purificação de produtos biotecnológicos
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PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS
BIOTECNOLÓGICOS
PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS
BIOTECNOLÓGICOS
Diversidade de produtos biotecnológicos não há processos de purificação e aplicação geral
Escolha das operações unitárias uso da molécula alvo e suas características físico-químicas
ETAPAS PRINCIPAIS
Clarificação = separação de células e seus fragmentos do meio de cultivo
Concentração e/ou purificação de baixa resolução = separação da molécula alvo
Purificação de alta resolução = separação de classes de moléculas com algumas características físico-químicas semelhantes
Operações para acondicionamento final do produto
Para produtos associados às células rompimento celular
A redução do número de etapas é de fundamental importância na viabilidade do processo
Exemplo, se a cada operação unitária o rendimento em produto for de 90%, a aplicação de 9 operações levará a um rendimento final de cerca de apenas 40%
PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS
BIOTECNOLÓGICOS
OPERAÇÕES UNITÁRIAS
CLARIFICAÇÃO:
Filtração convencional
Centrifugação
Filtração tangencial
Floculação
OPERAÇÕES UNITÁRIAS
ROMPIMENTO DE CÉLULAS:
Homogeneização
Moagem em moinho de bolas
Rompimento químico ou enzimático
OPERAÇÕES UNITÁRIAS
PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO:
Precipitação
Ultrafiltração
Extração em sistemas de duas fases líquidas
OPERAÇÕES UNITÁRIAS
PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO:
Cromatografia de troca iônica
Cromatografia de afinidade (biológica ou química)
Cromatografia de fase reversa
Cromatografia de exclusão molecular
OPERAÇÕES UNITÁRIAS
TRATAMENTOS FINAIS:
Cristalização
Liofilização
Secagem
CLARIFICAÇÃO
É a separação de células suspensas de um meio de cultivo
É a primeira operação unitária do processo de purificação
O meio resultante (isento de células) é denominado clarificado ou filtrado
Depende da dimensão da partícula a ser removida
Filtros convencionais Centrifugação
Microfiltração
0,1 m 1 m 10 m 100 m
Bactérias Leveduras
Bolores
CLARIFICAÇÃO
FILTRAÇÃO CONVENCIONAL
Aplica-se à clarificação de grandes volumes de suspensões diluídas de células (da ordem de milhares de litros), produtos extracelulares e situações nas quais a assepsia não é necessária
A contínua deposição das células sobre o meio filtrante resulta a formação de uma “torta” de filtração
FILTRAÇÃO CONVENCIONAL
Filtro Rotativo à Vácuo
CENTRIFUGAÇÃO
Processo que acelera o processo de sedimentação pela ação de um campo gravitacional centrífugo
Resulta em suspensões mais concentradas em relação à original
Centrífugas Tubulares
CENTRIFUGAÇÃO
Centrífugas de Discos
CENTRIFUGAÇÃO
MICROFILTRAÇÃO
Filtração tangencial fluido de alimentação escoa tangencialmente à superfície do meio filtrante a tensão de cisalhamento do fluido minimiza o acúmulo de células e seus fragmentos na superfície da membrana
MICROFILTRAÇÃO
Filtro Tubular com Fibra Oca
MICROFILTRAÇÃO
Filtro Tipo Quadro e Placa
MICROFILTRAÇÃO
MICROFILTRAÇÃO
Pode ser conduzida em um ou mais filtros
ROMPIMENTO DE CÉLULAS
MICROBIANAS Produtos associados às células
requerem o rompimento ou a permeabilização destas através de operações conduzidas sobre o adensado obtido após a clarificação
Para recuperação de produtos termolábeis ou sujeitos a ação de proteases processo deve ser rápido e conduzido em baixas temperaturas
PAREDE CELULAR
Bactérias Gram (+)
Bactérias Gram (-)D
Leveduras
Fungos Filamentosos
MÉTODOS MECÂNICOS:
Homogeneizador de alta pressão equipamento constituído de pistões projetados para aplicar altas pressões à suspensão celular, forçando sua passagem através de um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície em uma câmara de baixa pressão. A queda instantânea de pressão associada ao impacto, provoca o efetivo rompimento celular sem danificar proteínas
ROMPIMENTO DE CÉLULAS
MICROBIANAS
MÉTODOS MECÂNICOS:
ROMPIMENTO DE CÉLULAS
MICROBIANAS
MÉTODOS MECÂNICOS:
Moinho de bolas
Ultrassom
ROMPIMENTO DE CÉLULAS
MICROBIANAS
MÉTODOS NÃO MECÂNICOS:
Choque osmótico
Congelamento e descongelamento
Secagem
ROMPIMENTO DE CÉLULAS
MICROBIANAS
MÉTODOS QUÍMICOS:
Álcalis
Solventes
Detergentes
Ácidos
ROMPIMENTO DE CÉLULAS
MICROBIANAS
MÉTODOS ENZIMÁTICOS:
Adequados para a recuperação de biomoléculas sensíveis à tensão de cisalhamento ou pressão de trabalho geradas pelos métodos mecânicos
Quando uma certa quantidade de parede é removida, a pressão osmótica interna rompe a membrana citoplasmática, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado para o meio externo
ROMPIMENTO DE CÉLULAS
MICROBIANAS
MÉTODOS ENZIMÁTICOS:
Sistemas líticos são específicos para cada grupo de microrganismo
Para leveduras como glucanases, proteases e mananases
Para bactérias enzimas como glicosidases, acetilmuramilalanina amidases, endopeptidases e proteases
ROMPIMENTO DE CÉLULAS
MICROBIANAS
MÉTODOS ENZIMÁTICOS:
Vantagens facilidade no controle do pH e temperatura, baixo investimento de capital e alta especificidade para degradação da parede celular
Desvantagens alto custo das enzimas e variação da eficiência da lise enzimática com o estado fisiológico do microrganismo
ROMPIMENTO DE CÉLULAS
MICROBIANAS
PRECIPITAÇÃO
Método utilizado para separar os produtos microbianos em meio aquoso
Método tradicional de concentração e purificação de proteínas
A solubilização de proteínas precipitadas pode ser dimensionada de modo a promover a redução do volume inicial e, portanto, levar ao aumento da concentração pode proceder processos de elevada resolução, como cromatografia
PRECIPITAÇÃO
Proteínas precipitadas têm sua estrutura tridimensional modificada sua aplicação só é viável quando a conformação da proteína é recuperada após a precipitação
“Salting-out” = precipitação de proteínas em altas concentrações salinas. Mais usados: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amônio
PRECIPITAÇÃO
“Salting-out” = precipitação de proteínas em altas concentrações salinas. Mais usados: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amônio
Precipitação por solventes = devido à redução da constante dielétrica do meio
ULTRAFILTRAÇÃO
Utilizada para concentrar macromoléculas como proteínas ou polissacarídeos
Transporte de soluções através de membranas com poros de diâmetros de 0,001 a 0,1m, sob pressão de transmembrana de 100 a 500kPa e fluxo de filtrado de 10 a 200 L/hm2
ULTRAFILTRAÇÃO
VANTAGENS:
Separação de bioprodutos de caldos fermentados diluídos
Promover a concentração de compostos a baixa temperatura e pressão
Possibilitar a retirada de sais e outras moléculas pequenas
Manter constante o pH do meio
EXTRAÇÃO EM SISTEMAS DE
DUAS FASES AQUOSAS
As moléculas alvo e as impurezas são
separadas como resultado de suas diferentes solubilidades nas fases líquidas imiscíveis (fase aquosa e solvente)
Sistemas de suas fases aquosas: Polietilenoglicol (PEG)/ dextrana (Dx) Polipropilenoglicol (PPG)/ Dx Sulfato dextrana de sódio/PPG PEG/ fosfato de potássio PEG/ sulfato de magnésio PEG/ citrato de sódio
CROMATOGRAFIA
Processo os solutos de um meio líquido (proteínas, peptídeos, anticorpos) são adsorvidos ou retidos em um leito de material poroso
A posterior remoção gradual dos solutos por ação de uma fase líquida móvel (eluente), resulta na separação das diferentes moléculas
CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA
Processos cromatográficos industrialmente mais utilizados:
Gel filtração baseado na separação de moléculas em função do volume efetivo em solução
Troca iônica baseado na adsorção das moléculas sobre o leito cromatográfico
TRATAMENTOS FINAIS
Liofilização
Cristalização
Secagem
LIOFILIZAÇÃO
Processo de remoção de um solvente (tipicamente a água) de uma solução por sublimação
Nesse processo o material é congelado e em seguida submetido a baixa pressão para sublimação da água livre
CRISTALIZAÇÃO
Processo de agregação de cristais de moléculas presentes em soluções homogêneas supersaturadas
Operação Unitária Características determinantes
Centrifugação Densidade e tamanho das células
Viscosidade do meio
Filtração convencional Compressibilidade e tamanho das células
Microfiltração Tamanho das células ou partículas
Homogeneização Resistência física da parede celular ao
gradiente de pressão
Moinho de bolas Resistência física da parede celular à
tensão de cisalhamento
Extração em SDFA
Precipitação Solubilidade de proteínas
Cromatografia de troca
iônica Mobilidade eletroforética de proteínas
Ultrafiltração
Gel filtração Massa molecular
ALGUMA DÚVIDA?