modelos biotecnolÓgicos de frijol (phaseolus spp
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MODELOS BIOTECNOLÓGICOS DE FRIJOL (Phaseolus spp.) GENÉTICAMENTE MODIFICADO.
CIB IOGEM
SEPTIEMBRE 7 , 2017
CIUDAD DE MÉXICO
MARÍA ALEJANDRA MORA AVILÉS , PH.D.
MODELOS BIOTECNOLÓGICOS DE FRIJOL (Phaseolusspp.) GENÉTICAMENTE MODIFICADO.
FRIJOL (Phaseolus vulgaris L.)GENETICAMENTE MODIFICADO RESISTENTE AHONGOS FITOPATÓGENOS MODIFICADO CONEL GEN DEFENSINA (pdf1.2) DE Arabidopsisthaliana.
EVALUACIÓN DE LA TOLERANCIA A ESTRÉSHÍDRICO EN FRIJOL (Phaseolus vulgaris L.) CV.PINTO SALTILLO MODIFICADO CON EL GEN H+- PIROFOSFATASA VACUOLAR DE Arabidopsisthaliana (AVP1).
RIZO-SECRECIÓN DE UNA LECTINARECOMBINANTE CON ACTIVIDAD BIOLÓGICAMEDIANTE LA MANIPULACIÓN GENÉTICA DEFRIJOL TÉPARI (Phaseolus acutifolius).
Contenido:
262,836 ton
De 70,000 a 163,000 ton
De 5,000 a 30,000 ton
Menos de 5,000 ton
Fuente: SIAP SAGARPA, 2016
9.9%
8.7%
11.5%
35.9%
7%
6.2%
0. 969 millones de ton.
Estados Productores de Frijol
P. vulgaris
(7.4% alogamia*)
P. acutifolius
P. coccineusP. lunatus
-Rescate de embriones-Estéril
-Rescate de embriones-Estéril
-Híbridos con progenitor ♀usualmente abortan.
*(Miranda, 1971)
Hibridación Interespecífica
• Plagas (gorgojo, araña roja, mosquita)
• Enfermedades (antracnosis, patógenos de
raíz, roya, virus)
• Clima estrés hídrico, temperaturas extremas)
• Suelo (toxicidad por aluminio, deficiencia de
fosfato).
• Calidad nutricional (Fe, Zn)
• Productividad
Fuente: FAO y CIAT, 2017.
Reto
Identificación de genes
Identificación de marcadores
Regeneración y modificación genética
Rescate de embriones en cruzas con parientes distantes
Mejoramiento Biotecnológico
Generación de líneas de frijol modificadasgenéticamente con resistencia/tolerancia a factoresbióticos y abióticos.
Objetivo
FRIJOL (Phaseolus vulgaris L.) GENETICAMENTEMODIFICADO RESISTENTE A HONGOSFITOPATÓGENOS MODIFICADO CON EL GENDEFENSINA (pdf1.2) DE Arabidopsis thaliana.
FRI JOL (Phaseo lus vu lgar i s L . ) CV. FLOR DE MAYO ANITA CON TOLERANCIA DE AMPLIO ESPEC TRO A HONGOS F ITOPATÓGENOS . FONDO C IB IOGEM
VARIEDADES DE FRI JOL TRANSGÉNICAS CON RES ISTENCIA A ENFERMEDADES Y SU EQUIVALENCIA SUSTANCIAL . FONDO CONACYT-SAGARPA
Razonamiento
Cultivo susceptible a hongos patógenos
Mejoramiento encaminado a resistencia vertical (gen x gen)
Necesidad de generar tecnología nacional disponible para el mejorador y el agricultor.
Defensina (pdf1.2)
De Oliveira y Moreira, 2009
Unión del péptido a la
membrana celular
Inserción del péptido Agregación de péptido y lisis celular
1. Atracción electrostática entre el péptido catiónico y
la membrana aniónica del microorganismo.
2. Inserción del péptido en la membrana
3. Permeabilización (por formación de poros) y lisis
celular
4. Inducción de influjo de Ca+2 y eflujo de K+ cuando se
adhieren a las hifas de hongos.
Péptidos antimicrobianos conformados de 45 a 54
aminoácidos.
Respuesta del sistema inmune de vertebrados, invertebrados y plantas.
Proteínas generadas de un solo gen (eficientes) con limitado aporte de
energía y biomasa.
Presentan efectos inhibitorios de
crecimiento sobre un gran número de hongos.
Sobre Expresión de Defensinas
Defensina de rábano confirió resistencia a Alternaria longipes en tabaco (Terras et al., 1995) y en tomate a Alternaria solani (Parashina et al.,
2000).
Defensina de chícharo cierta tolerancia a Leptosphaeria maculans en canola (Wang et al.,
1999).
Defensina de alfalfa resistencia robusta a Verticillium dahliae en papa (Gao et al., 2000).
Resistente a biotipos de VMC,resistencia media-alta a las razasde roya de la región central deMéxico y moderadamenteresistente al tizón común.
Castellanos et al., 2003
Frijol cv. Flor de Mayo Anita
3
4
5
Extracción y Disección de Embriones
RB nos-p nptII nos- t P352-S pdf 1.2 rbcsS-E9 LB
Construcción T-DNA en vector pKYLX80. RB: Borde derecho; nos-p: promotor nopalinsintasa; nptII: gen de selección neomicin fosfotransferasa (resistencia a kanamicina(kan)); nos-t: terminador nopalin sintasa; P35S2: Promotor CaMV35S; pdf1.2:Defensina de A. thaliana; rbcsS-E9: terminador ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa dechícharo; LB: borde izquierdo.
Construcción
Tejido resistente a kanamicina
Raíces
1 mes después de trasplantar ainvernadero
Cámara de crecimiento 25° C
Modificación genética
Amplificación de genes por PCR punto final. 35S, nptII y
pdf1.2
Amplificación por qPCRpdf1.2.
Expresión transcripcional por qRT-PCR pdf1.2.
Caracterización Molecular
LíneaSuperficie cubierta con lesiones1± E.E
C - 80.0±13.5 a2
CT 82.0±12.0 a
L2 50.0±8.9 b
L3 82.5±13.5 a
L4 67.5±13.5 a
L7 36.8±7.8 b
L9 33.3±7.8 b
1 Promedio de superficie de hoja cubierta con lesiones (10 días después de inoculación). L2, L3, L4, L7 y L9 = Líneas transformadas; -C = Planta no transformada; CT= Control de transformación2 Análisis de comparación de medias Tukey = 0.05
Hojas de frijol de plantas T0 de frijol inoculadas con C. lindemuthianum 1472
Inoculación de C. lindemuthianum patotipo 1472 sobre planta de frijol. a. FMA-pdf1.2 y b.planta control. Las flechas indican la presencia de masas de esporas en peciolos.
a bb
0
1
2
3
0
5
10
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20
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448 1472 448 1472 448 1472 448 1472
Nú
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V
FMA
L2
L3
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0 1 2 3
Cepa
Daño
Plantas T3 de FMA-pdf1.2inoculadas con C. lindemuthianum
FMA L2
L9
Plantas T3 de FMA-pdf1.2 inoculadas con C. lindemuthianum
Bioensayo FMA-pdf1.2 T4
Fusarium lateritium
Rhizoctonia solani
Verticillium spp.
Líneas FMA-pdf1.2
Montcalm
FMA
F. latertium 1 x 105
Escala Visual
1= 0% 2= 1-5% 3= 6-10%4= 11-25%5= 26-35%6= 36-50%7= 51-65%8= 66-75%9= > del 75%del hipocotilo y tejido de la raíz con lesiones
Sánchez-García, 2006; CIAT, 1987.
Resistente
Tolerante
Susceptible
A
BCC
BC BCC
A
0
1
2
3
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5
6
Val
ore
s d
e R
esi
ste
nci
a
Poblaciones
1= 0% 2= 1-5% 3= 6-10%4= 11-25%5= 26-35%6= 36-50%7= 51-65%8= 66-75%9= > del 75% del hipocotilo y tejido de la raíz con lesiones
Inoculación con F. latertium
Colonización y Capacidad de Formación de Nódulos
Efecto en Organismos Benéficos
3.5 x 105 - 4.5 x 105 UFC/mL
MUESTRAFENOLES
mg EAG/100gTANINOS
mg EC/100gANTOCIANINASmg EC3G/100g
FLAVONOIDESmg EC/100g
FMA Control
991.9±56.2 a 4447.5±448.1 a 1.9±0.24 a 459.7±22.17 a
FMA-pdf1.2
1091.9±14.5 a 3890.8±323.1 a 2.07±0.01 a 491.0±25.87 a
Análisis Nutracéutico
MUESTRAFe
(mg/100g PS)Zn
(mg/100g PS)Ca
(mg/100g PS)K
(mg/100g PS)
FMA Control
2.7±0.5 a 5.48±1.6 a 10±0.02 a 1.56±0.2 a
FMA-pdf1.2
5.01±1.8 a 7.17±0.3 a 10±0.01 a 1.28±0.3 a
Minerales y Proximal
MUESTRA PROTEÍNA%
FMA Control 26.21±1.37 a
FMA-pdf1.2 26.28±0.30 a
Solicitud de Permiso de Liberación al Ambiente en Etapa Experimental
EVALUACIÓN DE LA TOLERANCIA A ESTRÉSHÍDRICO EN FRIJOL (Phaseolus vulgaris L.)CV. PINTO SALTILLO MODIFICADO CON ELGEN H+ - PIROFOSFATASA VACUOLAR DEArabidopsis thaliana (AVP1).
ELEMENTOS TECNOLÓGICOS DE TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE FRI JOL. CONACYT -GUANAJUATO 118814
Khadilka et al., 2016
Red de Floema EnergizadaH+-Ppasa-bomba de protones
Sistema radical eficiente en la toma de agua y nutrientes.
Fuerza Motriz de Protones
AVP1 en estrés hídrico, salinidad y baja disponibilidad de nutrientes
Especie Fenotipo Referencia
Arabidopsis Más iones y agua, mayor crecimiento de brotes y biomasa
Gaxiola et al., 2001
Alfalfa Mayor biomasa, incremento en retención de agua en hoja y tasa fotosintética
Bao et al., 2009
Tomate Mayor biomasa de raíz, potencial hídrico y recuperaron el crecimiento de brotes
Park et al., 2005
Algodón Mayor biomasa de brotes y raíz, mayor rendimiento de fibra
Pasapula et al., 2011
Maní Incremento del crecimiento de brotes Qin et al. 2013
Cebada Incremento en biomasa de brotes y rendimiento Schilling et al., 2014
Arroz Incremento del crecimiento de brotes Kim et al., 2013
Lechuga Mayor biomasa, acidificación de rizósfera y toma de nitrato en bajos niveles de N, asimismo, presentó mayor productividad
Páez-Valencia et al., 2013
Rhiannon et al., 2017.
Frijol cv. Pinto Saltillo
PINTO SALTILLO tolerante aenfermedades: antracnosis,roya y pudriciones de la raíz.Cierta tolerancia a sequía.
Sánchez-Valdez et al., 2009
Expresión Relativa
00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
L1 L5 L7 L9 L10 L11 L12 L13 L14 CNT
Exp
resi
ón
rel
ativ
a (2
po
t-D
DC
t)
Líneas de frijol cv. Pinto Saltillo modificadas con el gen AVP1
Expresión relativa transcripcional del AVP1 en líneas de frijol cv. Pinto Saltillo modificadas genéticamente.
Variables Agronómicas (rendimiento,
componentes de biomasa y de
partición)•A partir de 9% de CVA las
plantas fueron recuperadas con riego diariamente hasta el llenado completo de vaina en cada planta.
Variables Fenológicas
(Días a floración, madurez
fisiológica, llenado de
semilla)
• Inició en la etapa fenológica de 50 % de floración desde 100 % hasta 9 % de CVA (10 días).Variables.
Fisiológicas (tasa
fotosintética, transpiración y conductancia)
Bioensayo de estrés hídricoEl índice de intensidad a sequía (IIS)=0.78
Variables Fenológicas
Componentes Fenológicas
AVP1Estrés
PSEstrés
PSRiego
Días a floración 39 39 40
Días a madurez fisiológica
78 78 85
Días a llenado de semilla
38 39 45
No se encontraron diferencias significativas en DF, DMF y DLS
entre plantas PS-AVP1 y plantas control.
* **
** *
*
0
2
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PSEstrés
L1 L5 L7 L9 L10 L11 L12 L13 L14 PSRiego
Tasa
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L1 L5 L7 L9 L10 L11 L12 L13 L14 PSRiegoTa
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-1
020406080
100120140160180200
PSEstrés
L1 L5 L7 L9 L10 L11 L12 L13 L14 PSRiego
Co
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M/m
-2/s
-1
Líneas de frijol PS-AVP1
Variables fisiológicas
**
**
**
CI-340 Handheld Photosynthesis
System.
*
****
**
**
**
****
*
02468
1012141618
Ren
dim
ien
to
(g/1
0 p
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Líneas de frijol Pinto Saltillo
Rendimiento
La mayoría de las líneas PS-AVP1 bajo estrés hídrico presentó valores derendimiento superiores a PS en riego (35 a 96%).
*
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L1 L5 L7 L9 L10 L11 L12 L13 L14 PSRiego
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Líneas de frijol PS-AVP1
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L1 L5 L7 L9 L10 L11 L12 L13 L14 PSRiego
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M C
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/s-1
**
Eficiencia de translocación a órganos destino
Características L1 L5 L7 L9 L10 L11 L12 L13 L14PS
Riego
PS
Estrés
Rendimiento (g) 10.1 13.4 12.1 14.4 11.4 16.5 13.7 8.4 15.1 10.4 8.4
Biomasa total 33.89 36.53 53.64 25.67 41.31 40.82 45.44 68.89 54.22 30.4 49.2
Rendimiento vs. biomasa?
TCB=Biomasa total/DMF
TCE=Rend/DMF
TLS=Rend/DLS
IC=Rend/Biomasa Total
FRD=TLS/TCB
Variables de Partición: Mostraron valores similares o superiores a los comparadores no modificados bajo condiciones de estrés hídrico.
RIZO-SECRECIÓN DE UNA LECTINARECOMBINANTE CON ACTIVIDADBIOLÓGICA MEDIANTE LA MANIPULACIÓNGENÉTICA DE FRIJOL TÉPARI (Phaseolusacutifolius).
PA R Á M E T R O S D E TO L E R A B I L I D A D Y FA R M A C O C I N É T I C O S D E L AA D M I N I ST R A C I Ó N O R A L D E U N A F R A C C I Ó N C O N C E N T R A DA E NL EC T I N A S D E F R I J O L T É PA R I , D E T E R M I N AC I Ó N D E L A E S T R U C T U R AM O L EC U L A R D E L A L E C T I N A M AYO R I TA R I A Y G E N E R A C I Ó N D E U N AL EC T I N A R EC O M B I N A N T E B I O A C T I VA . S E P - C O N A C Y T 2 4 1 1 8 1
D R A . T E R E S A G A R C Í A G A S C A - UA Q
LectinasGlicoproteínas= proteínas+carbohidratos
Glicosilación=adición de carbohidratos a la secuencia polipeptídicapara generar grupos funcionales.
Funciones Biológicas de las Lectinas
Ferriz-Martínez et al., 2010
Neoplasias malignas Glicoproteínas LectinasLectinas de frijol tépari
Inconvenientes
2° Lugar en mortalidad(Cervantes y Ochoa, 2008).
Durante la transformación maligna, la biosíntesis de los oligosacáridos unidos a glicoproteínas está frecuentemente alterada (Dabelsteen,
1996).
(Sitia et al., 1984; Leibiger et al., 1998; Yarema et al., 2001).
La disposición y composición de sus antenas glúcidas les confieren la capacidad de aglutinar células de forma diferencial
Reconocen y provocan la muerte de diferentes tipos de cáncer (citotóxicas) y tienen un efecto antiproliferativo(metástasis) (García-Gasca et al., 2002; 2012).
Nivel de toxicidad intermedio y altamente específicas (Chrispeels
y Raikhel, 1991).
Métodos de purificación:Bajos niveles de recuperación.Proceso de obtención tardado y costoso (García-
Gasca et al., 2002; 2012).Glóbulos rojos
Lectina Hemaglutinación
mama cérvix colon
(García-Gasca et al., 2012).
Fracción semipura de lectina inhibió células tumorales (García-Gasca et al., 2002).
La función biológica, asociada con un mecanismo apoptótico (Ángeles-Zaragoza, 2010; García-Gasca et al., 2012).
Problema
•Sistema de síntesis constitutivo
•Sistema de rizosecreción, en el cual la purificaciónde la lectina sea simple.
•Garantice la integridad de glicosilación paramantener su capacidad biológica funcional.
Las lectinas no son empleadas como
agentes terapéuticos debido a que el
proceso de obtención es lento y de bajo
rendimiento; por lo que se requiere un
sistema que provea:
Mapa de Construcción
(Martínez-Alarcón, 2015; Espinoza-Núñez, 2016; Serrano-Jamaica, 2017)
Identificación de glicoproteínas en exudados radiculares
Tinción de membrana con reactivo de Schiff-ácido peryódico (PASS). Carril 1, control positivo (40 mg de fracción concentrada); Carriles 2 y 3, exudados radiculares provenientes de plantas de frijol Tépari transgénicas (40 mg proteína recombinante); Carriles 4 y 5, exudados radiculares provenientes de plantas de frijol Tépari no transgénicas (Martínez-Alarcón, 2015).
Actividad hemaglutinante de la lectina recombinante obtenida por rizo-secreción
Análisis de aglutinación de eritrocitos A+. Columna 1) control negativo deaglutinación con PBS (solución salina amortiguada con fosfato). Columna 2) exudadosradiculares de plantas no transformadas. Columna 3) exudados radiculares de lasplantas genéticamente modificadas. Columna 4) control positivo de Lectina nativa.Concentración= 1 mgP/mL
Participantes
• Luz María Serrano
• Elsa Espinosa
• Arantxa Espinoza
• Dania Martínez
• Anareli Quintero
• Mayela Sucedo
• Pablo Delgado
• Baltazar Tula
•Teresa García Gasca (UAQ)
•Bertha Sánchez (IT ROQUE)
•Roberto Gaxiola (U. Arizona)
•Miguel Gómez Lim (CINVESTAV)
•Oscar Grageda (INIFAP)
•Horacio Guzmán (INIFAP)
