universidade federal de mato grosso sÍntese
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DE COMPOSTOS DE COORDENAÇÃO DE Ru+3 COM
BIPIRIDINA E L-TRIPTOFANO.
Fabricio Tarso de Moraes
Mestrado em Química com área de concentração em Química Inorgânica.
CUIABÁ MATO GROSSO – BRASIL
2017
FABRICIO TARSO DE MORAES
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DE COMPOSTOS DE COORDENAÇÃO DE Ru+3 COM
BIPIRIDINA E L-TRIPTOFANO.
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Mato Grosso, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em Química, para
obtenção do título de Mestre em Química, com área de
concentração em Química Inorgânica.
CUIABÁ MATO GROSSO – BRASIL
2017
II
FABRICIO TARSO DE MORAES
FOLHA DE APROVAÇÃO
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DE COMPOSTOS DE COORDENAÇÃO DE Ru+3 COM
BIPIRIDINA E L-TRIPTOFANO.
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Mato Grosso, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em Química, para
obtenção do título de Mestre em Química, com área de
concentração em Química Inorgânica.
Aprovada: 10 de julho de 2017, Cuiabá - MT.
Comissão Examinadora:
III
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
M827s Moraes, Fabricio Tarso de.
Síntese, caracterização e avaliação do potencial antitumoral de compostos de coordenação de Ru+3 com bipiridina e L-triptofano. / Fabricio Tarso de Moraes. -- 2017
xiii, 48 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientador: Wagner Batista dos Santos.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Mato Grosso, Instituto de Ciências Exatas e da Terra, Programa de Pós-Graduação em Química, Cuiabá, 2017.
Inclui bibliografia.
1. Rutênio. 2. Antitumoral. 3. L-triptofano. I. Título.
IV
Dedico este trabalho aos meus pais Celso e Joana
Darc, a minha avó Duti e ao meu irmão Luiz Fernando, por todo
apoio, amor, carinho e compreensão. Sem vocês eu nunca teria
chegado tão longe, fica aqui o meu sincero obrigado e a minha
eterna gratidão.
V
AGRADECIMENTOS
Ao professor Doutor Wagner Batista dos Santos por ser um
exemplo de profissional a ser seguido, pela orientação, paciência, confiança
e amizade.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Estudos de Matérias,
casas 05 e 06, pelos anos de convivência e experiencias compartilhadas.
Ao meu grande amigo Baiano, que pensa que se chama
Anderson Dourado Galvão, pela a amizade sincera e por se fazer presente
desde a graduação.
Aos colegas e amigos de Cuiabá por terem me recepcionado e
acolhido tão bem.
Ao pessoal do Laboratório de Imunologia da Relação Materno
Infantil, em especial a Doutora Patrícia Gelli Feres de Marchi, pelo apoio
e auxílio nos testes biológicos.
Ao Laboratório de Análise Térmica Ivo Giolito, em especial ao
colega José Augusto Teixeira, pela disponibilidade e realização das
análises termoanalíticas.
Ao Grupo de Eletroquímica e Novos Materias, em especial a
colega Ana Carina Sobral, pela disponibilidade e realização das análises
UV-vis.
A Capes pelo apoio financeiro e a todos que de forma direta ou
indireta contribuíram para a concretização deste trabalho.
A todos vocês o meu muito obrigado.
VI
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
δ – Deformação angular
p – Deformação do tipo rocking
v – Estiramento
vas – Estiramento assimétrico
vs – Estiramento simétrico
ATCC – American Type Culture Collection
ATR – Refletância total atenuada
bipy – 2,2’-bipiridina
DMSO – Dimetilsulfóxido
dppb – 1,4-bis(difenilfosfina)butano
DTA – Análise Térmica Diferencial
FL1 – Intensidade de fluorescência 1
FL2 – Intensidade de fluorescência 2
FTIRmed – Infravermelho médio por transformada de Fourier
LMCT – Transição de carga ligante-metal
L-trip – L-triptofano
MCF-7 – Linhagem celular do tipo Adenocarcinoma de Mama Humano
MeCN – Acetonitrila
MLCT – Transição de carga metal-ligante
NAMI – trans-dimetilsufóxido-imidazole-tetraclororutenatoIII de sódio
NAMI-A – trans-dimetilsufóxido-imidazole-tetraclororutenatoIII de imidazolio
NSCLC – No Small Cell Lung Câncer (Câncer de pulmão de células não
pequenas)
PBMC – Peripheral blood mononuclear cell (Células mononucleares do
sangue periférico)
RAP – cis-dicloro-1,2-propilenodiamino-N,N,N0,N0-tetraacetatorutênioIII
UV-VIS – Ultravioleta-visível
TG – Termogravimetria
t-Bu2bipy – 4,4'-di-terc-butil-2,2'-bipiridina
phox – 2-(2'-hidroxifenil)oxazolina
VII
non2bipy – 4,4'-dinonil-2,2'-bipiridina
8-HQ – 8-hidroxiquinolina desprotonada
A-20 – Linhagem celular do tipo Linfoma de Células B de Burkitt murino
SK-BR-3 – Linhagem celular do tipo Adenocarcinoma de Mama Humano
S-180 – Linhagem celular do tipo Sarcoma murino 180
Jurkat – Linhagem celular do tipo Leucemia de Células T Humanas
RPMI – Meio Roswell Park Memorial Institute
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético
PBS – Tampão fosfato salino
FSC – Difração frontal
SSC – Difração lateral
VIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura do complexo cis-diaminodicloroplatinaII, também
conhecido como cisplatina. (Fonte: adaptado de Rosenberg) [8]
ChemSketch™ ............................................................................................ 15
Figura 2: Estrutura do complexo NAMI. (Fonte: adaptado de Gallori et al.) [12]
ChemSketch™ ............................................................................................ 18
Figura 3: Estrutura do complexo conhecido como NAMI-A. (Fonte: adaptado
de Alessio) [18] ChemSketch™ ................................................................... 19
Figura 4: Estrutura molecular do [Ru(tBu2bipy)2(phox)PF6. (Fonte: adaptado
de Mulcahy et al.) [24] ChemSketch™ ........................................................ 19
Figura 5: Estrutura molecular do; cis-(dicloro)tetraamimrutenioIII (a), cis-
tetraamim(oxalato)rutenioIII (b). (Fonte: adaptado de Vilanova-Costa et al.)
[30] ChemSketch™ ..................................................................................... 21
Figura 6: Estrutura molecular do 2,2’-bipiridinatetraclororutenatoIII de
potássio, K[Ru(bipy)Cl4]. (Fonte: adaptado de Durham et al.) [38]
ChemSketch™ ............................................................................................ 23
Figura 7: Curvas TG-DTA do composto [Ru(bipy)(L-trip)Cl2].1/2H2O .......... 34
Figura 8: Espectro UV-VIS qualitativo do composto K[Ru(bipy)Cl4] em solução
ácida HCl/água 1:1 ...................................................................................... 37
Figura 9: Espectro UV-VIS qualitativo do composto [Ru(bipy)(L-trip)Cl2] em
álcool etílico ................................................................................................. 38
Figura 10: Sobreposição dos espectros UV-VIS. L-triptofano em água
destilada, K[Ru(bipy)Cl4] em solução ácida HCl/água 1:1 e [Ru(bipy)(L-
trip)Cl2] em álcool etílico .............................................................................. 39
Figura 11: Espectro UV-VIS qualitativo do composto [Ru(bipy)(L-trip)Cl2] em
álcool etílico ................................................................................................. 40
Figura 12: Espectro FTIRmed dos compostos estudados ............................. 42
Figura 134: Gráfico das médias, de morte celular por necrose, pelo teste de
Tukey ........................................................................................................... 47
IX
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Relação composição-citotoxicidade de alguns compostos derivados
de rutênio em linhagem de células HeLa .................................................... 20
Tabela 2: Etapas de decomposição térmica para o [Ru(bipy)(L-
trip)Cl2].1/2H2O ............................................................................................ 35
Tabela 3: Tipo de transições observadas para os compostos estudados ... 37
X
RESUMO
MORAES, Fabricio Tarso de, M.S. Universidade Federal de Mato Grosso,
julho de 2017. Síntese, caracterização e avaliação do potencial
antitumoral de compostos de coordenação derivados de Ru+3.
Orientador: Wagner Batista dos Santos.
Com o objetivo de sintetizar, caracterizar e avaliar o potencial antitumoral de
compostos derivados de rutênio, foi gerado no presente trabalho, a partir do
precursor K[Ru(bipy)Cl4], uma rota de síntese simples e reprodutível para um
novo composto de coordenação de Ru+3 com bipy e L-trip. A caracterização
espectroscópica dá fortes indícios da interação Ru-(L-trip). O deslocamento
da banda referente ao íon carboxilato para energias mais altas, no FTIRmed,
e os deslocamentos de bandas referentes a amina alifática, indicam uma
coordenação bidentada do ligante L-trip. A presença de cloros na esfera de
coordenação é comprovada pela banda de absorção em 433 nm, no espectro
UV-VIS. Além disso, as bandas de transições em 496 e 601 nm, referentes a
transições do tipo MLCT que não são observadas no precursor
K[Ru(bipy)Cl4], confirmam a presença do ligante L-trip na esfera de
coordenação. Com os estudos em técnicas termoanalíticas foi possível
sugerir a formula mínima do composto, [Ru(bipy)(L-trip)Cl2].1/2H2O. Devido
aos problemas de solubilidade encontrados, a análise do potencial
antitumoral do composto [Ru(bipy)(L-trip)Cl2] se tornou inviável. Já a
avaliação do potencial antitumoral do precursor K[Ru(bipy)Cl4] demonstrou
que o mesmo possui efeitos tóxicos, consideráveis, em linhagem de células
MCF-7, porém não demonstrou seletividade e atinge em mesmas proporções
células PBMC.
Palavras-chave: rutênio, antitumoral, aminoácidos.
XI
ABSTRACT
MORAES, Fabricio Tarso de, M.S. Universidade Federal de Mato Grosso,
July 2017. Synthesis, characterization and evaluation of the antitumor
potential of Ru+3 derived coordination compounds. Adviser: Wagner
Batista dos Santos.
In order to synthesize, characterize and evaluate the antitumor potential of
ruthenium-derived compounds, was created in this work, from the
K[Ru(bipy)Cl4] precursor, a simple and reproducible synthesis route for a new
Ru+3 coordination compound with bipy and L-trip. The spectroscopic
characterization gives strong indications of the Ru-(L-trip) interaction. The
displacement of the band corresponding to the carboxylate ion to higher
energies in the FTIRmed, and the band displacements referring to the aliphatic
amine, indicates a bidentate coordination of the L-trip ligand. The presence of
chlorine in the coordination sphere is demonstrated by the absorption band at
433 nm in the UV-VIS spectrum. In addition, the transition bands at 496 and
601 nm, referring to MLCT transitions that are not observed in striker
K[Ru(bipy)Cl4], confirm the presence of L-trip linker in the coordination sphere.
With the studies in thermoanalytical techniques it was possible to suggest the
minimum formula of the compound, [Ru(bipy)(L-trip)Cl2].1/2H2O. Due to the
solubility problems encountered, analysis of the antitumor potential of the
compound [Ru(bipy)(L-trip)Cl2] became infeasible. However, the evaluation of
the antitumor potential of K[Ru(bipy)Cl4] demonstrated that it has considerable
toxic effects on the MCF-7 cell line but did not show selectivity and reach
PBMC cells in the same proportions.
Key words: ruthenium, antitumor, amino acids.
XII
SUMÁRIO
FOLHA DE APROVAÇÃO ............................................................................. II
AGRADECIMENTOS .................................................................................... V
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................ VI
LISTA DE FIGURAS ................................................................................... VIII
LISTA DE TABELAS .................................................................................... IX
RESUMO ....................................................................................................... X
ABSTRACT .................................................................................................. XI
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................ 14
2. OBJETIVOS ............................................................................................ 16
2.1. Objetivo geral ................................................................................... 16
2.2. Objetivos específicos ....................................................................... 16
3. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................... 17
3.1. Compostos derivados de rutênio no tratamento de neoplasias ....... 17
3.2. 2,2’-bipiridinatetraclororutenatoIII de potássio ................................. 22
4. MATERIAIS E METODOS ....................................................................... 25
4.1. Síntese do K[Ru(bipy)Cl4] ................................................................ 25
4.1.1. Materiais .................................................................................. 25
4.1.2. Síntese ..................................................................................... 26
4.1.3. Recristalização ......................................................................... 26
4.2. Síntese do [Ru(bipy)(L-trip)Cl2] ........................................................ 27
4.2.1. Materiais .................................................................................. 27
4.2.2. Síntese ..................................................................................... 27
4.2.3. Testes qualitativos de solubilidade........................................... 28
XIII
4.3. Caracterização ................................................................................. 28
4.4. Avaliação citotóxica dos compostos de rutênio ............................... 29
4.4.1. Preparo da solução .................................................................. 29
4.4.2. Ensaio biológico ....................................................................... 29
4.4.3. Análise de fluorescência por citometria de fluxo ...................... 31
4.4.4. Análise estatística .................................................................... 32
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 33
5.1. Síntese e solubilidade do [Ru(bipy)(L-trip)Cl2] ................................. 33
5.2. Caracterização ................................................................................. 34
5.2.1. Curvas TG-DTA ....................................................................... 34
5.2.2. Espectroscopia eletrônica UV-VIS ........................................... 36
5.2.3. Espectroscopia FTIRmed ........................................................... 41
5.3. Avaliação citotóxica dos compostos de rutênio ............................... 45
6. CONCLUSÃO .......................................................................................... 49
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ 50
8. ANEXOS.................................................................................................. 56
8.1 Arquivos gerados pelo programa AgroEstat ..................................... 56
14
1. INTRODUÇÃO
Segundo o documento World Cancer Report 2014,[1] publicado
pela International Agency for Research on Cancer (Iarc), a incidência global
de neoplasias malignas, popularmente conhecidas como câncer, aumentou
de 12,7 milhões em 2008 para 14,1 milhões em 2012. De acordo com o
documento, os novos números de casos poderão chegar perto dos 25
milhões nas próximas duas décadas, sendo que o maior impacto ocorrerá em
países em desenvolvimento, muitos dos quais não possuem estruturas
adequadas para lidar com o aumento de pacientes diagnosticados com a
doença.
No Brasil, o Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da
Silva (INCA) contribui a cada biênio com projeções estatísticas utilizadas por
todas as áreas de atuação que visão o combate a essa doença. Segundo a
Instituição, para o biênio 2016-2017, são esperados cerca de 600 mil novos
casos. Só no estado de Mato Grosso, a estimativa de todos os tipos de
câncer, no ano de 2016, foi de 9270 novos casos, sendo 4070 para a capital
Cuiabá.[2]
Atualmente, o tratamento de neoplasias malignas é constituído por
três principais métodos: intervenção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia,
sendo a última a utilização de medicamentos antineoplásicos no tratamento
sistêmico de câncer. Normalmente, esses métodos são utilizados em
conjunto, visando obter uma maior eficiência no tratamento.[3]
Desde os estudos realizados por Rosenberg [4-6] e colaboradores
os compostos de coordenação derivados de platina estão entre os fármacos
mais utilizados no tratamento do câncer.[7] Porém, esses compostos
apresentam uma elevada toxicidade, levando os pacientes a apresentar
alguns efeitos colaterais, como elevada nefrotoxicidade, náuseas, vômitos,
anorexia, ototoxicidade, neurotoxicidade e o desenvolvimento de resistência
ao medicamentos.[7-9]
A figura 1 ilustra um dos primeiros compostos de coordenação,
derivados da platina, utilizado como antineoplásico, a cisplatina.
15
Figura 1: Estrutura do complexo cis-diaminodicloroplatinaII, também conhecido como cisplatina. (Fonte: adaptado de Rosenberg) [8] ChemSketch™
Os efeitos tóxicos causados pelos compostos derivados de platina
impulsionaram diversos pesquisadores a desenvolverem novos fármacos.
Pesquisas envolvendo compostos derivados de rutênio se mostram
promissoras, isso devido a considerável citotoxicidade e baixa toxicidade
exibida por esses compostos.[10, 11]
O interesse por essa classe de compostos está em grande parte
relacionado ao fato do rutênio conseguir interagir com as bases nitrogenadas
da molécula de DNA.[12] A interação desse metal com o DNA pode ocasionar
danos à célula cancerígena e levar à morte celular por apoptose. Outra
propriedade que chama atenção é a capacidade do rutênio em mimetizar o
ferro dentro do organismo dos mamíferos. Essa propriedade está diretamente
relacionada com a baixa toxicidade exibida por esses compostos, no
tratamento contra o câncer.[10, 11]
Visando a elaboração de um medicamento eficiente, que combata
neoplasias malignas com o mínimo de dano possível ao corpo humano, este
trabalho traz a síntese e caracterização de um composto de coordenação de
rutênio.
16
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O presente trabalho tem como objetivo geral sintetizar e
caracterizar um novo composto de coordenação de Ru+3, com bipy e L-trip, e
avaliar a atividade antitumoral, assim como o do seu precursor
K[Ru(bipy)CL4], em linhagens de células saudáveis PBMC e linhagem de
células tumorais MCF-7.
2.2. Objetivos específicos
❖ Desenvolver uma rota de síntese, reprodutiva, para um
novo composto de coordenação de Ru+3 com bipy e L-trip, a partir do
composto K[Ru(bipy)Cl4];
❖ Purificar o novo composto sintetizado;
❖ Determinar propriedades espectroscópicas por análises de
UV-vis e FTIRmed;
❖ Propor uma estequiometria utilizando a técnica termo
analítica TG;
❖ Determinar o comportamento e a estabilidade térmica por
TG-DTA;
❖ Avaliar os efeitos citotóxicos, do material sintetizado e de
seu precursor, em linhagens de células saudáveis PBMC e tumorais MCF-7.
17
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. Compostos derivados de rutênio no tratamento de neoplasias
Pesquisas envolvendo compostos derivados de rutênio como
fármacos no tratamento de neoplasias malignas têm se mostrado
promissoras.[13] Essa classe de compostos apresenta características como
considerável citotoxicidade, propriedades antimetátese e baixa toxicidade
quando comparados aos compostos derivados de platina.[10]
Sabe-se que, assim como o ferro, o rutênio tem a capacidade de
se ligar a proteína transferrina. Essa proteína está diretamente relacionada
ao transporte de ferro no organismo dos mamíferos. Devido à grande
demanda de ferro, células cancerígenas tendem a aumentar os números de
receptores de transferrina em suas superfícies, capturando-as em maior
número. Acredita-se que ao mimetizar o ferro, uma maior concentração de
rutênio é direcionada para células cancerígenas, o que explicaria a menor
toxicidade dessa classe de compostos.[10, 11]
Já a considerável citotoxicidade pode estar relacionada a
interações entre o centro metálico e as bases nitrogenadas do DNA. Os
resultados obtidos por Gallori [12] e colaboradores sugerem que os
compostos conhecidos como NAMI e RAP são capazes, in vitro, de interagir
com o DNA causando alterações em sua conformação, inibindo seu
reconhecimento e corte por enzimas de restrição. Porém, esses compostos
só provocam danos consideráveis ao DNA em concentrações relativamente
altas, quando comparadas à cisplatina.
A figura 2 ilustra um dos dois compostos derivados de rutênio
utilizados nos estudos de Gallori [12] e colaboradores, o NAMI.
18
Figura 2: Estrutura do complexo NAMI. (Fonte: adaptado de Gallori et al.) [12] ChemSketch™
Alguns compostos derivados de Ru+3 e Ru+2 com amina,[14] N-
heterocíclicos [15, 16] e ligantes alquilsulfoxido [17] também demonstraram
uma potencial atividade antimetastatica. Dentre os compostos com essa
propriedade se destaca o NAMI-A.[18] Alterações na estrutura do composto
NAMI levaram à síntese de um novo composto, NAMI-A, com melhor
estabilidade no estado sólido, conservando a boa solubilidade apresentada
pelo NAMI.[18] Este composto apresenta uma série de peculiaridades, como
excelente atividade seletiva, contra metástases pulmonares de vários
tumores sólidos,[18-20] e baixíssima citotoxicidade, in vitro, em um painel de
60 linhagens celulares de tumores sólidos.[21]
O composto NAMI-A, representado na figura 3, foi primeiro
composto derivado de rutênio a ser testado em seres humanos. As
investigações de fase clínica I foram realizadas em 1999,[22] seguido anos
mais tarde de uma combinação de fases clinicas I/II em pacientes com cancro
de pulmão NSCLC.[23] Apesar da grande quantidade de evidências
experimentais pré-clínicas que demonstram propriedades únicas, o NAMI-A
apresentou resultados decepcionantes nas combinações de fases clinicas
I/II.[18]
19
Figura 3: Estrutura do complexo conhecido como NAMI-A. (Fonte: adaptado de Alessio) [18] ChemSketch™
Mulcahy [24] e colaboradores sintetizaram 560 novos compostos
derivados de rutênio e rastrearam os com melhor citotoxicidade. A partir do
percursor [Ru(bipy)(MeCN)3Cl]Cl, que possui grupos lábeis, os autores
fizeram uma síntese combinatória com um grupo de 57 ligantes, gerando uma
enorme biblioteca de novos compostos. A metodologia utilizada pelos autores
levou à síntese de um complexo muito promissor, o [Ru(tBu2bipy)2(phox)]PF6.
A figura 4 ilustra a estrutura do composto estudado.
Figura 4: Estrutura molecular do [Ru(tBu2bipy)2(phox)PF6. (Fonte: adaptado de Mulcahy et al.) [24] ChemSketch™
Os autores também realizaram uma análise da relação
composição-citotoxicidade. Veja a tabela 1.
20
Tabela 1: Relação composição-citotoxicidade de alguns compostos derivados de rutênio em linhagem de células HeLa
COMPOSTO X-X Y-Y Z-Z IC50 em µM
1 Bipy tBu2bipy phox 4’
2 Bipy non2bipy Br-picolinate 13’
3 Bipy non2bipy Cl-picolinate 13’
4 Bipy Bipy phox >100’
5 tBu2bipy tBu2bipy phox 1.3’ (0.3)”
6 tBu2bipy tBu2bipy 8-HQ 2’
7 tBu2bipy tBu2bipy Picolinate 40’
8 tBu2bipy tBu2bipy tBu2bipy 20’
9 tBu2bipy tBu2bipy Bipy 50’
10 tBu2bipy tBu2bipy dichloride 13’
Onde X-X, Y-Y e Z-Z são ligantes, ’ incubação de 24 horas e ” incubação de 72 horas.
Para avaliar o efeito de determinados ligantes na citotoxicidade
desses compostos, os autores realizaram uma breve investigação alterando
a estrutura do composto 1, tabela 1, e medindo a citotoxicidade resultante. A
substituição do ligante tBu2bipy (composto 1) por bipy (composto 4) resultou
em um composto inativo, com IC50 (concentração mínima para reduzir em 50
% a população de células) acima de 100 µM. Já a substituição da bipy
(composto1) por tBu2bipy (composto 5) resultou em um composto com IC50
de 1,3 µM com incubação de 24 horas e 0,3 µM com incubação de 72
horas.[24]
A substituição do ligante phox por qualquer um dos outros ligantes
reduziu os efeitos citotóxicos (compostos 2, 3, 6, 7, 8 e 9) quando comparados
ao composto 5 da tabela 1. Além disso, a substituição do ligante phox por
íons cloreto também reduziu os efeitos citotóxicos (composto 9) quando
21
comparado ao composto 5.[24] Esta metodologia se mostra viável para o
planejamento e elaboração de novos fármacos.
Outros dois compostos derivados de rutênio têm sido
intensivamente estudados,[13, 25-30] o cloreto de cis-
(dicloro)tetraamimrutenioIII e um intermediário de síntese, o ditionato de cis-
tetraamim(oxalato)rutenioIII. A figura 5 ilustra a estrutura destes dois
compostos na forma iônica.
Figura 5: Estrutura molecular do; cis-(dicloro)tetraamimrutenioIII (a), cis-tetraamim(oxalato)rutenioIII (b). (Fonte: adaptado de Vilanova-Costa et al.) [30]
ChemSketch™
Estudos em camundongos transplantados com células S-180 e
tratados com cis-[RuCl2(NH3)4]Cl demonstraram que o composto é bem
tolerado em doses terapêuticas, apresentando baixíssima toxicidade ao
hospedeiro e prolongando seu tempo de vida.[13] Estudos posteriores
demonstraram que o composto é seletivo, exercendo uma atividade tóxica
significativa em linhagens A-20, SK-Br-3 e S-180, moderada em células
Jurkat e toxicidade muito baixa em células PBMC quando comparado as
linhagens A-20, SK-Br-3 e S-180.[29]
Compostos de coordenação formados com aminoácidos podem
apresentar características físico-químicas importantes para o tratamento de
células tumorais, uma delas, é a boa solubilidade em água, nos valores de
temperatura e pH biológicos.[31] Outra característica muito importante desse
tipo de composto é que, se liberados no organismo, os aminoácidos são
degradados por mecanismos eficientes,[32] diminuindo assim outros efeitos
colaterais.
22
Para chegar ao DNA, os compostos de coordenação precisam
atravessar a membrana celular, que possui maior caráter lipolítico. Acredita-
se que a inserção de aminoácidos, em compostos de coordenação, possa
aumentar seu caráter apolar. Assim, a passagem pela membrana celular
seria facilitada, potencializando a internalização desses compostos.[33]
Alterações na estrutura do composto cis-[RuCl2(dppb)(bipy)] levou
a síntese do [Ru(L-trip)(dppb)(bipy)]PF6.[34] O relato existente é de que essa
alteração melhorou a atividade citotóxica do composto. Enquanto o IC50 do
precursor cis-[RuCl2(dppb)(bipy)] é de aproximadamente 131μM, o do
composto [Ru(L-trip)(dppb)(bipy)]PF6 é de aproximadamente 21,28 μM,
porém a linhagem tumoral não é relatada.[33]
3.2. 2,2’-bipiridinatetraclororutenatoIII de potássio
O 2,2’-bipiridinatetraclororutenatoIII de bipiridínio,
H(bipy)[Ru(bipy)Cl4], foi inicialmente sintetizado por Dwyer [35] e
colaboradores. O interesse dos autores por essa classe de compostos surgiu
devido à possibilidade de esses serem utilizados em uma variedade de
estudos químicos fundamentais, tais como reações de substituições e o efeito
do estado de oxidação, assim como o da natureza do ligante, nos potenciais
redox.
Em seus estudos, os autores constataram que esta substância,
quando suspensa em água, se decompõe formando um certo número de
produtos decorrentes da aquação, hidrólise básica e coordenação da base
do cátion ao metal. Para contornar esse problema, os autores relatam uma
série de passos envolvendo oxidações, com gás cloro ou íons de cério, e
reduções para a troca do contra íon H(bipy)+ por NH4+ ou K+.[35]
As potenciais propriedades catalíticas exibidas por essa classe de
compostos despertaram o interesse de James [36] e McMillan, que ao se
depararem com uma metodologia extremamente complicada desenvolveram
uma rota de síntese relativamente simples para compostos do tipo 2,2’-
bipiridinatetraclororutenatoIII de potássio, K[Ru(bipy)Cl4].
23
Ao obter resultados insatisfatórios, na reprodução dos estudos de
Dwyer [35], Krause [37] também desenvolveu uma metodologia de síntese
mais simples para compostos do tipo [Ru(bipy)Cl4]-. Apesar da simplicidade
dos passos descritos pelo autor, seu procedimento é fortemente dependente
do tempo, levando de 7 até 24 dias para se obter um rendimento satisfatório.
Além disso, o autor não faz menção ao contra íon do material sintetizado
ficando assim, neste trabalho, subtendido que o produto final se trata do
H(bipy)[Ru(bipy)Cl4].
A descomplicada metodologia desenvolvida por James [36] e
McMillan proporcionou, posteriormente, a Durham [38] a obtenção de cristais
ideais para a análise de difração de raio x. Os resultados obtidos por ele
forneceram mais informações sobre a estrutura do material sintetizado,
corroborando com a estrutura esperada. A figura 6 ilustra a estrutura
molecular do K[Ru(bipy)Cl4].
Figura 6: Estrutura molecular do 2,2’-bipiridinatetraclororutenatoIII de potássio, K[Ru(bipy)Cl4]. (Fonte: adaptado de Durham et al.) [38] ChemSketch™
Os estudos desenvolvidos por Fricker,[39] Bridger [40] e
colaboradores mostraram que o K[Ru(bipy)Cl4] pode ser utilizado como um
agente sequestrante do excesso de óxido nítrico no corpo humano, muitas
vezes relacionado a um grande número de doenças e inflamações
decorrentes de traumas cirúrgicos. Esses estudos nos despertaram um certo
interesse para outras possíveis aplicações, tais como o tratamento de
neoplasias malignas.
24
Assim como Dwyer [35] e colaboradores, nosso interesse neste
composto também decorre da possibilidade de estes serem utilizados em
uma variedade de reações de substituições e mudanças no estado de
oxidação. Essas características nos possibilitam desenvolver um grande
número de compostos de rutênio e rastrear o que possui maior eficiência no
tratamento de neoplasias, metodologia semelhante à utilizada por
Mulcahy.[24]
25
4. MATERIAIS E METODOS
Os procedimentos experimentais e análises espectroscópicas
FTIRmed, foram realizados no Laboratório de Estudos de Materiais (LEMat),
localizado na Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Universitário do
Araguaia, sob a supervisão e orientação do Prof. Dr. Wagner Batista dos
Santos.
Análises espectroscópicas UV-VIS foram realizadas, pela
mestranda Ana Carina Sobral, no Grupo de Eletroquímica e Novos Materiais
(GENMAT), localizado na Universidade Federal de Mato Grosso, Campus
Universitário de Cuiabá, sob a supervisão do Prof. Dr. Ailton José Terezo.
Também foram realizadas, análises termogravimétricas TG-DTA,
no Laboratório de Análise Térmica Ivo Giolito (LATIG), localizado na
Universidade Estadual Paulista, Campus Universitário de Araraquara, sob a
supervisão do Prof. Dr. Massao Ionashiro.
Os ensaios biológicos foram realizados com o auxílio da Dra.
Patrícia Gelli Feres de Marchi no Laboratório de Imunologia da Relação
Materno Infantil, localizado na Universidade Federal de Mato Grosso,
Campus Universitário do Araguaia, sob a supervisão da Profa. Dra. Adenilda
Cristina Honório França.
4.1. Síntese do K[Ru(bipy)Cl4]
4.1.1. Materiais
Para a síntese deste composto, utilizou-se reagentes: cloreto de
rutênio hidratado (RuCl3.nH2O) ReagentPlus e 2,2’-bipiridina (C10H8N2) com
pureza ≥ 98%, ambos fornecidos pela empresa SIGMA-ALDRICH BRASIL
LTDA, e cloreto de potássio (KCl) padrão analítico, fornecido pela empresa
LABSYNTH PRODUTOS PARA LABORATORIOS LTDA.
Como solventes foram utilizados álcool metílico (CH3OH) padrão
analítico, fornecido pela empresa LABSYNTH PRODUTOS PARA
LABORATORIOS LTDA, e soluções acidas preparadas a partir de água
destilada e ácido clorídrico (HCl) 36,5-38% padrão analítico, também
26
fornecido pela empresa LABSYNTH PRODUTOS PARA LABORATORIOS
LTDA.
Todos os reagentes e solventes foram utilizados como fornecidos
pelas empresas.
4.1.2. Síntese
Todo o procedimento de síntese foi realizado como o descrito por
James [36], porém com algumas alterações.
Em um balão reacional, de fundo chato, solubilizou-se 0,5014 g de
RuCl3.nH2O em ~ 25 mL de metanol, a solução resultante foi submetida a
agitação por 30 minutos para posterior adição de 0,3047 g de bipy
solubilizada em ~ 25 mL de metanol, (RuCl3.3H2O:bipy ≅ 1:1). Após a adição
bipy o sistema foi submetido a agitação e aquecimento a 100° C com refluxo.
Após 2 horas, adicionou-se ~ 400 mL de metanol e 0,3059 g de
KCl (KCl:RuCl3.3H2O ≅ 2:1), garantindo-se assim o excesso do contra íon K+.
O sistema foi mantido sob as mesmas condições de agitação e temperatura
por mais 20 horas.
Após 20 horas a solução vermelhada foi transferida para um
béquer e colocou-se o novo sistema em banho a 60° C para a redução do
volume a ~ 15 mL. O precipitado castanho foi separado por filtração a vácuo
e posto em dessecador por 24 horas.
Ao termino deste procedimento, obteve-se 0,7918 g do composto
K[Ru(bipy)Cl4], massa correspondente a um rendimento de 94,24 %.
4.1.3. Recristalização
O processo de recristalização foi baseado no método descrito por
James [36], porém com algumas modificações.
Em um béquer de 1000 mL, solubilizou-se 0,7918 g de
K[Ru(bipy)Cl4] e uma ponta de espátula de KCl em ~ 1000 mL de uma solução
HCl 36,5-38% / água ≅ 1:1. O sistema então permaneceu sob agitação e
banho a 100°C por 30 minutos.
27
Após 30 minutos, filtrou-se o sistema, a quente, por gravidade e
colocou-se o sobrenadante de coloração laranjada em banho a 100°C para a
redução de seu volume a ~ 30 mL. O arrefecimento lento da solução gerou
cristais, vermelhados, em forma de agulhas.
4.2. Síntese do [Ru(bipy)(L-trip)Cl2]
4.2.1. Materiais
Para a síntese deste composto, utilizou-se reagentes como:
bicarbonato de sódio (NaHCO3) com pureza ≥ 99%, fornecido pela empresa
SIGMA-ALDRICH BRASIL LTDA, L-trip (C11H12N2O2) padrão analítico,
fornecido pela empresa LABSYNTH PRODUTOS PARA LABORATORIOS
LTDA, e o composto K[Ru(bipy)Cl4] sintetizado como descrito no item 4.1.
Como solventes, foram utilizados álcool etílico (CH3CH2OH) 95%,
éter etílico [(C2H5)2O] e DMSO. Todos de padrão analítico, fornecidos pela
empresa LABSYNTH PRODUTOS PARA LABORATORIOS LTDA. Além
desses solventes também foi utilizado água destilada.
Todos os reagentes e solventes foram utilizados como fornecidos
pelas empresas.
4.2.2. Síntese
Em um béquer de 25 mL, adicionou-se 0,0478g de L-trip, 0,0195g
de NaHCO3 e ~ 5 mL de água destilada. Submeteu-se o sistema a agitação
por 30 minutos para posterior adição de 0,1012 g de K[Ru(bipy)Cl4].
Após 1 hora, o sistema foi filtrado a vácuo. O precipitado foi seco
com éter e posto em dessecador com sílica por 24 horas. Ao termino deste
procedimento, obteve-se 0,0680 g, massa correspondente a um rendimento
de 55,42%. O mesmo procedimento foi repetido duas vezes, sendo que em
um deles o sistema foi aquecido a 60 °C e no outro o tempo de síntese foi
prolongado por mais 3 horas.
28
4.2.3. Testes qualitativos de solubilidade
Em três tubos de ensaio, adicionou-se uma pequena quantidade
do composto sintetizado. Em cada tubo de ensaio foi adicionado um dos
seguintes solventes: água, álcool etílico e DMSO.
Cada tubo foi agitado para posterior adição de AgNO3.
4.3. Caracterização
Os compostos sintetizados foram caracterizados por
espectroscopia UV-VIS e FTIRmed, e análises térmicas TG-DTA.
As medidas na região do FTIRmed foram obtidas em um
espectrofotômetro com transformada de Fourier da Perkin Elmer, modelo
Perkin Elmer Spectometer 100. Resolução de 4 cm-1, na região compreendida
entre 4000-600 cm-1, utilizando-se acessório para a técnica de ATR com
cristal de germânio. Para a aquisição dos dados, pulverizou-se previamente
os materiais sintetizados e utilizou-se quantidades necessárias para
completar o porta amostra de sólidos para que em seguida os mesmos
fossem prensados no suporte de ATR.
As medidas nas regiões UV-VIS foram obtidas em um
espectrofotômetro da Varian, modelo Cary 50 Scan. Para a realização dessas
análises, utilizou-se uma cela de quartzo, com caminho óptico de 1 cm, e faixa
de varredura nos comprimentos de onda de 200-800 nm. Para a aquisição
dos dados utilizou-se 2 mL das soluções em concentrações não
determinadas.
As análises térmicas TG-DTA do composto sintetizado foram
realizadas em um termoanalisador da TA Instrumentos, modelo SDT 2960,
constituído de um comparador de massa horizontal com capacidade máxima
de 20,00 mg e sensibilidade de 1 µg. As análises foram realizadas no intervalo
de temperatura de 30 a 1000 °C, com razão de aquecimento de 10 °C.min-1
e atmosfera de ar seco com vazão de 100 mL. min-1. A massa de amostra
utilizada foi da ordem de 7 mg em cadinho de α-alumina.
29
4.4. Avaliação citotóxica dos compostos de rutênio
4.4.1. Preparo da solução
4.4.1.1. Materiais
Para o preparo da solução, utilizou-se o composto K[Ru(bipy)Cl4],
sintetizado como descrito no item 4.1.2.2., e água destilada.
4.4.1.2. Metodologia
Para a avaliação citotóxica do composto K[Ru(bipy)Cl4] foi
determinada uma concentração aleatória abaixo de 100 µM.
Para o preparo da solução utilizada nos ensaios biológicos
adicionou-se, em um béquer de 50 mL, 0,0029 g de K[Ru(bipy)Cl4] e ~ 30 mL
de água destilada. O sistema foi submetido a agitação e aquecimento de 60°
C por 30 minutos. Após o arrefecimento da solução, amarela, transferiu-se a
mesma para um balão volumétrico de 100 mL e completou-se o volume,
resultando assim em uma solução de K[Ru(bipy)Cl4] a 66 µM.
4.4.2. Ensaio biológico
4.4.2.1. Materiais e preparação das linhagens celulares utilizadas
Para a avaliação da citotoxicidade dos compostos de rutênio,
investigados neste trabalho, frente a células tumorais, utilizou-se linhagens
celulares ATCC (American Type Culture Collection, USA) do tipo
adenocarcinoma de mama (MCF-7). A linhagem foi cultivada e congelada em
nitrogênio líquido para estocagem e posterior utilização.
Para a realização dos ensaios biológicos as células tumorais, foram
cultivadas em meio RPMI, acrescido de HEPES, penicilina, estreptomicina,
bicarbonato de sódio, piruvato de sódio e soro fetal bovino, todos fornecidos
pela empresa SIGMA-ALDRICH BRASIL LTDA.
As células foram cultivadas em frascos de cultura de células e
mantidas em estufa a 37 °C a 5% de CO2 até a formação de monocamada
celular. Posteriormente, os frascos de cultura foram lavados com 5 mL RPMI
e submetidos à 1 mL de tripsina-EDTA, também fornecido pela empresa
30
SIGMA-ALDRICH BRASIL LTDA, até as células se desprenderem do fundo
do mesmo. Para a neutralização da tripsina, as células foram
homogeneizadas com um volume, não definido, do meio de cultura acrescido
de 10% de soro fetal. A suspenção contendo as células MCF-7 foi então
ajustada para 2 x 104 células/mL.
Como células saudáveis, utilizou-se a linhagem PBMC. Para a
obtenção dessas células, coletou-se amostras de sangue em tubos contendo
o anticoagulante EDTA. As populações celulares foram separadas por
gradiente de densidade com Ficoll-Paque, fornecido pela PHARMACIA
UPPSALA-SUÉCIA.
Em um tubo falcon, adicionou-se 3 mL de ficoll-paque seguido da
adição lenta de ~ 5 mL de sangue, formando assim duas fazes. O sistema foi
centrifugado a 1500 rpm por 40 minutos em temperatura ambiente. Após este
período, retirou-se o anel de células mononucleares e o transferiu para um
novo tubo.
Ao tubo contendo o anel de células mononucleares, adicionou-se 3
mL de PBS, fornecido pela empresa SIGMA-ALDRICH BRASIL LTDA, e
agitou-se para a homogeneização do sistema. Após a agitação centrifugou-
se o sistema por 10 minutos a 15000 rpm em temperatura ambiente, o
sobrenadante foi então descartado e repetiu-se essa etapa mais uma vez.
Após a segunda lavagem o sobrenadante foi desprezado e acrescentou-se
1mL de PBS. As células foram contadas em câmera de Neubauer e a
suspenção celular ajustada para 2x106 células/mL.
Para a análise de citometria de fluxo, utilizou-se o marcador Annexin
V-FITC Apoptosis Detection Kit fornecido pela empresa SIGMA-ALDRICH
BRASIL LTDA.
4.4.2.2. Metodologia
Os procedimentos experimentais descritos a seguir são baseados
nas instruções fornecidas com o marcador Annexin V-FITC Apoptosis
Detection Kit.
31
Em uma placa de cultura celular, incubou-se a 37° C e 5% de CO2,
por 24 horas, linhagens de células saudáveis PBMC e de adenocarcinoma
mamário MCF-7, na presença ou não do estimulo.
Para obter-se uma variedade de resultados e adequado
tratamento estatístico, foram feitas 5 variações de cultivo celular com 6
repetições cada, sendo que: em 6 poços adicionou-se 1x106 células
saudáveis PBMC; em outros 6 poços adicionou-se 1x104 células tumorais
MCF-7; em outros 6 poços adicionou-se 1x106 células saudáveis PBMC e 50
µL da solução contendo o composto K[Ru(bipy)Cl4]; em outros 6 poços
adicionou-se 1x104 células tumorais MCF-7 e 50 µL da solução contendo o
estimulo; e, por fim, em outros 6 poços adicionou-se 5x105 células saudáveis,
5x103 células tumorais MCF-7 e 50 µL da solução contendo o estimulo.
Após 24 horas, retirou-se a placa de cultura celular da incubação.
Removeu-se o sobrenadante de cada um dos poços e colocou-se os mesmos
em tubos falcon com a devida identificação. Tratou-se cada poço com 1 mL
de tripsina e, após 5 minutos, transferiu-se o líquido com partículas em
suspensão para seus respectivos tubos. Retirou-se o excesso de células
presente no fundo dos poços, lavando-os com 1 mL de RPMI e transferindo-
se o conteúdo para seus respectivos tubos.
Centrifugou-se e lavou-se cada tubo falcon com 1 mL de PBS,
repetiu-se este procedimento 2 vezes. Em seguida, ressuspendeu-se cada
pellet com 500 µL de Binding Buffer previamente diluído, como indicado pela
empresa fornecedora. Adicionou-se então 5 µL de Annexin V-FITC conjugado
e 10 µL de iodeto de propídeo em cada amostra. Após 10 minutos de
incubação, à temperatura ambiente, as amostras estavam prontas para
serem analisadas no citômetro.
4.4.3. Análise de fluorescência por citometria de fluxo
Para a análise de citometria de fluxo utilizou-se o equipamento BD
FACSCalibur ™, San Jose – EUA. Para a aquisição, armazenamento e
análise imediata ou posterior dos dados gerados utilizou-se o software BD
FACSCalibur ™, fornecido junto com o equipamento.
32
Para a realização das análises o citômetro foi ajustado para a
leitura de 10.000 eventos nos parâmetros: FSC para determinar o tamanho
da partícula, SSC para determinar a granulosidade ou complexidade interna
da mesma, FL1 e FL2 para diferenciar células em necrose, apoptose tardia
ou inicial.
4.4.4. Análise estatística
Para o devido tratamento estatístico, realizou-se o teste de Análise
de Variância (ANOVA), seguido do teste de comparações múltiplas, teste de
Tukey. As diferenças entre os tratamentos foram consideradas significativas
quando o valor de p foi menor que 0.05 (p<0.05). O tratamento estatístico foi
realizado no software AgroEstat.
33
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Síntese e solubilidade do [Ru(bipy)(L-trip)Cl2]
Assim como Puthraya [41] e colaboradores, preferiu-se
desprotonar o ligante L-trip com o uso de NaHCO3, evitando o uso de
hidróxidos. A adição de NaHCO3 e L-trip em água resultou em uma solução
de pH 8,3. Estudos realizados por Carvalho [42] demostraram que em
solução de pH 8 a maior parte das moléculas de L-trip estão na forma
zwitterion, porém a espécie desprotonada também se faz presente.
A adição do complexo k[Ru(bipy)Cl4] na solução contento o L-trip
forma quase que imediatamente uma solução de coloração vinho, que se
intensifica ao longo do tempo, atingindo a intensidade máxima com 1 hora de
síntese.
Após 1 hora de síntese a coloração vinho começa a ficar mais fraca
tornando-se marrom. É provável que o composto sintetizado sofra uma
mudança de isomeria, se rearranjando em uma estrutura mais estável. O
procedimento se mostrou reprodutível, porém as análises realizadas neste
trabalho não viabilizaram estudos referentes a determinação da estrutura e
mudança de isomeria.
O procedimento utilizando temperatura acarretou na liberação de
um odor semelhante ao que é gerado na queima do L-trip, acredita-se que
esse odor possa estar relacionado com a instabilidade térmica do novo
composto sintetizado, inviabilizando assim um posterior processo de
purificação do material.
Testes qualitativos de solubilidade demonstraram que o novo
composto é muito pouco solúvel em água e possui baixa solubilidade em
álcool etílico. O teste de solubilidade em DMSO seguido do teste qualitativo
com AgNO3 demonstrou que o solvente DMSO labiliza ligantes cloros.
34
5.2. Caracterização
5.2.1. Curvas TG-DTA
As curvas TG-DTA apresentadas na figura 7, mostram a
decomposição térmica do composto [Ru(bipy)(L-trip)Cl2].1/2H2O até 900 °C e
formação do resíduo RuO2 com um erro de 2,57% (TG = 27,20%; Calcd =
24,63%). Estudos realizados por Santos [43] demonstraram a formação do
mesmo tipo de resíduo, comprovados por difração de raio x, para compostos
derivados de rutênio e com erros na faixa de 3%.
Figura 7: Curvas TG-DTA do composto [Ru(bipy)(L-trip)Cl2].1/2H2O
A tabela 2 evidencia a decomposição térmica do composto
[Ru(bipy)(L-trip)Cl2].1/2H2O em cinco etapas acompanhadas por um único
evento exotérmico.
35
Tabela 2: Etapas de decomposição térmica para o [Ru(bipy)(L-trip)Cl2].1/2H2O
Etapas
T °C 35-115 115-315 315-395 395-548 548-900
Δm % 3,53 6,23 46,96 9,01 7,07
Evento --- --- 378°C/exo --- ---
Nota-se que o composto não possui estabilidade térmica. Uma
pequena perda de massa é observada até 115 °C, que é atribuída a água de
hidratação, uma vez que testes qualitativos com o nitrato de prata mostraram
ausência de íons cloretos, indicando assim que átomos de cloros estão
diretamente ligados ao centro metálico. A presença de cloros na esfera de
coordenação indica que todos os sítios disponíveis para ligações já estão
ocupados, inviabilizando uma interação entre a água e o centro metálico.
Acredita-se que além da perda de água até 115 °C também esteja
ocorrendo o início da decomposição térmica do composto, visto que
tentativas para desenvolver uma rota de síntese, para esse composto, com
aquecimento a 60 °C gerou um odor semelhante ao que é gerado na queima
do L-trip. A partir de 115 °C é possível observar uma acentuada perda de
massa acompanhada de um pico exotérmico, indicando a decomposição
oxidativa dos ligantes.
Além do que já foi discutido, nota-se na região entre 500 e 700°C
um pequeno ganho de massa. Esse pequeno ganho de massa é atribuído a
oxidação do metal de Ru+3 para Ru+4, justificando assim a formação do
resíduo proposto. O estranho é que essa etapa não é acompanhada por um
evento exotérmico bem definido, como é o esperado, e o que se observa são
duas pequenas ondulações na linha DTA entre a região de 450 e 550 °C. A
36
ausência de picos exotérmicos bem definidos pode estar relacionado a forma
branda e lenta com que o evento aconteceu.
Estudos realizados Guo-Nan [44] e colaboradores, envolvendo o
composto [Ru(bipy)2(L-trip)]ClO4.3H2O, demostraram uma estabilidade
térmica maior. Como é relatado pelos autores, tal composto demonstrou
estabilidade até 220 °C com saída de água até 230 °C, seguida de acentuada
perda de massa até 238 °C, atribuída a saída do ligante L-trip. Essa maior
estabilidade térmica pode estar relacionada ao número de bipy coordenadas
ao metal, que claramente proporcionam um maior número de interações
intermoleculares. Nenhuma menção é feita as etapas de perda de massa
envolvendo os ligantes bipy e ao íon ClO4-1 assim como ao resíduo formado.
A caracterização térmica e testes qualitativos com a observação
de saída de água, em tubo de ensaio, ausência de precipitado em testes com
AgNO3, e possível formação do resíduo RuO2, sugerem a estequiometria
[Ru(bipy)(L-trip)Cl2].1/2H2O.
Devido as etapas de decomposição térmica terem ocorridas de
forma consecutivas, sem a formação de patamar e sem a identificação dos
gases liberados durante a análise, não foi possível sugerir um mecanismo de
decomposição térmica para o composto.
5.2.2. Espectroscopia eletrônica UV-VIS
Para um melhor entendimento, da discussão a seguir, veja a tabela
3:
37
Tabela 3: Tipo de transições observadas para os compostos estudados
COMPOSTO Anel π π* X t2g LMCT MLCT
K[Ru(bipy)Cl4] [36] 254 nm --- 364 nm
405 nm --- ---
K[Ru(bipy)Cl4] [45] --- 296 nm 354 nm
406 nm --- ---
K[Ru(bipy)Cl4] ** 253 nm 300 nm 364 nm
405 nm --- ---
[Ru(bipy)(L-trip)Cl2] ** 242 nm 292 nm
354 nm 433 nm ---
496 nm
601 nm
[Ru(bipy)2(L-trip)]ClO4
[44] 245 nm
295 nm
350 nm --- --- 495 nm
L-trip zwitterion ** --- 279 nm --- --- --- X = Ligante cloro. ** Valores observados neste trabalho.
A figura 8 ilustra o espectro UV-VIS qualitativo do composto
K[Ru(bipy)Cl4].
Figura 8: Espectro UV-VIS qualitativo do composto K[Ru(bipy)Cl4] em solução ácida
HCl/água 1:1
A análise UV-VIS do composto K[Ru(bipy)Cl4] reproduzido neste
trabalho é coincidente com a descrita por James e McMillian,[36] onde há a
presença de bandas de absorção em 405 e 364 nm. Os autores também
38
fazem menção a uma banda de absorção em 254 nm, porém no espectro
acima essa absorção não é bem pronunciada e o que se observa é um
pequeno perfil de sobreposição de bandas em torno de 253nm. Acredita-se
que essa absorção pode estar relacionada a transições do anel aromático.
Um outro fato que chama a atenção é que os autores não fazem
menção a forte banda de absorção em 300 nm, observada no espectro acima.
A presença dessa forte banda pode ser corroborada com o trabalho
desenvolvido por Bryant e Fergusson,[45] que apresenta uma absorção em
296 nm atribuída a uma transição eletrônica do tipo π π*. Além dessa
absorção também são apresentadas absorções em 406 e 354 nm. Tais
absorções são atribuídas a transições do tipo X t2g, onde X é um ligante
cloro.
O espectro de absorção do material sintetizado, [Ru(bipy)(L-
trip)Cl2], possui características similares ao do seu precursor, K[Ru(bipy)Cl4],
porém com algumas alterações. A figura 9 ilustra o espectro de absorção UV-
VIS do novo material sintetizado.
Figura 9: Espectro UV-VIS qualitativo do composto [Ru(bipy)(L-trip)Cl2] em álcool etílico
39
Na figura 9 é possível observar uma intensa banda de absorção
em 292 nm que sugere uma transição do tipo π π*. Nota-se que um
deslocamento hipsocrômico, saindo de 300 para 292 nm, ocorre quando
comparada ao espectro do composto de partida. Veja a figura 10.
A presença de uma absorção similar em 295 nm, a qual é atribuída
a transições do tipo π π*, também pode ser observada no espectro UV-
VIS para o composto [Ru(bipy)2(L-trip)]ClO4.[44]
Figura 10: Sobreposição dos espectros UV-VIS. L-triptofano em água destilada,
K[Ru(bipy)Cl4] em solução ácida HCl/água 1:1 e [Ru(bipy)(L-trip)Cl2] em álcool etílico
Além da banda de absorção em 292 nm é possível observar
absorções em 354, 433, 496 e 601 nm. A figura 11 ilustra melhor essas
bandas de absorções.
40
Figura 11: Espectro UV-VIS qualitativo do composto [Ru(bipy)(L-trip)Cl2] em álcool etílico
Os deslocamentos e absorções, observados para o composto
[Ru(bipy)(L-trip)Cl2, indicam que a substituição de dois ligantes cloros por
uma molécula de L-trip ocasionou um pequeno aumento da energia 10Dq. As
absorções, em baixas energias, referentes a transições de carga do tipo
MLCT sugerem que, apesar do aumento 10Dq, o campo octaedro é fraco e
de spin alto.
As absorções referentes a transições de cargas MLCT são
observadas em 496 e 601 nm, figura 11. A banda de absorção em 496 nm é
condizente com a observada para o [Ru(bipy)2(L-trip)]ClO4, que aparece em
495 nm. Já a absorção em 601 nm, que não é observada no composto
[Ru(bipy)2(L-trip)]ClO4, pode ter surgido devido a uma possível assimetria
entre as moléculas nitrogenadas e os átomos de cloros. [44]
Apesar da substituição de dois ligantes cloros por L-trip a presença
de outros dois átomos de cloros, na esfera de coordenação, ainda é
observada. Essa informação pode ser corroborada pela presença da banda
de absorção presente em 433 nm. O espectro relatado para o composto
41
[Ru(bipy)2(L-trip)]ClO4 possui uma ausência de absorção nessa região,[44]
porém no espectro do composto k[Ru(bipy)Cl4] é possível observar transições
do tipo X t2g, onde X é um íon cloreto, em 364 e 405 nm.[45]
Com o aumento da energia 10Dq ocorreu um deslocamento
batocrômico, referente a absorção em 405 nm, indo de 405 nm para 433 nm.
O aumento da energia 10Dq ocasiona uma aproximação entre orbitais t2g e
orbitais π, facilitando de certa forma as transições X t2g, justificando a
mudança deste tipo de transição para menores energias.
Além do que já foi discutido, nota-se, no espectro do novo
composto sintetizado, uma absorção em 354 nm. Essa absorção é condizente
com a relatada na literatura, 350 nm, para o composto [Ru(bipy)2(L-trip)]ClO4,
e é atribuída a absorções referentes a transições internas do ligante L-
trip.[44]
5.2.3. Espectroscopia FTIRmed
A figura 12 ilustra os espectros FTIRmed dos compostos estudados.
Nela, é possível observar uma diferença significativa entre o espectro do
[Ru(bipy)(L-trip)Cl2], seu precursor K[Ru(bipy)Cl4] e o ligante L-trip livre. As
alterações mais relevantes ocorrem nas regiões referentes ao íon carboxilato
e a amina alifática.
42
Figura 12: Espectro FTIRmed dos compostos estudados
A presença de bandas características como os ν(NH3+) e as
δ(NH3+), assim como a posição das vibrações de estiramento do íon
carboxilato no ligante L-trip livre, podem indicar se o mesmo se encontra na
forma zwitterion.[42, 46, 47] No espectro acima essas bandas são
observadas em 3078 cm-1 para νas(NH3+), 2073 cm-1 para oscilações na
torção do grupo (NH3+), 1659 cm-1 para δ(NH3
+), 1582 cm-1 para νas(COO-)
e 1410 cm-1 para νs(COO-), confirmando assim a forma de zwitterion para o
ligante livre.
O espectro do novo composto sintetizado nos mostra que o íon
metálico rutênio foi seletivo ao se coordenar com a espécie desprotonada do
L-trip, isso nos explica o baixo rendimento da síntese, visto que para uma
43
solução de pH 8 a maior parte das moléculas de L-trip estão na forma
zwitterion, como é relatado por Carvalho [42]. A seletividade do metal pela
espécie desprotonada é vista pelo desaparecimento, após a coordenação, da
banda presente em 2073 cm-1 e pelo deslocamento da banda de 1659 cm-1
para menores energias.
O desaparecimento da banda em 2073 cm-1, referente a oscilações
na torção do grupo (NH3+), indica que a molécula de L-trip não se encontra
mais na forma zwitterion e a coordenação com o íon metálico pode ocorrer
pelo N do grupo (NH2).[42] Já a banda em 1659 cm-1, referente a δ(NH3+), ao
que tudo indica, se deslocou para menores energias e foi sobreposta pelo
deslocamento do νas(COO-) que saiu de 1582 para 1602 cm-1. Esse
deslocamento para menores energias é mais um indicativo de que a espécie
desprotonada de L-trip se coordenou ao metal. Para o composto [Cu(L-trip)2],
uma banda referente ao grupo δ(NH2) é observado em 1626 cm-1.[47]
A formação da ligação Ru-N pode ser corroborada pela ausência
da banda em 1097 cm-1, presente no espectro do ligante livre, referente ao
v(CN) alifático. A ausência dessa banda indica que um deslocamento da
mesma ocorreu, se sobrepondo com outras bandas inicialmente observadas,
no composto de partida, na região de 1108 cm-1. Para o composto [Cu(L-
trip)2] é observado um deslocamento de 1097 cm-1 para 1107 cm-1, indicando
a ligação Ru-N da amina alifática.[47]
Outros indícios da formação da ligação Ru-N poderiam ser obtidos
analisando bandas referentes ao vas(NH2) e vs(NH2). Porém, essa análise se
torna inviável, visto que uma larga banda, característica da presença de água,
é observada na região de 3373 a 3231 cm-1. Os dados obtidos com o FTIRmed
corroboram com os obtidos na análise TG-DTA, confirmando assim a
presença de água no composto. Para compostos de Mn+2, Ni+2, Cu+2 e Zn+2,
com L-trip, essas bandas estão presentes entre 3344 e 3270 cm-1.[48]
Nota-se que a presença de água, no composto, encobre a banda
referente ao v(NH)indol que pode ser observada em 3401 cm-1 no ligante livre.
A diminuição de intensidade seguida da sobreposição indica que o indol
44
participa de interações intramoleculares. Apesar da presença de água ainda
é possível observar os v(CH) em 3073 cm-1.
Segundo a literatura o íon carboxilato é muito versátil e pode se
coordenar de várias maneiras.[49] Para a coordenação monodentada, são
previstos dois comportamentos envolvendo o νas(COO-) em 1582 cm-1 e o
νs(COO-) em 1410 cm-1. Devido à geração de uma ligação M-O, onde M é um
metal de transição, a simetria existente no íon carboxilato é quebrada e o que
se espera é o deslocamento, para maiores energias, do νas(COO-) em 1582
cm-1 e um deslocamento, para menores energias, do νs(COO-) em 1410 cm-
1.[47, 49] Esses deslocamentos aumentam a distância entre as frequências
referentes aos ν(COO-) se comparados ao ligante livre na forma de sal de
sódio ou de potássio.[49]
No espectro do novo composto é possível observar um
deslocamento da banda referente ao νas(COO-) em 1582 cm-1 para 1602 cm-
1. Esse deslocamento, para maiores energias, corrobora com o esperado
para o νas(COO-). Porém, ao que tudo indica, o νs(COO-) em 1410 cm-1 obteve
um pequeno deslocamento para a região de 1419 cm-1, se sobrepondo com
a banda em 1421 cm-1, inicialmente observada no composto de partida,
divergindo do esperado. [47, 49]
Apesar do comportamento inesperado do νs(COO-) em 1410 cm-1,
é pouco provável que o íon carboxilato tenha se ligado ao metal de forma
quelante ou em ponte.[49] Além do indicativo da formação da ligação Ru-N,
obtido na análise de FTIRmed, testes qualitativos em tubo de ensaio com
nitrato de prata e ausência de precipitado, juntamente com os dados obtidos
na análise UV-VIS, confirmam a presença de dois átomos de cloro na esfera
de coordenação. A presença desses dois átomos de cloros na esfera de
coordenação inviabiliza qualquer outro tipo de ligação do íon carboxilato que
não seja a forma monodentada.
Mesmo que o νs(COO-) não tenha se deslocado para menores
energias, é possível observar um aumento na distância entre as frequências
referentes aos ν(COO-) se comparado ao ligante livre na forma de sal.
Carvalho [42] relata uma distância de 157 cm-1 para o ligante livre na forma
45
de sal de sódio. Para o novo composto, sintetizado neste trabalho, a distância
entre as frequências referentes aos ν(COO-) é de 183 cm-1. Esse resultado
coincide com o esperado para uma coordenação monodentada do íon
carboxilato.[49]
Além do que já foi discutido, é possível, no espectro do novo
composto, observar bandas que originalmente não estavam presentes no
espectro do composto precursor. Essas bandas são referentes ao v(CN) do
indol em 1342 cm-1 e ao p(CH2) em 878 e 801 cm-1. No ligante livre são
observadas, respectivamente, em 1355, 858, 849 e 803 cm-1. É possível notar
pequenos deslocamentos que podem estar relacionados com interações
intramoleculares. Esse tipo de interação é observado para o composto
[Ru(bipy)2(L-trip)]ClO4.[44]
Aminoácidos podem coordenar com metais de transição de duas
maneiras, monodentados ou bidentados, sendo a forma bidentada a mais
frequente.[34, 50] A análise dos espectros acima nós dá fortes indícios da
formação da ligação Ru-O e Ru-N, com o nitrogênio da amina linfática.
A análise FTIRmed nos leva a crer que a molécula de L-trip
coordenou de forma bidentada ao centro metálico. Esse tipo de coordenação
se encaixa bem com a descrita para compostos de L-trip com rutênio,[34, 44]
cobre [47, 51], platina [52, 53], paládio [53], dentre outros.
5.3. Avaliação citotóxica dos compostos de rutênio
A figura 13 apresenta um gráfico com alguns dos resultados
obtidos na avaliação citotóxica do composto K[Ru(bipy)Cl4], em células
saudáveis PBMC e tumorais MCF-7. Nela é possível observar a comparação
das médias, referentes a morte celular por apoptose, de cada uma das cinco
variações.
46
*Para letras iguais não existe diferença significativa entre as médias observadas.
Figura 13: Gráfico das médias, de morte celular por apoptose, pelo teste de Tukey
A análise de variância (ANOVA) seguida do teste de comparações
múltiplas (Tukey) mostra que, com 95 % de confiança, é possível afirmar que
não existe diferença significativa entre as médias de morte por apoptose das
variações células normais com estímulo e células tumorais com estímulo.
Em outras palavras, o que se percebe é que o composto
K[Ru(bipy)Cl4] induz, em mesmas proporções, a morte celular por apoptose,
tanto em células saudáveis PBMC quanto em células tumorais MCF-7. Logo,
esse composto derivado de rutênio não demonstrou seletividade para células
tumorais como era o esperado,[10, 11] podendo ser considerado como tóxico
para um comparativo entre as linhagens celulares analisadas.
Vale ressaltar que os resultados são para células PBMC e MCF-7,
possa ser que um comparativo da toxicidade, do composto estudado, entre
células PBMC e outras linhagens tumorais apresente uma diferença
significativa na indução de apoptose, mostrando seletividade para linhagens
tumorais específicas, e apresentando citotoxicidade para células saudáveis.
Esse é o caso do composto cloreto de cis-(dicloro)tetraamimrutenioIII que
apresenta uma toxicidade relevante para linhagens A-20, SK-Br-3 e S-180,
-10
40
C C B B A
COMPARATIVO DAS MÉDIAS, DE MORTE CELULAR POR APOPTOSE, PELO TESTE DE TUKEY COM
DMS(5%) = 10,44
Células tumorais. Células normais.
Células tumorais com estímulo. Células normais com estímulo.
Células tumorais e normais, com estímulo.
47
moderada em células Jurkat e toxicidade muito baixa em células PBMC
quando comparado as linhagens A-20, SK-Br-3 e S-180.[29]
Na tentativa de simular um sistema biológico, onde há a interação
de células saudáveis e células tumorais, foi realizado um cocultivo com
células MCF-7 e PBMC, na presença do composto analisado. Os dados
obtidos mostram que a média de apoptose no cocultivo praticamente dobrou,
porém não nos permitem fazer qualquer inferência ao que de fato aconteceu,
apenas que a porcentagem de morte por apoptose aumentou.
Apesar do composto não ter apresentado seletividade para as
linhagens de células estudadas, nota-se que o mesmo induz de forma
específica a morte celular por apoptose, uma vez que a taxa de morte celular
por necrose é baixíssima e não apresenta diferença significativa entre as
variáveis. Veja a figura 14.
*Para letras iguais não existe diferença significativa entre as médias observadas.
Figura 134: Gráfico das médias, de morte celular por necrose, pelo teste de Tukey
Apesar do material analisado não ter sido seletivo, para as
linhagens analisadas, os resultados obtidos com o cocultivo, a baixíssima
taxa de morte celular por necrose e a considerável atividade apoptótica nos
incentiva a continuar investigando o composto K[Ru(bipy)Cl4].
-5
0
5
10
15
A A A A A
COMPARATIVO DAS MÉDIAS, DE MORTE CELULAR POR NECROSE, PELO TESTE DE TUKEY COM
DMS(5%) = 6,07
Células tumorais. Células normais.
Células tumorais com estímulo. Células normais com estímulo.
Células tumorais e normais, com estímulo.
48
Problemas como insolubilidade em água, instabilidade isomérica e
labilização de ligantes, presentes na esfera de coordenação, frente a
solventes como DMSO, tornaram inviáveis a avaliação citotóxica do
composto [Ru(bipy)(L-trip)Cl2].
Para um melhor detalhamento do tratamento estátisco utilizado
veja os arquivos gerados pelo software AgroEstat no tópico 8.1 Arquivos
gerados pelo programa AgroEstat.
49
6. CONCLUSÃO
A partir do precursor K[Ru(bipy)Cl4] foi gerada, no presente
trabalho, uma rota de síntese simples e reprodutível para um novo composto
de coordenação de Ru+3 com bipy e L-trip. Devido à instabilidade térmica, do
novo composto, não foi possível desenvolver um processo de purificação
para o mesmo.
A caracterização espectroscópica nos dá fortes indícios da
interação Ru-(L-trip). O deslocamento da banda referente ao íon carboxilato
para energias mais altas, no FTIRmed, e a ausência de bandas referentes a
amina alifática, indicam uma coordenação bidentada do ligante L-trip. A
presença de cloros na esfera de coordenação é comprovada pela banda de
absorção em 433 nm, no espectro UV-VIS, referente a uma transição Cl
t2g. Além disso, as bandas de transições em 496 e 601 nm, referentes a
transições do tipo MLCT que não são observadas no precursor
K[Ru(bipy)Cl4], indicam a presença do ligante L-trip na esfera de
coordenação.
Com os estudos em técnicas termoanalíticas é possível sugerir a
formula mínima do composto, [Ru(bipy)(L-trip)Cl2].1/2H2O. O novo composto
se mostrou instável termicamente, testes qualitativos em tubo de ensaio e
sínteses com aquecimento confirmam a instabilidade térmica, abaixo de 100
°C, com a liberação de um odor semelhante ao que é gerado na queima do
L-trip.
A avaliação do potencial antitumoral do precursor K[Ru(bipy)Cl4]
demonstrou que o mesmo possui efeitos tóxicos, consideráveis, em linhagem
de células MCF-7, porém não demonstrou seletividade e atinge em mesmas
proporções células PBMC. Devido os problemas de solubilidade encontrados,
a análise do potencial antitumoral do composto [Ru(bipy)(L-trip)Cl2] se tornou
inviável.
50
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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anticancer [platinum (II)(2, 2'-bipyridine)(amino acid)] n+ (n= 1 or 2) complexes. Journal of inorganic biochemistry, v. 23, n. 1, p. 1-11, 1984. ISSN 0162-0134.
53. MITAL, R. et al. Synthesis, Characterization, DNA Binding, and Cytotoxic
Studies of Some Mixed-Ligand Palladium(II) and Platinum(II) Complexes of α-Diimine and Amino Acids. Journal of Inorganrc Blochemrstry, v. 41, p. 93-103, 1991.
56
8. ANEXOS
8.1 Arquivos gerados pelo programa AgroEstat
AgroEstat - Sistema para Análises Estatísticas de Ensaios Agronômicos
------------------------------------------------------------------------
--------
Prof. Dr. José Carlos Barbosa
Professor Titular do Departamento de Ciências Exatas
FCAV - UNESP - Campus de Jaboticabal
Walter Maldonado Junior
Engenheiro Agrônomo - Pós-graduando em Produção Vegetal (CAPES)
FCAV - UNESP - Campus de Jaboticabal
========================================================================
========
Delineamento Inteiramente Casualizado
Fabrício
Variável: Viáveis
Nomes dos Tratamentos/Fatores:
=======================
Tratamentos
=======================
1 - Célula normal
2 - Célula tumoral
3 - Normal com estímulo
4 - Tumoral com estímulo
5 - Normal, tumoral - estímulo
=======================
Dados Obtidos no Experimento:
========================================================================
========
Tratamentos 1ª Rep. 2ª Rep. 3ª Rep. 4ª Rep. 5ª
Rep.
------------------------------------------------------------------------
--------
Célula normal 96,5000000 94,2000000 91,4000000 88,1500000
87,7000000
Célula tumoral 95,8200000 97,3000000 98,0900000 96,4800000
94,8700000
Normal com estímul 56,2600000 65,2300000 69,9900000 67,9800000
68,8100000
Tumoral com estímu 80,2700000 77,9300000 68,3300000 81,2800000
75,0000000
Normal, tumoral - 51,5800000 41,2200000 29,2700000 35,4700000
43,7000000
========================================================================
========
================================
Tratamentos 6ª Rep.
--------------------------------
Célula normal 77,8300000
Célula tumoral 96,8000000
Normal com estímul 84,1200000
Tumoral com estímu 75,2000000
57
Normal, tumoral - 31,2500000
================================
Estatística Descritiva dos Tratamentos:
====================================================================
Tratamentos Média Variância Desv. Pad. EPM
--------------------------------------------------------------------
Célula normal 89,2966667 43,1406667 6,56815550 2,68143825
Célula tumoral 96,5600000 1,27124000 1,12749279 0,46029701
Normal com estímul 68,7316667 81,3518967 9,01952863 3,68220714
Tumoral com estímu 76,3350000 21,9263500 4,68255806 1,91164632
Normal, tumoral - 38,7483333 70,4182167 8,39155627 3,42583850
====================================================================
Análise de Variância para Efeitos de Tratamentos
========================================================================
========
Causas de Variação GL SQ QM F P
------------------------------------------------------------------------
--------
Tratamentos 4 12112,845687 3028,2114217 69,42** <
0,0001
Resíduo 25 1090,5418500 43,621674000 -
------------------------------------------------------------------------
--------
Total 29 13203,387537 - -
========================================================================
========
Média Geral............: 73,934333
Desvio Padrão..........: 6,6046706
Erro Padrão da Média...: 2,6963455
Coeficiente de Variação: 8,9331577
Comparação das Médias de Tratamentos
=====================================
Teste de Tukey
-------------------------------------
Tratamento Viáveis
-------------------------------------
Célula tumoral 96,560000 a
Célula normal 89,296667 a
Tumoral com estím 76,335000 b
Normal com estímu 68,731667 b
Normal, tumoral - 38,748333 c
-------------------------------------
DMS(5%) = 11,1989
=====================================
58
Delineamento Inteiramente Casualizado
Fabrício
Variável: Apoptose
Nomes dos Tratamentos/Fatores:
=======================
Tratamentos
=======================
1 - Célula normal
2 - Célula tumoral
3 - Normal com estímulo
4 - Tumoral com estímulo
5 - Normal, tumoral - estímulo
=======================
Dados Obtidos no Experimento:
========================================================================
========
Tratamentos 1ª Rep. 2ª Rep. 3ª Rep. 4ª Rep. 5ª
Rep.
------------------------------------------------------------------------
--------
Célula normal 2,70000000 4,50000000 6,10000000 8,25000000
9,20000000
Célula tumoral 0,45000000 0,46000000 0,41000000 2,10000000
2,90000000
Normal com estímul 42,6100000 33,7000000 28,8900000 30,3500000
29,0400000
Tumoral com estímu 16,7900000 19,0100000 27,9200000 15,5900000
20,3200000
Normal, tumoral - 45,3900000 56,2600000 69,2000000 62,4600000
54,2800000
========================================================================
========
================================
Tratamentos 6ª Rep.
--------------------------------
Célula normal 0,45000000
Célula tumoral 0,44000000
Normal com estímul 15,3400000
Tumoral com estímu 20,9400000
Normal, tumoral - 67,4600000
================================
Estatística Descritiva dos Tratamentos:
====================================================================
Tratamentos Média Variância Desv. Pad. EPM
--------------------------------------------------------------------
Célula normal 5,20000000 11,0830000 3,32911400 1,35910510
Célula tumoral 1,12666667 1,19590667 1,09357518 0,44645020
Normal com estímul 29,9883333 77,9786167 8,83055019 3,60505702
Tumoral com estímu 20,0950000 18,8781100 4,34489471 1,77379584
Normal, tumoral - 59,1750000 80,4835100 8,97126022 3,66250165
====================================================================
Análise de Variância para Efeitos de Tratamentos
========================================================================
========
Causas de Variação GL SQ QM F P
59
------------------------------------------------------------------------
--------
Tratamentos 4 12966,724313 3241,6810783 85,48** <
0,0001
Resíduo 25 948,09571667 37,923828667 -
------------------------------------------------------------------------
--------
Total 29 13914,820030 - -
========================================================================
========
Média Geral............: 23,117000
Desvio Padrão..........: 6,1582326
Erro Padrão da Média...: 2,5140879
Coeficiente de Variação: 26,639411
Comparação das Médias de Tratamentos
=====================================
Teste de Tukey
-------------------------------------
Tratamento Apoptose
-------------------------------------
Normal, tumoral - 59,175000 a
Normal com estímu 29,988333 b
Tumoral com estím 20,095000 b
Célula normal 5,2000000 c
Célula tumoral 1,1266667 c
-------------------------------------
DMS(5%) = 10,4419
=====================================
60
Delineamento Inteiramente Casualizado
Fabrício
Variável: Necrose
Nomes dos Tratamentos/Fatores:
=======================
Tratamentos
=======================
1 - Célula normal
2 - Célula tumoral
3 - Normal com estímulo
4 - Tumoral com estímulo
5 - Normal, tumoral - estímulo
=======================
Dados Obtidos no Experimento:
========================================================================
========
Tratamentos 1ª Rep. 2ª Rep. 3ª Rep. 4ª Rep. 5ª
Rep.
------------------------------------------------------------------------
--------
Célula normal 0,80000000 1,30000000 2,50000000 3,60000000
3,10000000
Célula tumoral 3,73000000 2,69000000 1,90000000 1,42000000
2,23000000
Normal com estímul 1,13000000 1,07000000 1,12000000 1,67000000
2,15000000
Tumoral com estímu 2,94000000 3,06000000 3,65000000 3,13000000
4,68000000
Normal, tumoral - 3,03000000 2,52000000 1,53000000 2,07000000
2,02000000
========================================================================
========
================================
Tratamentos 6ª Rep.
--------------------------------
Célula normal 21,4200000
Célula tumoral 2,77000000
Normal com estímul 0,54000000
Tumoral com estímu 3,86000000
Normal, tumoral - 1,29000000
================================
Estatística Descritiva dos Tratamentos:
====================================================================
Tratamentos Média Variância Desv. Pad. EPM
--------------------------------------------------------------------
Célula normal 5,45333333 62,3066667 7,89345721 3,22249041
Célula tumoral 2,45666667 0,64198667 0,80124070 0,32710515
Normal com estímul 1,28000000 0,30976000 0,55656087 0,22721502
Tumoral com estímu 3,55333333 0,43430667 0,65901947 0,26904357
Normal, tumoral - 2,07666667 0,40526667 0,63660558 0,25989314
====================================================================
Análise de Variância para Efeitos de Tratamentos
========================================================================
========
Causas de Variação GL SQ QM F P
61
------------------------------------------------------------------------
--------
Tratamentos 4 62,548186667 15,637046667 1,22NS
0,3275
Resíduo 25 320,48993333 12,819597333 -
------------------------------------------------------------------------
--------
Total 29 383,03812000 - -
========================================================================
========
Média Geral............: 2,9640000
Desvio Padrão..........: 3,5804465
Erro Padrão da Média...: 1,4617112
Coeficiente de Variação: 120,79779
Comparação das Médias de Tratamentos
===================================
Teste de Tukey
-----------------------------------
Tratamento Necrose
-----------------------------------
Célula normal 5,4533333 a
Tumoral com estím 3,5533333 a
Célula tumoral 2,4566667 a
Normal, tumoral - 2,0766667 a
Normal com estímu 1,2800000 a
-----------------------------------
DMS(5%) = 6,0710
===================================