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Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao Separao por membranas Extrao em sistemas de duas fases lquidas

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Processos de Separao por Membranas Os processos mais empregados para purificao de bioprodutos so os que utilizam a diferena de presso como fora motriz; Em razo da natureza e do tipo de solutos e da presena ou no de partculas em suspenso, existem diferentes membranas com diferentes tamanhos e distribuio de poros caracterizando 4 processos: Microfiltrao; Ultrafiltrao; Nanofiltrao. Osmove inversa.

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Principais caractersticas dos processos que utilizam diferena de presso como fora motriz

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Faixas de tamanho de poros das membranas

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Microfiltrao similar a uma filtrao clssica que utiliza membranas sintticas como barreira seletiva Emprega membranas microporosas, isotrpicas ou anisotrpicas, com tamanho de poros entre 0,05 a 5 m empregada para reter partculas em suspenso, tanto no ar quanto em misturas aquosas So membranas totalmente permeveis aos compostos solveis, independentemente do valor de suas massas molares Aplicao: filtrao estril, tanto de lquidos quanto de gases

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Ultrafiltrao Emprega membranas microporosas anisotrpicas, com dimetros de poros entre 1 e 500 nm. Capaz de reter macromolculas em soluo, e permevel a todos os solutos de baixa massa molar Bastante utilizada na purificao quanto na concentrao de protenas e enzimas

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Osmose Inversa Utiliza membranas anisotrpicas densas, portanto, so permeveis apenas ao solvente, em geral, gua, retendo, praticamente, todas as molculas solveis e materiais em suspenso; Alta presso faz a gua atravessar a membrana no sentido da soluo mais concentrada para a menos concentrada.

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Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao Separao por membranas Extrao em sistemas de duas fases lquidas

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Extrao em sistemas de duas fases aquosas Utilizada na purificao de antibiticos e cidos orgnicos; Consiste na separao da molcula-alvo e impurezas baseada em suas diferentes solubilidades nas fases lquidas

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Sistemas de duas fases aquosas so formados pela reunio de determinados polmeros, polieletrlitos, ou polmeros em combinao com solutos de baixa massa molar formando quatro grupos: 2 polmeros no-inicos. Polieletrlito e um polmero no-inico; 2 polieletrlitos Polmero no-inico e um composto de baixa massa molecular Extrao em sistemas de duas fases aquosas

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Sistemas formados por polietilenoglicol e um sal so intensamente empregados por apresentarem rpida separao das fases, baixo custo e elevada seletividade na separao de molculas com base na solubilidade Extrao em sistemas de duas fases aquosas

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Duas solues aquosas imiscveis; Molcula-alvo P apresenta maior solubilidade na fase de topo em relao fase de fundo; Maior grau de pureza da molcula-alvo se os contaminantes apresentarem solubilidade maior na fase de fundo

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Diagrama de Equilbrio em sistemas de duas fases aquosas (SDFA) Curva de equilbrio de um sistema PEG/fosfato Reta TMB: linha de amarrao (tie-line)

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Curvas de equilbrio do sistema PEG/fosfato de potssio em funo dos parmetros massa molecular e pH do meio

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Coeficiente de Partio (K) Grandeza adimensional que representa a relao entre as concentraes da molcula de interesse na fase de topo e na fase de fundo no equilbrio: K= C Ti C Fi C Ti = Concentrao de soluto i na fase de topo (g/L); C Fi = Concentrao de soluto i na fase de fundo (g/L); Utilizado para avaliao da extenso das separaes nos sistemas de duas fases aquosas; Ocorrncia de purificao: coeficientes distintos para a molcula de interesse e para as demais molculas.

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Fatores que influenciam no coeficiente de partio K Interaes hidrofbicas Cargas superficiais / pH Diferena de potencial eltrico entre as fases Efeito de salting-out da fase salina Diferenas de viscosidade Diferenas de densidade Diagramas de fases (ex.: concentrao de PEG e sal) Massa molecular da biomolcula

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Mtodos de Purificao de alta resoluo: Cromatografia

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Cromatografia Princpio Geral: Reteno e Liberao da molcula-alvo A matriz slida capaz de reter a molcula por um determinado perodo de tempo (tempo de reteno) Eluio do fluido e consequente separao da molcula-alvo

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Cromatografia

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Cromatografia de excluso molecular Cromatografia de troca-inica Cromatografia de interao hidrofbica Cromatografia de afinidade

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Cromatografia de excluso molecular Processo: Os solutos de um meio lquido (protenas, peptdeos, anticorpos) so adsorvidos ou retidos em um leito de material poroso; As molculas sofrem partio em virtude das diferenas no tamanho das espcies entre um solvente (fase mvel) e uma fase estacionria de porosidade definida; A posterior remoo gradual dos solutos por ao de uma fase lquida mvel (eluente), resulta na separao das diferentes molculas

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Cromatografia de excluso molecular A ordem de recuperao seletiva das molculas no fluxo eluente tem incio com as maiores molculas, prosseguindo em direo s menores. Separao por tamanho das molculas

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Cromatografia de excluso molecular Eluio de uma mistura de trs protenas de massas moleculares diferentes em uma coluna de permeao em gel, com a formao de faixas distintas medida que a amostra permeia a coluna

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Cromatografia de excluso molecular Aplicaes: Dessalinizao Determinao de massas moleculares Determinao de tamanho de poros

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Baseia-se na afinidade que componentes de uma amostra tem com os stios inicos em uma matriz slida, ou seja, existe uma competio entre ons de interesse e contaminantes pelos grupos carregados da matriz ou da fase estacionria. As resinas empregadas apresentam elevada capacidade de adsoro de protenas A fase estacionria, eletricamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que esto na fase mvel e apresentam cargas de sinais opostos Controle de pH e fora inica Cromatografia de troca-inica

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Matrizes de troca-inica: Trocadores aninicos: contm grupos positivamente carregados e adsorvem protenas com carga lquida negativa Trocadores catinicos: contm grupos negativamente carregados e adsorvem protenas com carga lquida positiva Aps serem adsorvidos matriz, os solutos podem ser eludos por deslocamento com outros ons, com a mesma carga da protena adsorvida, porm com maior fora de interao com a fase estacionria. Cromatografia de troca-inica

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Princpio bsico da cromatografia de troca inica Cromatografia de troca-inica

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Cromatografia de interao hidrofbica Baseia-se na reteno das molculas pela interao da sua regio hidrofbica com a matriz A protena colocada em meio com elevada concentrao de sal (expe a regio hidrofbica, aumentando a interao com a matriz)

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Cromatografia de interao hidrofbica Molcula de protena

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Cromatografia de interao hidrofbica Modelos de adsoro a: modelo uniponto; b e c: adsoro uniponto; d: foras hidrofbicas de intensidades diferentes em razo das irregularidades na superfcie da matriz.

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Tcnica de separao altamente especfica que depende das interaes entre os pares de materiais biolgico: enzima-substrato, enzima-inibidor, antgeno-anticorpo. O ligante imobilizado em uma matriz porosa Cromatografia de Afinidade

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Purificao de alta resoluo Alta especificidade Separao de formas ativas de formas desnaturadas

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Purificao de alta resoluo Alta especificidade Separao de formas nativas de formas desnaturadas

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O complexo formado entre o ligante e a protena tem que ser reversvel; A protena eluda e o ligante regenerado.

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Cromatografia Ampliao de Escala Critrios: Manter os mesmos graus de pureza, rendimento, atividade biolgica e, se possvel, rendimento, alcanados em escala de bancada; Purificao de miligramas a gramas de produto; Principal caracterstica: aumento do dimetro da coluna e a manuteno constante da altura do leito cromatogrfico, exceto para excluso molecular (ainda deve ser aumentado em 10 % a altura do leito);

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Parmetros que devem ser mantidos constantes: Volume da fase estacionria; Grau de empacotamento; Altura do leito cromatogrfico; Velocidade linear de alimentao (vazo volumtrica dividida pela rea de corte transversal da coluna). Parmetros que devem ter o valor aumentado: Dimetro da coluna; Fluxo volumtrico; Volume de amostra Cromatografia Ampliao de Escala Colunas industriais Altura de leito em torno de 30 cm e dimetro da ordem de 1 m. Maiores volumes de colunas da ordem de 700 a 2000 L (ex.: purificao do soro de queijo)

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Cromatografia Ampliao de Escala