IDENTIFICAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

PRESENTES NA FRAÇÃO 0 DE ANTÍGENOS FRACIONADOS DE Paracoccidioides

brasiliensis

Viviane Cristina Fernandes

Universidade Federal de Minas GeraisInstituto de Ciências Biológicas

Departamento de Bioquímica e Imunologia

Laboratório de Imunologia Celular e Molecular

Orientador: Bernardo Sgarbi Reis

Co-orientador: Alfredo Miranda de Goes

A Paracoccidioidomicose

1908: Adolpho Lutz descrevia pela primeira vez no Brasil a paracoccidioidomicose em dois pacientes internados na Santa Casa de Misericórdia em São Paulo.

1971: A denominação paracoccidioidomicose foi consagrada após reunião de micólogos das Américas, em Medellin (Colômbia).

Adolpho Lutz (1855-1840)

Epidemiologia

América Latina:

~ 90 milhões de habitantes: 10 milhões com P.

brasiliensis Florestas Tropicais ou Subtropicais

Temperaturas médias entre 14-20°C

Precipitações pluviométricas entre 800 a 2.000 mm

Umidade relativamente alta

A doença é uma micose

sistêmica, prevalente na

América do Sul. O Brasil é

responsável por 80% dos

casos já reportados.

Distribuição regional heterogênea. Problema de saúde pública.

P. brasiliensis é um fungo assexuado, dimórfico, agente

etiológico da paracoccidioidomicose (PCM).

Habitat incerto: vida saprofítica em solo e detritos vegetais.

Paracoccidioides brasiliensis: o agente

etiológico

Patogenia

Inalação de Esporos (conídias)

Nos pulmões:

• transformação em leveduras e multiplicação

• alveolite com abundantes neutrófilos e, posteriormente, mononucleares e macrófagos, formando o complexo primário

• granuloma epitelióide

Focos latentes ou quiescentes

Involução espontânea do complexo primário

• Progressão das lesões primárias com sinais e

sintomas da doença

Forma Crônica da

PCM

Forma Aguda ou Subaguda da PCM

Idade

Sexo

Fatores genéticos

Diagnóstico da paracoccidioidomicose

Visualização direta do fungo em materiais patológicos.

Forma parasitária:

“roda de leme”

Diagnóstico sorológico ainda possui valor limitado.

Tratamento da paracoccidioidomicose

Principais drogas:

Anfotericina B,

Derivados de Imidazol,

Sulfonamidas.

Dúvida freqüente: quando intorromper o tratamento?

Projetos Desenvolvidos

Fracionamento do antígeno sintético do P. brasiliensis (PbAg)

Sete frações: 0, I, II, III, IV, V e VI

Fração 0 - Alta produção de IL-10

Fração II - Formação de granuloma e produção de TNF-a

As frações 0 e II possuem antígenos de superfície reconhecidos por anticorpos de coelhos imunizados com as respectivas frações

O fracionamento do antígeno bruto de P. brasiliensis se

mostrou eficiente em separar frações antigênicas menos

complexas

A fração 0 foi capaz de de controlar a infecção em PCM

experimental, impedindo a disseminação do fungo para o

baço e fígado

A fração II foi capaz de conferir proteção em

camundongos BALB/c infectados com P. brasiliensis

Projetos Desenvolvidos

Objetivo Geral

Purificar, identificar e caracterizar proteínas presentes na fração 0, obtidas a partir de antígenos fracionados de Paracoccidioides brasiliensis (PbAg) , importantes na proteção e no diagnóstico da paracoccidioidomicose.

Fracionar o antígeno bruto de P. brasiliensis a fim de obter a fração 0.

Objetivo Específico

Obtenção dos antígenos fracionados

7 dias a 35 ºC

rompimento mecânico com

pérolas de vidro (45 ciclos)

LEVEDURAS

ultracentrifugação 37.000 rpm 4 ºC 1:30 h

CEPA Pb 18

Extrato solúvel (PbAg) FPLC(sete frações)

ResultadoGráfico do FPLC

Den

sid

ade

ópti

ca (

280n

m)

Gra

die

nte

de

NaC

l [M

]

0

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

0

20

40

60

80

100

0(0)

6(I)

12(II)

20(III)

30(IV)

45(V)

70(VI)

100

% NaCl (Fração)

Objetivo Específico

Avaliar o perfil eletroforético das frações obtidas no fracionamento do antígeno bruto de P. brasiliensis

Resultado

Gel SDS-PAGE

66 -

45 -

29 -

14 -

kDa

FIIIF0 FI FII FIV FV FVI PbAgPM

Objetivo Específico

Refracionar as proteínas da fração 0 em coluna Mono-S acoplada ao sistema de FPLC.

Resultado

20

40

60

80

100

Picos do refracionamentoG

rad

ien

te d

e

0.20

0.40

0.80

1.00

0.60

0

01 02 03

Den

sid

ade

ópti

ca (

280n

m)

NaC

l[M

]

Gráfico do FPLC

Objetivo Específico

Avaliar o perfil eletroforético dos picos obtidos a partir do refracionamento da fração 0 do antígeno bruto de P. brasiliensis.

Resultado

Gel SDS-PAGE

66 -

29-

24-

18,4-

kDa

45-

F0 Pico 1 Pico 2 Pico 3PM

66 -

29-

24-

18,4-

kDa

45-

F0 Pico 1 Pico 2 Pico 3PM

Objetivo Específico

Identificar através de ensaios de Western-blot, bandas protéicas dos picos obtidos no refracionamento da F0 de PbAg, que são especificamente reconhecidos por soros de pacientes com PCM.

Resultado

Western-blot

F0Pico 1Pico 2 PM

38,5

18,1

kDa

201

125

81

F 0 Pico 1 Pico 2 PM

F0Pico 1Pico 2 PM

38,5

18,1

kDa

201

125

81

6,9

F0Pico 1Pico 2 PM

31,3

18,1

kDa

201

125

81

F0Pico 1Pico 2 PM

38,5

18,1

kDa

201

125

81

F 0 Pico 1 Pico 2 PM

F0Pico 1Pico 2 PM

38,5

18,1

kDa

201

125

81

6,9

31,3

18,1

kDa

201

125

81

43

Objetivos Específicos

Determinar a seqüência de aminoácidos da região aminoterminal das bandas protéicas mais reativas aos soros de pacientes com PCM, através de um seqüenciador de aminoácidos.

Analisar as seqüências obtidas, através da comparação com outras seqüências presentes no banco de dados - BLASTp.

Resultados

24.0 7/7

(100%)7/7

(100%)220 aa

Paracoccidioides brasiliensis

27 kDa antigen

ScoreIdentitySimilarity

LengthAnimalHomologya

27 kDa antigen [Paracoccidioides brasiliensis]

ARALSSDELKTVVSVLAQKLDSLNIDYAIMGGAATCLLSGDPNRRTEDVDLVIHVDHRKITADNLTTQLLKSFPSDFEGVSQFGHTIPAYKLRRPGGTVQLVVELEVFDYQSWPQRPQYDLQTATRTTLNINGQKVKLFSPEWILREKILSQYQRQGSRKEGTDIRDIISMIPLAVPGKPELNFNQSQELQTALANLVQKRPDLSSALKAKIKCSAVFHN

a: N-terminal sequence of PB29: A P L S I Y E L K T V V S

This peptide was compared to protein sequences deposited in non-redundant databases, using the Basic Local Alignment Search Tool program, BLASTp

38.4 12/12

(100%)12/12

(100%),416 aa

Paracoccidioides

brasiliensis

Immunodominant antigen Gp43

ScoreIdentitySimilarity

LengthAnimalHomologya

Immunodominant antigen Gp43 [Paracoccidioides brasiliensis]

MNFSSLNLALASCVLAWVCLASASSHVASHIVPRQAGSAIYGVNIGGWLLLEPWISPSVFEAGGSSSVDEYTLSKNLGRDAKRHLSKHWDTFITEDDFKNIAAAGLNHVRIPIGYWAVNPIEGEPYVQGQLDYLDKALVWAKNSNLRVVIDLHGVPGSQNFDNSGHRGAINWQKGDTIRQTLIAIHTLAIRYANRTDVVDSIELVNKPSIPGGVQVSLLKEYYEDGYHIVRDIDSTVGVSISDASLPPRTWNGFLAPKTYKNVYIDTYHNQVFDDIFRTFTIDQHVKLACSLPHGRLRGADKPLIVKEWSGAMTDCAMYLNGRGIGSRFDGSFPSGKPSGACGARSKGSSSELSAQQKKDTLLYIEAQLDAFEVGAGWYFWTWKTEGAPGWDMQDLLNQKLFPQPIWARKYGGCR

a: N-terminal sequence of PB43: AGSAIYGVNIGGAGSAIYGVNIGG

This peptide was compared to protein sequences deposited in non-redundant databases, using the Basic Local Alignment Search Tool program, BLASTp.

Resultados

Resultados

81 kDa antigen [Paracoccidioides brasiliensis]

Não foi encontrada nenhuma homologia significativa com outra proteína presente no banco de dados.

a: N-terminal sequence of PB81: EPPPPPPPPPPPPPPPPPPP

This peptide was compared to protein sequences deposited in non-redundant databases, using the Basic Local Alignment Search Tool program, BLASTp

Conclusões

As técnicas de fracionamento e refracionamento adotadas são eficientes e possuem grande reprodutibilidade;

O refracionamento levou a obtenção de três picos

distintos e dois deles apresentaram um perfil protéico diferenciado em gel de eletroforese SDS-PAGE 10%;

Três dessas bandas apresentaram um maior reconhecimento por soro de pacientes com PCM, todas pertencentes ao pico 2 do refracionamento;

Conclusões

O seqüenciamento das três bandas protéicas mais evidenciadas por soro de pacientes revelou que duas das três bandas já foram descritas para o mesmo microorganismo (gp43 e pb27);

A terceira banda, de 81 KDa, porém, parece ser uma proteína ainda não descrita e específica do fungo.

Perspectivas

Agradecimentos

À Deus;

Aos meus pais e ao meu irmão;

à Lili;

Ao Jamil e ao Marco Túlio;

Ao Alfredo

Ao Bernardo;

Aos demais colegas e amigos do Labs.