Purificao de Produtos Biotecnolgicos

Mtodos de Purificao de Baixa ResoluoPrecipitaoSeparao por membranasExtrao em sistemas de duas fases lquidas

Processos de Separao por Membranas Os processos mais empregados para purificao de bioprodutos so os que utilizam a diferena de presso como fora motriz;

Em razo da natureza e do tipo de solutos e da presena ou no de partculas em suspenso, existem diferentes membranas com diferentes tamanhos e distribuio de poros caracterizando 4 processos:

Microfiltrao;Ultrafiltrao;Nanofiltrao.Osmove inversa.Principais caractersticas dos processos que utilizam diferena de presso como fora motriz

Faixas de tamanho de poros das membranas

Microfiltrao similar a uma filtrao clssica que utiliza membranas sintticas como barreira seletivaEmprega membranas microporosas, isotrpicas ou anisotrpicas, com tamanho de poros entre 0,05 a 5 mm empregada para reter partculas em suspenso, tanto no ar quanto em misturas aquosasSo membranas totalmente permeveis aos compostos solveis, independentemente do valor de suas massas molaresAplicao: filtrao estril, tanto de lquidos quanto de gasesUltrafiltrao Emprega membranas microporosas anisotrpicas, com dimetros de poros entre 1 e 500 nm.

Capaz de reter macromolculas em soluo, e permevel a todos os solutos de baixa massa molar

Bastante utilizada na purificao quanto na concentrao de protenas e enzimasOsmose InversaUtiliza membranas anisotrpicas densas, portanto, so permeveis apenas ao solvente, em geral, gua, retendo, praticamente, todas as molculas solveis e materiais em suspenso;

Alta presso faz a gua atravessar a membrana no sentido da soluo mais concentrada para a menos concentrada.

Mtodos de Purificao de Baixa ResoluoPrecipitaoSeparao por membranasExtrao em sistemas de duas fases lquidasExtrao em sistemas de duas fases aquosasUtilizada na purificao de antibiticos e cidos orgnicos;

Consiste na separao da molcula-alvo e impurezas baseada em suas diferentes solubilidades nas fases lquidas

Sistemas de duas fases aquosas so formados pela reunio de determinados polmeros, polieletrlitos, ou polmeros em combinao com solutos de baixa massa molar formando quatro grupos:2 polmeros no-inicos.Polieletrlito e um polmero no-inico;2 polieletrlitos Polmero no-inico e um composto de baixa massa molecularExtrao em sistemas de duas fases aquosasSistemas formados por polietilenoglicol e um sal so intensamente empregados por apresentarem rpida separao das fases, baixo custo e elevada seletividade na separao de molculas com base na solubilidadeExtrao em sistemas de duas fases aquosasExtrao em sistemas de duas fases aquosas

Duas solues aquosas imiscveis; Molcula-alvo P apresenta maior solubilidade na fase de topo em relao fase de fundo;

Maior grau de pureza da molcula-alvo se os contaminantes apresentarem solubilidade maior na fase de fundoDiagrama de Equilbrio em sistemas de duas fases aquosas (SDFA)Curva de equilbrio de um sistema PEG/fosfato

Reta TMB: linha de amarrao (tie-line)

Curvas de equilbrio do sistema PEG/fosfato de potssio em funo dos parmetros massa molecular e pH do meio

Coeficiente de Partio (K)Grandeza adimensional que representa a relao entre as concentraes da molcula de interesse na fase de topo e na fase de fundo no equilbrio: K= CTi CFi

CTi = Concentrao de soluto i na fase de topo (g/L); CFi= Concentrao de soluto i na fase de fundo (g/L);

Utilizado para avaliao da extenso das separaes nos sistemas de duas fases aquosas;Ocorrncia de purificao: coeficientes distintos para a molcula de interesse e para as demais molculas.Fatores que influenciam no coeficiente de partio KInteraes hidrofbicasCargas superficiais / pHDiferena de potencial eltrico entre as fasesEfeito de salting-out da fase salinaDiferenas de viscosidadeDiferenas de densidadeDiagramas de fases (ex.: concentrao de PEG e sal)Massa molecular da biomolculaMtodos de Purificao de alta resoluo:

CromatografiaCromatografia Princpio Geral:Reteno e Liberao da molcula-alvoA matriz slida capaz de reter a molcula por um determinado perodo de tempo (tempo de reteno)Eluio do fluido e consequente separao da molcula-alvo

CromatografiaCromatografia

Cromatografia Cromatografia de excluso molecularCromatografia de troca-inicaCromatografia de interao hidrofbicaCromatografia de afinidadeCromatografia de excluso molecularProcesso:

Os solutos de um meio lquido (protenas, peptdeos, anticorpos) so adsorvidos ou retidos em um leito de material poroso;

As molculas sofrem partio em virtude das diferenas no tamanho das espcies entre um solvente (fase mvel) e uma fase estacionria de porosidade definida;

A posterior remoo gradual dos solutos por ao de uma fase lquida mvel (eluente), resulta na separao das diferentes molculasCromatografia de excluso molecularA ordem de recuperao seletiva das molculas no fluxo eluente tem incio com as maiores molculas, prosseguindo em direo s menores.

Separao por tamanho das molculasCromatografia de excluso molecularEluio de uma mistura de trs protenas de massas moleculares diferentes em uma coluna de permeao em gel, com a formao de faixas distintas medida que a amostra permeia a coluna

Cromatografia de excluso molecularAplicaes:DessalinizaoDeterminao de massas molecularesDeterminao de tamanho de porosBaseia-se na afinidade que componentes de uma amostra tem com os stios inicos em uma matriz slida, ou seja, existe uma competio entre ons de interesse e contaminantes pelos grupos carregados da matriz ou da fase estacionria.

As resinas empregadas apresentam elevada capacidade de adsoro de protenas

A fase estacionria, eletricamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que esto na fase mvel e apresentam cargas de sinais opostos

Controle de pH e fora inica

Cromatografia de troca-inicaMatrizes de troca-inica:

Trocadores aninicos: contm grupos positivamente carregados e adsorvem protenas com carga lquida negativa

Trocadores catinicos: contm grupos negativamente carregados e adsorvem protenas com carga lquida positiva

Aps serem adsorvidos matriz, os solutos podem ser eludos por deslocamento com outros ons, com a mesma carga da protena adsorvida, porm com maior fora de interao com a fase estacionria.

Cromatografia de troca-inicaPrincpio bsico da cromatografia de troca inica

Cromatografia de troca-inica

Cromatografia de interao hidrofbicaBaseia-se na reteno das molculas pela interao da sua regio hidrofbica com a matriz

A protena colocada em meio com elevada concentrao de sal (expe a regio hidrofbica, aumentando a interao com a matriz)

Cromatografia de interao hidrofbicaMolcula de protena

Cromatografia de interao hidrofbicaModelos de adsoroa: modelo uniponto; b e c: adsoro uniponto; d: foras hidrofbicas de intensidades diferentes em razo das irregularidades na superfcie da matriz.Tcnica de separao altamente especfica que depende das interaes entre os pares de materiais biolgico: enzima-substrato, enzima-inibidor, antgeno-anticorpo.

O ligante imobilizado em uma matriz porosa Cromatografia de AfinidadePurificao de alta resoluoAlta especificidadeSeparao de formas ativas de formas desnaturadas

Purificao de alta resoluoAlta especificidadeSeparao de formas nativas de formas desnaturadasO complexo formado entre o ligante e a protena tem que ser reversvel;A protena eluda e o ligante regenerado.

Cromatografia Ampliao de EscalaCritrios:Manter os mesmos graus de pureza, rendimento, atividade biolgica e, se possvel, rendimento, alcanados em escala de bancada;

Purificao de miligramas a gramas de produto;

Principal caracterstica: aumento do dimetro da coluna e a manuteno constante da altura do leito cromatogrfico, exceto para excluso molecular (ainda deve ser aumentado em 10 % a altura do leito);

Parmetros que devem ser mantidos constantes:

Volume da fase estacionria;Grau de empacotamento;Altura do leito cromatogrfico;Velocidade linear de alimentao (vazo volumtrica dividida pela rea de corte transversal da coluna).

Parmetros que devem ter o valor aumentado:

Dimetro da coluna;Fluxo volumtrico;Volume de amostraCromatografia Ampliao de EscalaColunas industriais

Altura de leito em torno de 30 cm e dimetro da ordem de 1 m.Maiores volumes de colunas da ordem de 700 a 2000 L (ex.: purificao do soro de queijo)Cromatografia Ampliao de Escala