extraÇÃo, separaÇÃo e purificaÇÃo enzimÁtica grad/eqb483_aula9.pdf · eqb4383 –enzimologia...

__________________________________________

EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho

__________________________________________

_

EQB4383 – Enzimologia Industrial

M.A.Z. Coelho

EXTRAÇÃO, SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO ENZIMÁTICA

__________________________________________


Etapas de Extração, Separação e Purificação Enzimáticas

remoção de material insolúvel

separação dos produtos

purificação e polimento (geralmente associado a cristalização)

Remoção de material insolúvel, separação do sólido e líquido - a filtração e a centrifugação

Separação de produtos - a adsorção e a extração por solvente.

A obtenção de enzimas intracelulares a partir de microrganismos necessita de técnicas de lise celular, que abrangem métodos físicos, químicos e enzimáticos.

__________________________________________


Métodos enzimáticos: baseiam-se na digestão da parede microbiana catalisada por enzimas, tais como: lisozima (bactérias), glucanase, tripsina e protease (leveduras). -pouco aplicados em escala industrial em função dos altos custos das preparações enzimáticas e das enzimas terem que ser removidas depois.

Métodos químicos: tratamento com bases (NaOH): tem aplicações limitadas -valores elevados de

pH; choque osmótico: variação da concentração de soluto presente no tampão -

não pode ser usado em bactérias Gram positivas, pois estas tem elevada pressão osmótica interna;

tratamento com detergentes: laurilsulfato de sódio, triton, - dissolvendo membrana .

tratamento com solventes orgânicos: álcool isopropílico, etanol.

Métodos mecânicos Congelamento / descongelamento: formação de cristais de gelo

intracelulares, enzimas susceptíveis ao congelamento podem ser inativadas; moagem com abrasivos: é feita em moinhos vibratórios com esferas de vidro,

necessitando de sistema de resfriamento para absorver o calor gerado no processo;

cisalhamento líquido sob alta pressão: passagem por pequenos orifícios sob alta pressão - múltiplas etapas e com cuidados para não elevar a temperatura;

sonificação: realizado em aparelhos de ultrassom é muito empregada em laboratório.

__________________________________________


Concentração

Tamanho, carga, hidrofobicidade, solubilidade e atividade biológica são as principais características proteicas utilizadas na etapa de purificação das proteínas.

__________________________________________


• Precipitação Isoelétrica:

Solubilidade das proteínas em relação

ao pH

__________________________________________


- Precipitação com sais inorgânicos (Salting-out) -

__________________________________________


A concentração ótima de sal requerida para precipitação deve ser determinada

experimentalmente e geralmente varia entre 20 e 80% da saturação

0

2

4

6

8

10

12

14

25-40 40-55 55-70 70-85 85-95

% Saturação

% P

rote

ína P

recip

itad

a

Distribuição típica das proteínas

frente a precipitação com

(NH4)2SO4

__________________________________________


Precipitação com solventes orgânicos

Precipitação com polímeros

__________________________________________


UltrafiltraçãoUma membrana semi-permeável permite a separação das

moléculas de solvente das moléculas enzimáticas grandes porque apenas as moléculas pequenas podem penetrar na membrana quando a pressão osmótica é

excedida.

As principais vantagens da ultrafiltração como etapa de concentração são:

utiliza baixas pressões hidrostáticas;não ocorre mudança de fase;não utiliza reagentes químicos;mantém força iônica e pH da solução concentrada;evita desnaturação e inativação das enzimas.

As dificuldades advém da concentração por polarização , formação de camadas de géis na membrana ou por fouling (deposição) na membrana.

__________________________________________


__________________________________________


Liofilização

Resulta na concentração dos sais presentes na solução inicial, obtida a enzima na forma ativa em forma de

pó, esta é muito mais estável do que em solução aquosa.

O uso de tampão fosfato não é recomendado e aplicação de aditivos como lactose, trealose e manitol (1-5%) é

de grande utilidade.

__________________________________________


ETAPA DE PURIFICAÇÃO

Cromatografia de Gel-filtração

Também conhecida como permeação em gel, exclusão por tamanho ou peneira molecular. Este é um

método utilizado para o fracionamento e purificação de proteínas sendo, também, aplicável à

determinação de seus pesos moleculares.

O processo de gel-filtração pode ser definido como a partição difusional das moléculas de soluto entre a

fase móvel, constituída pelo solvente, e a fase estacionária formada pelos poros do gel.

__________________________________________


Troca-iônica

__________________________________________


__________________________________________


Cromatoenfoque

__________________________________________


Adsorção

Na adsorção, os componentes da amostra serão retidos ou não sobre a superfície da fase estacionária que é constituída por substâncias que apresentam campos de forças não neutralizados ou valências livres, permitindo a atração e a retenção das partículas sobre sua superfície por forças do tipo Van der Waals, ligações hidrogênio ou interações eletrostáticas.

Afinidade

__________________________________________


Interação hidrofóbica

__________________________________________


__________________________________________


EletroforeseBaseia-se na existência de grupos ionizáveis nas moléculas biológicas (proteínas,

ácidos nucleicos, peptídeos, aminoácidos, etc.) e, portanto, quando em solução podem existir como espécies eletricamente carregadas – separação pela

mobilidade das proteínas ocasionada por um campo elétrico.

A eletroforese em papel é o meio mais simples e mais usado na separação de uma vasta gama de produtos carregados. Em alguns casos, não se obtém uma boa separação.

Na eletroforese em gel, o uso de géis, como amido, agarose e poliacrilamida, como meio de suporte permitiu um aumento na resolução das amostras. A relevação do gel de proteína

pode ser feito empregando-se substâncias específicas como Comassie Brilliant Blue, Bromofenol – ZnSO4 – ácido acético ou Nitrato de prata.

__________________________________________


__________________________________________


Custos associados a purificação da enzima

__________________________________________


ETAPA DE FORMULAÇÃO

- As preparações enzimáticas podem ser comercializadas sob a forma sólida ou líquida, sendo para isso necessário que esta permaneça totalmente ativa pelo tempo em que esteja estocada e transportada.

- Os estabilizantes tem como exemplos NaCl, (NH4)2SO4, albumina, scarose, glicerol, PVA (polivinilalcool), PVP (polivinilpirrolidona), PEG (polietilenoglicol) e CMC (carboximetilcelulose).

- O preparado enzimático sob a forma sólida é obtido por secagem a vácuo ou por atomização (spray-dryer).

extraÇÃo, separaÇÃo e purificaÇÃo enzimÁtica grad/eqb483_aula9.pdf · eqb4383 –enzimologia...

Documents