Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de

Corynebacterium pseudotuberculosis

Revisão bibliográficaOs antígenosExtraçãoPurificação

Material e métodoExtraçãoPurificação

Membrana

Parede

Ag. Extra

celulares

Ag. Intra

celulares?

Ag. fracamenteligados à parede

Ag. de parede /membrana

Representação esquemática da localização das frações antigênicas de C. pseudotuberculosis

Peptidoglicano

Ácidos teicóicos

Camadalipídica

Quantidade de material solúvel extraído de parede celular de C. pseudotuberculosis por vários métodos de extração

(Cameron and Purdom, 1971)

1ra Fase 2da Fase 3ra Fase 4a Fase Resultado(% de material solúvel)

Ácido Tricloro Acético Gelado(ATAG) / / /

Traço

Etanol/Dietileter (E/D) ATAG / / TraçoE/D ATAG Formamide / TraçoE/D ATAG Enzima Streptomyces

Albus/ Traço

E/D ATAG Lisozima / 4,0E/D ATAG H2SO4 Enzima S.A. TraçoE/D ATAG H2SO4 Lisozima TraçoE/D SDS Enzima S.A. / 0E/D SDS Lisozima / 0,4E/D ATAG SDS 2% Enzima S.A. 0E/D ATAG SDS 2% Lisozima TraçoE/D ATAG 1N NaOH 100ºC, 10 min Enzima S.A. 90E/D ATAG 1N NaOH 100ºC, 10 min Lisozima 90E/D ATAG 1N NaOH 37ºC, 18 horas Enzima S.A. 0E/D ATAG 1N NaOH 37ºC, 18 horas Lisozima 40

Conclusões: Excepcional resistência das paredes celulares de C. pseudotuberculosis a tudo !!!.

Peso Molecular dos antígenos imunodominantes do sobrenadante de cultura de C. pseudotuberculosis

em ovinos-caprinos.

2025,1

31,6

39,8

63,168,1

30

55

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 3 4 5 6 7 8

PM

(kD

a)

Walker J. et al, 1994 Ter Laak E.A. et al, 1992 Ellis J.A. et al, 1991.2

Braithwaite C.E. et al, 1993 Sting R. et al, 1998

Peso Molecular dos antígenos imunodominantes da fração celular de C. pseudotuberculosis em

ovinos-caprinos.

20 2231,6 35,5 39,8

45,756

63

79

100

2231,5

40

64 68

120

43

0

20

40

60

80

100

120

140

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

PM

(k

Da

)

Ellis J.A. et al, 1991.2 Braithwaite C.E. et al, 1993 Sting R. et al, 1998Ellis J.A. et al, 1991.1 Muckle C.A. et al, 1992

As frações antigénicas de Corynebacterium pseudotuberculosis

Antígenos extracelulares

Frações antigénicas Peso MolecularDe 2 a 6 De 20 a 68 KDa

Antígenos fracamente ligados à parede

Frações antigénicas Peso Molecular5 (Muckle et al, 1992) 22, 31,5, 43, 64 e 68

KDa

Antígenos celulares (parede/membrana, intracelulares)

Frações antigénicas Peso MolecularDe 7 a 11 De 12 a 120 KDa

Extração dos antígenos de C. pseudotuberculosis

Autores Técnicas Resultados

Muckle et al, 1993 Sonicado 3 x 10 min. Ok

Ellis et al, 1991 Sonicado durante 15 min. Sonicado 3 min. + EE Digestão com lizozima,37C Octyl Glucoside 1%,2h,TA

Ok Ok Ok, muitos resíduos Solubilização partial

Braihwaite , 1993 Detergentes SDS, DOC,TDAB, CHAPS e NP40(1%, 60ºC, 30 min.)

Todos os detergentestêm resultados iguais

Sting et al, 1998 SDS 2%, 1 h, 100ºC. Ok

Purificação dos antígenos de C. pseudotuberculosis

Autores Técnicas Oque

Resultados

Soucek et al,1971

Precip. S.A., Etanol C. Troca Iónica

Sobrenadan

te

Purificação x 176Precip. 50% atividadeexotoxinaTroca iónica não adequada

Egen et al,1988

Diálise contra água(HPLC)

C. Isoelec. Focusing

Sobrenadan

te

3 bandas: 14, 21 e 31,7 kda14 e 21 kd não reconhecidas

Muckle et al,1993

C. Exclusão (ColunaSuperose 6)

S-Layer

4 bandas (PM ?) incluindo31,5 kda (exotoxina)

Wilson et al,1995

Precip. S. A. C. Hidrofóbica

Sobrenadan

te

Bandas 31,5 e 40 kdaBandas <20 kda:contaminantes do meio

Sonicado Separação por

gradiente de sucrose Enzimas

S-Layer (1) Extracelulares (4)Intracelulares (2)

Parede/MembranaPurificada

C.pseudotuberculosis

MassaBacteriana

Meio decultura

LavagemNaCl

ou LiCl

Extração pordetergentes/Sonicado

Centrifugação 10000 g, 15 min.

Purificação

Centrifugação100000 g, 1 hora

Bactériasinteiras

Filtração: 0,45 e 0,22 m Cromato Exclusão

Extração dosantígenos

Celulares (3)

Proposta de extração dos antígenosfracamente ligados à parede de C. pseudotuberculosis

Obtenção de células por centrifugação(10000 g, 15 min., 4ºC)

Turner M. S. et al, 1997 Muckle C. A. et al, 1992

Lavagem com volume 2 lavagens de 3 volumes deigual de NaCl 0,15 M NaCl 1 M em PBS 0,1 M, pH

7,4. Centrifugar cada lavagemResuspender em 500 l 10000 g, 10 min., 4ºC. Poolde LiCl 5M dos sobrenadantes e centrifug.

25000 g, 2 h, 4ºC.Deixar no gelo 15 min. ecentrifugar 16000 g 5 min.,guardar o sobrenadante. Diálise contra PBS 0,01 M

S-Layer (1)

Proposta de extração dos antígenosextracelulares de C. pseudotuberculosis

Obtenção do meio de cultura (BHI) porcentrifugação

(10000 g, 15 min., 4ºC)

Filtração prévia com filtro 0,45 e 0,25 m

Cromatografia de exclusão Sephacryl S-100Superfine

Extracelulares (4)

TTTeeesssttteee 111::: SSSooonnniiicccaaadddooo dddaaa bbbaaaccctttééérrriiiaaa iiinnnttteeeiiirrraaa 5 x 1, 5 x 3 , 3 x 10 min.

TTTeeesssttteee 222::: DDDeeettteeerrrgggeeennnttteeesss eee bbbaaaccctttééérrriiiaaa iiinnnttteeeiiirrraaaDetergentes: CHAPS (amfotérico)

DOC (aniónico) Concentração: 2%, 1 hora,TRITON X-100 (não iónico) a 37 ºC, sob agitaçãoSDS (aniónico: o controle)

TTTeeesssttteee 333::: SSSooonnniiicccaaadddooo eee dddeeettteeerrrgggeeennnttteeesss dddaaa bbbaaaccctttééérrriiiaaa iiinnnttteeeiiirrraaaA depender dos resultados dos testes 1 e 2, extração com

detergentes suaves em baixa concentração (1%), 37ºC, 1 hora e sonicado.

TTTeeesssttteee 444::: VVVaaannntttaaagggeeemmm dddooosss iiinnnhhhiiibbbiiidddooorrreeesss dddeee ppprrrooottteeeaaassseeeCocktail de inhibidores de proteases

TTTeeesssttteee 555::: TTTrrraaatttaaammmeeennntttooosss cccooommm aaasss pppaaarrreeedddeeesss///mmmeeemmmbbbrrraaannnaaasss pppuuurrriiifffiiicccaaadddaaasssA metodologia vai depender dos resultados dos testes 2, 3 e 4

Proposta de extração dos antígenos celulares deC. pseudotuberculosis

Celulares (3)

Esquema de vacinação: (3 coelhos por extrato) • Injeção inicial SC: 0,5 mg de proteína com adjuvante de Freund completo,• Boosts a cada 30 dias, 0,25 mg, SC (Freund incompleto) ou IV (Ag sem adjuvante)• Sangria 15 dias após cada boost.

Obtenção de soro para imunodifusão e Cromatografia de imunoafinidade

(E. Harlow and D. Lane, 1988, Weare et al, 1982)

C. Imunoafinidade ReversaFrações obtidas a partir de PAGE

NÃO DESNATURANTE

ImunodifusãoFrações antigénicas

extraídas (4)

Preparação do soro:• Aquecimento 56ºC, 30 min.• Precipitação com (NH4)2SO4 ou Cromatografia Exclusão• Resuspensão em NaHCO3 (CIAR)• Desalinização (Diálise ou Sephadex G-25) (ID)

Cromatografiade Exclusão

- Sephacryl (S-100 SF),

PAGE preparativo (sem SDS, sem Mercaptoetanol)

para Cromatografia de Imunoafinidade Reversa.

Cromatografia de ImunoAfinidadeReversa

Cromatografia de Exclusão

Purificaçãodos antígenos

S-Layer (1) Extracelulares (4)Intracelulares (2) Celulares (3)

- Dosagem das proteínas (A280, Lowry)Indicadores: - Teste de imunodifusão em gelde progresso - SDS PAGE e Imunoblot

Celulares (3)

Extracelulares (4)

PAGE não desnaturante

Bandas contaminantes

Sóro anti “Contaminantes”

Gel de Sepharose 6MBativado com Brometo

de cyanógeno+

Cromatografia de Imunoafinidade Reversa

Extração por detergentes/Sonicado

E. Celulares (3)

Controle de qualidade

LowryPAGE / Imunoblot

Outros Extratos

E. Intracelulares (2)

E. Extracelulares (4)

E. S-Layer (1)

Soro ID (4)EXTRAÇÃO

•Lowry•Soro ID•PAGE / Imunoblot

Extratos 1 e 2 Extratos 3 e 4

C. Exclusão

C. Exclusão

C. I. A. R.

PURIFICAÇÃO