métodos de purificação de proteínas -...

Disciplina de Engenharia de Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

2º Semestre de 2018

Aula 2: Purificação de Proteínas

(revisão) e Determinação de Estruturas

(difração de raio-X)

Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

mailto:[email protected]

Trabalhando com Proteínas

• Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais.

• Separadas de outras de forma pura considerando suas propriedades.

• Proteína pura essencial para que suas propriedades e atividades sejam determinadas.

Análise de Proteínas

• Absorbância;

• Eletroforese em gel desnaturante;

• Western blot (imunoblot).

A280

• A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos.

• A medida da luz absorvida permite interferir sobre a concentração de soluto em uma determinada solução ou material biológico.

Métodos de Quantificação Proteica

Principais ensaios de quantificação de proteínas

Fonte: http://www.labome.com.br/method/Protein-Quantitation.html

Eletroforese de Proteínas (SDS-PAGE)

• Eletroforese: separação com base na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico.

• Não é utilizado para purificar proteínas porque afetam sua estrutura e a função.

Eletroforese de Proteínas

• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida.

• Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína.


SDS-PAGE

• SDS (sodium dodecyl sulfate)

• 1 molécula de SDS para cada 2

resíduos de aminoácidos.

• Contribui com grande carga negativa.

• SDS desdobra parcialmente as proteínas, assumindo forma semelhantes.


• Método analítico: útil tanto para separar quanto para visualizar proteínas.

• Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza.

• Permite determinação da

massa molecular

aproximada.


• Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata.

• Aproximação da massa

molecular para proteínas

desconhecidas.

Western blot (imunoblot)


Como purificar uma proteína

Métodos clássicos

Diferença de propriedades das proteínas: carga,

tamanho, ligantes.

Métodos modernos

Clonagem de DNA, sequenciamento

genômico, proteínas recombinantes, etc.


• Proteína nova precedentes estabelecidos e bom senso.

• Mais de um método de purificação utilizado.

• Escolha do método: empírico.

• Levar em consideração métodos descritos para proteínas semelhantes.

• Iniciar com métodos de baixo custo.

Purificação Proteica: Fonte Proteica

Estratégia Geral para Obtenção da

Proteína Purificada

• Extração Isolamento

1. Material de Partida ------ Extrato Bruto

2. Desintegração celular

Fracionamento

•Solubilidade

•Tamanho

•Carga

•Afinidade Ligação

Separação

Diálise

Ultra filtração

Coluna Cromatografica

Purificação Proteica: Isolamento

Extrato Bruto

Métodos Cromatográficos

• Poderoso método de fracionamento.

• Diferença de tamanho, carga, afinidade de ligação e outros.

• Velocidade da migração depende da propriedade da proteína.

Cromatografia em Coluna

Lehninger, 6ª ed. 2010

Métodos Cromatográficos

Tipos de Cromatografia em Coluna:

o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica);

o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho;

o Afinidade;

o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).

Blue-Sepharose

C+ Ind S FT W1

0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN

Fosfocelulose

S FT W1 W2

Gradient 60-100 mM KPO4 150 mM KPO4

1 2 3 4

Coloração com Prata

Yuxun Wang et al. J. Biol. Chem. 1997;272:13640-13646

©1997 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Western Blot

Proteínas Recombinantes

Cromatografia de Afinidade

Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.

Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA


Coloração com

Coomassie Blue Western Blot


Coloração com

Coomassie Blue Western Blot

Anticorpos que

reconhecem

Poli-histidina!!!

Como produzir a proteína contendo

a cauda de poli-histidina?

Sistemas de Expressão

Representação Esquemática de um Vetor

de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.


de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

6 códons para His (CAT ou CAC)

ou

Inclusão dos códons de His


de Expressão para Células Sf9

Representação Esquemática – Vetor de

Expressão para Células Humanas

Tags de Fusão de Proteína Comuns

Proteínas Recombinantes então

resolvem dois problemas comuns da

purificação de proteínas nativas:

1 - Abundância

2 - Especificidade pela Coluna

Cromatográfica

Exemplo: a DNA polymerase γ de

Drosophila melanogaster

Nativa Recombinante

Expressão em Sf9

Extrato Celular

Coluna de Fosfocelulose

Precipitação com (NH4)2SO4

Sedimentação em Gradiente de Glicerol

Coluna de Ni-NTA

Quilos de ovos de D. melanogaster

Centrifugação diferencial

Coluna de Fosfocelulose

Precipitação com (NH4)2SO4

Sedimentação em Gradiente de Glicerol

Coluna de DNA-celulose

Extrato Celular Coluna de Octil-sefarose

Coluna de Blue-agarose

Exemplo: a DNA polymerase γ de

Drosophila melanogaster

Nativa vs

Recombinante

Determinação da Estrutura Tridimensional de Proteínas por

Difração de Raios-X

Níveis estruturais das proteínas

Fonte: Lehninger, 2010. 5ªed.

Estrutura proteica

• A conformação tridimensional (3D) depende da sequência de aminoácidos

• A função depende da estrutura

• Cada proteína existe em um ou em pequeno número de formas estruturalmente estáveis

• As principais forças para a estabilização de estruturas são forças não-covalentes

Estrutura tridimensional

• Arranjo espacial de todos os átomos de uma proteína conformação

• As conformações possíveis de uma proteína incluem qualquer estado estrutural que ela possa assumir sem a quebra das ligações covalentes.

• Porém, poucas são as conformações nativas.

• Algumas proteínas são formadas por mais de um complexo polipeptídico (quaternária)

Determinação da estrutura

tridimensional proteica

• O primeiro passo para o estudo sobre as propriedades de um composto orgânico é a determinação de suas estruturas cristalinas.

• Diversas propriedades estão intimamente ligadas à maneira como os átomos estão dispostos pela molécula.

Mas...o que são cristais?

• Cristais são arranjos atômicos ou moleculares cuja estrutura se repete numa forma periódica tridimensional.

• Exemplo: NaCl, cuja estrutura consiste em átomos de Sódio e Cloro dispostos de forma que um átomo de sódio terá sempre átomos de cloro como vizinhos e vice-versa.

Sólidos cristalinos

• Formas regulares e simétricas assim como a ordenação das partículas que os formam.

Como observar os cristais?

• O estudo da estrutura cristalina não é possível através da microscopia óptica.

• Os microscópios ópticos possuem uma limitação

física, ditada pelo comprimento de onda da luz visível.

Como observar os cristais?

• Para resolver objetos tão pequenos quanto proteínas, precisamos usar raios X, que possuem comprimentos de onda na faixa de 0,7 a 1,5 Å (0,07 a 0,15 nm).

Cristalografia de raios-x

• Uma das técnicas mais conhecidas para a determinação dos padrões de uma estrutura é cristalografia por difração de raios-X.

• O primeiro passo é obter proteína com alto grau de pureza!!!

• Segundo, obter cristais!!!


• Raio X incide no cristal, onde parte de sua energia é absorvida e reemitida em todas as direções (cada átomo se torna uma fonte secundária de raios X);

Padrão de difração dos raios x

Fonte: Paula Kuser Falcão.


• Não há lentes que reagrupem os raios X para formar a imagem.

• Ao invés disso, o padrão de difração dos raios X é coletado diretamente e a imagem é reconstruída por técnicas matemáticas.


• A difração de raios-X aplicada à análise de cristais de macromoléculas biológicas tem influenciado a bioquímica estrutural, tendo contribuído para o conhecimento da estrutura 3D de proteínas, ácidos nucleicos, vírus e outras macromoléculas.

Padrão de difração dos raios x


• A quantidade de informação obtida em uma cristalografia por raios X depende do grau de organização estrutural da amostra.

• Informações da estrutura 3D detalhadas precisam de cristais proteicos altamente ordenados.

• Dificuldade em cristalizar várias proteínas.


• O ambiente físico em um cristal não é idêntico ao em solução ou na célula viva.

• Poucas informações são fornecidas em termos de movimentos moleculares no interior da proteína.

A partir da cristalografia de raios-x, é

possível...

• Compreender melhor os princípios básicos da arquitetura proteica;

• Estudar em nível atômico os centros catalíticos de enzimas;

• Compreender a especificidade das reações que as enzimas catalisam;

• Compreender a relação existente entre sequencia primária, estrutura e função.

ESQUEMA DA DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS

Exemplo de proteínas cristalizadas

Fonte: Paula Kuser Falcão.

Oliveira et al. 2015. Genome Biol Evol.

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2º Semestre de 2018

Próxima aula 21/08: Prática – Entendendo Cristalografia

e Visualizando Estruturas Proteicas

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