Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Métodos de Purificação de

Proteínas Nativas

Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

mailto:mtoliveira@fcav.unesp.br

Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Agradecimentos ao Prof. João Pizauro

(Depto. Tecnologia) pelos slides

Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

mailto:mtoliveira@fcav.unesp.br

As células são constituídas de proteínas

codificadas por diferentes gene.

Executam uma função específica

Para caracterizar bioquimicamente uma

proteína, o ideal é extrair e purificá-la

mantendo sua estrutura e função originais

Introdução

A purificação permite a caracterização

estrutural e funcional da proteína, já que

encontram-se “livres” de contaminantes

Rompimento das células – obtenção do

extrato proteico bruto

SEMPRE, SEMPRE e SEMPRE trabalhar com

proteínas em baixa temperaturas (0 a 4ºC)!!!

Usar tampão correto (pH, cofatores,

estabilizadores, etc.)

Bactérias: Bactérias normais são rompidas ou

choque osmótico, já as com parede celular

espessa necessitam de outros tratamentos

Animal: Tecidos de animais como eritrócitos,

fígado e cérebro são fáceis de serem rompidos;

já tecidos ricos em colágeno como vasos

sanguíneos e músculo liso são mais difíceis

Vegetal: Células são mais difíceis de serem

rompidas porque contém celulose e fenóis

Método mecânico mais simples e mais barato para se

obter extrato de tecido ou célula

Esse método é utilizado na homogeneização de células

bacterianas e vegetais em pequenas quantidades

Almofariz (cadinho)

Material Duro

Agitação com pequenas partículas (beads)

Utiliza-se agitador para proporcionar agitação violenta de uma suspensão de

células com partículas de material resistente capaz de se desintegrar pelo

choque

Usado para obtenção de extratos livres de células de levedura

Resfriamento prévio do material e

imediatamente após ruptura são

fundamentais nesse processo!

Material Duro

Rompe células microbianas forçando a passagem das mesmas por um

orifício muito pequeno a uma alta pressão

A diferença de pressão em ambos lados do orifício e o atrito fazem as células

romperem

Aplicada em várias preparações

French Press

Material Duro

Ultrassom

São empregados no rompimento

de parede celular. As vibrações

sônicas e ultra-sônicas quebram

as células por cavitação.

É produzida pela alternância de

ondas de baixa pressão em que

as bolhas crescem até atingirem

alta pressão na qual são

comprimidas e implodem.

Material Duro

Heteropolissacarideo constituído por dois tipos de monossacarídeos : N-Acetil- ß-D-glucosamina e ácido N-acetilmurâmico

A parede celular das bactérias consiste de uma estrutura em rede que envolve completamente a célula.

Lisozima

Material Duro

Material Mole

Choque osmótico

Transferência rápida de uma solução

isotônica para uma solução hipotônica.

Devido a osmose as células ficam túrgidas

provocando a lise da membrana.

Ruptura por tratamento químico

Usa-se solvente orgânico ou detergente para

romper diferentes tipos de tecidos, células e

organelas. Ex: álcalis, solventes, detergentes

e ácidos.

Material Mole

Material Mole

Centrifugação diferencial é usada

para separar organelas, pedaços de

membranas e citosol (fração solúvel

do citoplasma) do extrato celular.

Centrifugação diferencial

Etapas de separação

Etapas de separação

Placa óssea

Fração solúvel

NH2

Enzimas

associadas

à membrana +

Matriz óssea

Centrifugação

diferencial

Placa óssea

Fração solúvel

NH2

Enzimas

associadas

à membrana +

Matriz óssea

Centrifugação

diferencial

NH2

Enzimas

associadas

à membrana

Detergente

NH2

Enzimas

associadas

à membrana

NH2

Fosfatase alcalina

Pirofosfatase e ATPase

PIPLC

Extração de proteínas de membranas

Estratégia Geral para Obtenção da

Proteína Purificada

• Extração Isolamento

1. Material de Partida ------ Extrato Bruto

2. Desintegração celular

Fracionamento

•Solubilidade

•Tamanho

•Carga

•Afinidade Ligação

Separação

Diálise

Ultra filtração

Coluna Cromatografica

Precipitação de proteínas

• Utilização de diferenças nas solubilidades das proteínas

– Concentração salina

• A adição de um sal na quantidade correta pode precipitar algumas proteínas e manter outras em solução

– (NH4)2SO4 • O sal tem muita solubilidade e estabiliza

a estrutura nativa das proteínas

• Salting in

– Muitas proteínas tornam-se mais solúveis com

aumento da concentração de sal

• Salting out

– Quando as concentrações de sal atingem

valores muito elevados, a solubilidade diminui

Ultra Filtração

• Princípio: Uma membrana semipermeável permite

a separação das moléculas menores (solventes,

íons, etc) das moléculas grandes ( peptídeos,

protéicas), pois apenas as moléculas pequenas

podem penetrar na membrana quando a pressão

osmótica é excedida

• O processo de ultra filtração é empregado para

concentração, dessalinização e fracionamento

Diálise

• Procedimento que separa as proteínas dos solventes beneficiando-se do tamanho maior das proteínas

Cromatografia em coluna

Gel-Filtração • A separação é feita de acordo com o tamanho molecular

Cromatografia de troca iônica

Cromatografia de

Afinidade

Pequenas proteínas são ligadas aos suportes e a mistura complexa de proteínas é aplicada

Proteínas ligadas

podem ser eluídas com moléculas pequenas ou reagentes

Exemplos de Colunas Cromatográficas

DNA-celulose

Heparina

Fosfocelulose

Blue-sepharose

HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Pressão

Como analisar o resultado da

purificação?

(como visualizar proteínas e determinar a

pureza da amostra?

Absorbância 280nm

SDS-PAGE

A280

A280

SDS-PAGE

(Eletroforese em Gel de Poliacrilamida-

SDS)

Ação do SDS

SDS-PAGE

S

S

S

S

-S-S-

-S-S-

+ SDS + 2-mercaptoetanol 4

SH

SH

Ação do -mercaptoetanol

SDS-PAGE

1 2 3

Adição de SDS

β - Mercaptoetanol

Fervura

Amostra

Amostra

Amostra

SDS-PAGE

o Eletroforese: Separação e visualização das proteínas no Gel

•Prata

•Azul de Comassie

SDS-PAGE

Blue-Sepharose

C+ Ind S FT W1

0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN

Fosfocelulose

S FT W1 W2

Gradient 60-100 mM KPO4 150 mM KPO4

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