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UUNNII VVEERRSSII DDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMM BBUUCCOO CCEENNTTRROO DDEE CCII ÊÊNNCCII AASS BBII OOLL ÓÓGGII CCAASS
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[[DDII SSSSEERRTTAAÇÇÃÃOO DDEE MM EESSTTRRAADDOO]]
IDENTIFICAÇÃO DE MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS EM HOMÓLOGOS DE FATORES DE
INICIAÇÃO DA TRADUÇÃO EM TRYPANOSOMA BRUCEI
AMARANTA MUNIZ MALVEZZI
RECIFE 2010
UUNNII VVEERRSSII DDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMM BBUUCCOO CCEENNTTRROO DDEE CCII ÊÊNNCCII AASS BBII OOLL ÓÓGGII CCAASS
DDEEPPAARRTTAAMM EENNTTOO DDEE GGEENNÉÉTTII CCAA
PPRROOGGRRAAMM AA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTII CCAA EE BBII OOLL OOGGII AA MM OOLL EECCUULL AARR
DDII SSSSEERRTTAAÇÇÃÃOO DDEE MM EESSTTRRAADDOO
Identificação de modificações pós-traducionais em homólogos de fatores de iniciação da tradução em Trypanosoma brucei
AMARANTA MUNIZ MALVEZZI
RECIFE 2010
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE
Orientador: Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto
Malvezzi, Amaranta Muniz
Identificação de modificações pós-traducionai s em homólogos de fatores de iniciação da tradução em Trypanosoma brucei / Amaranta Muniz Malvezzi. – Recife: O Autor, 2010. 71 folhas : il., fig., tab.
Orientador: Osvaldo Pompílio de Melo Neto. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB.
Genética e Biologia Molecular, 2010.
Inclui bibliografia.
1. Regulação de expressão gênica 2. Genética molecular 3. Protozoário 4. Trypanossoma 5. Tripanosomíase africana I. Título.
572.865 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2010-129
“A coisa mais bela que o homem pode experimentar é o mistério. É esta a emoção fundamental que está na raiz de toda ciência e arte. O homem que desconhece esse encanto, incapaz de sentir admiração e estupefação, esse já está, por assim dizer, morto e tem os olhos extintos.”
Albert Einstein
AAooss mmeeuuss ppaaiiss..
AAggrr aaddeecciimmeennttooss
Ao meu orientador Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto, que me deu a oportunidade e
confiança para que eu pudesse realizar este trabalho. Também pela orientação e paciência no
decorrer desse tempo.
A todos os amigos da microbiologia: Bruna Caiado, Rodrigo Pontes, Éden Freire,
Christian Reis, Franklin Magalhães, Tamara Lima, Danielle Moura, Mariana Marques,
Adelino Lima, Kellyanne Carvalho, Eduardo Nunes, Diego Tavares, Janaína Nascimento e
Marília Barbosa, os quais enriqueceram meu conhecimento científico e tornaram o dia-a-dia
do laboratório mais agradável.
Aos funcionários da microbiologia Isaac Martins, Cláudio Eduardo, Silvana Santos,
Yara Nakasawa e Bruna Lima, pois é através da ajuda deles que a execução do nosso trabalho
torna-se possível.
A Drª Viviane Gouveia, ao Dr. Tercílio Calsa e a Isadora Louise pelo suporte
fornecido para a realização dos experimentos de eletroforese bidimensional.
A Deus, por permitir e me dar forças para chegar até aqui e poder alcançar meus
objetivos.
A todas minhas amigas que estão sempre do meu lado, mesmo quando estão centenas
de quilômetros distantes: Valéria Dias, Patrícia Toniolo, Mariana Palma, Deborah Ott, Rita
Muniz, Solange Vasconcelos e Debora Lopes.
Ao meu namorado Isaac Santos, pelo incentivo, apoio e carinho que sempre me deu.
Aos meus irmãos e a minha família em geral, que sempre me ajudaram quando
precisei e sempre contribuíram de alguma forma para garantir minha formação profissional.
Aos meus pais, em especial, pois nunca pouparam esforços para que eu seguisse meu
caminho e que apesar dos momentos difíceis sempre me incentivaram, apoiaram e fizeram de
tudo que estava ao alcance deles para que eu obtivesse sucesso em minha vida.
Sumário Lista de abreviaturas............................................................................................................................ ix
LL iissttaa ddee ff iigguurr aass ..................................................................................................................................... xi
LL iissttaa ddee ttaabbeellaass .................................................................................................................................... xii
RReessuummoo................................................................................................................................................ xiii
AAbbsstt rr aacctt ............................................................................................................................................... xiv
II nntt rr oodduuççããoo.............................................................................................................................................xv
1. Revisão da literatura........................................................................................................................17
1.1 Kinetoplastídeos .......................................................................................................................... 17
1.2 Trypanosoma brucei e a tripanosomíase africana humana.......................................................... 18
1.2.1 O ciclo evolutivo do T. brucei...................................................................................... 19
1.3 Regulação da expressão gênica nos tripanossomatídeos............................................................. 21
1.3.1 Promotores, RNA polimerases e transcricão policistrônica............................................. 21
1.3.2 Controle da estabilidade e degradação dos mRNAs........................................................ 23
1.4 Síntese protéica em eucariotos .................................................................................................... 24
1.4.1 O processo da iniciação da tradução............................................................................. 24
1.4.2 Complexo eIF4F e PABP............................................................................................. 26
1.4.2.1 eIF4E.................................................................................................................. 27
1.4.2.2 eIF4G................................................................................................................... 27
1.4.2.3 eIF4A................................................................................................................... 28
1.4.2.4 PABP................................................................................................................... 29
1.4.3 Síntese protéica em tripanossomatídeos........................................................................ 29
1.5 Modificações pós-traducionais de fatores de tradução via fosforilação...................................... 30
1.5.1 Vias de sinalização que regulam a fosforilação dos fatores de iniciação da tradução......... 31
1.5.1.1 mTOR.................................................................................................................. 32
1.5.1.2 MAPK................................................................................................................. 32
1.5.1.3 Outras vias........................................................................................................... 33
1.5.2 Eventos de fosforilação nos fatores de iniciação da tradução em mamíferos.................... 33
1.5.2.1 eIF4E................................................................................................................... 33
1.5.2.2 EIF4G.................................................................................................................. 33
1.5.2.3 PABP................................................................................................................... 34
1.5.3 Eventos de fosforilação nos tripanossomatídeos ............................................................ 34
2. Objetivo geral ...................................................................................................................................36
2.1 Objetivos específicos................................................................................................................... 36
33.. MM aatteerr iiaaiiss ee mmééttooddooss..........................................................................................................................37
3.1 Cultivo de células de T. brucei. ................................................................................................... 37
3.2 Curvas de crescimento de T. brucei na fase prociclíca................................................................ 37
3.3 Curvas de crescimento de T. brucei na fase sanguínea. .............................................................. 38
3.4 Diferenciação de T. brucei.......................................................................................................... 38
3.5 Purificação dos anticorpos por imunoadsorção........................................................................... 39
3.6 Ensaios de Western-blot. ............................................................................................................. 39
3.7 Fracionamento celular ................................................................................................................. 40
3.8 Ensaios de desfosforilação. ......................................................................................................... 40
3.9 Imunoprecipitação....................................................................................................................... 40
3.10 Purificação de fosfoproteínas .................................................................................................... 41
3.11 Eletroforese bidimensional........................................................................................................ 41
44.. RReessuull ttaaddooss .........................................................................................................................................43
4.1 Estabelecimento das curvas de crescimento de T. brucei na fase prociclíca............................... 43
4.3 Diferenciação de formas sanguíneas em formas procíclicas de T. brucei................................... 45
4.4 Análise da expressão de fatores selecionados em curvas de crescimento de T. brucei na fase prociclíca. ...................................................................................................................................... 46
4.5 Análise da expressão de fatores selecionados em curvas de crescimento de T. brucei na fase sanguínea. ...................................................................................................................................... 47
4.6 Análise do crescimento de T. brucei na forma procíclica sob indução de estresse. .................... 48
4.7 Ensaios de desfosforilação com fosfatase alcalina...................................................................... 50
4.8 Investigação da modificação pós-traducional dos fatores de iniciação através da purificação de fosfoproteínas. ............................................................................................................................... 50
4.9 Estudo das isformas dos fatores alvo através da eletroforese bidimensional. ............................. 51
4.10 Impacto das mudanças pós-traducionais na interação TbEIF4E3/ TbEIF4G4. ......................... 53
55.. DDiissccuussssããoo ...........................................................................................................................................55
66.. CCoonncclluussõõeess.........................................................................................................................................59
77.. RReeffeerr êênncciiaass bbiibbll iiooggrr ááff iiccaass................................................................................................................60
ix
Lista de abreviaturas 4EBP’s – 4E Binding Proteins (Proteinas de ligação ao 4E)
ADP – Adenosina Difosfato
AREs – AU-rich Elements (Regiões ricas em repetições dos nucleotídeos AU)
ATP – Adenosina Trifosfato
BARP – (brucei Alanine Rich Protein)
BSF – Bloodstream form (Forma sanguine)
CaMKI – Calmodulin-dependent protein Kinase I
CCA – Citrato/Cis-Aconitato
Dcp1/Dcp2 – Decapping Protein 1e 2
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
DTM – Differentiating Trypanosome Medium
DTT – Ditiotreitol
ECL – Enhanced Chemioluminescence (Deteção por quimioluminescência)
eIFs – Eukariotic Initiation Factors (Fatores de Iniciação Eucarióticos)
ERK – Extracellular Signal-Regulated Kinase
GPEET – (Gly-Pro-Glu-Glu-Thr)
GTP – Guanosina Trifosfato
HAT – Human African Trypanosomiasis
Hsp70 – Heat Shock Protein 70
IEF – Isoelectric Focusing
JNK – c-Jun N terminal kinase
kDa – Kilodálton
kDNA – kinetoplast DNA (DNA do cinetoplasto)
MAPK – Mitogen-activated Protein Kinase
MAPKK – MAPK Kinase
MAPKKK – (MAPK Kinase Kinase)
MEK – Map or Erk Kinase
Met – Metionina
MKK2 – Map Kinase Kinase 2
MKs – MAPK-activated Protein Kinases
MNK1 – MAPK-Interacting Kinase 1
Mnks – MAPK-Interacting Kinases
x
mRNA – Ácido Ribonucléico Mensageiro
Msk – Mitogen and stress-activated protein Kinase
mTOR – mammalian Target Of Rapamycin
ORF – Open Reading Frame (Sequência aberta de leitura)
Pak2 – p21-activated protein Kinase 2
PARP – Procyclic Acidic Repetitive Protein
PBS – Phosphate Buffered Saline (Solução salina tamponada com fosfato)
PCF – Procyclic form (Forma procíclica)
pH – Potencial Hidrogeniônico
PI – Ponto Isoelétrico
PIKK – Phosphoinositide-3-kinase-related Kinase
PVDF – Polyvinylidene Fluoride (Polivinilideno Fluorado)
RNA – Ácido Ribonucléico
RNA pol – RNA Polimerase
SDS-PAGE – Sodium Disulfate – Polyacrilamide Gel Eletrophoresis (Gel de poliacrilamida
em condições desnaturantes)
Ser – Serina
SFB – Soro Fetal Bovino
SL – Sequência Spliced Leader ou mini-éxon
Tbpgt – Trypanosoma brucei Putative Glucose Transporter
TBS – Tris buffered Saline (Solução salina tamponada com TRIS)
TCA – Ácido Tricloroacético
Thr – Treonina
tRNA – Ácido Ribonucléico Transportador
tRNAi – tRNA Iniciador
Tyr – Tirosina
uORFs – upstream Open Reading Frames
UTR – Untranslated Region (Região não traduzível)
VSG – Variant surface Glycoprotein (Glicoproteína Variante de Superfície)
W – Triptofano
xi
LL iissttaa ddee ff iigguurr aass Figura 1. Mapa da África ilustrando o status epidemiológico de países considerados endêmicos para a doença do sono . .......................................................................................... 18
Figura 2. Fotomicrografia mostrando a presença do Trypanosoma brucei no sangue ........... 19
Figura 3. Diagrama esquemático do ciclo de vida do Trypanosoma brucei.. .......................... 20
Figura 4. Processamento de mRNAs nos tripanossomatídeos. ................................................ 22
Figura 5. Representação esquemática da iniciação da tradução............................................... 26
Figura 6. O eIF4GI humano e seus domínios de ligação para outras proteínas........................28
Figura 7. Mecanismo de atuação das proteínas quinases. ........................................................ 31
Figura 8. Curva de crescimento de T. brucei na fase procíclica. ............................................. 44
Figura 9. Curvas de crescimento de T. brucei na fase sanguínea............................................. 45
Figura 10. Análise da expressão de fatores selecionados em curvas de crescimento de T. brucei na fase prociclíca.. ......................................................................................................... 47
Figura 11. Análise da expressão de fatores selecionados em curvas de crescimento de T. brucei na fase sanguínea. ......................................................................................................... 48
Figura 12. Comparação do perfil de expressão dos homólogos EIF4E3, EIF4E4 e TbEIF4G4 em curvas de crescimento realizadas na presença e na ausência de SFB. ............................... 49
Figura 13. Ensaio de desfosforilação.. ..................................................................................... 50
Figura 14. Purificação de fosfoproteínas.................................................................................. 51
Figura 15. Eletroforese bidimensional. .................................................................................... 53
Figura 16. Imunoprecipitação do TbEIF4E3............................................................................ 54
xii
LL iissttaa ddee ttaabbeellaass
Tabela 1. Número de quinases e fosfatases que constituem o quinoma e fosfatoma em T. brucei, T. cruzi e L. major........................................................................................................ 35
xiii
RReessuummoo
O Trypanosoma brucei é um protozoário unicelular causador da doença do sono em humanos,
e cujo ciclo de vida se alterna entre dois hospedeiros, sendo a forma procílica encontrada em
insetos vetores e a forma sanguínea em mamíferos suscetíveis. Nesse parasita a regulação da
expressão gênica ocorre basicamente em nível pós-transcricional e a biossíntese de proteínas,
principalmente na etapa denominada iniciação da tradução, é um ponto potencialmente crítico
dessa regulação. Análises genômicas identificaram um número consideravelmente grande de
proteínas quinases, o que levou a especulação de que a fosforilação de proteínas, dentre as
modificações pós-traducionais, também seja um mecanismo chave para eventos dessa
regulação. Em eucariotos, o complexo eIF4F (formado pelas subunidades eIF4A, eIF4E e
eIF4G), auxiliado pela proteína de ligação ao poli-A (PABP), atua na iniciação da tradução e
tem sua atividade regulada por modificações como fosforilação. Este trabalho buscou analisar
a expressão de homólogos selecionados de eIF4E, eIF4G e PABP de T. brucei (TbEIF4E1,
TbEIF4E3 e 4, TbEIF4G4 e 5) e investigar a ocorrência de modificações pós-traducionais que
possam estar associadas ao controle da sua função. Primeiro, curvas de crescimento foram
geradas e extratos protéicos produzidos a partir de células derivadas de pontos selecionados
destas curvas. Foi possível observar que todas as proteínas selecionadas eram expressas ao
longo das curvas em ambas as formas do ciclo de vida do parasita, porém com padrões de
expressão distintos. Os TbEIF4E1 e 3 são as proteínas menos e mais expressas,
respectivamente, em ambas as formas procíclica e sanguínea. Os TbEIF4E3 e 4 e o TbEIF4G4
foram representados por mais de uma isoforma, ao contrário dos demais fatores estudados, e
observou-se que as três proteínas eram encontradas sob formas fosforiladas. Através da
eletroforese bidimensional foi possível visualizar que TbPABP1, TbEIF4E3 e TbEIF4E4
possuem 2, 5 e 4 isoformas, respectivamente, enquanto o TbEIF4AI, não fosforilado, possui
apenas uma. Adicionalmente, foi demonstrado que a fosforilação do TbEIF4G4 não impede
sua a interação com o TbEIF4E3. Esses resultados indicam que a fosforilação é um
mecanismo que parece possuir um papel predominante na regulação da função dos fatores
estudados.
Palavras-chave: tripanossomatídeos, eIF4E, fosforilação.
xiv
AAbbssttrr aacctt Trypanosoma brucei is a unicellular protozoan which in humans causes the sleeping sickness
and whose life cycle alternates between two hosts, its procyclic form being found in insect
vectors and its bloodstream form in susceptible mammals. Regulation of gene expression in
this parasite occurs primarily at the post-transcriptional level and protein synthesis, mainly its
initiation stage, is a potentially critical point of regulation. Genomic analysis identified a
considerably large number of protein kinases, leading to speculation that protein
phosphorylation, among the post-translational modifications, may also be a key mechanism
for such regulation events. In eukaryotes, the eIF4F complex (formed by subunits eIF4A,
eIF4E and eIF4G), assisted by the poly(A)-binding protein (PABP), works in translation
initiation and has its activity regulated by modifications such as phosphorylation. This study
sought to analyze the expression of selected eIF4E, eIF4G and PABP homologues in T. brucei
(TbEIF4E1, TbEIF4E3 and 4 TbEIF4G4 and 5) and to investigate the occurrence of post-
translational modifications which may be associated with control of their function. First,
growth curves were generated and protein extracts made from cells derived from selected time
points. All the chosen proteins were observed to be expressed throughout the curves in both
forms of the parasite’s life cycle, but with distinct expression patterns. TbEIF4E1 and 3 are
the least expressed and the most expressed proteins, respectively, in both procyclic and
bloodstream forms. TbEIF4E3 and 4 and TbEIF4G4 were represented by more than one
isoform, unlike the other proteins studied, and the three proteins were found in
phosphorylated forms. Through two-dimentional electrophoresis it was possible to visualize 2,
5 and 4 isoforms for TbPABP1, TbEIF4E3 and TbEIF4E4, respectively, whilst only one non-
phosphorylated isoform was observed for the TbEIF4AI. In addition, it was shown that
phosphorylation of TbEIF4G4 does not prevent its interaction with TbEIF4E3. These results
indicate that phosphorylation is a mechanism that may have a predominant role in regulating
the function of the translation factors studied.
Keywords: trypanosomatids, eIF4E, phosphorylation.
xv
II nnttrr oodduuççããoo
O Trypanosoma brucei, protozoário unicelular e patógeno responsável pela doença do
sono, é uma das espécies mais conhecidas de tripanosomatídeos, organismos que se destacam
por possuir uma série de particularidades nos seus processos biológicos que os distinguem dos
demais eucariotos. Nesses organismos, diferentes linhas de evidências indicam a biossíntese
de proteínas, ou tradução, como um ponto crítico de regulação da expressão gênica, embora
pouco se conheça em detalhes sobre este processo. Em outros eucariotos a etapa de iniciação
da tradução é a etapa mais complexa do processo e aquela mais sujeita a mecanismos de
regulação. Nessa etapa participa um número elevado de fatores de iniciação da tradução (eIFs
de eukaryotic initiation factors), dentre os quais o complexo eIF4F e a proteína de ligação ao
poli-A (PABP), que atuam no reconhecimento do mRNA e facilitam o recrutamento do
ribossomo para iniciar a síntese de proteínas, propriamente. O complexo eIF4F é formado por
três subunidades: eIF4E, a proteína de ligação ao cap, que reconhece o mRNA na sua
extremidade 5’; eIF4A, uma RNA helicase; e eIF4G, a proteína que estrutura o complexo e
media sua interação com parceiros funcionais, como a PABP. Em estudos prévios foram
identificados seis homólogos de eIF4E, cinco de eIF4G e dois de PABP conservados em
diferentes espécies de tripanosomatídeos. Esta multiplicidade de homólogos para estes fatores
constitui um fato inédito para organismos unicelulares e sugere uma maior complexidade na
sua etapa de iniciação da tradução.
Em estudos prévios, os homólogos de eIF4E, eIF4G e PABP de Leishmania major
tiveram seus genes clonados, expressos em Escherichia coli e utilizados para a produção de
soro policlonal. Estes soros foram utilizados para se analisar a expressão de homólogos
selecionados em amostras representativas das fases do ciclo de vida de espécies de
Leishmania. Nestes ensaios foi observado, para vários homólogos, um padrão de migração em
gel compatível com a existência de isoformas originárias de modificações pós-traducionais,
possivelmente fosforilação. Além disso, para um mesmo homólogo, a expressão de isoformas
distintas se mostrou variável de acordo com as fases de crescimento do parasita, sugerindo
que modificações pós-traducionais poderiam modular sua atividade em resposta às condições
ambientais.
Tendo como referência os resultados obtidos a partir de espécies de Leishmania o
presente trabalho fez uso de soros disponíveis contra os homólogos de eIF4E e eIF4G de T.
brucei, para identificar modificações pós-traducionais e suas implicações na regulação da
síntese protéica. Inicialmente foi analisada a expressão de cada um desses homólogos de
xvi
forma a definir quais são representados por isoformas com padrões diferenciados de
expressão ao longo do cultivo destes organismos. Homólogos selecionados foram então
testados quanto a sua modificação por fosforilação por meio de ensaios de desfosforilação
utilizando fosfatase alcalina e também através de experimentos de purificação de
fosfoproteínas. Em seguida foram correlacionados padrões de modificação de fatores de
tradução com o perfil de migração de isoformas selecionadas em gel bi-dimensional. Os
experimentos executados devem levar a um maior conhecimento tanto do processo de síntese
de proteínas como também dos mecanismos pós-traducionais de regulação da expressão
gênica nos tripanosomatídeos.
17
1. Revisão da literatura
1.1 Kinetoplastídeos
Os kinetoplastídeos são um grupo notável de protistas. Eles abrangem uma enorme
variedade de espécies de vida livre e de patógenos que parasitam invertebrados, vertebrados e
até mesmo plantas (Simpson et al., 2006). Esses protozoários flagelados se distinguem por
conter uma organela chamada cinetoplasto, o qual é composto por uma rede de moléculas de
DNA circulares (kDNA) e localiza-se dentro de uma grande mitocôndria que contém
numerosas cópias do genoma mitocondrial (Hellemond et al., 2005). Do ponto de vista de sua
biologia celular, os diferentes kinetoplastídeos são todos protozoários móveis com um único
flagelo que se origina próximo a sua única e grande mitocôndria e do qual emana uma “bolsa”
da membrana celular, onde a endocitose ocorre; seus peroxissomos são modificados para
realizar glicólise e são então conhecidos como glicossomos; sua membrana celular é revestida
de moléculas espécie-específicas, as quais são críticas para sua sobrevivência; são tipicamente
assexuados e se dividem por fissão binária (Stuart et al., 2008). Apesar das similaridades
existentes, as doenças causadas por suas formas patogênicas são bem distintas.
Dentro da ordem Kinetoplastida se destacam as espécies da família Trypanosomatidae,
tendo em vista àquelas causadoras de doenças em humano, tais como a doença do sono, a
doença de Chagas e as leishmanioses, causadas por espécies dos gêneros Trypanosoma e
Leishmania, que matam e debilitam milhares de pessoas em todo o mundo (Simpson et al.,
2006) e que fazem parte do grupo de doenças conhecido como “doenças negligenciadas”
(Kennedy, 2008). Esses patógenos humanos possuem devastadoras consequências para a
saúde e a economia (Simarro et al., 2008; Stuart et al., 2008) e apresentam um complexo ciclo
de infecção que implica em vários estágios de desenvolvimento, envolvendo um hospedeiro
invertebrado e outro vertebrado.
Cerca de 500 milhões de pessoas, localizadas primariamente em áreas tropicais e
subtropicais do mundo, estão em risco de se infectar com kinetoplastídeos patogênicos, e é
estimado que mais de 20 milhões de indivíduos estejam de fato infectados, resultando em
intenso sofrimento e mais de 100.000 mortes por ano (Stuart et al., 2008). Apesar dessas
doenças matarem milhares de pessoas em regiões tropicais subdesenvolvidas, o tratamento
disponível para elas é geralmente inadequado, e os governos e a indústria farmacêutica até
recentemente têm demonstrado pouco interesse em desenvolver novas drogas para seu
tratamento (Kennedy, 2008).
18
1.2 Trypanosoma brucei e a tripanosomíase africana humana
A tripanosomíase africana humana (HAT- Human African Trypanosomiasis), também
conhecida como doença do sono, é uma das maiores ameaças à saúde de 60 milhões de
pessoas em 36 países na África Subsaariana e é considerada a terceira mais importante doença
parasitária que afeta a saúde humana, depois da malária e esquistossomose (Kennedy, 2008).
A espécie do Trypanosoma brucei, agente causador desta enfermidade, pode ser
subdividida em três subespécies, sendo que duas causam tripanossomíase africana humana.
Na África central e ocidental, T. b. gambiense causa uma forma crônica da doença do sono e
nas regiões do sul e leste africano, T. b. rhodesiense causa uma forma aguda da doença
(Figura 1) (Kennedy, 2008; Simarro et al., 2008).
Figura 1. Mapa da África ilustrando o status epidemiológico de países considerados endêmicos para a doença do sono (Simarro et al., 2008).
Todos os organismos do grupo T. brucei são transmitidos pela mosca tsé-tsé do gênero
Glossina (ordem Diptera), as quais são encontradas exclusivamente na África (Simarro et al.,
2008). Os parasitas se disseminam na corrente sanguínea do hospedeiro uma a três semanas
depois da picada inicial, e invadem os linfonodos e órgãos sistêmicos incluindo o fígado,
19
baço, coração, sistema endócrino e olhos determinando o estágio 1, ou estágio hemolinfático
da doença (Figura 2). Se não tratada, dentro de poucas semanas no caso de infecção causada
por T. b. rhodesiense, ou muitos meses no caso de infecção por T. b. gambiense, os parasitas
atravessam a barreira hematoencefálica e entram no sistema nervoso central, dando início ao
estágio 2, ou estágio encefálico da doença (Barrett et al., 2003; Kennedy, 2008; Stuart et al.,
2008).
Figura 2. Fotomicrografia mostrando a presença do Trypanosoma brucei no sangue (Kennedy, 2008).
O tratamento atual para HAT conta com cinco drogas disponíveis, e todas apresentam
efeitos adversos, problemas de eficácia e administração. Suramina e pentamidina são
utilizadas para tratar o primeiro estágio da doença causado por infecção com T. b. rhodesiense
e T. b. gambiense, respectivamente. Melarsoprol é efetivo contra o segundo estágio da doença
causado por T. b. rhodesiense e T. b. gambiense e eflornitina é apenas ativa para o segundo
estágio da infecção causada por T. b. gambiense. Uma combinação de melarsoprol e
nifurtimox tem se mostrado eficiente nos casos de tratamento do segundo estágio que são
refratários ao tratamento apenas com melarsoprol (Barret et al., 2003; Kennedy, 2008; Stuart
et al., 2008).
1.2.1 O ciclo evolutivo do T. brucei
A infecção do T. brucei no hospedeiro mamífero é iniciada quando formas
metacíclicas são inoculadas pela picada de uma mosca tsé-tsé infectada. Estas se desenvolvem
em formas sanguíneas do tipo alongadas, que se multiplicam no sangue para estabelecer a
infecção. À medida que o seu número aumenta, um fator derivado do parasita promove parada
da divisão celular e a geração de formas mais curtas e espessas. Uma vez que essas células
são ingeridas pelas moscas tsé-tsé elas se transformam em formas procíclicas (Fenn e
Matthews, 2007). Esse processo de diferenciação de formas sanguíneas em formas procíclicas
20
também pode ser reproduzido in vitro mediante a redução da temperatura e exposição dos
parasitas a citrato/cis-aconitato (CCA) (Czichos et al., 1986). Outros fatores também podem
atuar estimulando a diferenciação, como a exposição da superfície dos parasitas a tratamento
com protease (Sbicego et al., 1999) e submissão dos parasitas a condições de estresse como a
redução do pH (Figura 3) (Rolin et al., 1998).
As formas procíclicas se desenvolvem inicialmente como formas iniciais, e que
expressam como proteínas de superfície prociclinas do tipo GPEET (Gly-Pro-Glu-Glu-Thr),
mas à medida que se transformam nas formas procíclicas tardias os níveis dessa expressão são
reduzidos. Através de uma divisão assimétrica essas células originam uma forma longa e uma
forma curta, sendo esta última capaz de aderir nas glândulas salivárias e se transformar em
formas epimastigotas proliferativas, as quais expressam na superfície BARP (brucei Alanine
Rich Protein). Eventualmente células epimastigotas sofrem maturação gerando formas
metacíclicas, que expressam VSG (Variant Surface Glycoprotein – Glicoproteínas Variantes
de Superfície) e estão prontas para serem transmitidas para um novo hospedeiro mamífero
(Fenn e Matthews, 2007).
Figura 3. Diagrama esquemático do ciclo de vida do Trypanosoma brucei. O parasita Trypanosoma brucei apresenta diferentes formas celulares durante a transição entre o hospedeiro vertebrado e invertebrado. Meta= metacíclico (metacyclic); SL= sanguineo alongado (bloodstream slender); SIF= fator de indução de formas curtas (stumpy induction factor); ST= formas curtas (stumpy forms); PC= formas procíclicas (procyclic forms); PV= formas proventriculares (proventricular forms); Epi= formas epimastigotas (epimastigote forms) (Fenn e Matthews, 2007).
Assim, durante todo o seu ciclo de vida, o T. brucei se alterna de uma maneira bem
regulada entre células proliferativas e células em diferenciação. Esses eventos ocorrem em
21
resposta aos diferentes ambientes dos hospedeiros e envolvem coordenadas cascatas de vias
de sinalização e um preciso controle da expressão gênica.
1.3 Regulação da expressão gênica nos tripanossomatídeos
A regulação da expressão gênica é um processo central que define o fenótipo de uma
célula ou organismo. Na grande maioria dos casos, esse processo é controlado através de
regulação da transcrição, no qual sequências do DNA juntamente com proteínas de ligação ao
DNA direcionam a transcrição de genes codificadores de proteínas pela RNA polimerase
(RNA pol) II. Os tripanosomatídeos se destacam entre os demais eucariotos, e mesmo em
comparação com procariotos, uma vez que os únicos genes codificantes de proteínas
regulados em nível transcricional são aqueles que codificam as proteínas de superfície
prociclinas e VSGs. Estes genes, contudo, são transcritos pela RNA Pol I, que é usada
exclusivamente para a transcrição de DNA ribossomal em outros organismos (Clayton e
Shapira, 2007; Bayele, 2009). A forma de regulação mais comum de seus transcritos maduros,
sintetizados e processados de forma única, como descrita a seguir, parece ocorrer ao nível
pós-transcricional. Exemplos desse tipo de regulação nos tripanosomatídeos já foram
observados controlando a estabilidade e/ou degradação de mRNAs específicos. Múltiplas
evidências, entretanto, apontam para um componente importante de controle da tradução dos
mRNAs, na síntese protéica, na regulação da sua expressão gênica. Da mesma forma o
controle da atividade de proteínas, via modificações pós-traducionais, também parece exercer
um papel relevante nessa regulação nestes organismos (Clayton e Shapira, 2007).
1.3.1 Promotores, RNA polimerases e transcricão policistrônica
O genoma do T. brucei contém aproximadamente 8.000 genes que são transcritos
principalmente de forma policistrônica pela RNA polimerase II e essa transcrição se inicia em
poucos sítios do genoma (Berriman et al., 2005). Poucos promotores para a RNA pol II foram
identificados até o momento, mas nenhum deles tem as características de um promotor típico
tais como as caixas TATA e CCAAT. Estes promotores incluem os genes do spliced leader
(SL), actina, heat shock protein 70 (HSP70), PARP (Procyclic Acidic Repetitive Protein) e
VSG (Clayton et al., 1990; Zomerdijk et al., 1990; Ben Amar et al., 1991; Sherman et al.,
1991; Brown et al., 1992; Lee, 1996; Lee e van der Ploeg, 1997; Wilson et al., 1999; Gilinger
and Bellofatto, 2001). Recentemente foi caracterizado um putativo promotor do gene Tbpgt
22
(Trypanosoma brucei Putative Glucose Transporter) que é transcrito pela RNA pol II e que
possui as caixas TATA e CCAAT e um elemento iniciador, evidenciando que a maquinaria de
transcrição presente nos eucariotos pode ser conservada nos tripanossomatídeos com uma
estrutura do promotor similar à de leveduras. Este estudo foi a primeira descrição de um
promotor que possui elementos canônicos para a pol II dentro do grupo dos kinetoplastídeos
(Bayele, 2009).
Diferentemente dos óperons bacterianos, a maioria dos genes em uma unidade
policitrônica nos kinetoplastídeos, não são funcionalmente relacionados. Esses policistrons
formam mRNAs monocistrônicos maduros através do mecanismo de processamento em
trans-splicing, que é um processo similar ao cis-splicing, mas que ocorre entre dois RNAs
precursores transcritos em diferentes locais do genoma (Palenchar e Bellofatto, 2006; Clayton
e Shapira, 2007; Jäger et al., 2007). Durante o trans-splicing uma sequência de 39
nucleotídeos, denominada spliced leader e ligada ao cap típico dos tripanossomatídeos, é
adicionada na região 5’ do mRNA. Nos tripanosomatideos o cap é modificado por sete
metilações, composta de 2’-O-metilações na ribose dos primeiros quatro nucleotídeos
(AACU), com metilações adicionais sobre as bases do primeiro (m6,6A) e do quarto (m3U)
nucleotídeos, formando a estrutura altamente complexa m7guanosina(5’)ppp-N6,N6,2-O-tri-
metil-adenosina-p-2-O-metiladenosina-p-2-O-metil-citosina-p-3,2-O-di-metil-uridina, que foi
denominada de cap4 (Bangs et al., 1992; Mittra et al., 2008). O sítio aceptor para o
processamento no pré-mRNA é o dinucleotídeo AG quando localizado imediatamente após
uma região rica em pirimidinas. Esse processo acontece interligado à poliadenilacão dos
RNAs na sua regiao 3’, levando a formação dos mRNAs monocistrônicos maduros prontos
para serem traduzidos. O sítio de poliadenilação é localizado cerca de 100-300 nucleotídeos
acima do sinal de trans-splicing, dessa forma, esta região serve tanto de sinal para a
poliadenilação do cistron (gene) anterior, como para a adição da sequência SL no cistron
posterior (Figura 4) (Liang et al., 2003; Clayton e Shapira, 2007).
Figura 4. Processamento de mRNAs nos tripanossomatídeos. Um mesmo trato de polipirimidinas (Py) serve com sinal de trans-splicing para o mRNA contendo a ORF2 (Open Reading Frame-Sequência aberta de leitura), e de sinal de poliadenilação para o mRNA contendo a ORF1 (Benz et al., 2005).
23
Estudos também demonstraram que a omissão do evento de splicing em determinados
sítios também pode ser parte dos mecanismos pós-transcricionais que regulam a expressão
gênica nos tripanosomatídeos, através da geração de moléculas de RNAs prematuras não-
traduzíveis. Esses RNAs intermediários são formados no núcleo e então exportados para o
citoplasma. Dependendo das necessidades da célula, eventualmente esses RNAs podem ser
reimportados para o núcleo para serem processados em monocistrons, gerando mRNAs que
podem ser traduzidos (Jäger, 2007).
1.3.2 Controle da estabilidade e degradação dos mRNAs
Os níveis de mRNAs em células eucarióticas são regulados em parte via controle de
sua estabilidade (Mitchell e Tollervey, 2001; Wilusz et al., 2001). O tempo de meia-vida de
cada mRNA pode ser alterado em resposta a vários sinais internos e externos. Esses sinais são
capazes de modificar a expressão gênica através da regulação das vias de turnover do RNA. O
processo que regula a estabilidade dos mRNAs é mediado por uma complexa rede de
interações entre proteínas e entre proteínas e RNAs. Para que essas interações ocorram são
fundamentais a presença do cap e da cauda poli(A) dos mRNAs. A remoção dessas estruturas
leva a uma instabilidade dos mRNAs e ao turnover da molécula de RNA (Milone et al.,
2002).
Processos envolvidos no controle da estabilidade e na degradação do mRNA, como a
desadenilação e a remoção do cap (decapping), parecem ocorrer também nos mRNAs dos
tripanossomatídeos. A desadenilação, processo em que enzimas conhecidas como
desadenilases promovem a redução e/ou eliminação da cauda poli-A, já foi demonstrada em
extratos de trypanosomas e ocorre durante a degradação de mRNAs in vivo (Haile et al.,
2003; Li et al., 2006). A atividade de deccaping foi verificada em extratos de Leptomonas
seymouri, onde foi observado que as enzimas responsáveis pela remoção do cap são
funcionalmente equivalentes às enzimas de levedura Dcp1/Dcp2 (decapping protein 1e 2)
(Milone et al., 2002).
Em mamíferos, as regiões 3’ UTRs (Untranslated Region - Região não traduzível)
contêm sequências envolvidas no controle da meia-vida dos transcritos e na modulação da
eficiência da tradução. Em particular, sequência ricas em nucleotídeos AU (AU-rich elements
– AREs) são capazes de ligar motivos de reconhecimento do RNA, os quais modificam a
meia-vida dos RNAs (Barreau et al., 2005). Sequências similares às AREs de mamíferos
estão presentes em vários mRNAs regulados nos kinetoplastídeos (D'Orso e Frasch, 2001;
24
Quijada et al., 2002) e alguns motivos de ligação a sequências desse tipo já foram
identificados no genoma dos tripanossomatídeos (De Gaudenzi et al., 2005).
1.4 Síntese protéica em eucariotos
A expressão gênica é regulada em múltiplos estágios, incluindo a tradução de mRNAs
em proteínas. Comparado com a regulação transcricional, o controle traducional de RNAs
existentes permite mudanças mais rápidas na concentração de proteínas específicas,
facilitando a manutenção da homeostase celular (Sonenberg e Hinnebusch, 2009).
O processo de tradução pode ser dividido em iniciação, elongação, terminação e
reciclagem dos ribossomos (Acker e Lorsch, 2008; Sonenberg e Hinnebusch, 2009). Enquanto
as fases de elongação e terminação envolvem a atuação de um grupo limitado de fatores, a
etapa da iniciação da tradução em eucariotos é um evento complexo que é assistido por mais
de 25 polipetídeos (Gebauer e Hentze, 2004). Assim essa etapa, que se encerra com a
identificação do códon AUG inicial da sequência codificadora e com a montagem do
ribossomo sobre o mesmo, é a mais sujeita a eventos regulatórios.
1.4.1 O processo da iniciação da tradução
A iniciação da tradução é o conjunto de eventos que conduz a formação do ribossomo
80S no mRNA, no qual o códon AUG é pareado com o anticódon do Met-tRNAi (tRNA
codificante da metionina inicial) no sítio peptidil (P) do ribossomo. O códon AUG de
iniciação da tradução é geralmente identificado pelo processo de rastreamento (scanning), no
qual a subunidade menor ribossomal mais o Met-tRNAi, formando um complexo de pré-
iniciação, se liga ao mRNA na região 5’ e se desloca ao longo da 5’UTR até encontrar um
códon AUG no contexto correto. Consequentemente, estruturas no RNA que impedem a
habilidade dos ribossomos em interagir com a 5’UTR, bloqueando o deslocamento dos
ribossomos, reduzem a eficiência da iniciação (Besse e Ephrussi, 2008; Sonenberg e
Hinnebusch, 2009).
O mRNA é ativado para a ligação do complexo de pré-iniciação através de fatores de
iniciação eucarióticos (eIFs – Eukariotic Initiation Factors), os quais reconhecem a estrutura
cap (7-metil-Guanosina) na região 5’ do mRNA ou a cauda poli(A), na sua região 3’, com a
ajuda da proteína de ligação a cauda poli-A (PABP) (von der Haar et al., 2004) (Figura 5).
Esse processo de ativação pode ser abolido através da inativação dos eIFs, reduzindo a
tradução da maioria dos mRNAs em condições de estresse e privação (Pestova et al., 2007;
25
Sonenberg e Hinnebusch, 2009). O complexo de pré-iniciação 43S contendo o Met-tRNAi e
os eIFs 1, 1A, 2, 3, 5 e mais a subunidade menor ribosomal é recrutado para o cap do mRNA,
sendo esse processo facilitado pela proteína de ligação ao cap eIF4E e seus parceiros, eIF4G e
eIF4A, dentro do fator heterotrímerico eIF4F. Esse complexo desloca-se no sentido 5’-3’pela
região 5’ não-traduzida do mRNA (5’-UTR), inspecionando sucessivas trincas, à medida que
elas entram no sítio P, por complementaridade com o anticódon do Met-tRNAi (von der Haar
et al., 2004; Pestova et al., 2007). O Met-tRNAi é ancorado ao complex 43S através do eIF2-
GTP, e no momento em que acontece um pareamento correto com o códon AUG ocorre a
parada do processo de rastreamento e uma hidrólise irreversível do GTP no complexo ternário
eIF2-GTP/Met-tRNAi (Gebauer e Hentze, 2004; Kapp e Lorsch, 2004; Besse e Ephrussi,
2008). Nessa etapa o eIF1 atua regulando a seleção do códon AUG correto e o fator eIF5
estimula a hidrólise do GTP ligado ao eIF2. Esta hidrólise promove a liberação dos fatores
ligados à subunidade 40S e sua associação à subunidade 60S, o que reconstitui o ribossomo
80S e o torna apto a aceitar o segundo aminoacil-tRNA no seu sítio A (aminoacil), de acordo
com a sequência do segundo anticódon, e realizar a primeira ligação peptídica (Sonenberg e
Hinnebusch, 2009). A fase de elongação da tradução que se segue é caracterizada pela adição
de aminoácidos no peptídeo crescente e pela translocação dos ribossomos ao longo do mRNA.
Finalmente, a terminação da tradução é associada com a liberação do peptídeo sintetizado e
pela dissociação das subunidades 60S e 40S do ribossomo que são recicladas para novo ciclo
de tradução (Kapp e Lorsch, 2004; Acker e Lorsch, 2008; Besse e Ephrussi, 2008).
26
Figura 5. Representação esquemática da iniciação da tradução. A iniciação da tradução requer a associação do complexo eIF4F (que consiste do fator eIF4E, eIF4A e eIF4G) e da PABP com o cap na região 5’ do mRNA e com sua cauda poli-A. O fator eIF2 liga o Met-tRNAi à subunidade ribossomal 40S. O fator eIF3 é um complexo multimérico e interage com o eIF4G, o qual atua como um adaptador para o recrutamento do mRNA, e contém sítios para a ligação do eIF4E, PABP, eIF4A e para a quinase do eIF4E MNK1. Os fatores eIF1, eIF1A, eIF2, eIF3, eIF5 se ligam à subunidade 40S durante determinados momentos da iniciação da tradução. As proteínas 4E-BPs (4E Binding Proteins - Proteínas de ligação ao 4E) competem com o eIF4G pela ligação com o eIF4E. De maneira a favorecer a tradução cap-dependente, a fosforilação do 4E-BP, através da via mTOR (Mammalian Target of Rapamycin), enfraquece a ligação com o eIF4E, o qual passa a se ligar ao eIF4G promovendo a tradução.
1.4.2 Complexo eIF4F e PABP
Como foi visto, os fatores de iniciação do complexo eIF4F, auxiliados por outros
fatores da tradução, permitem o reconhecimento do mRNA pela subunidade ribossomal 40S e
o início do processo da tradução. O eIF4F é composto por três polipeptídeos: (1) eIF4A, uma
RNA helicase ATP-dependente que remove as estruturas secundárias ao longo da 5’UTR do
mRNA, permitindo o recrutamento da subunidade ribossomal 40S e seu deslocamento até o
códon de inciação da tradução; (2) eIF4E, responsável pelo reconhecimento específico do cap
na extremidade 5’ do mRNA e (3) eIF4G, proteína que possui sítios de ligação para o eIF4E,
eIF4A, PABP e eIF3. Desta forma, o eIF4F interage tanto com o cap (através do eIF4E)
quanto com o eIF3 associado a subunidade 40S ribosomal (através do eIF4G), o que permite a
27
ligação entre o mRNA e o ribossomo (Figura 5) (Gingras et al., 1999; Sonenberg e Dever,
2003; Brook et al., 2009).
1.4.2.1 eIF4E
O fator eIF4E é uma proteína de 25 KDa responsável pelo reconhecimento do cap,
sendo essencial na tradução cap-dependente. A maioria dos eucariotos expressa múltiplos
membros da família eIF4E. Este fator apresenta a forma de mão em concha, sendo a parte
côncava responsável pelo reconhecimento e ligação ao cap e a parte convexa interage com o
eIF4G. O reconhecimento específico do cap acontece através de interações entre a guanosina
metilada e os anéis aromáticos de dois triptofanos conservados (W56 e W102 em
camundongo). Uma estabilização adicional é mediada pelo radical metil do cap, o qual
introduz cargas positivas nessa estrutura aumentando a estabilidade do empacotamento
(Marcotrigiano et al., 1997; Gingras et al., 1999; von der Haar et al., 2004). Além de atuar no
processo de iniciação da tradução o eIF4E também atua no controle da estabilidade e no
processo de exportação nuclear de alguns mRNAs (von der Haar et al., 2004).
A atividade do eIF4E no complexo eIF4F é regulada por proteínas da família 4E-BPs
(4E-BP1, 4E-BP2 e 4E-BP3), as quais competem com o fator eIF4G para se ligarem ao eIF4E
e assim inibirem a tradução cap-dependente. A ligação das 4E-BPs ao eIF4E é regulada
mediante a fosforilação através da via de sinalização mTOR. Quando hiperfosforiladas, as 4E-
BPs não conseguem interagir com o eIF4E, tornando-se hábeis a realizar esta interação apenas
quando hipofosforiladas (Sonenberg e Hinnebusch, 2009).
Apesar de alterações nos níveis de expressão do fator eIF4E não interferirem ou então
apenas afetar moderadamente a tradução global, essas alterações podem ter grandes efeitos na
fisiologia celular, uma vez que a superexpressão do eIF4E pode causar transformação maligna
das células e está associada a uma série de tumores humanos (von der Haar et al., 2004).
1.4.2.2 eIF4G
Em mamíferos, a família do eIF4G é composta por três grandes proteínas (eIF4GI,
eIF4GII e p97) que têm papéis críticos na iniciação da tradução cap-dependente e cap-
independente. eIF4GI e eIF4GII parecem ser funcionalmente equivalentes, pois as duas
proteínas se ligam aos mesmos fatores de tradução e as duas possuem atividade estimulatória
da tradução in vitro e in vivo (Gradi et al., 1998). A p97, por sua vez, só possui homologia
com a região carboxi-terminal dos dois eIF4Gs, e não possui os sítios de ligação para o eIF4E
28
e a PABP na sua região amino-terminal. Ensaios de tradução in vitro demonstraram que p97
ativa a tradução cap-independente (Hundsdoerfer et al., 2005). Outro estudo observou que a
depleção de p97, ao contrário de eIF4GI, não impediu a tradução de certos mRNAs contendo
uORFs (upstream Open Reading Frames), sugerindo que esse fator promove a iniciação da
tradução de diferentes classes de mRNAs (Ramírez-Valle et al., 2008).
A complexidade do eIF4G pode ser refletida pela sua estrutura, a qual possui vários
sítios de ligação para outras proteínas, atribuindo a este fator um papel multifuncional.
Através da interação do eIF4G com a PABP ocorre uma mudança conformacional que
aumenta a interação do complexo eIF4F com o cap promovendo a circularização do mRNA
(Prevôt et al., 2003; Sonenberg e Dever, 2003). Assim o eIF4G atua como uma plataforma
interagindo com diversos fatores e favorecendo o processo de iniciação da tradução (Figura
6).
Figura 6. O eIF4GI humano e seus domínios de ligação para outras proteínas. O eIF4GI possui na sua região N-terminal os sítios de ligação para a PABP e eIF4E. Na região central desta proteína, encontra-se o domínio central de ligação ao eIF4A e ao eIF3. Na parte C-terminal, se encontra um segundo sítio de ligação ao eIF4A e o sítio de ligação da quinase Mnk1 (Prevôt et al., 2003).
1.4.2.3 eIF4A
Três homólogos de eIF4A já foram estudados em humanos: eIF4A-I, eIF4A-III e
eIF4A-II (Sudo et al., 1995; Li et al., 1999; Hernández e Vazquez-Pianzola, 2005). O fator de
iniciação da tradução eIF4A-I, é uma RNA helicase que é ativa durante a iniciação da
tradução (Hernández e Vazquez-Pianzola, 2005). Uma grande quantidade de informações
bioquímicas e genéticas demonstram que o eIF4A participa na iniciação da tradução como
parte do complexo eIF4F. O eIF4A provavelmente também interage diretamente com o eIF4B
e essa interação deve levar a uma ligação mais eficiente ao RNA alvo e, consequentemente, a
uma elevação nas atividades de helicase e ATPase. Assim, o eIF4A atua desfazendo estruturas
secundárias na região 5’UTR do mRNA como parte do complexo eIF4F, durante a etapa de
ligação do complexo de pré-iniciação 43S ao mRNA e durante o rastreamento na busca pelo
códon AUG de iniciação da tradução (Cordin et al., 2006). Já o eIF4A-III faz parte do
complexo de junção de éxons (EJC de exon junction complex), o qual é formado durante o
processo de retirada dos íntrons (splicing) dos mRNAs e o eIF4A-II pode ser considerado
29
uma isoforma do eIF4A-I, mas sua real função é desconhecida (Hernández e Vazquez-
Pianzola, 2005).
1.4.2.4 PABP
As PABPs possuem papel crucial nas vias da expressão gênica. Elas se ligam à cauda
Poli(A) dos mRNAs maduros ou recém-sintetizados e atuam em vários processos como
poliadenilação, exportação, tradução e turnover dos transcritos aos quais se ligam. Além
disso, essas proteínas fornecem uma plataforma para a ligação de outros fatores que também
agem nesses processos e inibem a ligação de fatores que degradam o mRNA (Mangus et al.,
2003; Brook et al., 2009).
No citoplasma, a associação da PABP com a cauda poli(A) dos mRNAs promove a
interação entre suas extremidades 5’ e 3’, o que estimula a inciação da sua tradução. A
circularização do mRNA promove o recrutamento da subunidade ribossomal 40S e esse
processo é dependente de interações entre o fator eIF4G e a PABP e de interações paralelas
entre o eIF4G e a proteína de ligação ao cap eIF4E (Tarun e Sachs, 1996; Tarun et al., 1997;
Wells et al., 1998). A interação cooperativa entre essas proteínas aumenta a afinidade do
eIF4E pelo cap do mRNA, estimula a atividade de ligação ao RNA da PABP e eleva as
atividades de RNA helicase e ATPase do eIF4A e eIF4B (Haghighat e Sonenberg, 1997; Le et
al., 1997; Ptushkina et al., 1998; Bi e Goss, 2000; Borman et al., 2000). A combinação desses
efeitos assegura uma tradução preferencial de mRNAs contendo o cap e a cauda poli-(A) e
também pode favorecer a reciclagem dos ribossomos da região 3’ para a 5’ do mesmo mRNA
(Bi e Goss, 2000; Sachs, 2000).
1.4.3 Síntese protéica em tripanossomatídeos
O processo de tradução nos tripanossomatídeos ainda é pouco compreendido, e até o
momento existem poucas informações sobre a atuação dos diversos fatores que atuam no
evento da iniciação da tradução. Trabalhos preliminares de caracterização de homólogos
individuais de PABP (Batista et al., 1994; Bates et al., 2000) e eIF4A (Skeiky et al., 1998) já
foram realizados há algum tempo, porém sem uma maior investigação de seu papel funcional.
Com o sequenciamento dos genomas das espécies T. brucei, T. cruzi e L. major foi possível a
identificação de sequências que apresentavam homologia à maioria dos fatores eucarióticos de
iniciação da tradução. Apesar de possuírem diferentes graus de similaridades, estas sequências
apresentam semelhanças entre as espécies de tripanosomatídeos, o que indica que elas devem
30
ser conservadas e desempenham papéis importantes nestes parasitas. Um dado novo foi a
existência de múltiplas sequências para homólogos de eIF4E (6 homólogos - EIF4E1, EIF4E2,
EIF4E3, EIF4E4, EIF4E5 e EIF4E6) e eIF4G (EIF4G1, EIF4G2, EIF4G3, EIF4G4 e EIF4G5)
(Dhalia et al., 2005), além de dois homólogos de PABP conservados em todos os
tripanosomatídeos (PABP1 e PABP2 - em Leishmania existe um terceiro homólogo de PABP
não conservado).
Em L. major, foi constatado que dentre as isoformas estudadas, os fatores LmEIF4E1 e
LmEIF4E4 se ligaram ao cap 4 e ao 7-metil-GTP com maior eficiência, sendo por isso
considerados os candidatos mais prováveis a serem ativos na tradução (Yoffe et al., 2006).
Além disso, tanto em T. brucei como em L. major, apenas o LmEIF4AI parece estar
envolvido na iniciação da tradução. Em L. major, apenas o LmEIF4AI foi capaz de interagir
com o domínio HEAT do fator LmEIF4G3 e, em T. brucei, essa proteína apresentou
localização citoplasmática, e a redução no seu nível intracelular reduziu drasticamente a
síntese protéica (Dhalia et al., 2006). Em relação aos homólogos do eIF4G em L. major, o
LmEIF4G3 já teve sua caracterização iniciada e foi possível observar que essa proteína
interage com o LmEIF4AI e com o eIF4A humano, dando indícios de que esse fator atua no
processo de iniciação da tradução (Dhalia et al., 2005). Recentemente, um estudo sobre o
papel do hómologo eIF4G3 de L. major demonstrou que em um ensaio utilizando uma coluna
m7GTP-sefarose, esse fator foi eluido juntamente com outras subunidades do complexo
eIF4F e que ele se liga diretamente ao LmEIF4E. Posteriormente, a interação LmEIF4G3 a
homólogos de eIF4E também foi confirmada através de ressonância magnética nuclear (Yoffe
et al., 2009).
1.5 Modificações pós-traducionais de fatores de tradução via fosforilação
As modificações pós-traducionais representam o mecanismo mais comum pelo qual as
funções das proteínas podem ser alteradas. Em muitos casos, múltiplas modificações podem
ocorrer em um único polipeptídio que podem envolver complexos mecanismos regulatórios
que controlam as funções das proteínas (Yang, 2005). A fosforilação é a modificação pós-
traducional mais estudada (Cohen, 2001) e, uma vez que existem aproximadamente 500
proteínas quinases no genoma humano (Manning et al., 2002), as quais podem se auto-regular
e possuem no mínimo um alvo específico, o número de sítios de fosforilação regulatórios
deve ser da ordem de milhares (Figura 7). Aproximadamente um terço de todas as proteínas
eucarióticas é modificado por fosforilação em resíduos de serina (Ser), treonina (Thr), ou
tirosina (Tyr) durante seu tempo de atividade na célula. Esses eventos de fosforilação
31
controlam então um enorme número de funções celulares (Roach, 1991; Cohen, 2000;
Holmberg et al., 2002; Walsh et al., 2005). Assim, não é de surpreender que eventos de
fosforilação anormais sejam observados em muitas doenças humanas, inlcuindo câncer,
diabetes, hipertensão, ataques cardíacos e artrite reumatóide (Cohen, 2001). Na tradução, a
fosforilação de proteínas tais como as proteínas ribossomais (Roux e Blenis, 2004), eIFs
(Topisirovic et al., 2004; Rush et al., 2005), fatores de elongação (Knebel et al., 2002) e a
PABP (Pierrat et al., 2007), contribuem para a regulação geral da expressão gênica no nível
de síntese protéica.
Figura 7. Mecanismo de atuação das proteínas quinases. O ciclo catalítico básico para a fosforilação de um substrato por uma quinase inicia-se com a ligação do ATP ao sítio ativo da quinase. Esta etapa é seguida pela ligação do substrato ao sítio ativo. Uma vez ligado, o fosfato do ATP é transferido para um resíduo de serina, treonina, ou tirosina do substrato. Após o evento de fosforilação o substrato desliga-se da quinase e uma molécula de ADP é liberada (Ubersax e Ferrell, 2007).
1.5.1 Vias de sinalização que regulam a fosforilação dos fatores de iniciação da tradução
É evidente que o status de fosforilação pode regular a atividade de fatores da tradução
e recentes avanços têm fornecido abundantes evidências de que em particular duas cascatas de
sinalização possuem papéis críticos nesse processo: a mTOR/PI3K/Akt e MAPK (Raught e
Gingras, 2007).
32
1.5.1.1 mTOR
As proteínas TOR (target of rapamycin) são proteínas quinases de alto peso
molecular, conservadas evolutivamente, e que possuem papéis chave no crescimento e
proliferação celular (Lorberg e Hall, 2004). Essas quinases fazem parte da família PIKK
(Phosphoinositide-3-Kinase-related Kinase) (Richardson et al., 2004) e, quando complexadas
com a proteína raptor, são fortemente inibidas pelo antibiótico rapamicina (Kim et al., 2002).
As proteínas mTOR (Mammalian Target Of Rapamycin) atuam como checkpoint no
controle da tradução, recebendo sinais de hormônios/fatores de crescimento e de sensores de
nutrientes, e assim permitem que a tradução ocorra somente na presença de nutrientes
suficientes para suprir a síntese protéica. Um grande número de estudos indica que a
fosforilação de vários fatores de tradução (eIF4B, eIF4GI, e eEF2) é mediada pela sinalização
da via mTOR (Holz et al., 2005; Raught e Gingras, 2007).
Além do exposto, as proteínas mTOR controlam um dos eventos críticos na formação
do complexo de iniciação da tradução. A fosforilação do 4E-BP1 através de mTOR impede a
interação entre 4E-BP1 e eIF4E , liberando o eIF4E para interagir com o eIF4G, estimulando
assim a tradução cap-dependente (Cully e Downward, 2009). Entretanto, ao contrário dos
componentes que ativam a cascata de mTOR, o mecanismo de sinalização para as moléculas
ativadas pela via mTOR permanece pouco compreendido (Raught e Gingras, 2007).
1.5.1.2 MAPK
Cada cascata de sinalização que envolve uma MAPK (Mitogen-Activated Protein
Kinase) inicia-se a partir da ativação de uma MAPKKK (MAPK Kinase Kinase), que fosforila
e ativa uma MAPKK (MAPK Kinase), a qual por sua vez fosforila e ativa uma MAPK. As
MAPKs podem fosforilar e ativar quinases adicionais, conhecidas coletivamente como MKs
(MAPK-activated protein Kinases). A cascata clássica consiste de Raf (MAPKKK), MEK1 ou
2 (Map or Erk Kinase; MAPKK), e ERK 1 ou 2 (Extracellular Signal-Regulated Kinase;
MAPK). A proteína Raf é responsável por acoplar a cascata de ERK à GTPase Ras: a ativação
de Ras através de fatores de crescimento ou ésteres de forbol ativa a cascata inteira,
resultando na ativação de ERK. Em adição à fosforilação direta de vários substratos nucleares,
a ativação de ERKs pode também fosforilar e ativar três distintas famílias de MK: as famílias
Rsk, MsK, e Mnk (Raught e Gingras, 2007). Outras cascatas de MAPK são
especializadas em transmitir os sinais de estresse (Johnson e Lapadat, 2002). As proteínas
quinases ativadas pelo estresse incluem as famílias JNK e p38MAPK. MKs são ativadas por
33
p38MAPK, sendo que algumas dessas MKs também são ativadas através de ERK (MnK1 e as
MsKs) (Roux e Blenis, 2004).
Várias famílias de MKs parecem ser importantes para o controle da iniciação da
tradução: (1) As Mnks (MAPK-interacting Kinases) são fosforiladas e ativadas por ERKs
(Mnk1 e Mnk2) e por p38MAPKs (MnK1), repassando assim os sinais vindos através da
estimulação de fatores de crescimento e estresse (Fukunaga e Hunter, 1997; Wang et al.,
1998). As Mnks conectam as MAPKs à iniciação da tradução via fosforilação do eIF4E e a
quinase Msk1 (Mitogen and Stress-activated protein Kinase 1) media a fosforilação do 4E-
BP1 induzida por radiação ultravioleta do tipo B (Liu et al., 2002).
1.5.1.3 Outras vias Apesar de não serem bem caracterizados, outros módulos de sinalização têm sido
implicados no controle da iniciação da tradução. Pak2 (p21-Activated protein Kinase 2) é
ativada em resposta a vários tipos de estresse celular e pode ser responsável por fornecer um
sinal inibitório para a tradução via fosforilação do eIF4GI (Ling et al., 2005). A sinalização
através da via Ca2+/Cam também possui um papel no controle da tradução, uma vez que a
fosforilação da proteína eIF4GII é mediada por CaMKI (calmodulin-dependent protein kinase
I) (Qin et al., 2003).
1.5.2 Eventos de fosforilação nos fatores de iniciação da tradução em mamíferos
1.5.2.1 eIF4E
A fosforilação do eIF4E de mamíferos ocorre principalmente em um único resíduo,
Ser-209 (Joshi et al., 1995; Whalen et al., 1996), e é mediada através das quinases Mnk1 e
Mnk2 (Fukunaga e Hunter, 1997; Wang et al., 1998; Pyronnet et al., 1999; Waskiewicz et al.,
1999). As Mnks interagem fisicamente com o eIF4G, localizando efetivamente as quinases
nos seus substratos (Pyronnet et al., 1999). O nível de fosforilação do eIF4E pode ser elevado
em decorrência do estímulo de fatores de crescimento, insulina, tratamento das células com
soro e através de certas citocinas (Scheper e Proud, 2002).
1.5.2.2 EIF4G
34
Mapeamento de fosfopetídeos através de análise bidimensional e espectometria de
massa demonstraram que três sítios de fosforilação, Ser-1148, Ser-1188, e Ser-1232, foram
identificados na região que une os domínios amino e carboxi-terminal do eIF4GI (Raught et
al., 2000). Estes resíduos não são conservados no eIF4GII ou p97. A via de sinalização de
PI3K/mTOR atua regulando a fosforilação de todos os três resíduos em resposta a estimulação
hormonal ou mitogênica. Estudos proteômicos em larga escala, identificaram sítios de
fosforilação adicionais no eIF4GI: Tyr-594 (Rush et al., 2005), Ser-1146 (Kim et al., 2005) e
Ser-1210 (Beausoleil et al., 2004). A quinase Pak2, em resposta ao estresse celular, fosforila a
Ser-896 do eIF4GI e inibe a tradução, possivelmente através da inibição da ligação ao cap ou
da dissociação do complexo eIF4G- eIF4E (Ling et al., 2005).
O eIF4GII também foi identificado como uma fosfoproteína em um screnning de
fosforilação utilizando a CaMKI, uma proteína quinase dependente de Ca2+/calmodulina,
(Qin et al., 2003). Consistente com essa informação, a fosforilação do eIF4GII demonstrou
ser sensível à ionomicina (ionóforo de cálcio). O sítio de fosforilação da CaMKI no eIF4GII
localiza-se na Ser-1156.
1.5.2.3 PABP
A PABP também é uma fosfoproteína e atua em conjunção com o eIF4E e o eIF4G
para estimular a tradução cap-dependente. Até pouco tempo atrás, a fosforilação da PABP1
ainda não tinha sido demonstrada em vertebrados, mas múltiplas formas fosforiladas das
PABPs já haviam sido descritas em planta, levedura e ouriço do mar (Drawbridge et al., 1990;
Gallie et al., 1997). Em células HeLa, análises bidimensionais utilizando um inibidor da
quinase MKK2 (U0126), fez com que a PABP migrasse como uma proteína mais básica, e
apareceu como um único spot no gel, sugerindo que a regulação da fosforilação da mesma
seja efetuada através da via p38MAP Kinase/MKK2 (Ma et al., 2009).
1.5.3 Eventos de fosforilação nos tripanossomatídeos
Devido ao fato do ciclo de vida dos tripanosomatídeos abranger uma grande variedade
de ambientes, frequentemente ocorrem mudanças adaptativas necessárias em muitos
processos celulares, resultando em alterações na expressão gênica, nos níveis protéicos e em
modificações pós-traducionais de proteínas. Uma modificação pós-traducional bem
documentada nos tripanossomatídeos é a fosforilação (Brenchley et al., 2007; Haile e
Papadopoulou, 2007). Muitas alterações na fosforilação de proteínas durante o ciclo de vida
35
desses parasitas têm sido relatadas e acredita-se que eles contam com a fosforilação de muitas
moléculas que atuam em funções estágio-específicas para regular o ciclo celular. Em
concordância com essa afirmação, análises de bioinformática identificaram nos genomas dos
tripanossomatídeos uma grande quantidade de proteínas quinases e fostases (Parsons et al.,
2005; Brenchley et al., 2007) (Tabela 1).
Tabela 1. Número de quinases e fosfatases que constituem o quinoma e fosfatoma em T. brucei, T. cruzi e L. major.
Enzimas T. brucei T. cruzi L. major
Quinases 176 190 199
Fosfatases 78 86 88
Recentemente um estudo em larga escala identificou 491 fosfoproteínas em T. brucei
na forma sanguínea. Em adição à fosforilação em resíduos de serina e treonina, também foi
descrito a fosforilação em vários resíduos de tirosina nas proteínas analisadas. Além disso, a
fosforilação em proteínas quinases também foi demonstrada em T. brucei, sugerindo que
algumas vias de sinalização descritas em outros eucariotos possam estar presentes nesses
protozoários (Nett et al., 2009). De fato, estudos têm demonstrado que muitas proteínas em
Leishmania e Trypanosoma apresentam-se como múltiplas isoformas, sugerindo que
mudanças pós-traducionais são extensivas nesses organismos. Em muitos casos, diferentes
isoformas são específicas para um determinado estágio do ciclo de vida (Jones et al., 2006;
McNicoll et al., 2006). Assim, em diferentes estágios do ciclo de vida de espécies de
Leishmania e Trypanosoma, padrões diferenciados de fosforilação de proteínas foram
observados, sugerindo que proteínas quinases, e também fosfatases, estejam envolvidas nos
processos de diferenciação (Aboagye-Kwarteng et al., 1991; Parsons et al., 1991; Parsons et
al., 1993; Dell and Engel, 1994; Parsons et al., 1995; Bengs et al., 2005; Aguirre-Garcia et al.,
2006). Tendo em vista o que se conhece sobre os mecanismos de controle da expressão gênica
em tripanosomatídeos, e a ausência de regulação transcricional da expressão gênica, é
provável que estes eventos de modificações pós-traducionais possam afetar a expressão
diferencial de genes e também possam agir ao nível da síntese protéica.
36
2. Objetivo geral
Investigar a ocorrência de isoformas induzidas por modificações pós-traducionais em
homólogos de fatores de iniciação da tradução de T. brucei. Identificar a natureza destas
modificações e investigar como variam ao longo do ciclo de vida dos parasitas, analisando sua
ação sobre a atividade dos fatores e quais as suas implicações para os mecanismos de
regulação da síntese protéica, e da expressão gênica como um todo, nestes organismos.
2.1 Objetivos específicos
1. Estabelecer a metodologia para diferenciação de formas sanguíneas em formas
procíclicas de T. brucei, realizando curvas de crescimento e diferenciação voltadas a
obtenção de extratos protéicos com fins de avaliar a expressão de proteínas durante as
diferentes fases do seu ciclo de vida.
2. Analisar a expressão de homólogos selecionados de eIF4G e eIF4E de T. brucei
durante diferentes fases de desenvolvimento do parasita com ênfase na identificação
de isoformas e padrões de expressão diferenciados, associados a modificações pós-
traducionais.
3. Investigar a natureza das modificações pós-traducionais identificadas, se fosforilação
ou não, por meio de ensaios de desfosforilação utilizando fosfatase alcalina.
4. Investigar se os fatores em estudo fazem parte da fração de proteínas de T. brucei
correspondente ao fosfoproteoma, através da utilização de uma resina de afinidade
para fosfoproteínas.
5. Realizar eletroforose bidimensional para identificar spots que possam estar associados
a diferentes padrões de isoformas dos fatores de tradução.
37
33.. MM aatteerr iiaaiiss ee mmééttooddooss
3.1 Cultivo de células de T. brucei
A manutenção da linhagem de T. brucei selvagem (427), na sua fase procíclica, foi
realizada em meio SDM-79, a 27 ºC, suplementado com hemina e soro fetal bovino. O
crescimento dos parasitas foi monitorado por meio de contagem em câmara de Neubauer.
Nestas condições, as culturas eram repassadas para novo meio a cada três dias. No caso das
formas sanguíneas de T. brucei (427 e AnTaT 1.1), os procedimentos descritos acima também
se aplicam, com exceção de que estas foram cultivadas em meio HMI-9, suplementado com
10% de soro fetal bovino, sendo o repasse realizado a cada dois dias, e então mantidas a 37ºC
em estufa de CO2 a 5% (Hirumi and Hirumi, 1989).
3.2 Curvas de crescimento de T. brucei na fase prociclíca
Para realização das curvas de crescimento de T. brucei na fase prociclíca inicialmente
foi feito um pré-inóculo de 20 a 30 mL de cultura com uma concentração inicial de 2 a 4x106
células/mL, utilizando para isso alíquotas da cultura de manutenção. Estas culturas eram
acompanhadas diariamente até que fosse atingida a fase estacionária de crescimento (em torno
de 8x106 células/mL), quando era então retirada a alíquota do ponto de 0h da curva de
crescimento contendo 5x105 células/mL .Outra alíquota do pré-inóculo era utilizada para
realizar a expansão da cultura para um volume de 300 mL do respectivo meio de cultura, de
forma a ajustar a concentração inicial da cultura também para 5x105 células/mL. Após esse
momento, alíquotas contendo um número equivalente de células foram retiradas a cada 24
horas até a ocorrência da morte celular. Estas alíquotas foram utilizadas para a produção de
extratos protéicos totais, sendo as células coletadas através de centrifugação durante 5
minutos (1000 g a 4ºC), lavadas com PBS e o sedimento ressuspendido em tampão de
proteína SDS-desnaturante (Laemmli 2x). Em seguida, os extratos foram fracionados em
SDS-PAGE e utilizados nos experimentos de Western-blot com os soros contra as diferentes
proteínas alvo.
Curvas de crescimento em condições de estresse celular também foram realizadas. As
etapas inicias da curva foram realizadas de maneira idêntica às curvas convencionais, ou seja,
através de um pré-inóculo na fase estacionária foram retirados o ponto de 0 h contendo 5x105
células/mL e uma outra alíquota foi utilizada para realizar a expansão para um meio de cultivo
38
sem soro fetal bovino. As etapas subsequentes também foram realizadas do mesmo modo das
curvas convencionais.
3.3 Curvas de crescimento de T. brucei na fase sanguínea
Para realização das curvas de crescimento das duas linhagens de T. brucei na fase
sanguínea (427 e AnTaT 1.1) utilizou-se os mesmos procedimentos. Inicialmente foi feito um
pré-inóculo de 50 a 70 mL de cultura com uma concentração inicial de 2 a 4x105 células/mL,
utilizando para isso alíquotas da cultura de manutenção. Estas culturas eram acompanhadas
diariamente até que fosse atingida a fase estacionária de crescimento (em torno de 106
células/mL), quando era então retirada a alíquota do ponto de 0 h da curva de crescimento
contendo 2,5x105 células/mL.Outra alíquota do pré-inóculo foi utilizada para realizar a
expansão da cultura para um volume de 400 mL do respectivo meio de cultura, de forma a
ajustar a concentração inicial da cultura também para 2,5x105 células/mL. Após esse
momento, alíquotas contendo um número equivalente de células foram retiradas no tempo de
6 horas e depois a cada 24 horas até a ocorrência da morte celular. Estas alíquotas foram
utilizadas para a produção de extratos protéicos totais, e o procedimento adotado para tal fim
foi o mesmo já descrito para as formas procíclicas. Em seguida os extratos foram fracionados
em SDS-PAGE e utilizados nos experimentos de Western-blot com os soros contra as
diferentes proteínas alvo.
3.4 Diferenciação de T. brucei
Também foram realizadas curvas de crescimento para diferenciação da forma
sanguínea em procíclica de T. brucei. Para tal fim, foi utilizada a linhagem pleomórfica
AnTaT 1.1, a qual foi cultivada em meio HMI-9 a uma concentração inicial de 5 x 105 cel/ml
e incubadas a 37°C. Quando a cultura atingiu a concentração de aproximadamente 2 x 106
células/mL, foi adicionado 6mM de Cis-aconitato e a cultura foi transferida para uma
incubadora a 27°C. Após 24 horas os parasitas em diferenciação foram coletados através de
centrifugação a 1500g, 25ºC por 8 minutos e transferidos para o meio de cultura de
procíclicos SDM-79. Alternativamente quando a cultura atingiu a concentração de
aproximadamente 2 x 106 células/mL, os parasitas foram coletados e transferidos para o meio
de cultivo DTM acrescido de 6mM de Cis-aconitato. Assim como descrito no item 2, foram
produzidos extratos protéicos a partir de alíquotas retiradas a cada 24 horas, para que fosse
avaliada a eficiência da diferenciação através de ensaios de Western-blot. Como controle
39
positivo desse experimento foi utilizado o anticorpo monoclonal para detecção de prociclina
GPEET da empresa abcam (ab65362), uma vez que essa proteína é somente expressa na
forma procíclica do T. brucei.
3.5 Purificação dos anticorpos por imunoadsorção
Com o objetivo de aumentar a especificidade dos soros utilizados nos ensaios de
Western-blot, os anticorpos dirigidos contra as proteínas TbEIF4E1, TbEIF4E3-4, TbEIF4G4-
5 e LmPABP1 foram purificados por imunoadsorção. A produção de soro policlonal
específico para cada homólogo já havia sido realizada em trabalhos anteriores. Estes soros
foram retirados por meio de uma punção cardíaca e permaneceram conservados a -80°C.
Para realizar a purificação, cerca de 100 a 200 µg das proteínas recombinantes foram
fracionados individualmente por eletroforese em gel SDS-PAGE para posterior transferência
para membrana de PVDF (Immobilon-P Millipore). Em seguida, a membrana foi corada com
Rouge Ponceau 0,2%/TCA 1%, para a visualização da banda referente à proteína de interesse.
A região dessa banda foi excisada da membrana e fragmentada. Após três lavagens de 10
minutos com PBS, os fragmentos foram incubados durante 30 minutos a 4ºC numa solução de
leite 5% em PBS / Tween-20 0,05%. Em seguida, os fragmentos foram incubados, sob
agitação, com o soro policlonal contra as respectivas proteínas recombinantes, por um período
de 18 h a 4ºC. Após esta etapa, foram realizadas três lavagens de 10 minutos com PBS e
posterior tratamento com solução ácida de glicina 0,1 M (pH 2,5), para a eluição dos
anticorpos específicos. A solução foi então separada dos fragmentos da membrana e
neutralizada com Tris-HCl pH 8,0 e PBS duas vezes concentrado. Os anticorpos purificados
foram armazenados a -80 ºC.
3.6 Ensaios de Western-blot
Amostras das proteínas recombinantes e dos extratos dos parasitas diluídas em tampão
de proteína foram fracionadas em gel SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de
PVDF. Após a transferência, a membrana foi incubada inicialmente em solução de leite 5%/
TBS Tween-20 1% e em seguida foi incubada em solução de leite 2,5-5%/ TBS Tween-20
1%, com seu respectivo anticorpo purificado, em diluições variadas. A membrana foi lavada
três vezes com TBS Tween-20 1% e incubada em solução de leite 2,5-5%/ TBS Tween-20 1%
com segundo anticorpo (anti-IgG de coelho) conjugado à peroxidase na diluição de 1:10.000.
Após três lavagens de 10 minutos com TBS Tween-20 1%, foi adicionada à membrana uma
40
mistura de luminol 1,2 mM, iodofenol 0,4 mM (em DMSO) e peróxido de hidrogênio 0,03%
para a reação de quimioluminescência (ECL). Após incubação de 1 minuto nessa mistura, a
membrana foi seca e exposta a um filme (Hyperfilm – Amersham Biosciences) por 1 e 10
minutos, que então foi revelado por uma solução de dektol (1:2) e fixado em solução de ácido
acético.
3.7 Fracionamento celular
Alíquotas de culturas da forma procíclica de T. brucei contendo 2x108 células foram
centrifugadas a 5.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC e o sedimento foi lavado com PBS. Este
sedimento foi então ressuspendido em 1 mL de tampão de lise (20 mM de HEPES-KOH pH
7,4, 75 mM de acetato de Potássio, 4 mM de acetato de Magnésio e 2 mM de DTT ) acrescido
de 100 µL de inibidor de protease e 1 mM de fluoreto de sódio. Em seguida as amostras
foram submetidas a cinco ciclos de congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido.
Para obtenção da fração solúvel as amostras contendo as células lisadas foram centrifugadas a
4ºC durante 15 minutos a 10.000 g, o sedimento formado corresponde à fração nuclear e o
sobrenadante à fração citoplasmática. Alíquotas dos lisados foram ressuspendidas em tampão
de proteína para serem analisadas através de SDS-PAGE e o restante das amostras foi
armazenado em freezer -80ºC.
3.8 Ensaios de desfosforilação
Inicialmente foram produzidos lisados celulares, como descrito acima e uma amostra
desses lisados contendo 106 células foi incubada de 1 a 3 horas a 37ºC, com 20 unidades de
fosfatase alcalina em tampão contendo TRIS-HCL 50 mM pH 9,3, MgCl2 1 mM, ZnCl2 100
µM e spermidina em um volume final de 10 µL. Após o período de incubação, o produto do
ensaio foi analisado através de Western-blot.
3.9 Imunoprecipitação
Para a imunoprecipitação das proteínas de interesse, inicialmente foi feita uma
suspensão contendo uma quantidade variável de anticorpo específico, 30 µL de proteína A
sefarose 50% e 0,5 mL de PBS. A suspensão foi misturada e incubada durante a noite a 4ºC
em um agitador. Após essa etapa, a suspensão foi centrifugada rapidamente a 4ºC a 16.000 g,
o sobrenadante contendo os anticorpos não ligados removido e a resina lavada por cinco vezes
41
com tampão de lise. Logo em seguida, beads da resina ligados aos anticorpos foram
incubados por 2 horas a 4ºC com alíquotas de lisados previamente preparados (2x107-4x107
céls). Após esse período, a suspensão foi rapidamente centrifugada a 16.000 g a 4ºC. O
sobrenadante contendo as proteínas não ligadas foi retirado e guardado para ser analisado
posteriormente. Os beads foram lavados cinco vezes com PBS e o último sobrenadante
aspirado de maneira a restar aproximadamente 20 µL do mesmo sobre os beads da resina.
Para avaliar a eficiência da imunoprecipitação, alíquotas dos beads e dos lisados utilizados no
processo foram ressuspendidas em tampão de proteína para serem analisadas através de SDS-
PAGE.
3.10 Purificação de fosfoproteínas
Utilizando-se o sistema PhosphoProtein Purification Kit (Qiagen) para purificação de
fosfoproteínas foi possível obter a separação da fração de proteínas fosforiladas das proteínas
não fosforiladas de lisados da forma procíclica de T. brucei. Inicialmente, uma alíquota da
cultura de 2x108 células foi centrifugada a 5000 rpm a 4ºC e lavada com HEPES 50 mM pH
7,0. O sedimento foi ressupsendido em 5 mL do tampão de lise do kit (25 mM MES, 1M
NaCl, 0.25% CHAPS) contendo inibidores de proteases e a nuclease benzonase (utilizada na
degradação de ácidos nucléicos) e então incubado por 30 minutos a 4ºC, sendo brevemente
agitado a cada 10 minutos. Após o período de incubação, o lisado celular foi centrifugado a
10.000 g a 4ºC durante 30 minutos. O sobrenadante foi coletado e a concentração protéica foi
determinada através do método de Bradford. Após o equilíbrio da coluna de purificação de
fosfoproteínas, um volume de lisado contendo 0,1 mg/mL foi passado pela mesma permitindo
que todas as proteínas fosforiladas ficassem retidas na coluna de afinidade. Em sequência a
coluna foi lavada com tampão de lise e a fração não-ligada foi coletada e armazenada para
avaliar a eficiência da purificação e para análise das proteínas não fosforiladas. Para obtenção
da fração protéica fosforilada foram realizadas quatro eluições utilizando o tampão de eluição
de fosfoproteínas (fosfato de potássio 50 mM e NaCl 50 mM). A concentração protéica de
todas as eluições foi determinada através do método de Bradford, e amostras das eluições e da
fração não-ligada foram fracionadas em SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF
para detecção das proteínas de interesse através de ensaios de Western-blot.
3.11 Eletroforese bidimensional
42
De uma cultura de T. brucei da forma procíclica na fase exponencial de crescimento,
foram coletados 5x108 parasitas por centrifugação a 2000 g por 10 minutos a 4ºC. O
sedimento foi lavado com PBS e homogeneizado a 4ºC em tampão de lise (uréia 7M, tiouréia
2M, CHAPS 4%, Tris base 40mM, adicionado de um coquetel de inibidores de protease
(Complete, EDTA-free - Roche). Para favorecer a lise, as amostras foram submetidas a um
ciclo de congelamento/descongelamento em nitrogênio líquido e a 30ºC, e então foram
centrifugadas a 14000 g por 2 minutos a 4ºC, para remover os restos celulares. O
sobrenadante foi transferido para outro tubo e alíquotas foram utilizadas para quantificar as
proteínas através do método de Bradford. Depois de quantificadas as amostras foram
aliquotadas e estocadas em freezer -80ºC. Para a focalização isoelétrica os extratos protéicos
foram purificados por precipitação com o sistema 2-D clean-up (GE-Healthcare) seguido de
solubilização em tampão IEF (Isoelectric focusing; Uréia 8 M, Chaps 4%, 2M Thiouréia e
traços de azul de bromofenol) e aplicação em fitas immobiline dry-strips (GE-HealthCare) de
11 cm , com faixas de pH entre 3-10 ou 6-11. Para isso as fitas foram hidratadas com a
solução de proteínas solubilizadas contendo cerca de 75-100 µg de proteína. A focalização
isoelétrica foi feita com base nas condições recomendadas pelo fabricante. Para a segunda
dimensão as fitas foram equilibradas em tampão de equilíbrio (6 M Uréia, glicerol 30%, SDS
2%, 50 mM Tris-HCl pH 8.8 e traços de azul de bromofenol), sendo a primeira etapa na
presença de 10 mg/mL de DTT e a segunda com 25 mg/mL de iodoacetamida. Em seguida as
fitas foram montadas em cima de géis desnaturantes de poliacrilamida a 12,5% para se
realizar a segunda dimensão em condições convencionais. Na busca pelas isoformas de
fatores selecionados foram realizadas duplicatas de géis onde um destes foi utilizado para
ensaios de Western-blot, visando observar os fatores de interesse e suas isoformas, enquanto o
outro foi corado com nitrato de prata para que fosse possível identificar os spots
correspondentes àquelas observadas no Western-blot.
43
44.. RReessuull ttaaddooss
4.1 Estabelecimento das curvas de crescimento de T. brucei na fase prociclíca.
Inicialmente, para realização das curvas de crescimento de T. brucei na forma
prociclíca (PCF), buscou-se otimizar as condições de crescimento desse parasita. Para tal, a
alíquota do ponto de 0h da curva de crescimento foi retirada de um pré-inóculo que tivesse
atingido a fase estacionária de crescimento. A partir do mesmo pré-inóculo, realizou-se a
expansão da cultura para um volume maior do meio de cultivo. Após essa etapa, essas
culturas foram monitoradas diariamente de acordo com determinados critérios como a
morfologia celular, motilidade dos parasitas e crescimento celular. Em intervalos regulares de
crescimento, até a ocorrência da morte celular, amostras dessas curvas foram retiradas para
posterior análise.
Sendo a forma procíclica um microrganismo de fácil cultivo, foi possível observar
que as curvas feitas da maneira descrita acima, mantinham um padrão de crescimento
característico, sendo possível identificar claramente as fases de crescimento lag, log,
estacionária e de declínio (Figura 8). Logo após a expansão da cultura, as células entravam na
fase lag, a qual é caracterizada por um baixo crescimento dos parasitas. Após o período de
readaptação celular, acontecia o crescimento exponencial favorecido pela grande
concentração de nutrientes disponíveis no meio de cultura. A cultura atingia a fase
estacionária com uma concentração celular de aproximadamente 8x106 células/mL, momento
em que os nutrientes tornavam-se escassos e os produtos tóxicos, resultantes do metabolismo
celular, mais abundantes. Ao atingir a concentração celular de aproximadamente 2 a 6x107
células/mL, os parasitas entravam em processo declínio, ocorrendo a morte celular total
depois de passados de 9 a 10 dias após o início da curva.
Curva de crescimento de T. brucei PCF
050
100150200250300350400
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216
Tempo (horas)
nº d
e ce
ls/m
L (x
105)
Fase log
estacionária declínio
Fase lag
Curva de crescimento de T. brucei PCF
050
100150200250300350400
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216
Tempo (horas)
nº d
e ce
ls/m
L (x
105)
Fase log
estacionária declínio
Fase lag
44
Figura 8. Curva de crescimento de T. brucei na fase procíclica. Na figura podem ser identificadas as fases de crescimento lag, log, estacionário e de declínio. 4.2 Estabelecimento das curvas de crescimento de T. brucei na fase sanguínea
As curvas de crescimento de T. brucei na fase sanguínea (BSF) foram realizadas com
duas linhagens diferentes, a linhagem monomórfica selvagem 427 e a linhagem AnTaT 1.1, a
qual é pleomórfica e passível de sofrer diferenciação em determinadas condições de cultivo.
Os procedimentos adotados para a realização das curvas foram os mesmos para ambas as
linhagens.
A forma sanguínea do T. brucei apresenta um padrão de crescimento muito distinto da
forma procíclica. Apesar de ser mais sensível a pequenas alterações no meio de cultivo do que
a forma procíclica, o sanguíneo é caracterizado por um perfil de crescimento exponencial,
sendo difícil caracterizar todas as fases de crescimento desse parasita, o qual atingia dentro de
poucos dias a fase de declínio com uma concentração celular em torno de 5x106 para a
linhagem 427 (Figura 9A) e 2x106 para a AnTaT 1.1 (Figura 9B).
Para dar início a curva de crescimento, a alíquota do ponto de 0 h da curva de
crescimento foi retirada de um pré-inóculo que tivesse atingido a fase estacionária de
crescimento. A partir do mesmo pré-inóculo, realizou-se a expansão da cultura para um
volume maior do meio de cultivo. A partir destas culturas foram retiradas alíquotas em
intervalos selecionados até a ocorrência da morte celular, que geralmente ocorria dentro de até
96 horas após o início da curva.
45
Figura 9. Curvas de crescimento de T. brucei na fase sanguínea. (A) Curva de crescimento de T.brucei na fase sanguínea da linhagem 427. (B) Curva de crescimento de T.brucei na fase sanguínea da linhagem AnTaT 1.1.
4.3 Diferenciação de formas sanguíneas em formas procíclicas de T. brucei
Para o estabelecimento da diferenciação de T. brucei foram realizados testes com duas
metodologias diferentes. Para tal fim foram avaliadas a eficiência do método que utiliza o
meio SDM-79 e outro que utiliza o DTM (Differentiating Trypanosome Medium) para
diferenciação de formas sanguíneas em procíclicas. Após a transferência para o meio de
cultivo de diferenciação (tanto para o SDM-79, quanto para o DTM) no período após 24 a 48
horas foi observada uma cultura heterogênea de formas sanguíneas, algumas células com
morfologia celular intermediária entre os sangúineos e procíclicos e raras formas
características de procíclicos. Porém, apesar de algumas células sofrerem o processo de
diferenciação, não foi observado o crescimento da cultura e a densidade celular se manteve
idêntica desde o momento do início da curva até a morte dos parasitas, que ocorreu dentro de
aproximadamente 10 dias. Esses testes foram repetidos na tentativa de se otimizar o processo
de diferenciação, mas tal evento não ocorreu de maneira sincronizada e uma cultura
46
homogênea de procíclicos não pode ser obtida. Esses resultados nos levaram a especular que o
insucesso da diferenciação pode ter sido devido ao fato de a cultura de AnTaT 1.1 ter sido
cultivada in vitro por um longo tempo, o que pode ter alterado as características fenotípicas do
parasita necessárias para que ocorresse a diferenciação em formas procíclicas.
4.4 Análise da expressão de fatores selecionados em curvas de crescimento de T. brucei na fase prociclíca
Com o intuito de caracterizar o padrão de expressão dos homólogos dos fatores eIF4G
e eIF4E ao longo do ciclo de vida de T. brucei, partiu-se para a análise da expressão das
respectivas proteínas em extratos de células obtidos ao longo da curva de crescimento. Para a
produção dos extratos protéicos totais, as alíquotas coletadas durante a realização das curvas
de crescimento foram submetidas a centrifugação e os sedimentos foram ressuspendidos em
tampão de amostra para SDS-PAGE. Os extratos protéicos totais foram utilizados em ensaios
de Western-Blot com os anticorpos purificados contra os fatores de iniciação TbEIF4E1,
TbEIF4E3, TbEIF4E4, TbEIF4G4 e TbEIF4G5.
A maioria dessas proteínas na forma prociclíca foram detectadas utilizando-se 106
células, e como controle do número de parasitas presentes em cada amostra foi utilizada a
proteína TbEIF4AI, uma vez que já foi descrito que essa proteína é expressa de maneira
constitutiva ao longo do ciclo de vida de T. brucei (Dhalia et al., 2006). Assim, foi observado
que todas as proteínas em estudo (TbEIF4E1, 3 e 4 e TbEIF4G4 e 5) estão presentes nesta
fase do ciclo de vida, porém possuem padrões de expressão distintos (Figura 10). O
TbEIF4E4 e TbEIF4G4 apresentaram duas isoformas ao longo de toda a curva de
crescimento. Por outro lado, o TbEIF4E3 apresentou duas isoformas da fase lag até a
logarítmica, mas na fase estacionária apresentou somente uma isoforma. A presença de mais
de uma isoforma para o fator TbEIF4G4 é mais evidente do que para os fatores TbEIF4E3 e
TbEIF4E4, os quais apresentaram isoformas de tamanhos bem próximos, tornando mais
difícil sua visualização. Já as proteínas TbEIF4E1, TbEIF4G5 e TbPABP1 são expressas de
maneira constitutiva e possuem apenas uma isoforma, ressaltando porém que a detectação do
TbEIF4E1 só foi possível com uma concentração de células cinco vezes maior do que o
necessário para as demais proteínas (Figura 10).
47
Figura 10. Análise da expressão de fatores selecionados em curvas de crescimento de T. brucei na fase prociclíca. O controle utilizado no experimento foi a proteína TbEIF4AI que se expressa constitutivamente ao longo do ciclo evolutivo.
4.5 Análise da expressão de fatores selecionados em curvas de crescimento de T. brucei na fase sanguínea
Com o mesmo objetivo, e da mesma maneira descrita para a forma prociclíca de T.
brucei, foram realizados ensaios de Western-Blot com os extratos protéicos totais da sua
forma sanguínea obtidos ao longo da curva de crescimento.
A caracterização do perfil de expressão das proteínas TbEIF4E1, 3 e 4, TbEIF4G4 e 5
e TbPABP1 nessa fase do ciclo de vida de T. brucei, tanto para a linhagem 427 como para a
AnTaT 1.1, foi mais complexa do que para os ensaios de caracterização no procíclico. A
maioria dessas proteínas na forma prociclíca foi detectada utilizando-se 106 células, porém
para a forma sanguínea essas proteínas foram detectadas, ainda com um sinal fraco,
utilizando-se 2,5x106 células (a exceção é o TbEIF4E3, detectável com 106 células). Aqui
também foi utilizado como controle do número de parasitas presentes em cada amostra a
proteína TbEIF4AI.
Com os ensaios realizados, foi observado que todas as proteínas em estudo também
estão presentes nesta fase do ciclo de vida. Devido à pouca abundância do TbEIF4E1 e da
TbPABP1 em T. brucei, os ensaios para caracterizá-los só conseguiram detectar baixíssimas
quantidades dessas proteínas na linhagem de AnTaT 1.1 e 427, respectivamente (Figura 11 A
e B). O TbEIF4G5 é expresso constitutivamente nas duas linhagens, e foi detectado com
48
somente uma isoforma (Figura 11 A e B). O TbEIF4G4 apresentou duas isoformas ao longo
de toda a curva nas linhagens 427 e AnTaT 1.1 (Figura 11 A e B), porém nessa última, as
duas isoformas possuem pesos moleculares ainda mais próximos do que o que foi observado
para essa proteína na linhagem 427, tanto na forma sanguínea, quanto na procíclica. Já o
TbEIF4E3 na linhagem 427 é expresso sob a forma de duas bandas até 24 horas (Figura 11A),
e na AnTaT 1.1, aparentemente, essa proteína possui o mesmo perfil de expressão, porém as
duas bandas, assim como o TbEIF4G4, possuem tamanhos bem próximos (Figura 11B).
Diferentemente do observado para outros fatores, cujos padrões de expressões mantiveram-se
idênticos ao longo das curvas de crescimento nas formas sanguíneas e procíclicas, a proteína
TbEIF4E4, nas formas sanguíneas tanto da linhagem 427 como da AnTaT 1.1, foi expressa
sob a forma de duas bandas até o ponto de 24 h, porém, mais especificamente no ponto de 6 h,
momento entre a expansão da cultura e a fase que precede o crescimento celular acelerado,
essas isoformas foram diferencialmente modificadas em relação aos outros pontos da curva,
podendo serem nitidamente visualizadas mais de uma banda para esse fator (Figura 11 A e B).
TbEIF4E4
TbEIF4G4
TbEIF4E3
TbEIF4G5
TbPABP1
TbEIF4AI
TbEIF4E4
TbEIF4G4
TbEIF4E3
TbEIF4G5
TbEIF4AI
TbEIF4E1
0h 6h 24h 48h 72h 0h 6h 24h 48h 72h
A) T. brucei BSF 427 B) T. brucei BSF AnTaT 1.1
Figura 11. Análise da expressão de fatores selecionados em curvas de crescimento de T. brucei na fase sanguínea. A) Expressão dos fatores TbEIF4E3, TbEIF4E4, TbEIF4G4, TbEIF4G5 e TbPABP1 ao longo da curva de crescimento da linhagem sanguínea 427. B) Expressão dos fatores TbEIF4E1, TbEIF4E3, TbEIF4E4, TbEIF4G4 e TbEIF4G5 ao longo da curva de crescimento da linhagem sanguínea AnTaT 1.1. O controle utilizado no experimento foi a proteína TbEIF4AI que se expressa constitutivamente ao longo do ciclo evolutivo.
4.6 Análise do crescimento de T. brucei na forma procíclica sob indução de estresse Levando em consideração os resultados prévios obtidos, os quais demonstraram que os
fatores TbEIF4E3, TbEIF4E4 e TbEIF4G4 são detectados nos ensaios de Western-blot com
49
mais de uma isoforma, especulou-se que essas seriam consequência de modificações pós-
traducionais, possivelmente fosforilação, uma vez que já foi observado que fatores de início
da tradução em mamíferos são fosforilados (Raught e Gingras, 2007). Sabidamente, uma
grande variedade de condições fisiológicas de estresse pode alterar o perfil de expressão
protéica celular. De forma a analisar se um ambiente estressante para o crescimento celular
poderia afetar a expressão dos homólogos selecionados levando a um estado hiperfosforilado
ou hipofosforilado, foi realizada uma curva de crescimento da forma procíclica na ausência de
soro fetal bovino (SFB), o qual é essencial para o adequado crescimento deste parasita. As
primeiras etapas da curva foram realizadas de maneira idêntica às curvas convencionais,
exceto que uma alíquota do pré-inóculo foi expandida para um meio de cultivo sem SFB. No
momento da expansão, a densidade celular foi ajustada para 5x105 cels/mL. Ao longo da
curva, foi observado que os parasitas mantiveram suas características morfológicas, porém
não houve crescimento celular e a cultura manteve a densidade em torno de 3.105 céls/mL, ao
contrário da curva controle realizada com SFB, na qual os parasitas cresceram
exponencialmente. Como pode-se observar na figura 12, o padrão de expressão de alguns
fatores analisados através de Western-blot aparentemente não foi afetado pela deprivação do
SFB, ou então mudanças mínimas no estado de fosforilação aconteceram, tornando difícil a
análise através da eletroforese unidimensional.
Figura 12. Comparação do perfil de expressão dos homólogos TbEIF4E3, TbEIF4E4 e TbEIF4G4 em curvas de crescimento realizadas na presença e na ausência de SFB. Como controle do número de parasitas presentes na amostra, foi utilizado a proteína TbEIF4AI.
50
4.7 Ensaios de desfosforilação com fosfatase alcalina
Estes ensaios foram realizados com o intuito de desvendar se a ocorrência de mais de
uma isoforma nas proteínas estudadas é realmente devido a modificações pós-traducionais do
tipo fosforilação. Lisados celulares de T. brucei 427 da forma procíclica foram incubados com
fosfatase alcalina de bezerro, uma vez que esta atua degradando os resíduos de fosfato. Como
controle positivo destes experimentos foi utilizada a PABP1 de Leishmania cuja fosforilação
já foi demonstrada previamente (Bates et al., 2000). Como pode ser analisado na figura 13, a
isoforma de maior peso molecular do fator TbEIF4E3, o qual foi utilizado como teste neste
ensaio, continuou sendo detectada, embora tenha sido possível visualizar uma discreta
diminuição na sua intensidade. Posteriormente, ainda tentou-se utilizar outro tipo de fosfatase
alcalina em ensaios subsequentes, porém o perfil da proteína não foi alterado. Diante dos
resultados insatisfatórios obtidos através desses experimentos, decidiu-se investigar a natureza
dessas isoformas por meio de outros experimentos como a purificação de proteínas
fosforiladas através do Phosphoprotein Purification Kit da Qiagen e através de experimentos
utilizando a eletroforese bidimensional.
Figura 13. Ensaio de desfosforilação. Neste experimento pode-se observar o lisado controle, o lisado incubado a 37ºC na ausência da enzima CIP por 2 horas e o lisado incubado a 37ºC na presença da enzima CIP por 2 horas. Através desse experimento foi possível observar uma discreta desfosforilação das proteínas avaliadas.
4.8 Investigação da modificação pós-traducional dos fatores de iniciação através da purificação de fosfoproteínas
Para obtenção e análise do fosfoproteoma do T. brucei 427 foi utilizado o
Phosphoprotein Purification Kit da Quiagen. Através deste kit, foi possível purificar as
51
proteínas fosforiladas deste microrganismo. O lisado total do parasita foi passado por uma
coluna de bioafinidade, à qual as proteínas fosforiladas ficaram ligadas. Após a eluição das
proteínas ligadas a resina, amostras desta purificação foram analisadas através de Western-
blot para identificar em quais das frações as proteínas em estudo (TbEIF4E3, TbEIF4E4,
TbEIF4G4) estariam presentes. Como controle positivo para as proteínas não fosforiladas foi
utilizado o TbEIF4AI, uma vez que não há quaisquer indícios de essa proteína ser fosforilada
no Trypanosoma brucei. Através dessa purificação, foi possível detectar os fatores TbEIF4E3
e 4 e o TbEIF4G4 nas eluições 2, 3 e 4 (Figura 14). Como esperado, o TbEIF4AI não foi
detectado nas eluições, comprovando que este fator não faz parte do fosfoproteoma do
parasita. Esses resultados comprovaram que as proteínas em estudo são realmente
fosforiladas. Amostras dessa purificação também foram utilizadas na realização de
eletroforese bidimensional.
Figura 14. Purificação de fosfoproteínas. Através desta purificação apenas as proteínas fosforiladas são detectadas nas eluições, como foi o caso do TbEIF4E3, TbEIF4E4 e TbEIF4G4.
4.9 Estudo das isoformas dos fatores alvo através da eletroforese bidimensional
A eletroforese bidimensional é uma técnica poderosa e usada amplamente para a
análise de proteínas extraídas de amostras biológicas. Este método é capaz de separar as
proteínas de acordo com dois parâmetros independentes através de duas etapas. A etapa da
primeira dimensão, a focalização isoelétrica, separa as proteínas de acordo com os seus pontos
isoelétricos (PI); a etapa da segunda dimensão, SDS-PAGE, separa as proteínas de acordo
com os seus pesos moleculares. Dessa maneira, cada spot presente no gel resultante da
eletroforese bidimensional, corresponde potencialmente a uma única proteína da amostra.
52
Assim, informações como o pI da proteína, o aparente peso molecular e a quantidade de cada
proteína podem ser obtidas. Além disso, essa técnica é única na habilidade em detectar
modificações pós-traducionais, uma vez que essas modificações podem alterar tanto o peso
molecular como o pI das proteínas.
A eletroforese bidimensional foi realizada utilizando o lisado total do parasita e esses
experimentos foram realizados em duplicatas, assim foram obtidos dois géis que
representavam o conteúdo protéico total do parasita, sendo um corado com prata e o outro
transferido para membrana de PVDF. Para identificar a presença das proteínas de interesse a
partir desses géis, foram realizados Western-blots, através dos quais foi possível detectar o
TbEIF4E3, TbEIF4E4, TbEIF4AI e TbPABP1 (Figura 15). O fator TbEIF4E3 se apresentou
sob a forma de cinco spots e na faixa de PI entre oito e nove. Por outro lado o fator TbEIF4AI,
de acordo com os resultados da purificação de fosfoproteínas, apresentou-se como um único
spot. Já a proteína TbEIF4E4 foi detectada na faixa de PI entre nove e 10 sob a forma de 4
spots e a TbPABP1 como dois spots na faixa de PI entre oito e nove. A presença desses
múltiplos spots para cada proteína, pode representar que cada proteína está sendo alvo de
sucessivas fosforilações, uma vez que os spots apresentam tamanhos moleculares
progressivamente maiores para cada um dos fatores analisados e além disso o pI das proteínas
também foram modificados, tornando-se mais ácidos à medida que aumentam o número de
fosforilações.
53
Figura 15. Análise por eletroforese bidimensional das proteínas TbEIF4AI, TbEIF4E3, TbEIF4E4 e TbPABP1. As fosfoproteínas foram fracionadas através da eletroforese bidimensional e então transferidas para uma membrana de PVDF. Através de ensaios de Western-blot utilizando anticorpos contra as diversas proteínas, foi possível visualizar as diversas isoformas dos fatores TbEIF4E3 e 4 e da TbPABP1, além de um único spot para o fator TbEIF4AI.
4.10 Impacto das mudanças pós-traducionais na interação TbEIF4E3/ TbEIF4G4
A identificação da interação de proteínas em complexos estáveis em um sistema
celular pode ser alcançada através do procedimento de imunoprecipitação, no qual a proteína
alvo e seus parceiros podem ser isolados através da ligação dessas moléculas a ligantes
específicos imobilizados em suportes insolúveis. Para isso, lisados celulares foram incubados
com uma suspensão de anticorpos específicos para a proteína de interesse, ligados na proteína
A sefarose e para controle negativo do experimento esses lisados também foram incubados
com soro pré-imune na presença da proteína A sefarose. Esse procedimento foi realizado para
imunoprecipitar o TbEIF4E3. Como pode ser observado na figura 14, a imunoprecipitação
dessa proteína foi bem sucedida, e adicionalmente foi possível verificar que o TbEIF4G4 co-
imunoprecipitou com o TbEIF4E3. Como ambas as isoformas do TbEIF4G4 foram
encontradas no imunoprecipitado é possível sugerir que a sua fosforilação não impede a sua
associação com o TbEIF4E3.
54
Figura 16. Imunoprecipitação do TbEIF4E3. O TbEIF4E3 foi completamente depletado do lisado, demonstrando que toda a proteína foi imunoprecipitada. Ademais, na imunoprecipitação do TbEIF4E3, também foi detectada a presença do TbEIF4G4, sendo também possível visualizar na imunoprecipitação dessas proteínas suas isoformas fosforiladas. IP C-= imunoprecipitação do controle negativo; IP TbEIF4E3= imunoprecipitação do fator TbEIF4E3; LIS APÓS IP C-= lisado após imunoprecipitação do controle negativo; LIS APÓS IP TbEIF4E3= lisado após imunoprecipitação do TbEIF4E3.
55
55.. DDiissccuussssããoo O controle da expressão gênica em T. brucei e em outros kinetoplastídeos baseia-se
amplamente em alterações nos níveis dos transcritos, cujos níveis são regulados através da
estabilidade e degradação dos mRNAs, e possivelmente também em alterações no seu padrão
de tradução (Clayton, 2002). Estudos prévios em Leishmania e Trypanosoma sugerem que,
enquanto diferenças na abundância de transcritos possam ser quantificadas ao longo da
diferenciação celular, essas mudanças não são tão pronunciadas quanto em organismos que
regulem a sua expressão gênica através da iniciação da transcrição, e a porcentagem de genes
cujos níveis de mRNAs variam ao logo do ciclo de vida é bem menor que a de proteínas (10%)
(McNicoll et al., 2006). Por outro lado, , até o momento poucas informações foram obtidas no
âmbito da regulação em nível pós-traducional, apesar de ser um dos mecanismos de maior
relevância dentre os aspectos da biologia desses parasitas. É possível que o grande número de
homólogos dos fatores de iniciação eIF4E e eIF4G e as modificações pós-traducionais
presentes nestes fatores possam acrescentar outras vias pelas quais a expressão gênica pode
ser regulada nesses organismos.
Através da análise da expressão dos fatores TbEIF4E1, TbEIF4E3 e 4 e TbEIF4G4 e 5,
nas fases procíclica e sanguínea, foi possível observar que o padrão de expressão deles
diferiram ao longo das curvas de crescimento. Dentre as proteínas em estudo algumas se
apresentaram sob a forma de no mínimo duas bandas (TbEIF4E3, TbEIF4E4 e TbEIF4G4),
nas duas fases do ciclo de vida de T. brucei. Em Leishmania, se observou que a banda de
maior peso molecular do EIF4E3 diminui de intensidade ao longo de uma curva de
crescimento mas se intensifica novamente na fase estacionária, enquanto que a banda de
maior peso molecular do EIF4E4 aumenta ao longo da curva e depois desaparece no final
(Pereira, 2008). Este comportamento, entretanto, não foi observado para nenhum dos fatores
analisados de T. brucei. Nossos resultados contudo mostraram, de forma mais proeminente,
uma segunda banda de maior peso molecular do fator TbEIF4E4 apenas para a forma
sanguínea, e somente no ponto de 6 horas da sua curva de crescimento. Já o TbEIF4G4
apresentou-se como duas isoformas ao longo de todas as curvas da forma procíclica e
sanguínea, ambas fosforiladas, diferentemente também do que acontece em Leishmania
amazonensis, uma vez que neste organismo foi observado que seu ortólogo é expresso de
maneira estágio específica, sendo sua expressão drasticamente reduzida em células da fase
amastigota (Reis,C.R., dados não publicados).
Os fatores TbEIF4E1 e TbEIF4G5 se apresentaram sob a forma de bandas únicas,
indicando que aparentemente não são fosforilados, e o perfil de expressão também não variou
56
ao longo das curvas de crescimento realizadas. Dentre todos os homólogos estudados, a
proteína menos abundante em células de T. brucei foi o TbEIF4E1 e a mais abundante foi o
TbEIF4E3, tanto na forma procíclica quanto na sanguínea. A quantificação do TbEIF4E1 e do
TbEIF4E3 realizada em ambas as formas do T. brucei, é consistente com os níveis de
expressão dessas proteínas visualizados nos experimentos de Western-blot, sendo detectado
cerca de 1,5-5x103 e 2-4x104 moléculas/célula na forma sanguínea e 3-8x103 e 5-10x104
moléculas/célula na forma procíclica para o TbEIF4E1 e para o TbEIF4E3, respectivamente
(Freire, 2010).
A permanência da expressão de todos os fatores analisados (TbEIF4E1, TbEIF4E3-4,
TbEIF4G4-5 e a TbPABP1) durante as duas fases do ciclo de vida do T. brucei, leva a crer
que essas proteínas são essenciais para a manutenção da homeostasia celular. De acordo com
essa afirmação, ensaios de interferência de RNA para avaliar a viabilidade celular após a
depleção dos níveis das proteínas TbEIF4G4 e TbEIF4E3 em T. brucei, resultaram em morte
rápida da cultura (Moura, 2007; Freire, 2010). A depleção do TbEIF4G4 também induziu
mudanças na morfologia celular, resultando em parasitas com formas arredondadas (Moura,
2007).
Através da purificação de fosfoproteínas realizada nesse trabalho foi possível
determinar que a presença de mais de uma isoforma nas proteínas alvo (TbEIF4E3, TbEIF4E4
e TbEIF4EG4) na forma procíclica é devido a modificações pós-traducionais do tipo
fosforilação. A análise do TbEIF4AI nesse mesmo experimento confirmou que esse fator não
é fosforilado. Um recente trabalho também identificou, na forma saguínea do T. brucei,
formas fosforiladas do TbEIF4E3 (Nett et al., 2009). A confirmação da fosforilação dessas
proteínas em ambas as formas do ciclo de vida do organsimo torna possível pressupor que
esta modificação está associada a mecanismos que atuem constantemente na regulação da sua
atividade.
Os experimentos de imunoprecipitação aqui realizados demonstraram que ambas as
formas fosforiladas do TbEIF4G4 co-imunoprecipitaram com o TbEIF4E3. Em animais após
a alimentação, foi observado um aumento na formação do complexo eIF4F, e esse evento foi
associado com uma elevação de dez vezes no nível de fosforilação da Ser-1148 do eIF4GI
(Vary e Lynch, 2006). È possível que as modificações pós-traducionais observadas no
TbEIF4G4 e em outros fatores possam estar atuando regulando a especificidade de interação
entre parceiros na iniciação da tradução, como já foi visto para a PABP (Le et al., 2000), mas
até o momento não está claro como isso ocorre.
Dados na literatura já haviam relatado que uma das isoformas da PABP1 em
Leishmania é na verdade a mesma proteína na sua forma fosforilada (Bates et al., 2000). A
57
visualização da TbPABP1 sob a forma de dois spots, dá indícios de que essa proteína também
é fosforilada no T. brucei, evidenciando uma conservação nos mecanismos de regulação entre
esses parasitas. Estudos com gérmen de trigo têm demonstrado que a PABP no seu estado
hiperfosforilado interage mais eficientemente com o eIF4G do que a sua forma
hipofosforilada (Gallie et al., 1997; Le et al., 2000; Ma et al., 2009), e aumenta sua ligação
cooperativa à cauda poli(A), sugerindo que sua capacidade de homodimerizar é aumentada
(Le et al., 2000). Outro estudo demonstrou em células HeLa que durante o período de
recuperação após choque de calor houve um aumento na associação da PABP1 com o eIF4G,
e um concomitante aumento no nível de fosforilação. Assim o aumento no status de
fosforilação da PABP após choques de calor pode ser um passo importante para restaurar os
níveis normais de tradução.
Em formas procíclicas do T. brucei, um estudo demonstrou que cerca de 80% das
proteínas analisadas através de gel 2-D foram identificadas sob a forma de quatro ou menos
spots (ex.: β-tubulina, HSP70), os quais apresentaram mudanças no pI, apesar de a massa
molecular apresentar discreta ou nenhuma alteração, o que demonstra que a modificação de
proteínas é bastante comum nesse parasita (Jones et al., 2006). De acordo com essas
informações, no presente trabalho foi possível visualizar claramente diversas isoformas para
os fatores TbEIF4E3 e 4, com pequenas diferenças de massa molecular e pI. Os efeitos da
fosforilação do eIF4E de vertebrados na tradução cap-depentente in vitro são insignificantes.
Entretanto, a hiperfosforilação forçada do eIF4E através da superexpressão de Mnks em
células de mamíferos levou a uma redução nos níveis de tradução (Knauf et al., 2001). A
fosforilação também parece produzir uma modesta diminuição na afinidade do eIF4E por
mRNA capeados ou análogos de nucleotídeos capeados (Scheper e Proud, 2002) e análises
mutacionais indicam que a fosforilação também é necessária para que ocorra transformação
celular (Topisirovic et al., 2004).
Em eucariotos superiores, um dos papéis da fosforilação de proteínas é regular vias
necessárias para a proliferação e diferenciação celular (Parsons et al., 1993). Uma
comparação entre o estágio sanguíneo e o procíclico de T. brucei demonstrou que a atividade
e a abundância de muitas proteínas quinases, são reguladas durante o desenvolvimento do
parasita (Parsons et al., 1993; Hua e Wang., 1994). Trabalhos adicionais necessitam ser
realizados para identificar o real papel da fosforilação dos fatores estudados durante o evento
da iniciação da tradução. Ensaios de eletroforese bidimensional comparando as diversas fases
da curva de crescimento de cada forma do parasita, a análise da associação dos homólogos
com polissomos, e a possível identificação das quinases e fosfatases que atuam regulando o
nível de fosforilação podem ajudar a esclarecer as vias de regulação que controlam a
58
expressão gênica desses parasitas. Essas modificações pós-traducionais podem desempenhar
papel central na regulação da síntese protéica desses parasitas. Os dados obtidos, juntamente
com dados futuros, serão úteis para a identificação de mecanismos conservados na iniciação
da tradução entre os tripanossomatídeos e eucariotos superiores.
59
66.. CCoonncclluussõõeess • As proteínas TbEIF4E1, TbEIF4E3, TbEIF4E4, TbEIF4G4, TbEIF4G5 e a TbPABP1
são expressas nas duas principais formas do ciclo de vida do T. brucei em níveis
relativamente constantes.
• TbEIF4E3, TbEIF4E4 e TbEIF4G4 são proteínas modificadas pós-traducionalmente
através da fosforilação e o TbEIF4AI não é fosforilado.
• TbPABP1, TbEIF4E3 e TbEIF4E4 são representados por 2, 5 e 4 isoformas,
respectivamente, enquanto o TbEIF4AI é representado por apenas uma.
• Diferentes fosforilações do TbEIF4G4 não parecem alterar sua interação com o
TbEIF4E3.
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