de sustentação à planta, é dividido
em colênquima e esclerênquima. E o tecido vascular, de condução, divide-se
em xilema e floema (lenhoso e liberiano), organiza-se conjuntamente com o
6
tecido de preenchimento conhecido por parênquima, podendo ser composto de
diversos tipos: o assimilador; o de reserva; e o secretor, entre outros. Estes
existindo em distribuição e quantidade que atendem à necessidade da planta
(FERRI, 1984; WILSON, 1993; TAIZ; ZEIGER, 2013).
Portanto, a epiderme deve ser vista como uma camada de revestimento
do organismo primário da planta, tendo a função de proteção contra a
desidratação por transpiração e agressões de animais. Nas Poaceae ela pode
estar ligada a uma apresentação da camada de cutícula em ambas as faces da
folha. Em se tratando das forrageiras, a epiderme contém estômatos, que são
formados por células estreitas associadas a células subsidiárias. Em certas
partes da folha podem estar presentes as células silicificadas, as suberificadas,
os tricomas e as células buliformes, que auxiliam na troca gasosa, tem função
de reserva da planta, de controle de umidade, excretora e motora. (FERRI,
1984; ESAU, 1993; WILSON, 1993; TAIZ; ZEIGER, 2013).
O colênquima e o esclerênquima fazem parte de um conjunto histológico
que promove o suporte das estruturas vegetais. Nas folhas de Poaceae essas
estruturas estão frequentemente associadas ao feixe vascular e ao ápice da
lâmina (FERRI, 1984; WILSON, 1993; SILVEIRA, 2004; TAIZ; ZEIGER, 2013).
O primeiro deles é um tecido que permite as trocas metabólicas. Já o segundo
serve somente como suporte mecânico; e isso porque suas células têm
paredes espessadas e lignificadas, podendo ser encontradas densamente
agrupadas, o que lhe dá capacidade de sustentação (FERRI, 1984; PACIULLO,
2002; SILVEIRA, 2004; TAIZ; ZEIGER, 2013).
O xilema é um tecido constituído por elementos traqueários, sendo o
principal meio de transporte de seiva elaborada dentro das plantas. É formado
por parênquima lenhoso, especializado na sustentação, e tem em sua
composição células vivas e mortas. Já o floema é um tecido constituído por
elementos crivados, onde há células parenquimáticas, fibras liberianas e
escleritos, sendo condutor de seiva orgânica (FERRI, 1984; SILVEIRA, 2004).
O parênquima é um tecido de morfologia e fisiologia variáveis. Entre as
suas várias funções estão: fotossíntese, respiração, armazenagem, secreção e
excreção. Nas Poaceae vê-se o clorofiliano regular, com poucos espaços
intercelulares, como componente de suas folhas, constituindo um mesófilo
homogêneo (FERRI, 1984; BRITO, 2002; SCATENA; SCREMIN-DIAS, 2012).
7
As atividades dependentes do protoplasma têm como sede em geral as células
desse tecido (FERRI, 1984). Essas células são dispostas radialmente, ao redor
dos feixes, mas entre esses feixes e o parênquima organizam-se uma ou duas
camadas de células denominadas de bainha parenquimática e de bainha
mestomática (OLIVEIRA et al., 1973) onde se estabelece uma associação do
feixe, com o tecido esclerenquimático (WILSON, 1993). Esse arranjo é referido
como anatomia Kranz (RAVEN, 2007). Assim, é possível concluir que há maior
proporção de tecidos condutores, bainha parenquimática dos feixes vasculares
e esclerênquima no limbo foliar de espécies C4 (QUEIROZ et al., 2000).
2.1.2. Célula vegetal
As células vegetais são consideradas unidades estruturais e funcionais
das plantas e consistem, tipicamente, em uma parede celular formada por
microfibrilas de celulose imersas em uma matriz contendo polissacarídeos não
celulósicos, tais como hemicelulose e pectinas. Essas paredes tendem a ser
mais ou menos rígidas e, nelas, muitas outras substâncias orgânicas e
inorgânicas podem ser encontradas em quantidades variáveis. Entre as
substâncias orgânicas estão a lignina, proteínas e lipídeos como a suberina, a
cutina e ceras que as tornam impermeáveis.
Localizado na parte interna dessas células, o protoplasto é constituído
de citoplasma e núcleo. O citoplasma contém diferentes estruturas, dentre as
quais, as envolvidas por membranas (os plastídios e as mitocôndrias), as dos
sistemas de membranas (o retículo endoplasmático e o aparelho de Golgi) e as
estruturas não membranosas (os ribossomos, os filamentos de actina e os
microtúbulos), todas imersas no chamado citossol e com superfície delimitada
por uma simples membrana plasmática, já o núcleo possui sua própria
membrana (RAVEN, 2007; KRAUS et al., 2012).
A estrutura externa, formada pela membrana celular conhecida por
parede celular, que difere em espessura, composição e propriedades físicas
nas diferentes células, organiza-se geralmente em três camadas; mas há
alguns casos sem a terceira delas. Por exemplo, vê-se que as células tidas
como mortas são delimitadas somente pela parede secundária. Essa estrutura,
além da função de suporte, é portadora de enzimas relacionadas a vários
8
processos metabólicos e atua na defesa contra a ação de bactérias e fungos; e
pode sofrer modificações durante o crescimento e desenvolvimento das células
(KRAUS et al., 2012).
Entre as organelas citoplasmáticas, os cloroplastos tem grande destaque
por ser o local onde ocorre o processo da fotossíntese, já que contêm
pigmentos do grupo das clorofilas, além de outros pigmentos acessórios nesse
processo. Os vacúolos também merecem destaque, por terem a função de
armazenamento de substâncias orgânicas tais como os metabólitos (SANTOS,
2000; KRAUS et al., 2012).
Nas folhas, os cloroplastos são mais numerosos e diferenciados, e têm o
seu espaço intermembranoso acessível aos metabólitos do citoplasma, pois
sua membrana externa é uma barreira menos seletiva. Há também neles o
possível encontrar plastoglóbulos ou glóbulos de substâncias lipofílicas
(KRAUS et al., 2012).
A maior evidência disso está na célula da bainha Kranz, onde são
observados vários cloropastos, mitocôndrias e vacúolos, além do retículo
endoplasmático, do núcleo e do nucléolo. Também nesse sentido, observa-se
que as plantas C4 têm um retículo periférico que se estima servir para facilitar
as trocas entre organelas e o citoplasma (KRAUS et al., 2012). Ainda neles
existem as células do parênquima clorofiliano, que se organizam para
disponibilizar uma grande superfície de contato, visando facilitar a captação de
energia luminosa e demais elementos gasosos necessários para a fotossíntese
(SCATENA; DIAS, 2012).
2.1.3. Aspectos fisiológicos das folhas
As plantas de coloração verde são coletoras fundamentais de energia
solar, convertendo energia luminosa em química, que é armazenada através de
ligações formadas durante a síntese de carboidratos a partir do dióxido de
carbono (CO2) e água (H2O). A maior parte da folha em si desempenha essa
função (OLIVEIRA; SAITO, 2000; TAIZ; ZEIGER, 2013).
Nas células ocorre o encontro de diversas organelas distribuídas em três
categorias; e uma delas é a das semiautônomas de divisão independente,
composta pelos plastídeos e mitocôndrias, que atuam no metabolismo
9
energético e na reserva de substâncias. Nesse conjunto, o vacúolo, de forma e
função variáveis, destaca-se como compartimento de metabólitos secundários
envolvidos na defesa contra a herbivoria. E os cloroplastos, que contêm
clorofilas e suas moléculas associadas, e são delimitados por membranas
formadas, basicamente, por glicosilglicerídeos, são um dos sítios onde se
realiza a fotossíntese (TAIZ; ZEIGER, 2013).
Na organização do ciclo fotossintético, as Poaceae tropicais são
conhecidas por possuírem mecanismos de concentração do CO2 (Figura 2), os
quais contribuem para reduzir a fotorrespiração (processo onde se consome O2
e libera CO2 em presença de luz) e incrementam a eficiência do uso da água.
Tais mecanismos envolveram algumas adaptações morfofisiológicas, que são
conhecidas como ciclo de quatro carbonos (C4) (SOWINSKI; SZCZEPANIK;
MINCHIN, 2008).
Figura 2. Ilustração esquemática de mecanismo fotossintético em plantas C4
do tipo 2. (FONTE: Adaptado de Loureiro; Martinez, 2014).
Essas adaptações dizem respeito à disposição anatômica da folha, que
possui dois tipos de células fotossintéticas: as primeiras são as células do
parênquima clorofiliano, que circundam as segundas, conhecidas como células
da bainha. Estas, por sua vez, circundam o feixe vascular, separadas dele por
suas respectivas membranas, que formam uma barreira de difusão. Esse
sistema é conhecido como anatomia de Kranz (BERRY; PATEL, 2008; TAIZ;
ZEIGER, 2013) e garante compartimentalização das enzimas essenciais ao
funcionamento do metabolismo C4, com o fim de se minimizar a perda de
carbono. Por isso tal sistema tornou-se um dos principais mecanismos de
10
concentração de carbono, para se aproveitar de melhor forma os níveis de CO2
atmosférico livre. O transporte dos metabólitos entre as células é acionado a
partir do gradiente entre os compartimentos das mesmas; mas também ocorre
dentro das células, a exemplo de seres de célula única, como as algas verdes
(SOWINSKI; SZCZEPANIK; MINCHIN, 2008; TAIZ; ZEIGER, 2013).
Esse ciclo foi observado a partir do final da década de 1950, com a
marcação de ácidos de quatro carbonos, compostos por sais de malato e/ou
aspartato. Esse é de padrão diferente daquele observado por Calvin-Benson,
que posteriormente, ao ser mais bem elucidado, ficou conhecido também ciclo
Hatch-Slack (SOWINSKI; SZCZEPANIK; MINCHIN, 2008; TAIZ; ZEIGER,
2013). Trata-se de um aperfeiçoamento do ciclo C3, complementando-o e
aumentando a sua eficiência energética e diminuindo a perda de CO2 durante a
fotorrespiração (LEEGOOD, 2008; TAIZ; ZEIGER, 2013).
Na maioria dos casos a operação do ciclo C4 requer esforço cooperativo
das duas principais células responsáveis pelo metabolismo e transporte de
CO2, onde se tem os cloroplastos das células do mesófilo, que são arranjados
aleatoriamente com tilacóides empilhados, com a grana bem desenvolvida. Já
os cloroplastos das células da bainha vascular são arranjados de forma
concêntrica, com as membranas dos tilacóides não empilhados, com grana
pouco desenvolvida ou ausente. Além disso, quando a fotossíntese está
ocorrendo, os cloroplastos da bainha vascular geralmente formam grãos de
amido maiores e mais numerosos do que os cloroplastos das células do
mesófilo. Desses arranjos fixa-se uma das diferenças, entre outras que as
caracterizam, enfim com relação à composição enzimática entre elas, tem-se a
presença da PEPcase no mesófilo, e de RUBISCO nas células da bainha
(RAVEN, 2007; SOWINSKI; SZCZEPANIK; MINCHIN, 2008; TAIZ; ZEIGER,
2013).
O transporte intermembranas entre essas células é facilitado pela
quantidade e qualidade dos plasmodesmos presentes, que as conectam
gerando uma concentração muito mais elevada de CO2 nas células da bainha
do feixe vascular, o sítio da carboxilação, do que nas do mesófilo, reprimindo
assim, a fotorrespiração no sistema (SOWINSKI; SZCZEPANIK; MINCHIN,
2008; TAIZ; ZEIGER, 2013). Enfim, o ciclo C4 concentra CO2 nos cloroplastos
das células da bainha do feixe, onde ocorre o acúmulo predominante do amido,
11
que é o produto transitório da fotossíntese. Atualmente sabe-se que o ciclo C4
ocorre em 18 famílias vegetais, com proeminência em Poaceae (TAIZ;
ZEIGER, 2013).
2.2. Os Metabólitos secundários
São produtos do processo fisiológico, restritos em sua distribuição, tanto
dentro da planta quanto entre as diferentes espécies vegetais. Têm importância
para a sobrevivência e a propagação das plantas que os produzem. Muitos
deles acabam funcionando como sinalizadores químicos, o que permite a
essas plantas responderem aos estímulos do ambiente. Em situações de
estresse eles atuam como instrumento de defesa das mesmas, protegendo-as
contra ação de herbívoros, patógenos ou competidores dentro do ecossistema
(GOTTLIEB; KAPLAN; BORIN, 1996; RAVEN, 2007).
Existem metabólitos secundários com as funções de ferormônios como,
dentre os pigmentos, as antocianinas; e de sustentação estrutural das plantas,
como a lignina. Esses metabólitos podem ter papéis não reconhecidos
diretamente sobre processos como a fotossíntese, a respiração, o transporte
de solutos, a translocação e síntese de proteínas, a assimilação de nutrientes e
a diferenciação ou síntese de carboidratos e lipídeos. Os metabólitos são
específicos às suas funções e costumam estar restritos a uma espécie ou a um
grupo de espécies relacionadas (TAIZ; ZEIGER, 2013). Por isso são tidos
como indicadores funcionais de adaptação de seus produtores ao seu meio,
conforme disse em Santos (2000).
Os metabólitos secundários exercem importante função de defesa nas
plantas uma vez que, através das suas estruturas físicas e composição
química, eles diminuem a fragilidade defensiva das mesmas, em especial pela
imobilidade física, o que as expõem às pressões ambientais desencadeadas,
por exemplo, pelo ataque de animais (CARVALHO et al., 2003).
Qualquer tecido ou célula vegetal tem a capacidade de biossintetizar
metabólitos secundários. Porém, essa capacidade é maior em alguns tecidos
ou mesmo em células especiais, em função do grau de diferenciação e
desenvolvimento dos mesmos (SANTOS, 2000). Além disso, há indícios de que
o nível de concentração desses metabolitos é controlado geneticamente, e de
12
que a concentração é acentuadamente variável em função de condições
ambientais próprias. Os fatores ambientais mais importantes para a expressão
dessas concentrações nas plantas são: a luz, a água, a latitude, a temperatura,
as propriedades químicas e físicas do solo, os ventos, os macro e os
micronutrientes (PALEVITCH, 1987; FARIAS, 2000).
Mesmo diante da probabilidade de alguns desses metabólitos não serem
essenciais ao organismo que os produz, em geral eles possuem alguma função
específica no funcionamento desse organismo (GROS et al., 1985). Assim, é
de se considerar que em alguns casos a produção deles pode estar restrita a
um estágio específico do desenvolvimento vegetal e ou sujeita a determinadas
condições ecológicas ou ambientais, uma vez que essa produção resulta de
uma complexa interação entre fatores como a biossíntese, o transporte, a
estocagem e degradação Em várias espécies esse processo biossintético tem
o local de processamento restrito a um órgão vegetal, enquanto que os seus
produtos são acumulados em toda planta ou em órgãos diferentes, devido a um
sistema de transporte intercelular. Por força disso, os metabólitos hidrofílicos
tendem a ser armazenados nos vacúolos e os lipofílicos se acumulam em
ductos de células mortas ou ligam-se aos componentes como membranas,
ceras cuticulares e lignina (SANTOS, 2000).
O estudo dos metabólitos secundários iniciou-se no final do século XIX,
movido pela percepção da importância que eles poderiam adquirir como drogas
medicinais, venenos (toxinas), aromatizantes e outros insumos industriais
(TAIZ; ZEIGER, 2013). Diante da grande diversidade desses compostos, se
acentuou o interesse de pesquisadores, em diversos campos da ciência, que
os veem como fonte promissora de novas moléculas potencialmente úteis ao
homem (SANTOS, 2000). Atualmente esses metabólitos são importantes para
a agricultura, pelas suas funções ecológicas, mas não se pode ignorar que eles
podem tornar as plantas que os produzem impróprias para o consumo humano
e animal (TAIZ; ZEIGER, 2013).
Os metabólitos secundários são divididos em três grupos principais: os
terpenos, os compostos fenólicos e os compostos nitrogenados. Dentro do
grupo dos terpenos, que são tóxicos e agem na defesa dos vegetais, têm-se as
saponinas (TAIZ; ZEIGER, 2013).
13
2.2.1. As saponinas
As saponinas formam um grupo particular de heterosídeos e se dividem
em esteroides e triterpenoides (terpenos policíclicos), de acordo com a
estrutura e propriedades do núcleo molecular que as compõem. Possuem
estrutura alilifática, parte com caráter lipofílico - as geninas, e parte hidrofílica -
os glicídeos, composto esse que tem a propriedade de redução da tensão
superficial da água, o que promove suas funções detergentes e emulsificantes.
Em soluções aquosas (coloidal), formam espuma persistente e abundante por
agitação; mas esse processo pode ser inibido por álcool anidro, éter,
clorofórmio e lectinas. Entretanto, por se diferenciarem dos sabões comuns,
pelo fato de se manterem estáveis diante da ação de ácidos minerais diluídos,
adquiriram essa denominação (BRUNETON,1991; SCHENKEL; GOSMANN;
ATHAYDE, 2000; COSTA, 2002; PERES, 2004; OLIVEIRA, 2011; TAIZ e
ZEIGER, 2013).
São classificadas também em ácidas, básicas ou neutras. As ácidas tem
a participação do agrupamento carboxila na aglicona ou na cadeia glicídica (ex.
ácidos glicurônico e galacturônico) ou em ambas. As básicas distinguem-se
pela presença de nitrogênio sob a forma de amina secundária ou terciária. As
neutras não apresentam esses agrupamentos. Classificam-se ainda pelo
número da cadeia glicídica, como monodesmosídicas ou bidesmosídicas; e
essa diferenciação é relevante pois as atividades biológicas relatadas não são
as mesmas entre essas formas. No entanto, como características gerais, as
saponinas são substâncias sólidas ou amorfas em estado líquido, brancas ou
amareladas, mas poucas são cristalinas, incolores, porém todas são inodoras e
de sabor amargo (SCHENKEL; GOSMANN; ATHAYDE, 2000; COSTA, 2002).
As saponinas são misturas complexas, pois na sua estruturação entra
um número variado de açúcares (glicosídeos), com diversidade de agliconas
(sapogeninas), o que dificulta a sua elucidação estrutural e isolamento. Para tal
elucidação podem se usados diversos tipos de processos cromatográficos. Mas
para isso é necessário se ter a substância pura – saponina. Para purificá-la
usam-se métodos de derivatização, como acetilação, metilação e benzoilação.
Elas também podem ser identificadas através de hidrólise seguida de análises
14
espectroscópicas. Portanto, há um tipo de saponinas (triterpênicas) que são
derivadas biogeneticamente do metabolismo de acetato e que são ativadas via
ácido mevalônico ou mevalonato. O nível atual de saber sobre as saponinas se
deve a conhecimentos químicos e biológicos recentes, adquiridos com a
evolução das técnicas cromatográficas e espectográficas (HOSTETTMANN;
MARSTON, 1995; SANTOS, 2000; SCHENKEL; GOSMANN; ATHAYDE, 2000;
COSTA, 2001; COSTA, 2002; PERES, 2004; TAIZ e ZEIGER, 2013).
Quanto à variação estrutural, partindo de suas agliconas, têm-se as
saponinas esteroidais neutras, que apresentam duas estruturas básicas, a
saber: o espirostano e o furostano, ambos apresentados na Figura 3. As
esteroidais neutras do tipo furostano são conhecidas como pseudo-saponinas.
As esteroidais básicas apresentam o espirosolano e o solanidano (SCHENKEL;
GOSMANN; ATHAYDE, 2000; COSTA, 2002). As saponinas encontradas com
mais frequência possuem núcleo triterpênico, mas tem origem esteroidal, uma
vez que, de acordo com o rearranjo, os seus anéis podem ser tetra ou
pentacíclicos. Elas se apresentam como oleanos (beta-amirina), ursanos (alfa-
amirina) e lupeol ou lupanos (ABE, ROHMER, PRESTWICH, 1993;
SCHENKEL; GOSMANN; ATHAYDE, 2000; COSTA, 2002).
Figura 3. Exemplos de estrutura de saponina esteroidal neutra – esqueleto básico das saponinas, espirostano e furostano. (FONTE: Schenkel;
Gosmann; Athayde, 2000, p.601).
15
As saponinas são estudadas com base nas suas propriedades físico-
químicas e biológicas - que podem variar em termos de presença e de
intensidade. Exemplos disso são a solubilidade em água e a complexação com
proteínas, fosfolipídeos e esteroides de membrana, que promove ação
hemolítica, ictiotóxica, moluscicida, antifúngica, inseticida, espermicida e anti-
helmíntica - esta capaz de produzir irritação da mucosa (JENTSCH; SIEGL;
FUCHS, 1961; COSTA, 2002; PERES, 2004; TAIZ; ZIEGER, 2013). Tem-se
ainda a complexação com colesterol (colesterina) sérico, que, através de ação
hipocolesterolminante, forma combinações insolúveis e promove o aumento de
excreção do colesterol, principalmente quando as saponinas são administradas
pela via oral. Nesse caso há a eliminação dos ácidos biliares, o que acelera o
consumo metabólico do colesterol. Por fim, é possível a complexação de
saponinas com o colesterol das membranas das células intestinais, o que
produz esfoliação (JOHNSON et al, 1986; CHEEKE, 1996; COSTA, 2002;
TAIZ; ZEIGER, 2013). A eficiência dessas complexações depende diretamente
da natureza da sapogenina que compõe a molécula da saponina considerada,
e como a cadeia glicídica, fator que modifica os valores quantitativos de tais
concentrações (COSTA, 2002).
As saponinas são frequentes e com distribuição ampla e diferenciada no
reino vegetal, produzidas durante o metabolismo secundário (Figura 4). E
dentre elas, as esteroidais neutras que se encontram quase que
exclusivamente em monocotiledôneas e raramente em eudicotiledôneas. Já as
triterpênicas são predominantemente encontradas nas eudicotiledôneas
(BRUNETON, 1991; SCHENKEL; GOSMANN; ATHAYDE, 2000; COSTA,
2002; OLIVEIRA, 2011).
16
Figura 4. Vias metabólicas da biossíntese dos terpenos, mostrando as
saponinas.( FONTE: Santos, 2000, p.430).
As saponinas são substâncias polares solúveis em meio aquoso e pouco
solúveis ou insolúveis em meio que contenha solventes apolares tais como o
clorofórmio e o benzeno. Por isso, para extraí-las, sopesadas as vantagens e
desvantagens entre a utilização de meio aquoso e a de solventes apolares, a
literatura consultada sugere a utilização de misturas hidroalcoólicas. Contudo,
17
dependendo-se da utilização da hidrólise do extrato bruto, com ou sem o
processo vagaroso de isolamento dos componentes individuais da solução
(com seria melhor), a análise cromatrográfica é a forma mais adequada de
identificação e detalhamento dos componentes do extrato vegetal, inclusive as
saponinas Porém, se a intenção for apenas identificar a presença de
saponinas, isso pode ser feito por hidrotermólise e arrefecimento, com posterior
agitação, onde a existência desses metabólitos será indicada pela formação
abundante e persistente de espuma (HOSTETTMANN; MARSTON, 1995;
COSTA, 2002).
A identificação das saponinas nos tecidos vegetais pode ser feita através
de testes qualitativos ou quantitativos, tais como reações fitoquímicas ou
histoquímicas com ácidos minerais (ácido sulfúrico), aldeídos aromáticos ou
sais metálicos, nos quais elas adquirem coloração específica. A quantificação
se torna possível através de testes com o decoto vegetal, pela conjugação do
índice afrosimétrico ou do de hemólise, com análise cromatográfica de camada
delgada (CCD), esta especialmente útil para a diferenciação das saponinas em
relação a outras substâncias hemolíticas, quando realizada juntamente com
testes qualitativos. Na atualidade, a análise quantitativa é feita através de
métodos fotométricos como a densitometria e a colorimetria de produtos
derivatizados, sendo que destes, o mais utilizado é a cromatrografia líquida de
alta eficiência (CLAE). Apesar de se dispor dos métodos espectrofotométricos,
eles não são recomendados para quantificação das saponinas não totalmente
purificadas, pois produzem reações não específicas através das quais outros
produtos são formados a partir de reações com compostos como os
flavonoides e fitosteróis, o que pode mascarar o resultado. Outro método que
exige cuidados é o do uso de radiação ultravioleta. Nele a dificuldade está na
necessidade de se utilizar essa radiação em baixos comprimentos de onda
(203 a 210 nm), sob pena de surgirem problemas como a interferência dos
eluentes na análise. Porém, ele é viável com o uso correto de solventes de alto
grau de pureza (SCHENKEL; GOSMANN; ATHAYDE, 2000; COSTA, 2002).
O interesse farmacêutico das saponinas reside na possível utilização
como adjuvante em formulações diversas, onde funcionam como componente
ativo de drogas vegetais, a exemplo da formação de matéria-prima para a
síntese de esteroides (SCHENKEL; GOSMANN; ATHAYDE, 2000; PERES,
18
2004). Elas potencializam as ações anti-inflamatória, expectorante e diurética
de drogas com tais propriedades. Há ainda as que promovem a absorção de
componentes químicos aos quais estejam associadas e a ação de resposta
imunológica (SCHENKEL; GOSMANN; ATHAYDE, 2000). Por fim, através da
hecogenina e da diosgenina elas pode se tornar hormônios, o que possibilitou a
produção de anticoncepcionais e causou grande mudança no comportamento
da sociedade atual (COSTA, 2002; DJERASSI apud PERES, 2004).
2.3. Brachiaria spp. e protodioscina
As Brachiaria são importante fonte de forrageiras em regiões tropicais da
África, Ásia, Austrália e América do Sul (FERRAZ, 2003). No Brasil elas são
mais encontradas na região Centro-Oeste e constituem fonte importante de
alimento para ruminantes em pastejo (EUCLIDES et al, 2010) Assim, pondo
que existem mais de 172 milhões de hectares de pastagens que desses
aproximadamente 95 milhões hectares são cultivados com espécies do gênero:
Brachiaria brizantha (60 milhões de ha); Brachiaria decumbens (25 milhões de
ha); Brachiaria humidícola e outras (10milhões de ha), vista isso há clara
importância dessa espécie para pecuária nacional (IBGE, 2006).
Porém, nessas espécies, foram identificadas saponinas; mais
especificamente a protodioscina, com seus isômeros 25R e 25S, cujos arranjos
estruturais já são conhecidos (Figura 5). Essa variante é classificada como
esteroidal neutra do tipo furostano e já foi isolada de folhas de Brachiaria
decumbens (HARAGUCHI et al., 2003).
19
Figura 5. Estrutura de um dos isômeros da protodioscina (25R- e 25S-) - uma saponina esteroidal neutra. (FONTE: NUTRIMAX, 2014)
Em estudo de um surto de fotodermite ou fotossensibilização ocorrido
em ovinos mantidos em piquete com Brachiaria decumbens em uma fazenda
de Mato Grosso do Sul constatou-se a existência de 2,36% de protodioscina no
substrato vegetal, enquanto num piquete vizinho de cerca, onde os animais não
tinham sido afetados pela doença, encontrou-se o índice de 1,63% da referida
substância, o que demonstra que o teor de protodioscina é fator determinante
para a formação de um quadro de intoxicação (BRUM et al., 2007).
A identificação e quantificação de saponinas nas folhas de diferentes
espécies e cultivares de Brachiaria foi estabelecida recentemente por Barbosa-
Ferreira et al. (2011b). Esse estudo constatou serem as B. decumbens as que
possuem maiores concentrações de protodioscina ao longo do ano (24,8 g/kg,
± 0,9), seguidas das B. brizantha (10,9 g/Kg, ± 0,9), B. ruziziensis (7,8 g/Kg, ±
0,6) e das menos tóxicas, as B. humidicola (1,2 g/Kg, ± 0,04). No caso das B.
decumbens, o valor máximo observado foi de 33,6 g/Kg. Essas identificações
são dependentes de aparelho de CLAE acoplado a um detector evaporativo de
luz espalhada (ELSD).
2.4. Brachiaria spp. e fotossensibilização hepatógena
O termo fotossensibilização refere-se à sensibilidade exagerada da pele
à luz solar; e o fenômeno é induzido pela presença de um agente fotodinâmico,
ocorrendo principalmente em áreas de pele despigmentada ou desprotegida de
Açúcar (es)
Açúcar (es)
20
pelo ou lã dos animais. O aparecimento das lesões é muito rápido (YAGER;
SCOTT, 1993; TOKARNIA et al., 2000; CULLEN, 2009).
A fotossensibilização é classificada de acordo com a origem do agente
fotodinâmico envolvido. Pode ser: primária, quando o agente é adquirido pré-
formado; porfírica, congênita ou tipo II, na qual o agente é formado durante a
síntese de pigmentos endógenos aberrantes; e hepatógena ou tipo III, que é
secundária a um dano hepático que causa perturbações no mecanismo de
eliminação da filoeritrina (CLARE, 1952; HARGIS; GINN, 2009). O tipo de
fotossensibilização mais observado em bovinos é a hepatógena, sendo que os
principais agentes envolvidos nos casos espontâneos descritos no Brasil são
plantas tóxicas e algumas micotoxinas (TOKARNIA et al., 2000).
Três espécies de Brachiaria spp - decumbens, brizantha e humidícola,
em especial a primeira, são descritas como causadoras de fotossensibilização
hepatógena em bovinos, ovinos e caprinos (OPASINA, 1985; GRAYDON et al.,
1991; SMITH; MILES, 1993; MEAGHER et al., 1996; LEMOS; PURISCO, 2002;
SOUZA et al, 2010).
Casos de fotossensibilização no Brasil foram observados em bovinos
mantidos em pastagens formadas com B. decumbens cv. Basilisk (ou
braquiária australiana), sendo descritos pela primeira vez em 1975 (CAMARGO
et al., 1976; NOBRE; ANDRADE, 1976). A enfermidade tem sido relatada em
bovinos, ovinos, caprinos e equinos mantidos em pastagens de Brachiaria spp.
(LEMOS et al., 1996; LEMOS; SALVADOR; NAKAZATO, 1997; LEMOS et al.,
1998; SEITZ et al., 2004; BRUM et al., 2007; BARBOSA et al., 2006; SILVEIRA
et al., 2009; ALBERNAZ et al., 2010; CASTRO et al., 2011).
Inicialmente a doença foi atribuída à presença do fungo Pithomyces
chartarum, produtor da toxina esporidesmina (DÖBEREINER et al., 1976;
TOKARNIA et al., 1979; FAGLIARI et al., 1990; FIORAVANTI, 1999), mas
alterações histológicas de colangiohepatopatia associada a cristais, causadas
pela presença de saponinas esteroidais, semelhantes às encontradas nas
intoxicações por Panicum spp (HOLLAND et al., 1991), Narthecium ossifragum
(CEH; HAUGE, 1981), Agave lecheguilla (CAMP et al., 1988) e Tribulus
terrestris (GLASTONBURY et al., 1984) têm sido observadas em animais que
desenvolvem fotossensibilização em pastagens de Brachiaria spp. (LEMOS et
al., 1996; LEMOS et al., 1997; LEMOS et al., 1998; BRUM et al., 2007).
21
Cruz et al. (2001) conseguiram reproduzir a colangiohepatopatia em
ovinos, pela administração de extratos fracionados de B. decumbens. A
intoxicação por essa gramínea também tem sido reproduzida em experimentos
com ovinos a campo e confinados. Nestes experimentos as contagens de
esporos de P. chartarum estavam nulas ou abaixo de 5.000 por grama de pasto
(CRUZ et al., 2001; SATURNINO et al., 2010).
Além desses importantes avanços, não se conhecem as estruturas
foliares nas quais a protodioscina está armazenada na Brachiaria spp. Tal
conhecimento pode servir de base para melhor compreensão do papel das
saponinas na forrageira, bem como pode lançar novas luzes no conhecimento
atual da fisiologia destes metabólitos secundários nas forrageiras mais
utilizadas no Brasil como pastagens, fornecendo subsídios para a seleção de
novos cultivares menos tóxicas.
Portanto, o presente trabalho teve como objetivo principal a identificação
de saponinas nas folhas de Brachiaria spp. e em cultivares de Panicum
maximum, bem como a descrição das estruturas histológicas que as contém.
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS
ABE, I.; ROHMER, M.; PRESTWICH, G. D. Enzymatic cyclization of squalene and oxidosqualene to sterols and triterpenes. Chemical Reviews, v. 93, p. 2189-2206, 1993. ALBERNAZ, T. T.; SILVEIRA, J. A. S.; SILVA, N. S.; OLIVEIRA, C. M. C.; DUARTE, M. D.; BARBOSA, J D. Fotossensibilização em ovinos associada à ingestão de Brachiaria brizantha no estado do Pará. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 30, n. 9, p. 741-748, 2010. ALVES, S. J.; MORAES, A.; CANTO, M. W.; SANDINI, I.; EMBRAPA. Espécies forrageiras recomendadas para produção animal. 2000, p.4-23. Disponível em: http://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/zootecnia/ANACLAUDIARUGGIERI/especies_forrageiras.pdf. Acesso em: 01 ago. 2014. BARBOSA, J. D.; OLIVEIRA, C. M. C.; TOKARNIA, C. H.; PEIXOTO, P. V. Fotossensibilização hepatógena em equinos pela ingestão de Brachiaria humicola (Gramineae) no estado do Pará. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 26, n. 3, p. 147-153, 2006. BARBOSA-FERREIRA, M., BRUM, K. B. B., OLIVEIRA, N. M. R., VALLE, C.B., FERREIRA, V. B. N, GARCEZ, W. S., RIET-CORREA, F.; LEMOS, R. A. A. Antinutritional factors in plants steroidal saponin (Protodioscin) in Brachiaria spp. preliminary data. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL SOBRE MELHORAMENTO DE FORRAGEIRAS, 3. 2011b, Bonito. Procedings... Bonito: EMBRAPA, 2011b. p. 322-332. BARBOSA-FERREIRA, M.; BRUM, K. B.; FERNANDES, C. E.; MARTINS, C. F.; PINTO, G. S.; CASTRO, V. S.; REZENDE, K. G.; RIET-CORREA, F., HARAGUCHI, M., JUNIOR, H. L. W.; LEMOS, R. A. A. Variations of saponin concentration in Brachiaria brizantha leaves as a function of maturation: preliminary data. In: RIET-CORREA, F.; PFISTER, J.; SCHILD, A. L. & WIERENGA, T. (eds.). Poisoning by plants, mycotoxins and related Toxins. Cambridge: CAB International, 2011a. p. 118-123. BERRY, J. O; PATEL, M. Kranz Anatomy and the C4 Pathway. Chichester: eLS, John Wiley & Sons Ltd, 2008. Disponível em: <http://www.els.net [doi: 10.1002/9780470015902.a0001295.pub2]>. Acesso em: 27 ago. 2014. BRITO, C. J. F. A.; RODELLA, R. A. Caracterização morfo-anatômica da folha e do caule de Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) Stapf e B. humidicola (Rendle) Schweick. (Poaceae) Revista Brasileira de Botânica, v. 25, n. 2, p. 221-228, 2002. BRUM, K. B.; HARAGUCHI, M.; LEMOS, R. A. A.; FIORAVANTI, M. C. S. Crystal-associated cholangiopathy in sheep grazing Brachiaria decumbens containing the saponin protodioscin. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 27, n. 1, p. 39-42, 2007. BRUNETON, J. Elementos de Fitoquímica y de farmacognosia. Isla de Mallorca - Zaragoza: Editorial Acribia, 1991, p. 189-213. CAMARGO, W. V. A.; NAZARIO, W.; FERNÁNDEZ, N. S.; AMARAL., R. E. M. Fotossensibilização em bovinos de corte. Provável participação do fungo Pithomyces chartarum, na etiologia do processo. Biológico, v. 42, n. 5, p. 249-261, 1976.
23
CAMP, B. J.; BRIDGES, C. H.; HILL, D. W.; PATAMALAI, B. e WILSON, S. Isolation of steroidal. sapogenin from the bile of a sheep fed Agave lecheguilla. Veterinary and Human Toxicology, v. 30, n. 6, p. 533-535, 1988. CARVALHO, L. M.; CASALI, V. W. D.; SOUZA, M. A.; CECON, P. R. Disponibilidade de água no solo e crescimento de artemísia. Horticultura brasileira. Brasília, v. 21, n. 4, p. 726-730, 2003. CARVALHO, P. C. F. Country pastures / forage resource profile – Brazil part. II and I review. 2006. Disponível em: Agriculture sector – Brazil. Countries – Food and Agriculture Organization of the United Nations – FAO. Disponível em: <http://www.fao.org/ag/AGP/AGPC/doc/Counprof/Brazil/brazil.htm#1.int>. Acesso em: 22 mar. 2014. CASTRO, M. B.; SANTOS JR, H. L.; MUSTAFA, V. S.; GRACINDO, C. V.; MOSCARDINI, A. C. R.; LOUVANDINI, H.; PALUDO, G. R.; BORGES, J. R. J.; HARAGUCHI, M.; FERREIRA, M. B.; RIET-CORREA, F. Brachiaria spp. poisoning in sheep in Brazil: Experimental. and epidemiological findings. In: RIET-CORREA, F.; PFISTER, J.; SCHILD, A. L. e WIERENGA, T. (eds.) Poisoning by plants, mycotoxins and related Toxins. Cambridge: CAB International, 2011, p. 110-117. CEH, L.; HAUGE, J. G. Alveld – producing saponins. I. Chemical studies. Acta Veterinary Scandinavica, v. 22, p. 391-402, 1981. CHEEKE, P. R. Biological effect of feed and forage saponins and their impacts on animal production. In: WALLER, G. R.; YAMASAKI, K. (ed.). Saponins used in food and agriculture, 1996, New York: Plenum, p. 47-56. CLARE, N. T. Photosensitization in Diseases of Domestic Animals. In: Ruakura Animal Research Station, Department of Agriculture, Hamilton, New Zealand, 1952 p. 58. COSTA, A. F. Fármacos com saponósidos. In:______ (Ed). Farmacognosia: volume III - Farmacognosia Experimental. 3. ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2001, p. 707-709. COSTA, A. F. Fármacos com saponósidos. In:______(Ed). Farmacognosia: volume II. 5. ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2002, pp. 338-370. CRUZ, C.; DRIEMEIER, D.; PIRES, V. S.; SCHENKEL, E. P. Experimentally induced Cholangiohepatopathy by dosing sheep with fractionated extracts from Brachiaria decumbens. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v. 13, p. 170-172, 2001. CULLEN, J. M. Fígado, Sistema Biliar e Pâncreas Exócrino. In: MCGAVIN, M. D.; ZACHARY, J. F. (edts); tradução: FERNANDES, P. D. et al. Bases da patologia em veterinária, 4ª ed., Rio de Janeiro: Elsevier, 2009 p. 825-830. DÖBEREINER, J.; TOKARNIA, C. H.; MONTEIRO, M. C. C.; CRUZ, L. C. H.; CARVALHO, E. G.; PRIMO, A. T. Intoxicação de bovinos e ovinos em pastos de Brachiaria decumbens contaminados por Pithomyces chartarum. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 11, p. 87-94, 1976. ESAU, K. A folha: variações da estrutura – folhas das monocotiledôneas – folha das Poaceae. In:______(Ed). Anatomia das plantas com sementes. São Paulo: Editora Edgard Blücher, 1993, p. 223-225. EUCLIDES, V. P. B.; MACEDO, M. C. M.; OLIVEIRA, M. P. Avaliação de diferentes métodos de amostragem sob pastejo. Revista Brasileira de Zootecnia, v.21, n.4, p.691-702, 1992. EUCLIDES, V. P. B.; VALLE, C. B.; MACEDO, M. C. M.; ALMEIDA, R. G.; MONTAGNER, D. P.; BARBOSA, R. A. Progresso científico em pastagem na
24
primeira década do século XXI. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 39, p. 151-168, 2010. FAO. Panicum maximum Jacq. Grassland index, 2004. Disponível em: http://www.fao.org/ag/agp/AGPC/doc/gbase/data/Pf000278.HTM. Acesso em: 21 ago. 2014. FERRAZ, F. M. Pastagens garantem o futuro da agropecuária brasileira. In: ANUALPEC, 2003. Anuário da Pecuária Brasileira, 10ª ed. São Paulo: FNP Consultoria e Agroinformativos, 2003 p. 55-56. FERRI, M. G. Botânica: morfologia interna das plantas (anatomia). 9. ed., São Paulo: Nobel,1984, p.54-83. FIORAVANTI, M. C. S. Incidência, avaliações clínica, laboratorial. e anatomopatológica da intoxicação subclínica por esporidesmina em bovinos. 1999. 256f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista. Botucatu 1999. GLASTONBURY, J. R. W.; DOUGHTY, F. R.; WHITAKER, S. J.; SERGEANT, E. A syndrome of hepatogenous photosensitization, resembling geldikkop, in sheep grazing Tribulus terrestris. Australian Veterinary Journal, v. 61, n. 10, p. 314-316, 1984. GOTTLIBEB, O. R.; KAPLAN, M. A. C.; BORIN, M. R. M. B. Biodiversidade: um enfoque químico-biológico. Rio de Janeiro - RJ: UFRJ, 1996 p. 268. GRAYDON, R. J.; HAMID, H.; ZAHA, R. I. P.; GARDINER, C. Photosensitization and crystal-associated cholangiohepatopathy in sheep grazing Brachiaria decumbens. Australian Veterinary Journal, n. 68, p. 234-236, 1991. GROS, E. G.; POMILIO. A. B.; SELDES, A. M.;BURTON, G. Introducction al studio de los productos naturales. Washington: The General Secretariat of the Organization of American Status, 1985, 196 p. HARAGUCHI M., CUNHA H. A., MIMAKI Y., BRUM K. B., LEMOS R. A. A., YOKOSUKA, A.; SASHIDA Y. Furostanol glicosídicos nas folhas de Brachiaria decumbens. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 26, 2003, Poços de Caldas. Anais... Poços de Caldas: SBQ, 2003, PN- 066. HARGIS, A. M.; GINN, P. E. O tegumento In: MCGAVIN, M. D.; ZACHARY, J. F. (edts). Bases da patologia em veterinária, 4ª ed., Rio de Janeiro: Elsevier, 2009, p. 416. HOLLAND, P. T.; MILES, C. O.; MORTIMER, P. H.; WILKINS, A. L.; HAWKES, A. D.; SMITH, B. L. Isolation of the steroidal. sapogenin epismilagenin from the bile of sheep affected by Panicum dichotomiflorum toxicosis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 39, n. 11, p. 1963-1965, 1991. HOSTETTMANN, K.; MARSTON, A. Saponins-chemistry and pharmacology of natural products. Cambridge: University, 1995, 239-285. IBGE. Censo Agropecuário. Rio de Janeiro: IBGE, 2006. Disponível em: http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/agropecuaria/censoagro/default.shtm. Acesso em: 22 de jun. 2014. JENTSCH, K.; SPIEGL, P.; FUCHS, L. Vergleichende untersuchung der anthelminthischen wirksamkeit von saponinen in vitro. Arzeimittelforsch, v. 11, p. 413-414, 1961.
25
JOHNSON, I. T.; GEE, J. M.; PRICE, K.; CURI, C. FENWICK, G. R. Influence of saponins on gut permeability and active nutrient transport in vitro. Journal of Nutrition, v. 116, p. 2270, 1986. KISSMANN, K. G. Plantas Infestantes e Nocivas - Tomo I. Plantas Inferiores, Monocotiledôneas. 2 ed., São Paulo: Editora BASF, 1997, 811 p. KRAUS, J. E.; LOURO, R. P.; ESTELITA, M. E. M.; ARDUIN, M. A célula vegetal. In: APPEZZATO-DA-GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, S. M. (edts) Anatomia Vegetal. 3ª ed. Viçosa: Ed.UFV, 2012, p. 31-86. LEMOS, R. A. A.; FERREIRA, L. C. L.; SILVA, S. M.; NAKAZATO, L.; SALVADOR, S. C. Fotossensibilização e colangiopatia associada a cristais em ovinos em pastagem com Brachiaria decumbens Ciência Rural, v. 26, n. 1, p. 109-113, 1996. LEMOS, R. A. A.; NAKAZATO, L.; HERRERO JR, G. O.; SILVEIRA, A. C.; PORFÍRIO, L. C. Fotossensibilização e colangiopatia associada a cristais em caprinos mantidos sob pastagens de Brachiaria decumbens no Mato Grosso do Sul. Ciência Rural, v. 28, n. 3, p. 507-510, 1998. LEMOS, R. A. A.; PURISCO, E. Plantas que causam fotossensibilização hepatógena. In: LEMOS, R. A. A.; BARROS, N.; BRUM, K. B. (Org.) Enfermidades de interesse econômico em bovinos de corte: perguntas e respostas. Campo Grande - MS: UFMS, 2002, p. 147-155. LEMOS, R. A. A.; SALVADOR, S. C.; NAKAZATO, L. Photosensitization and crystal associated cholangiohepatopathy in cattle grazing Brachiaria decumbens in Brazil. Veterinary and Human Toxicology, v. 39, n. 6, p. 376-387, 1997. LOUREIRO, M. E.; MARTINEZ, C. Variações no metabolismo fotossintético. In: POMPELLI, M. F.; DIAS, L. C. (Ed.). Fotossíntese: parte 3 – plantas C3, C4 e CAM, Apostila. (UFMT, Faculdade de Engenharia Agronomia), 2006, 40p. Disponível em: http://www.ebah.com.br/content/ABAAABH6MAC/apostila-fotossintese-parte-3-plantas-c3-c4-cam. Acesso em: 03 out. 2014. MEAGHER, L. P.; MILES, C. O.; FAGLIARI, J. J. Hepatogenous photosensitization of ruminants by Brachiaria decumbens and Panicum dichotomiflorum in the absence of sporidesmin: lithogenic saponins may be responsible. Veterinary and Human Toxicology, v. 38, p. 271-274, 1996. MENEZES, N. L.; SILVA, D. C.; PINNA, G. F. A. M. Folha In: APEZZATO-DA-GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, B. (Ed.). Anatomia vegetal. 3ª ed. rev. e ampl., Viçosa - MG: UFV p.303-311, 2012. MOMIM, R. K.; KADAM, V. B. Histochemical investigation of different organce of genus sesbania of marathwada region in maharashtra. Journal of Phytology, v. 3, n. 12, p. 31-34, 2011. NOBRE, D.; ANDRADE, S. O. Relação entre fotossensibilização em bovinos jovens e a gramínea Brachiaria decumbens Stapf. Biológico, v. 42, n. 11/12, p. 249-258, 1976. NUTRIMAX. Voadingssuplementh & Sportvoaeding – Nutrimax TestoBolic. Disponível em: <http://www.nutrimax.be/nutrimax-testobolic/>. Acesso em: 20 jun. 2014. OLIVEIRA, B. A. D; de; FARIA, P. R. S.; SOUTO, S. M.; CARNEIRO, A. M.; DÖBEREINER; J.; ARONOVICH, S. Identificação de gramíneas tropicais com via fotossintética C4 pela anatomia foliar. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 8, p. 267-271; 1973.
26
OLIVEIRA, C. H. S. Fotossensibilização hepatógena em búfalos (Bubalus bubalis) em pastagens de Brachiaria decumbens no estado de Minas Gerais. 2011, 44f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária Preventiva), Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2011. OLIVEIRA, F.; SAITO, M. L. Práticas de morfologia vegetal. São Paulo: Atheneu, 2000, 115 p. OPASINA, B. A. Photosensitization jaundice syndrome in West African Dwarf Sheep and goats grazed on Brachiaria decumbens. Tropical Grasslands, v. 19, n. 3, p. 120-123, 1985. PACIULLO, D. S. C. Características anatômicas relacionadas ao valor nutritivo de Gramíneas forrageiras. Ciência Rural, v. 32, p. 357-364, 2002. PALEVITCH, D. Recent advances in the cultivation of medicinal plants. Acta Horticultarae, n. 208, p. 29-35, 1987. PERES, L. E. P. Metabolismo secundário (apostila) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – ESALQ, Universidade de São Paulo – USP, 26 p., 2004. Disponível em: <http://www.ufpel.edu.br/biotecnologia/gbiotec/site/content/paginadoprofessor/uploadsprofessor/ce5449dfcf0e02f741a5af86c3c5ae9a.pdf?PHPSESSID=faaa31248d8149ee235c5eb0cb54830e>. Acesso em: 17 set. 2013. QUEIROZ, D. S.; GOMIDE, J. A.; MARIA, J. Avaliação da folha e do colmo de topo e base de perfilhos de três gramíneas forrageiras. 2. Anatomia. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 29, p. 61-68, 2000. RAVEN, P.H. Biologia Vegetal. (Ed.) KRAUS, J. E. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007, 738 p. SANTOS, E. D. G.; PAULINO, M. F.; QUEIROZ, D. S.; FONSECA, D. M. DA; VALADARES FILHO, S. DE C.; LANA, R. de P. Avaliação de pastagem diferida de Brachiaria decumbens Stapf. 2. Disponibilidade de forragem e desempenho animal durante a seca. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 33, n. 1, 2004. In: Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-35982004000100025&lng=en&nrm=iso> ou <http://dx.doi.org/10.1590/S1516-35982004000100025> Acesso em: 25 mar. 2013. SANTOS, R. I. Metabolismo básico e origem dos metabólitos secundários In: SIMÕES, C. M. O; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETRVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento 2.ed. Porto Alegre: UFRGS; Florianópolis: UFSC,2000, p. 323-354. SATURNINO, K. C.; MARIANI, T. M.; BARBOSA-FERREIRA, M.; BRUM, K. B.; FERNANDES, C. E. S.; LEMOS, R. A. A. Intoxicação experimental por Brachiaria decumbens em ovinos confinados. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 30, n. 3, p. 195-202, 2010. SCATENA, V. L.; SCREMIN-DIAS, E. Parênquima, colênquima e esclerênquima, In: APEZZATO-DA-GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, B. (Ed.) Anatomia vegetal. 3ª ed, Viçosa: UFV, 2012, p. 105-122. SCHENKEL, E. P; GOSMANN, G.; ATHAYDE, M. L. Saponinas. In: SIMÕES, C. M. O; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETRVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento 2.ed. Porto Alegre: UFRGS; Florianópolis: UFSC, 2000, p. 597-622. SEIFFERT, N. F. Gramíneas Forrageiras do Gênero Brachiaria. Campo Grande, EMBRAPA-CNPGC, (CNPGC. Circular Técnica. 01), 83p, 1980. Disponível em:
27
http://www.cnpgc.embrapa.br/publicacoes/ct/ct01/04especies.html. Acesso em 13 ago. 2013. SEITZ, A. L.; ROZZA, D. B., FELTRIN, C., TRAVERSO, S. D., COLODEL, E. M.; DRIEMEIER, D. Fotossensibilização por Brachiaria decumbens em ovinos no Rio Grande do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 24; p. 67, 2004. SILVEIRA, F. A. O. Anatomia Vegetal (apostila). Curvelo-MG, 2004. Faculdade de Ciências de Curvelo, Departamento de Ciências Biológicas. Disponível em <http://www.joinville.udesc.br/sbs/professores/arlindo/materiais/Anatomia_Fernando.pdf>. Acesso em: 19 set. 2013. SILVEIRA, J. A. S.; ALBERNAZ, T. T.; SILVA E SILVA, N.; LOPES, C. T. A.; CERQUEIRA, V. D.; OLIVEIRA, C. M. C.; DUARTE, M. D.; BARBOSA, J. D. Fotossensibilização hepatógena em caprinos associada à ingestão de Brachiaria brizantha no estado do Pará. Ciência Animal Brasileira 1(Supl.): 336-441, 2009. SMITH B. L.; MILES, C. O. A letter to the editor: a role for Brachiaria decumbens in heoatogenous photosensitization of ruminants? Veterinary Human Toxicology Jornal, v. 35, p. 43-52, 1993. SOUZA, R. I. C.; RIET-CORREA, F.; BRUM, K. B.; FERNANDES, C. E.; BARBOSA-FERREIRA, M.; LEMOS, R. A. A. Intoxicação por Brachiaria spp. em bovinos no Mato Grosso do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 30, n. 12, p. 1036-1042, 2010. SOWINSKI, P.; SZCZEPANIK, J.; MINCHIN, P. E. H. On the mechanism of C4 photosynthesis intermediate exchange between Kranz mesophyll and bundle sheath cells in grasses. Journal of Experimental Botany, v. 59, n. 6, p. 1137–1147, 2008. TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fotossíntese: Reações de Carboxilação. In: Fisiologia Vegetal. 5ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. p.199-241. TOKARNIA, C. H.; DÖBEREINER, J.; SILVA, M. F. Plantas tóxicas da Amazônia: bovinos e outros herbívoros. Manaus - AM: INPA, 1979, 95 p. TOKARNIA, C. H.; DÖBEREINER, J.; PEIXOTO, P. V. Plantas Tóxicas do Brasil. Rio de Janeiro: Helianthus, 2000, 310 p. VALLE, C. B.; EUCLIDES, V. P. B.; MACEDO, M. C. M. Características de plantas forrageiras do gênero Brachiaria. In: SIMPÓSIO SOBRE O MANEJO DA PASTAGEM, 17, Piracicaba, 2001. Anais... Piracicaba: FEALQ, 2001 p. 133-176. VERONKA, D. A.; MARQUES, D. C.; CAVADA, L. H.; LAURA, V. A.; VALLE, C. B.; FERREIRA, M. B.; FERREIRA, V. B. N.; GARCEZ, W. S.; CONTREIRAS-RODRIGUES, A. P. D. Efeito alelopático do extrato bruto de Brachiaria decumbens na germinação e no vigor de sementes e de plântulas de Brachiaria brizantha. 2012, p. 01-36 (Embrapa Gado de Corte. Documentos 188). Disponível em <http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/937959/1/DOC188.pdf>. Acesso em: 8 mar. 2013. VILLELA, H. Série Gramíneas Tropicais - Panicum maximum - Massai Capim. In: Agronomia – o portal da ciência e tecnologia, 2009. Disponível em: <http://www.agronomia.com.br/conteudo/artigos/artigos_gramineas_tropicais_panicum_mombaca.htm>. Acesso em: 10 jul. 2014c. VILLELA, H. Série Gramíneas Tropicais - Panicum maximum - Mombaça Capim. In: Agronomia – o portal da ciência e tecnologia, 2009. Disponível em:
28
<http://www.agronomia.com.br/conteudo/artigos/artigos_gramineas_tropicais_panicum_mombaca.htm>. Acesso em: 10 jul. 2014a. VILLELA, H. Série Gramíneas Tropicais - Panicum maximum - Tanzânia Capim. In: Agronomia – o portal da ciência e tecnologia, 2009. Disponível em: <http://www.agronomia.com.br/conteudo/artigos/artigos_gramineas_tropicais_panicum_mombaca.htm>. Acesso em: 10 jul. 2014b. WILSON, J. R., MERTENS, D. R., HATFIELD, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal Science Food Agriculture, v. 63, p. 407- 417, 1993. YAGER, J. A.; SCOTT, D. W. The Skin and Appendages In: JUBB, K. V. F.; KENNEDY, P. C.; PALMER, N. Pathology of Domestic Animals. California: Academic Press, 1993. p. 531-738.
4. ARTIGO
IDENTIFICAÇÃO HISTOQUÍMICA DE SAPONINAS EM FOLHAS DE Brachiaria spp. E Panicum maximum
RESUMO: As espécies de Brachiaria são encontradas, principalmente, na
região Centro-Oeste do Brasil, constituindo fonte importante de alimento para
ruminantes a pasto. No entanto, há ocorrência de intoxicações em decorrência
da presença, nestas pastagens, da saponina protodioscina, a qual ocasiona
lesão hepática que, quando não é fatal, desencadeia processo de
hipersensibilidade à luz solar caracterizada por queimaduras de segundo grau,
que levam ao desprendimento da pele nas áreas expostas, as acometidas. O
Panicum maximum é outra espécie forrageira com cultivares presentes em todo
o Brasil. Existem relatos de que essas pastagens apresentam pequenas
quantidades de saponinas. Sabe-se que as B. decumbens são as mais tóxicas,
seguidas das B. brizantha e B. ruziziensis e, finalmente pelas B. humidicola,
praticamente isentas de saponinas. Até a realização deste trabalho não eram
conhecidas as estruturas histológicas onde as saponinas são armazenadas nas
folhas das Brachiaria spp. e de P. maximum. Assim, este estudo teve como
objetivo adaptar um protocolo histoquímico específico para saponinas e
evidenciar as células que as contêm. Foram utilizadas folhas maduras frescas
de cultivares de quatro espécies de braquiária e de quatro cultivares de P.
maximum. Além da análise histoquímica, realizaram-se testes de persistência
de espuma. Foram observados depósitos de saponinas nas células da bainha e
do mesófilo, responsáveis pelo metabolismo de carbono e a síntese de glicose;
nos tricomas; e nas células buliformes. Tais locais de observações possibilitam
sugerir que estes metabólitos secundários podem estar envolvidos no
armazenamento e transporte da glicose, até à defesa por exsudação como
ocorre na ação alelopática, corroborando com outros autores. Outros estudos
devem ser desenvolvidos para melhor se compreender a importância das
saponinas no metabolismo vegetal das Brachiaria spp. e P. maximum.
Palavras-chave: fotossensibilização hepatógena; histologia vegetal;
metabólitos secundários; protodioscina.
30
HISTOCHEMISTRY IDENTIFICATION OF SAPONINS IN Brachiaria spp. AND Panicum maximum LEAVES
ABSTRACT: Brachiaria spp. are important forage in tropical regions such as
Africa, Asia, Australia and South America. In Brazil they are found mainly in the
Midwest region constituting very important food for ruminants raised on pasture
source. However, there are occurrences of poisoning in these animals, due to
the presence of saponin protodioscin in these pastures causing liver damage
triggering a process of hypersensitivity to sunlight, causing death or second-
degree burns that lead to loss of skin in the area to the sun exposed. The
Panicum maximum is another forage with cultivars present throughout the Brazil
there are reports that these pastures have small amounts of saponins. The
identification and quantification of protodioscin in Brachiaria spp. leaves was
former performed and is known that B. decumbens are the most toxic, followed
by B. brizantha and B. ruziziensis and the last by B. humidicola. However isn’t
known which histological structures the saponins are stored in Brachiaria spp.
and P. maximum leaves. Thus, this study aimed to adapt a specific
histochemical protocol for saponins identification in Brachiaria spp. and P.
maximum leaves, pointing which are the cells that contain them. Fresh mature
leaves of cultivars from four Brachiaria species and four cultivars of Panicum
maximum were studied. Besides the histochemical analysis, there were
performed foam tests. Saponins deposits were observed in different cell
structures such as sheath cells responsible for local carbon metabolism to the
glucose synthesis and its transportation also, it was observed in excretion
structures as trichomes and in bulliform cells which store water. The
observation sites of saponins allows suggests that it could be involved in
different mechanisms of plant metabolism, as glucose storage and
transportation, and in the plant defense being exuded as in allelopathy, as has
been previously proposed by other researchers. Further studies are being
developed to better understand the importance of saponins in plant metabolism
of Brachiaria spp. and P. maximum.
Keywords: hepatogenous photosensitivity; plant histology; protodioscin;
secondary metabolites.
31
4.1. Introdução
As pastagens dos gêneros Brachiaria spp. e Panicum maximum,
membros da família Poaceae (Gramineae) têm origem africana e foram
introduzidas no Brasil a partir da década 1950 (KISSMANN, 1997; LORENZI,
2008). Tais plantas são importantes forrageiras de regiões tropicais como a
África, Ásia, Austrália e América do Sul (FERRAZ, 2003), e se adaptam às
mais variadas condições de solos (SEIFFERT, 1980; KISSMANN, 1997;
ALVES et al., 2012). No Brasil elas são cultivadas em grande extensão
territorial, possuindo importância econômica para a pecuária, principalmente a
de corte, tornando-se base para produção animal (IBGE, 2006).
Contudo, as Brachiaria spp. têm sido consideradas tóxicas, devido à
ocorrência da intoxicação em ruminantes, causada pela presença de saponinas
nos tecidos vegetais dessas forrageiras e identificadas como protodioscina por
Brum et al. (2007), utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE),
em conjunto a um detector evaporativo de luz espalhada (DELE). A
protodioscina está presente em praticamente todo o tecido vegetal das
Brachiaria spp., mas apresenta-se em maior concentração nas folhas jovens
(BARBOSA-FERREIRA et al., 2011), que são a parte principal ingerida durante
o pastejo (EUCLIDES; MACEDO; OLIVEIRA, 1992; SANTOS et al., 2004).
Quando ingerida ela ocasiona lesão hepática caracterizada histologicamente
como colangite que, quando não é fatal, desencadeia um processo de
hipersensibilidade à luz solar (fotossensibilização hepatógena), caracterizado
por queimaduras de segundo grau, que levam à perda da pele nas áreas mais
gravemente lesionadas (BRUM et al., 2007; BARBOSA-FERREIRA et al.,
2011).
Em relação aos cultivares de Panicum maximum cultivados no Brasil,
existem autores que relatam a existência de saponinas em suas folhas
(NOBREGA, 2004; BURAKOVAS et al., 2006), mas em quantidades muito
inferiores às encontradas nas Brachiaria spp.
As saponinas são heterosídeos triterpernoides ou esteroides, produzidos
durante o metabolismo secundário e de distribuição ampla e diferenciada no
reino vegetal e de forma distinta nos vegetais que as contém. (BRUNETON,
1991; SCHENKEL; GOSMANN; ATHAYDE, 2000; COSTA, 2002; PERES,
2004; OLIVEIRA, 2013). Sua presença e concentração são restritas em termos
32
tanto dentro da planta como entre diferentes espécies de plantas, que
funcionam como sinalizadores químicos, permitindo a estas responderem a
estímulos do ambiente, acionando mecanismos de defesa contra a ação de
herbívoros e de patógenos ou em resposta à competição dentro do
ecossistema, especialmente em situações de estresse (GOTTLIEB; KAPLAN;
BORIN, 1996; RAVEN, 2007). Assim, podem ser encontradas nos locais mais
expostos aos ataques dos agentes nocivos, funcionando como uma barreira
química no sistema de defesa da planta que compõem (WINA et al., 2005). Em
outras situações as saponinas podem desempenhar papel relacionado com a
regulação hormonal (VERONKA et al., 2012).
Não se conhece as estruturas foliares nas quais a protodioscina está
armazenada na Brachiaria spp., o que revela uma lacuna em relação à sua
identificação, espaço esse que merece ser investigado. Tal conhecimento
poderá servir de base para a melhor compreensão do papel das saponinas nas
plantas, bem como para lançar novas luzes sobre o saber atual da fisiologia
desta classe de metabólitos secundários nas forrageiras mais utilizadas no
Brasil, fornecendo subsídios para a seleção de novos cultivares menos tóxicos.
Portanto, o presente trabalho teve como objetivo a identificação de
saponinas no tecido das folhas de Brachiaria spp. e em cultivares de Panicum
maximum, bem como a descrição das estruturas histológicas que as contém.
4.2. Material e métodos
4.2.1. Coleta de folhas de Brachiaria spp.
As coletas das folhas verdes adultas foram feitas manualmente, em um
campo experimental da EMBRAPA – Gado de Corte, Campo Grande - MS,
região Centro-Oeste do Brasil, coordenadas sob a responsabilidade da Dra.
Cacilda Borges do Valle, contendo canteiros cultivados em duplicata com dois
cultivares de B. decumbens: cv. Basilisk (D62) e seu ecótipo BRA001996
(D70); cinco cultivares de B. brizantha: cv. BRS Arapoty, cv. Marandu, cv. BRS
Paiaguás (B6), cv. BRS Piatã e cv. BRS Xaraés; um cultivar de B. ruziziensis:
cv. R124 e dois cultivares de B. humidicola cv. Comum e cv. BRS Tupi, e mais
33
quatro cultivares de Panicum maximum: cv. Colonião, cv. Massai, cv. Mombaça
e cv. Tanzânia, como grupo controle (Figura 6).
H com Marandu Tupi D62 ARAPO B6 XAR PIATÃ R124 D70 Massai Momb Col Tanz REP 4
XAR ARAPO R124 PIATÃ Marandu H com D70 Tupi D62 B6 Tanz Col Massai Momb REP 3
R124 PIATÃ B6 D70 H com Tupi D62 Marandu XAR ARAPO Massai Tanz Momb Col REP 2
B6 D70 R124 Marandu D62 XAR PIATÃ ARAPO H com Tupi Col Tanz Momb Massai REP 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 6. Mapa de canteiros de Brachiaria spp. EMBRAPA Gado de Corte, contendo 14 espécimes com duas repetições (rep). - B. decumbens cv. Basilisk (D62) e ecótipo D70; B. brizantha cv. BRS Arapoty (Arapo), BRS Xaraés (Xar), BRS Piatã (Piatã), Paiaguás (B6); B. humidicola cv. comum (H com) e BRS Tupi (Tupi); B. ruziziensis cv. R124 (R124); P. maximus cv. Massai (Massai), Tanzânia (Tanz.), Mombaça (Momb.) e Colonião (Col).
4.2.2. Processamento fitoquímico – Índice afrosimétrico
Parte das folhas colhidas foi submetida ao protocolo de índice
afrosimétrico (SCHENKEL et al., 2000; MATOS, 2009; BRASIL, 2010):
1) As amostras, acondicionadas em sacos de papel rotulados, foram
colocadas em estufa com circulação de ar pré-aquecido a 40ºC e mantidas
para secagem entre 40-45ºC durante dez dias, com monitoramento a cada dois
dias. Após esse período os sacos foram retirados e postos em ambiente seco,
fresco e escuro, por quatro dias;
2) De cada saco foram trituradas e extraídas porções de 30g de massa
seca em moinho de facas tipo Willey (Tecnal®), 20 Mesh (0,850 mm) e
acondicionadas em potes plásticos com tampa opaca, devidamente rotulados;
3) Juntou-se 1g de cada uma das amostras trituradas a 50 mL de água
destilada em um becker e, em sequência aquecida em banho-maria a 60ºC,
por 30 minutos;
4) Resfriou-se esse material por 10 minutos, à temperatura ambiente,
sendo filtrado, em seguida, em um erlenmayer (100 mL). Completou-se o
volume para 100 mL, com água destilada. O decoto foi rotulado, e tampado
com filme PVC;
34
5) Para análise do índice de espuma foram separados dez tubos de
ensaio com tampa e neles distribui-se o decoto em séries sucessivas de 1, 2, 3,
até 10 mL, ajustando-se em todos, o volume para 10 mL, com água destilada
(Quadro 1). Por fim, esses tubos foram manualmente agitados de forma
enérgica e deixados em repouso por 15 minutos;
Quadro 1. Bateria com 10 tubos de ensaio utilizados para determinar o índice afrosimétrico.
Tubos I II III IV V VI VII VIII IX X
Sol. da droga (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Água destilada (mL) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 -
Após esse período, observou-se, nos tubos, a formação de anéis de
espuma consistente e persistente, indicando a presença de saponina. Aferiram-
se então as alturas das colunas de espuma, marcando-se a parte os tubos que
apresentaram a diluição em que se registravam anéis com 1 cm de altura, para
determinação do índice. Foi realizado o cálculo do índice a partir do volume
dessa diluição em mililitros da solução extrativa (1%) que se submeteu a tal
condição. Exemplo: o tubo V apresentou anel de 1 cm, então 0,01g:10mL ::
x:5mL, x = 0,005g. O índice é calculado para 1g, da seguinte maneira:
0,005:10::1g:Y=2000, COSTA (2001). Assim, quanto menor a concentração a
apresentar espuma, maior quantidade de saponinas terá a amostra. Esse
método foi executado em triplicata (SCHENKEL, GOSMANN, ATHAYDE, 2000;
COSTA, 2001).
4.2.3. Processamento Histológico
A partir de cortes transversais das folhas, fixados em álcool etílico 70%,
e obtidos pela técnica de corte da “Mão-Livre”, os tecidos foram corados pela
técnica de histologia básica, para identificação anatômica pelo método
adaptado de Kraus; Arduin (1997) e Brasil (2010).
35
4.2.4. Processamento Histoquímico
As folhas sofreram cortes histológicos em suas partes centrais e foram
submetidas ao protocolo histoquímico para saponinas (COSTA, 2001; MOMIM;
KADAM, 2011), adaptado para o objeto do estudo. Todos os procedimentos
foram realizados em ambiente de capela.
1) Os cortes frescos de cada espécime permaneceram imersos por 20
horas dentro de um dessecador com vácuo, em solução aquosa saturada de
hidróxido de bário octahidratada (Ba(OH)2.8H2O), ou barita, utilizando-se
placas de Petri de plástico, com o volume médio de 10 ml da solução, com o
que se formou um precipitado gelatinoso e incolor com as saponinas;
2) Após 20 horas, os cortes foram retirados da solução e lavados em
solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 8% por 1-2 minutos, para deslocar o que
sobrou de barita em excesso, não fixada. Em seguida foram montados em
lâminas de microscopia e banhados, por 20 segundos, com uma gota de
solução de dicromato de potássio (K₂Cr₂O₇) a 10%, a fim de se destruir a
combinação de barita com a saponina. Imediatamente formou-se um
precipitado de cromato de Bário (BaCrO4), de coloração amarela, nas células
que contêm saponinas;
3) Na montagem das lâminas utilizou-se solução de glicerina 50%, com
o intuito de retirar o excesso de K₂Cr₂O7, que deixa toda a lâmina amarelada
em sequência as lamínulas foram vedadas com base de unha comum (KRAUS
e ARDUIN, 1997; BRASIL, 2010). Realizou-se a leitura em microscopia de luz,
o mais rápido possível, para a visualização e captura de imagens das
estruturas contendo as saponinas, nas células, coradas em tons de amarelo,
dando definição da localização onde se concentra a substância em estudo.
4) Entretanto, conforme Costa (2001), o K₂Cr₂O₇ reage também com
taninos, resultando um precipitado castanho-avermelhado nas células, o que
pode influenciar nas leituras das lâminas. Assim procedeu-se à adaptação de
Conrard (COSTA, 2001), que consiste em, após a exposição dos cortes em
K₂Cr₂O₇, lavá-los em água e, em seguida, montá-los em lâmina de microscopia
com uma gota de nitrato de prata (AgNO3) 0,1N. As células que continham o
36
precipitado amarelo de cromato de bário formam um precipitado vermelho, de
cromato de prata (Ag2CrO4).
4.3. Resultados e Discussão
A espuma observada apresentou persistência em todas as
concentrações para os exemplares de Brachiaria spp., exceto a B. humidicola
cv Tupi, que produziu pouca (menor que 5cm) porém persistente espuma. Os
exemplares do grupo Panicum maximum não apresentaram as mesmas
evidências que possibilitassem o cálculo para o índice de espuma (Figura 7).
Figura 7. Ilustração representando a análise afrosimétrica realizada em todos
os espécimes avaliados. Esquerda: teste positivo para a B.brizantha cv. BRS Paiaguás. Direita: teste negativo para P.maximum cv. Mombaça.
O índice afrosimétrico da B. decumbens cv. Basilisk e o ecotipo BRA
001996 foram, respectivamente, de 1250 e 2500. Nas B. brizantha ele variou
de 1000 a 3333,3; na B. ruziziensis cv. R124 foi de 3333,33; na B. humidicola
cv. Comum foi de 1000 e no cv. BRS Tupi manteve-se menor do que 1000
(Tabela 1).
37
Tabela 1. Valores do índice afrosimétrico de Brachiaria spp. e cultivares de Panicum maximum, obtidos após a análise de persistência de espuma em dez diluições diferentes.
Amostras Espuma
persistente* Índice de Espuma
Histoquímica
B. decumbens cv. Basilisk 100% 1250 +
B. decumbens ecótipo BRA 001996 100% 2500 +
B. brizantha cv. BRS Arapoty 100% 2000 +
B. brizantha cv. Marandú 100% 1428,6 +
B. brizantha cv. BRS Paiaguás 100% 3333,3 +
B. brizantha cv. BRS Piatã 100% 1666,7 +
B. brizantha cv. Xaraés 90% 1000 +
B. ruziziensis cv. R124 100% 3333,3 +
B. humidicola cv. Comum 100% 1000 +
B. humidicola cv. BRS Tupi 90% < 1000 +
P. maximum cv. Colonião 0% < 1000 +
P. maximum cv. Massai 90% < 1000 +
P. maximum cv. Mombaça 90% < 1000 +
P. maximum cv. Tanzânia 20% < 1000 +
* Refere-se à percentagem de tubos que apresentaram espuma em uma bateria com dez diluições diferentes, com três repetições.
Quanto à frequência de espuma, nas dez diluições do teste, observou-se
que oito amostras de Brachiaria apresentaram espuma consistente e
persistente (100%) As amostras de B. brizantha cv. Xaraés e B. humidicola cv.
BRS Tupi alcançaram 90% de frequência, sendo que estas amostras
apresentaram menor índice de espuma em relação às demais espécies.
Em relação aos resultados obtidos com Panicum maximum, o índice
afrosimétrico revelou concentrações muito baixas de espuma nas soluções, o
que impossibilita a afirmação de que as saponinas estejam presentes nessas
Poaceae.
O índice afrosimétrico indica a menor diluição do extrato em água capaz
de formar 1 cm de espuma. Quanto maior a coluna de espuma em uma grande
diluição, maior o índice e, consequentemente, maior a toxicidade (COSTA,
2001; SCHENKEL, GOSMANN, ATHAYDE, 2007; MATOS, 2009).
Este método não traduz o conteúdo de saponósidos, todavia permite
apreciar o conteúdo relativo de substâncias afrogênicas. Não foram
encontrados até o momento trabalhos relatando o índice de saponinas com
38
pastagens, sendo que esse índice é especificamente aplicado para plantas
medicinais (COSTA, 2001).
Dentre as amostras de Brachiaria utilizadas em outro estudo, as B.
decumbens apresentam maior quantidade de protodioscina (BARBOSA-
FERREIRA et al., 2011), entretanto, resultados de colheitas pontuais revelam
discrepâncias, uma vez que os componentes químicos nos vegetais podem
variar consideravelmente em razão de diferentes fatores como a época do ano,
local de coleta, formas de cultivo, condições climáticas, idade do material
vegetal, período e condições de armazenamento, entre outros (FARIAS, 2000).
Os resultados apresentados no presente trabalho corroboram os achados de
BARBOSA-FERREIRA et al. (2011), que observaram que as concentrações de
protodioscina variam em uma mesma espécie ao longo do tempo, podendo
haver altas concentrações nas B. brizantha e baixas nas B. decumbens em um
determinado momento, equiparando-as. Os índices afrosimétricos corroboram
também o observado pelos mesmos autores, em que as B. brizantha podem se
equivaler em toxicidade à B. ruziziensis. Além disso, as B. humidicola são as
que apresentam as menores concentrações de saponinas.
Os resultados histoquímicos dos cortes histológicos são apresentados
nas próximas Figuras (8 a 15). Imediatamente após a adição de dicromato de
potássio, todos os cortes positivos para saponinas apresentaram coloração
amarela ou amarelo-alaranjada, coloração essa observada somente dentro das
células do mesófilo e da bainha do feixe vascular, permeando a superfície dos
cloroplastos.
39
Figura 8. Reação histoquímica para saponinas, evidenciando em amarelo o
conteúdo de saponinas nas células do mesófilo e da bainha. A) e B) B. decumbens cv. Basiliski, AX10 e A X40 respectivamente. C) e D) B. decumbens ecotipo D70 AX10 e A~X50, respectivamente.
Após a realização do teste com nitrato de prata, observou-se perda da
estrutura celular dos tecidos, com precipitação da saponina em forma de
cristais difusamente distribuídos na lâmina histológica e, em alguns casos,
precipitação vermelha dentro de estruturas celulares (Figura 9).
Figura 9. Reação histoquímica para saponinas, seguida da imersão em nitrato
de prata, evidenciando desorganização celular e cristais de saponina
B A
D C
B A
40
em vermelho, presentes na área do corte tecidual. B. decumbens D70 AX40 e A~X80, respectivamente.
As cultivares de Brachiaria brizantha apresentaram a coloração amarela,
variando em intensidade, o que pode ser devido, em grande parte, à espessura
do corte, realizado à mão livre. A Figura 10 ilustra a histoquímica de B.
brizantha, cultivares Marandu e Xaraés.
Figura 10. Cortes histológicos de B. brizantha evidenciando o conteúdo de saponina, em amarelo, à esquerda, e a reação com nitrado de prata, evidenciando cristais vermelhos de saponina. A e B: B. cv. Marandu; C e D: cv. Xaraés. A e C X10. B~X 50 e D A~X80.
Após a reação com o nitrato de prata, a cultivar Arapoti apresentou
precipitado cristalino, de coloração avermelhada, dentro das células buliformes,
e a cultivar Paiaguás apresentou coloração vermelha na região da inserção dos
tricomas. A cultivar Piatã apresentou pouco precipitado vermelho marginando a
região abaxial do corte histológico, possivelmente por ter ocorrido
extravasamento do conteúdo celular após a reação química (Figura 11).
A B
C D
41
Figura 11. Cortes histoquímicos de B. brizantha, após reação com nitrato de
prata, evidenciando cristais vermelhos de saponina dentro de células buliformes da cv. Arapoti (A), e na região da inserção de um tricoma da cv. Paiaguás (B) AX40, A~X80 e A~X80, respectivamente. A figura C ilustra a presença de precipitado vermelho marginando a região abaxial de cv. Piatã. A~X60.
Após a reação com nitrato de prata, o corte histológico de B. ruziziensis
revelou a presença de cristais de saponina esparsos em algumas áreas
fragmentadas do tecido, no interior de células buliformes e dentro de células da
bainha do feixe vascular (Figura 12).
B PIAT
A PIAT
C PIAT
42
Figura 12. Reações histoquímicas de B. ruziziensis, após reação com nitrato de prata, evidenciando cristais vermelhos de saponina dentro de célula buliforme (A) e dentro de célula da bainha (B) AX40 e A~X50.
Os cortes histológicos de B. humidicola apresentaram cristais vermelhos
de saponinas distribuídos difusamente no sobrenadante do tecido,
caracterizando extravasamento do material após rompimentos celulares (Figura
13).
Figura 13. Cortes histoquímicos de B. humidicola cv. Tupi, após reação com
nitrato de prata, evidenciando cristais vermelhos de saponinas espalhados difusamente sobre o corte tecidual AX40.
As cultivares de Panicum maximum apresentaram colorações
amareladas e esverdeadas após o teste de dicromato de potássio nas mesmas
células observadas para as Brachiaria spp., aparentemente corando os
cloroplastos existentes (Figura 14).
A PIAT
B PIAT
43
Figura 14. Cortes histológicos de Panicum maximum submetidos à
histoquímica para evidenciação de saponinas. Cultivares colonião (A), Tanzânia (B), Mombaça (C) e Massai (D).
Após a reação com nitrato de prata, essas cultivares apresentaram a
presença de cristais de saponinas no sobrenadante e nas células da nervura
central (Figura. 15)
Figura 15. Fotomicrografia de corte histológico de Panicum maximum cv.
Massai submetido à histoquímica para evidenciação de saponinas, com exposição posterior ao nitrato de prata evidenciando-se imagem da nervura central contendo cristais sugestivos de saponinas (setas). A~80X.
B PIAT
A PIAT
D PIAT
C PIAT
44
Apesar de o Panicum dichotomiflorum possuir, comprovadamente, a
saponina esteroidal dicotomina (MEAGHER et al., 1996; RIET-CORREA,
2009), existem relatos conflitantes sobre a concentração desses metabólitos
secundários nos Panicum maximum estudados no presente trabalho.
BURAKOVAS et al. (2006) observaram baixas concentrações de protodioscina,
em P. maximum cv. Tanzânia, Massai e Mombaça, avaliadas por meio de
CCD, CLAE e espectroscopia RMN. Por outro lado Nóbrega et al. (2004)
relataram não haver, no cultivar Tanzânia, detecção destes metabólitos por
meio de CCD. Portanto, esses achados conflitantes podem ocorrer,
possivelmente, devido à baixa concentração desta saponina nos Panicum
maximum estudados.
Na análise histoquímica, o teste usual de saponinas recomendado para
drogas vegetais, segundo a 5a edição da farmacopeia brasileira (BRASIL,
2010) é a reação feita com material fresco seccionado ou material cortado em
micrótomo e incluído em parafina ou macrogol, adicionando-se uma gota dos
reativos sobre uma lâmina com uma secção da amostra.
Este reativo para saponinas é uma gota de ácido sulfúrico. Após a
adição ocorre uma sequência de cor amarela, seguida de cor vermelha e,
finalmente, de cor violeta ou azul-esverdeada. Contudo, esse teste acaba
sendo inviável, como foi observado no trabalho com a Gomphrena arborescens
L.f. (Amaranthaceae), onde a reação dos tecidos submetidos ao ácido sulfúrico
concentrado, para a detecção de saponinas e/ou lactonas sesquiterpênicas nas
folhas foi considerada não conclusiva (FRANK-DE-CARVALHO; GRACIANO-
RIBEIRO, 2005). Além disso, o uso de ácido sulfúrico no presente trabalho
acarretou em destruição precoce das estruturas celulares, impedindo a
identificação dos locais de depósito das saponinas.
O uso da solução aquosa de hidróxido de bário octahidratado, em
contato com as saponinas (protodioscina), presente no órgão vegetal, libera íon
Ba+2, que forma complexo com os pares de elétrons livres das hidroxilas (OH-)
do glicosídeo. Com a retirada do excesso desse hidróxido, que não foi
complexado às saponinas, pelo cloreto de cálcio, ocorrerá à formação de
precipitado amarelo pálido, após a adição de solução aquosa de dicromato de
potássio, que reage precipitando o cromato de bário (VOGEL, 1981). Essa
coloração amarelada pode sofrer oxirredução do cromato, resultando na
45
coloração verde (BACCAN, 2011). Por este motivo, as leituras dos cortes pós-
coloração devem ser realizadas imediatamente, para serem identificadas as
áreas que possuem cor amarela.
As Brachiaria spp. e o Panicum maximum fazem parte do grupo de
plantas C4, comuns nas regiões tropicais, que possuem uma arquitetura foliar
apresentando células parenquimais adaptadas (mesófilo), distribuídas ao redor
do feixe vascular, conhecidas como células da bainha (RAVEN, 2007). Estas
células da bainha são intimamente relacionadas com as células do parênquima
(mesófilo), que dividem a fotossíntese entre si. Assim, duas etapas do
metabolismo C4 com reações químicas dependentes de luz e subsequente
fixação de CO2 na forma de malato, ocorrem nas células do mesófilo (RAVEN,
2007). Este malato é transportado para as células da bainha, onde a enzima
RUBISCO, dentro do ciclo de Calvin-Benson, utiliza o CO2 para formar os
carboidratos que, finalmente, serão armazenados na forma de amido ou
transportados para a planta toda (TAIZ; ZEIGER, 2013).
Em relação à coloração amarelada dos cloroplastos, observada, pela
histoquímica, após a reação com o dicromato de potássio, pode-se sugerir que
as saponinas estariam ligadas a essas organelas, participando de parte do
metabolismo C4, possivelmente na captação dos açúcares formados. Essa
teoria se deve ao fato de as saponinas serem formadas por uma porção
sapogenina e uma porção glicona (SCHENKEL; GOSMANN; ATHAYDE, 2007),
ilustrado na Figura 16. Assim, a porção glicona representaria aquele
carboidrato produzido ao final do metabolismo C4, que seria atraído pela
sapogenina, formando a saponina.
Desta maneira, além do armazenamento da glicose na forma de amido,
a ligação dos carboidratos a uma sapogenina poderia se dar pela necessidade
de transporte tecidual, tornando a saponina um transportador desses nutrientes
às diferentes partes da planta para a produção de ATP.
46
Figura 16. Esquema de degradação da protodioscina em outros metabólitos.
Dentro dos círculos são evidenciadas as moléculas de açúcares. (FONTE: BRUM et al., (2007).
Apesar da reação com nitrato de prata ter causado perda da estrutura
celular em alguns tecidos, a presença de cristais de saponina precipitados no
interior das células da bainha indica que as saponinas estariam contribuindo
com os cloroplastos na acepção dos carboidratos. A presença dentro de
estruturas excretoras como nas células buliformes e nas estruturas tubulares
dos tricomas evidenciaria um caráter excretório das saponinas, que poderiam
ser transudadas pelas folhas com funções diversas, sendo uma delas a
alelopática, conforme sugerido por Veronka et al. (2012), permeando o solo ao
redor da planta e impedindo o crescimento de outras plantas competidoras
suscetíveis ao efeito tóxico das mesmas.
4.4. Conclusões
O teste histoquímico utilizado no trabalho mostrou-se eficiente na
identificação e localização das saponinas (protodioscina) nas células foliares,
do mesófilo e da bainha do feixe dos cultivares das Brachiaria spp. estudadas.
47
Apesar de alguns (testes) experimentos anteriores não se identificarem a
presença da protodioscina, o teste histoquímico identificou presença de
pequena concentração das saponinas nas células de Panicum maximum.
Os testes feitos com ácido sulfúrico não foram eficientes para esse
estudo, pois ele destrói precocemente as estruturas celulares impedindo a
identificação dos locais de depósito das saponinas
Há necessidade de se realizar mais estudos com o intuito de melhorar a
metodologia empregada, incluindo o uso de micrótomo para se efetuar o corte
tecidual e padronizar a espessura dos tecidos a serem corados.
4.5. Referências Bibliográficas
ALVES, S. J.; MORAES, A.; CANTO, M. W.; SANDINI, I.; EMBRAPA. Espécies forrageiras recomendadas para produção animal. 2000, p. 4-23. Disponível em: http://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/zootecnia/ANACLAUDIARUGGIERI/especies_forrageiras.pdf. Acesso em: 01 ago. 2014. BACCAN, N. Aula Prática 11: Volumetria de oxirredução: Dicromato de Potássio. GRUPO de Química Analítica Universidade Federal de Juiz de Fora, Instituto de Ciências Exatas – ICE, Juiz de Fora-MG, 2011 p. 8 Disponível em: <http://www.ufjf.br/baccan/files/2011/05/Aula_pratica_11.pdf>. Acessa em: 25 jul. 2014. BARBOSA, J. D.; OLIVEIRA, C. M. C.; TOKARNIA, C. H.; PEIXOTO, P. V. Fotossensibilização hepatógena em equinos pela ingestão de Brachiaria humicola (Gramineae) no estado do Pará. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 26, n. 3, p. 147-153, 2006. BARBOSA-FERREIRA, M.; BRUM, K. B.; FERNANDES, C. E.; MARTINS, C. F.; PINTO, G. S.; CASTRO, V. S.; REZENDE, K. G.; RIET-CORREA, F., HARAGUCHI, M., JUNIOR, H. L. W.; LEMOS, R. A. A. Variations of saponin concentration in Brachiaria brizantha leaves as a function of maturation: preliminary data. In: Riet-Correa, F.; Pfister, J.; Schild, A. L. & Wierenga, T. (eds.). Poisoning by plants, mycotoxins and related Toxins. CAB International, Cambridge, 2011, p. 118-123. BRASIL. Farmacopeia Brasileira, volume 2 / Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: Anvisa, v. 2, 2010, 546 p. BRUM, K. B.; HARAGUCHI, M.; LEMOS, R. A. A.; FIORAVANTI, M. C. S. Crystal-associated cholangiopathy in sheep grazing Brachiaria decumbens containing the saponin protodioscin. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 27, n. 1, p. 39-42, 2007. BRUNETON, J. Elementos de Fitoquímica y de farmacognosia. 1991 Isla de Mallorca - Zaragoza: Editorial Acribia, 1991, p.189-213. BURAKOVAS R. G.; YOKOSUKA A.; MIMAKI Y.; RIET-CORREA F.; MEDEIROS R. M. T.; DANTAS A. F. M.; MATOS P. F.; KATIKI L. M.; VERÍSSIMO C. J.; BUENO M. S.; BRUM K. B.; FIORAVANTI M. C. S.;
48
BARBOSA NETO J. D.; HARAGUCHI M. Investigação das saponinas furostânicas nas gramíneas de Panicum. In: Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 30, 2007, Águas de Lindóia, Anais eletrônicos. Águas de Lindóia, SBQ, 2007, disponível em http://sec.sbq.org.br/cdrom/30ra/resumos/T0491-1.pdf. Acesso em: 12 ago. 2014. COSTA, A. F. Fármacos com saponósidos. In:______ (Ed). Farmacognosia: volume III - Farmacognosia Experimental. 3ª ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2001, p. 707-709. COSTA, A. F. Fármacos com saponósidos. In:______(Ed). Farmacognosia: volume II. 5a ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2002, p. 338-370. EUCLIDES, V. P. B.; MACEDO, M. C. M.; OLIVEIRA, M. P. Avaliação de diferentes métodos de amostragem sob pastejo. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 21, n. 4, p. 691-702, 1992. FARIAS, M. R. Avaliação da qualidade de matérias-primas vegetais. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. (org.) Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2.ed. Porto Alegre: UFRGS; Florianópolis: UFSC/Editora da UFRGS e Editora da UFSC, 2000. cap. 12. p. 197-220. FAGLIARI, J. J. Estudo epidemiológico, clínico e laboratorial da intoxicação natural de bovinos pela micotoxina esporidesmina. 1990. 107f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 1990. FERRAZ, F. M. Pastagens garantem o futuro da agropecuária brasileira. In: ANUALPEC, 2003. Anuário da Pecuária Brasileira, 10 ed. São Paulo: FNP Consultoria e Agroinformativos, 2003, p. 55-56. FRANK-DE-CARVALHO, S. M.; GRACIANO-RIBEIRO, D. Arquitetura, anatomia e histoquímica das folhas de Gomphrena arborescens L.f. (Amaranthaceae). Acta Botanica Brasileira, n. 19, n. 2, p. 377-90, 2005. GOTTLIBEB, O. R.; KAPLAN, M. A. C.; BORIN, M. R. M. B. Biodiversidade: um enfoque químico-biológico. Rio de Janeiro: UFRJ, 1996, p. 268. IBGE. Censo Agropecuário. Rio de Janeiro: IBGE, 2006. Disponível em: http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/agropecuaria/censoagro/default.shtm. Acesso em: 22 de jun. 2014. KISSMANN, K. G. Plantas Infestantes e Nocivas - Tomo I. Plantas Inferiores, Monocotiledôneas. 2., São Paulo – SP: Editora BASF, 1997, 811 p. KRAUS, J. E.; ARDUIN, M. Manual básico de métodos em morfologia vegetal 3. ed., Seropédica: EDUR, 1997. LORENZI, H. Plantas Daninhas do Brasil: Terrestres, Aquáticas, Parasitas e Tóxicas. 4. ed. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2008, 672 p. MATOS, F. J. A. Introdução à Fitoquímica Experimental. 3.ed. Fortaleza: EUFC. 2009, 141 p. MEAGHER, L. P.; MILES, C. O.; FAGLIARI, J. J. Hepatogenous photosensitization of ruminants by Brachiaria decumbens and Panicum dichotomiflorum in the absence os sporidesmin: lithogenic saponins may be responsible. Veterinary and Human Toxicology, v. 38, p. 271-274, 1996. MOMIM, R. K.; KADAM, V. B. Histochemical investigation of different organce of genus sesbania of marathwada region in maharashtra. Journal of Phytology, v. 3, n. 12, p. 31-4, 2011.
49
NÓBREGA, F. N.; GARUTTI, M. B.; BRUM, K. B. MOREIRA, C. N.; FIORAVANTI, M. C. S.; SILVA, L. A. F.; HARAGUCHI, M. Occurrence of saponins in Brachiaria, Panicum and Andropogon species used in bovine pastures. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 27, 2004. Salvador. Anais eletrônicos... Salvador: SBQ, 2004, disponível em <http://sec.sbq.org.br/cdrom/31ra/resumos/T1667-2.pdf>. Acesso em: 12 ago. 2014. OLIVEIRA, C. H. S.; BARBOSA, J. D.; OLIVEIRA, C. M. C.; BASTIANETTO, E.; MELO, M. M.; HARAGUCHI, M.; FREITAS, L. G. L.; SILVA, M. X.; LEITE, R.C. Hepatic photosensitization in buffaloes intoxicated by Brachiaria decumbens in Minas Gerais state, Brazil. Toxicon, v. 73, p. 121-129, 2013. RAVEN, P. H. Biologia Vegetal. (Ed.) KRAUS, J. E. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007, 738 p. RIET-CORREA, F.; HARAGUCHI, M.; DANTAS, A. F. M.; BURAKOVAS, R. G.; YOKOSUKA, A.; MIMAKI, Y.; MEDEIROS, R. M. T.; MATOS, P. F. Sheep poisoning by Panicum dichotomiflorum in northeastern Brazil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 29, n. 1, p. 94-98, 2009.
RIET-CORREA, F.; MEDEIROS, R. M. T. Intoxicações por plantas em ruminantes no Brasil e no Uruguai: importância econômica, controle e riscos para a saúde pública. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 21, n. 1, 2001. Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1590/S0100-736X2001000100008>. SANTOS, E. D. G.; PAULINO, M.F.; QUEIROZ, D.S.; FONSECA, D.M. DA; VALADARES FILHO, S. DE C.; LANA, R. de P. Avaliação de pastagem diferida de Brachiaria decumbens Stapf. 2. Disponibilidade de forragem e desempenho animal durante a seca. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 33, n. 1, 2004. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1590/S1516-35982004000100025> Acesso em: 25 mar. 2013. SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; ATHAYDE, M. L. Saponinas. In: SIMÕES, C. M. O; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETRVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6 .ed. Porto Alegre: UFRGS; Florianópolis: UFSC, 2007. p. 711-740. SEIFFERT, N. F. Gramíneas Forrageiras do Gênero Brachiaria. Campo Grande, EMBRAPA-CNPGC, (CNPGC. Circular Técnica. 01), 83 p., 1980. Disponível em: http://www.cnpgc.embrapa.br/publicacoes/ct/ct01/04especies.html Acesso em 13 ago. 2013. TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fotossíntese: Reações de Carboxilação. In: Fisiologia Vegetal. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. p. 199-241. VERONKA, D. A.; MARQUES, D. C.; CAVADA, L. H.; LAURA, V. A.; VALLE, C. B.; FERREIRA, M. B.; FERREIRA, V. B. N.; GARCEZ, W. S.; CONTREIRAS-RODRIGUES, A. P. D. Efeito alelopático do extrato bruto de Brachiaria decumbens na germinação e no vigor de sementes e de plântulas de Brachiaria brizantha. 2012. p. 01-36 (Embrapa Gado de Corte. Documentos 188). Disponível em <http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/937959/1/DOC188.pdf>. Acesso em 8 mar. 2013. VOGEL, A. I. Química Analítica Qualitativa. 5.ed. São Paulo: Editora Mestre Jou. 1981, p.393-95.
50
WINA, E.; MUETZEL, S.; BECKER, K. The impact of saponins or saponin-containing plant materials on ruminant productions: a review. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 53, n. 21, p. 8093-105, 2005.