TATIANA IERVOLINO RICCA

A expresso de Timp1 associada desmetilao de seu

promotor confere resistncia ao anoikis durante a

transformao maligna de melancitos murinos

Tese apresentada Universidade

Federal de So Paulo para obteno

do ttulo de Doutor em Cincias.

So Paulo 2008

Livros Grtis

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TATIANA IERVOLINO RICCA

A expresso de Timp1 associada desmetilao de seu

promotor confere resistncia ao anoikis durante a

transformao maligna de melancitos murinos

Tese preparada durante o Programa de Ps-

Graduao em Microbiologia e Imunologia do

Departamento de Microbiologia, Imunologia e

Parasitologia (DMIP), na Disciplina de Imunologia e

apresentada Universidade Federal de So Paulo

Escola Paulista de Medicina, como requisito parcial

para obteno do ttulo de Doutor em Cincias.

Orientadora: Profa. Dra. Miriam Galvonas Jasiulionis

So Paulo 2008

FICHA CATALOGRFICA

RICCA, Tatiana Iervolino

A expresso de Timp-1 associada desmetilao de seu promotor confere resistncia ao anoikis durante a transformao maligna de melancitos murinos. Tatiana Iervolino Ricca So Paulo, 2008.

xvii, 203f

Tese (Doutorado) Universidade Federal de So Paulo, Escola Paulista de Medicina. Programa de Ps-graduao em Microbiologia e Imunologia.

Ttulo em ingls. Timp-1 expression associated with promoter

demethylation confers anoikis resistance along murine melanocyte malignant transformation.

1. Inibidor de metaloprotease 1 (Timp1). 2. Resistncia ao anoikis. 3. Metilao de DNA. 4. Transformao maligna. 5. Melanoma

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA

DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA

Chefe de Departamento: Prof. Dr. Jos Daniel Lopes

Coordenador do Curso de Ps-Graduao: Prof. Dr. Renato Arruda Mortara

Este trabalho foi desenvolvido na Disciplina de Imunologia do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina, com auxlios financeiros concedidos pela Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) e Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES).

Aos meus pais, Artur e Valquria, pelo amor

e apoio incondicionais, e pelo exemplo de vida

que me guiou at aqui, obrigada. Amo vocs.

Ao meu irmo mais querido, Gustavo, pelo

apoio constante, dedicao, pacincia e amor,

obrigada.

Profa. Dra. Miriam Galvonas Jasiulionis

pela orientao, apoio, pacincia e

perseverana, expresso minha profunda

gratido por sua inabalvel determinao e

pelos ensinamentos que enriqueceram minha

formao profissional, obrigada.

Ao Prof. Dr. Jos Daniel Lopes pelos

valiosos ensinamentos, por sua

disponibilidade e auxlio indispensveis para

a realizao deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

So inmeras as pessoas a quem desejo agradecer pelo apoio e carinho que me

dedicaram durante a realizao deste trabalho. Agradeo:

Aos Professores Doutores da Disciplina de Imunologia, Mario Mariano, Joel

Machado Jnior, Ieda Maria Longo Maugri, Clia Regina Whitaker Carneiro e Zulma

Peixinho, pelo apoio cientfico, sugestes e crticas no decorrer do trabalho.

Dra. Maringela Corra pelo apoio, sensatez, crticas e sugestes valiosas que

foram muito importantes para a execuo deste trabalho.

amiga de todas as horas Fabiana Aliperti que sempre esteve ao meu lado,

trazendo equilbrio em horas difceis, alegria nos momentos de tristeza e muita

pacincia durante todo o meu trajeto. Obrigada pela amizade incondicional, pela

lealdade e por estar aqui sempre quando precisei.

amiga Amanda G. S. Silva pela maravilhosa convivncia, amizade e apoio

constante. Obrigada pelo auxlio tcnico e pelas ricas discusses cientficas que foram

essenciais em muitos momentos do meu trabalho.

queridona amiga Ana Paula Mitsue Suenaga pelo apoio, pacincia,

generosidade, ajuda, principalmente na hora de realizar os ensaios in vivo feitos neste

trabalho, e por sua amizade. A sua presena tornou esse caminho mais fcil.

grande amiga Dra Flvia Vigna pelo seu companheirismo infinito, amizade,

apoio e confiana. A minha gratido no cabe em palavras, mas posso dizer que a

diverso ao seu lado est sempre garantida.

s minhas queridas amigas Adriana Konno, Aline Morgado e Fabiana Toshie pela

presena constante, apoio, pacincia e amizade. Certamente sem vocs no teria sido

to divertido.

Ao meu namorado Aldo de Paula Jnior pelo carinho, sensatez, equilbrio, apoio e

amor dados no final deste importante caminho da minha vida. Obrigada por tudo.

Ao Dr. Rubens Bollos pela amizade, carinho e ensinamentos da vida

Ao amigo Andr Bachi pela lealdade, ajuda nos experimentos, amizade e apoio

ao longo deste difcil caminho. Obrigada por fazer parte da turminha!!!

Ao amigo Leandro S. L. Nunes que trouxe um pouco de testosterona para o

laboratrio, mostrando como tudo mais fcil quando somos prticos. Obrigada

tambm pela amizade, apoio e momentos de alegria.

s meninas do laboratrio, Adriana Taveira da Cruz, Karina Santiago, Alice S.

Moraes, Mariana Toricelli, Camila Souza, Letcia Abigail, Viviane C. Cordaro, Paula

Sola, Fabiana Melo, pela agradvel convivncia, generosidade e incentivo constante.

Aos demais colegas ps-graduandos da Disciplina de Imunologia e da Disciplina

de Microbiologia pelo carinho, apoio e amizade.

Aos Professores e funcionrios do Departamento de Microbiologia, Imunologia e

Parasitologia pelo auxlio.

Aos funcionrios da Disciplina de Imunologia Aparecido Mendes, Geov dos

Santos, Zlia Pereira, Creusa Marina, Ivone Mozat Eraldina do Nascimento, Gislia

Lopes e Creuza Rosa pelo carinho e constante ajuda.

s instituies de fomento CAPES e FAPESP pelo auxilio financeiro.

todos aqueles que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste

trabalho.

NDICE

INTRODUO......................................................................................................... 1

1. Melanoma............................................................................................................. 2. Resistncia ao anoikis e transformao maligna................................................. 3. Timp1....................................................................................................................

3.1 Timp e cncer.................................................................................................3.2 Aspectos gerais de Timp1.............................................................................. 3.3 Timp1 como molcula multifuncional.............................................................

3.3.1 Regulao da proliferao celular......................................................... 3.3.2 Regulao da angiognese...................................................................3.3.3 Regulao da apoptose........................................................................

3.4 Timp1 e eventos epigenticos........................................................................4. Metilao de DNA e cncer.................................................................................. 5. Modelo de transformao neoplsica...................................................................

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1315151616192127

OBJETIVOS............................................................................................................. 31

1. Objetivo geral....................................................................................................... 2. Objetivos especficos............................................................................................

3131

MATERIAL............................................................................................................... 32

1. Comit de tica e Pesquisa................................................................................. 2. Animais................................................................................................................. 3. Anticorpos.............................................................................................................4. Drogas e reagentes.............................................................................................. 5. Enzimas................................................................................................................ 6. Linhagens Celulares............................................................................................. 7. Oligonucleotdeos................................................................................................. 8. Programas............................................................................................................

3232323335363636

MTODOS............................................................................................................... 37

1. Meios de Cultura.................................................................................................. 1.1 Preparao dos meios de cultura...................................................................1.2 Meios para cultivo de bactrias...................................................................... 1.3 Meios para cultivo e manuteno de clulas de mamferos..........................

2. Cultivo e manuteno dos estoques celulares de mamferos.............................. 2.1 Cultivo celular em suspenso........................................................................ 2.2 Cultivo celular em soft-agar............................................................................

3. Desenho dos oligonucleotdeos........................................................................... 4. Extrao de RNA total.......................................................................................... 5. Sntese da primeira fita de DNA complementar (cDNA) Transcrio reversa

e reao de polimerase em cadeia (RT-PCR)..................................................... 6. RT-PCR semiquantitativo..................................................................................... 7. Western Blot............................................................. ........................................... 8. Imunofluorescncia indireta..................................................................................9. Extrao de DNA genmico................................................................................. 10. Tratamento de tecido murino com Liberase....................................................... 11. Tratamento das clulas melan-a com agente desmetilante............................... 12. Tratamento do DNA genmico com bissulfito de sdio......................................13. Desulfonao do DNA tratado com bissulfito de sdio...................................... 14. Methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).. 15. Construo do plasmdeo de expresso............................................................ 16. Preparao de bactrias competentes............................................................... 17. Transformao de bactrias competentes por CaCl2.............................................................18. Mini-preparao para extrao de DNA plasmidial (MiniPrep)......................... 19. Seleo dos clones pcDNA3.1-T1S................................................................... 20. Confirmao da seqncia dos clones selecionados por seqenciamento

de DNA............................................................................................................... 21. Maxi-preparao para extrao de DNA plasmidial (MaxiPrep) ...................... 22. Purificao plasmidial por coluna de gradiente de Csio (CsCl2) ..................... 23. Tranfeco de DNA plasmidial com lipossomos em clulas de camundongo.. 24. Ensaio de proliferao celular in vitro.................................................................25. Ensaio de ciclo celular...................................................................................... 26. Tumorignese in vivo......................................................................................... 27. Ensaio de metstase experimental....................................................................

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28. Zimograma......................................................................................................... 29. Imunohistoqumica............................................................................................. 30. Ensaio de migrao celular in vitro.....................................................................31. Ensaio de invaso celular in vitro....................................................................... 32. Ensaio de imunoprecipitao............................................................................. 33. Anlise Estatstica..............................................................................................

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RESULTADOS......................................................................................................... 68

1. Transformao maligna associada com resistncia ao anoikis........................... 1.1 Morfologia das linhagens ao longo da transformao maligna 1.2 Anlise da proliferao celular in vitro e tumorigenicidade in vivo das

linhagens celulares derivadas das clulas melan-a....................................... 1.3 Anlise da resistncia ao anoikis ao longo da transformao maligna

dos melancitos............................................................................................. 2. Padro de expresso de Timp1 ao longo da transformao maligna..................

2.1 Anlise da atividade de Mmps reguladas por Timp1 ao longo da transformao maligna dos melancitos..................................

3. Expresso de Timp1 regulada por mecanismos epigenticos............................. 3.1 Expresso do RNA mensageiro de Timp1 em clulas melan-a aps

tratamento com agente desmetilante...............................................................3.2 Presena de dinucleotdeos CpG na seqncia genmica do gene Timp1...3.3 Nvel da metilao de DNA no gene Timp1.

4. Papel da expresso de Timp1 nos melancitos e em clulas de melanoma...............................................................................................................

4.1 Expresso do RNA mensageiro de Timp1 em clulas melan-a e Tm5 aps transfeco com plasmdeo de expresso para Timp1.........................

4.2 Superexpresso de Timp1 no influencia na proliferao celular... 4.3 A superexpresso de Timp1 causa resistncia ao anoikis em

melancitos e em clulas de melanoma cultivados por 96 horas em suspenso......................................................................................................

4.4 A superexpresso de Timp1 causa resistncia ao anoikis em melancitos melan-a cultivados em soft-agar................................................

4.5 A superexpresso de Timp1 causada pelo tratamento com agente desmetilante 5-Aza-CdR no resulta na resistncia ao anoikis em melancitos melan-a.....................

4.6 A superexpresso de Timp1 em melancitos melan-a no capaz de induzir crescimento tumoral in vivo...

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4.7 A superexpresso de Timp1 aumenta a migrao in vitro de clulas de melanoma....... ..............................

4.8 A superexpresso de Timp1 em clulas de melanoma no resulta em fentipo mais invasivo in vitro........

4.9 Possvel participao de Timp1 na sinalizao celular..................................

98

101104

DISCUSSO............................................................................................................ 106

REFERNCIAS........................................................................................................ 116

ABSTRACT

APNDICE

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Modelo de progresso do melanoma proposto por Clark......................... Figura 2. Principais passos na formao da metstase........................................... Figura 3. Estrutura primria da protena TIMP1....................................................... Figura 4. Mapa esquemtico de genes que flanqueiam TIMP1............................... Figura 5. Mecanismo de metilao de DNA............................................................. Figura 6. Metilao de DNA e cncer.......................................................................Figura 7. Modelo de transformao maligna de melancitos associado resistncia ao anoikis........................................................................... Figura 8. Produto de RT-PCR gerado a partir de cDNA enriquecido para o gene Timp1................................................................................ Figura 9. Esquema de seleo dos clones de Timp1 senso e anti-senso............... Figura 10. Morfologia dos melancitos melan-a e das linhagens obtidas aps ciclos seqenciais de bloqueio de ancoragem......................................................... Figura 11. Proliferao celular in vitro...................................................................... Figura 12: Tumorigenicidade in vivo das linhagens derivadas de clulas melan-a..Figura 13: Linhagens estabelecidas aps submeter melancitos a ciclos seqenciais de bloqueio de ancoragem so mais resistentes ao anoikis que a linhagem parental melan-a....................................................................................... Figura 14. Cluster de genes associados ao cncer de Mus Musculus.................... Figura 15. Aumento da expresso do RNA mensageiro de Timp1 durante a transformao maligna dos melancitos melan-a.................................................... Figura 16. Anlise da expresso da protena Timp1 durante a transformao maligna dos melancitos melan-a............................................................................ Figura 17. Anlise da atividade das metaloproteases 2 e 9 durante a transformao maligna dos melancitos melan-a.................................................... Figura 18. O tratamento com agente desmetilante induz a expresso de Timp1 em melancitos melan-a.......................................................................................... Figura 19. Representao esquemtica da localizao dos stios CpG no promotor e primeiro exon de Timp1......................................................................... Figura 20. A desmetilao do promotor e primeiro exon de Timp1 est correlacionada com sua expresso nos melancitos melan-a................................. Figura 21. A desmetilao progressiva do promotor e primeiro exon de Timp1 est correlacionada com sua expresso durante a transformao neoplsica dos melancitos melan-a............................................... Figura 22. Superexpresso de Timp1 em melancitos melan-a e em clulas de melanoma Tm5..............................................................................

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Figura 23. A superexpresso de Timp1 no afeta a proliferao das linhagens melan-a e Tm5.................................................................................. Figura 24. Clulas melan-a superexpressando Timp1 tornam-se resistentes ao anoikis...................................................................................................................... Figura 25. Clulas melan-a expressando Timp1 so capazes de formar colnias em soft-agar como a linhagem de melanoma Tm5................... Figura 26. Clulas melan-a tratadas com agente desmetilante no se tornam resistentes ao anoikis....................................................................... Figura 27. Ensaio de tumorigenicidade in vivo de melancitos melan-a superexpressando Timp1......................................................................................... Figura 28. Ensaio de tumorigenicidade in vivo de clulas de melanoma Tm5 superexpressando Timp1......................................................................................... Figura 29. Metstase experimental in vivo de clulas de melanoma Tm5 superexpressando Timp1......................................................................................... Figura 30. Ensaio de migrao celular in vitro dos melancitos melan-a e de clulas de melanoma Tm5 superexpressando Timp1.............................................. Figura 31. Ensaio de invaso celular in vitro dos melancitos melan-a e de clulas de melanoma Tm5 superexpressando Timp1.............................................. Figura 32. A protena Timp1 est associada com 1 integrinas..............................

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LISTA DE ABREVIATURAS

g micrograma

L microlitro

M micromolar

1C linhagem obtida aps submeter cluals melan-a um ciclo de

bloqueio da adeso ao substrato.

2C linhagem obtida aps submeter cluals 1C um ciclo de

bloqueio da adeso ao substrato.

3C linhagem obtida aps submeter cluals 2C um ciclo de

bloqueio da adeso ao substrato.

4C linhagem obtida aps submeter cluals 3C um ciclo de

bloqueio da adeso ao substrato.

4C3, 4C11, Tm1 e Tm5 diferentes linhagens de melanoma obtidas a partir da

diluio limitante de esferides formados aps submeter a

linhagem 4C a um ciclo de bloqueio da adeso ao substrato.

ATP adenosina-trifosfato

bp pares de base

BSA soro albumina bovina

cDNA DNA complementar

dinucleotdeo CpG nucleotdeo citosina precedido de uma guanina

DNA cido desoxirribonucleico

DNMT DNA metiltransferase

DTT ditiotreitol

EDTA cido etilenodiamino tetractico

FACS Fluorescence Activeted Cell Sorting

GST gene suppressor de tumor

Ig Imunoglobulina

IL interleucina

ilha CpG regio rica em dinucleotdeos CpG

Kb quilo base

kDa quilo Dalton

MB membrana basal

MBD methyl binding protein

MEC matrix extracelular

mg miligrama

mL mililitro

mM milimolar

MMP metaloprotease de matriz

nM nanomolar

pb pares de base

PBS Tampo salino fosfato

PCR Reao em cadeia da polimerase

PMA ster de forbol-miristato

RGP melanoma primrio de fase de crescimento radial

RNA cido ribonuclico

rpm rotao por minuto

SDS dodecil sulfato de sdio

SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis

Timp inibidor de metaloprotease de matriz

v/v volume a volume

VGP melanoma primrio de fase de crescimento vertical

RESUMO

Embora a resistncia ao anoikis seja considerada um importante processo

envolvido no fentipo maligno, a relao causal entre transformao neoplsica e

crescimento independente de ancoragem continua indefinida. Para estudar essa

correlao, foi desenvolvido em nosso laboratrio um modelo experimental de

transformao maligna de melancitos murinos, em que melancitos melan-a foram

submetidos a ciclos seqenciais de bloqueio de ancoragem. Ao longo deste processo,

foram estabelecidas tanto linhagens celulares correspondendo a fases intermedirias

da progresso tumoral como linhagens de melanoma, as quais so progressivamente

resistentes ao anoikis e representam fases distintas da progresso tumoral. Anlises de

expresso gnica mostraram aumento da expresso de Timp1 nas linhagens de

melanoma quando comparadas linhagem parental de melancitos. Ainda que descrita

como inibidora de MMPs, essa protena foi recentemente associada resistncia ao

anoikis em clulas epiteliais de mama humana. Deste modo foram analisadas neste

trabalho: 1) a relao entre expresso de Timp1 e aquisio do fentipo resistente ao

anoikis e 2) a possvel regulao epigentica da expresso de Timp1 por metilao de

DNA neste modelo. Enquanto clulas melan-a expressam baixos nveis de Timp1,

todas as linhagens derivadas desta expressam nveis elevados desta protena. O

tratamento dos melancitos melan-a com o agente desmetilante 5-aza-2-deoxicitidina

resultou em aumento significativo da expresso de Timp1. De fato, a anlise pelo

ensaio Methylation sensitive-Single Nucleotide Primer Extension (Ms-SNuPE) mostrou

aumento progressivo na desmetilao do gene Timp1 em paralelo a sua crescente

expresso ao longo da transformao maligna. A superexpresso de Timp1 em clulas

melan-a resultou no aumento da sobrevivncia das mesmas em condies

independentes de ancoragem, mas foi incapaz de transform-las. Alm disso, o tempo

de latncia para o aparecimento de tumores foi menor para clulas de melanoma

transfectadas com Timp1, indicando que esta molcula pode estar associada com a

agressividade do tumor. Esses resultados mostram aumento da expresso de Timp1

durante a transformao maligna, em decorrncia da desmetilao gnica progressiva,

associado ao aumento da resistncia ao anoikis, mas no aquisio de um fentipo

maligno transformado.

INTRODUO

Introduo

1. Melanoma

Em 2005 o cncer foi responsvel por 13% das mortes ocorridas no mundo,

sendo que mais de 70% destas ocorreram em pases de mdia ou baixa renda (WHO,

2006). No ano passado, foram estimados 59.940 novos casos de melanoma nos

Estados Unidos, com uma expectativa de 8.110 mortes (American Cancer Society,

2007). Estima-se que em 2008 dentre todos os tipos de cncer o de pele ser o mais

incidente na populao brasileira com 120.930 casos novos, dos quais 4,9% sero de

melanoma (INCA, 2007). Mesmo sendo o tipo de cncer de pele mais raro, o

melanoma responsvel pela maioria das mortes (aproximadamente 80%)

relacionadas ao cncer de pele (Lewis et al., 2005; Medic et al., 2007), sendo que

apenas 14% dos pacientes com melanoma metasttico sobrevivem por cinco anos

(American Cancer Society, 2003).

A maioria dos pacientes diagnosticados com melanoma primrio curada aps

exciso cirrgica do tumor (Miller & Mihm, 2006). Porm, em estdios avanados

raramente tratvel por no responder s formas de terapia utilizadas atualmente e

por isso apresenta prognstico ruim com taxa de sobrevida mdia de seis meses

(Wascher et al., 2003; Miller & Mihm, 2006). Diferente da maioria, o melanoma no est

associado idade, sendo um dos tipos de cncer mais comuns e letais entre pessoas

na faixa dos 20 a 35 anos. Por afligir jovens e adultos na meia idade, o impacto

socioeconmico e psicolgico enorme, pois h perda de produtividade destes

indivduos causada pela patologia (Houghton & Polsky, 2002; Tsao et al., 2004).

Os principais fatores de risco para o desenvolvimento do melanoma so histrico

familiar, mltiplos nevos (benignos ou atpicos) e ocorrncia de melanoma prvio.

Fatores de risco adicionais incluem sensibilidade ao sol, exposio solar excessiva e

doenas imunossupressoras. Cada um desses fatores corresponde a uma

predisposio gentica ou um estressor ambiental que contribuiro para a gnese do

melanoma (Miller & Mihm, 2006). Alis, o melanoma visto como um dos melhores

exemplos de como gentica e meio ambiente interagem na patogenicidade do tumor

(Houghton & Polsky, 2002), j que sua incidncia influenciada pela cor da pele e

parmetros geogrficos como altitude e latitude (Armstrong & Kricker, 2001).

1

Introduo

A exposio radiao ultravioleta o nico fator de risco relacionado ao meio

ambiente conhecido em melanoma e o aumento dramtico na incidncia de

melanomas nos ltimos 50 anos pode ser associado em parte s mudanas de hbitos

em relao ao sol (Tsao et al., 2004), j que ocorre mais frequentemente em locais do

corpo que so expostos radiao solar. Alm disso, o melanoma

predominantemente uma doena de populaes de pele clara e sua incidncia de 5 a

20 vezes menor nas populaes de pele escura. Dentro da populao caucasiana, a

incidncia influenciada pela proximidade ao Equador, sugerindo uma associao

desta doena com a exposio solar. Nos Estados Unidos esta relao bem evidente,

j que a incidncia do melanoma de duas a trs vezes maior nos estados do Sul

quando comparada aos estados do Norte (American Cancer Society, 2007). Por outro

lado, dados epidemiolgicos sugerem que exposies crnicas ou de baixo grau luz

ultravioleta induzem proteo contra danos ao DNA, enquanto que exposies intensas

e intermitentes com freqentes queimaduras causam danos genticos (Gilchrest et al.,

1999).

O melanoma se origina a partir dos melancitos epidermais ou a partir de clulas

precursoras de melancitos. Melancitos so clulas produtoras do pigmento melanina,

derivadas da crista neural, que migram para a pele durante o desenvolvimento e esto

normalmente confinadas sobre a membrana basal da epiderme num padro no

randmico (Bennett, 1993; Hsu et al., 2002). Por meio de prolongamentos dendrticos,

os melancitos interagem com queratincitos que se encontram na camada basal e

superficial da pele (Miller & Mihm, 2006). Cada melancito transfere melanossomos

contendo pigmentos por estes prolongamentos para aproximadamente 36

queratincitos basais e suprabasais, formando a unidade de melanina epidermal. Uma

vez nos queratincitos, o pigmento protege a pele da absoro de radiao solar

nociva. Os queratincitos so considerados parceiros celulares dominantes dos

melancitos na epiderme e so capazes de controlar a proliferao, grau de

prolongamento dendrtico (morfologia) e quantidade de melanina contida nos

melancitos, por estabelecerem contato direto por meio de receptores de adeso

clula-clula, como a E-caderina (Meier et al., 1998; Hsu et al., 2002).

2

Introduo

Baseado em caractersticas clnicas e histopatolgicas, cinco fases da progresso

do melanoma foram propostas (Clark et al., 1984; Meier, 1998): clusters de melancitos

normais (nevo comum), nevo displsico, melanoma primrio de fase de crescimento

radial (RGP), melanoma primrio de crescimento vertical (VGP), e melanoma

metasttico (Figura 1).

A progresso de um melancito para um nevo comum e no acompanha

mudanas genticas. O nevo comum tem tempo de vida finito e geralmente no

carrega anormalidades citogenticas (Mancianti et al., 1993). Meier e colaboradores

(1998) acreditam que essa progresso ocorra pela perda de controle do

comportamento dos melancitos pelos queratincitos, mediada pelo contato normal

clula-clula. Realmente, alteraes na expresso de molculas de adeso celular

como caderinas, integrinas e protenas da superfamlia das imunoglobulinas so

importantes para o crescimento e a metstase do melanoma (McGary et al., 2002). A

diminuio dos nveis de E-caderina parece ser responsvel pela reduo da interao

entre melancitos e queratincitos (Hsu et al., 1996; Li et al., 2001). De modo inverso, o

aumento nos nveis de N-caderina pode permitir que clulas de melanoma interajam

com fibroblastos presentes no estroma (Smalley ecol., 2005), o que pode facilitar sua

sobrevivncia fora da epiderme (Hsu et al., 2002; Haass et al., 2005).

Mudanas genticas acompanham o desenvolvimento de nevos displsicos que

apresentam citologia e arquitetura atpicas, e so considerados precursores do

melanoma (Kraemer & Greene, 1985). Estas clulas podem surgir a partir de um nevo

comum preexistente ou como novas leses (Miller & Mihm, 2006).

O aparecimento do melanoma primrio RGP gradual e espontneo, e pode no

requerer mudanas moleculares adicionais. Estas clulas so capazes de se espalhar

horizontalmente na epiderme e na parte superior da derme, mas so raramente

metastticas (Houghton & Polsky, 2002) e por isso esto associados a um bom

prognstico (Gaglioli & Sahai, 2007).

3

Introduo

Figura 1. Modelo de progresso do melanoma proposto por Clark. Os melanomas so classificados histologicamente de acordo com sua locao e estgio da progresso. Cinco estgios foram propostos

na evoluo do melanoma com base nesses critrios histolgicos: nevo adquirido e congnito comum

sem mudanas displsicas; nevo displsico com estrutura e arquitetura atpicas; melanoma primrio de

fase de crescimento radial (RGP), melanoma primrio de crescimento vertical (VGP), e melanoma

metasttico (Clark et al., 1984). Figura modificada de Miller & Mihm, 2006.

4

Introduo

Invaso local e metastatizao so processos responsveis pela morbidade e

mortalidade associadas ao melanoma. O aparecimento de caractersticas invasivas

ocorre na fase de crescimento vertical (VGP), quando clulas de melanoma so

capazes de penetrar a membrana basal, crescer intradermicamente e metastatizar

(Guerry et al., 1993). Alm disso, essas clulas apresentam inmeras anormalidades

citogenticas, sugerindo uma considervel instabilidade genmica (Meier et al., 1998).

O desenvolvimento do melanoma metasttico, a partir de melanomas primrios

VGP, ocorre quando essas clulas dissociam-se da leso primria, migram atravs do

estroma adjacente e invadem os vasos linfticos e/ou sangneos para formar o tumor

em stios distantes (Haass et al., 2005). A invaso e migrao do melanoma esto

relacionadas com alteraes na adeso celular. Normalmente, a adeso celular

controla a migrao da clula, organizao dos tecidos e organognese (Johnson,

1999). Distrbios na adeso contribuem para a invaso do tumor, interao tumor-

estroma e sinalizao entre clulas tumorais e clulas normais (Miller & Mihm, 2006)

Embora haja na literatura inmeros trabalhos com diferentes modelos (tecidos,

linhagens celulares e anticorpos) indicando mudanas em vrias molculas envolvidas

na gnese do melanoma, as alteraes responsveis pelo desenvolvimento e a

progresso do melanoma ainda no so totalmente conhecidas.

5

Introduo

2. Resistncia ao anoikis e transformao maligna

Em organismos multicelulares, as clulas no vivem isoladas, ao invs disso, elas

encontram-se associadas com clulas vizinhas e com o ambiente extracelular (Assoian,

1997), do qual a matriz extracelular (MEC) faz parte. Alm de servir como suporte fsico

para a adeso das clulas, a MEC tambm garante a elas informao necessria para

sua proliferao, migrao, diferenciao e sobrevivncia em relao ao seu contexto

dentro de um rgo ou tecido (Lukashev & Werb, 1998; Valentijn et al., 2004).

A ancoragem da clula aos componentes da MEC mediada por molculas de

adeso do tipo integrinas, que alm de garantirem a ligao estrutural entre a MEC e o

citoesqueleto, so responsveis pela ativao de molculas de sinalizao que iro

governar seu destino (Reddig & Juliano, 2005; Sepulveda et al., 2005). A perda do

contato das integrinas com os componentes da MEC tem efeito deletrio para a vida de

uma clula, o que a leva a um tipo especfico de apoptose, denominado anoikis (Frisch

& Francis, 1994). Esse fenmeno ocorre mesmo quando elas so cultivadas na

presena de todos os fatores de crescimento e nutrientes necessrios sua

sobrevivncia (Meredith et al., 1993). Durante o processo de anoikis, todos os aspectos

que caracterizam a apoptose, incluindo fragmentao nuclear e permeabilidade da

membrana, so observados (Fadeel & Orrenius, 2005).

O anoikis foi descoberto primeiramente em clulas epiteliais, mas j foi observado

em inmeros tipos celulares (Meredith et al., 1993; Frisch & Francis, 1994). Estudos

mostraram sua participao durante o desenvolvimento embrionrio (Coucouvanis &

Martin, 1995) e na manuteno da homeostase de diferentes tecidos como a pele

(Polakowska et al.,1994), tecido epitelial (Hall et al., 1994) e glndulas mamrias

(Boudreau et al., 1995). Quando o controle do anoikis perdido, clulas aderentes

podem tanto entrar em uma fase estacionria do ciclo celular, como proliferar sem as

restries de adeso at que um ambiente adequado seja encontrado (Frisch &

Ruoslahti, 1997; Reed, 1999; Frisch & Screaton, 2001).

A capacidade de sobreviver independentemente de ancoragem considerada

passo importante para a transformao maligna das clulas, alm de ter participao

fundamental durante a progresso tumoral atravs do aumento do tempo de

sobrevivncia na ausncia da adeso, facilitando a migrao e a colonizao em

6

Introduo

rgos distantes (Shanmugathasan & Jothy, 2000; Grossmann, 2002; Daz-Montero &

McIntyre, 2003). Em modelos animais, os tumores resistentes ao anoikis apresentam

incidncia maior de leses metastticas e aumento na sobrevivncia de clulas

circulantes no sangue (Howlett et al., 1995; Nikiforov et al., 1996; Zhu et al., 2001).

Particularmente em tumores no epiteliais como melanomas, foi demonstrado que a

transformao neoplsica confere resistncia ao anoikis (Petitclerc et al., 1999; Zhu et

al., 2001). Esta propriedade, observada nas clulas quando cultivadas in vitro, pode ser

correlacionada ao seu potencial oncognico encontrado in vivo (Wang, 2004).

A resistncia ao anoikis pode ser decorrente de vrios mecanismos como

alteraes no padro de molculas de adeso celular, perda da funo de genes

supressores de tumor, como PTEN e p53, expresso de oncogenes, como ras, raf, rac

e src, aumento no nvel de sinais de sobrevivncia, inativao de membros envolvidos

em vias de sinalizao de sobrevicncia ou mesmo defeitos na execuo das mesmas

(Hanahan & Weinberg, 2000; Grossmann, 2002). A diferena de expresso desses

fatores influenciada pelo ambiente, microambiente, fatores genticos e epigenticos,

e, como so fundamentais em vrios processos biolgicos, pode contribuir tanto com o

incio da transformao maligna como com a progresso tumoral (McGary et al., 2002).

Apesar da forte correlao entre a resistncia de clulas transformadas ao anoikis

e sua capacidade de formar tumores in vivo, a evidncia direta de uma relao causal

entre estas duas caractersticas ainda no foi claramente estabelecida.

7

Introduo

3. Timp1

3.1 Timp e cncer

A metstase responsvel pela maioria das mortes causadas pelo cncer e o

processo de sua formao pode ser resumido em uma srie de passos distintos em

que a clula tumoral deixa o tumor primrio, invade os tecidos adjacentes e migra para

stios distantes atravs do sistema circulatrio, onde estabelece o tumor secundrio

(Woodhouse et al., 1997). Durante esse processo, necessrio que essas clulas

adquiram caractersticas que as tornem capazes de migrar por diferentes

compartimentos e invadir a MEC (Figura 2).

A principal barreira que impede a disseminao tumoral a membrana basal

(MB), uma forma especializada de MEC composta de uma rede de colgeno tipo IV,

laminina, perlecan e nidognio (Albini, 1998). A invaso da MB considerada um

evento fisiolgico raro, regulado cuidadosamente, que ocorre, por exemplo, durante o

desenvolvimento placentrio, quando clulas trofoblsticas invadem o endomtrio, e

durante a angiognese, onde clulas endoteliais invadem sua prpria membrana basal

vascular a fim de extravasar e formar um novo capilar (Liotta et al., 1991). Por isso, o

tumor classificado como no invasivo enquanto suas clulas permanecerem dentro

das barreiras da MB e torna-se invasivo a partir do momento em que adquirem a

capacidade de romp-las e invadir tecidos adjacentes (Kopfstein & Christofori, 2006).

8

Introduo

Figura 2. Principais passos na formao da metstase. O primeiro passo (a) ocorre com a transformao celular e proliferao tumoral, seguido de intensa vascularizao que ocorre geralmente

quando a massa do tumor excede 2 mm de dimetro (b). A invaso local ocorre (c) e a desadeso e a embolizao de uma nica clula ou de clulas agregadas (d) ocorre em seguida. Aps sobreviverem na circulao sanginea, as clulas tumorais ficam presas nos capilares de rgos distantes por aderirem

nas clulas do endotlio capilar. O extravasamento ocorre depois (e), provavelmente pelos mesmos mecanismos envolvidos na invaso inicial. A proliferao dentro do rgo secundrio completa o

processo metasttico (f). Para continuar proliferando, a micrometstase precisa desenvolver uma rede de vasos e escapar das defesas do organismo. Figura modificada de Fidler, 2003.

9

Introduo

Enzimas proteolticas, atravs da capacidade em degradar as protenas da MEC,

tornam-se componentes importantes para o processo de transformao maligna das

clulas. Com o seqenciamento do genoma humano, mais de 500 genes foram

identificados como codificadores de proteases ou protenas do tipo protease, com um

nmero enorme sendo associado ao processo tumoral (Lpez-Otn & Overall, 2002).

Dentre estas, as metaloproteases de matriz (MMPs) um grupo de 24 enzimas que

degradam os componentes da MEC e da MB (Brinckerhoff & Matrisian, 2002) tm

sido o foco de muitas pesquisas contra o cncer (Coussens et al., 2002; Egeblad &

Werb, 2002). Essa famlia de glicoprotenas secretada como pr-enzima latente,

ativada pela protelise de uma regio conservada presente no domnio N-terminal e

est dividida em seis grupos dependendo do tipo de substrato que degradam (Visse &

Nagase, 2003).

As MMPs so reguladas tanto em nvel transcricional como traducional

(Westermarck & Khri, 1999). Esses mecanismos de regulao operam

coordenadamente para garantir que a expresso e a atividade das MMPs ocorram

apenas onde a protelise necessria. Entretanto, tumores malignos apresentam

estratgias que evitam esses mecanismos reguladores e propiciam atividade

proteoltica que acompanha o desenvolvimento do cncer e da metstase (Overall &

Lpez-Otn, 2002).

A transcrio gnica das MMPs influenciada por fatores que incluem citocinas,

fatores de crescimento, hormnios, oncogenes e promotores tumorais (Westermarck &

Khri, 1999). Em nvel protico, a atividade biolgica das MMPs determinada por

seu estado de ativao. Como descrito anteriormente, a maioria das MMPs secretada

pelas clulas em forma latente e a converso para sua forma funcionalmente ativa

requer um processo de ativao de vrios passos especficos (Hofmann et al., 2005).

Aps ativao, a atividade das MMPs modulada atravs de inibidores comuns de

endopeptidases, como as 2-macroglobulinas, que esto presentes no plasma e fludo

dos tecidos e, mais especificamente, pelos inibidores de metaloproteases de matriz

(TIMPs) (Overall & Lpez-Otn, 2002; Hofmann et al., 2005). Quatro membros da

famlia TIMP (TIMP1, TIMP2, TIMP3 e TIMP4) foram identificados em vertebrados, e

podem ser encontrados ancorados na MEC ou secretados pela clula (Brew et al.,

2000). TIMPs so protenas de 21 a 34 kDa, que possuem uma estrutura com dois

10

Introduo

domnios, um N- e um C-terminal de 125 e 65 aminocidos, respectivamente, com cada

um contendo trs ligaes dissulfeto conservadas (Williamson et al., 1990; Murphy et

al., 1991) (Figura 3). O domnio N-terminal contm a regio de maior homologia entre os quatro membros e suficiente para inibir a atividade proteoltica das MMPs (Murphy

et al., 1991; Willenbrock & Murphy, 1994; Caterina et al., 1997; Huang et al., 1997). A

inibio das MMPs pelos TIMPs ocorre atravs de ligao resistente denaturao

pelo calor e degradao proteoltica, mas reversvel e no-covalente, formando um

complexo estequiomtrico de 1:1 (Gomez et al., 1997; Brew et al., 2000). O domnio C-

terminal de TIMP parece ser importante para a interao com outras protenas e para a

formao de complexos com as pr-MMPs, retardando ou at impedindo o processo de

ativao das MMPs (Lambert et al., 2004).

O balano entre as atividades da protease e do inibidor determina o potencial

proteoltico do tumor, e a diminuio nos nveis de TIMP est geralmente

correlacionada com a tumorignese (Khokha et al., 1989). Desse modo, aumentos de

expresso e atividade das MMPs so encontrados em quase todos os cnceres

humanos. Interessantemente, a expresso de seus inibidores, TIMPs, tambm se

encontra geralmente aumentada em vrios cnceres. Dentre eles, TIMP1 foi associado

a um prognstico negativo em muitos cnceres humanos incluindo cncer de mama

metasttico, cncer coloretal, linfoma e carcinoma de pulmo (non-small cell lung

carcinoma), sugerindo um valor promissor de TIMP1 como marcador prognstico do

tumor (Kossakowska et al., 1991; Zeng et al., 1995; Fong et al., 1996; Ree et al., 1997;

McCarthy et al., 1999; Schrohl et al., 2004). Este foi um achado inicialmente inesperado

considerando o papel bem estabelecido de TIMP1 na inibio da degradao da MEC

pelas MMPs, invaso da clula tumoral e formao de metstases.

11

Introduo

Figura 3. Estrutura primria da protena TIMP1. O diagrama mostra uma reprentao esquemtica da seqncia de aminocidos de TIMP1, incluindo seis pontes dissulfeto formadas pela ligao de cistenas.

Os stios de N-glicosilao encontram-se nos aminocidos 30 e 78 (Q). Na figura esto indicadas as alas formadas pelas pontes dissulfeto (L1 a L6) e a juno entre os domnios N- e C-terminal da protena (Stop). Figura modificada de Caterina et al., 1998.

12

Introduo

3.2 Aspectos gerais de TIMP1

O gene TIMP1 est localizado no cromossomo humano Xp11.1-p11.4 e seu RNA

mensageiro (mRNA) de 900pb codifica uma protena de 184 aminocidos e de massa

molecular variando de 29 a 34kDa, dependendo do grau de glicosilao (Carmichael et

al., 1986; Huebner et al., 1986; Lambert et al., 2004). Essa glicosilao parece ter papel

em vrias funes incluindo a conformao correta da protena, o transporte da

molcula para a superfcie da clula e o aumento de sua estabilidade (Caterina et al.,

1998). Derry e Barnard (1992) demonstraram que o gene TIMP1 encontra-se dentro do

intron seis do gene synapsin I (SYN1) tanto em camundongos como em humanos

(Figura 4). Sua transcrio ocorre na direo oposta deste gene em camundongos e presumivelmente em humanos. O gene ARAF, que tambm transcrito na mesma

direo de TIMP1, est situado a 10kb de distncia (Derry & Barnard, 1992).

TIMP1 na maioria das vezes apresenta-se na forma solvel e sua expresso

induzida e geralmente tecido-especfica, sendo maior no sistema reprodutivo (Chirco et

al, 2006), embora j tenha sido descrita em uma variedade de culturas celulares

(Welgus et al., 1985; Cawston et al., 1986; Bord et al., 1999; Ries et al., 1999).

Camundongos que tiveram o gene Timp1 silenciado permanecem viveis, mas

apresentam reduo no tempo de vida reprodutivo e aumento na resistncia a

Pseudomonas aeruginosas (Gomez et al., 1997).

O promotor de TIMP1 no possui TATA box e a regulao de sua expresso

ocorre primariamente em nvel transcricional envolvendo vrios elementos responsivos

como AP-1, Sp1, NF-kappaB e fatores de transcrio CRE (Logan et al., 1996; Botelho

et al., 1998; Trim et al., 2000; Dean et al., 2000; Sohara et al., 2002; Aicher et al.,

2003; Bachmeier et al., 2005). Consequentemente, a expresso de TIMP1 regulada

por vrios fatores incluindo steres de forbol, soro, citocinas (TGF-, IL-6, IL-1 e IL-1),

fatores de crescimento (b-FGF, PDGF, EGF), entre outros (Gomez et al., 1997;

Lambert et al., 2004). Embora ainda no esteja claro como a regulao da expresso

de TIMP1 ocorre em cnceres humanos e se o aumento de sua expresso contribui ou

no para a progresso do tumor, muitos estudos clnicos o reportam como um

promissor marcador tumoral em malignidades humanas.

13

Introduo

Figura 4. Mapa esquemtico de genes que flanqueiam TIMP1. O gene TIMP1 encontra-se no cromossomo X dentro do intron seis do gene SYN1, mas com transcrio oposta. O gene ARAF1 est

situado a 10kb de distncia de TIMP1 e transcrito na mesma direo. Os demais genes, ELK1, ZNF41

e ZNF157, encontram-se num raio de aproximadamente 100kb de distncia de TIMP1. Tel: telmero;

Cen: centrmero. Figura modificada de Anderson e Brown, 1999.

14

Introduo

Sabe-se que TIMP1 inibe a atividade da maioria das MMPs, exceto MMP-19 e

vrios membros da subfamlia das metaloproteases tipo membrana (MT-MMPs), e

suprime a atividade da desintegrina e metaloprotease 10 (ADAM-10) (Baker et al.,

2002). Alm de se ligar no stio ativo das MMPs, TIMP1 tambm capaz de formar um

complexo estvel com a pr-MMP9 atravs de seu domnio C-terminal, retardando sua

ativao (Fassina et al., 2000).

3.3 Outras funes de TIMP1

A funo primria descrita para a famlia TIMP foi sua habilidade de inibir as

MMPs, entretanto inmeros trabalhos tm relatado uma variedade de outras funes

como induo da proliferao celular, inibio da angiognese, participao na

embriognese e inibio de apoptose. Algumas destas funes so atribudas

inibio das MMPs, entretando dados recentes da literatura tm monstrado que TIMPs

tambm exibem atividades celulares independentes desta inibio.

3.3.1 Regulao da proliferao celular

Quando TIMP1 foi identificado, foi descoberto ser idntico protena de

potencializao da atividade eritride (EPA), capaz de estimular a proliferao e

diferenciao de precursores dos eritrcitos murinos, clulas de leucemia mielide

crnica humana K-562, e da linhagem celular de leucemia ELM-1-1-3 (Gasson et al.,

1985; Docherty et al., 1985; Niskanen et al., 1988; Murate et al., 1993). Desde ento

inmeros trabalhos descreveram seu papel na promoo da proliferao de diversos

tipos celulares incluindo queratincitos, condrcitos, fibroblastos, clulas epiteliais e

endoteliais, clulas linfides e mielides, hepatoma, carcinoma de mama e

osteosarcoma humano (Bertaux et al., 1991; Hayakawa et al, 1992; Yamashita et al.,

1996; Kikuchi et al., 1997; Fata et al., 1999; Baker et al., 2002; Wang et al., 2002). Uma

srie de resultados parece provar que a promoo da proliferao celular por TIMP1

ocorre independentemente de sua atividade de inibir as MMPs, j que a reduo da

15

Introduo

capacidade inibidora de TIMP1 no altera sua habilidade em estimular a proliferao

celular (Hayakawa et al., 1994; Chesler et al., 1995; Guedez et al., 1998a).

3.3.2 Regulao da angiognese

O processo de angiognese requer a invaso da clula endotelial na matriz

intersticial (Carmeliet & Jain, 2000). Portanto, os efeitos pr-angiognicos das MMPs

via degradao dos componentes da MEC e as atividades anti-angiognicas dos

TIMPs atravs da capacidade de inibir as MMPs tm sido extensivamente estudados in

vitro, assim como em modelos animais (Fassina et al., 2000). O envolvimento dos

TIMPs na angiognese foi demonstrado pela primeira vez em embries de galinhas

onde a angiognese foi inibida por TIMP1 e TIMP2 (Takigawa et al., 1990). A

superexpresso de TIMP1 em clulas tumorais pancreticas reduziu a angiognese e a

implantao destas clulas (Bloomston et al., 2002). Como TIMP1 est principalmente

envolvido no controle da MMP9, uma das molculas que medeia o processo de

extravasamento celular pela digesto do colgeno tipo IV da MB vascular, esta

atividade anti-angiognica de TIMP1 est envolvida com a inibio das MMPs (Lambert

et al., 2004).

3.3.3 Regulao da apoptose

Como descrito anteriormente, interaes clula-matriz extracelular e o

remodelamento da MEC por enzimas especficas influenciam enormemente na

sobrevivncia da clula, e a dissociao de clulas dependentes de ancoragem MEC

resulta em apoptose (Frisch & Francis, 1994; Boudreau et al., 1996).

Consistentemente, foi demonstrado que a superexpresso da MMP3 induz

apoptose em clulas epiteliais de mama in vitro e em camundongos transgnicos

(Boudreau et al., 1995), e que esta induo de apoptose significativamente inibida

quando camundongos transgnicos para a expresso de Mmp3 so cruzados com

camundongos que superexpressam Timp1 (Chirco et al., 2006). A inibio de apoptose

por TIMP1 atravs da inibio das MMPs tambm foi relatada em clulas estreladas

hepticas ativadas (Bachem et al., 1992), j que a perda da funo de inibir a MMP

16

Introduo

extingue sua atividade anti-apopttica nessas clulas, sugerindo que esta

dependente desta inibio (Murphy et al., 2002). Este envolvimento da inibio das

MMPs na atividade anti-apopttica de TIMP1 pode ser explicado por meio da

preveno da degradao da matriz e consequentemente a extino da morte celular

por anoikis.

Recentemente, muitos estudos tm demonstrado que TIMP1 pode atuar como um

fator de sobrevivncia celular independente de seu papel de inibir as MMPs. Alguns

destes estudos observaram que TIMP1 pode atuar como fator de sobrevivncia em

clulas de linfoma, alm de sua expresso, e no a das MMPs, estar correlacionada

com grau clnico em linfoma no-Hodgkin, sugerindo um mecanismo independente da

inibio das MMPs pelo qual TIMP1 medeia sobrevivncia celular (Kossakowska et al.,

1991; Oelmann et al., 2002). Alm disso, observou-se que TIMP1 aumentava a

sobrevivncia de clulas B do centro germinativo, clulas B normais de tonsila e em

linhagens de linfoma de Burkitt pela supresso da apoptose atravs da induo do

gene anti-apopttico bcl-xL e de fatores de sobrevivncia e de diferenciao de clulas

B, como IL-10, mesmo quando estas clulas eram tratadas com um inibidor de MMP e

com uma forma de TIMP1 que no possuia atividade inibidora de MMP, concluindo que

a regulao da apoptose por TIMP1 nestas clulas independente da inibio das

MMPs (Guedez et al., 1998a; Guedez et al., 1998b; Gaudin et al., 2000; Guedez et al.,

2001).

Adicionalmente, foi demonstrado que a superexpresso de Bcl-2 induz a

expresso de TIMP1 e que este, atuando como uma molcula anti-apopttica

downstream a Bcl-2, protege clulas epiteliais de mama humanas da morte celular

intrnseca e extrnseca, causada por diversos fatores como choque-trmico,

adriamicina, perxido de hidrognio, irradiao por raios-X, e anoikis (Li et al., 1999; Liu

et al., 2003; Liu et al., 2005). A proteo contra apoptose nessas clulas foi efetiva

quando se comparou um mutante de TIMP1, o mesmo que falhou em inibir a apoptose

em clulas hepticas ativadas, com seu controle normal, sugerindo que a regulao

especifica da apoptose independe da atividade de inibir as MMPs em clulas epiteliais

de mama humana. Em concordncia com esses estudos, Lee e colaboradores (2003)

relataram a habilidade de TIMP1 em inibir a apoptose em clulas de carcinoma de

mama humano ser decorrente da ativao seqencial de molculas envolvidas na

17

Introduo

cascata da via de sinalizao de sobrevivncia (c-Scr, PI3-K e AKT) e no da inibio

das MMPs.

Juntos, torna-se claro que a regulao da apoptose por TIMP1 dependente ou

independente da inibio de MMP coexiste. Em um microambiente onde a degradao

da MEC afeta a sobrevivncia, possvel prever que TIMP1 regula a apoptose

primariamente atravs da inibio das MMPs. Se a sobrevivncia celular regulada por

um estimulo independente das MMPs, TIMP1 pode ser considerado um determinante

crtico da morte celular atravs de sua funo em regular vias de transduo de sinais

intracelulares. pouco provvel que a regulao da morte celular dependente e no

das MMPs seja mutuamente exclusiva, parecendo haver mais uma interao entre

elas, dependendo do estimulo pr-apopttico, do microambiente celular, dos nveis de

MMPs, e da disponibilidade de um receptor hipottico para TIMP1 na superfcie das

clulas.

A primeira evidncia de que TIMP1 poderia sinalizar atravs de um receptor de

membrana celular ocorreu a partir de estudos com protenas recombinantes de TIMP1

marcadas radioativamente ligando-se a superfcie celular de clulas de linfoma

mielide crnico e queratincitos (Chirco et al., 2006). Desde ento, muitos

investigadores tm focado seus trabalhos na identificao de um receptor para TIMP1

em diversos tipos celulares (Luparello et al., 1999; Ritter et al., 1999; Tan et al., 2003).

Recentemente, anlises de imunoprecipitao e microscopia confocal revelaram a

interao da molcula CD63 com TIMP1 e com 1 integrina, e suas co-localizaes na

superfcie das clulas epiteliais de mama humana (Jung et al., 2006). A molcula CD63

uma protena transmembrana da famlia das tetraspaninas que faz ligao com

diversos tipos de protenas e, na membrana plasmtica, os membros desta famlia,

incluindo a CD63, so conhecidos por interagir com molculas de adeso celular como

as integrinas, regular vias de transduo de sinais incluindo as de adeso celular,

motilidade e sobrevivncia (Berditchevski, 2001; Hemler, 2001; Yunta & Lazo, 2003).

Nas clulas epiteliais de mama humana, quando a expresso de CD63 foi diminuda,

observou-se efetiva reduo na ligao de TIMP1 na superfcie celular, na sua co-

localizao com 1 integrinas e, consequentemente, reverso do estado de ativao da

integrina mediada por TIMP1, da sinalizao de sobrevivncia celular e da inibio da

apoptose mesmo em clulas que superexpressavam TIMP1. Alm disso, os autores

18

Introduo

conseguiram demonstrar correlao entre expresso de TIMP1 e nvel de 1 integrina

na superfcie da clula independente da adeso celular (Jung et al., 2006).

A identificao de um receptor para TIMP1 na superfcie da clula apenas o

comeo para explicar as diversas aes moleculares exercidas por esta molcula. O

complexo mecanismo da via de sinalizao de sobrevivncia por TIMP1 no

microambiente tecidual ainda necessita intensa investigao.

3.4 TIMP1 e eventos epigenticos

Recentemente, alguns trabalhos vm sugerindo a participao de eventos

epigenticos, como a metilao do DNA, na regulao da expresso de Timp1 (Xu et

al., 1998; MacDougall et al., 1999; Huang et al., 2000). Alm de participarem da

regulao da expresso gnica, esses eventos tambm esto envolvidos na inativao

do cromossomo X, onde o gene TIMP1 se encontra. Em mamferos, essa inativao

silencia a maioria dos genes de um dos dois cromossomos encontrados nas fmeas. O

cromossomo X humano preserva seu status de ativao quando isolado em clulas

somticas hbridas de roedores/humanos, e esses hbridos, que podem conter tanto o

cromossomo X ativo como o inativo, tm sido usados para avaliar o estado de

inativao dos genes ligados a ele (genes ligados ao X). O gene TIMP1 expresso em

alguns, mas no em todos os cromossomos X inativos desses hbridos, sugerindo que

este gene est propenso tanto reativao como variabilidade da sua inativao. J

que muitos genes que escapam da inativao do cromossomo X encontram-se em

grupos, Anderson e Brown (1999) examinaram a expresso de quatro genes (ARAF1,

ELK1, ZNF41 e ZNF157) encontrados aproximadamente 100kb de distncia de TIMP1

(Figura 4) e constataram que os quatro genes eram expressos apenas pelo cromossomo X ativo, demonstrando, portanto, que os fatores que permitem a

expresso de TIMP1 a partir do cromossomo X inativo so nica e exclusivamente

especficos para este gene. Alm disso, para determinar se essa variao da inativao

de TIMP1 uma funo do ambiente da clula hbrida ou tambm se poderia ser

observada em humanos, os autores desenvolveram um ensaio de anlise alelo-

especifico para avaliar a expresso de TIMP1 em mulheres. A expresso dos dois

alelos foi detectada em 37,5% das mulheres analisadas, enquanto que o restante das

19

Introduo

mulheres no apresentou expresso de TIMP1 no cromossomo X inativo, sugerindo

que a inativao deste gene polimrfica em mulheres.

20

Introduo

4. Metilao de DNA e cncer

Atualmente so conhecidas inmeras alteraes moleculares que foram descritas

em melanomas malignos, quando comparados aos melancitos. Diversas outras, a

maioria talvez desconhecida, esto sendo descobertas a partir de anlises

comparativas de perfis de expresso gnica de melanomas de vrias fases (Curtin et

al., 2005; Haqq et al., 2005; Kabbarah & Chin, 2006; Gray-Schopfer et al., 2007;

Jnsson et al., 2007). Com esse acesso infindvel de informaes, certamente, o mais

importante ser distinguir as causas primrias da transformao maligna de

melancitos.

O principal evento durante um processo de transformao pode ser acarretado

por uma mudana celular que clonalmente herdada. Este evento poder contribuir

para uma eventual malignidade, o que ocorreria independentemente e no como um

resultado secundrio de algumas outras mudanas oncognicas. Todas as outras

alteraes, ocorrendo como conseqncia da mudana primria, poderiam ser

chamadas de mudanas secundrias (Bennett, 2008). Inmeras tcnicas podem ser

utilizadas para detectar centenas destas mudanas (Winnepenninckx et al., 2006;

Hoek, 2007; Johansson et al., 2007; Stark & Hayward, 2007), mas infelizmente nem

todas contribuiro para a malignidade. Portanto, identificar eventos primrios de

extrema importncia, pois, por definio, so a causa do desenvolvimento tumoral.

Conseqentemente, durante sua evoluo clonal, tal evento primrio resultaria em um

clone que apresentaria uma vantagem de crescimento comparado aos seus vizinhos,

ou uma vantagem alternativa e seletiva como capacidade de migrao (Hoek et al.,

2006).

A maioria dos estudos sobre a etiologia do cncer considera as alteraes

genticas (mutao, deleo, amplificao e translocao) como os nicos

mecanismos responsveis pela gnese do tumor (Davies et al., 2002; Houghton &

Polsky, 2002; Carr et al., 2003; Chin, 2003; Medic et al., 2006; Miller & Mihm, 2006;

Gagglioli & Sahai, 2007). Recentemente, entretanto, eventos epigenticos tem atrado

a ateno dos investigadores, e um nmero crescente de trabalhos tm demonstrado a

participao de alteraes epigenticas tanto na iniciao como na promoo de

tumores e, ao que tudo indica, esses eventos so to importantes quanto as mutaes

21

Introduo

(Baylin & Herman, 2000). Eventos epigenticos podem alterar o estado fenotpico sem

que haja mudanas no gentipo e, mesmo sendo potencialmente reversveis, so

geralmente herdados durante a diviso celular (Laird, 2005). Neste processo, mltiplos

mecanismos interagem para estabelecer coletivamente um estado da cromatina,

envolvendo modificaes em histonas, associao de protenas, atividade

transcricional e, em mamferos, metilao do DNA (Robertson & Jones, 1998).

A nica modificao epigentica que ocorre no DNA de mamferos a metilao

no carbono C5 da citosina que precede a guanina nos dinucleotdeos CpG (Bird, 2002)

(Figura 5), e tem sido reconhecida como um importante mecanismo de regulao da expresso gnica destas clulas (Jones & Takai, 2001; Jones & Baylin, 2002). A

maquinaria da metilao de DNA em mamferos composta pelas DNA

metiltransferases (DNMTs), que estabelecem e mantm o padro de metilao do

DNA, e pelas methyl binding proteins (MBDs), que esto envolvidas no reconhecimento

da metilao (Robertson, 2005).

Em clulas normais, a metilao ocorre predominantemente em regies

repetitivas do genoma, incluindo DNA satlites, elementos transponveis e retrovrus

endgenos (Robertson, 2002). Alm disso, participa da inativao do cromossomo X e

do imprinting genmico, que definido como uma modificao epigentica de um

cromossomo parental especfico, no gameta ou no zigoto, que leva expresso

diferencial de dois alelos de um gene na clula somtica do descendente (Feinberg et

al., 2002). Ilhas CpG (regies ricas em dinucleotdeos CpG), localizadas em

promotores de cerca de 50% de todos os genes, apresentam-se geralmente

desmetiladas (Jones & Baylin, 2002), embora um aumento no nmero de excees

tenha sido identificado (Liu et al., 2005; Song et al., 2005) (Figura 6). A metilao do DNA pode reprimir a transcrio gnica diretamente, atravs da inibio da ligao de

fatores de transcrio especficos e, indiretamente, pelo recrutamento de MBDs e suas

associaes a protenas repressoras e remodeladoras da cromatina (Robertson, 2005).

22

Introduo

Figura 5. Mecanismo de metilao de DNA. As fitas de DNA esto enroladas em volta de um octmero de histonas, formando os nucleossomos. Estes nucleossomos so organizados em cromatina, que o

bloco de construo dos cromossomos. A metilao de DNA ocorre no carbono 5 da citosina que

precede uma guanina, e esta reao catalizada pelas DNA metiltransferases (DNMTs). Essa metilao

garante uma assinatura epigentica nica que regula a expresso gnica. Figura modificada de

Rodenhiser & Mann, 2006.

23

Introduo

Figura 6. Metilao de DNA e cncer. O diagrama mostra uma regio representativa do DNA genmico de uma clula normal. Essa regio contm heterocromatina pericentromrica hipermetilada rica em

repeties e um gene suppressor de tumor (GST) ativamente transcrito associado a uma ilha CpG

hipometilada (indicada em vermelho). Em clulas tumorais, a heterocromatina rica em repeties torna-

se hipometilada e isso contribui para a instabilidade genmica, uma caracterstica de clulas tumorais,

por meio do aumento de eventos mitticos recombinantes. Metilao de novo de ilhas CpG tambm

ocorre em tumor, e pode resultar no silenciamento transcricional de genes que regulam a proliferao.

Mudanas no padro de metilao do DNA parecem ocorrer no incio da tumorignese. Figura

modificada de Robertson, 2005.

24

Introduo

O estabelecimento adequado e a manuteno dos padres de metilao so

essenciais para o desenvolvimento normal dos mamferos e para o funcionamento do

organismo adulto. Alm de ser responsvel pelo silenciamento da expresso gnica, a

metilao do DNA mantm a estabilidade genmica, tendo em vista a vasta quantidade

de regies repetitivas, que, quando desmetiladas, podem favorecer recombinaes e

causar a desregulao transcricional de genes prximos a estas regies (Eden et al.,

2003). Por isso, sua importncia tem sido cada vez mais ressaltada por meio de um

nmero crescente de estudos com doenas humanas que ocorrem quando padres

epigenticos no so apropriadamente estabelecidos e/ou mantidos (Egger et al.,

2004). Alm de ser comumente relacionada ao desenvolvimento do cncer humano

(Brueckner & Lyko, 2004; Das & Singal, 2004; Jiang et al., 2004; Levenson, 2004),

anormalidades epigenticas so encontradas em vrias outras doenas, entre elas

desordens neurolgicas, psiquitricas e imunes, e malformaes congnitas

(Robertson, 2005).

Inmeros trabalhos mostram a hipermetilaao de DNA reprimindo a transcrio de

genes que codificam supressores de tumor (Zheng et al., 2000; Jackson-Grusby et al.,

2001), reguladores do ciclo celular (Gonzalez-Gomez, 2003), enzimas responsveis

pelo reparo do DNA (Dobrovic & Simpfendorfer, 1997; Chan et al., 2002), receptores de

hormnios (Nass et al., 2000) e promotores de apoptose (Soengas et al., 2001). De

fato, dados obtidos de estudos de screening de alteraes epigenticas no genoma de

clulas tumorais demonstraram que os produtos de genes modificados

epigeneticamente esto envolvidos na regulao de todas as funes celulares e que o

silenciamento epigentico destes genes contribui com a tumorignese (Herman &

Baylin, 2003). Nos ltimos cinco anos, estudos com melanomas malignos revelaram

por exemplo a hipermetilao aberrante de regies promotoras de pelo menos 50

genes (Paz et al., 2003; van der Velden et al., 2003; Gallagher et al., 2005). Embora o

padro epigentico anormal de genes possa ocorrer em qualquer fase da progresso

tumoral, estudos tm indicado que ele ocorre com maior freqncia durante os estgios

iniciais do processo neoplsico (Yamada et al, 2005).

A perda da metilao global um evento freqente e precoce no cncer, e est

relaciona com a gravidade da doena e com o potencial metasttico de muitos tipos de

tumores (Widschwendter et al., 2004). A perda da metilao em promotores gnicos

25

Introduo

tambm pode ocorrer durante a carcinognese. A desmetilao acompanhada pelo

aumento da expresso tem sido relatada em alguns genes como o gene SERPINB5,

inibidor de serina protease (tambm conhecido como maspina) em cncer gstrico

(Akiyama et al., 2003), bem como o oncogene -synuclein (SNCG) em melanoma

(Wada et al., 2004) e nos cnceres de mama e de ovrio (Gupta et al., 2003), e a

famlia de genes MAGE, que codifica antgenos tumorais de funo desconhecida (De

Smet et al., 1999). No incio da tumorignese, a hipometilao global pode predispor

instabilidade genmica e, conseqentemente, mais alteraes genticas, enquanto que

a hipometilao do promotor poderia ser um evento tardio, que permitiria a adaptao

das clulas tumorais em seu ambiente local e promoveria a metstase. Entretanto, a

perda do controle epigentico que reativa a transcrio de genes no desenvolvimento

de cnceres ainda muito pouco compreendida.

26

Introduo

5. Modelo de transformao neoplsica

Com o objetivo de estudar a relao entre resistncia ao anoikis e transformao

maligna de uma maneira mais direta, o modelo de estudo de transformao maligna de

melancitos murinos utilizado durante esse trabalho foi desenvolvido no nosso

laboratrio a partir da restrio da adeso ao substrato da linhagem no tumorignica

de melancitos, melan-a (Correa et al., 2005; Oba-Shinjo et al, 2006). Nele, a condio

de impedimento seqencial de ancoragem foi suficiente para o estabelecimento tanto

de linhagens celulares no tumorignicas, correspondentes s etapas que levam

transformao dos melancitos melan-a, como de linhagens de melanoma com

diferentes nveis de agressividade (Figura 7).

Melan-a uma linhagem de melancitos pigmentados imortalizados que foi

estabelecida a partir de melanoblastos epidermais normais de embries de

camundongos C57BL (Bennett et al., 1987). Estas clulas proliferam em condies

semelhantes quelas requeridas pelos melancitos e melanoblastos de camundongos

normais no estabelecidos, como dependncia de forbol miristato acetato (PMA) e pH

extracelular baixo. Elas no formam tumores em camundongos singenicos ou nude,

mesmo quando inoculadas em quantidade elevada (2107 clulas por animal), e retm

todas as caractersticas de melancitos normais testadas, exceto pela resposta

proliferativa toxina da clera na presena de PMA e pela senescncia (Bennett et al.,

1987).

Clulas melan-a (105 clulas/mL) foram mantidas em suspenso por 96 horas

tempo que corresponde a um ciclo impedimento de ancoragem. Apesar de no serem

tumorignicas, as clulas melan-a formaram pequenos esferides em uma baixa

proporo de aproximadamente 0,1%. Esses esferides foram transferidos para uma

placa de cultura, cultivados em condies normais de adeso e expandidos, dando

origem a uma nova linhagem, denominada 1C (linhagem obtida aps um ciclo de

bloqueio da adeso ao substrato). Essa sublinhagem de melan-a foi submetida a um

novo ciclo de impedimento de ancoragem e, aps 96 horas, clulas sobreviventes

foram resgatadas e a sublinhagem 2C (dois ciclos de bloqueio de adeso ao substrato)

foi obtida.

27

Introduo

1C 2C, 3C, 4C melan-a

anoikis

Diluio limitante

96h

Linhagens de Melanoma

Figura 7. Modelo de transformao maligna de melancitos associado resistncia ao anoikis. Representao esquemtica do protocolo experimental que resulta na transformao dos melancitos

melan-a. Melancitos no tumorignicos da linhagem melan-a foram submetidos a ciclos seqenciais de

bloqueio de ancoragem. Os esferides formados aps submeter estas clulas ao 5 ciclo de bloqueio de

ancoragem foram clonados e todos os clones, selecionados aleatoriamente, foram tumorignicos quando

inoculados subcutaneamente em camundongos singenicos. Desta forma, diferentes linhagens de

melanoma foram obtidas, apresentando diferentes taxas de proliferao tanto in vitro quanto in vivo,

alm de diferentes padres de pigmentao. 1C, 2C, 3C e 4C: clulas melan-a submetidas,

respectivamente, a 1, 2, 3 e 4 ciclos de bloqueio de ancoragem; 96h: tempo de cultivo em condio de

bloqueio de ancoragem em horas.

28

Introduo

Estes ciclos seqenciais de impedimento de ancoragem por 96 horas, seguidos

pelo cultivo em adeso e expanso das clulas sobreviventes, foram repetidos dando

origem s linhagens 3C e 4C (trs e quatro ciclos de bloqueio da adeso ao substrato,

respectivamente). As linhagens 1C, 2C, 3C e 4C, como a parental, no so capazes de

formar tumores in vivo, mas j apresentam crescimento independente de PMA (Oba-

Shinjo et al., 2006).

Esferides formados aps submeter a linhagem 4C a um ciclo de bloqueio da

adeso ao substrato foram sujeitos diluio limitante originando diferentes linhagens

de melanoma (4C3, 4C11, Tm1 e Tm5, entre outras). Esses clones tambm

apresentaram capacidade de crescimento independente de PMA, uma caracterstica de

clulas de melanoma em cultura (Mufson et al., 1979), e foram testados quanto a sua

tumorigenicidade, sendo transplantados subcutaneamente (5105 clulas/animal) no

dorso de camundongos C57BL/6 singenicos. Surpreendentemente, todos os clones

analisados derivados dos esferides da linhagem 4C mostraram-se tumorignicos, com

perodos de latncia para o aparecimento do tumor variando de 12 a 30 dias.

Posteriormente, estes clones foram avaliados quanto capacidade de formao de

esferides e mostraram-se capazes de formar esferides em uma proporo 20 a 320

vezes maior que as clulas parentais. Alm disso, estas clulas apresentam diferenas

fenotpicas como pigmentao, velocidade de crescimento em cultura, agregao e

capacidade metasttica (Oba-Shinjo et al., 2006).

Assim, este modelo confere uma vantagem excepcional para elucidar quais

mecanismos esto envolvidos no incio da tumorignese e quais deles so

responsveis pela sua progresso. Isso porque foram estabelecidas tanto linhagens

celulares no tumorignicas, correspondentes s etapas que levam transformao

dos melancitos melan-a, como linhagens de melanoma com diferentes nveis de

agressividade, sendo que todas elas, bem como a linhagem parental melan-a, tm uma

origem gentica comum.

Esta heterogeneidade sugere a contribuio de mecanismos epigenticos na

origem da neoplasia. Portanto, as teorias que propem uma origem epigentica para a

transformao maligna (Rubin, 2001 e 2005; Esteller, 2005 e 2006; Baylin & Ohm,

2006; Feinberg et al., 2006) tambm fundamentam as bases do estabelecimento deste

29

Introduo

modelo. Deste modo, possvel que o impedimento de adeso ao substrato atue ento

como um fator desencadeador da transformao celular induzindo, atravs de

mecanismos epigenticos, alteraes cumulativas ao longo dos ciclos de bloqueio de

adeso ao substrato.

30

OBJETIVOS

Objetivos

1. Objetivo geral

Identificar genes superexpressos ao longo da transformao maligna de

melancitos melan-a induzida pelo bloqueio de adeso ao substrato e correlacionar

seus papis na aquisio do fentipo resistente ao anoikis.

2. Objetivos especficos

Determinar o nvel de expresso de Timp1 ao longo da transformao maligna

dos melancitos;

Estudar uma possvel regulao epigentica da expresso deste gene;

Investigar o papel biolgico de Timp1 na aquisio do fentipo resistente ao

anoikis.

Investigar o papel biolgico de Timp1 na transformao maligna dos

melancitos.

31

MATERIAL

Material

1. Comit de tica em Pesquisa

O desenvolvimento deste projeto foi autorizado pelo Comit de tica em

Pesquisa da Universidade Federal de So Paulo/Hospital So Paulo, sob o

processo de nmero 175/07.

2. Animais

Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6, do sexo feminino,

com 6 a 8 semanas de idade, obtidos do biotrio do Centro de

Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME) da Universidade

Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina. Os animais foram

mantidos em condies padronizadas de temperatura e iluminao (ciclo 12/12

horas claro/escuro), sem restrio alimentar. A manipulao e manuteno dos

animais estiveram de acordo com procedimentos padro definidos no Guia

Internacional de Princpios para a Pesquisa Biomdica Envolvendo Animais

(CIOMS, Genebra, 1985).

3. Anticorpos

Anticorpo primrio policlonal produzido em coelho, direcionado a

seqncias de aminocidos especficas da regio carboxi-terminal do inibidor

de metaloprotease 1 (TIMP1) humano, reativo para amostras de camundongo,

rato e humano, procedentes da Affinity BioReagents (ABR, Golden, CO, USA);

Anticorpos primrios policlonais produzidos em cabra, direcionados a

seqncias de aminocidos especficas de regies da beta-actina, MMP9 e

CD34, reativos para amostras de camundongo, procedentes da Santa Cruz

Biotechnology, Inc. (San Diego, CA, USA);

32

Material

Anticorpo secundrio policlonal produzido em cabra, direcionado IgG

de coelho, e anticorpo secundrio policlonal produzido em coelho, direcionado

IgG de cabra, conjugados com HRP (Horseradish Peroxidase), procedentes

da Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA).

Anticorpo secundrio policlonal produzido em cabra, direcionado IgG

de coelho, conjugado com Alexa 610, procedentes da Molecular Probes

(Eugene, OR, USA)

4. Drogas e reagentes

-mercaptoetanol, fosfato de sdio monobsico (NaH2PO4), fosfato de

sdio dibsico (Na2HPO4), formamida deionizada, Nonidet P-40, ortovanato de

sdio, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), polyoxyethilenesorbitan

monolaurate (Tween 20), procedentes da Amresco (Slon, Ohio, USA);

5-Aza-2-deoxicidina (5-Aza-CdR), aprotinina, 4-6-Diamidino-2-

phenylindole (DAPI), Corante tetrazolium amarelo solvel 3-(4,5,-

dimethylthiazol)-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), leupeptina,

procedentes da Calbiochem (Darmstadt, Germany);

cido actico glacial, cido clordrico 37% (HCl), azul brilhante

Comassie R-250, azul de bromofenol, azul de toluidina, cloreto de potssio

(KCl), cloreto de sdio (NaCl), clorofrmio, dimetilsulfxido (DMSO), etanol

absoluto, extran, formaldedo 37%, fosfato de potssio (K2HPO4), hidroquinona,

isopropanol, metanol, xilol e xyleno cyanol, procedentes da Merck (Darmstadt,

Germany);

cido brico, ampicilina, bicarbonato de sdio, geneticina (G418), meio

de cultura RPMI 1640, penicilina-estreptomicina, soro fetal bovino, procedentes

da Gibco (Carlsbad, CA, USA);

cido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfnico (HEPES), albumina

de soro bovino (BSA), brometo de etdeo, diethylpyrocarbonate (DEPC),

33

Material

ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), phorbol 12-myristate13-acetate (PMA),

procedentes da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA);

gar, procedente da Vetec Qumica Fina LTDA (Rio de Janeiro, RJ);

agarose (DNA typing grade), dNTP Mix, fenol saturado em Tris-HCl

UltraPure Buffer-Saturated Phenol, LB Broth Base, Lipofectamine 2000

Transfection Reagent, tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris base),

tris[hydroxymethyl]aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), TRIzol,

procedentes da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA);

Cmaras de Boyden modificadas Transwell, procedentes da Corning

(Acton, MA, USA);

Colunas de purificao de DNA GFX PCR DNA and Gel Band

Purification, filmes para autoradiografia Hyperfilm ECL, membranas de

PVDF, procedentes da Amersham (Piscataway, NJ, USA);

Colunas Wizard minipreparation, procedentes da Promega (Madison,

WI, USA);

Criotubos, filtros com membrana de 0,2 m para meio de cultura celular

Filtropur, placas de cultura celular de 100 mm e de 60 mm de dimetro, placas

de Petri para cultura de bactria, placas plsticas de cultura celular contendo 6,

24 e 96 poos, ponteiras de micropipetas com capacidade de volume mximo

de 0,1, 0,2 e 1 mL, tubos para microcentrfuga com capacidade de volume

mximo de 0,2, 0,5, 1,5 e 2,0 mL e tubos para centrfuga com capacidade de

volume mximo de 15 e 50 mL, procedentes da Sarstedt AG & Co. (Nmbrecht,

Germany);

Kit de deteco de quimioluminescncia SuperSignal West Pico

Chemiluminescent Substrate procedente da Pierce Chemical (Rockford, IL,

USA);

Kit QIAquick Gel Extraction, procedentes da Qiagen (Valencia, CA,

USA);

34

Material

Leite em p desnatado Molico, procedente da Nestl (So Paulo, SP);

Marcadores de peso molecular para DNA, procedentes da Fermentas

International Inc (Ontrio, Canad);

MATRIGEL Basement Membrane Matrix, procedentes da Becton

Dickinson Labware (Bedford, MA, USA);

Permount, procedente da Fisher Scientific (New Jersey, NJ, USA);

Reagente Bio-Rad protein assay dye reagente concentrate, procedente

da Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA);

Soluo de tripsina 0,25%/EDTA 0,5mM, procedente do Instituto Adolfo

Lutz (So Paulo, SP).

5. Enzimas

1:1 Taq/TaqStart antibody, procedente da BD Biosciences Clontech

(Palo Alto, CA, USA);

DNA polimerase BioTools DNA PolymeraseRecombinant from

Thermus thermophilus procedente da BioTools (Madri, Espanha);

DNase I (Amplification Grade), Ribonuclease A (RNAse A),

RNAseOUT, Superscript III, procedentes da Invitrogen (Carlsbad, CA,

USA);

Enzima Liberase, procedente da Roche (Basel, Switzerland);

Enzimas de restrio BamHI e NotI, procedentes da New England

Biolabs (Ipswich, MA, USA);

Taq DNA polimerase recombinante, T4 DNA Ligase e enzimas de

restrio Bgl2, EcoRI e XhoI, procedentes da Fermentas International Inc.

(Ontrio, Canad).

35

Material

6. Linhagens celulares

Diversas linhagens celulares foram utilizadas neste estudo e representam

fases distintas da transformao maligna de melancitos murinos e da

progresso do melanoma. A linhagem de melancitos melan-a (Bennett et al.,

1987) foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Michel Rabinovitch da Disciplina de

Parasitologia da Universidade Federal de So Paulo (UNIFESP). As demais

linhagens (2C, 4C, 4C3, 4C11, Tm1 e Tm5) foram estabelecidas aps

submeter clulas melan-a a ciclos seqenciais de impedimento de ancoragem

ao substrato (Correa et al., 2005; Oba-Shinjo et al., 2006).

7. Oligonucleotdeos

M13 (-21), Oligo(dT)12-18 Primer, T3 Promoter e T7 Promoter, Timp1 F,

Timp1 R, Act F, Act R, procedentes da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA);

Timp1SNuPE R, S1, S2, S3, procedentes da Operon Biotechnology

(Huntsville, AL, USA);

Timp1Transf F, Timp1Transf R, procedentes da Integrated DNA

Technologies (Idt, Coralville, IA, USA).

8. Programas

Para a quantificao da intensidade dos pixels presentes na imagem das

bandas geradas por eletroforese em gel de agarose 1%, foi utilizado o

programa Image Processing and Analysis in Java, ImageJ 1.38b (Wayne

Rasband, National Institute of Health, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/).

36

MTODOS

Mtodos

1. Meios de cultura

1.1 Preparao dos meios de cultura

Os meios de cultura para o cultivo de bactrias foram preparados com gua

deionizada e esterilizados em autoclave a 120C por 15 minutos. No caso do cultivo

das clulas de mamferos, os meios de cultura tambm foram preparados com gua

deionizada, mas esterilizados por filtrao positiva atravs de membrana de 0,2 m.

1.2 Meios para cultivo de bactrias

Meio LB: 200 mg/L de LB Broth Base.

Meio LB amp: meio LB acrescido de 100 g/mL de ampicilina.

Meio LB gar: meio LB acrescido de 2% de gar e 100 g/mL de ampicilina.

1.3 Meios para cultivo e manuteno de clulas de mamferos

Meio RPMI: 10 g de RPMI 1640, acrescido de 10 mM HEPES, 24 mM de

bicarbonato de sdio, 10mL/L de penicilina-estreptomicina e 200 nM de PMA. O pH do

meio de cultura foi ajustado para 6,9.

Meio R5: meio RPMI suplementado com 5% de SFB.

Meio R10: meio RPMI suplementado com 10% de SFB.

Meio de congelamento: 10% de DMSO em SFB (v/v).

37

Mtodos

2. Cultivo e manuteno dos estoques celulares de mamferos

Todas as linhagens utilizadas neste trabalho (clulas melan-a e as linhagens

derivadas 2C, 4C, 4C3, 4C11, Tm1 e Tm5) foram cultivadas em monocamadas em

placas plsticas de cultura celular de 100 mm de dimetro, em meio R5, at atingirem

subconfluncia. O pH e a temperatura da cultura foram mantidos atravs de incubao

em estufa com atmosfera de 5% de CO , a 37C.2 Estoques celulares foram

armazenados em criotubos, congelados em meio de congelamento e mantidos em

nitrognio lquido.

2.1 Cultivo celular em suspenso

Para os ensaios de bloqueio de adeso ao substrato, as placas plsticas de

cultura de 100 mm de dimetro foram previamente recobertas com um fino filme de

agarose 1% para impedir a ade