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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CURSO DE ZOOTECNIA
FELIPE CACITE
NOVAS INFORMAÇÕES SOBRE A DEPRESSÃO DA GORDURA DO LEITE E MEGASPHAERA ELSDENII
CUIABÁ 2016
FELIPE CACITE
NOVAS INFORMAÇÕES SOBRE A DEPRESSÃO DA GORDURA DO LEITE E MEGASPHAERA ELSDENII
Trabalho de Conclusão do Curso de Graduação em Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso, apresentado como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Zootecnia. Orientador: Prof. Dr. Luciano da Silva
Cabral
CUIABÁ 2016
À família Cacite,
Dedico.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus, por ter me dado várias oportunidades e eu
ter escolhido dentre elas as melhores, ao meu Anjo da Guarda, por me guiar em
caminhos desconhecidos.
Agradeço com muita intensidade aos meus pais, primeiramente ao meu pai,
por ter sido enérgico e mostrado escolhas, oportunidades e consquências delas ao
longo da minha vida, à minha mãe que juntamente ao meu pai, mostrou o carinho, o
afeto e as coisas que a vida tem a nos ensinar em um lar. À minha irmã, que sempre
nos unimos para conquistar um bem maior, mostrou o quão diversa é a vida.
Agradeço a Universidade Federal de Mato-Grosso, em especial aos meus
coordenadores ao longo de minha vida acadêmica, à Secretaria de Relações
Internacionais, que esteve fornecendo suporte em todas as necessidades. Agradeço
aos meus professores, que abriram os meus olhos e mostraram que a Zootecnia é
muito além da produção animal, aqui em especial ao meu orientador, professor
Luciano da Silva Cabral, que me mostrou o incrível mundo da microbiologia.
Gostaria de agradecer ao Departamento de Agricultura dos Estados Unidos
da América, por permitir o intercâmbio de alunos internacionais aos seus centros de
pesquisas, em especial o US Dairy Forage Research Center. Agradeço do fundo do
meu coração ao meu supervisor de estágio, professor Paul J. Weimer, que me
recebeu duas vezes e me deu os conhecimentos necessários para o meu futuro
profissional. Também agradeço a técnica do laboratório de microbiologia do
USDFRC, Christine Odt, por me ajudar nas atividades práticas e diárias do
laboratório.
Por fim, agradeço aos meus amigos, que participaram da minha vida
acadêmica, desde trabalhos em grupo, encontrando soluções para determinados
problemas, ou fornecendo apoio durante o meu estágio e em ambos os programas
de mobilidade acadêmica internacional.
Agradeço a todos que, de forma direta ou indireta, contribuíram para o meu
engrandecimento profissional e a formação de uma pessoa, que se apaixonou pela
vida acadêmica. A todos vocês, muito obrigado.
“Books are the legacies that a great genius leaves to mankind, which are
delivered down from generation to generation as presents to the posterity of
those who are yet unborn”.
Joseph Addison
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Organização do Serviço de Pesquisas Agrícolas ....................................... 12 Figura 2. Disposição dos primers de identificação das amostras .............................. 27 Figura 3. Porcentagem (%) de leituras de Megasphaera elsdenii ao longo do experi-
mento. ....................................................................................................... 31 Figura 4. Porcentagem (%) de gordura ao longo do periodo do experimento .......... 32
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Resumo das atividades realizadas na semana de inoculação da cultura nos animais ............................................................................................ 21
LISTA DE ABREVIATURAS
ARS: Agricultural Research Service
ºC: graus Celsius
CLA: ácido linoléico conjugado
DNA: ácido desoxirribonucléico
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético
EUA: Estados Unidos da América
g: gravidade
LC: Large Cocus (grande coco)
LTY: Lactato, Tripticase, e extrato de levedura
RNA: ácido ribonucléico
PCR: Reação em Cadeia de Polimerase
TAE: TRIS Acetato EDTA
US: United States
USDA: United States Department of Agriculture
USDFRC: United States Dairy Forage Research Center
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1 2. OBJETIVOS ........................................................................................................... 4 3. REVISÃO ............................................................................................................... 5 Depressão da gordura do leite ............................................................................... 8 4. RELATÓRIO DE ESTÁGIO .................................................................................. 12 5. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS E DISCUSSÃO ............................................... 14 Preparo do meio de cultura .................................................................................. 14 O método de tubos rolados .................................................................................. 16 O método de placas de Petri ................................................................................ 18 O método de diluição até a extinção .................................................................... 19 O experimento com vacas leiteiras ...................................................................... 20 Purificação e extração do DNA ............................................................................ 22 Preparação da biblioteca de sequenciamento metagenômico do gene 16S........ 25 Eletroforese .......................................................................................................... 28 Sequenciamento metagenômico .......................................................................... 29 6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 34 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 35 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 37
RESUMO
A microbiologia e as novas tecnologias de biologia molecular evoluem ao longo dos
anos, e a utilização dessas técnicas são imprescindíveis para a ciência. Com isso,
objetivou-se como trabalho de conclusão de curso a atualização de técnicas de
produção de culturas anaeróbicas, extração e purificação de DNA e seu
sequenciamento. Realizou-se um experimento, em que a parte laboratorial foi
realizada no laboratório de microbiologia do US Dairy Forage Research Center, em
Madison, Wisconsin, e as inoculações e coleta de amostras na fazenda experimental
do USDFRC em Praire du Sac, Wisconsin/USA. Foram utilizados 9 vacas de raça
Holandesa e em lactação divididos em 3 grupos sendo 1 grupo controle, um
recebendo um inóculo da cepa 5045 e outro recebendo o inóculo da cepa 4257
isoladas previamente de Megasphaera elsdenii. Os animais foram inoculados e ao
longo do experimento, foram coletadas amostras de líquido ruminal e de leite para
análise da comunidade microbiana no rúmen e a porcentagem de gordura no leite.
Como resultados, notou-se a ocorrência da depressão da gordura no leite e também
alterações na população de Megasphaera elsdenii. Os dados mostraram que houve
mudanças individuais e entre as cepas, sugerindo que a depressão da gordura do
leite está relacionada às cepas de Megasphaera elsdenii. Por fim, os objetivos
propostos de atualização de novas informações relacionadas à microbiologia e
biologia celular foram alcançados.
Palavras-chave: microbioma ruminal, queda da gordura no leite, bactéria
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1. INTRODUÇÃO
A origem dos ruminantes é documentalmente citada nos textos bíblicos,
sendo o primeiro em Levíticos 11, 3: “você poderá comer dos animais de cascos
partidos, divididos em duas partes e que é um ruminante”. Ainda a domesticação dos
ruminantes evidenciadas em estudos mostra que eles foram domesticados entre
8.000 e 10.000 anos atrás (Luftus et al., 1994).
No entanto, antes de se comentar da domesticação dos ruminantes, que se
faz parte da história recente, como explicado por Luftus e seus colaboradores, deve-
se levar em consideração a origem da vida, pois, para tudo o que se sabe no
mundo, existiu um começo. Desde a criação do Universo, ou seja, 13,7 bilhões de
anos atrás, de acordo com a lei de Hubble, descrito por Turner (2013). Hubble
descreveu que todas as galáxias se afastam de um determinado ponto e esse
afastamento é possivel ser determinado através de um modelo matemático por ele
proposto, levando em consideração a velocidade e a distância que essas galáxias se
movem. Ainda, Turner comenta que o universo quanto mais se desenvolve, mais
escuro e frio ele se torna. Assim é possível observar que a origem do universo está
em regiões mais quentes e iluminadas, justificando a origem do universo pela teoria
mais aceita hoje que é a Teoria do Big Bang (Hubble, 1929).
Kuiper (1950) afirma que, a origem do Sistema Solar se deu por uma união de
massas que eram influenciadas por uma fonte de energia e a formação dos planetas
respondiam a essas influências e apresentam uma inclinação em relação ao Sol. E
de acordo com Wilson et al. (1978) e Turner (2013) a origem do Sistema Solar e a
origem da Terra datam de idades semelhantes, sendo a origem do sistema solar em
4,7 bilhões de anos e a Terra em 4,5 bilhões de anos. Turner ainda divide o Período
Pré-Cambriano em diferentes eras: Arqueozóica e Proterozóica, e o Período
Cambriano em Mesozóica, Paleozóica e Cenozóica.
Wilson et al. (1978) formularam um calendário geológico mostrando o que
teria acontecido com o desenvolvimento do planeta Terra desde sua origem. Na Era
Arqueozóica, eles descrevem que, surgiram as primeiras formas de vida em meio
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líquido. No final dessa era, bactérias e cianobatérias poderiam ter surgido. Uma
comparação pode ser feita com o livro do Gênesis, que trata da criação do mundo
conhecido pela humanidade, o livro traz a origem da vida na Terra de forma bem
resumida, tratando-a como “dias”, mas o que é um dia? O dia é uma metáfora para a
representação de um começo e um fim, em Gênesis, a primeira coisa a ser criada foi
a luz, ou seja, uma primeira sugestão do que seria o Big Bang proposto por
Hubble(1929) e Turner (2013).
A bíblia forma um compilado de escritos onde até o momento não tinha o
conhecimento dos microrganismos, todavia, existem vestígios da origem da vida
microbiana nesse período, através das bactérias e cianobactérias (Lal, 2008).
A partir do surgimento do homem moderno, a domesticação dos animais se
tornou necessária. Foram apresentadas duas diferentes evidências para a
domesticação de ruminantes, uma ocorrida na Índia e outra na África. As atuais
raças europeias e indianas foram mostradas na pesquisa que tiveram a mesma
origem, em evidencias encontradas em fósseis e também em análise genética
relacionado ao DNA mitocondrial, mostrando que as raças africanas não apresentam
o compartilhamento desse DNA. Apesar de serem raças zebuínas, suspeita-se que
apenas animais machos haviam sido utilizados na África na seleção dos animais.
Sendo assim, uma purificação das raças ali presente (Luftus et al., 1994).
Após a domesticação dos ruminantes, e a observação do interior desses
animais, notou-se que os ruminantes eram diferentes. Russell (2002) observou em
estudos que Aristóteles descreveu os ruminantes como um animal com o estomago
dividido em quatro compartimentos. Ele também cita que apenas em 1884 quando
Van Tappeiner dosou antibióticos no interior do rúmen e verificou que a digestão de
fibra foi inibida. Assim, iniciou-se o conhecimento de que havia pequenos seres que
colonizavam o rúmen.
Brock (1970), em seu livro afirma que somente em 1664 com Antonie van
Leeuwenhoek, um construtor de microscópios amador, reportou a existência de
“animáculos”, observando pela primeira vez a existência de microrganismos,
confirmado posteriormente por outros pesquisadores. O autor ainda apresenta uma
relação de simbiose entre o rúmen e os microrganismos ali presentes.
Hungate (1966) afirmou que o primeiro cientista que observou a produção de
gases e ácidos no rúmen foi Zuntz, em 1879, trazendo assim, novas informações ao
conhecimento científico ao longo dos anos. Dentre várias publicações aqui citadas e
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também a enorme quantidade de diferentes microrganismos presentes no rúmen,
desde vírus, bactérias e protozoários até fungos, Hungate afirma que são várias as
funções que eles exercem no rúmen, e as relações que eles possuem podem ser
inter e intraespecífica, na qual uma bactéria necessita de um subproduto metabólico.
Por sua vez, ocorre a predação de bactérias por protozoários e a quebra de
moléculas de grande tamanho por simbiose entre fungos e bactérias. Ainda que as
funções de grande parte desses microrganismos sejam desconhecidas. As novas
tecnologias fornecem artifícios para essas descobertas, além disso, a associação da
medicina e de outras ciências biológicas e da terra para uma abrangência maior do
entendimento desse mundo.
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2. OBJETIVOS
O objetivo com o estágio foi aprimorar técnicas em microbiologia, como
preparação de meios de cultura anaeróbicos, preparo de soluções tampão, utilização
da câmara anaeróbica, e técnicas de biologia molecular, extração e purificação de
DNA de culturas puras, e de líquido ruminal, além do sequenciamento do DNA
extraído aplicados na investigação da depressão da gordura do leite e na
identificação de bactérias ruminais.
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3. REVISÃO
É sabido que no rúmen existem milhares de espécies, dentre bactérias, virus,
fungos, protozoários e outros microrganismos, como citado por Hungate (1966). No
entanto, a descoberta de microrganismos no rúmen só ocorreu em 1843 por Gruby e
Delafond identificando protozoários e foi apenas em 1864, com Pasteur, que as
bactérias foram realmente registradas e também as primeiras descobertas que elas
produziam gases e ácidos. (Hungate, 1966).
O rúmen possuí grande diversidade de vida microbiana. Os microrganismos
que habitam o rúmen possuem diferentes funções e pertecem a diferentes
classificações biológicas. Esses organismos são divididos em arqueobactérias,
bactérias, protozoários e fungos.
As arqueobactérias são responsáveis pela formação de metano no rúmen ou
seja, a metanogênese. Esse processo ocorre através da utilização do H2 e do CO2
formando CH4. (Morgavi et al., 2010)
Os protozoários, em sua grande maioria, ingerem e degradam componentes
da parede celular, além de bactérias e também utilizam amido e celulose como fonte
de energia (Orpin, 1984; Hungate, 1966). Também observou-se que a grande
maioria dos protozoários presentes no rúmen são ciliados, e o restante apresentam
flagelos como estrutura de locomoção e predação de bactérias. Em animais
defaunados (sem protozoários) a população bacteriana é maior (Hungate, 1966).
Os fungos encontrados no rúmen, são anaeróbicos obrigatórios e utilizam
como fonte de energia carboidratos, dentre eles a glicose e frutose. Os fungos
também apresentam a capacidade de romper fisicamente a lignina, característica
importante na comunidade ruminal pois nenhum outro microrganismo do rúmen
possui essa característica (Gordon e Phillips, 1998).
Por fim, a principal comunidade microbiana no rúmen, as bactérias. Esses
organismos são os mais abundantes no rúmen e devido a sua grande variedade,
apresentam diferentes características e dentre elas está a utilização de diferentes
produtos como fonte principal de energia. De acordo com Hungate, 1966, as
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bactérias foram classificadas como fermentadoras de celulose, hemicelulose, amido,
açúcares, proteína, lipídios, e as utilizadoras de ácidos.
O primeiro grupo, as fermentadoras de celulose, tem como o organismo mais
abundante a espécie Bacteroides succinogenes. Esta bactéria utiliza a celulose
como principal meio de energia e ela é uma fixadora de CO2 e como produtos da
fermentação o succinato. Uma outra bactéria, Butyrivibrio fibrosolvens, apresenta a
fermentação da celulose mas não de forma rápida como a B. succinogenes, mas
tem como produtos da fermentação: H2, CO2, etanol, e ácidos acético, butírico,
fórmico e lático. A porcentagem de bactérias deste grupo em animais com dietas de
alta forragem é de aproximadamente 15,6% (Hungate,1966).
A hemicelulose é insolúvel em água mas solúvel em meio ácido. Diferentes
formas da hemicelulose são digeridas por uma grande variedade de bactérias, como
Eubacterium, Bacteroides ruminicola, Bacteroides amylogenes entre outras
(Hungate, 1966).
O próximo grupo são as fermentadoras de amido, essas bactérias são mais
abundantes em dietas com baixa concentração de forragem. Parte das bactérias
celulolíticas também são amilolíticas como cepas de Bacteroides succinogenes e
Butyrivibrio fibrosolvens. A principal bactéria deste grupo é a Streptococcus bovis, e
tem como principal produto de fermentação o lactato (Hungate, 1966).
Algumas bactérias fermentam monossacarídeos ou dissacarídeos, entre as
fermentadoras de açucares estão os Lactobacillus e Eubacterium ruminatium, esta
última gerando como produtos da fermentação: CO2, acetato, formato, lactato e
butirato (Hungate 1966).
As bactérias proteolíticas utilizam particulas presentes no rúmen e não
diretamente do que é fornecido na dieta. As fermentadoras de aminoácidos geram
amônia, e gases cabônico e hidrogênio. Ainda existem bactérias fermentadoras
utilizadoras de amônia (Hungate,1966).
As bactérias fermentadoras de lipídios citadas por Hungate, 1966, são duas,
uma Veillonella alcalescens, e outra Anaerovibrio lipolytica, sendo esta com produtos
da fermentação: acetato, propionato, butirato e o succinato.
No último grupo estão as utilizadoras de ácidos, tendo como importância a
Vibrio succinogenes como fermentadora de formato e a Megasphaera elsdenii
importante fermentadora de lactato. Estudos mostram uma relação entre a
população de M. elsdenii e de S. bovis (Hungate,1966; Russell et al., 1981).
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A bactéria em estudo neste estágio foi inicialmente descrita por Elsden e
Lewis (1953) como um organismo LC (large coccus). Esse organismo continha as
características de uma bactéria gram-negativa, no formato de cocos, anaeróbica e
que utiliza como fonte de energia, DL- Lactato, glicose, frutose, maltose, manitol,
com a produção de hidrogênio, dióxido de carbono, acetato, propionato, butirato,
pentanato e hexanato.
Mais tarde, Elsden e Lewis (1956) propuseram uma classificação desse
organismo ruminal LC, mas devido às características, não encontraram um gênero
para sua classificação, reportando que o organismo possui uma similiaridade com
bactérias do gênero Neisseria e Moraxella.
Em artigo publicado por Gutierrez et al. (1958), foi sugerida uma classificação
para o organismo ruminal LC. Segundo os autores, esse organismo apresentava as
seguintes características: células vivas e esféricas com tamanho de 2,0 a 2,4 µm por
2,6 µm em pares ou em cadeias entre 16 e 20 células. Em esfregaços com
tingimento as bactérias apresentavam estrutura granular, sem observação de
cápsulas, imóveis, gram-negativas, todavia algumas cepas foram identificadas como
gram-positivas. Também apresentando diferenciais de tamanho quanto a culturas
antigas. A bactéria é anaeróbica obrigatória e é encontrada no rúmen de bovinos e
ovinos. Então essas características sugeriram que a bactéria pertencia ao gênero
Peptostreptococcus e a espécie designada Peptostreptococcus elsdenii.
As características morfológicas macroscópicas das colônias crescidas em
placas apresentam uma estrutura arredondada entre 1 e 4 mm de textura macia e
uma leve coloração com tons marrons. Dentre outras características, os substratos
utilizados como: lactato, glicose, frutose, e maltose, não metabolizando D- xilanose,
ramnose, salicina, manose, arabinose, esculina, rafinose, lactose, trealose, celobiose
e sorbitol, tendo como produtos da fermentação o lactato, dióxido de carbono,
hidrogênio, acetato, propionato, butirato e valerato. Os autores (Gutierrez et al.,
1958) ainda afirmam que na fermentação da glicose, além dos produtos
supracitados, também há a produção de ácido capróico.
Hungate (1966) resumiu algumas características da bactéria conhecida na
época como P. elsdenii afirmando que além das informações apresentadas por
Gutierrez et al, 1958, a bactéria em questão necessita de acetato e aminoácidos no
meio de cultura apresentando boa assimilação desses aminoácidos. Os aminoácidos
assimilados são L-serina que é metabolizada em dióxido de carbono, amônia e
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acetato, e L-treonina fermentada em dióxido de carbono, amônia, propionato, e
pequenas quantidades de acetato e valerato (Hungate, 1966).
No entanto, em um estudo apresentado por Rogosa (1971), este autor propôs
que a bactéria conhecida como Peptostreptococcus elsdenii deveria ser
reclassificada para um novo gênero: Megasphaera, o que significa grande esfera. O
autor justificou a mudança de gênero mostrando que o organismo LC descoberto por
Elsden e Lewis (1953), não apresentava as características de outras bactérias
pertencentes àquele grupo, como sendo organismos proteolíticos ou capazes de
metabolizar produtos da fermentação de proteínas. O autor também adicionou que a
P. elsdenii não era uma bactéria gram–positiva, mas sim, gram-negativa, sendo
realizado o teste de pigmentação e observação em microscopia eletrônica.
Sendo assim, Rogosa atualizou as informações da bactéria sendo ela
diplococos, podendo formar cadeias, células grandes chegando a diâmetros
superiores a 2µm, sem estruturas de locomoção, e não esporodifícam. Gram-
negativas, anaeróbicas obrigatórias, requerimentos nutricionais complexos, quimio-
heterotrófica, produtora de gases, e com a fermentação de glicose e lactato, há a
formação de ácidos graxos de cadeia curta, dióxido de carbono e hidrogênio. Tendo
como produtos da utilização do lactato a produção de acetato, propionato, ácidos
com quatro carbonos na estrutura como o butirato, e valerato. Quanto à fonte
principal de energia, a glicose, a bactéria apresentou uma produção menor de
acetato, propionato, butirato e valerato e apresentou grande produção de coproato.
Em 1989, Marounek et al, testaram diferentes cepas da bactéria em diferentes
fontes de carboidratos e também testaram a resistência à agentes antimicrobianos
utilizados como aditivos. Os autores ratificaram a preferência por lactato pela
bactéria bem como os produtos da fermentação do lactato e também da utilização da
glicose como uma fonte alternativa de energia apontado também estudo semelhante
realizado por Weimer e Moen (2013). Somando a isso, Marounek et al. (1989),
perceberam que algumas cepas apresentavam resistência a determinados agentes
antimicrobianos e outras não.
Depressão da gordura do leite
Alguns autores, associaram a Depressão da Gordura do Leite (DGL), com a
Megasphaera elsdenii (Weimer et al, 2010; Weimer et al, 2015; Maia et al, 2007).
Weimer et al, 2010, verificaram que vacas com DGL apresentaram uma abundância
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maior na população de M. elsdenii no rúmen do que animais que não apresentavam
a DGL. Essa associação foi feita também utilizando dietas com grande consumo de
carboidratos não-fibrosos.
Storry e Sutton (1969), notaram que mesmo em animais com dietas de alta
quantidade de grãos e pH ruminal baixo não apresentavam redução do teor de
gordura no leite. Mas, Counotte et al (1981), em sua pesquisa observaram que a
participação da Megasphaera elsdenii na digestão de lactato em dietas normais está
entre 60 e 80%. No entanto em dietas ricas em carboidratos rapidamente
fermentáveis e baixa fibra, a participação da Megasphaera elsdenii aumentou.
Posteriormente, foi afirmado que de fato a bactéria tem um papel importante na
depressão da gordura do leite, (Kim et al., 2002)
Bauman e Griinari (2003) em sua revisão verificaram uma assimilação entre
dietas com alto e baixo teor de fibra, eles observaram que, a produção de acetato e
propionato em diferentes dietas apresentam concentrações diferentes. Em dietas de
alta forragem, a porcentagem de acetato foi maior, enquanto a de propionato era
menor. As dietas de baixo teor de fibra, apresentaram uma redução na porcentagem
de acetato e um aumento na de propionato. No entanto em estudos citados
anteriormente,(Hungate, 1966; Gutierrez et al. 1958) mostram que parte das
bactérias utilizam o acetato como substrato. Assim, Daves (1967), afirma que a
proporção de acetato registrado não representa totalmente a produção real de
acetato. Visto que dietas de alta concentração de alimentos energéticos são
rapidamente fermentadas no rúmen, existe uma alteração na comunidade
microbiana deste compartimento, tornando necessária a adaptação dos animais
(Counotte e Pris, 1981).
Bauman e Lock (2004) citaram que em dietas com baixo teor de fibra, e
principalmente de vacas em lactação, são utilizados alimentos ricos em lipídios.
Esses alimentos ricos em ácidos graxos de cadeia longa e de cadeia ramificada, na
foma de óleos são insaturados, parecem ser tóxicos à microbiota ruminal,
necessitando da bio-hidrogenação efetuada por algumas bactérias, conforme
verificado por Kim et al. (2002), cepas da bactéria aqui em estudo, podem bio-
hidrogenar o ácido linoleico ao isômero trans-10, cis- 12 CLA em presença de lactato
ou lactato e tripticase. Os principais ácidos graxos presentes nessas dietas são os
ácidos linoleico e o linolênico. A bio-hidrogenação do ácido linoléico gera como o
primeiro produto um CLA, ácido linoleico conjugado, cis-9, trans-11 CLA, sendo o
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mais abundante no rúmen. Mas outro CLA apresenta grande interesse, o isômero:
trans-10, cis- 12 CLA, pois este CLA está associado à inibição da produção de
gordura nas glândulas mamárias, conforme demonstrado em pesquisa de Bauman e
Lock (2004).
Maia et al. (2007), em seu trabalho testou uma série de organismos ruminais
quanto a toxicidade dos ácidos graxos poli-insaturados, dentre os organismos estava
uma das cepas utilizadas por Kim et al. (2002) a cepa J1. Ambos os trabalhos
verificaram que essa cepa em questão não apresentou uma bio-hidrogenação
satisfatória do ácido graxo, o que se sugere que seja uma característica ligada a
determinadas cepas da bactéria e não necessariamente uma aplicação geral como
uma característica da espécie em estudo. Maia et al., ainda afirmam que outras
espécies ali presentes realizam maior bio-hidrogenação dos ácidos graxos.
No último trabalho publicado por Weimer et al. (2015) foram realizados 3
experimentos, em todos eles utilizando técnicas para identificar a persistência da
Megasphaera elsdenii no rúmen. No entanto, os autores verificaram que durante o
primeiro experimento a cepa utilizada para realizar as dosagens no rúmen
apresentaram uma redução ao longo do tempo, mas, em uma das vacas utilizadas
apresentou um pequeno aumento no último dia de coleta dos dados, sugerindo que
naquele animal, talvez a colonização do rúmen foi realizada efetivamente. Porém,
não se pode afirmar que aquela bactéria encontrada seria realmente a cepa
utilizada. No restante dos experimentos verificou-se que a bactéria ao longo do
tempo também passou a diminuir sua abundância.
Por fim, Weimer et al. (2015), formulam alguns questionamentos se a bactéria
realmente não permaneceu abundante no rúmen por questões de não fornecer um
ambiente menos competitivo, como o esvaziamento do rúmen, parcialmente, ou,
fornecer uma fonte de energia para a bactéria a fim de que isso favoreça a
colonização dele. Os autores ainda sugerem que impulsionando a dieta ao limite de
dietas que estão sujeitas a causar a depressão da gordura do leite poderiam ser
fatores colaborativos as causas da depressão da gordura do leite (Weimer et al,
2015).
Como é de conhecimento em diferentes áreas da ciência, a utilização de
ácido linoléico é benéfica, pois tem os seguintes efeitos desejáveis: prevenção de
doenças cornonárias, corrige possíveis deficiências de ácidos graxos essenciais
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ocorridas na infância, previnindo doenças autoimunes, os cânceres de mama,
próstata e cólon, hipertensão moderada e artrite reumatoide (Connor ,2000).
Contudo, no estudo foi apresentardo as dificuldades de melhorar a qualidade
do leite com ácidos graxos poli-insaturados. (Lanier e Carl, 2015) Os autores
comentam que um dos fatores que dificultam o enriquecimento do leite é o processo
de bio-hidrogenação que ocorre no rúmen pelas bactérias e a conversão do ácido
linoleico e linolênico em CLA e uma dessas isomerias, causa queda da podução da
gordura do leite (Bauman e Gruiinari, 2013; Lanier e Carl, 2015).
Outra observação feita por Lanier e Carl (2015) é a limitação da formação de
micelas no intestino, a absorção de ácidos graxos de cadeia longa pelas células
epiteliais. Além de citar a absorção desses ácidos graxos pelas células do tecido
mamário. Os autores ainda se referem à transgenia para aumentar a presença de
acidos graxos poli-insaturados no leite.
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4. RELATÓRIO DE ESTÁGIO
O U.S. Dairy Forage Research Center (USDFRC) é uma das 90 unidades de
pesquisas subordinadas ao Agricultural Research Service (ARS) (Serviço de
Pesquisas Agrícolas) pertencente ao U.S. Department of Agriculture (Departamento
de Agricultura dos Estados Unidos). O ARS possui um orçamento anual de 1,1
bilhão de dólares americanos, contando com mais de 6.000 empregados e 2.000
cientistas e pós-doutores. E sua organização está descrita na figura 1.
Figura 1. Organização do Serviço de Pesquisas Agrícolas
Departamento de Agricultura dos EUA
Secretaria de Agricultura
Subsecretaria, Pesquisa, Educação e Economia
Serviço de Pesquisas Agrícolas
Região do Pacífico Oeste
Regiões Planas
Região Centro - Oeste
Região Nordeste
Região do Sudeste
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O U.S. Dairy Forage Research Center é o único centro de pesquisas do
Serviço de Pesquisas Agrícolas que tem como missão melhorar o uso da forragem
na nutrição de vacas leiteiras. O mesmo possui um grupo de 17 cientistas e uma
fazenda experimental administrada em parceria com a University of Wisconsin
Agricultural Research Station (Estação de Pesquisa Agrícola da Universidade de
Wisconsin) e conta com uma área de 2.006 acres e possuindo atualmente 350
vacas. O mesmo também possui outro centro de pesquisa na cidade de Marshfield
além de fazenda experimental na cidade de Stratford, com 115 vacas em lactação e
530 novilhas.
O estágio ocorreu no U.S. Dairy Forage Research Center (Centro de
Pesquisa Americano de Forragem e Bovinocultura Leiteira) localizado no campus da
Universidade de Wisconsin, na cidade de Madison, no estado de Wisconsin, e na
fazenda experimental do mesmo centro de pesquisas, localizado na cidade de
Prairie du Sac, no mesmo estado, entre os dias 16 de outubro de 2015 e o dia 13 de
abril de 2016. A supervisão foi realizada pelo Dr. Paul James Weimer,
microbiologista, pesquisador e professor associado ao Departamento de
Bacteriologia da Universidade de Wisconsin, bem como pela Christine Odt, técnica
em ciência biológica laboratorial.
A carga horária do estágio fora de no mínimo de 4 horas diárias, podendo
chegar a 6 horas, alguns dias permanecendo por mais de 12 horas, devidos às
atividades de suma importância, tornando-se indispensável a minha saída do
laboratório não havendo a possibilidade de realizá-las em outro dia. Nos dias que o
período de 6 horas foi extrapolado, era permitido uma flexibilização dos horários nos
dias posteriores.
14
5. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS E DISCUSSÃO
Preparo do meio de cultura
O preparo do meio de cultura seletivo mara Megasphaera elsdenii foi
necessário para as atividades durante o experimento. Durante a fase inicial, foi
necessário o isolamento da bactéria e para tal, 3 diferentes métodos foram testados.
O primeiro, a utilização de tubos, o segundo a utilização de placas e o terceiro
utilizando o método de diluição até a extinção. Os dois primeiros métodos receberam
uma adição, de 3% do volume da solução, de ágar.
A preparação do meio de cultura de todos os métodos foram preparados
conforme descrito a seguir:
Equipamentos:
- Cilindro de gás carbônico (CO2);
- Bomba de vácuo;
- Autoclave;
- Banho-maria.
Materiais::
- Método 1: tubos de cultura de 50 mL de capacidade, para a técnica de
isolamento em tubos, tampas de borracha suporte para compressão
das tampas.
- Método 2: frascos de 125 mL, tampas de borracha e lacres de
alumínio.
- Método 3: tubos de ensaio com capacidade para 25 mL, tampas de
borracha e lacres de alumínio.
Reagentes e solutos:
Meio Dehority Modificado (MDM) em g/L:
- 1,02g de extrato de levedura;
- 1,02g de trypticase;
- 1,17g de cloreto de sódio (NaCl);
15
- 1,17g de sulfato de amônio ((NH4)2SO4);
- 0,065g de cloreto de cálcio dihidratado (CaCl2.2H2O);
- 0,065g de sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O);
- 0,026g de sulfato de manganês monohidratado (MnSO4·H2O);
- 0,026g sulfato de ferro (2) heptahidratado (FeSO4.7H2O);
- 0,026g sulfato de zinco dihidratado (ZnSO4·2H2O);
- 0,0026g cloreto de cobalto dihidratado (CoCl2.2H2O);
- 3% de ágar*
LTY (Para o método 2 é colocado 10 vezes o volume a seguir):
- 0,40 mL monopotássio fosfato (KH2PO4) de 22,5 g/L;
- 0,40 mL carbonato de sódio (Na2CO3) de 80 g/L;
- 0,2 mL lactato de sódio 4mM.
Inibidores (Para o método 2 é colocado 10 vezes o volume a seguir):
- 0,05 mL de monensina 200mM;
- 0,1 mL de molibidato de sódio 100mM;
- 0,1mL de 2-bromoetanosulfonato 1mM;
- 0,1 mL de 1,8-di-hidroxi-antraquinona 3M.
Preparação do meio:
Para todos os métodos: preparar o MDM com aquecimento, sob asperção de
gas carbônico. No método 3, o ágar não é adicionado.
Para o método 1 e 3, é adicionado 8,8 mL do meio em cada tubo de cultura
sob aspersão de CO2, onde imediatamente após, os tubos foram vedados com
tampas de borracha e lacres de alumínio. E no método 2 é colocado 80 mL dentro
dos frascos e também são selados.
A seguir, os tubos passaram por um processo de retirada do ar do seu
interior, o qual consistiu de 3 minutos de vácuo alternando com 30 segundos de
injeção de CO2, repentindo 3 vezes o procedimento. E são autoclavados.
Após os tubos serem autoclavados, os tubos com ágar são deixados em
banho-maria e todos os tubos e frascos recebem os inibidores e LTY.
Isolamento:
16
As cepas de M. elsdenii foram provenientes de vacas canuladas no rúmen,
sendo elas os animais com maior pré-disposição à depressão da gordura do leite
levando em consideração a porcentagem de gordura no leite sendo inferior a 3,2%
(Weimer et al, 2015). Dentre os animais do rebanho foram selecionadas 6 vacas,
das quais foram coletados 25mL de líquido ruminal filtrado em uma camada
quadrupla de gaze e armazenado em tubos tipo plástico com tampa de rosca e
acondicionados em gelo, transportados em caixa térmica. Adiante, os tubos com
tampa em rosca foram homogeneizados indivualmente e manualmente, e um após o
outro, foram abertos e coletado com o auxílio de uma agulha e seringa esterilizadas,
foram retirados 0,2 mL de liquido ruminal e inoculando em cada tubo contendo o
meio de cultura MDM e também LTY e os inibidores e colocadas em incubadora à
39°C e transferidas a cada 2 dias.
Os 3 métodos apresentam técnicas diferentes de inoculação e isolamento. E
serão descritos de maneira distinta.
O método de tubos rolados
Para a realização deste método é nescessário realizar a diluição seriada das
amostras inoculadas. Para isso, é necessário tubos contendo 9,8 mL de uma
solução de 20mM de fosfato de potássio dibásico anidro (K2HPO4) em condição de
anaerobiose e estéril. Como descrito anteriormente, é o método utilizando os tubos e
o procedimento está descrito à seguir:
Equipamentos:
- Rolador de tubos;
- Caixa térmica com gelo e água;
- Incubadora.
Materiais:
- Tubos de cultura de 50 mL de capacidade com o meio LTY e os inibidores;
- Tubos com a solução de K2HPO4;
- Seringas e agulhas.
Procedimento de inoculação:
Os tubos contendo a solução tampão de K2HPO4, são colocados em
sequência e identificados de 1 à 6 e com a identificação das amostras. As amostras
17
a serem diluídas são as incubadas à partir do líquido ruminal previamente coletado.
Individualmente, com uma seringa e uma agulha esterilizadas, é retirado 0,2 mL do
inóculo e injetado no tubo 1 e homogeneizado, então com outro conjunto de seringas
e agulhas, retira-se 0,2 mL do tubo 1 e transferido para o tubo 2. Este procedimento
foi repetido até o tubo de número 4. A partir deste tubo, o volume a ser transferido foi
alterado para 1,2 mL. Este processo se repete até a diluição chegar ao tubo número
6.
Os tubos com ágar são identificados com o número correspondente de cada
diluição (1 até 6) e da amostra proveniente. Utilizando outro conjunto de agulhas e
seringas esterilizadas, transfere-se 0,2mL de cada diluição no respectivo tubo com
ágar, e este é imediatamente acoplado horizonalmente em um rotor na qual o tubo é
rotacionado em seu próprio eixo, e para a solidificação do ágar o tubo é aspergido
com água gelada. Este procedimento é necessário para que as bactérias não sejam
inviabilizadas devido a temperatura do tubo. Em seguida, o tubo é armazendo em
incubadora à 39ºC. O crescimento das colônias deve ser acompanhado diariamente.
Procedimento de isolamento:
Equipamentos:
- Autoclave;
- Camara anaeróbica;
- Incubadora.
Materias
- Tubos com as culturas;
- Haste de metal com garra;
- Tubos esterilizados com solução tampão de K2HPO4;
- Seringas e agulhas;
- Pipetas de Pasteur;
- Tubos com o meio de cultura MDM líquido, LTY e inibidores sem ágar;
- Álcool 70.
Inicialmente as seringas, agulhas, pipetas, os tubos com a solução são
esterilizados, e juntamente com a mistura colocados dentro da câmara anaeróbica
no dia anterior para que o oxigênio remanecente fosse perdido.
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No momento da coleta das colônias, uma haste de metal com garra para fixar
os tubos é colocada dentro da câmara anaeróbica, juntamente com os tubos
contendo ágar e as colônias e os tubos com o meio liquido. As colônias são
selecionadas e os critérios para a escolha das colônias foram os seguintes:
tamanho, distância em relação a outras colônias e morfologia. Foram coletadas
aproximadamente 5 colônias de cada grupo de diluição, as diluições que
apresentaram as melhores colônias para a retirada foram à partir da terceira diluição.
Abre-se o tubo a ser utilizado, e com o auxílio da pipeta de Pasteur
esterilizadas a colônia é retirada, em seguida, ela é diluída em um tubo contendo
aproximadamente 0,07 mL da solução tampão e com uma seringa e agulha estéreis
o conteúdo foi colocado dentro do tubo com o meio de cultura com a tampa que
estava submergida em álcool para evitar contaminação. Após realizar esse
procedimento com todos os tubos, os mesmos foram colocados em uma incubadora
de 39ºC e acompanhados diariamente para checar se as bactérias estavam se
multiplicando.
O método de placas de Petri
Equipamentos:
- Camara anaeróbica;
- Incubadora.
Materias:
- Frascos com meio LTY e os inibidores de crescimento;
- Placas de Petri;
- Ansa de inoculação;
- Agulhas e seringas;
- tubos contendo o meio de cultura liquido;
Ao dia anterior a preparação das placas, as placas de Petri sem o meio de
cultivo foram colocadas dentro da câmara anaeróbica para trocas gasosas.
No dia de preparação das Placas, coloca-se dentro da câmara e são
imediatamente abertos espalhando-se o conteúdo nas placas e deixados em
repouso para o ágar solidificar. Também são colocadas dentro da câmara
anaeróbica as ansas de inoculação descartáveis, agulhas e seringas.
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No dia seguinte, observa-se o ágar do meio, caso estiver sólido, as amostras
a serem inoculadas são colocadas dentro da câmara, caso contrário sólidos espera-
se mais um dia para a inoculação.
No dia da inoculação o procedimento foi o seguinte: destampar a placa de
Petri, segurando a tampa, colocando-se uma gota na extremidade esquerda. Com a
alça de inoculação posicionada sobre a gota, foram feitos movimentos verticais, da
esquerda para a direita, até percorrer aproximadamente 30% da placa, então, no
limite superior da placa, o ágar é marcado com a ansa. A placa então é rotacionado
aproximadamente 90º, e com a ansa passando por apenas alguns milímetros e uma
vez sobre o conteúdo já espalhado, repetindo os movimentos verticais da esquerda
para a direita, sem tocar onde já havia sido espalhado, até aproximadamente 50%
dos 70% restante. A placa foi rotacionada novamente aproximadamente 60º, e
repetindo o que fora realizado anteriormente, mas dessa vez os movimentos da
esquerda para a direita se seguiram até a extremidade oposta, passando novamente
sobre os primeiros 30% que já haviam sido espalhados.
Esta técnica permite a diluição ao longo da placa, sem a necessidade de
utilização dos tubos com a solução tampão. Após a preparação de todas as placas,
elas foram colocadas na incubadora dentro da câmara até apresentarem o
crescimento das colônias.
O método de diluição até a extinção
Equipamentos:
- Incubadora.
Materias:
- Agulhas e seringas;
- Tubos contendo o meio de cultura LTY e inibidores.
Os tubos são identificados e em cada transferência as agulhas e seringas são
trocadas. Do tubo inicial com o inóculo original, é transferido 0,1mL do inóculo ao
tubo de número 1. Então 0,1 mL do tubo 1 é transferido para o tubo 2. Este
procedimento é repetido até o tubo de número 4. Os tubos de número 5 e 6,
receberam 1,1 mL do tubo anterior. Os dois últimos tubos receberam um volume
maior para permitir que algumas células pudessem chegar aos últimos tubos e assim
eles apresentassem uma cultura pura ou mais limpa que os anteriores. E, de fato,
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das 5 amostras, apenas 1 tubo se mostrou livre de contaminação. Os tubos foram
incubados em estufa à 39°C.
Passados dois dias de incubação, observa-se em microscópio a presença ou
não de outras células no tubo, e para confirmar a pureza da cultura, é realizada uma
nova diluição até a extinção com o mesmo formato de diluições, e o tubo com o
maior grau de diluição é selecionado por apresentar a cultura mais pura. Após a
primeira transferência, coloca-se 1 mL do meio de cultura em 1 mL de glicerol em
frasco selado, esterilizado e anaeróbico, com injeção de gás carbônico (CO2) e
congelado em freezer à -80ºC.
O experimento com vacas leiteiras
O experimento teve como foco causar a depressão da gordura do leite em
vacas em lactação dosadas com as cepas 4257 e 5045 de M. elsdenii. Utilizaram-se
9 animais divididos em 3 grupos, sendo um controle e nos outros dois cada grupo
recebeu 1 cepa da M.elsdenii isolada de vacas com depressão da gordura do leite,
as cepas foram isoladas em laboratório sendo que uma delas (cepa 5045) pelo
método da diluição até a extinção e a outra (cepa 4257) utilizando placas de Petri. O
experimento fora realizado na fazenda do Centro de Pesquisas na cidade de Praire
du Sac, Wisconsin.
Antes do início do experimento os animais foram organizados nos 3 grupos, a
ração e as sobras foram pesadas. Os animais foram também ordenhados 3 vezes ao
dia, sendo duas ordenhas pela manhã, e uma pela tarde, e coletadas amostras de
todas as ordenhas desde o período anterior ao experimento até o último dia. As
amostras foram enviadas para a análise da gordura do leite ao laboratório AgSource
Verona, localizado na cidade de Verona, também no estado de Wisconsin.
Previamente ao início da dosagem do experimento, efetuo-se um teste, no
qual, pegou-se um animal e esvazio-se aproximadamente 50% do conteúdo ruminal
verificando-se se a vaca teria algum comportamento como movimentos laterais
indicando desequilíbrio, e também a produção leiteira nos dias que se seguiram.
Não foi identificada nenhuma alteração nem quanto ao desempenho nem na
diferença da quantidade ingerida de alimento. Observou-se que imediatamente após
esvaziar o rúmem parcialmente, a vaca começou a se alimentar.
O experimento foi dividido em 3 partes, a parte anterior a dosagem, a parte de
dosagem e a parte posterior a dosagem.
21
Na parte anterior a dosagem, os animais foram adaptados à uma dieta que
prédispõe os animais a entrarem em depressão. O leite foi analisado todos os dias.
Coletou-se 2 amostras, 4 e 3 dias anteriores ao período de dosagem, da
porção líquida do conteúdo ruminal e também anotado o pH. Nesse mesmo periodo,
separou-se aproximadamente 24 litros de cultura em 3 diferentes galões de vidro,
previamente esterilizados. Um desses galões destinou-se para o grupo controle,
outro recebeu ao dia anterior a dosagem a cepa 4257 e outro a cepa 5045. Cada
galão foi inoculado com 80 mL de inoculo preparado no dia anterior à inoculação
conforme mostrado na tabela 2.
Durante a semana de experimento, os animais dos 3 grupos foram
esvaziados parcialmente, a digesta foi colocada em baldes e pesada
individualmente. Foram coletadas amostras da porção líquida do conteúdo ruminal
imediatamente antes de dosar os animais, bem como o pH. Também retirou-se uma
amostra de líquido ruminal 1 hora após dosar, para permitir que ocorra uma
homogeneização do conteúdo ruminal. Durante a dosagem também se optou por
adicionar uma solução de lactato de sódio (100 g) para fornecer uma fonte inicial de
energia para a bactéria. No dia seguinte à dosagem, foram também coletadas
amostras de líquido ruminal. Todos os animais receberam a mesma quantidade de
lactato, incluindo os do grupo controle.
Tabela 1 - Resumo das atividades realizadas na semana de inoculação da cultura
nos animais
Domingo Segunda-feira
Terça-feira Quarta-feira
Quinta-feira
Sexta-feira Sábado
03/01/2016 04/01/2016 05/01/2016 06/01/2016 07/01/2016 08/01/2016 09/01/2016
Preparação dos galões
inoculação dos frascos
10/01/2016 11/01/2016 12/01/2016 13/01/2016 14/01/2016 15/01/2016 16/01/2016
Inoculação dos galões
Primeira dosagem
Inoculação dos galões
Segunda dosage
Inoculação dos galões
Terceira dosage
Preparação dos galões
Preparação dos galões
Inoculação dos frascos
Inoculação dos frascos
Dosou-se 3 vezes durante a semana do experimento e amostras foram
coletadas entre os dias das dosagens.
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Na terceira parte do experimento também se coletou amostras de líquido
ruminal e pH nos dias 1, 4, 6, 10, 13 e 17 a partir do último dia da terceira
inoculação. As amostras foram guardadas em freezer à -80ºC para futuras análises.
No entanto, nos dias de amostragem, parte delas fora direcionada para análise de
ácidos graxos voláteis. Nessa fase foram feitas as análises de biologia molecular
como extração e purificação de DNA e sequenciamento.
Purificação e extração do DNA
O método aqui utilizado para extração e purificação de DNA está descrito no
trabalho de Weimer e Stevenson (2007), e o protocolo está apresentado a seguir:
- Equipamentos:
o Centrifuga refrigerada;
o Microcentrífuga
o Homogeneizador bead beater;
o Banho-maria;
o Capela de exaustão
o Espectrofotômetro;
o Freezer;
o Refrigerador.
- Materiais:
o Pipetas de precisão;
o Kits de ponteiras para pipetas de precisão;
o Tubos para microcentrífuga;
o Tubos de rosca para microcentrífuga
o Buffer de extração de DNA;
o Microesferas de zircônia;
o Solução de 20% SDS;
o Fenol para DNA;
o Clorofórmio para DNA;
o Álcool 70 recém preparado;
o Isopropanol;
o Acetato de sódio 3M;
o TE;
o TRIS.
23
Para a purificação do DNA, as amostras de liquido ruminal tiveram que ser
descongeladas em água em temperatura ambiente, e transferido aproximadamente
12mL do liquido para tubos de tampa em rosca para centrífuga. Em seguida, as
amostras foram centrifugadas por 25 minutos e numa velocidade de rotação de
8.000g (78.453,2m/s2) e temperatura de 4°C. Após as amostras serem
centrifugadas, a porção liquida é descartada. O pelete é ressuspendido em agitador
do tipo vortex com 3mL de buffer de extração (100mM TRIS/HCl, 10mM EDTA,
0,15M NaCl, com um pH de 8,0). A partir dessa nova mistura, transferiu-se 1000 µL
para tubos de rosca de 2mL para microcentrífuga contendo 0,5g de microesferas de
zirconia. É adicionado 50 µL de uma solução de 20% SDS (Dodecil sulfato de sódio)
e 700µL de fenol para DNA (pH 8,0). Esses tubos são colocados em um
homogeneizador bead beater por 2 minutos, deixados em banho-maria de 60°C por
10 minutos e colocados de volta no homogeneizador por mais 2 minutos. Logo após,
são colocados em uma microcentrífuga por 10 minutos numa velocidade de 12.000
rpm.
Após as amostras serem centrifugadas, a porção sobrenadante,
aproximadamente 1000µL, é transferida com o auxílio de pipetas de precisão e
ponteiras descartáveis para novos tubos de microcentrífuga, desprezando o material
sólido. Após essa primeira etapa, é adicionado 500µL de fenol para DNA. As
amostras devem ser agitadas no agitador tipo vortex por 10 segundos e
imediatamente colocadas na microcentrífuga com a mesma velocidade de rotação
por 10 minutos.
Na segunda extração, é adicionado aproximadamente 700µL do
sobrenadante para tubos novos e 500µL de fenol. Caso não seja possível transferir o
volume proposto, deve-se adicionar mais do buffer de extração, respeitando o
volume máximo de 100µL. As amostras são agitadas novamente e colocadas na
centrifuga, mas desta vez por 5 minutos.
Na terceira extração, retira-se desta vez 650µL da porção sobrenadante, e
adiciona-se 500µL de fenol. Observando se existe a necessidade de adicionar mais
buffer, agitar por 10 segundos e cetrifugar por 5 minutos.
A quarta e quinta extração são semelhantes. Transfere-se 650µL do
sobrenadante, para novos tubos, e adicionado 250µL de fenol para DNA e 250µL de
clorofórmio para DNA, verificando se a necessidade de adicionar mais buffer. Os
tubos são agitados e colocados novamente na centrífuga por 5 minutos.
24
Na sexta extração, retira-se novamente 650µL do sobrenadante e transfere-
se em novos tubos, nessa penúltima etapa é colocado 500µL de clorofórmio para
DNA e buffer se for preciso, as amostras são agitadas no agitador, e centrifugadas
por 5 minutos.
Na sétima e última extração, retira-se 550µL da porção sobrenadante e
adiciona-se 400µL de clorofórmio, caso necessário, adiciona-se mais buffer. Por fim,
agita-se por 10 segundos e centrifugado por 5 minutos. A necessidade de adicionar
o buffer de extração em todas ou quase todas as etapas é em razão de não perder
grande quantidade de DNA na porção líquida, e manter o volume constante.
Após essas 7 etapas, coloca-se a porção sobrenadante em novos tubos, e o
volume retirado é anotado pois necessita-se calcular a quantidade de novos -
reagentes para adicionar no conteúdo retirado. Calcula-se a quantidade de 3M de
acetato de sódio pela fórmula: “volume do sobrenadante x 0,11” também calcula-se
o volume de isopropanol adicionado, pela fórmula “volume do sobrenadante x 0,66”.
A partir desse momento, caso seja observado com atenção pode-se verificar os
filamentos de DNA no líquido. Cuidadosamente o tubo deve ser agitado
manualmente aproximadamente 10 vezes, e colocado na centrifuga mantendo a
velocidade de 12 mil rotações por minuto, mas por um período de 20 minutos.
Após os 20 minutos retiram-se os tubos da centrífuga e no fundo do tubo
observa-se um pélete, o que significa que a extração foi realizada de forma correta,
descarte-se o liquido, e adiciona-se 1000µL de uma solução de álcool 70, e
centrifuga-se por 5 minutos. Descarta-se o liquido, e repete-se o procedimento mas
dessa vez com 500µL de álcool 70. Centrifuga-se por 3 minutos, e descarta-se o
liquido. Os tubos devem permanecer abertos, no entanto protegidos para não
ocorrer contaminação das amostras e permitir que percam umidade. No dia seguinte
adiciona-se 100µL de TE (10mM TRIS/HCl, 1 mM EDTA em pH 8,0) e estoca-se em
freezer -20°C.
Após o final da extração e purificação do DNA, todas as amostras devem ser
quantificadas em um equipamento de fluorometria Qubit 2.0 (ThermoFisher
Scientific, EUA), e os resultados são anotados para posterior diluição das amostras.
Essas amostras devem estar com a mesma concentração para a realização da
identificação das espécies presentes no rúmen.
Como a concentração de cada amostra é diferente, individualmente, elas
necessitaram ser diluídas em TRIS, para todas elas manterem a mesma
25
concentração de 5ng/µL. Após a diluição, as amostras devem ser mantidas
refrigeradas em temperatura de 4°C para posterior preparação do sequenciamento.
Preparação da biblioteca de sequenciamento metagenômico do gene
16S
O gene 16S do DNA ribossômico é utilizado em estudos em uso de
sequenciamento e identificação filogenética em nível de gênero e espécie em
diferentes microrganismos. Esse gene contém aproximadamente 1500 pares de
bases. (Woo et al., 2008)
O protocolo utilizado, foi o protocolo descrito para a utilização do equipamento
Illumina MiSeq System.
A primeira etapa para a preparação é amplificar a área de interesse do DNA
contido nas amostras, para isso utiliza-se dois marcadores genéticos para sinalizar o
trecho a ser amplificado. Para esse processo foram necessários uma placa para
PCR com 96 câmaras de 0,2 mL e dentro de cada câmara se adicionado 2,5µL da
amostra que havia sido diluída para chegar à concentração de 5ng/µL, também foi
adicionado 5µL dos marcadores, primers, de início e 5µL de marcadores, primers, de
conclusão, sendo que ambos na concentração de 1mM. Por fim, se adiciona 12,5µL
de uma solução de buffers, DNA polimerase, nucleotídeos e MgCl2, a solução
utilizada é comercializada com o nome 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix, aqui
sendo utilizado o nome de “Solução KAPA”. Sela-se a placa utilizando-se um
microfilme ‘A’ e o PCR realiza-se em um equipamento de ciclo termal seguindo a
seguinte configuração:
95°C por 3 minutos;
25 ciclos de:
- 95°C por 30 segundos,
- 55°C por 30 segundos,
- 72°C por 30 segundos;
72°C por 5 minutos;
Manter em 4°C.
Retirando-se a placa com as amostras do primeiro PCR, necessita-se realizar
a primeira limpeza, nessa limpeza utiliza-se microesferas magnéticas “AMPure XP”.
Antes de começar o processo de limpeza as esferas devem ser agitadas em agitador
26
do tipo vortez por 30 segundos, e a placa com as amostras devem ser centrifugadas
numa rotação de 1000g por um minuto.
Utilizando uma pipeta multicanal, adiciona-se 20µL da solução de
microesferas em cada compartimento da placa, homogeineizando as amostras na
placa. Repetir em todas as colunas e trocar de ponteiras em cada pipetada. Deixar a
placa descansar em temperatura ambiente por 5 minutos e em seguida colocar ela
em uma plataforma magnética por 2 minutos. Remover e descartar a porção
sobrenadante. Prepara-se uma solução de 80% etanol, e aplicar 200µL em cada
campo, deixa-se descansar por 30 segundos, remove-se e descarta o sobrenadante.
Repete-se o mesmo processo com a solução de etanol, mas, com uma pipeta com
menor capacidade, remover o restante de líquido de cada campo e deixar secando
ao ar por 10 minutos.
Passados os 10 minutos, remove-se a placa da placa magnética e mistura-se
os sólidos com 52,5µL de uma solução TRIS na concentração de 10mM.
Ressuspende-se cuidadosamente as microesferas. Encuba-se em temperatura
ambiente por 2 minutos, recoloca-se a placa na plataforma magnética e aguardar por
2 minutos. Usando-se uma pipeta multicanal, transfere-se 50µL do conteúdo
sobrenatante para uma nova placa para PCR.
A segunda reação de PCR codifica-se cada amostra utilizando-se primers que
irão identificar aquela amostra específica. Na placa utiliza-se um linha com 12
números diferentes e uma coluna com 8 números distintos, sendo assim gera-se
uma combinação de 96 sequências distintas conforme demonstrado na figura 2.
Inicialmente, transfere-se da placa anterior apenas 5µL de cada amostra para
uma nova placa, sendo que a anterior pode ser congelada em freezer a -20°C. Em
cada amostra coloca-se 5µL de um primer representando um número de uma coluna
e 5µL de outro primer representando um número de cada linha, sendo que todas as
amostras que se encontram na mesma coluna recebem o mesmo primer daquela
coluna e as amostras na mesma linha recebem o mesmo número do primer naquela
linha. Adiciona-se também 25µL de solução KAPA e 10µL de água para PCR.
Gentilmente mistura-se cada solução e sela-se com microfilme “A” e centrifuga-se a
placa por um minuto de rotação de 1000g.
27
Figura 2. Disposição dos primers de identificação das amostras
Fonte: Trombetta et al. (2014).
Novamente, o PCR realiza-se em um equipamento de ciclo termal seguindo a
seguinte programação:
95°C por 3 minutos;
8 ciclos de:
- 95°C por 30 segundos,
- 55°C por 30 segundos,
- 72°C por 30 segundos;
72°C por 5 minutos;
Manter em 4°C.
Após o PCR, realiza-se uma nova limpeza utilizando-se as microesferas
magnéticas. Retira-se as amostras do equipamento, centrifuga-se a uma velocidade
de rotação reduzida, 280g por um minuto. Enquanto as amostras são centrifugadas,
o frasco com as microesferas é agitado por 30 segundos no agitador tipo vortex para
dispersão das mesmas. Em seguida adiciona-se 56µL das microesferas em cada
amostra e gentilmente mistura-se. Deixar em repouso em temperatura ambiente por
5 minutos. Então coloca-se a placa na base magnética por 2 minutos. Utiliza-se uma
pipeta multicanal, remove-se e descarta-se o sobrenadante. E adicionar 200µL de
uma solução recentemente preparada de álcool 80%, remove-se o sobrenadante e
adiciona-se novamente 200µL de álcool. Com o auxílio de uma pipeta, remove-se o
restante de líquidos e deixa-se secar ao ar por 10 minutos.
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Após perder a umidade, remove-e a placa da base magnética, e adiciona-se
27,5µL de solução TRIS com concentração de 10 mM em cada amostra mistura-se
delicadamente até ressuspender as microesferas. Deixa-se em repouso por 2
minutos e em seguida coloca-se sobre a placa magnética e aguarda-se 2 minutos.
Utilizando-se uma pipeta multicanal, transfere-se para uma nova placa 25µL de cada
amostra. Essas amostras são mantidas refrigeradas a 4°C para realização da
eletroforese em gel de agarose.
Eletroforese
A eletroforese foi realizada em gel de agarose a 1% utilizando-se o
equipamento Sub-Cell 96 (BioRad, EUA), solução buffer 1x TAE, e gel de agarose.
Para preparar o buffer 50X TAE é necessário 60,5g de TRIS, 14.3mL de ácido
acético glacial, e 25mL de 0,5M de EDTA (pH 8,0), e ajusta-se o volume para
250mL. Para diluir a solução de 50x TAE para 1x basta apenas diluir 5mL de 50x
TAE em 245 mL de água ultrapurificada. Portanto, para uma solução de 3L utilizou-
se 60mL de 50X TAE e dilui-se em 3,94L de água ultrapurificada. No equipamento
de eletroforese fora utilizado aproximadamente 2,5L desse buffer.
Para o gel de agarose fora utilizado 375mL do buffer 1X TAE, 3,75g de
agarose e 37µL. Tudo foi misturado e aquecido até a ebulição e deixado esfriar até
atingir uma temperatura de 60°C. Então, a solução do gel foi derramada dentro da
forma e o pente com a marcação dos compartimentos para colocar as amostras e
deixado refrigerar a 4°C, após 50 minutos, o pente foi removido e o gel junto com o
suporte foi colocado dentro do equipamento de eletroforese. Em seguida,
preencheu-se com o restante do buffer até o gel de agarose ficar completamente
submerso. As amostras provenientes das placas do PCR, foram misturadas em
partes iguais com um marcador molecular, e também utilizou-se um sinalizador
molecular de 100 pares de base para indicar a posição para cortar as regiões
necessárias no gel. As amostras percorrem no sentido ânodo-cátodo (200 V).
Após ocorrer a migração de aproximadamente ¾ das amostras no gel, o gel
foi transferido para uma base com luz ultravioleta, o equipamento utilizado fora o
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator (ThermoFisher, EUA). As bandas
sinalizadas foram cortadas, identificadas, armazenadas e refrigeradas a 4°C. O
procedimento seguinte foi separa o gel do DNA, para isso utilizou-se o protocolo de
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kit de recuperação de DNA Zymoclean (Zymo Research, EUA). Inicialmente, foi
necessário diluir o buffer de limpeza do DNA em etanol 100%.
O primeiro passo após a retirada do DNA refrigerado foi adicionar 3 vezes o
volume de agarose de um buffer específico para dissolver o gel de agarose, sem
prejudicar o DNA, então os tubos foram incubados em temperatura de 37-55°C por
um periodo de 5-10 minutos até o gel estar completamente dissolvido. Em seguida, a
mistura de gel de agarose e de buffer foi transferida para um tubo contendo uma
matriz de sílica no fundo permitindo a passagem da porção líquida, mas filtrando o
DNA. Centrifugado por um minuto e o resíduo foi descartado, em seguida esse DNA
na matriz foi lavado com o buffer de limpeza duas vezes sendo em cada uma dessas
vezes colocado 200µL de buffer e centrifugado em cada uma dessas vezes também
por um minuto. Então, a coluna é colocada em um novo tubo e um buffer de eluição
se adicionado diretamente na matriz e centrifugado por um minuto. O tubo então é
refrigerado. Esse procedimento foi realizado em todas as amostras.
Após a conclusão da separação do DNA dos tubos, se realizou uma nova
quantificação do DNA e o mesmo foi diluído em uma solução de 10mM TRIS pH 8,5
a uma concentração de 4nM em 10µL. Neste momento todas as amostras foram
combinadas sendo 5µL de cada amostra dentro de um novo tubo para
microcentrífuga, após a combinação, foi feita uma nova leitura utilizando-se o
espectrofotômetro para alta sensibilidade, e confirmado ou não a diluição na
concentração desejada, caso contrário, uma nova diluição é realizada até atingir a
concentração adequada e prosseguir com a etapa de sequenciamento.
Sequenciamento metagenômico
Para o sequenciamento, uma série de procedimentos devem ser realizados,
de acordo com o manual de instruções, como uma pré lavagem com Tween 20, duas
vezes. Durante as lavagens o cartucho para a preparação do DNA deve passar por
descongelamento em água, em temperatura ambiente, após descongelado coloca-
se em gelo.
Com a biblioteca das amostras de DNA em concentração de 4nM, novamente
são diluídas a uma concentração de 2nM, e em um tubo é colocado 10µL dessa
mistura e 10µL de 0,2N NaOH e em outro tubo, é colocado 3µL de TRIS 10nM pH
8,5, 5µL 0,2N NaOH e 2µL de 10nM PhiX (adaptador ligante em toda a biblioteca
sinalizado como controle para o sequenciamento). Os dois tubos foram agitados em
30
agitador tipo vortex, e encubados a temperatura ambiente por 5 minutos. Em
seguida, os tubos foram diluidos em buffer de hibridização a chegarem à mesma
concentração de 20ρM.
Ambos os tubos foram diluidos novamente no buffer de hibridização ao atingir
uma concentração de 11ρM. As duas soluções então foram combinadas, sendo
mantido um máximo de 15% da solução de PhiX para evitar a sobreposição das
amostras dificultando a leitura do sequenciador. A mistura então foi colocada em
bloco aquecido a 96°C por 2 minutos e imediatamente após, a amostra foi
conservada em gelo.
Após o descongelamento do cartucho e deixado em repouso no banho de
gelo, ele deve ser agitado cuidadosamente e verificar se todas as posições estão
descongeladas e homogêneas. Com o auxílio de uma ponteira e uma pipeta, o selo
da posição que irá receber a amostra deve ser rompido, e com uma nova ponteira
deve ser carregado 600µL da mistura 85% biblioteca denaturada e 15% PhiX. O
cartucho deve ser colocado novamente em gelo. Trocam-se as luvas para evitar
contaminação, carregado-se uma nova célula de fluxo no equipamento de
sequenciamento, aqui neste trabalho utilizado o Illumina MiSeq, (Illumina, EUA)
Então os reagentes são carregados, e a tabela com as informações de cada
amostra são inseridas no sistema do equipamento e por fim se inicia o
sequenciamento. O perído de sequenciamento das amostras varia de acordo com a
quantidade de amostras, bem como o número de leituras realizadas pelo
equipamento.
Após o período total de leituras, o equipamento determinou através da leitura
da biblioteca, a composição bacteriana de cada amostra. O foco neste estudo foi
apenas analisar a população da bactéria Megasphaera elsdenii.
Como pode-se ser observados nas figuras 3 e 4, O primeiro gráfico, figura 3,
mostra a porcentagem de leituras da população de Megasphaera elsdenii no líquido
ruminal. Nos dias de inocular a bactéria foi coletado o líquido ruminal antes de dosar
a cultura nos animais e também uma hora após a inoculação. É possível observar
um aumento da população logo após as inoculações em todos os dias, com exceção
dos animais 4403, 5009, grupo controle, não apresentaram grandes variações
quanto à presença de Megasphaera elsdenii. No entanto, o que foram encontradas,
são populações nativas, e não foram inoculadas no experimento, como descrito
anteriormente. É possivel observar que após a última inoculação (19/01/16) ocorreu
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um grande aumento da população, mas, nos dias seguintes, a população entrou em
declínio. Ao final do experimento pode-se verificar que a população de M. elsdenii
começou a se estabilizar, e ocorreu um pequeno aumento na poulação em quase
todas as amostras, não sabendo se as populações presentes no rúmen são das
cepas inoculadas, ou da população nativa. No entanto, é possível verificar um
aumento da bactéria. Concomitantemente, é possível observar maiores alterações
quanto à porcentagem de gordura no leite.Weimer et al. (2015) observaram o
mesmo efeito em seu trabalho.
Figura 3. Porcentagem (%) de leituras de Megasphaera elsdenii ao longo do
experimento.
No gráfico seguinte, figura 4, é possível observar uma grande alteração na
porcentagem de gordura no leite após o período de inoculação da bactéria. Os
animais apresentaram uma queda na porcentagem de gordura no leite, não
desmostrado nos animais que estavam no grupo controle. O animal 4257
apresentou uma elevada produção de gordura ao final do seu período no
experimento, pois a vaca apresentou um quadro grave de mastite e por esta ocasião
a produção de leite não era elevada, aumentando o teor de gordura. O animal
precisou ser retirado do experimento. Estudos apontam que um animal é
considerado com depressão da gordura do leite, com porcentagem de gordura
inferior a 3,2%. (Weimer at al, 2015; Weimer at al., 2010). Os animais do grupo
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controle 4403 e 5009 não apresentaram teor de gordura no leite inferior a 3,2%. No
entanto, um terceiro animal, 4273, pertencente ao grupo controle, apresentou um
desempenho diferente, demonstrando que o animal mostrou sintomas da depressão
ao longo do experimento.
Figura 4. Porcentagem (%) de gordura ao longo do periodo do experimento
É possivel observar que 4273, foi o animal que permaneceu na area inferior a
3,2% de gordura no leite por mais tempo. Logo após a primeira dosagem, o animal
apresentou uma grande queda na produção da gordura, e apresentou dificuldades
para a recuperação ao longo do experimento, sendo assim, até o último dia, o
animal ainda não havia saido da área inferior a 3,2%, sugerindo que o animal
mostrou queda na gordura do leite com a cepa presente ali anteriormente, ou seja,
com sua própria comunidade microbiana. Os animais do grupo 1 (4257, 4294, 5298)
que receberam a cepa 4257, apresentaram um teor de gordura inferior as 3,2%,
ainda como particulari-dade o animal 5298, que apresentou uma maior dificuldade
para sair da região inferior a 3,2%. Pode-se afirmar que este animal, manteve o
número elevado na população de M.e. no rúmen, sugerindo que a população se
fixou, mas ao longo do tempo, o animal se recuperou, mas a população da bactéria
mostrou um crescimento no final do experimento.
Os animais do grupo 2 (4281, 4282, 5053) que receberam a cepa 5045
apresentaram pouca ou nenhuma interferência na redução da porcentagem de
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gordura no leite, e se recuperaram rapidamente. É possivel observar que a
porcentagem de gordura do leite ao final do experimento mostrou pouca variação a
partir do momento que o perfil de Megasphaera elsdenii. tornou-se ao que era
aproximadamente o mesmo ao início do experimento.
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6. CONCLUSÕES
Como conclusão verificou que a utilização de técnicas de biologia molecular e
microbiologia é possivel afirmar que ao inocular grandes quantidades de bactérias
no rúmen existem certas alterações na comunidade ruminal e também efeitos que
estão associados à resposta do animal. Porém, não se pode afirmar que a
Megasphaera elsdenii é o agente causador da depressão da gordura do leite, e
também é necessário avaliar a característica das cepas. Estudos devem ser
realizados para verificar se as cepas testadas e outras a serem isoladas realizam a
bio-hidrogenação do ácido linoléico e causam a depressão da gordura do leite.
35
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Estagiar em um país estrangeiro não traz apenas o aperfeiçoamento de uma
língua, mas uma imersão em costumes, culturas e filosofia de vida bem como
comportamentos sociais, tanto na relação interpessoal como também em res-
significação do modo de viver, pensar e agir.
A experiência de estagiar nos Estados Unidos da América, mais precisamente
no US Dairy Forage Research Center em Madison, trouxe um suporte técnico para a
pesquisa brasileira, e uma atualização dos conhecimentos adquiridos quanto a
microbiologia ruminal, e a aplicabilidade de um zootecnista na pesquisa para
compreender melhor a vida microbiana, especialmente no conhecimento global das
diferentes particularidades dos ruminantes, aqui neste trabalho, o objeto de estudo
os bovinos leiteiros. Além de melhorar as habilidades técnicas em laboratório,
percebeu-se que muitas vezes, não se deve seguir precisamente um manual ou um
protocolo, principalmente enquanto realizando pipetagens, ou a quantidade de buffer
a adicionar numa determinada amostra para manter o volume em uma quantidade
adequada, ou esperar alguns minutos a mais ou a menos. A sensibilidade e a
racionalidade andam juntos na pesquisa. Seguir um manual ou um protocolo com
extrema perfeição pode gerar também baixos resultados.
Quanto ao trabalho com os animais, também a sensibilidade e o cuidado,
devem ser respeitados, sempre se levando em consideração o bem-estar aprendido
e também sempre citado por todos os professores, independente da disciplina
ministrada. Todos sempre falavam do bem-estar animal, de como se aproximar dele,
ambiência, tonalidade da voz, olhares e toque. Apesar de todos os animais estarem
acostumados com seres humanos por perto, dois desses animais não permitiram a
aproximação de um dos investigadores, demonstrando claros sinais de atenção, e
estranhamento, sendo assim a melhor decisão seria afastar imediatamente do
animal e permitir que outro investigador realizasse os devidos procedimentos de
amostragem.
36
Trabalhar com técnicas de próxima geração de sequenciamento de DNA,
abriu novas portas para trazer ao Brasil, uma nova técnica de investigação de
presença e abundância de espécies descritas na literatura e ainda desconhecidas,
sendo assim, pode-se gerar um conhecimento mais rápido e de melhor qualidade da
comunidade microbiana presente no rúmen.
Por fim, o estágio proporcionou um reconhecimento global de que as áreas de
diferentes ciências se comunicam, não deixando uma área em específico com maior
importância ou menor, cabe a nós utilizarmos de ferramentas que enriqueça a
pesquisa, na qual é um ponto a ser constantemente melhorado na vida acadêmica,
profissional e pessoal, a sociabilidade humana se mostra complementar e funda-
mental para a união de diferentes ciências e modos de pensar.
Concluo ressaltando que o estágio final trouxe uma interdisciplinaridade
singular, trazendo disciplinas como bovinocultura leiteira, comunicação e expressão
oral, antropologia, microbiologia, as disciplinas de base como química, e bioquímica,
nutrição de ruminantes, anatomia, fisiologia, comportamento e bem-estar animal,
bioclimatologia e também sociologia e extensão rural, e assim, definindo e
moldando o zootecnista que agora estou me tornando.
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REFERÊNCIAS
BAUMAN, D.E. & GRIINARI, J.M. Nutritional regulation of milk fat synthesis. AnnuRev Nutr. v. 23, p.203–227. 2003. BROCK, T. D. Biology of microorganisms. Prentice-Hall, Inc. Englewood Cliffs, EUA. 1970. CONNOR, W.E. Importance of n–3 fatty acids in health and disease. The American Journal of Clinical Nutrition v.71, p.171–175. 2000. COUNOTTE, G. H. M. & R. A. PRINS. Regulation of lactate metabolism in the rumen. Veterinary Research Communications.v.5, p.101–115. 1981. COUNOTTE, G. H. M., PRINS, R. A., JANSSEN, R. H. A. M., & DEBIE, M. J. A. Role of Megasphaera elsdenii in the fermentation of dl-[2-13C]lactate in the rumen of dairy cattle. Applied and Environmental Microbiology, v.42, n.4, p.649–655, 1981. DAVES, C. L. Acetate Production in the Rumen of Cows Fed Either Control or Low Fiber, High-Grain Diets. Journal of Dairy Science. v.50, n.10. p.1621-1625, 1967 ELSDEN, S. R. & LEWIS, D. The production of fatty acids by a gram-negative coccus. Biochemical Journal. v. 55, n. 1, p.183-189, 1953. ELSDEN, S. R., VOLCANI, B. E., GILCHRIST, F. M. C., LEWIS D. Properties of a fatty acid forming organism isolated from the rumen of sheep. Journal of Bacteriology. v. 72, n. 5, p.681-689. 1956. GENESIS, 1,1-31. The jerusalem bible. Doubleday & Company, Inc. Nova Iorque, 1968. GORDON, G. L. R., & PHILLIPS, M. W. The role of anaerobic gut fungi in the ruminants. Nutrition research reviews. v.8, p.133-168, 1998. GUTIERREZ, J., DAVIS, R. E., LINDAHL, I. L., WARWICK, E. J. Bacterial changes in the rumen during the onset of feed-lot bloat of cattle and characteristics of Peptostreptococcus elsdenii n. sp. Applied Microbiology. v. 7, n. 1, p.16-22, 1959. HUBBLE, E. Proceedings of the National Academy of Sciences. v.15 p168-173, 1929. HUNGATE, R. E. The rumen and its microbes. Academic Press Inc, Londres, 1966. KIM, Y. J., LIU, R.H., RYCHLIK J.L., RUSSELL, J. B. The enrichment of a ruminal bacterium (Megasphaera elsdenii YJ-4) that produces the trans-10, cis-12 isomer of conjugated linoleic acid. Journal of Applied Microbiology.. v.92, p.976-982, 2002.
38
KUIPER G P. On the origin of the solar system. Proceedings of the National Academy of Sciences. v.37, n.1, p.1-14, 1951. LAL, A. K. Origin of life. Astrophisics and Space Science. v.317, n.3, p.267-278, 2008. LANIER, J. S., & CORL, B. A. Challenges in enriching milk fat with polyunsaturated fatty acids. Journal of Animal Science and Biotechnology, v.6, n.1, 2015. LEVITICUS, 11, 3. The jerusalem bible. Doubleday & Company, Inc. Nova Iorque, 1968. LOCK, A.L., & BAUMAN, D.E. Modifying milk fat composition of dairy cows to enhance fatty acids beneficial to human health. Lipids v.39, p.1197–1206. 2004. LOFTUS, R.T., MACHUGH, D.E., BRADLEY, D.G., SHARP, P.M., CUNNINGHAM P. Evidence for two independent domestications of cattle. Proceedings of the National Academy of Sciences. v.91, n.7, p.2757-2761, 1994. MAIA, M.R., CHAUDHARY, L.C., FIGUERES, L., WALLACE, R.J. Metabolism of polyunsaturated fatty acids and their toxicity to the microflora of the rumen. Antonie van Leeuwenhoek.v.91, p.303–314, 2007. MAROUNEK, M., FLIEGROVA, K. & BARTOS, S. Metabolism and some characteristics of ruminal strains of Megasphaera elsdenii. Applied and Environmental Microbiology. v. 55, n. 6, p.1570-1573. 1989. MORAN, J. Tropical dairy farming: feeding management for small holder dairy farmers in the humid tropics. Landlinks Press, 2005 MORGAVI, D.P., FORANO, E., MARTIN, C. & NEWBOLD, C. J. Microbial ecosystem and methanogenesis in ruminants. Animal. v.4, n.7, p.1024-1036, 2010 ORPIN, C. G. The role of ciliate protozoa and fungi in the rumen digestion of plant
cell walls. Animal Feed Science and Technology. V. 10, n.2-3, p.121-143, 1984.
ROGOSA M., Transfer of Peptostreptococcus elsdenii Gutierrez et al. to a new genus, Megasphaera (M. elsdenii (Gutierrez et al.) comb. nov.). International Journal of Systematic and Evolutionary Bacteriology. v. 21, n. 2, p.187 – 189, 1971. RUSSELL, J. B. Rumen microbiology and its role in ruminant nutrition. Ithaca, EUA. 2002. RUSSELL, J. B., COTTA, M. A. & DOMBROWSKI, D. B. Rumen Bacterial Competition in Continuous Culture: Streptococcus bovis Versus Megasphaera elsdenii. Applied And Environmental Microbiology. V. 41, n. 6, p.1394-1399, 1981
39
SÆBØ,A., SÆBØ, P., GRIINARI, J. M. & SHINGFIELD, K.J. Effect of abomasal infusion of geometric isomers of 10,12 conjugated linoleic acid on milk fat synthesis in dairy cows. Lipids. v.40, p 823–832, 2005. SCOTT, H. W., & DEHORITY, B. A.. Vitamin requirements of several cellulolytic rumen bacteria. Journal of Bacteriology. v.89, n.5, p.1169–1175,1965. STORRY, J.E. & SUTTON, J. D. The effect of change from low-roughage to high-roughage diets on rumen fermentation blood composition and milk fat secretion in the cow. British Journal of Nutrition. V.23 p 511-521, 1969. TROMBETTA, J.J., GENNERT, D., LU, D., SATIJA, R., SHALEK, A.K. & REGEV, A. Preparation of single-cell RNA-seq libraries for next generation sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. v.107, p.4.22.1–4.22.17, 2014. TURNER, M. S. Origin of the Universe. Scientific American. V.22, p.36-43, 2013. WEIMER, P.J., CABRAL, L. S., CACITE, F. Effects of ruminal dosing of Holstein cows with Megasphaera elsdenii on milk fat production, ruminal chemistry, and bacterial strain persistence. Journal of Dairy Science, v. 98, p. 8078-8092, 2015. WEIMER, P. J. & MOEN, G. N.. Quantitative analysis of growth and volatile fatty acid production by the anaerobic ruminal bacterium Megasphaera elsdenii T81. Applied Microbiology and Biotechnology . v.97, n.9, p. 4075-4081, 2013. WEIMER, P.J. & STEVENSON, D.M. Dominance of Prevotella and low abundance of classical ruminal bacterial species in the bovine rumen revealed by relative quantification real-time PCR. Applied Microbiology and Biotechnology. v.75, n.1, p. 165-174, 2007. WEIMER, P.J., STEVENSON, D.M. & MERTENS, D.R. Shifts in bacterial community composition in the rumen of lactating dairy cows under milk fat-depressing conditions Journal of Dairy Science. v.93, p. 265–278, 2010. WILSON, E. O., EISNER, T., BRIGGS, W. R., DICKERSON, R. E., METZENBERG, R. I., O’BRIEN, R. D., SUSMAN, M. & BOGGS, W. E., Life on earth. Sinauer Associates, INC. Sunderland, EUA, 1978. WOO, P.C., LAU, S.K., TENG, J.L., TSE, H. & YUEN, K.Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection.v.14, n.10, p. 908–934, 2008.