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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
ESTUDOS FUNCIONAIS DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO
ENVOLVIDOS NA INTERAÇÃO Theobroma cacao - Moniliophthora
perniciosa
DAYANNE SILVA MONTEIRO DE ALMEIDA
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Julho de 2016
DAYANNE SILVA MONTEIRO DE ALMEIDA
ESTUDOS FUNCIONAIS DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO ENVOLVIDOS
NA INTERAÇÃO Theobroma cacao - Moniliophthora perniciosa
Tese apresentada à Universidade Estadual
de Santa Cruz, como parte das exigências
para obtenção do título de Doutor em
Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética Molecular
e de Micro-organismos
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Julho de 2016
DAYANNE SILVA MONTEIRO DE ALMEIDA
ESTUDOS FUNCIONAIS DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO ENVOLVIDOS
NA INTERAÇÃO Theobroma cacao - Moniliophthora perniciosa
Tese apresentada à Universidade Estadual
de Santa Cruz, como parte das exigências
para obtenção do título de Doutor em
Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética Molecular
e de Micro-organismos
APROVADA: 29 de julho de 2016
Dra. . Kaleandra Freitas Sena Dra. Janisete Gomes da Silva Miller
(Instituto Biofábrica de Cacau) (UESC)
Dra. Sara Pereira Menezes Dra. Tahise Magalhães de Oliveira
(UESC) (UESC)
Dra. Fabienne Micheli
(CIRAD/UESC - orientadora)
“Apesar dos nossos defeitos, precisamos
enxergar que somos pérolas únicas no teatro da vida e entender que não existem pessoas de sucesso e pessoas fracassadas. O que existem são pessoas que lutam pelos seus sonhos ou desistem deles.”
(Augusto Jorge Cury)
DEDICO:
Aos meus pais, Christovaldo e Cosmélia, por me
ensinarem os valores mais sublimes da vida, por toda a
dedicação e amor, por estarem sempre ao meu lado
em momentos de alegrias e tristezas, de dúvidas e
incertezas, nas minhas lutas, derrotas e conquistas.
Obrigada por tudo que fizeram e fazem por mim.
Obrigada por me incentivarem e acreditarem em mim.
Ao meu filho Enzo, por me fazer tão feliz e realizada,
por estar comigo tão grudadinho. Por ser a pessoinha
responsável pela minha força de vontade e coragem
para vencer os desafios e meus próprios medos, por
sorrir comigo nos momentos felizes, enxugar minhas
lágrimas e chorar comigo nos momentos de tristeza.
Enfim, por participar de cada minuto da minha vida.
Ao meu irmão Danillo, pessoa que admiro e me inspiro
pela sua determinação e garra. Sempre me apoiando e
incentivando em tudo que faço. Obrigada.
Amo vocês.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pelas bênçãos recebidas, objetivos alcançados e
por me dar forças nos momentos mais difíceis da minha vida.
À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), à coordenação e aos
funcionários do Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia
Molecular, pelas condições de trabalho proporcionadas e presteza de todos.
À FAPESB, pela concessão da bolsa e financiamento do projeto,
proporcionando condições financeiras para o desenvolvimento do meu trabalho
e formação profissional.
À minha orientadora Fabienne Micheli, pela oportunidade, orientação,
dedicação, preocupação, paciência, pelos ensinamentos passados, por
acreditar na minha capacidade e muitas vezes me ajudar a vencer minhas
inseguranças e medos, por me ensinar a crescer. Toda a minha admiração e
gratidão a você.
Ao meu co-orientador e amigo Daniel Amaral pela amizade, dedicação,
incentivo, disponibilidade, ajuda e contribuição do começo ao fim do meu
trabalho. Por compartilhar dos momentos de dificuldades e vitórias, pelos
conselhos, pelo convívio e, principalmente, por poder contar sempre com ele
tanto na vida profissional quanto pessoal.
À minha co-orientadora Karina Gramacho, sempre muito prestativa
comigo, por dar suporte e apoio aos experimentos realizados na CEPLAC.
Ao Doutor Luís Eduardo Del Bem, da Unicamp, pelos ensinamentos na
Bioinformática, apoio e contribuição com meu trabalho.
Ao Doutor Michel Vicentz, pela parceria e apoio no trabalho realizado na
Unicamp.
À família Biomol, pela amizade, pela troca de ensinamentos dos nossos
trabalhos, que contribuíram para meu conhecimento científico e por todo nosso
convívio e união durante esse tempo.
Às minhas amigas Joise Hander, Jamilly Azevedo, Aurizângela, Lu
Camilo, Sara Menezes, Fabi, Tahise Magalhães, Laís Freire, Ákyla Maria,
Jacque, Monique e amigos Allan Pereira, Lucas, Raner José, Edson e Horley
pela amizade, confiança, por participarem das horas alegres e também das
horas de sufoco, sempre dispostos a me ajudar nos momentos em que precisei
e pelos ensinamentos compartilhados por todos eles.
Aos alunos de iniciação científica Emilly, Amanda e Patrick por
participarem e ajudarem em algum momento do meu trabalho, principalmente a
Emilly, por ter passado mais tempo me apoiando e aprendendo em cada
experimento realizado.
Aos colegas do laboratório do Fitomol da CEPLAC / CEPEC / SEFIT,
dentre eles Louise, Yaska, Kaleandra, Rodrigo que me ajudaram nos
experimentos de inoculação. Ao técnico e trabalhadores da casa de vegetação,
por auxiliarem nos experimentos realizados.
A todos da minha família que torceram, oraram, vibraram e me apoiaram
nas conquistas e graças alcançadas.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram nessa minha
caminhada e conquista.
ÍNDICE
EXTRATO ........................................................................................................ i
ABSTRACT .................................................................................................... iii
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................... iv
INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................... 3
2.1 Cacau: origem e importância da matéria-prima do chocolate .................. 3
2.2 Moniliophthora perniciosa: o patógeno que devastou a cacauicultura .... 7
2.3 Hormônios vegetais envolvidos na interação planta-patógeno e mecanismos de defesa da planta ................................................................. 11
2.4 Fatores de transcrição : reguladores da expressão gênica em todos os organismos................................................................................................... 15
2.4.1 Fatores de transcrição da família bZIP ......................................... 17
2.4.2 Fatores de transcrição da família WRKY ...................................... 19
CAPÍTULO 1: Análise in silico de fatores de transcrição de Theobroma
cacao: enfoque na familia bZIP .................................................................... 23
CAPÍTULO 2: Genome-wide identification and characterization of cacao WRKY transcription factors and analysis of their expression in response to witches’ broom disease ................................................................................ 46
OUTRAS ANÁLISES: Análise do promotor bZIP por transformação genética de plantas ...................................................................................... 90
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS ............................................ 107
i
EXTRATO
ALMEIDA, Dayanne S, M, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus - Bahia
julho de 2016. Estudos funcionais de fatores de transcrição envolvidos na
interação Theobroma cacao - Moniliophthora perniciosa. Orientadora: Dra
Fabienne Micheli (CIRAD/UESC). Co-orientadores: Daniel Oliveira Jordão do
Amaral (UESC) e Karina Peres Gramacho (CEPLAC).
As plantas respondem aos estresses bióticos e abióticos por modulações
transcricionais. Os fatores de transcrição (FTs) são os responsáveis por
regularem os genes de resposta a estresses, seja ativando ou reprimindo sua
expressão. Essas variações ambientais causam grandes perdas sobre plantas
economicamente importantes. Com a chegada do fungo Moniliophthora
perniciosa no município de Uruçuca em 1989, causador da vassoura-de-bruxa,
as plantações de Theobroma cacao sofreram drásticas quedas na sua
produção principalmente na Bahia, maior produtor do Brasil. No entanto,
algumas variedades, espécies ou gêneros de plantas possuem uma maior
tolerância a estresses do que outras. Alterações evolutivas tem promovido a
adaptação destas plantas às condições adversas ao longo do tempo. Esta
variação entre plantas é regulada por uma ampla e complexa rede de
comunicação entre os fatores de transcrição e os hormônios vegetais.
Moléculas sinalizadoras captam os estímulos externos e são responsáveis por
desencadear uma cascata de eventos envolvidos na defesa da planta. Entre
esses genes estão os FTs das famílias WRKY, ERF, NAC, MADS e bZIP. Esse
trabalho teve como objetivo a caracterização e o estudo funcional de famílias
de FTs potencialmente envolvidos na interação do cacau-M. perniciosa. Para
isso, 1923 sequências de FTs de Arabidopsis thaliana foram alinhadas e
comparadas ao banco de dados do CIRAD e assim foram obtidas 1978 FTs
distribuídos em todos os cromossomos do genoma do cacau. Com esta
análise, 61 membros pertencentes à família WRKY e 59 bZIPs foram obtidos e
ii
classificados em 3 e 13 grupos de acordo com seus motivos conservados,
respectivamente. Para compreender o processo evolutivo destas duas famílias,
análises de regiões sintênicas e filogenia molecular entre cacau e outras
espécies foram realizadas. Dezenove genes bZIP demonstraram ter se
originado de eventos de duplicação de genes, sendo que o gene
Tc01_g005580 apresentou dois eventos . Para a família WRKY, foram vinte e
quatro genes oriundos por duplicação, sendo que os genes Tc01_g035330,
Tc01_g034680 participaram de dois eventos durante a evolução da família no
cacau. De acordo com a análise filogenética, sete genes potencialmente
envolvidos na resposta à infecção fúngica foram escolhidos e suas expressões
analisadas por RT-qPCR após as plântulas serem infectadas com o fungo M.
perniciosa. Os genes de FTs da família WRKY em estudo apresentaram tanto
funções de ativadores quanto de repressores transcricionais nessa interação
específica, dependendo do tempo de infecção e variedades contrastantes
analisadas. Alguns genes WRKY em cacau apresentaram respostas ao M.
perniciosa e podem estar associados ao balanço dos hormônios ácido
salicílico/ ácido jasmônico. Em outra análise, foi construído um cassete de
expressão constituído pelo promotor do gene Tc02_g006520 (bZIP) dirigindo a
síntese do gene repórter GUS no vetor pCAMBIA1381Z e confirmada sua
transformação em planta. Portanto, nossos resultados possui relevância para a
compreensão da relação estrutural, evolutiva e funcional dos genes FTs
responsáveis pela regulação da maquinaria envolvida na defesa, tolerância e
adaptação das plantas. Nosso trabalho é pioneiro na caracterização de famílias
de FTs de Theobroma cacao e pode ajudar a selecionar outros candidatos para
estudos funcionais de genes que possam contribuir para compreender melhor a
complexa rede transcricional e que possam auxiliar no melhoramento genético
de plantas.
Palavras-chaves: regulação transcricional, filogenia molecular, WRKY, bZIP,
duplicação de genes.
iii
ABSTRACT
ALMEIDA, Dayanne S, M. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus - Bahia
july de 2016. Functional studies of transcription factors involved in the
interaction Theobroma cacao – Moniliophthora perniciosa. Adviser: Dra
Fabienne Micheli (CIRAD/UESC). Co-advisers: Daniel Oliveira Jordão do
Amaral (UESC) e Karina Peres Gramacho (CEPLAC).
Plants respond to biotic and abiotic stress by transcriptional modulations.
Transcription factors (TFs) are responsible for regulating the stress response
genes, either activating or repressing their expression. These environmental
changes cause large losses for economically important plants. With the arrival
of the fungus Moniliophthora perniciosa in the city of Uruçuca in 1989, which
caused the witche’s broom, the plantations of Theobroma cacao suffered
drastic drops in its production mainly in Bahia, the largest producer in Brazil.
However, some varieties, species or genera of plants have more tolerance to
stresses than others. Evolutionary changes have promoted the adaptation of
these plants to adverse conditions over time. This variation between plants is
regulated by a large and complex network of communication between
transcription factors and plant hormones. Signaling molecules capture the
external stimuli and are responsible for triggering a cascade of events involved
in plant defense. Among these genes are TFs of WRKY, ERF, NAC, MADS and
bZIP families. This work aimed at the characterization and functional study of
TFs families potentially involved in the interaction of cocoa-M. perniciosa. To
this, 1923 sequences FTs of Arabidopsis thaliana were aligned to the CIRAD
database and thus 1978 FTs were distributed across all the chromosomes of
the cacao genome. With this analysis, 61 WRKY family members belonging and
59 bZIPs were obtained and classified into 3 and 13 groups according to their
conserved motifs, respectively. To understand the evolutionary process of these
two families, analysis of syntenic regions and molecular phylogeny of cacao and
iv
other species were performed. Nineteen genes bZIP shown to have originated
from gene duplication events, and the Tc01_g005580 gene exhibiting two
events. For WRKY family, there were twenty-four genes originated by
duplication, with the genes Tc01_g035330, Tc01_g034680 participating in two
events during the evolution of the family in cacao. According to phylogenetic
analysis, seven genes potentially involved in the response to fungal infection
were selected and their expression analyzed by RT-qPCR after the seedlings
were infected with the fungus M. perniciosa. The TFs genes of the WRKY family
under study showed activating and transcriptional repressor functions in this
specific interaction, depending on the time of infection and the contrasting
varieties analyzed. Some WRKY genes in cacao showed responses to M.
perniciosa and may be associated with the balance of the salicylic acid /
jasmonic acid hormones. In another analysis, an expression cassette was built
consisting of the promoter of the gene Tc02_g006520 (bZIP) directing the
synthesis of the GUS reporter gene in pCAMBIA1381Z vector and confirmed its
transformation plant. Therefore, our results have relevance for the
understanding the structural, evolutionary and functional relationships of the
FTs genes responsible for the regulation of the machinery involved in the
defense, tolerance and adaptation of plants. Our work is a pioneer in
characterizing TFs families in Theobroma cacao and may help select other
candidates for functional studies of genes that can contribute to better
understand the complex transcriptional network that can aid in the genetic
improvement of plants.
Keywords: transcriptional regulation, molecular phylogeny, WRKY, bZIP, gene
duplication.
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Frutos das variedades pioneiras cultivadas de cacau: Crioulo, Forasteiro e Trinitário, no qual deu origem outras variedades genéticas da espécie. (Fotos: http://www.marscacau.com.br/) ................................................ 4
Figura 2. Plântulas de T. cacao L. mantidas em casa de vegetação. A. Variedade Catongo (suscetível à M. perniciosa). B. Variedade TSH1188 (resistente à M. perniciosa). ............................................................................... 7
Figura 3. Processo de infecção do fungo M. perniciosa no cacau (Modificado de Sena et al, 2014). ............................................................................................. 10
1
INTRODUÇÃO
O Theobroma cacao L., pertencente à família Malvaceae, é uma espécie
economicamente importante pois é a matéria-prima para o chocolate, alimento
de consumo em todo o mundo (SANTOS FILHO, 2008). No entanto, assim
como outras culturas, suas plantações são ameaçadas por inúmeros
patógenos, como Ceratocystis cacaofunesta, espécies do gênero
Phytophthora, Moniliophthora roreri e Moniliophthora perniciosa. O Brasil
durante a década de 80 destacou-se com a produtividade de cacau, sendo
considerado o primeiro maior produtor do continente americano e segundo
entre os produtores mundiais. Entretanto, a partir dos anos 90 com a chegada
do fungo M. perniciosa, causador da vassoura-de-bruxa, às plantações do
Estado da Bahia, a produção no país declinou acentuadamente, pois o Estado
era responsável por cerca de 95% da produção (ALVIM; NAIR, 1986; AIME;
PHILLIPS-MORA, 2005).
Por ser um fungo hemibiotrófico, M. perniciosa possui um ciclo de vida
com duas fases distintas: uma fase biotrófica e outra necrotrófica. Na fase
biotrófica, o fungo possui hifas monocarióticas que crescem entre as células e
devido à sua presença na planta, um desbalanço hormonal é desencadeado
(KILARU, A.; BAILEY, B. A.; HASENSTEIN, K. H., 2007; SENA; ALEMANNO;
GRAMACHO, 2014). Esse desbalanço causa sintomas característicos como
hipertrofia dos tecidos infectados, perda de dominância apical e proliferação de
brotos axilares, resultando em ramos anormais chamados de “vassouras
verdes” (GRIFFITH et al., 2003; KILARU, A.; BAILEY, B. A.; HASENSTEIN, K.
H., 2007; SENA; ALEMANNO; GRAMACHO, 2014). A partir daí o fungo passa
a crescer intracelularmente, causando necrose e morte dos tecidos infectados,
formando assim a “vassoura seca” (EVANS, 1980; SCARPARI et al., 2005).
Após esse período, ocorre a formação dos basidiocarpos nos tecidos
necrosados, produção e liberação dos esporos que irão infectar outras plantas,
reiniciando o ciclo (EVANS, 1981; LAWRENCE; CAMPÊLO; FIGUEIREDO,
1991). As plantas para sobreviverem ao ataque de patógenos e/ou a um
ambiente com condições desfavoráveis como seca, salinidade, temperaturas
2
extremas entre outros fatores, foram selecionadas durante a evolução, no qual
mecanismos de defesa e tolerância a essas condições adversas foram sendo
fixadas. Diversos genes são induzidos em resposta a estresses, codificando
proteínas reguladoras como, por exemplo, proteínas quinases, fosfatases e
fatores de transcrição envolvidos na adaptação, sobrevivência e reprodução
das plantas (NAKAMINAMI et al., 2012; SORNARAJ et al., 2016). Os fatores de
transcrição (FTs) regulam a expressão de muitos genes envolvidos na
germinação de sementes, crescimento, desenvolvimento da planta, bem como
na participação em diferentes vias de defesa e adaptação a estresses bióticos
e abióticos (RIAÑO-PACHÓN, D. et al., 2007; KHONG, G. N. et al., 2008).
Dessa maneira, ocorre uma reprogramação transcricional na planta quando
esta é submetida a um estresse. Durante o ataque de um patógeno, por
exemplo, acontece uma modulação da expressão, mudanças nos padrões dos
FTs e nas atividades dos produtos gênicos que contribuem para a ativação de
inúmeras vias de sinalização e defesa (TAJ et al., 2014; TEIXEIRA et al.,
2014).
Muitos trabalhos vêm sendo realizados na tentativa de compreender os
processos fisiológicos e moleculares durante a interação cacau-M. perniciosa,
na tentativa de buscar alternativas de manejo e controle da doença. GESTEIRA
et al. (2007a) analisaram os genes expressos em meristemas de cacau
infectado pelo fungo da vassoura–de-bruxa de genótipos contrastantes.
TEIXEIRA et al. (2014) exploraram os mecanismos moleculares na doença
vassoura-de-bruxa durante sua fase biotrófica, buscando os genes envolvidos
nesses mecanismos. Nestes dois trabalhos, vários grupos de fatores de
transcrição, como WRKY, bZIP, MYB e EREB/ AP2 estiveram presentes,
envolvidos na regulação da defesa da planta infectada por patógenos e de
outros processos biológicos. Portanto, nesse trabalho foi realizada uma análise
das famílias de fatores de transcrição reguladores, presentes no genoma do
cacau. Duas famílias de FTs, bZIP e WRKY, foram escolhidas para um maior
aprofundamento, sendo realizada a caracterização e filogenia dessas famílias,
assim como o estudo de expressão gênica de alguns genes candidatos WRKY
envolvidos na interação cacau-M. perniciosa, possivelmente desempenhando
papéis importantes na suscetibilidade e resistência da planta ao fungo.
3
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Cacau: origem e importância da matéria-prima do chocolate
O cacau é uma espécie originada da floresta Amazônica na América do
Sul, de porte arbóreo e pertencente à família Malvaceae (ALVERSON et al.,
1999). Seu primeiro nome foi Amygdalae pecuniariae, que significa “amêndoa-
dinheiro”, por ter sido durante muito tempo usado como moeda de intercâmbio.
Entretanto, o sueco Carolus Linnaeus fez a primeira classificação botânica da
espécie e a nomeou como Theobroma cacao, significando “cacau, alimento dos
deuses” (VALENZUELA B, 2007). No gênero Theobroma são conhecidas 22
espécies, mas Theobroma cacao é a espécie mais explorada economicamente
tendo suas amêndoas como o principal produto comercial e de matéria-prima
para a produção de chocolate e derivados (SODRÉ, 2007; SANTOS FILHO,
2008). Das amêndoas também são extraídas a manteiga de cacau, utilizada
em cosméticos e remédios, além da torta e do pó, que são usados na
fabricação de doces, massas e do chocolate. A polpa do cacau é utilizada na
fabricação de suco, licor, vinho, geleia e vinagre (SILVA NETO, 1999).
Domesticada há mais de 2000 anos pelos povos mesoamericanos, o
cacau da variedade Crioulo, foi uma das primeiras variedades a serem
cultivadas. Esta produzia um chocolate fino de alta qualidade, porém de baixo
potencial agronômico e suscetível a várias pragas. Seu cultivo aumentou e se
espalhou em toda a América Central e do Sul, devido ao aumento do consumo
na Europa depois da colonização espanhola (MOTAMAYOR et al., 2003). Dois
grupos morfogeográficos de Theobroma cacao são descritos no trabalho de
CHEESMAN (1944), o Crioulo e o Forasteiro. Mais tarde, foi proposto um
terceiro grupo, o Trinitário, como sendo um híbrido entre o cruzamento do
Crioulo e Forasteiro, sendo mais produtivo e mais resistente a doenças. O
cacaueiro aos poucos foi sendo plantado em outras regiões de climas tropicais
4
e se expandindo pelo mundo, ganhando cada vez mais valor econômico. A
maioria do cacau introduzido na Ásia e África faz parte dos grupos de
variedades Crioulo, Amelonado Forasteiro e Trinitário (Figura 1), originados da
Venezuela, Brasil e Trinidad, respectivamente (MOTAMAYOR et al., 2003). O
cacau se adaptou muito bem àquelas regiões, sendo aqueles continentes os
maiores produtores do mundo há muitos anos.
Figura 1. Frutos das variedades pioneiras cultivadas de cacau: Crioulo, Forasteiro e Trinitário, no qual
deu origem outras variedades genéticas da espécie. (Fotos: http://www.marscacau.com.br/)
No Brasil, os índios iniciaram o cultivo do cacau e mais tarde os
colonizadores em suas propriedades. Mas, somente no ano de 1679 depois da
autorização através da Carta Régia foi que oficialmente ficou registrado o
cultivo do cacau. Na Bahia, o cacau foi introduzido somente em 1746 por
Antônio Dias que recebeu amêndoas do Pará doadas por um colonizador
francês. Os plantios foram feitos inicialmente no município de Canavieiras e em
Ilhéus (SOUZA; DIAS, 2001). Mais tarde foram adicionadas na Bahia,
variedades do Maranhão que se diferenciavam dessas do Pará. Estas duas
variedades geraram mutantes espontâneos como, por exemplo, Catongo
(Figura 2A), que produz sementes brancas e é usado para a produção de
cacau fino (CARVALHO et al., 2001).
Durante a década de 80, o Estado da Bahia passou a produzir quase
todo o cacau do Brasil para consumo e exportação, levando o país a segundo
maior produtor de cacau do mundo. Entre os anos 1986/1987, o Brasil atingiu
uma produção de quase 450.000 t de amêndoas secas, sendo o Estado da
Bahia responsável por 397.362 t correspondendo a quase 90% da produção
5
total do país. Os 10% restantes foram produzidos pelos estados do Amazonas
e Espírito Santo. O cacau representou para o Brasil e, principalmente, para a
região sul da Bahia, prosperidade, renda, empregos, além de melhoria da
infraestrutura de muitas cidades da região cacaueira. O cacau rendeu para o
país cerca de 3 bilhões e 618 milhões de dólares durante o período de maior
produção compreendido entre os anos de 1975 a 1980 (FAO, 2011).
O agronegócio de cacau no Brasil nessa época expandiu-se de tal
maneira que foi implantado na região sul da Bahia o maior e mais moderno
parque processador de amêndoas, superando inclusive a capacidade de
moagem dos Estados Unidos, Holanda, Alemanha e Rússia (MENEZES;
CARMO-NETO, 1993). Segundo BASTOS (1987), aproximadamente 90% da
produção de cacau no Brasil era destinada à exportação e a Bahia produzia
80% dela. A lavoura cacaueira baiana chegou a cultivar uma área superior a
700 mil hectares, compreendendo 106 municípios (SOUZA; DIAS, 2001). O
cacau do Sul da Bahia passou a receber prêmios pelo mercado internacional
pelo seu cacau de alta qualidade que ficou conhecido como Cacau Superior
Bahia (Tipo I, II e II). O cacau do tipo 1 foi produzido em grandes quantidades e
era oriundo de variedades do grupo Forasteiro (PEREIRA, 2012).
No entanto, a cacauicultura durante sua história atravessou algumas
crises por alguns fatores como déficit hídrico, devido a mudanças climáticas, e
doenças causadas por patógenos. Mas foi na década de 90 que a maior e mais
duradoura crise acometeu os cacauicultores com a chegada da doença
conhecida como vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo Moniliophthora
perniciosa (PEREIRA et al., 1989). O primeiro município a ser detectada essa
doença na Bahia foi em Uruçuca no ano de 1989, sendo o fungo possivelmente
oriundo da Amazônia. Assim como aconteceu com o cacau, o clima quente e
úmido da região sul da Bahia também favoreceu o desenvolvimento e a
disseminação do fungo pelas propriedades produtoras de cacau (CUENCA;
NAZÁRIO, 2004). Em pouco tempo, o fungo já havia devastado inúmeras
plantações, resultando em uma queda absurda da sua produção, na
desvalorização do cacau e na perda de mercado. Esses fatores
desencadearam impactos sócio-econômicos e ambientais profundos, havendo
redução da renda e endividamento dos produtores, além de desemprego em
6
massa dos trabalhadores rurais e aumento do desmatamento da região
cacaueira para a venda de madeira (PEREIRA et al., 1989; VIRGENS FILHO et
al., 1993; COUTO, 2000; SCARPARI, 2005).
A produção de cacau no Brasil, consequentemente, teve uma queda de
400 mil toneladas no ano de maior produção, antes da doença, para 123 mil no
ano de 2000. Em 2002, apenas 32 mil toneladas foram produzidas. O Estado
da Bahia sempre liderando o mercado como o principal produtor no país.
(AGRIANUAL, 2004). No período de alta da produção do cacau, na década de
80, a arroba chegou a ser negociada por R$ 175 reais caindo para R$ 59 entre
os anos de 1990 e 2005 (SANTOS FILHO, 2008). Com toda essa crise advinda
pela vassoura-de-bruxa e as condições climáticas desfavoráveis, o país caiu de
segundo para sexto lugar no ranking mundial de maiores produtores de cacau
(FAO, 2012).
Muitos estudos vêm sendo realizados em diversas áreas, como por
exemplo, o desenvolvimento de cultivares resistentes ao fungo M. perniciosa,
além de controle biológico como o fungo Trichoderma stromaticum, fungicidas
e podas fitossanitárias para tentar diminuir os danos causados por essa doença
(LOGUERCIO et al., 2009; RODGERS-MELNICK et al., 2012). Assim, ao longo
desses anos a lavoura cacaueira vem se recuperando e no ano de 2011/2012 e
2014/2015 o Brasil produziu suas maiores safras dos últimos 12 anos após a
doença, ultrapassando as 200 mil toneladas de cacau (CEPLAC, 2011; FAO,
2015). Recentemente, no ano de 2013, a CEPLAC lançou um fungicida
chamado Tricovab®, um produto biológico desenvolvido a partir do fungo
Trichoderma stromaticum, antagônico ao fungo M. perniciosa. Nos testes de
campo, esse biofungicida teve uma eficácia contra o fungo de 97% em tecido
morto e 56% em tecido vivo, tornando-se uma fonte de combate a essa doença
na cacauicultura (POMELLA et al., 2007; CEPLAC, 2013).
No entanto, muitos estudos ainda precisam ser realizados, pois em
longo prazo, essas técnicas de manejo e controle do fungo não são tão
eficazes. Como exemplo, alguns clones oriundos do melhoramento genético
foram usados na cacauicultura, sendo cultivares resistentes, como é o caso do
Sca6 (Scavina-6) e seus descendentes TSH (Trinidad Selected Hybrids)
(Figura 2B) e TSA (Trinidad Selected Amazonian), pertencentes ao grupo
7
Forasteiro da Amazônia. Porém, estudos recentes revelam que o M. perniciosa
vem conseguindo transpor as barreiras de defesa dessas variedades, uma vez
que o fungo possui uma alta variabilidade genética e um processo de constante
adaptação (LEAL; ALBUQUERQUE; FIGUEIRA, 2007; PATROCINIO et al.,
2012). Entretanto, apesar da variabilidade genética do fungo e o
desenvolvimento de mecanismos diferentes de patogenicidade, o uso de
variedades resistentes de cacau à doença vassoura-de-bruxa ainda é o método
mais eficiente de controle da doença até o momento.
Figura 2. Plântulas de T. cacao L. mantidas em casa de vegetação. A. Variedade Catongo (suscetível à
M. perniciosa). B. Variedade TSH1188 (resistente à M. perniciosa).
2.2 Moniliophthora perniciosa: patógeno que devastou a cacauicultura
A doença conhecida como vassoura-de-bruxa que acomete as
plantações de cacau é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora
perniciosa da família Marasmiaceae (AIME; PHILLIPS-MORA, 2005) e assim
como seu hospedeiro também é endêmico da região da Bacia Amazônica na
América do Sul. Outras doenças como a podridão-parda, causada por
Phytophthora spp. e a monilíase, causada por Moniliophthora roreri, também
causam perdas na cacauicultura. Mas a vassoura-de-bruxa do cacaueiro foi
sem dúvidas, a doença que causou maior devastação nessa cultura no Brasil.
8
Em outros países produtores de cacau, como os situados na América do Sul e
nas ilhas do Caribe, essa doença também está entre as mais importantes
(BASTOS, 1996; PURDY; SCHMIDT, 1996; GRIFFITH et al., 2003). No
entanto, a vassoura-de-bruxa do cacaueiro ainda não foi detectada em países
do continente africano e asiático, os atuais principais produtores de cacau do
mundo (DE ARRUDA et al., 2003).
Além do cacau, o fungo M. perniciosa infecta outras espécies do gênero
Theobroma, como Theobroma grandiflorum (cupuaçu), assim como membros
de outras famílias, como exemplo, Solanaceae, Sterculiacea e Bignoniaceae.
Esse fungo infecta tecidos meristemáticos da planta e frutos jovens, causando
os mais variados sintomas dependendo do estágio fisiológico, nutricional, da
idade da planta e do local da infecção (BASTOS; EVANS, 1985; SCARPARI et
al., 2005; MARELLI et al., 2009).
Moniliophthora perniciosa é um fungo hemibiotrófico e por isso possui
duas fases bem distintas: a fase biotrófica e a fase necrotrófica. Assim que os
basidiósporos (esporos) do fungo são liberados pelo basidiocarpo, atingem a
superfície da planta, conseguem driblar a sua defesa e instalam-se no
hospedeiro, sintomas como por exemplo, hipertrofia, brotos axilares e necrose
são observados com o passar do desenvolvimento do fungo no tecido
infectado. A presença do fungo na planta implica em mudanças fisiológicas,
histológicas e morfológicas no tecido afetado pela doença (ORCHARD et al.,
1994; SCARPARI et al., 2005; DE OLIVEIRA CEITA et al., 2007; SENA;
ALEMANNO; GRAMACHO, 2014). O processo de infecção da doença
vassoura-de-bruxa no cacaueiro inicia-se com o desenvolvimento dos tubos
germinativos dos basidiósporos, estruturas infectivas desse fungo (BASTOS;
EVANS; SAMSON, 1981). Esses basidiósporos são formados no corpo de
frutificação, chamado basidiocarpo, sendo liberados sob condições de clima
quente (26ºC ± 2) e umidade relativa entre 80 e 90%, principalmente em
períodos de chuva. O tubo germinativo é formado variando de 2-6 horas após a
infecção no tecido, a depender do genótipo. Na variedade suscetível de cacau
é iniciado mais cedo com duas horas e após quatro horas já está totalmente
formado, enquanto no resistente só é iniciado com quatro horas. Em seguida,
esses basidiósporos penetram nos tecidos jovens como meristemas, brotos,
9
almofadas florais ou folhas jovens através de tricomas, estômatos e junções da
epiderme (SREENIVASAN; SABYDEEN, 1989; SILVA et al., 2002).
O modo de penetração no tecido meristemático pode ocorrer de várias
maneiras, sendo observado por Sena et al. (2014) e ocorreu depois de um
período de 6 horas para os dois genótipos contrastantes. No genótipo
suscetível, 48 horas após a infecção, observou-se o crescimento entre as
células de hifas monocarióticas que não possuem grampo de conexão. O
primeiro sintoma da doença, a hipertrofia apical dos tecidos, é observado no
genótipo suscetível entre 15 e 30 dias (KILARU, ARUNA; BAILEY, BRYAN A.;
HASENSTEIN, KARL H., 2007; MEINHARDT et al., 2008). Com a progressão
da doença pode-se observar ainda perda de dominância apical e emissão de
brotos axilares, ao qual induz a formação de ramos anormais conhecidos como
vassoura verde. Esse fenótipo na planta infectada é observado com 45 dias
após a infecção, onde as folhas já começam a apresentar-se necrosadas.
Microscopicamente, nesse período, os grampos de conexão são formados e se
inicia a mudança de fase biotrófica para necrotrófica. A vassoura verde é
totalmente formada aos 60 dias. Nesse estágio, o micélio já está crescendo
dentro das células e o tecido já está em uma fase adiantada de necrose
formando com 90 dias a vassoura seca (SCARPARI et al., 2005; SENA;
ALEMANNO; GRAMACHO, 2014). São nesses tecidos infectados necrosados
que os basidiocarpos formam-se e produzem os basidiósporos, reiniciando
desta forma o ciclo de vida do M. perniciosa (Figura 3) (SCARPARI et al., 2005;
GARCIA et al., 2007; PIRES et al., 2009).
Os fungos hemibiotróficos, em sua maioria, apresentam sua fase
biotrófica ou parasítica por um curto período de tempo, aproximadamente 10
dias, fase em que o fungo se alimenta dos nutrientes do hospedeiro nos tecidos
vivos. Já a fase necrotrófica ou saprotrófica, normalmente é mais estendida e o
fungo alimenta-se de tecidos mortos e em putrefação (AGRIOS, 1997).
Diferentemente, o fungo M. perniciosa apresenta uma longa fase parasítica
com duração, em média, de 45 a 60 dias. A fase saprotrófica é bem acentuada
aos 90 dias após a infecção do hospedeiro pelo fungo (SCARPARI, 2005).
Os sintomas da doença vassoura-de-bruxa estão relacionados ao
desbalanço hormonal causado na planta pela presença do fungo (KILARU,
10
ARUNA; BAILEY, BRYAN A.; HASENSTEIN, KARL H., 2007). É muito comum
doenças de plantas estarem associadas à inibição ou ao estímulo do
crescimento nos tecidos infectados, formando tumores devido às variações
desses hormônios. Os patógenos podem alterar o metabolismo desses
hormônios, induzirem a planta a produzi-los ou eles mesmos secretarem-nos
na planta para o seu próprio benefício (MAOR; SHIRASU, 2005; ROBERT-
SEILANIANTZ; GRANT; JONES, 2011; DENANCÉ et al., 2013).
Figura 3. Processo de infecção do fungo M. perniciosa no cacau (Modificado de Sena et al, 2014).
11
2.3 Hormônios vegetais envolvidos na interação planta-patógeno e
mecanismos de defesa da planta
Os hormônios vegetais controlam e regulam inúmeros processos
importantes para o crescimento e desenvolvimento das plantas, ativando assim
complexas vias de sinalização (AGRIOS, 2005). A regulação dessas vias de
sinalização influencia diretamente ou indiretamente na interação planta-
patógeno e nos mecanismos de defesa da planta (ROBERT-SEILANIANTZ, A.
et al., 2007; PIETERSE et al., 2012; DENANCÉ et al., 2013). As principais
classes de hormônios são as auxinas (AUX), citocininas (CK), ácido abscísico
(ABA), ácido salicílico (AS), giberelinas (GA), etileno (ET), ácido jasmônico
(AJ), brasinosteróides (BL) e stringolactone (SL). Na interação planta-patógeno,
a produção de hormônios é essencial para o estabelecimento da doença e sua
quantidade varia de acordo com cada sistema de interação e o tipo do
hospedeiro (MAOR; SHIRASU, 2005).
Em plantas, as vias de sinalização de hormônios como AS, AJ e ET são
bem conhecidas por atuarem na resposta de defesa a patógenos (KUNKEL;
BROOKS, 2002; PIETERSE et al., 2012). Porém, estudos têm mostrado que
esses hormônios também são essenciais para o estabelecimento e
desenvolvimento de processos fisiológicos do fungo como mostrado no
trabalho de PRUSTY et al. (2004). Neste trabalho, leveduras em resposta à
auxina diferenciaram-se de haplóides para diplóides. KOLATTUKUDY et al.
(1995) mostraram no seu trabalho que apressórios formados pelos esporos de
Colletotrichum gloeosporioides necessitam do ET. Portanto, de acordo com os
trabalhos realizados tanto a invasão pelo patógeno quanto o reconhecimento e
resposta de defesa da planta tem a participação dos hormônios.
Estudos têm demonstrado, por exemplo, que a supressão da sinalização
da auxina favorece a resistência da planta a patógenos e essa supressão tem
sido usada como estratégia na resposta de defesa das plantas (ROBERT-
SEILANIANTZ, ALEXANDRE et al., 2007). NAVARRO et al. (2006)
demonstraram isto a partir do silenciamento de receptores de auxina.
Evidências mostram que isto acontece porque muitos patógenos utilizam o
estímulo da sinalização da auxina como uma das estratégias de invasão no
12
hospedeiro. Pseudomonas syringae, por exemplo, utiliza fatores de virulência
como AvrRpt2 para elevar os níveis de auxina no processo de infecção o que
reprime as defesas vegetais e altera processos fisiológicos que podem facilitar
a colonização do patógeno (CHEN et al., 2007).
As bactérias Pseudomonas syringae pv. savastonoi, Erwinia
chrysanthemi, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes são
bem conhecidas por produzirem alta quantidade de hormônios nas plantas
como auxinas e citocininas, causando um desbalanço hormonal e induzindo a
formação de galhas ou tumores (GOHLKE; DEEKEN, 2014). Os fungos
também produzem hormônios tais como giberelinas no caso de Gibberella
fujikuroi e de auxinas em Ustilago maydis e Colletotrichum gloeosporioide e do
próprio M. perniciosa (MAOR et al., 2004; KILARU, ARUNA; BAILEY, BRYAN
A.; HASENSTEIN, KARL H., 2007). Portanto, esses hormônios ou análogos
são importantes para o próprio estabelecimento da doença no hospedeiro,
podendo ser produzidos pelo patógeno e sua produção induzida na planta.
No caso de M. perniciosa, causador da vassoura-de-bruxa no cacaueiro
já foi relatado em alguns estudos que a auxina é importante para o
estabelecimento da fase biotrófica e desenvolvimento da doença. KILARU,
ARUNA; BAILEY, BRYAN A.; HASENSTEIN, KARL H. (2007) observaram em
seu trabalho que após 10 dias de infecção as auxinas aumentaram
significantemente. Outros estudos indicaram este hormônio como sendo o
responsável por causar o sintoma típico da doença, a hipertrofia dos tecidos
infectados (EVANS, 1980; KILARU; HASENSTEIN, 2005); além de facilitar a
colonização da planta pelo fungo. Este aumento de auxina nos tecidos
infectados pode ser uma resposta da planta ao patógeno ou uma produção
pelo próprio fungo.
No trabalho de ALVAREZ (2013) foi analisado o transcriptoma da
interação cacau-M. perniciosa na fase assintomática de variedades
contrastantes quanto à resistência à doença. Observou-se com os resultados
uma maior quantidade de genes expressos de resposta à auxina na variedade
de cacaueiro suscetível infectada pelo fungo. No entanto, não foi observado
indução de genes da via de biossíntese na planta, sugerindo que a auxina era
produzida pelo patógeno. Já para a variedade resistente houve um maior
13
aumento no número de fatores de transcrição (DNA-binding), podendo estar
relacionados à uma regulação mais intensa dos genes de reforço da parede
celular, fotossíntese ou mesmo de detoxificação celular como mecanismos de
defesa contra o fungo (DA HORA JUNIOR et al., 2012). Outros hormônios
foram analisados quanto a seu nível durante o desenvolvimento da doença e
foi mostrado que os níveis de AS durante a infecção também aumentaram.
Porém, isso foi observado em etapas mais avançadas da doença, uma vez que
esse composto pode ser induzido por resistência sistêmica adquirida
(CHAVES; GIANFAGNA, 2006; KILARU, ARUNA; BAILEY, BRYAN A.;
HASENSTEIN, KARL H., 2007). Já os hormônios vegetais ABA e AJ não
mudaram seus níveis durante a infecção e desenvolvimento da vassoura-de-
bruxa (KILARU, ARUNA; BAILEY, BRYAN A.; HASENSTEIN, KARL H., 2007).
No entanto, o trabalho de LITHOLDO et al. (2015) sugere que a
resistência do cacaueiro contra o M. perniciosa pode ser regulada por via de
sinalização AJ/ET. Nesse trabalho foi mostrado, por análise de expressão
gênica em variedades contrastantes de cacaueiro, uma regulação positiva de
genes envolvidos na biossíntese de AJ por aplicação exógena de metil
jasmonato. No genótipo resistente de cacau sob infecção do M. perniciosa, foi
observada a indução do gene aleno óxido sintase (AOS), que codifica uma
enzima chave na biossíntese de AJ (LITHOLDO et al., 2015). Em contrapartida,
o AJ pode ter um papel importante na indução de proteínas relacionadas à
patogênese (PRs), uma vez que plantas de arroz transformadas com o gene
AOS aumentaram seus níveis de AJ e ativaram genes PR1a, PR3 e PR5 além
de aumentar a resistência ao fungo Magnaporthe grisea, após sua infecção
(MEI et al., 2006).
Diferenças na expressão de genes e na sinalização dos processos
biológicos envolvidos nas interações compatíveis e incompatíveis entre o
cacaueiro e o fungo M. perniciosa também foram alvo de estudo no trabalho de
(DA HORA JUNIOR et al., 2012). Foi observado que para a variedade
resistente houve expressão de genes que desempenham papel de elicitores e
na propagação de sinais do início ao fim do tempo de infecção analisado (60
dias), além de genes envolvidos em mecanismos de defesa e resistência da
planta. Esses elicitores e alguns genes identificados são conhecidos por
14
ativarem mecanismos de defesa da planta em respostas a estímulos
patogênicos como hipersensibilidade (HR) (AGRIOS, 2005), resistência
adquirida sistêmica (SAS) (FU; DONG, 2013), além de interações com
proteínas quinases MAPK relacionadas aos fatores de transcrição da família
WRKY. A família de FTs WRKY modula diversos processos no hospedeiro,
incluindo respostas a estresses bióticos (EULGEM; SOMSSICH, 2007;
RUSHTON et al., 2010). Alguns desses FTs WRKY identificados participam da
via de sinalização de AJ que são hormônios indutores da biossíntese de
metabólitos secundários de defesa, incluindo também outros FTs como
membros das famílias WRKY, MYB, AP2/ERF e bHLH (ZHOU; MEMELINK).
Além de genes expressos em resposta a estímulos hormonais, de genes
envolvidos na via de biossíntese de hormônios e na defesa da planta, também
foi observada a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) na variedade
de cacau resistente infectada com o fungo da vassoura-de-bruxa. Essa
produção de ROS foi observada, principalmente nos tempos iniciais da
infecção (DA HORA JUNIOR et al., 2012). As espécies reativas de oxigênio
(ROS) são conhecidas por serem moléculas sinalizadoras de estresse em
plantas e importantes para ativar mecanismos de defesa (KANKOFER, 2001).
Em estudos realizados com Arabidopsis, o tratamento com ROS (H2O2, ROS
apoplástico e O3, por exemplo) suprimiu ou diminuiu a expressão de genes
relacionados à via de biossíntese de auxina e seus receptores, conferindo
maior resistência a patógenos (KOVTUN et al., 2000; BLOMSTER et al., 2011).
Na variedade resistente de cacaueiro foi observado um alto nível de
ácido oxálico, substrato da enzima oxalato que causa aumento do nível de
peróxido de oxigênio (H2O2) no tecido infectado nas fases inicias, auxiliando no
bloqueio da infecção precocemente. Esse ácido oxálico é resultado da
dissolução de cristais de oxalato de cálcio (COC) no córtex dos ramos
infectados (DIAS et al., 2011). Com o passar do tempo de infecção, enzimas
envolvidas na detoxificação de ROS foram detectadas, principalmente com 60
dias após a inoculação do fungo (DA HORA JUNIOR et al., 2012).
Na interação compatível, portanto suscetível à doença, a planta
infectada apresentou inúmeros cristais de oxalato de cálcio que, ao contrário da
planta resistente, só são dissolvidos nas fases mais tardias da infecção, o que
15
pode comprometer a defesa da planta (VILLELA-DIAS et al., 2014). Ainda na
variedade suscetível, da Hora Junior et al (2012) também identificaram
aumento na expressão de genes envolvidos na transdução de sinais e resposta
de defesa ao ataque de patógenos nos estágios iniciais de infecção, tais como
proteínas quinases, cisteíno proteases e proteínas relacionadas à patogênese
(PR). Porém, a maquinaria de defesa na interação compatível não consegue
deter a colonização e desenvolvimento do fungo com eficiência como nas
plantas resistentes. O gene fosfatase 2C, por exemplo, apesar de aumentar
sua expressão no suscetível participa como regulador negativo na atividade de
MAP quinases em respostas a estresses bióticos e abióticos (MESKIENE et al.,
2003). Em Arabidopsis, o gene fosfatase 2C foi relatado como papel chave na
regulação de níveis de hormônios em estresses, podendo controlar a resposta
de defesa ao fungo Botrytis cinerea (SCHWEIGHOFER et al., 2007).
Outros genes associados à resposta a auxina foram identificados
durante toda a infecção na interação cacau-M. perniciosa, principalmente
depois de 30 e 60 dias, associados ao desenvolvimento de meristemas e
biossíntese de flavonoides, além de genes envolvidos na autofagia e morte
celular programada (DA HORA JUNIOR et al., 2012; ALVAREZ, 2013).
2.4 Fatores de transcrição : reguladores da expressão gênica em todos os
organismos
Os organismos tanto procariontes quanto eucariontes são expostos a
diversos estímulos ambientais, tais como disponibilidade de nutrientes, sinais
hormonais, luz, calor, patógenos, dentre outros. Assim, a modulação da
expressão gênica pelos fatores de transcrição (FTs) em resposta aos sinais
ambientais e fisiológicos tem como objetivo ativar mecanismos de adaptação e
defesa da planta (KHONG, G. et al., 2008). Os FTs são responsáveis por
regularem essa expressão gênica durante o crescimento, desenvolvimento ou
respostas a condições adversas em todos os organismos vivos e, por isso, são
alvos moleculares para o melhoramento genético de plantas tolerantes a
diferentes estresses (ZHANG; PENG; GUO, 2008; SHEN et al., 2012). Alguns
16
genes, conhecidos como constitutivos, são requeridos durante todo o tempo,
por isso são expressos constantemente pelos fatores gerais da transcrição, não
necessitando de regulação. No entanto, têm aqueles genes que são regulados
de acordo com a necessidade celular, podendo ser induzidos ou reprimidos por
FTs específicos. Portanto, a expressão desses genes varia de acordo com o
tecido e/ou órgão específico, fase de desenvolvimento do organismo e
condições ambientais (RUSHTON et al., 2010; ZHU et al., 2013). Assim, os
FTs são proteínas regulatórias que se ligam a sequências de DNA específicas
presentes nos promotores dos genes, aumentando ou diminuindo a taxa
transcricional e, consequente a expressão desses genes alvo (PANDEY;
SOMSSICH, 2009; WANG et al., 2015). Estes FTs são necessários para se
iniciar o processo de transcrição e podem ser agrupados em famílias com base
na similaridade da estrutura primária e/ou tridimensional de seus domínios de
ligação ao DNA (WARREN, 2002).
No banco de dados de fatores de transcrição de plantas (PLNTFDB) são
descritas 60 famílias de fatores de transcrição, além de 22 famílias de outros
reguladores transcricionais (PÉREZ-RODRÍGUEZ et al., 2010). Essas
proteínas ligantes de DNA de vários organismos são normalmente classificadas
de acordo com o seu domínio de ligação que são mantidos bastante
conservados entre os membros da família. Algumas famílias de FTs são
encontradas exclusivamente em plantas, como é o caso das famílias AP2, B3,
NAC e DOF. A familia WRKY também é muito estudada em plantas, sendo a
maior parte de seus membros encontrada em plantas. Porém, já foram
descritos alguns FTs WRKY em um número restrito de espécies de algas,
amebas e fungos (RINERSON; SCULLY; et al., 2015). Diversos estudos vêm
sendo realizados ao longo dos anos para entender o mecanismo de regulação
dos organismos. Saber onde, quando e como agem os FTs (CHEN et al.,
2002). Em Arabidopsis, os FTs representam cerca de 5-8 % (PÉREZ-
RODRÍGUEZ et al., 2010) dos genes codificadores de proteínas do genoma
onde foram anotados aproximadamente 30000 loci
(http://www.arabidopsis.org). Desses genes de FTs, menos de 10% tem sido
caracterizados geneticamente. No genoma de arroz e soja, estima-se que 4% e
12,2% do total sejam FTs, respectivamente (GOFF et al., 2002; SCHMUTZ et
17
al., 2010). Em plantas, esses fatores de transcrição são pouco expressos,
normalmente em um tipo de célula ou tecido específico, ou ainda
transientemente durante seu desenvolvimento (UDVARDI et. al, 2004).
Entre uma série de FTs já descritos (FIORILLI et al., 2009; GOMEZ et
al., 2009), os membros da família MYB, MYC, ERF, bZIP e WRKY foram
implicados na regulação da resposta ao estresse abiótico (SCHWECHHEIMER;
ZOURELIDOU; BEVAN, 1998; SINGH; FOLEY; OÑATE-SÁNCHEZ, 2002) e
também na defesa contra patógenos (LOPES, M.A. et al., 2010). Isso se deve
ao fato de que um FT é codificado por um único gene, mas regula a expressão
de vários outros genes levando à ativação de complexos mecanismos de
adaptação e, portanto, representa grandes alvos moleculares para
melhoramento genético de plantas cultivadas (KHONG, G. et al., 2008).
2.4.1 Fatores de transcrição da família bZIP
Os fatores de transcrição bZIP (zíper básico de leucina) são proteínas
regulatórias que se ligam ao DNA e possuem um domínio contendo de 60-80
aminoácidos com duas regiões distintas localizadas na sua contínua alfa-
hélice: uma região altamente conservada N-X7-R / K –X9 e um zíper de leucina
menos conservado contendo normalmente várias repetições de leucina ou
outros aminoácidos hidrofóbicos (ELLENBERGER, 1994). As proteínas bZIP
são fatores de transcrição dimerizadas em todos os eucariotos e o zíper de
leucina é o responsável pelo reconhecimento e especificidade na dimerização,
formando complexos homodímeros ou heterodímeros (FASSLER et al., 2002;
WANG, J. et al., 2011). Essa habilidade é influenciada por atração eletrostática
e repulsão de resíduos polares flanqueando a interação hidrofóbica na
superfície das hélices (ELLENBERGER, 1994). Já a região básica conservada
é responsável pela ligação específica ao cis- elementos no DNA do gene alvo a
ser regulado. A posição de resíduos específicos conservados de cada alfa-
hélice da proteína bZIP, assim como a composição aminoacídica do domínio
tem papel fundamental para determinar a especificidade da ligação ao DNA
alvo. Em plantas, as proteínas bZIP ligam-se preferencialmente a sequências
18
palindrômicas no DNA contendo ACGT como em A-box (TACGTA), C-box
(GACGTC), G-box (CACGTG) ou ABRE – responsivo de ABA (ACGTGT/GC),
mas também há exemplos de sítios de ligações não palindrômicos. Esses cis-
elementos regulatórios estão presentes em diversos genes alvos (FOSTER;
IZAWA; CHUA, 1994; SORNARAJ et al., 2016).
Estudos vêm sendo realizados ao longo dos anos e membros de bZIP
têm sido identificados ou previstos em diversos eucariotos, por exemplo, em
Saccharomyces cerevisiae foram encontrados 17 genes bZIP (COLEMAN;
TSENG; MOYE-ROWLEY, 1997), em Drosophila melanogaster 27 genes
(FASSLER et al., 2002), 31 em Caenorhabditis elegans (ESTES et al., 2010),
em Homo sapiens foram 56 genes (DEPPMANN et al., 2004), 77 em
Arabidopsis thaliana (CORRÊA et al., 2008), 89 em Oryza sativa (NIJHAWAN
et al., 2008), 138 em Glycine max (WANG et al., 2015) e 92 genes bZIP em
Sorghum bicolor (WANG, J. et al., 2011) entre outros organismos. Entre as
famílias conhecidas de FTs, esta família está entre as mais diversificadas. Os
fatores de transcrição bZIP controlam diversos processos fisiológicos e
bioquímicos importantes em todos os organismos eucariontes (SORNARAJ et
al., 2016). Em plantas, os membros bZIP estão envolvidos em inúmeros
processos biológicos, tais como germinação de sementes (ALONSO et al.,
2009), desenvolvimento de sementes e flores (Abe et al., 2005), sinalização
hormonal (WEISTE; DRÖGE-LASER, 2014), sinalização de estresses abióticos
(FUJITA, M. et al., 2006), defesa contra patógenos (LEE et al., 2006; ALVES et
al., 2013), metabolismo energético (BAENA-GONZALEZ et al., 2007),
diferenciação do tecido (SILVEIRA et al., 2007) e embriogênese somática
(GUAN et al., 2009).
No trabalho de CORRÊA et al. (2008) foi realizado um estudo
filogenético da família bZIP desde as algas verdes até as angiospermas, no
qual os membros da família foram agrupados em 13 grupos nomeados de A - L
e o grupo S. Essa classificação foi baseada na similaridade entre os domínios e
motivos conservados presentes nas sequências. Pertencem ao grupo S os
genes bZIP que apresentaram uma maior taxa de mutação, e portanto, mais
difíceis de serem agrupados nos grupos de ortólogos. Estudos funcionais dos
genes dessa família de FTs também vêm sendo desenvolvidos e demonstram
19
o envolvimento dos genes bZIP em diferentes processos biológicos. Por
exemplo, em Arabidopsis, membros de bZIP como AtbZIP39, AtbZIP36,
AtbZIP38, AtbZIP66, AtbZIP40, AtbZIP351 e AtbZIP37 desempenham papéis
na sinalização do estresse ou na sinalização por ácido abscísico (ABA) (CHOI
et al., 2000). Fatores da subfamília bZIP/TGA são envolvidos nos mecanismos
de defesa e desenvolvimento das plantas. Estudos em Arabidopsis e tabaco
demonstraram que os fatores TGA são implicados como reguladores positivos
de genes relacionados à patogenicidade (PRs), induzidos em resposta ao
ataque de patógenos e AS (JOHNSON; BODEN; ARIAS, 2003). Os fatores
TGA também interagem com a proteína NPR, necessária para a indução de
PRs (ZHOU et al., 2000), bem como com elementos responsivos de ET
presentes em muitos promotores de PRs (ZANDER et al., 2010). Em pepino
(Cucumis sativa), os genes CsbZIP06, CsbZIP08, CsbZIP12, CsbZIP15,
CsbZIP29, CsbZIP30, CsbZIP44, vbZIP53, CsbZIP55, CsbZIP59 foram
relatados para serem induzidos em raízes sob condições de estresse à seca.
Portanto, essa família multigênica de fatores de transcrição tem sido alvo de
estudos para compreensão de suas funções e também para o melhoramento
genético de culturas, com intuito principalmente de aumentar a tolerância a
estresses abióticos e bióticos.
2.4.2 Fatores de transcrição da família WRKY
Os fatores de transcrição pertencentes à família WRKY são assim
chamados por possuírem em sua sequência proteica um domínio altamente
conservado de aproximadamente 60 aminoácidos formado por um
heptapeptídeo WRKYGQK seguido de um zinc finger C2H2 (EULGEM et al.,
2000). Esse domínio conservado é responsável por reconhecer e ligar-se à cis-
elementos regulatórios em regiões de DNA específicas e conservadas
(T)(T)TGAC(C/T) no promotor dos genes conhecidos como W-box. Esses cis-
elementos regulam repostas transcricionais a estresses abióticos ou bióticos e
estão presentes nos promotores de muitos genes de defesa das plantas
(RUSHTON et al., 2010; WANG, Q. et al., 2011). Essa resposta aos estímulos
20
ambientais é detectada por moléculas de sinalização que induzem os principais
genes associados com o estresse. Dessa maneira, participam dessa
sinalização e defesa da planta as famílias de FTs como WRKY, ERF, NAC e
MADS (JIANG et al., 2014). As proteínas regulatórias WRKY são conhecidas
por terem funções como ativadores ou repressores da transcrição de vários
genes em processos fisiológicos, do desenvolvimento das plantas e respostas
a diferentes estímulos do ambiente. No entanto, essa regulação múltipla inclui
uma enorme rede de interações e interconexões. Portanto, tem se observado
que muitos FTs WRKYs trabalham em conjunto para uma maior eficiência à
tolerância ao estresse e desenvolvimento da planta (PHUKAN; JEENA;
SHUKLA, 2016).
Durante muito tempo, a família WRKY foi considerada como sendo
exclusiva de plantas, mas tem sido descrita em espécies não vegetais como
espécies do reino Amoebozoa, por exemplo, Giardia lambia, Giardia
intestinalis, Polysphondylium pallidum, Acanthamoeba castellanii, Dictyostelium
purpureum e fungos como Mucor circinelloides, Rhizopus delemar, Absidia
idahoensis, Lichtheimia corymbifer, Rhizophagus irregularis e Mortierella
verticillata (RINERSON; RABARA; et al., 2015). No entanto, a ocorrência do
domínio WRKY (WD) nessas espécies tem sido difícil de explicar. As diferentes
plantas existentes atualmente são descendentes de uma alga verde unicelular
carófita que colonizou a Terra entre 430 e 470 milhões de anos atrás (LEWIS;
MCCOURT, 2004). O primeiro genoma de uma alga carófita a ser sequenciado
foi o de Klebsormidium flaccidum, que acabou preenchendo lacunas nas
sequências do genoma disponíveis no reino vegetal entre algas verdes
unicelulares, nas quais possuem de 1-3 genes WRKY e musgos que possuem
de 30-40 membros WRKY em seu genoma (HORI et al., 2014).
No entanto, essa família sofreu uma grande evolução tanto em número
de genes quanto funções no reino Plantae. A espécie de algodão Gossypium
raimondii até o momento possui o maior número de WRKYs com 277 membros
(GUO et al., 2014) comparado à espécie de alga Chlorella vulgaris que possui
apenas um membro (http://supfam.org/SUPERFAMILY). Os estudos também
vêm tentando entender como essa família evoluiu de algas aquáticas
unicelulares até plantas multicelulares com flores (RINERSON; RABARA; et al.,
21
2015). Durante a evolução dessa família, o domínio conservado e o zinc finger
presentes sofreram variações devido à pressão seletiva ou eventos de
duplicações. Isso possibilitou o agrupamento dos membros da família WRKY
de plantas nos grupos I, II (subdividido em IIa, IIb, IIc, IId, IIe) e o grupo III
(EULGEM et al., 2000).
Muitos estudos funcionais de genes dessa família multigênica vêm
sendo realizados e esses FTs WRKY têm sido implicados na regulação do
crescimento e desenvolvimento da planta (ULKER; SOMSSICH, 2004;
RUSHTON et al., 2010), tais como morfogênese de tricomas (LI et al., 2015) e
embriões (GRUNEWALD et al., 2013), senescência da folha (GUO et al.,
2014), germinação e dormência de sementes (JIANG; YU, 2009), formação de
raízes (GALLOU et al., 2012), vias metabólicas (BIRKENBIHL; DIEZEL;
SOMSSICH, 2012). Entretanto, um dos papéis mais importantes da família
WRKY é a sinalização e resposta de defesa a estresses abióticos e bióticos
induzidos por vírus, oomicetos, bactérias e fungos (ULKER; SOMSSICH, 2004;
EULGEM; SOMSSICH, 2007; QIU; YU, 2009).
Os fatores WRKY atuam também nas vias de transdução induzidas por
AS, AJ, ABA e giberelinas. Algumas funções de membros dessa família
multigênica já são bem conhecidas em diferentes espécies. Em Arabidopsis,
por exemplo, o fator de transcrição WRKY70 é considerado elemento
pertencente a ambas as vias de sinalização do AS e AJ induzidas por elicitores
patogênicos. Em adição, NPR1 (não expressor de genes PR1) regula o gene
WRKY70 mediado pela via AS, que codifica proteínas reguladoras dos genes
de defesa PRs (PR1, PR2 e PR5) (LI et al., 2004). Mutações no gene WRKY70
realizadas em Arabidopsis aumentam a suscetibilidade a patógenos biotróficos
e necrotróficos, Erwinia carotovora e os fungos patogênicos Erysiphe
cichoracearum e Botrytis cinerea (LI et al., 2004; LI et al., 2006). O gene
WRKY18 tratado com proteína fúngica NEP1, indutora de necrose aumenta
sua expressão nos tecidos infectados e é regulador positivo na defesa basal e
SAR (resistência adquirida sistêmica).
O gene WRKY53 é ativado pelo peróxido de hidrogênio durante a
senescência das folhas (MIAO et al., 2004). ROBATZEK; SOMSSICH (2001)
mostraram que a expressão de WRKY6 sofria influência de vários sinais
22
externos e internos e eram envolvidos em processos de senescência e
respostas de defesa da planta. Os genes WRKY22 e WRKY29 têm sido
relatados como tendo papel na cascata de sinais por MAPK (defesa induzida
por proteínas quinases ativadora de mitogênese) (WAN; ZHANG; STACEY,
2004). Ainda em Arabidopsis, os genes WRKY7, WRKY11 e WRKY17 quando
mutados aumentam a resistência basal ao patógeno bacteriano P. syringae
(KIM; FAN; CHEN, 2006). Em arroz, os genes OsWRKY23 e OsWRKY45 em
Arabidopsis aumentaram a resistência da planta ao patógeno P. syringae (JING
et al. 2009; QIU and YU 2009). Já o gene WRKY71 codifica um repressor
transcricional dos genes responsivos da via de giberelinas (ZHANG et al.,
2004). Genes WRKY1 e WRKY2 em cevada também apresentaram funções
como repressores da resistência basal induzida por PAMP (SHEN et. al, 2007).
Assim, proteínas WRKY induzidas por patógenos podem ser reguladores
positivos ou negativos na defesa e resistência a doenças em plantas. Essa
família de genes participa do ajuste da regulação das complexas vias de
sinalização e redes transcricionais envolvidas em diferentes mecanismos de
defesa da planta. Em Arabidopsis, 49 dos 72 genes WRKY identificados
respondem à infecção por patógenos ou tratamento com AS (CHEN; CHEN,
2000) e é provável que esse número seja ainda maior. Em comparação a
outras famílias multigênicas de fatores de transcrição, esse número de genes
que respondem ao estresse biótico é elevado sugerindo que esse estresse por
patógenos tenha sido fundamental para a expansão da família WRKY.
Estresses abióticos como seca, ferimento, frio e calor também induzem a
expressão desses FTs em plantas (HARA et al., 2000; CHEONG et al., 2002).
Esses fatores de transcrição têm sido alvo de estudos em melhoramento
genético de plantas, principalmente por seu envolvimento na defesa das
plantas.
23
Capítulo I
Manuscrito em elaboração
Análise in silico de fatores de transcrição de
Theobroma cacao: enfoque na familia bZIP
24
Análise in silico de fatores de transcrição de Theobroma cacao:
enfoque na familia bZIP
Dayanne Silva Monteiro de Almeida1, Daniel Oliveira Jordão do Amaral1,
Amanda Santos Prado1, Luiz Eduardo Vieira Del Bem2, Raner José Santana
Silva1, Michel Vincent2, Fabienne Micheli1,3,*
1 Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Departamento de Ciências
Biológicas (DCB), Centro de Biotecnologia e Genética (CBG), Rodovia Ilhéus-
Itabuna, km 16, 45662-900 Ilhéus-BA, Brazil 2 Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Departamento de
Genética e Evolução, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas, Campinas, Brasil 3 CIRAD, UMR AGAP, F-34398 Montpellier, France
* Autor correspondente. E-mail: [email protected]
Palavras-chave: Gene regulatório, motivos conservados, filogenia molecular,
bZIP.
1. Introdução
O cacau (Theobroma cacao L.), espécie nativa da Amazônia tem como
principal produto comercial suas amêndoas, as quais são utilizadas como
matéria-prima do chocolate (SANTOS FILHO, 2008). A cultura encontra-se entre
as 10 colheitas mais negociadas no mundo e é cultivada em cerca de 17 milhões
de hectares em todo o globo (CEPLAC, 2011). Mas a cacauicultura tem sofrido
grandes danos devido às diversas doenças que acometem suas plantações,
principalmente à vassoura-de-bruxa, causada pelo fitopatógeno Moniliophthora
perniciosa (AIME; PHILLIPS-MORA, 2005). Por ser um patógeno hemibiotrófico,
25
apresenta duas fases distintas durante seu ciclo de vida, uma fase biotrófica e
uma fase necrotrófica. Essas fases provocam mudanças morfológicas,
fisiológicas e histológicas nos tecidos do cacaueiro afetados pela doença
(ORCHARD et al., 1994; SCARPARI et al., 2005; DE OLIVEIRA CEITA et al.,
2007; SENA; ALEMANNO; GRAMACHO, 2014). Esta doença pode reduzir a
produção de sementes de cacau em até 80-90% em algumas plantações,
resultando em abandono de muitas áreas de produção ao redor do mundo
(MICHELI et al., 2010).
Apesar dos avanços para melhor compreender os mecanismos da
interação cacau-M. perniciosa ainda temos muito a aprender, no sentido de
proporcionar novos métodos de manejo da vassoura-de-bruxa. Estudos recentes
têm identificado vários genes/proteínas, incluindo fatores de transcrição (FTs),
como candidatos promissores para desenvolver papéis comuns na via de
regulação e sinalização de diferentes estresses da planta (FUJITA, MIKI et al.,
2006; KHONG, G. et al., 2008) e de mecanismos moleculares e fisiológicos
relacionados com resistência a patógenos (JALALI; BHARGAVA; KAMBLE,
2006; RIAÑO-PACHÓN, D. M. et al., 2007).
Os fatores de transcrição participam do crescimento e desenvolvimento
de todos os organismos e, portanto, são proteínas regulatórias importantes no
controle da expressão gênica e respostas a estresses ambientais; eles
aumentam ou diminuem a taxa transcricional de seus genes alvo pela ligação a
seqüências de DNA específicas existentes em seus promotores. Estes FTs
podem ser classificados em várias famílias com base na estrutura de seus
domínios de ligação (PÉREZ-RODRÍGUEZ et al., 2010). Estudos de expressão
gênica têm identificado diversos FTs, tais como WRKY, bZIP e MYB em
diferentes espécies vegetais e essas famílias foram implicadas na regulação ao
estresse abiótico (CHEN; CHEN, 2002; CHEN; ZHANG; YU, 2010) e também na
defesa contra patógenos (LOPES, M.A et al., 2010). O trabalho realizado por
Lopes et al. (2010) analisou a expressão por macroarranjos e qPCR de oitenta e
oito FTs oriundos do trabalho de GESTEIRA et al. (2007b), possivelmente
envolvidos na resposta do cacaueiro à infecção por M. perniciosa. O resultado
desse trabalho mostrou que 72 destes fatores apresentaram expressão
diferencial entre plantas de cacaueuiro resistentes e suscetíveis inoculadas com
26
fungo da vassoura-de-bruxa. Estes fatores pertencem às famílias bZIP, MYB e
WRKY, e apresentam perfis de expressão opostos entre as interações cacau-M.
perniciosa resistentes e suscetíveis.
Os fatores de transcrição, em oposição à maioria dos genes estruturais,
tendem a controlar as etapas múltiplas de diferentes vias de sinalização, sendo
sugeridos como grandes alvos moleculares para melhoramento genético de
plantas cultivadas (KHONG, G. et al., 2008). Assim, no presente trabalho foi feito
uma análise in silico das famílias de FTs em geral contidas no genoma do
cacaueiro, além de caracterizar especificamente a família de FTs bZIP e inferir
relações filogenéticas com outras espécies de angiospermas. Para a análise in
silico foi feita uma busca de todas as famílias de FTs de Theobroma cacao em
comparação com estudos em Arabidopsis thaliana, com intuito de observar sua
distribuição no genoma e nos cromossomos. Para a família de FTs bZIP foi
realizada a análise de domínios conservados, localização cromossômica e
estudos de filogenia molecular. Os FTs encontrados no genoma de T. cacao
foram comparados a grupos de ortólogos em dicotiledôneas (Arabidopsis
thaliana e Solanum lycopersicum) e em mocotiledôneas (Oryza sativa e
Sorghum bicolor).
2. Materiais e métodos
Identificação de fatores de trancrição
As sequências proteicas não-redundantes de Arabidopsis thaliana
contidas nas 60 famílias de fatores de transcrição foram obtidas do banco de
dados PLNTFDB (plntfdb.bio.uni-potsdam.de/V3.0) e do PHYTHOZOME
(www.phythozome.org). As proteínas codificadas e anotadas no genoma do
cacau foram obtidas do banco de dados do CIRAD
(http://cocoagendb.cirad.fr/download.html) para a análise. As sequências
proteicas de cada família de fator de transcrição em Arabidopsis foram usadas
para blastar contra as proteínas preditas no genoma do cacau usando o
programa Blastall versão 2.2.7 baixado no NCBI
27
(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST). O e-value utilizado no
BlastP foi ≤ -10 para buscar sequências candidatas das famílias de FTs. Em
seguida, as sequências candidatas de cacau foram analisadas nos programas
PFAM (pfam.sanger.ac.uk) e SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/),
baseando no HMMER para identificar domínios conservados e específicos para
cada família. Após a análise, as proteínas foram agrupadas nas suas
respectivas famílias de fatores de transcrição. Para a análise mais detalhada
da família bZIP, as espécies Oryza sativa, Sorghum bicolor e Solanum
lycopersicum também foram utilizadas. As sequências proteicas de Oryza
sativa e Sorghum bicolor foram obtidas do banco de dados genômicos
PlantGDB (http://www.plantgdb.org/XGDB/phplib/download.php?GDB=Sb) e
estas da espécie Solanum lycopersicum do SOL GENOMICS
(solgenomics.net). A busca pelos FTs bZIP nessas espécies também foi
realizada a partir do BlastP das sequências de Arabidopsis como molde usando
o mesmo programa citado.
Localização cromossomal e duplicação de genes TcbZIP
Após determinar os genes pertencentes à família TcbZIP, foi realizada
uma análise para observar a distribuição e localização desses genes nos
cromossomos do cacaueiro. Para isso, foi obtido um mapa físico dos
cromossomos no site do banco de dados genômicos do cacau – CacaoGenDB
(http://cocoagendb.cirad.fr) usando os números do Interpro IPR004827 e
IPR011616 para bZIP1 (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Para a duplicação de
genes e colinearidade, todos os genes presentes no genoma do cacau obtidas
do banco de dados CacaoGenDB foram usados na análise como arquivo de
entrada utilizando o programa MCScanX de acordo o manual (WANG et al.,
2012). Para essa análise, o cromossomo “Tc00” foi excluído, pois esse
cromossomo corresponde a regiões do genoma que não foram agrupadas nem
anotadas dentre os dez cromossomos presentes no cacaueiro.
28
Identificação de motivos conservados dos membros TcbZIP
Os motivos conservados das 59 proteínas TcbZIP foi determinado pelo
programa MEME versão 4.11.2 (http://meme-suite.org/tools/meme) (BAILEY et
al., 2009) e um diagrama esquemático de motivos de cada gene TcbZIP foi
desenhado. Os parâmetros foram ajustados para determinar um número
máximo de 20 motivos, sendo que cada motivo deveria ter entre 6 e 300
resíduos de aminoácido e apresentar qualquer número de repetição. Outros
parâmetros foram usados como padrão. A classificação das proteínas de
TcbZIP foi baseada na classificação feita por CORRÊA et al. (2008) que
determinou grupos de ortólogos entre espécies estudadas. Também foi
utilizada para a classificação da família TcbZIP a análise de motivos
conservados e análise filogenética entre Arabidopsis, cacau, arroz, tomate e
sorgo. A arquitetura do domínio nas sequências de TcbZIP foi dada pelo
Superfamily (http://supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMILY) e modificada
manualmente de acordo com análises do MEME.
Alinhamento múltiplo e análise filogenética
Para investigar as relações evolutivas entre os genes da família bZIP de
cacau foi feito um alinhamento entre as sequências aminoacídicas de cacau,
arabidopsis, tomate, arroz e sorgo usando o programa MUSCLE v3.6 (EDGAR,
2004). A árvore filogenética foi construída usando o programa MEGA 5.1 e o
método estatístico Neighbor-Joining foi utilizado com uma confiabilidade de
1000 replicações (SAITOU; NEI, 1987). P-distance foi o modelo evolucionário
usado para a análise dos genes de bZIP entre cacau e Arabidopsis, enquanto o
modelo Jones Taylor Thornton (JTT) usado para a filogenia das angiospermas,
sendo escolhido como o melhor modelo evolutivo de substituição pelo
Modeltest versão 3.7 (POSADA; CRANDALL, 1998).
3. Resultados e Discussão
29
Fatores de transcrição no genoma do cacau
Os fatores de transcrição (FTs) são agrupados em 60 famílias baseado
no banco de dados do PLNTFDB (PÉREZ-RODRÍGUEZ et al., 2010). No
genoma do cacau foram identificados 1978 genes de fatores de transcrição que
foram agrupados dentro de 59 famílias de FTs, sendo que não foram
encontrados genes para a família S1Fa-like (Tabela 1). Para Arabidopsis foram
anotados 1923 FTs no banco de dados de fatores de transcrição de plantas.
Esse grande número de FTs já demonstra a importância na regulação gênica
da planta (PÉREZ-RODRÍGUEZ et al., 2010). Trinta e oito famílias de FTs
apresentaram números de genes similares entre cacau e Arabidopsis. No
entanto, 21 famílias apresentaram diferentes números de genes entre as
espécies em estudo. No cacau, dez famílias possuem um maior número de
genes e onze famílias apresentam menor número de genes se comparados à
Arabidopsis (Tabela 1).
O genoma do cacau contém algumas famílias de fatores de transcrição
que incluem mais de 100 membros, tais como AP2- EREBP (APETALA2 -
ETHYLENE RESPONSE ELEMENT BINDING PROTEIN), MYB, bHLH (basic
helix-loop-helix), C2H2 e NAC. MYB apresentou um maior número de
representantes com 170 FTs, o que significou quase 9% do total de FTs no
genoma do cacau (Tabela 1 e Figura 1). Ao contrário, em famílias como SAP,
NOZZLE, LFY e HRT só foi encontrado um único fator de transcrição para
cacau e na família S1Fa-like nenhum membro foi detectado, enquanto que em
Arabidopsis três membros foram descritos no banco de dados. As famílias
ABI3VP1, ARR-B, bHLH, DBP, FAR1, GRAS, MYB, NAC, Trihelix e CAMTA
tiveram mais membros em cacau do que em Arabidopsis, apresentando uma
diferença expressiva para as famílias DBP e FAR1 onde houve uma diferença
de 62 e 50 membros entre as duas espécies, respectivamente. DBP e FAR1
representaram aproximadamente 3% do total de FTs em cacau, enquanto em
Arabidopsis foi de apenas 0,2 e 0,9 % (Figura 1). Em contrapartida, outras
famílias apresentaram menos FTs do que Arabidopsis como AP2-EREBP,
bZIP, C2C2-DOF, C3H, GeBP, HB, MADS, LOB e WRKY. A diferença mais
30
expressiva foi para os FTs da família MADS que apresentou 29 FTs a menos
que em Arabidopsis (Tabela 1).
O genoma do cacau possui 10 cromossomos (Chr) e um tamanho
estimado de 430 Mb para a variedade de cacau Criollo (B97-61/B2). O CIRAD
sequenciou aproximadamente 326.9 Mb, sendo identificados 28.798 genes que
codificam alguma proteína (ARGOUT et al., 2011). Com isso, os FTs das
famílias em estudo representam aproximadamente 7% de todo o genoma
anotado. Uma maior porcentagem de FTs foi observada no cromossomo 1 (15
%), seguido pelo 2 e 9 (11%), ao contrário do cromossomo 7 (3%) que teve
menor abundância. Muitos genes de FTs ainda não foram anotados em
nenhum cromossomo, representando 15% do total e por isso foram colocados
no Chr00 (Figura 2). Para a espécie Arabidopsis spp., o tamanho do genoma é
de 135 Mb e este contêm 25.498 genes codificadores de proteínas. Os fatores
de transcrição representam assim uma porcentagem de aproximadamente 7,5
% dos genes codificadores de proteínas. Apesar do genoma do cacau ser
quase quatro vezes maior que o de Arabidopsis, essas duas espécies possuem
um valor próximo de genes codificadores de proteínas e interessantemente
também a quantidade de FTs é similar. Comparando os dois genomas, o cacau
tem um maior número de genes, mas uma menor densidade por 100 kb, sendo
que Arabidopsis possui 85% de seu genoma composto por regiões gênicas ou
genes propriamente ditos (BARAKAT; MATASSI; BERNARDI, 1998; ARGOUT
et al., 2008). É sabido que muitas diferenças no tamanho dos genomas devem-
se ao acúmulo de elementos transponíveis ou regiões não codificadoras de
proteínas. No entanto, não há clara evidência da relação entre tamanho do
genoma e complexidade biológica.
Tabela 1. Número de genes presentes nas diferentes famílias de fatores de transcrição no genoma de Theobroma cacao.
Familia de FT Arabidopsis thaliana Theobroma cacao ABI3VP1 57 81 Alfin-like 7 8
AP2-EREBP 146 126 ARF 23 24
ARR-B 13 25 BBR/BPC 7 4
BES1 8 9 bHLH 136 154
31
BSD 11 9 bZIP 77 59
C2C2-CO-like 17 10 C2C2-Dof 36 24
C2C2-GATA 29 24 C2C2-YABBY 6 9
C2H2 99 105 C3H 68 58
CAMTA 6 17 CCAAT 43 42
CPP 8 9 CSD 4 3 DBP 4 66
E2F-DP 8 8 EIL 6 3
FAR1 17 67 FHA 17 15
G2-like 40 45 GeBP 20 8 GRAS 33 46 GRF 9 11 HB 91 76
HRT 2 1 HSF 23 19 LFY 1 1 LIM 6 7 LOB 43 36
MADS 105 76 mTERF 34 37
MYB 147 170 MYB-related 69 61
NAC 104 113 NOZZLE 1 1
OFP 18 14 Orphans 87 78
PBF-2-like 3 2 PLATZ 11 15
RWP-RK 14 13 S1Fa-like 3 0
SAP 1 1 SBP 16 17
Sigma70-like 6 5 SRS 10 6 TAZ 7 4 TCP 24 22 Tify 16 13
Trihelix 23 32 TUB 10 9 ULT 2 2 VOZ 2 3
WRKY 72 61 zf-HD 17 17 Total 1923 1978
32
Figura 1. Abundância de fatores de transcrição no genoma de cacau e Arabidopsis thaliana. Porcentagem de cada família de fatores de transcrição no genoma das duas espécies em relação ao total de proteínas nas 60 famílias de FTs.
33
Figure 2. Distribuição dos fatores de transcrição nos cromossomos de cacau. Porcentagem de membros FTs de todas as famílias presentes nos dez cromossomos do cacau (Ch 01 a Ch 10). No Ch00 corresponde a regiões do genoma não clusterizadas e, portanto contêm genes que não foram anotados nos cromossomos.
Análise da família de fatores de transcrição bZIP
Os fatores de transcrição da família bZIP se caracterizam por conterem
de 60 a 80 aminoácidos no seu domínio conservado bZIP, sendo composto por
dois motivos: uma região responsável pela ligação da proteína a seu DNA alvo
e um zíper de leucina que é necessária para a dimerização do fator de
transcrição (ALBER, 1992; JAKOBY et al., 2002). Em nossa análise, 59 genes
bZIP foram detectados e distribuídos em nove dos dez cromossomos do cacau,
exceto no Chr 06 (Figura 3). A maior abundância de bZIP foi vista nos
cromossomos 1 e 8 com 9 genes cada. Os cromossomos 3, 4 e 7
apresentaram somente três genes cada. Os outros genes foram distribuídos
nos Chr 2, 5, 9 e 10 com 8, 5, 7 e 4, respectivamente (Figura 3). Oito genes
bZIP (Tc00_g054140, Tc00_g051020, Tc00_g087150, Tc00_g054170,
34
Tc00_g064820, Tc00_g085110, Tc00_g023170 e Tc00_g028220) não tiveram
suas localizações definidas, sendo alocados no “Chr 00”.
Nós analisamos também as regiões sintênicas presentes nos 10
cromossomos do cacau. Dezenove genes da família bZIP identificados nesse
trabalho demonstraram ter se originado de eventos de duplicação gênica
conforme mostra a Figura 4. O gene Tc01_g002580 foi o único gene a
participar de dois eventos de duplicação segmental com os genes
Tc02_g006520 e Tc08_g002600. Os cromossomos 1 e 8 apresentaram um
maior número de genes localizados em regiões sintênicas, enquanto os
cromossomos 3, 6 e 7 não apresentaram duplicações para essa família em
estudo (Figura 4). A análise sintênica indicou que 32% dos genes TcbZIP foram
duplicados segmentalmente. Diversos estudos têm demonstrado que os
eventos de duplicação de genes acontecem com alta frequência em
organismos eucariontes (MAERE et al., 2005). Essas duplicações são de
fundamental importância para os organismos, pois esses genes são capazes
de responder a diferentes estímulos ambientais e ajudam a tolerar mutações no
DNA. Por isso, esses eventos de duplicação e a disposição em tandem dos
genes desempenham um papel chave nas vantagens evolutivas adquiridas
pelo organismo ao longo dos anos (CANNON et al., 2004). Sendo assim, esses
eventos são importantes na expansão de famílias multigênicas como as de
FTs, nos quais os genes podem manter a mesma função do gene ancestral,
adquirirem novas funções ou mesmo serem silenciados. O padrão de
transcrição nos genes pode se alterar diante desses eventos e também de
duplicações do genoma que ocorre em muitas espécies de angiospermas. Por
isso é fundamental identificar e compreender a influência dessas duplicações
nos FTs para o conhecimento evolutivo e melhoramento genético (LYNCH;
CONERY, 2000; BLANC; WOLFE, 2004).
35
Figure 3. Localização cromossômica dos fatores de transcrição bZIP no cacau. Distribuição e posição dos genes TcbZIP nos 10 cromossomos presentes no banco de dados do CocoaGenDB. Os genes que não foram clusterizados, portanto alocados no cromossomo “00” não foram mostrados.
36
Figura 4. Duplicação de genes bZIP no genoma do cacau. Os números dos cromossomos são indicados em cada cromossomo. Os genes com relações de sintenia são relacionados por linhas. As linhas cinza representam todos os blocos sintênicos existentes no genoma do cacau entre os 10 cromossomos. A linha vermelha sugere duplicação entre os genes bZIP. Os genes estão nomeados e as cores iguais representam as duplicações cromossômicas.
Para analisar as relações entre os genes TcbZIP, o padrão de motivos
conservados presentes nas 59 proteínas do genoma do cacau foi analisado. A
combinação entre alguns desses motivos encontrados formam o domínio bZIP
nas diferentes proteínas e caracteriza a diversidade na família. A composição e
37
distribuição dos motivos nas proteínas bZIP encontradas no genoma do cacau
são mostradas na Figura 5. O motivo 1 é encontrado em quase todas as
proteínas e possui 29 aminoácidos conservados (Figura 5 e 6). A combinação
dos motivos 1 e 6 é a mais abundante e esta presente em 41 proteínas (Figura
5). Os motivos 1 e 4 foram encontrados juntos em 10 proteínas, enquanto 6
proteínas apresentaram a combinação entre os motivos 1 e 9 (Figura 5). A
proteína Tc10_g011860 apresentou somente o motivo 4 e Tc02_g028220 o
motivo 9. Os 20 motivos encontrados pelo programa MEME foram
determinados com base na posição específica dos aminoácidos na sequência e
nas suas propriedades bioquímicas (BAILEY et al., 2009). Dentre eles, 4
motivos (1, 4, 6 e 9) e suas combinações formam o domínio bZIP completo
(Figura 6A). Dentre as proteínas do cacau analisadas foi possível detectar
quatro combinações apresentando o domínio bZIP (Figura 6B). Quarenta e
duas proteínas apresentaram uma arquitetura do domínio ao centro ou
acompanhado de aminoácidos antes e depois do bZIP, 13 na região C-terminal
e 3 na região N-terminal, sendo que Tc07_g005870 apresentou ainda o
domínio NB-ARC (Figura 6B).
Classificação dos membros TcbZIP e filogenia molecular
As regiões conservadas na sequência proteica (motivos) e a combinação
entre elas dentro das proteínas de uma família possibilitam classificar seus
membros em grupos. Assim, comparando a estrutura primária e/ou terciária
dessas proteínas com as de outras espécies é possível inferir algumas
relações filogenéticas e possíveis funções homólogas entre organismos (CHOI;
KIM, 2006). A classificação dos fatores de transcrição bZIP em cacau foi
baseada na classificação do grupo de Angiospermas realizada com as
espécies Arabidopsis, arroz e algodão (CORRÊA et al., 2008). As proteínas
foram organizadas em treze grupos (A a L e o grupo S) de acordo com a
similaridade entre as sequências. Os membros do grupo S tenderam a ficar
separados dos outros grupos.
Assim, nesse trabalho uma árvore filogenética de angiospermas foi
construída a partir do alinhamento das sequências proteicas da família bZIP de
38
Theobroma cacao (59), Arabidopsis thaliana (77), Solanum lycopersicum (76),
Oryza sativa (90) e Sorghum bicolor (89). As proteínas bZIP do cacau tiveram
representantes nos treze grupos. O grupo A apresentou um maior número de
genes (11 bZIPs), enquanto os grupos B, K, J e H tiveram um único membro
(Figura 7). Alguns clados agruparam somente proteínas das monocotiledôneas
(arroz e sorgo), assim como outros clados só agruparam membros de
dicotiledôneas (Arabidopsis, tomate e cacau). Os genes Tc01g001240 e
Tc08g004010 pertencem ao grupo A e, curiosamente, foram agrupadas em um
clado com espécies de monocotildôneas (Figura 7). Esses dois FTs
apresentaram a composição de motivos diferentes dos outros membros do
grupo A.
39
Figura 5. Localização e composição de motivos conservados nas proteínas TcbZIP. Representação esquemática de dez motivos nas sequencias de bZIP em cacau e suas combinações.
40
Figure 6. Representação esquemática dos motivos bZIP e sua localização nas sequências dos genes. A. Sequências aminoacídicas conservadas identificadas nos motivos de bZIP pelo programa MEME. As letras representam os resíduos aminoacídicos presentes na sequência, enquanto o eixo y mostra seu posicionamento. O tamanho da letra indica o grau de conservação do aminoácido naquela posição. B. Localização do domínio zíper de leucina nos membros TcbZIP e sua combinação com outros domínios analisados pelo Superfamily.
41
Figure 7. Árvore filogenética dos reguladores bZIP em Angiospermas. Árvore inferida pelo método estatístico Neighbor-joining com o modelo JTT usando as sequências de fatores de transcrição bZIP das dicotiledôneas Arabidopsis thaliana (At), Theobroma cacao (Tc) e Solanum lycopersicum (Sl) e monocotiledôneas Oryza sativa (Os) e Sorghum bicolor (Sb). (A) Proteínas agrupadas em triângulos coloridos representam os grupos similares de A a L, além do grupo S com proteínas tendendo a formar grupos separados. (B) Representação do número de FTs bZIP das espécies em cada grupo que foram identificados.
42
4. Conclusão
Esses dados permitiram uma análise por bioinformática dos FTs
presentes no genoma do cacau e uma melhor compreensão evolutiva da
família de FTs bZIP, conhecida por serem envolvidos nos mecanismos de
resposta da planta a patógenos. Esse trabalho é pioneiro na caracterização e
estudo evolutivo da família bZIP em Theobroma cacao e permitirá a
continuidade da investigação sobre as funções biológicas dos genes. A partir
dos dados gerados genes candidatos podem ser selecionados para o
melhoramento genético de plantas.
43
Referências Bibliográficas
ALBER, T. Structure of the leucine zipper. Current Opinion in Genetics & Development, v.2, n.2, p.205-210. 1992.
ARGOUT, X. et al. Towards the understanding of the cocoa transcriptome: Production and analysis of an exhaustive dataset of ESTs of Theobroma cacao L. generated from various tissues and under various conditions. BMC Genomics, v.9, n.1, p.512. 2008.
BAILEY, T. L. et al. MEME Suite: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Research, v.37, n.Web Server issue, p.W202-W208. 2009.
BARAKAT, A.; MATASSI, G.; BERNARDI, G. Distribution of genes in the genome of Arabidopsis thaliana and its implications for the genome organization of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.95, n.17, p.10044-10049. 1998.
BLANC, G.; WOLFE, K. H. Functional Divergence of Duplicated Genes Formed by Polyploidy during Arabidopsis Evolution. The Plant Cell, v.16, n.7, July 1, 2004, p.1679-1691. 2004.
CANNON, S. B. et al. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology, v.4, n.1, p.1-21. 2004.
CHEN, C.; CHEN, Z. Potentiation of developmentally regulated plant defense response by AtWRKY18, a pathogen-induced Arabidopsis transcription factor. Plant Physiol, v.129. 2002.
CHEN, L.; ZHANG, L.; YU, D. Wounding-Induced WRKY8 Is Involved in Basal Defense in Arabidopsis. Molecular Plant-Microbe Interactions, v.23, n.5, 2010/05/01, p.558-565. 2010.
CHOI, I.-G.; KIM, S.-H. Evolution of protein structural classes and protein sequence families. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.103, n.38, September 19, 2006, p.14056-14061. 2006.
CORRÊA, L. G. G. et al. The Role of bZIP Transcription Factors in Green Plant Evolution: Adaptive Features Emerging from Four Founder Genes. PLoS ONE, v.3, n.8, p.e2944. 2008.
44
EDGAR, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research, v.32, n.5, March 1, 2004, p.1792-1797. 2004.
FUJITA, M. et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses: a current view from the points of convergence in the stress signaling networks. Current Opinion in Plant Biology, v.9, n.4, p.436-442. 2006.
GESTEIRA, A. S. et al. Comparative Analysis of Expressed Genes from Cacao Meristems Infected by Moniliophthora perniciosa. Ann Bot (Lond), v.100. 2007.
JAKOBY, M. et al. bZIP transcription factors in <em>Arabidopsis</em>. Trends in Plant Science, v.7, n.3, p.106-111. 2002.
JALALI, B. L.; BHARGAVA, S.; KAMBLE, A. Signal transduction and transcriptional reglulation of plant defense responses. Journal Phytopathology, v.154, p.65-74. 2006.
KHONG, G. et al. Modulating rice stress tolerance by transcription factors. Biotechnol Genet Eng Rev, v.25, p.381-403. 2008.
LOPES, M. A. et al. Expression analysis of transcription factors from the interaction between cacao and Moniliophthora perniciosa (Tricholomataceae). Genet Mol Res. , v.9, p.1279-97. 2010.
LYNCH, M.; CONERY, J. S. The evolutionary fate and consequences of duplicate genes. Science, v.290, p.1151-1155. 2000.
MAERE, S. et al. Modeling gene and genome duplications in eukaryotes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.102, n.15, April 12, 2005, p.5454-5459. 2005.
MICHELI, F. et al. Functional genomics of cacao. In: K. Jean-Claude. e D. Michel (Ed.). Advances in botanical research. Londres: Academic Press, v.55, 2010. Functional genomics of cacao, p.119-177
ORCHARD, J. et al. Changes in morphology and measurement of cytokinin levels during the development of witches' brooms on cocoa. Plant Pathology, v.43, n.1, p.65-72. 1994.
PÉREZ-RODRÍGUEZ, P. et al. PlnTFDB: updated content and new features of the plant transcription factor database. Nucleic Acids Research, v.38, n.suppl 1, January 1, 2010, p.D822-D827. 2010.
45
POSADA, D.; CRANDALL, K. A. MODELTEST: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics, v.14, n.9, January 1, 1998, p.817-818. 1998.
RIAÑO-PACHÓN, D. M. et al. PlnTFDB: an integrative plant transcription factor database. BioMed Central Bioinformatics. 2007.
SAITOU, N.; NEI, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, v.4, n.4, July 1, 1987, p.406-425. 1987.
SANTOS FILHO, L. P. Produção de cacau e a vassoura-de-bruxa na Bahia. Agrotópica., v.20, p. 73-82. 2008.
SCARPARI, L. M. Biochemical changes during the development of witches' broom: the most important disease of cocoa in Brazil caused by Crinipellis perniciosa. Journal of Experimental Botany, v.56, n.413, p.865-877. 2005.
WANG, Y. et al. MCScanX: a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity. Nucleic Acids Research, v.40, n.7, p.e49-e49. 2012.
46
Capítulo II
Manuscrito submetido
Genome-wide identification and characterization of cacao
WRKY transcription factors and analysis of their expression
in response to witches’ broom disease
Scientific reports – Factor impact 5.47 (2015)
47
Genome-wide identification and characterization of cacao WRKY transcription factors
and analysis of their expression in response to witches’ broom disease
Dayanne Silva Monteiro de Almeida1, Daniel Oliveira Jordão do Amaral
1, Luiz
Eduardo Vieira Del Bem2, Emily Bronze dos Santos
1, Raner José Santana Silva
1, Karina
Peres Gramacho3, Michel Vincentz
2, Fabienne Micheli
1,4,*
1 Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Departamento de Ciências Biológicas
(DCB), Centro de Biotecnologia e Genética (CBG), Rodovia Ilhéus-Itabuna, km 16,
45662-900 Ilhéus-BA, Brazil
2 Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Departamento de Genética e
Evolução, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, Brasil
3 Cocoa Research Center, CEPLAC/CEPEC, 45600-970 Itabuna-BA, Brazil
4 CIRAD, UMR AGAP, F-34398 Montpellier, France
* Corresponding author. E-mail: [email protected]
Running title: WRKY family of cacao
Keywords: DNA-protein interaction, plant defense, regulatory gene, Theobroma cacao
Abbreviations: ABA: abscisic acid; COC: calcium oxalate crystals; hai: hours after
inoculation; dai: days after inoculation; JA: jasmonic acid; LRR: leucine-rich repeat;
OA: oxalic acid; ROS: reactive oxygen species; SA: salicylic acid; TF: transcription
factor; WD: WRKY domain.
Abstract
48
The transcriptional regulation, led by transcription factors (TFs) such as those of the
WRKY family, is a mechanism used by the organism to enhance or repressed gene
expression in response to stimuli. Here, we report the genome-wide analysis of the
Theobroma cacao WRKY TF family and also the investigation the expression of
WRKY genes in cacao infected by the fungus Moniliophthora perniciosa. In the cacao
genome, 61 non-redundant WRKY sequences were found and classified in three groups
(I to III) according to the WRKY and zinc-finger motif types. The 61 putative WRKY
sequences were distributed on the 10 cacao chromosomes and 24 of them came from
duplication events. The sequences were phylogenetically organized according to the
general WRKY groups. Some clades were structured also according to plant
classification. The most divergent groups according to plant origin were IIc and III.
According to the phylogenetic analysis, 7 TcWRKY genes were selected and analyzed
by RT-qPCR. Some TcWRKY genes showed interesting responses to M. perniciosa
and/or may be associated with SA/JA balance, such as
Tc01_p014750/Tc06_p013130/AtWRKY28,
Tc09_p001530/Tc06_p004420/AtWRKY40, Tc04_p016130/AtWRKY54 and
Tc10_p016570/ AtWRKY70. Our results can help to select appropriate candidate genes
for further characterization in cacao or in other Theobroma species.
Introduction
Plants, whether growing under natural or agricultural conditions, are exposed to adverse
environmental situations that affect their development and can drastically reduce their
productivity. Such environmental stimuli can be abiotic (e.g., drought, cold, wounds) or
caused by pathogens1. However, plants have mechanisms to survive in such adverse
conditions, including tolerance or resistance to stress through adaptation mechanisms2.
49
When stress conditions are detected by plants, complex transduction pathways are
induced, initiating a series of molecular, physiological and metabolic events, generally
leading to an increase of tolerance/resistance3. The transcriptional regulation, led by
transcription factors (TFs) – regulation proteins that link DNA sequences in specific
promotor regions of target genes – is the first mechanism that is activated by the
organism to enhance or repress gene expression involved in response to internal or
external stimuli4. Such TFs can regulate more than one gene as well as other TFs
4.
Among TFs, the WRKY family is well known. The first WRKY protein was
identified from sweet potato5 and since then, WRKY proteins have been characterized
in several other plants6,7
as well as in algae and non-plant eukaryotes8. The WRKY TFs
link a specific promotor sequence of the target gene, known as W-box, positively or
negatively regulating the target gene expression. The WRKY proteins contain one or
two DNA binding domains of 60 amino acids containing the conserved heptapeptide
WRKYGQK followed by a zinc-finger motif C2H2 (C-X4-5-C-X22-23-H-X-H) or C2HC
(C-X7-C-X23-24-H-X-C)6. In some species, members of the WRKY family containing
three DNA binding domains have been found9,10
. The WRKY TF family is known to be
involved in response to biotic and abiotic stresses7, and also to modulate various other
processes in plants such as embryogenesis11
, trichome and seed development12
, leaf
senescence13
, fruit and pollen development14
, biomass15
, secondary metabolite
biosynthesis16
and hormone signalization17
. In Arabidopsis species, several WRKY
genes have been experimentally characterized and associated with response to fungal or
bacterial pathogens18,19
, as well as to nematodes20
. In cacao (Theobroma cacao L.),
some WRKY genes have been previously identified and partially analyzed regarding
expression, phylogenetic analysis within the Malvaceae family, and/or potential use for
50
marker assisted selection21-23
, but no exhaustive analysis of this TF family based on
cacao genome data has been carried out.
Here, we report the genome-wide analysis of the T. cacao WRKY TF family and
the identification of a comprehensive and non-redundant set of WRKY genes from this
species. Subsequently, chromosomal location was determined and phylogenetic and
motif analyses were performed as a basis for further comparative genomics studies.
Moreover, expression patterns of WRKY genes in cacao infected (or not) with the
pathogenic fungus Moniliophthora perniciosa were also investigated.
The cacao tree is cultivated mainly for its beans, used as raw material for making
chocolate. However, bean production is threatened worldwide by several pathogens,
such as M. perniciosa, the agent of the witches’ broom disease24
, one of the most
devastating diseases of the crop in Central and South America and the Caribbean25
. This
disease has been responsible for the abandonment by producers of many cultivated areas
in these regions26
, to the point of causing a shortage of cacao beans in the global
market27
. In this scenario, during the genomic and post-genomic eras, tools have been
developed to understand the cacao-M. perniciosa interaction as well as identify
molecules that can be used to develop disease control methods. Here we identified 61
TcWRKY proteins, of which some were closely related to cacao’s response to M.
perniciosa and can be considered good candidates for subsequent functional analyses or
disease management.
Materials and methods
Datasets and WRKY protein identification
All Theobroma cacao protein sequences available in a single file in the CocoaGenDB
database (Theobroma_cacao_v1.pep.faa.gz; http://cocoagendb.cirad.fr)28
were
51
downloaded. WRKY protein sequences of Arabidopsis thaliana were downloaded from
the Phytozome database (www.phythozome.org) and plant transcription factor database
(http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0) and were used as input sequences. The
annotated protein sequences of tomato (Solanum lycopersicum) were downloaded from
the Sol Genomics Network (http://solgenomics.net), and those of rice (Oryza sativa spp.
japonica) and sorghum (Sorghum bicolor) were downloaded from PlantGDB
(http://www.plantgdb.org). The local BLASTP program (blastall version 2.2.27;
ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST) was downloaded and used to
search WRKY members in the different genomes. The e-value for BLASTP was set at
1e-10 to obtain the final dataset of WRKY proteins. Only the longest non-redundant
sequences were used for subsequent analysis when more than one alternative splicing
sequence was found for the same locus. Subsequently, these candidate protein
sequences in all species were submitted to analysis using the InterPro
(http://www.ebi.ac.uk/interpro/) and PFAM programs (http://pfam.xfam.org/) to
confirm the presence of the WRKY domain. Search in the CocoaGenDB based on
keywords was also realized. In some cases, the zinc-finger domain was searched using
the SMART program (http://smart.embl-heidelberg.de/). The protein sequences lacking
both the WRKY and the zinc-finger domains were manually excluded.
TcWRKY gene classification and chromosomal location
After confirmation and identification of the final dataset of TcWRKY proteins, the
sequence alignment was performed using the ClustalOMEGA software
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). The cacao TcWRKY proteins were
categorized based on Arabidopsis WRKY protein classification6. The distribution of the
TcWRKY sequences on cacao chromosomes was obtained from the CacaoGenDB
52
database (http://cocoagendb.cirad.fr)28
using the Interpro number IPR003657
(http://www.ebi.ac.uk/interpro/). The sequences downloaded from the CacaoGenDB
database, excluding the chromosome Tc00, were used as input file for prediction of
WRKY gene duplication and collinearity using the MCScanX toolkit, according to the
manual29
.
Identification of conserved motifs in TcWRKY proteins
The detection of the motif composition in the 59 identified cacao WRKY proteins was
performed with the MEME 4.9.1 program (http://meme.nbcr.net/meme/intro.html)30
.
The maximum number of motifs was set at 20, the maximum motif length was set at 80
amino acids, the optimum motif width was constrained to between 6 and 300 residues,
and the other parameters were used as default. The combination of motifs within the
cacao WRKY genes was performed with the SuperFam program
(http://supfam.org/SUPERFAMILY/) based on hidden Markov models.
Phylogenetic analysis
Phylogenetic analysis and evolutionary framework was performed based on the
alignment of 58 TcWRKY genes with 72, 103, 79 and 96 WRKY genes from
Arabidopsis, rice, tomato and sorghum, respectively (Supplementary Material 1). A
phylogenetic tree of amino acid sequences of WRKY domains from only cacao and
Arabidopsis (Supplementary material 2) was also constructed. The complete WRKY
protein sequences or the amino acid sequences of WRKY domains were aligned using
the MUSCLE program v3.631
with default parameters. The MEGA 5.1 software was
used to construct a rooted phylogenetic tree32
. The tree based on WRKY domain of
Arabidopsis and cacao was used to identify and classify putative orthologs. The
53
statistical method used to construct the tree was neighbor-joining33
, the evolutionary
distances were obtained using the p-distances method, and these distances were used to
estimate the number of amino acid substitutions per site. The reliability of each tree was
established by conducting 1000 bootstrap sampling steps. To construct the tree with all
species used in this study, the JTT evolutionary model plus gamma-distributed rate
(JTT+G) were used as determined by the Modeltest program version 3.734
.
Plant material and inoculation fungus
Seeds of Theobroma cacao L. genotypes Catongo (susceptible to M. perniciosa) and
TSH1188 (resistant) were germinated in a mixture of Plantmax® and soil (proportion
2:1) and grown in greenhouses of CEPLAC/CEPEC (Bahia, Brazil). Four weeks after
germination, the apical meristems of 300 seedlings from each genotype were inoculated
with a drop35
of a basidiospore suspension (2.105 basidiospores.ml
-1) in agar (4145
inoculum maintained in the CEPLAC/CEPEC M. perniciosa phytopathological
collection under number 109/2013/SECEX/CGEN). After inoculation, the plantlets
were kept for 48 h at 23 ± 2 °C and 100% humidity. Apical meristems were harvested at
6, 12, 24, 48 and 72 hai and 7, 15, 30 and 45 dai. Control plants (300 seedlings of each
genotype were mock-inoculated with distilled water) were kept and harvested under the
same conditions and at the same time points. For each genotype and at each harvesting
time (for inoculated and non-inoculated plants), 24 samples were collected (1 sample =
1 apical meristem of 1 cacao plantlet) and immediately frozen in liquid nitrogen and
stored at -80°C until use. Then three samples collected from each genotype at each
harvesting time were pooled forming one biological replicate; three biological replicates
were obtained (i.e., 9 meristems from the 24 collected were used).
54
Total RNA extraction and cDNA synthesis
Cacao samples were macerated in liquid nitrogen until obtaining a fine powder. Total
RNA was extracted using the RNAqueous® Total RNA isolation kit according to the
manufacturer’s instructions (Thermo Scientific) with modifications as previously
described 36
. Briefly, after the addition of the lysis buffer to the macerated samples, a
sonication step was added (10 s pulse/min, 70% output; Gex Ultrasonic processor 130,
130 W) to break polysaccharides which are present in high levels in cacao tissues. This
step was conducted on ice. RNA was quantified using a NanoDrop 2000
spectrophotometer (Thermo Scientific) and its integrity was checked by 1% agarose gel
electrophoresis. RNA was treated by DNAse I RNase-free according to the
manufacturer’s instructions (Invitrogen). The cDNA was synthesized from 200 ng of
RNA using the RevertAid First Strand cDNA kit according to the manufacturer’s
instruction (Thermo Scientific). The cDNA quantification was carried out in the same
NanoDrop 2000 spectrophotometer.
Primer design and qPCR analysis
Seven cacao WRKY genes (Tc04_t016130, Tc10_t016570, Tc09_t001530,
Tc06_t004420, Tc06_t013130, Tc01_t014750, Tc01_t018460) were selected based on
the phylogenetic analysis and search for genes well characterized in the Arabidopsis
genus and possibly involved in plant defense mechanism against fungi. Specific primers
were designed for each gene using the OligoPerfect™ Designer tool
(http://tools.thermofisher.com) according to the following criteria: i) amplicon size of
65–150 bp; ii) primer length of 17-23 bases; iii) melting temperature of 57-63°C; and
iv) GC content of 40%-80% (Supplementary Materials 3 and 4). The OligoAnalyzer
55
v.3.1 program (https://www.idtdna.com/calc/analyzer) was used to analyze the primer
pairs in relation to hairpin, self-dimer and hetero-dimer formation
(https://www.idtdna.com/calc/analyzer). Primers were also designed to amplify specific
regions showing different sizes, melting temperatures, GC contents and GC/AT ratios
(Supplementary Material 4) to avoid cross-reaction between genes from the cacao
WRKY family37
. For qPCR analysis, two reference genes (malate dehydrogenase/MDH
and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase/GAPDH) previously described in cacao
meristems infected by M. perniciosa36,38
were used (Supplementary Material 3).
Expression analysis by qPCR was conducted in an Agilent Technologies Stratagene
Mx3005P system (Agilent Technologies). The qPCR reaction consisted of 200 ng of
cDNA, 0.5 µM of each primer from candidate reference genes (Supplementary Material
3) and 1X of Maxima™
SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Scientific) in a
total volume of 12.5 µl. Cycling conditions were: 50 °C for 2 min, 95 °C for 1 min
followed by 40 cycles at 95 °C for 30 s, 58 °C for 45 s and 72 °C for 30 s, with
detection of the fluorescent signal at the end of each extension cycle. To verify that each
primer pair produced only a single PCR product, dissociation analysis was carried out
under the following cycling conditions: 95 ºC for 25 s, 58 ºC for 30 s and 72 ºC for 30 s.
The amplification efficiency of each primer pair was analyzed using three amounts (50,
100 and 200 ng) of each cDNA sample. Experiments also included a negative control
(no template DNA). Real-time data acquisition was performed with the Stratagene
MX3005P system containing the MxPro QPCR software (Agilent Technologies), which
provided the values of cycle threshold (Ct) and of fluorescence. Amplification
efficiency (E) was accessed using the Miner 2.2 software39
. The gene expression level
was analyzed with three experimental repetitions for both Catongo and TSH1188
genotypes with the comparative Ct method (2-ΔΔCt
) using: i) MDH and GAPDH as
56
reference genes (average of expression values from both genes); and ii) non-inoculated
plants as calibrator (at each harvesting time, a non-inoculated sample was collected and
used as calibrator of the corresponding inoculated sample). Statistical analysis was done
using the SASM-Agri software, which tested the experiments as a completely
randomized design. F-test (ANOVA) was applied with a critical value of 0.05. The
Duncan test (P ≤ 0.05) was employed for mean separation when F-values were
significant.
Results
Identification and classification of TcWRKY sequences
In the cacao genome, 61 non-redundant sequences corresponding to putative WRKY
proteins were found using BLASTP (Table 1). Among them, 47 had been previously
annotated as WRKY proteins in the CocoaGenDB; the other 14 proteins identified by
BLASTP had been previously annotated as uncharacterized, predicted or hypothetical
proteins (data not shown). Among the 61 non redundant sequences, 60 contained at least
one complete heptapeptide WRKY motif while one sequence (Tc02_g012180) did not
present such conserved stretch (Table 1). The TcWRKY proteins were classified into
three groups according to the presence of WRKY motif and the zinc-finger motif type.
Group I contained two WRKY motifs (one in the N-terminal region of the sequence, the
other in the C-terminal region) and two C2H2 zinc-finger motifs; this group contained
10 TcWRKY proteins (Table 1; Fig. 1A). Group II contained only one WRKY motif
and a C2H2 zinc-finger motif (40 TcWRKY proteins). Group III contained only one
WRKY motif and a C2HC zinc-finger motif (8 TcWRKY proteins) (Table 1, Fig. 1A).
It was not possible to classify the three other putative WRKY proteins (Tc02_g017240,
Tc02_g001170 and Tc02_g012180) because of the presence of a highly altered WRKY
57
motif and/or zinc-finger motif, or because of the absence of WRKY motif (Table 1; Fig.
1A). The zinc finger motifs C2H2 from the group I were CX4CX22HX1H (N-terminal)
and CX4CX23HX1H (C-terminal) for all sequences (Fig. 2). Group II was divided into
five subgroups (IIa to e) according to C2H2 zinc-finger structure. Subgroups IIa, IIb,
IIc, IId and IIe were found to contain 3, 8, 17, 6 and 6 genes, respectively (Table 1) and
the members of subgroups IIa, IId, IIe and 6 members of subgroup IIb showed the
CX5CX23HX1H zinc-finger motif. The other two members of subgroup IIb
(Tc02_g033950 and Tc04_g007790) showed the CX5CX25HX1H and CX5CX31HX1H
zinc-finger structures, respectively (Fig. 2). All the members of group IIc showed the
CX4CX23HX1H zinc-finger structure (Fig. 2). In the case of group III, the zing-finger
motif was CX7CX23HX1C (Fig. 2). The WD was highly conserved in 52 proteins, but
some of them presented variations (Table 1; Fig. 2). The proteins Tc00_g076580,
Tc00_g017270, Tc01_g010220, Tc08_g013540 and Tc09_g005290 showed a WRKY
motif with only one amino acid modification; the protein Tc02_g001230 showed a
WRKY motif with two amino acid modifications (WRKHGQT) while Tc00_g017240
contained a WRKY motif with three modifications (WRCIGIK) – in addition to the
presence of an incomplete zinc-finger motif (Table 1, Fig. 2). These seven proteins
belong to subgroup IIc, III, or were non-classified (Table 1). The sequence
Tc02_g012180, which did not contain any WRKY motif , was removed from all
subsequent analyses, while the sequences Tc02_g001170 and Tc02_g012180, which
showed modified WRKY motif and modified zinc-finger motif, were excluded from
phylogenetic analysis.
Distribution of WRKY genes in the cacao genome
58
The 61 putative WRKY sequences were distributed on the 10 cacao chromosomes (Fig.
1B and C). A higher abundance of WRKY genes was observed on chromosome 1: 14
genes belonging to groups I (1 gene), II (12) and III (1) (Fig. 1B and C). In contrast,
chromosomes 8 and 10 contained only two WRKY genes each (from groups II and III,
respectively; Fig. 1B). The other WRKY genes were distributed as follows: 8, 7, 5, 5, 5,
3 and 6 on chromosomes 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 9, respectively. These genes mainly belong
to groups I and II (Fig. 1B). For four of the genes (Tc00_g047270, Tc00_g076580,
Tc00_017270, Tc00_g017240), the location was uncertain, so the genes were
distributed on “chromosome 00”, corresponding to non-clustered sequences of the
genome (Table 1; Fig. 1B). Because tandem and segmental duplication played an
important role in the expansion of multigene families, we analyzed the syntenic regions
and structural changes of all 10 cacao chromosomes (Fig. 3). Twenty-four WRKY
genes were identified in segmental duplication events in the cacao genome (Fig. 3).
Tc01_g035330 participated in two duplication events with Tc03_g019750 and
Tc03_g028030, as well as Tc01_g034680, which also participated in two duplication
events with Tc03_g017550 and Tc03_g028700. TcWRKY genes were located within
syntenic blocks of all chromosomes except chromosome 10. Most of the duplications
were located in chromosomes 1 and 3 (Fig. 3).
Phylogenetic analysis of TcWRKY proteins
A phylogenetic tree of complete WRKY sequences from T. cacao, Arabidopsis, rice,
tomato and sorghum was constructed to investigate the relationship between these
species (Supplementary Material 5). A phylogenetic tree of WRKY amino acid domains
from cacao and Arabidopsis was also constructed using the same method and for the
same purpose (Fig. 4). The resulting topologies of trees obtained from the two different
59
analyses were consistent (Fig. 4 and Supplementary Material 5). In general, the
complete sequences and WRKY domains were grouped according to the general
WRKY classification (group I, IIa-e, II). Some clades were organized also according to
the plant classification. For example, inside group III, sequences from sorghum and rice
(monocotyledons) were separated from Arabidopsis, tomato and cacao (dicotyledonous)
sequences. The most divergent subgroups according to plant origin were IIc and III
while the most related were IIa and IIb, as well as IIe and IId (Supplementary Material
5). In general, the TcWRKY sequences were closer to tomato and Arabidopsis
sequences (Supplementary Material 5). The phylogenetic tree constructed with cacao
and Arabidopsis WRKY domains allowed visualization of the WRKY groups and
making inferences about the possible function of cacao sequences based on Arabidopsis
sequence function knowledge (Fig. 4). Clades or sequences associated with plant
response to pathogen or defense inducers (such as abscisic acid or salicylic acid) were
identified and cacao sequences with possible defense response were selected for
expression analysis (Fig. 4).
To investigate the relationship between WRKY family members in cacao more
thoroughly, we analyzed the motif pattern of the TcWRKY sequences (Fig. 5A and B).
The different motifs were identified based on the biochemical properties of their amino
acids as well as their specific location in the protein sequence40
. The conserved amino
acids, the position of each residue in the WRKY sequence, as well as the residue that
varied according to the protein are presented in Figure 5B. Twenty motifs were found
and 3 of them (motifs 1 to 3; Fig. 5C) constituted the WD. Motifs 1 and 2,
corresponding to the C-terminal WRKY and the C2H2 motifs, were present in 58
TcWRKY members. Motif 3 corresponded to the N-terminal WRKY motif (10
members). Motif 4 is an intermediary amino acid region between motifs 1 and 2,
60
forming the complete WD with approximately 60 amino acids. This motif is present in
58 TcWRKY proteins (Fig. 5B and C). Six different combinations containing the
WRKY motifs were found in the proteins identified in the cacao genome (Fig. 5D).
Twenty-nine presented the WRKY motif in the center of the sequence, 18 in the C-
terminal region (one sequence/Tc05_g005710 contained also 2 leucine-rich repeat/LRR
motifs). Of the 10 members of group I (with duplicated domain), 9 members presented
the WRKY motif in the central region of the proteins while one presented this domain
in the C-terminal region. Three other members (Tc02_g001230, Tc02_g001200 e
Tc02_g001170) presented the WRKY motif domain in the N-terminal region of the
protein and also contained the 2 LRR motifs and one NB-ARC domain (Fig. 5D).
Expression patterns of seven selected TcWRKY genes in resistant and susceptible
Theobroma cacao genotypes
According to the phylogenetic analysis (Fig. 4), the orthology between cacao and
Arabidopsis and the putative function of WRKY genes in Arabidopsis (related to
response to biotic stress), 7 TcWRKY (Tc04_g016130, Tc10_g016570, Tc09_g001530,
Tc06_t004420, Tc06_t013130, Tc01_t014750 and Tc01_t018460) genes were selected
for expression analysis by RT-qPCR. From the 7 TcWRKY genes analyzed, one
belonged to group I (Tc01_t018460), two to subgroup IIa (Tc06_t004420,
Tc09_g001530), two to subgroup IIc (Tc01_t014750, Tc06_t013130) and one to group
III (Tc10_g016570). The expression of the TcWRKY genes was analyzed in two cacao
genotypes, TSH1188 (resistant to witches’ broom disease) and Catongo (susceptible)
infected or not (control) with M. perniciosa (Fig. 6). For both genotypes and for all the
harvesting points, the PCR amplification occurred at the same melting temperature,
showing that only the target gene was amplified (data not shown). RT-qPCR analysis
61
showed differential expression between genotypes and/or between time intervals for all
the analyzed genes. In Catongo, the TcWRKY genes Tc06_p004420, Tc09_p001530,
Tc04_p016130 and Tc10_p016570 showed higher expression in throughout the
infection (15 to 45d). The gene Tc01_p014750 showed higher expression at 15 dai but
also during the penetration of the fungus (6 hai; about 6 times more expressed). The
gene Tc06_p013130 showed higher expression (about 7 times more than the control) at
24 h, while the gene Tc01_p018460 was more expressed 7 dai (Fig. 6). In TSH1188, the
expression of the genes Tc06_p013130, Tc06_p004420, Tc09_p001530 and
Tc01_p018460 were low (about 2 times more expressed than control). The gene
Tc01_p014750 was mainly expressed during the penetration and colonization of the
fungus (6 to 24 hai; about 5 times more expressed). Interestingly, the Tc04_p016130
and Tc10_p016570 TcWRKY genes showed very high expression at 45 dai:
Tc04_p016130 showed an increase of about 12 times while Tc10_p016570 was
expressed 120 times more than the control (Fig. 6).
Discussion
WRKY proteins constitute one of the most important transcription factor families in
plants due to their participation in diverse biological processes, including responses to
biotic and abiotic stresses7. A better understanding of this family, including member
characterization, phylogenetic analysis and expression study, can help to define new
strategies for genetic improvement, as in the case of the cacao-M. perniciosa
interaction. In this study, based on sequence comparison and molecular phylogeny, 59
cacao proteins with complete WD were found (Table 1). These proteins belonged to the
three main WRKY groups and their subgroups, and were distributed in the overall
genome (Fig. 1). Seven members presented variations in the WD (in the heptapeptide or
62
in the C2H2 zinc finger motifs), suggesting a higher divergence – probably due to
recent mutations – of these genes in comparison to the rest of the TcWRKY family.
Groups IIc and III (5 and 1 gene, respectively) contained 70% of the amino acid
variations observed, suggesting that these two groups were the most active and variable.
Analysis in other species such as cotton or tomato, also showed that these two groups
were the most divergent in the evolutionary history of the WRKY family41,42
. The
phylogenetic analysis revealed that subgroups IIa and IIb are sister groups and share a
common ancestor, as well as subgroups IId and IIe (Fig. 4). Various studies have
demonstrated that the expression of WRKY FT members is mainly due to gene
duplication events, as shown in rice43
, Arabidopsis44
, cotton41
, Populus45
and barley46
.
Here, we observed that 40% of the TcWRKY sequences presented one or more
duplication events (Fig. 3) and that these events were associated mainly with the
conservation of the TcWRKY motif patterns (Fig. 4). Generally, the duplicated genes
were also present together in the same clades of the motif phylogeny as observed for
Tc04_g029800/Tc01_g031960, Tc04_g009710/Tc02_g032670,
Tc03_g028700/Tc03_g017550/Tc01_g034680, Tc03_g009820/Tc02_g033950,
Tc03_g028030/Tc03_g019750/Tc01_g035330, Tc01_g014750/Tc06_g013130,
Tc07_g002910/Tc06_g019530, Tc09_g034740/Tc05_g001480,
Tc04_g004210/Tc03_g015140 and Tc08_g000030/Tc01_g005580 (Fig. 3 and 4).
However, in the case of the duplication Tc08_g013540/Tc01_g010370, the two
sequences were located in different clades, suggesting an evolution of the motif
structure and gene (Fig. 3 and 4). Phylogenetic analysis in macromolecules, by forming
non-random clusters, also suggests that these molecules may share the same biological
functions, may be present in the same cell compartment or be expressed/produced at the
same moment during a biological process. Besides the heptapeptide WRKYGQK and
63
the C2H2/C2HC zinc-finger motifs – known to be involved in DNA-binding – some
TcWRKY proteins (Tc02_g001230, Tc02_g001200, Tc02_g001170 and
Tc00_g017270) showed conserved motifs, such as NB-ARC and/or LRR (Fig. 4D),
known to be involved in pathogen recognition, plant resistance and activation of plant
immunity. Several resistance (R) proteins contain the NB-ARC or NB-LRR domains,
and the NB site is known to be a key element of the R protein regulation activity. The
presence of such multi-functional domains in WRKY TF suggests that these proteins
possibly act either indirectly – by gene regulation through DNA-binding interaction – or
directly by interaction with pathogen effectors or with host factors modified by such
effectors (protein-protein interaction), leading to plant defense and transcriptional
reprogramming47,48
.
Expression and functional analysis of WRKY TF could help in discriminating
the role and function of these proteins at the tissue and organism levels. Here, we
evaluated by RT-qPCR the expression of seven TcWRKY genes in resistant and
susceptible cacao plants inoculated or not with M. perniciosa. The choice of the genes
was based on previous indications in the genome databank (CocoaGenDB),
phylogenetic analysis and putative function of the orthologous in Arabidopsis, showing
that: i) Tc01_p014750 and Tc06_p013130 (indicated as TcWRKY28) were co-
orthologous to AtWRKY8 and AtWRKY28; ii) Tc09_p001530 and Tc06_p004420 (both
indicated as TcWRKY40) were both orthologous to AtWRKY40; iii) Tc04_p016130 and
Tc10_p016570 were co-orthologous to AtWRKY54 and AtWRKY70; and iv)
Tc01_p018460 was orthologous to AtWRKY1 (Fig. 4). Interestingly, the Tc01_p014750
and Tc06_p013130 genes came from an event of duplication (Fig. 3) but showed
different expression patterns (Fig. 6), suggesting that sequence evolution resulted in
different roles and/or functions in relation to pathogen response. These two sequences
64
were co-orthologous to AtWRKY8 and AtWRKY28, which are induced by ABA,
wounding, oxalic acid (OA) and/or hydrogen peroxide (H2O2)49,50
. In cacao, the
Tc01_p014750 gene showed higher expression at the beginning of the penetration of the
fungus in TSH1188 and at 15 dai in the Catongo genotype (Fig. 6). In previous works, it
has been reported that the amount of calcium oxalate crystal (COC) and H2O2 level in
the same cacao genotype (TSH1188/resistant vs. Catongo/susceptible) present distinct
temporal and genotype dependent patterns51,52
. The susceptible genotype accumulated
more COC than the resistant one, and the COC dissolution – resulting in OA and H2O2
formation – occurred in the early infection stages in the resistant genotype and in the
final stage of the disease in the susceptible one. This suggests that Tc01_p014750 gene
expression may be induced through OA and/or H2O2 production, as observed for
AtWRKY28. The Tc06_p013130 gene (previously annotated as TcWRKY28) showed an
expression pattern different from the Tc01_p014750 one, with high expression at 24 h
in the susceptible genotype and a constant and low expression in the resistant one (Fig.
6). Such divergent behavior was previously observed for the rice WRKY28 gene.
DELTEIL et al. (2012) reported that the defect of OsWRKY28 by T-DNA insertion
leads to a twofold increase in resistance to a compatible rice blast fungus, and this
phenotype is accompanied with increased expression of several defense-related genes53
.
Likewise, Choja et al. showed that the overexpression of OsWRKY28 resulted in
enhanced susceptibility to the rice blast fungus Magnaporthe oryzae and decreased
accumulation of PR-554
. According to the authors, these phenotypes observed in
overexpression or genetic defects in OsWRKY28 are consistent with their presumed role
as a negative regulators of basal defense responses to compatible rice blast fungus
strains54
. The same role was also suggested for WRKY8 in Arabidopsis. This gene could
be a negative or positive regulator of the basal resistance of the plant when infected by
65
Pseudomonas syringae or Botrytis cinerea, respectively49
. In cacao, it can be suggested
that Tc01_p014750 acted as positive regulator of the plant resistance to M. perniciosa
through activation by OA and/or reactive oxygen species (ROS), while Tc06_p013130
may have acted as negative regulator of the basal resistant of cacao.
The Tc09_p001530 and Tc06_p004420 genes (both indicated as TcWRKY40)
showed high expression level in the susceptible cacao genotype (final stages; Fig. 6). In
Arabidopsis, studies have shown that the WRKY18, WRKY40 and WRKY60 TFs are
induced by pathogens and interact physically and functionally together forming homo
and heterocomplexes55
. The constitutive overexpression of these genes in Arabidopsis
increased the susceptibility to B. cinerea56
. Moreover, the superexpression of WRKY40
in transgenic Populus trichocarpa plants conferred high susceptibility to the
hemibiotrophic fungus Dothiorella gregária Sacc., indicating that PtrWRKY40 plays a
negative role in resistance to hemibiotrophic fungi in poplar57
. In cacao, the
Tc09_p001530 and Tc06_p004420 genes (TcWRKY40) may have a similar function to
that observed in poplar: the gene expression in the Catongo genotype may be associated
with the plant susceptibility to M. perniciosa. In the phylogenetic analysis, the
sequences Tc04_p016130 and Tc10_p016570 were grouped with AtWRKY54 and
AtWKY70 (Fig. 4). Tc04_p016130 and Tc10_p016570 showed similar expression
patterns, mainly with a very high expression in the longest interval in TSH1188 (about
10 and 140 times more at 45 dai, respectively). Several works have reported the
cooperation of the AtWRKY54 and AtWKY70 genes in response to biotic and abiotic
stresses58,59
. These TFs are positive regulators of plant defense, and cooperate as
negative regulators of salicylic acid (SA) biosynthesis and senescence59
. Moreover,
WRKY70 TF was identified as an integrator in cross-talk between SA and jasmonic
acid (JA), two hormones with a well-defined function in plant defense response
66
regulation. Generally, SA is associated with defense response against biotrophic
pathogens, whereas JA has a function in defense responses against herbivore and
necrotrophic pathogens60
. In cacao, previous works have shown an increase of
jasmonate biosynthesis gene expression in the last time stages in TSH1188-M.
perniciosa interaction (from 30 to 60 dai), as well as an increase of ROS detoxication
genes61
. In this context, the high expression of the Tc04_p016130 and Tc10_p016570
genes may be associated with the increase of JA biosynthesis gene expression as well as
ROS decrease in TSH1188. Indeed, in Arabidopsis, WRKY54 and WRKY70 are not
responsive to signals such as ROS58
. The gene Tc01_p018460 showed high
phylogenetic proximity with AtWRKY1 but also with other genes involved in pathogen
response induced by SA, such as AtWRKY3, ATWRKY58 and OsWRKY82 (Fig. 4;
Supplementary Material 5), and their expression was higher mainly at 7 dai in the
susceptible genotype (Fig. 6). No duplication was observed for this gene (Fig. 3). In O.
sativa, the WRKY82 gene was expressed mainly at the early stage of infection by
Magnaporthe grisea62
.
Conclusion
Here we identified 61 WRKY proteins from T. cacao, distributed in all chromosomes,
in some cases coming from different duplication events. To our knowledge, this is the
first report of the entire WRKY TF family in cacao and of expression analysis in
relation to M. perniciosa infection. The TcWRKY family showed a phylogenetic
composition similar to that of Arabidopsis and some sequences showed similar
expression patterns and possibly functions (e.g.,
Tc01_p014750/Tc06_p013130/AtWRKY28;
Tc09_p001530/Tc06_p004420/AtWRKY40; Tc04_p016130/AtWRKY54;
67
Tc10_p016570/ AtWRKY70; Tc01_p018460/AtWRKY1). Some TcWRKY genes
presented interesting responses to M. perniciosa and/or may be associated with SA/JA
balance. Our results can help to select appropriate candidate genes for further
characterization in relation to pathogen resistance in cacao or in other Theobroma
species.
Disclosures
No conflicts of interest declared.
Funding
The work of DSMA was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da
Bahia (FAPESB). DOJA was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq, project 401924/2012-2). LEVB was supported by
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). EBS was
supported by ICB/UESC then by CNPq. RJSS was supported by FAPESB. FM and
KPG were supported by research fellowships from CNPq (PQ1). This research was
supported by FAPESB (project DTE0038/2013) coordinated by FM. DSMA took a
practical course at Unicamp funded by Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de
Nível Superior (CAPES, PROCAD project).
Acknowledgments
We thank Dr. Aurizângela Oliveira de Sousa and Dr. Sara Pereira Menezes (UESC) for
helpful comments during RT-qPCR design and Dr. Claudia Fortes Ferreira (Embrapa
CNPMF, Brazil) for the English language revision.
68
Authors’ contributions
DSMA was responsible for conducting all the experiments. DOJA helped in design and
development of the expression analysis. LEVDB and MV participated in the
phylogenetic analysis. EBS helped in RNA extraction and cDNA synthesis. RJSS was
responsible for the duplication gene relationship analysis. KPG provided the plant
material. FM, MV, DOJM and DSMA analyzed the data. FM and DSMA wrote the
manuscript. FM was responsible for the financial support of the research and for
advising DSMA, EBS and RJSS, and for supervising DOJA. MV supervised DSMA
during the practical course at Unicamp.
69
Tables
Table 1. WRKY proteins present in the cacao genome (CacaoGenDB28
). The variants
of the conserved WRKYGQK peptide are shown in bold. nd: not determined.
Gene locus
WRKY domain
Group Chromosome Acession number Conserved heptapeptide
Zinc-finger
type
Domain
amount
Tc02_g032670 WRKYGQK/
WRKYGQK C2H2 2 I 2 XP_007045981.1
Tc04_g009710 WRKYGQK/
WRKYGQK C2H2 2 I 4 XP_007032626.1
Tc09_g034740 WRKYGQK/
WRKYGQK C2H2 2 I 9 XP_007017012.1
Tc05_g001480 WRKYGQK/
WRKYGQK C2H2 2 I 5 XP_007026547.1
Tc05_g005710 WRKYGQK/
WRKYGQK C2H2 2 I 5 XP_007027196.1
Tc05_g020810 WRKYGQK/
WRKYGQK C2H2 2 I 5 XP_007029376.1
Tc07_g002020 WRKYGQK/
WRKYGQK C2H2 2 I 7 XP_007020620.1
Tc07_g000190 WRKYGQK/
WRKYGQK C2H2 2 I 7 XP_007020301.1
Tc01_g018460 WRKYGQK/
WRKYGQK C2H2 2 I 1 XP_007049282.1
Tc09_g002780 WRKYGQK/
WRKYGQK C2H2 2 I 9 XP_007011940.1
Tc09_g001530 WRKYGQK C2H2 1 IIa 9 XP_007011727.1
Tc09_g001520 WRKYGQK C2H2 1 IIa 9 XP_007011726.1
Tc06_g004420 WRKYGQK C2H2 1 IIa 6 XP_007023430.1
Tc06_g019530 WRKYGQK C2H2 1 IIb 6 XP_007026134.1
Tc02_g003250 WRKYGQK C2H2 1 IIb 2 XP_007041570.1
Tc01_g032940 WRKYGQK C2H2 1 IIb 1 XP_007051308.1
Tc01_g017430 WRKYGQK C2H2 1 IIb 1 XP_007049086.1
Tc03_g009820 WRKYGQK C2H2 1 IIb 3 XP_007037253.1
Tc07_g002910 WRKYGQK C2H2 1 IIb 7 XP_007020766.1
Tc04_g007790 WRKYGQK C2H2 1 IIb 4 XP_007032468.1
Tc02_g033950 WRKYGQK C2H2 1 IIb 2 XP_007046206.1
Tc04_g029800 WRKYGQK C2H2 1 IIc 4 XP_007035842.1
Tc01_g010370 WRKYGQK C2H2 1 IIc 1 XP_007048165.1
Tc06_g013130 WRKYGQK C2H2 1 IIc 6 XP_007025165.1
Tc01_g039500 WRKYGQK C2H2 1 IIc 1 XP_007052352.1
Tc01_g014750 WRKYGQK C2H2 1 IIc 1 XP_007048873.1
Tc00_g047270 WRKYGQK C2H2 1 IIc 0 XP_007043929.1
Tc04_g004210 WRKYGQK C2H2 1 IIc 4 XP_007031915.1
Tc01_g031960 WRKYGQK C2H2 1 IIc 1 XP_007051149.1
Tc05_g004380 WRKYGQK C2H2 1 IIc 5 XP_007026988.1
Tc00_g076580 WRKYGKK C2H2 1 IIc 0 XP_007037699.1
Tc01_g035290 WRKYGQK C2H2 1 IIc 1 XP_007051697.1
70
Tc08_g013540 WRKYGKK C2H2 1 IIc 8 XP_007019683.1
Tc03_g015140 WRKYGQK C2H2 1 IIc 3 XP_007038026.1
Tc01_g010220 WRKYGKK C2H2 1 IIc 1 XP_007048143.1
Tc00_g017270 WRKYGKK C2H2 1 IIc 0 XP_007037701.1
Tc09_g005290 WRKYGKK C2H2 1 IIc 9 XP_007012369.1
Tc02_g032350 WRKYGQK C2H2 1 IIc 2 XP_007045916.1
Tc05_g027100 WRKYGQK C2H2 1 IId 5 XP_007030538.1
Tc09_g000780 WRKYGQK C2H2 1 IId 9 XP_007011614.1
Tc01_g005580 WRKYGQK C2H2 1 IId 1 XP_007047364.1
Tc03_g025390 WRKYGQK C2H2 1 IId 3 XP_007039903.1
Tc01_g027130 WRKYGQK C2H2 1 IId 1 XP_007050397.1
Tc08_g000030 WRKYGQK C2H2 1 IId 8 XP_007017155.1
Tc03_g028030 WRKYGQK C2H2 1 IIe 3 XP_007040356.1
Tc06_g000970 WRKYGQK C2H2 1 IIe 6 XP_007022995.1
Tc03_g019750 WRKYGQK C2H2 1 IIe 3 XP_007099721.1
Tc06_g013990 WRKYGQK C2H2 1 IIe 6 XP_007025322.1
Tc01_g035330 WRKYGQK C2H2 1 IIe 1 XP_007051705.1
Tc01_g031780 WRKYGQK C2H2 1 IIe 1 XP_007051114.1
Tc10_g016560 WRKYGQK C2HC 1 III 10 XP_007011366.1
Tc03_g017550 WRKYGQK C2HC 1 III 3 XP_007038956.1
Tc03_g028700 WRKYGQK C2HC 1 III 3 XP_007040478.1
Tc01_g034680 WRKYGQK C2HC 1 III 1 XP_007051596.1
Tc04_g016130 WRKYGQK C2HC 1 III 4 XP_007033512.1
Tc10_g016570 WRKYGQK C2HC 1 III 10 XP_007011367.1
Tc02_g001230 WRKHGQT C2HC 1 III 2 XP_007041160.1
Tc02_g001200 WRKYGQK C2HC 1 III 2 XP_007041155.1
Tc00_g017240a* WRCIGIK C1H2 1 nd 0 XP_007037703.1
Tc02_g001170a* RTKYYRC C1HC 1 nd 2 XP_007041153.1
Tc02_g012180a*
* No conserved stretch C2H2b 1 nd 2 XP_007043029.1
a Sequences not classified in any group due to the absence of WRKY domain, incomplete zinc finger motif and/or
small conserved WRKY domain. b Zinc finger C2H2 identified by the Smart program (http://smart.embl-heidelberg.de/) * Excluded from the phylogenetic analyses. ** Excluded from all the subsequent analyses.
71
Figure legends
Figure 1. Classification of TcWRKY genes and distribution on cacao chromosomes.
A. Number of TcWRKY genes belonging to WRKY groups. nc: non classified. B.
Repartition of TcWRKY gene groups among cacao chromosomes. Chromosome 00
corresponds to non-clustered genome regions. C. Distribution of the TcWRKY genes on
cacao chromosomes. In CocoaGenDB, the sequence names are preceded by “Tc_g”
(e.g., Tc_g005580).
Figure 2. Multiple alignments of WRKY domains from 60 TcWRKY genes. The
conserved WRKY heptapeptide is indicated in black; variations of the heptapeptide are
indicated in red. The zinc finger domain is indicated in grey. Gaps introduced to get the
best alignment are indicated by (-), (*) represents identical amino acids between all
sequences, (.) and (:) represent conserved substitutions and semi-conserved
substitutions, respectively.
Figure 3. Schematic representation of interchromosomal relationships of TcWRKY
genes. Gray lines indicate all syntenic blocks in the cacao genome, whereas the red lines
suggest duplicated WRKY gene pairs. The corresponding WRKY gene names are
indicated, duplicated genes are marked with the same color. The chromosome number is
indicated at the top of each chromosome.
Figure 4. Phylogenetic tree of 60 WRKY genes from cacao and Arabidopsis. TcWRKY
proteins were grouped into three groups and their subgroups as follows: group I in red,
subgroup IIa in light purple, subgroup IIb in dark blue, subgroup IIc in dark green,
subgroup IId in light green, subgroup IIe in orange, group III in dark purple. (*) and
(**) indicate the N-terminal and C-terminal WD from group I genes. Cacao WRKY
genes possibly involved in plant defense response and selected for gene expression
analysis are indicated in red.
72
Figure 5. Phylogenetic tree and motif composition of TcWRKY proteins. A.
Phylogenetic tree of 58 TcWRKY proteins (excluding Tc00_g017240, Tc02_g001170
and Tc02_g012180) obtained using the Mega v.5.1 program. WRKY groups are
indicated in red. B and C. Motif composition (B.) and detail (C.) of the three first most
probable motifs (WRKY C-terminal, C2H2 and WRKY N-terminal motifs) of the
TcWRKY proteins, obtained by the MEME program. D. Organization of the 60
TcWRKY genes (excluding Tc02_g012180) in 6 categories by domain combination
using the Superfamily program. The numbers indicated on the left represent the number
of WRKY cacao genes in each category.
Figure 6. Expression profile of seven TcWRKY genes in resistant (TSH118) and
susceptible (Catongo) cacao plants inoculated with M. perniciosa. Cacao genotypes are
indicated at the top of the figure; gene name is indicated on the left. The control used as
calibrator in the expression value calculation corresponds to the non-inoculated plants
collected at each harvesting time and used as calibrators of the corresponding inoculated
sample (see also Methods section). The results are the arithmetical mean of the
repetitions ± standard error. Different letters indicate significant statistical difference
between samples by the Duncan test (P ≤ 0.05). d: days after inoculation; h: hours after
inoculation.
73
Figures
Figure 1. Almeida et al.
74
Figure 2. Almeida et al.
75
Figure 3. Almeida et al.
76
Figure 4. Almeida et al.
77
Figure 5. Almeida et al.
78
Figure 6. Almeida et al.
79
References
1 Kole, C. et al. Application of genomics-assisted breeding for generation of climate
resilient crops: Progress and prospects. Frontiers in Plant Science 6,
doi:10.3389/fpls.2015.00563 (2015).
2 Mickelbart, M. V., Hasegawa, P. M. & Bailey-Serres, J. Genetic mechanisms of abiotic
stress tolerance that translate to crop yield stability. Nat Rev Genet 16, 237-251,
doi:10.1038/nrg3901 (2015).
3 Lata, C. et al. Genome-Wide Investigation and Expression Profiling of AP2/ERF
Transcription Factor Superfamily in Foxtail Millet (<italic>Setaria italica L.</italic>).
PLoS ONE 9, e113092, doi:10.1371/journal.pone.0113092 (2014).
4 Burley, S. K. & Kamada, K. Transcription factor complexes. Current Opinion in Structural
Biology 12, 225-230, doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0959-440X(02)00314-7 (2002).
5 Ishiguro, S. & Nakamura, K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding
protein, SPF1, that recognizes SP8 sequences in the 5' upstream regions of genes
coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato. Mol Gen Genet. 244, 563-
571 (1994).
6 Eulgem, T., Rushton, P. J., Robatzek, S. & Somssich, I. E. The WRKY superfamily of plant
transcription factors. Trends in Plant Science 5, 199-206,
doi:http://dx.doi.org/10.1016/S1360-1385(00)01600-9 (2000).
7 Rushton, P. J., Somssich, I. E., Ringler, P. & Shen, Q. J. WRKY transcription factors.
Trends in Plant Science 15, 247-258 (2010).
8 Zhang, Y. & Wang, L. The WRKY transcription factor superfamily: its origin in
eukaryotes and expansion in plants. BMC Evolutionary Biology 5, 1-1,
doi:10.1186/1471-2148-5-1 (2005).
9 Zhang, Y. & Feng, J. c. Identification and Characterization of the Grape WRKY Family.
BioMed Research International 2014, 14, doi:10.1155/2014/787680 (2014).
10 Cai, H. et al. CaWRKY6 transcriptionally activates CaWRKY40, regulates Ralstonia
solanacearum resistance, and confers high-temperature and high-humidity tolerance
in pepper. Journal of Experimental Botany 66, 3163-3174, doi:10.1093/jxb/erv125
(2015).
11 Lagacé, M. & Matton, D. P. Characterization of a WRKY transcription factor expressed
in late torpedo-stage embryos of Solanum chacoense. Planta 219, 185-189,
doi:10.1007/s00425-004-1253-2 (2004).
12 Johnson, C. S., Kolevski, B. & Smyth, D. R. TRANSPARENT TESTA GLABRA2, a Trichome
and Seed Coat Development Gene of Arabidopsis, Encodes a WRKY Transcription
Factor. The Plant Cell 14, 1359-1375, doi:10.1105/tpc.001404 (2002).
13 Miao, Y., Laun, T., Zimmermann, P. & Zentgraf, U. Targets of the WRKY53 transcription
factor and its role during leaf senescence in Arabidopsis. Plant Molecular Biology 55,
853-867, doi:10.1007/s11103-005-2142-1 (2004).
14 Guan, Y. et al. Phosphorylation of a WRKY Transcription Factor by MAPKs Is Required
for Pollen Development and Function in <italic>Arabidopsis</italic>. PLoS Genet 10,
e1004384, doi:10.1371/journal.pgen.1004384 (2014).
15 Rinerson, C. I. et al. The WRKY transcription factor family and senescence in
switchgrass. BMC Genomics 16, 912, doi:10.1186/s12864-015-2057-4 (2015).
16 Suttipanta, N. et al. The Transcription Factor CrWRKY1 Positively Regulates the
Terpenoid Indole Alkaloid Biosynthesis in Catharanthus roseus. Plant Physiology 157,
2081-2093, doi:10.1104/pp.111.181834 (2011).
80
17 Zhang, Z. L. A Rice WRKY Gene Encodes a Transcriptional Repressor of the Gibberellin
Signaling Pathway in Aleurone Cells. Plant Physiology 134, 1500-1513,
doi:10.1104/pp.103.034967 (2004).
18 Pandey, S. P., Roccaro, M., Schön, M., Logemann, E. & Somssich, I. E. Transcriptional
reprogramming regulated by WRKY18 and WRKY40 facilitates powdery mildew
infection of Arabidopsis. The Plant Journal 64, 912-923, doi:10.1111/j.1365-
313X.2010.04387.x (2010).
19 Mukhtar, M. S., Deslandes, L., Auriac, M.-C., Marco, Y. & Somssich, I. E. The
Arabidopsis transcription factor WRKY27 influences wilt disease symptom
development caused by Ralstonia solanacearum. The Plant Journal 56, 935-947,
doi:10.1111/j.1365-313X.2008.03651.x (2008).
20 Bhattarai, K. K., Atamian, H. S., Kaloshian, I. & Eulgem, T. WRKY72-type transcription
factors contribute to basal immunity in tomato and Arabidopsis as well as gene-for-
gene resistance mediated by the tomato R gene Mi-1. The Plant Journal 63, 229-240,
doi:10.1111/j.1365-313X.2010.04232.x (2010).
21 Lopes, M. A. et al. Expression analysis of transcription factors from the interaction
between cacao and Moniliophthora perniciosa (Tricholomataceae). Genet Mol Res 9,
1279-1297, doi:10.4238/vol9-3gmr825 (2010).
22 Borrone, J. W., Meerow, A. W., Kuhn, D. N., Whitlock, B. A. & Schnell, R. J. The
potential of the WRKY gene family for phylogenetic reconstruction: An example from
the Malvaceae. Molecular Phylogenetics and Evolution 44, 1141-1154,
doi:10.1016/j.ympev.2007.06.012 (2007).
23 Borrone, J. W., Kuhn, D. N. & Schnell, R. J. Isolation, characterization, and development
of WRKY genes as useful genetic markers in Theobroma cacao. Theoretical and Applied
Genetics 109, 495-507, doi:10.1007/s00122-004-1662-4 (2004).
24 Aime, M. C. & Phillips-Mora, W. The causal agents of witches' broom and frosty pod
rot of cacao (chocolate, Theobroma cacao) form a new lineage of Marasmiaceae.
Mycologia 97, 1012-1022, doi:10.3852/mycologia.97.5.1012 (2005).
25 Purdy, L. & Schmidt, R. Status of cacao witches' broom: biology, epidemiology, and
management. Annual Review of Phytopathology 34, 573-594,
doi:doi:10.1146/annurev.phyto.34.1.573 (1996).
26 Griffith, G. W., Nicholson, J., Nenninger, A., Birch, R. N. & Hedger, J. N. Witches'
brooms and frosty pods: two major pathogens of cacao. Vol. 41 (Scientific and
Industrial Research Publishing, 2003).
27 Sayid, R. in The Daily Mirror online http://www.mirror.co.uk/news/world-
news/chocolate-could-run-out-2020-2913505 (2013).
28 Argout, X. et al. The genome of Theobroma cacao. Nat Genet 43, 101–108 (2011).
29 Wang, Y. et al. MCScanX: a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene
synteny and collinearity. Nucleic Acids Research 40, e49-e49, doi:10.1093/nar/gkr1293
(2012).
30 Bailey, T. L. et al. MEME Suite: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids
Research 37, W202-W208, doi:10.1093/nar/gkp335 (2009).
31 Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high
throughput. Nucleic Acids Research 32, 1792-1797, doi:10.1093/nar/gkh340 (2004).
32 Tamura, K. et al. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum
Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular
Biology and Evolution 28, 2731-2739, doi:10.1093/molbev/msr121 (2011).
33 Saitou, N. & Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4, 406-425 (1987).
81
34 Posada, D. & Crandall, K. A. MODELTEST: testing the model of DNA substitution.
Bioinformatics 14, 817-818, doi:10.1093/bioinformatics/14.9.817 (1998).
35 Surujdeo-Maharaj, S., Umaharan, P., Butler, D. R. & Sreenivasan, T. N. An optimized
screening method for identifying levels of resistance to Crinipellis perniciosa in cocoa
(Theobroma cacao). Plant Pathology 52, 464-475, doi:10.1046/j.1365-
3059.2003.00865.x (2003).
36 Pereira Menezes, S. et al. The pathogenesis-related protein PR-4b from Theobroma
cacao presents RNase activity, Ca2+ and Mg2+ dependent-DNase activity and
antifungal action on Moniliophthora perniciosa. BMC Plant Biology 14, 161 (2014).
37 Ririe, K. M., Rasmussen, R. P. & Wittwer, C. T. Product Differentiation by Analysis of
DNA Melting Curves during the Polymerase Chain Reaction. Analytical Biochemistry
245, 154-160, doi:http://dx.doi.org/10.1006/abio.1996.9916 (1997).
38 Pinheiro, T. T. et al. Establishing references for gene expression analyses by RT-qPCR in
Theobroma cacao tissues. Genetics and Molecular Research 10, 3291 - 3305, doi:DOI:
10.4238/2011.November.17.4 (2012).
39 Zhao, S. & Fernald, R. D. Comprehensive Algorithm for Quantitative Real-Time
Polymerase Chain Reaction. Journal of computational biology : a journal of
computational molecular cell biology 12, 1047-1064, doi:10.1089/cmb.2005.12.1047
(2005).
40 Bailey, T. L. & Gribskov, M. Combining evidence using p-values: application to
sequence homology searches. Bioinformatics 14, 48-54,
doi:10.1093/bioinformatics/14.1.48 (1998).
41 Cai, C. et al. Genome-wide analysis of the WRKY transcription factor gene family in
Gossypium raimondii and the expression of orthologs in cultivated tetraploid cotton.
The Crop Journal 2, 87-101, doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.cj.2014.03.001 (2014).
42 Huang, S. et al. Genome-wide analysis of WRKY transcription factors in Solanum
lycopersicum. Molecular Genetics and Genomics 287, 495-513, doi:10.1007/s00438-
012-0696-6 (2012).
43 Ross, C. A., Liu, Y. & Shen, Q. J. The WRKY Gene Family in Rice (Oryza sativa). Journal of
Integrative Plant Biology 49, 827-842, doi:10.1111/j.1744-7909.2007.00504.x (2007).
44 Wang, Q. et al. WRKY gene family evolution in Arabidopsis thaliana. Genetica 139, 973-
983, doi:10.1007/s10709-011-9599-4 (2011).
45 Jiang, Y. et al. Genome-wide identification and characterization of the Populus WRKY
transcription factor family and analysis of their expression in response to biotic and
abiotic stresses. Journal of Experimental Botany 65, 6629-6644,
doi:10.1093/jxb/eru381 (2014).
46 Mangelsen, E. et al. Phylogenetic and comparative gene expression analysis of barley
(Hordeum vulgare) WRKY transcription factor family reveals putatively retained
functions between monocots and dicots. BMC Genomics 9, 194, doi:10.1186/1471-
2164-9-194 (2008).
47 van Ooijen, G. et al. Structure–function analysis of the NB-ARC domain of plant disease
resistance proteins. Journal of Experimental Botany 59, 1383-1397,
doi:10.1093/jxb/ern045 (2008).
48 Caplan, J., Padmanabhan, M. & Dinesh-Kumar, S. P. Plant NB-LRR Immune Receptors:
From Recognition to Transcriptional Reprogramming. Cell Host & Microbe 3, 126-135,
doi:10.1016/j.chom.2008.02.010.
49 Chen, L., Zhang, L. & Yu, D. Wounding-Induced WRKY8 Is Involved in Basal Defense in
Arabidopsis. Molecular Plant-Microbe Interactions 23, 558-565, doi:10.1094/mpmi-23-
5-0558 (2010).
82
50 Chen, X. et al. Overexpression of AtWRKY28 and AtWRKY75 in Arabidopsis enhances
resistance to oxalic acid and Sclerotinia sclerotiorum. Plant Cell Reports 32, 1589-1599,
doi:10.1007/s00299-013-1469-3 (2013).
51 de Oliveira Ceita, G. et al. Involvement of calcium oxalate degradation during
programmed cell death in Theobroma cacao tissues triggered by the hemibiotrophic
fungus Moniliophthora perniciosa. Plant Science 173, 106-117,
doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.plantsci.2007.04.006 (2007).
52 Dias, C. V. et al. Hydrogen peroxide formation in cacao tissues infected by the
hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa. Plant Physiology and Biochemistry
49, 917-922, doi:10.1016/j.plaphy.2011.05.004 (2011).
53 Delteil, A. et al. Building a mutant resource for the study of disease resistance in rice
reveals the pivotal role of several genes involved in defence. Molecular Plant
Pathology 13, 72-82, doi:10.1111/j.1364-3703.2011.00731.x (2012).
54 Chujo, T. et al. OsWRKY28, a PAMP-responsive transrepressor, negatively regulates
innate immune responses in rice against rice blast fungus. Plant Molecular Biology 82,
23-37, doi:10.1007/s11103-013-0032-5 (2013).
55 Xu, X., Chen, C., Fan, B. & Chen, Z. Physical and functional interactions between
pathogen-induced Arabidopsis WRKY18, WRKY40, and WRKY60 transcription factors.
Plant Cell 18, doi:10.1105/tpc.105.037523 (2006).
56 Xu, X., Chen, C., Fan, B. & Chen, Z. Physical and Functional Interactions between
Pathogen-Induced Arabidopsis WRKY18, WRKY40, and WRKY60 Transcription Factors.
The Plant Cell 18, 1310-1326, doi:10.1105/tpc.105.037523 (2006).
57 Karim, A. et al. Isolation and characterization of a subgroup IIa WRKY transcription
factor PtrWRKY40 from Populus trichocarpa. Tree Physiology 35, 1129-1139,
doi:10.1093/treephys/tpv084 (2015).
58 Besseau, S., Li, J. & Palva, E. T. WRKY54 and WRKY70 co-operate as negative regulators
of leaf senescence in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany 63, 2667-
2679, doi:10.1093/jxb/err450 (2012).
59 Li, J. et al. Defense-related transcription factors WRKY70 and WRKY54 modulate
osmotic stress tolerance by regulating stomatal aperture in Arabidopsis. The New
Phytologist 200, 457-472, doi:10.1111/nph.12378 (2013).
60 Shim, J. S. et al. AtMYB44 regulates WRKY70 expression and modulates antagonistic
interaction between salicylic acid and jasmonic acid signaling. The Plant Journal 73,
483-495, doi:10.1111/tpj.12051 (2013).
61 da Hora Junior, B. T. et al. Transcriptomics and systems biology analysis in
identification of specific pathways involved in cacao resistance and susceptibility to
witches' broom disease. Molecular BioSystems 8, 1507-1519 (2012).
62 Ryu, H.-S. et al. A comprehensive expression analysis of the WRKY gene superfamily in
rice plants during defense response. Plant Cell Reports 25, 836-847,
doi:10.1007/s00299-006-0138-1 (2006).
83
SUPPLEMENTARY MATERIAL
Supplementary Material 1. Accession numbers of Arabidopsis thaliana, Oryza sativa,
Solanum lycopersicum and Sorghum bicolor WRKY sequences used for phylogenetic
analysis.
Arabidopsis thaliana Oryza sativa Solanum lycopersicum Sorghum bicolor
AT1G13960.1 Os01g08710 Solyc05g012770 Sb08g016240
AT1G18860.1 Os01g09080 Solyc03g104810 Sb01g032120
AT1G29280.1 Os01g09100 Solyc02g088340 Sb03g038510
AT1G29860.1 Os01g14440 Solyc06g066370 Sb09g015900
AT1G30650.1 Os01g18584 Solyc09g014990 Sb09g023270
AT1G55600.1 Os01g40260 Solyc07g066220 Sb07g028430
AT1G62300.1 Os01g40430 Solyc07g065260 Sb02g037660
AT1G64000.1 Os01g43550 Solyc12g014610 Sb07g016330
AT1G66550.1 Os01g43650 Solyc04g056360 Sb02g027950
AT1G66560.1 Os01g46800 Solyc05g055750 Sb06g019710
AT1G66600.1 Os01g47560 Solyc10g084380 Sb01g007480
AT1G68150.1 Os01g51690 Solyc10g005680 Sb09g029810
AT1G69310.1 Os01g53040 Solyc12g006170 Sb03g030480
AT1G69810.1 Os01g53260 Solyc07g047960 Sb04g033240
AT1G80590.1 Os01g54600 Solyc07g005650 Sb09g028660
AT1G80840.1 Os01g60490 Solyc04g051540 Sb03g028530
AT2G03340.1 Os01g60520 Solyc02g094270 Sb07g006230
AT2G04880.1 Os01g60540 Solyc01g079260 Sb06g024220
AT2G21900.1 Os01g60600 Solyc05g053380 Sb03g003360
AT2G23320.1 Os01g60640 Solyc05g015850 Sb03g003640
AT2G24570.1 Os01g61080 Solyc01g089960 Sb09g005700
AT2G25000.1 Os01g62510 Solyc02g071130 Sb01g007570
AT2G30250.1 Os01g62514 Solyc07g056280 Sb05g017130
AT2G30590.1 Os01g74140 Solyc01g058540 Sb03g026170
AT2G34830.1 Os02g08440 Solyc12g011200 Sb09g026830
AT2G37260.1 Os02g16540 Solyc08g062490 Sb09g026350
AT2G38470.1 Os02g26430 Solyc08g081630 Sb03g011800
AT2G40740.1 Os02g43560 Solyc04g051690 Sb03g033780
AT2G40750.1 Os02g47060 Solyc05g012500 Sb09g028750
AT2G44745.1 Os02g53100 Solyc02g080890 Sb03g000240
AT2G46130.1 Os03g20550 Solyc07g051840 Sb04g016540
AT2G46400.1 Os03g21710 Solyc12g056750 Sb04g034440
AT2G47260.1 Os03g33012 Solyc02g032950 Sb03g032800
AT3G01080.1 Os03g45450 Solyc09g010960 Sb03g026280
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Supplementary Material 2. List of the 153 T. cacao and A. thaliana WRKY domains
used for phylogeny.
85
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>AtWRKY71 SEIDHLEDGYRWRKYGQKAVKNSPYPRSYYRCTTQKCNVKKRVERSFQDPSIVITTYEGKHNHPIP
>AtWRKY8 TEVDHLEDGYRWRKYGQKAVKNSPYPRSYYRCTTQKCNVKKRVERSYQDPTVVITTYESQHNHPIP
>Tc06_g013130 SEVDHLEDGYRWRKYGQKAVKNSPYPRSYYRCTTQKCTVKKRVERSFQDPSVVITTYEGQHNHPLPTTLRG
>AtWRKY28 SEVDHLEDGYRWRKYGQKAVKNSPYPRSYYRCTTQKCNVKKRVERSFQDPTVVITTYEGQHNHPIP
>Tc02_g032350 SEVDHLEDGYRWRKYGQKAVKNSPYPRSVAISKSEKTDMSYYRCTNSKCTVKKRVERSSEDPTTVITTYEGQHCHHS
>AtWRKY57 SDVDNLEDGYRWRKYGQKAVKNSPFPRSYYRCTNSRCTVKKRVERSSDDPSIVITTYEGQHCHQTI
>AtWRKY68 SEVLHLDDGYKWRKYGQKPVKDSPFPRNYYRCTTTWCDVKKRVERSFSDPSSVITTYEGQHTHPRP
>Tc01_g031960 SEVDHLEDGYRWRKYGQKAVKNSPFPRSYYRCTTTSCNVKKRVERSFSDPSIVVTTYEGQHTHPSPVIPRP
>AtWRKY23 SEVDHLEDGYRWRKYGQKAVKNSPFPRSYYRCTTASCNVKKRVERSFRDPSTVVTTYEGQHTHISP
>Tc09_g002780C GDVGISGDGYRWRKYGQKMVKGNPNPRNYYRCTSAGCPVRKHIETAVDNTNAVIITYKGVHDHDMPVPKKR
>AtWRKY32C GDVGICGDGYRWRKYGQKMVKGNPHPRNYYRCTSAGCPVRKHIETAVENTKAVIITYKGVHNHDMP
>AtWRKY44C VESDSLEDGFRWRKYGQKVVGGNAYPRSYYRCTSANCRARKHVERASDDPRAFITTYEGKHNHHLL
>Tc05_g005710C TDSEIMGDGFRWRKYGQKVVKGNPYPRSYYRCTSLKCNVRKHVERASDDPRAFITTYEGKHNHEMPLRNTN
>AtWRKY1C TLFDIVNDGYRWRKYGQKSVKGSPYPRSYYRCSSPGCPVKKHVERSSHDTKLLITTYEGKHDHDMP
88
>Tc01_g018460C SEVDIVNDGYRWRKYGQKLVKGNPNPRSYYRCSNPGCPVKKHVERDSHDVKLVITTYEGRHDHDIPPTRTV
>AtWRKY10C SDEDNPNDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYFKCTNIECRVKKHVERGADNIKLVVTTYDGIHNHPSP
>AtWRKY25C SDIDVLIDGFRWRKYGQKVVKGNTNPRSYYKCTFQGCGVKKQVERSAADERAVLTTYEGRHNHDIP
>AtWRKY34C SDIDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTANGCTVTKHVERASDDFKSVLTTYIGKHTHVVP
>AtWRKY58C SEVDLLDDGYRWRKYGQKVVKGNPHPRSYYKCTTPNCTVRKHVERASTDAKAVITTYEGKHNHDVP
>AtWRKY4C SEVDLLDDGYRWRKYGQKVVKGNPYPRSYYKCTTPGCGVRKHVERAATDPKAVVTTYEGKHNHDLP
>AtWRKY3C SEVDLLDDGYRWRKYGQKVVKGNPYPRSYYKCTTPDCGVRKHVERAATDPKAVVTTYEGKHNHDVP
>Tc04_g009710C SEVDLLDDGYRWRKYGQKVVKGNPHPRSYYKCTSAGCNVRKHVERASTDPKAVITTYEGKHNHDVPAARNS
>Tc02_g032670C SEVDLLDDGYRWRKYGQKVVKGNPYPRSYYKCTTPGCNVRKHVERASTDPKAVITTYEGKHNHDVPAAKTS
>AtWRKY26C SDIDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTFTGCFVRKHVERAFQDPKSVITTYEGKHKHQIP
>Tc05_g020810C SDVDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTTPGCPVRKHVERASHNLKCVLTTYDGKHNHEVPAARSS
>Tc09_g034740C SDIDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTHPGCPVRKHVERASHDRRAVITTYEGKHNHDVPAARGS
>Tc05_g001480C SDIDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTTIGCPVRKHVERASHDLRAVITTYEGKHNHDVPAARGS
>AtWRKY33C SDIDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTTIGCPVRKHVERASHDMRAVITTYEGKHNHDVP
>AtWRKY2C SDVDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTAPGCTVRKHVERASHDLKSVITTYEGKHNHDVP
>Tc07_g000190C SEVDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTSAGCTVRKHVERASHDLKSVITTYEGKHNHDVPAARSS
>AtWRKY20C SEVDILDDGYRWRKYGQKVVRGNPNPRSYYKCTAHGCPVRKHVERASHDPKAVITTYEGKHDHDVP
>Tc07_g002020C SEVDILDDGYRWRKYGQKVVRGNPNPRSYYKCTNAGCPVRKHVERASHDPKAVITTYEGKHNHDVPTARTS
Supplementary Material 3. Primers used in this study.
Gene Primer 5’-3’ Size
(bp) %GC Tm (°C) Reference
Tc04_t016130 F: TTCTCAGCTTTCCCACCAGT 20 50 59.84
This study
R: TTGAGCTGATGACTCGAACG 20 50 60.14
Tc10_t016570 F: TGCTAAGCACCCAAGGAGTT 20 50 59.88
R: TGGATGAGTCTCTGCAGGTG 20 55 59.98
Tc09_t001530
F:
GGGTTAGCGCTGAGAACAAG 20 55 60.02
R:
AGTTCTTGCTCACCAATTCCA 21 42.86 59.73
Tc06_t004420
F: ATGGGTGGATACTTCGTTGG 20 50 59.67
R:
TGCTAGTCGACTCCTTCTTCG 21 52.38 59.77
Tc06_t013130
F: TACTACCAGGCTGCATTCCA 20 50 59.30
R:
AACAATCCGTGAAGCTCATGT 21 42.86 59.61
Tc01_t014750
F: CAAGGATTCAACCGATCGAC 20 50 60.46
R:
TTTTGGGTTGGAGCTGTTAGA 21 42.86 59.73
Tc08_t013540 F: CACCACCTTCCTAGCAGCAG 20 60 60.98
R: CATGACGGCGTGACTGTAAA 20 50 60.72
Tc01_t018460 F: TATGGTTTCTTCGGGGGAGT 20 50 60.68
R: CCTCCTTGATTGGATTGTGG 20 50 60.31
GAPDH
F:
GATGCTCCTATGTTTGTTGTGG 22 45.45 54
Pinheiro et al. (2012)
Menezes et al.
(2014)
R: TCTTCCTCCTCTCCAGTCCTT 21 52.38 57
MDH F: AAAATGGAGTTGGTGGATGC 20 45 54
R: AACCATGACTGCGATGTTGA 20 45 55
Supplementary Material 4. Characteristics of WRKY amplicons
89
Gene Tm°C CG% Size
(bp) A T G C GC/AT
Tc04_t016130 95 46.7 137 42 31 43 21 0.87
Tc10_t016570 95 45.9 146 50 29 36 31 0.84
Tc09_t001530 91.6 44.1 102 34 23 18 27 0.789
Tc06_t004420 92.1 51.3 80 19 20 18 23 1.05
Tc06_t013130 92.5 43.1 109 28 34 23 24 0.758
Tc01_t014750 92.4 45.7 92 28 22 30 12 0.84
Tc08_t013540 93.9 52.4 82 24 15 31 12 1.102
Tc01_t018460 85.5 42 69 21 19 9 20 0.725
Supplementary Material 5. Phylogenetic tree of WRKY genes among cacao,
Arabidopsis, rice, tomato and sorghum. The leaf labels of members from cacao
(TcWRKYs), Arabidopsis (AtWRKYs), rice (OsWRKYs), tomato (SolycoWRKYs)
and sorghum (SbWRKYs) are indicated in blue, black, red, purple and green,
respectively.
90
Outras análises
Análise do promotor de fatores de transcrição da família
bZIP por transformação genética de plantas
91
Análise do promotor de fatores de transcrição da família bZIP
por transformação genética de plantas
Resumo
O sul da Bahia é a principal região produtora de cacau (Theobroma
cacao L.) do Brasil. A cacauicultura tem sofrido grandes danos devido a
diversas doenças que acometem suas plantações, causando perdas
aproximadas de 30-40% de todo o potencial mundial dessa cultura,
destacando-se a vassoura-de-bruxa causada pelo fitopatógeno Moniliophthora
perniciosa. Vários esforços têm sido deflagrados por instituições de pesquisa
no intuito de compreender melhor os mecanismos da interação cacau-M.
perniciosa e de proporcionar novos métodos de manejo da vassoura-de-bruxa.
Assim, entre outros, o Centro de Investigação Agronômica para o
Desenvolvimento (CIRAD) disponibilizou há alguns anos os dados oriundos do
sequenciamento do genoma do cacau. Esses dados permitiram uma análise
detalhada das famílias de genes potencialmente envolvidos nos mecanismos
de resistência do cacaueiro a várias doenças. Em particular, os fatores de
transcrição (FTs) que são elementos importantes na regulação de mecanismos
moleculares e fisiológicos relacionados com resistência a patógenos e,
portanto, tornam-se uma alternativa interessante para a engenharia genética.
Este projeto teve como objetivo a análise funcional dos promotores de três FTs
das famílias bZIP e WRKY por transformação genética de plantas-modelo.
Esses genes foram previamente identificados como diferentemente expressos
entre cacaueiros resistentes e suscetíveis à vassoura-de-bruxa.
Palavras-chave: plantas modelo; transformação de plantas; promotores
92
1. Introdução
Os fatores de transcrição das famílias bZIP e WRKY já são bem
caracterizados em algumas espécies de plantas e são envolvidos na regulação
de processos fisiológicos específicos e desenvolvimento de plantas (GUAN et
al., 2009; RINERSON; RABARA; et al., 2015). No entanto, trabalhos
demonstraram que as proteínas bZIP e WRKY têm um papel chave na
sinalização em resposta a estresses e na defesa de plantas induzidos por
vírus, oomicetos, bactérias e elicitores fúngicos (BHATTARAI et al., 2010;
ESTES et al., 2010). A ativação dos fatores dessas famílias desencadeiam vias
de transdução complexas e regula a ativação de genes de respostas
secundárias envolvidas na proteção e defesa da planta.
Estudos moleculares realizados na UESC, identificaram seqüências de
FTs WRKY e bZIP em bibliotecas de cDNA das interações resistente e
suscetíveis no patossistema Theobroma cacao-Moniliophthora perniciosa.
Elucidar o papel dessas seqüências, através da análise funcional dos
promotores e da expressão dos genes potencialmente alvos relacionados foi o
objetivo. A determinação do papel dos fatores de transcrição TcWRKY é
realizada por meio de transformação de tomate (patossistema modelo da
interação cacau - M. perniciosa) com construções promotor TcWRKY - gene
repórter GUS , análise dos transformantes e avaliação da expressão gênica
dos fatores TcbZIP e TcWRKY durante a infecção do cacaueiro pelo M.
perniciosa. A elucidação do papel desses genes permite uma melhor
compreensão das funções dos fatores de transcrição em relação à resposta de
defesa da planta contra o patógeno que desencadeiam os processos de
resistência e/ou susceptibilidade no cacaueiro em resposta a M. perniciosa.
2. Materiais e métodos
Seleção e análise in silico da região promotora dos FTs
93
A partir do trabalho de LOPES et al. (2010) foram identificados FTs
diferentemente expressos entre genótipos de cacau suscetível e resistente
inoculados com o fungo M. perniciosa, dentre os quais estavam os FTs das
famílias bZIP e WRKY. Com o genoma do cacaueiro disponível no site
http://www.cirad.fr/ foi realizada uma busca dos FTs Tc05_g027410 (bZIP),
Tc02_g006520 (bZIP) e Tc05_g005710 (WRKY44) para obtenção do gene
inteiro com o seu promotor (ARGOUT et al., 2011). Portanto, estes genes
foram considerados candidatos para estudo in planta e suas as regiões
promotoras, que corresponde normalmente de 1500 a 2000 pares de bases
antecedentes ao códon iniciador ATG, foram analisadas quanto à presença de
cis elementos regulatórios com o programa PlantCARE
(bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/).
Construção dos cassetes de transformação de plantas promotor FT::GUS
O DNA genômico do cacau Criollo B97 foi cedido pelo CIRAD/ França
para a obtenção dos fragmentos dos promotores bZIP e WRKY. Um mapa de
restrição das sequências em estudo foi gerado pelo programa NEBCutter V2.0
para análise. Primers foram desenhados para isolar, por PCR, a região
promotora dos genes Tc05_g027410 (bZIP), Tc02_g006520 (bZIP) e
Tc05_g005710 (WRKY44) mostrados na tabela 1. As reações foram realizadas
no termociclador Applied Biosystems Veriti™ Thermal Cycler com
desnaturação inicial de 94ºC, 35 ciclos de 94ºC por 50s, 58ºC por 60s, e 72ºC
por 3min. Os fragmentos obtidos foram purificados com o kit illustra GFX PCR
DNA e banda em gel da GE Healthcare. Para a confirmação do promotor de
interesse foi realizado um sequenciamento utilizando o plasmídeo PGEM-T
Easy (Promega, USA) e o kit BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing da
Applied Biosystems. Após essa etapa, somente o promotor do gene bZIP
Tc02_g006520 foi confirmado e, portanto, os outros promotores foram
excluídos das análises subsequentes. Após cada etapa da clonagem, os
fragmentos foram visualizados em gel de agarose 0,8%. O fragmento
amplificado do gene foi inserido no vetor intermediário pGem T easy, em
94
seguida foi feita a transformação em células de E. coli TOP 10 pelo método de
seleção “branca/azul”, extração plasmidial e o inserto removido por digestão
com as enzimas de restrição EcoRI e SalI. O produto foi analisado em gel de
agarose 0,8% para confirmar a digestão e purificado com o kit AccuPrep PCR /
Gel Purification (Bioneer.), de acordo com protocolo do fabricante. O fragmento
liberado na digestão enzimática foi então inserido no vetor pCambia1381Z
(Figura 3A), resultando no cassete para transformação de plantas
pCambia1381Z - TcbZIP6520, dirigindo a expressão do gene repórter GUS
(Figura 3C).
Transformação de plantas e cultura de tecidos
O plasmídeo pCambia1381Z - TcbZIP6520 (Figura 3C) construído foi
inserido para Agrobacterium tumefaciens estirpe EHA105 via choque térmico e
as colônias positivas foram confirmadas via PCR, sendo utilizado os mesmos
primers para a amplificação já citados. As bactérias recombinantes com o
inserto de interesse foram utilizadas em experimentos de co-cultivo por meio da
metodologia descrita por COSTA et al. (2000) para tomate cv Micro-tom. Três
estratégias foram utilizadas na transformação: A. tumefaciens contendo
cassete bZIP-1381Z, vetor pCambia 1381Z sem inserto e o pCambia 2301 sem
inserto. Plantas não transformada foram usadas como controle.
Aproximadamente 200 cotilédones e hipocótilos foram utilizados como
explantes nas cinco repetições de transformação. Após o co-cultivo, os
explantes foram transferidos para o meio seletivo MS (MURASHIGE; SKOOG,
1962) para indução de calos e regeneração e depois para o meio seletivo de
alongamento de brotos. Brotos diferenciados e alongados foram então
colocados em meio seletivo de enraizamento descrito por (FRARY, 1995). Para
diagnóstico da transformação, o DNA genômico das plantas transgências foi
extraído segundo protocolo descrito por DOYLE e DOYLE (1990). Após a
extração, PCR foi usado para confirmar a presença do promotor de bZIP
usando primers específicos já mencionados (Tabela 1).
Análise histoquímica
95
As folhas de plântulas de tomates transgênicos foram usadas para a
análise histoquímica GUS seguindo o protocol de COSTA et al. (2000). Plantas
não transgênicas de tomate foram usadas como o controle negativo da
atividade GUS. Os tecidos foram corados com a solução contendo o substrato
X-Gluc por 24h a 37ºC. Em seguida, diferenciados com álcool e analisados no
estereomiscroscópio Leica EZ4D.
3. Resultados
Análise do promotor e desenho de primers
No trabalho de Gesteira et al. (2007) e Lopes et al. (2010) alguns genes
da família de fatores de transcrição bZIP e WRKY foram relatados como sendo
diferentemente expressos entre cacaueiros resistentes e suscetíveis à
vassoura-de-bruxa, portanto esses genes foram considerados possíveis
candidatos para estarem envolvidos na resposta de defesa da planta e sua
resistência. Esses genes Tc05_g027410 (bZIP1), Tc02_g006520 (bZIP2) e
Tc05_g005710 (WRKY44) foram então selecionados para análise funcional de
seus promotores em planta. As sequências de promotores obtidas no banco de
dados do genoma do cacau do CIRAD (http://cocoagendb.cirad.fr/) foram
analisadas pelo programa online PLANTCARE. A análise indicou a presença
de cis-elementos regulatórios que indicam serem regulados em respostas a
estresses bióticos como a presença de Box I e W-box (elemento responsivo
elicitor fúngico), ERE (elemento responsivo ao etileno), TCA-element (resposta
ao ácido salicílico) e também abióticos como exemplo MBS (elemento de
ligação do FT MYB em resposta à seca) e LTR (resposta à baixas
temperaturas) (Figura 1). Em seguida, as sequências dos promotores dos três
genes foram analisados no NEBcutter para detectar sítios de clivagem por
endonucleases de restrição, sendo importante no desenho dos primers para a
estratégia de clonagem, buscando escolher enzimas de restrições que não
cortassem a sequência (Figura 2).
96
Figura 1. Cis-elementos regulatórios presentes nos promotores dos genes de cacau bZIP (Tc05_g027410 e Tc02_g006520) e WRKY44 (Tc05_g005710).
97
Figura 2. Mapa de restrição apresentado pelo NEBcutter. Sequências dos promotores dos
genes Tc05_g027410 (bZIP1), Tc02_g006520 (bZIP2) e Tc05_g005710 (WRKY44).
Para a estratégia de clonagem o vetor de expressão em plantas
pCambia 1381Z (Figura 3A) foi escolhido por possuir no seu T-DNA, fragmento
que é inserido na planta, um sítio múltiplo de clonagem específico para
promotores (Figura 3B). Primers então foram desenhados com o intuito de
amplificar as regiões promotoras dos genes em estudo, sendo inseridos sítios
de restrições com as enzimas BamHI e HindIII para os genes Tc05_g027410
(bZIP1) e Tc02_g006520 (bZIP2), e BamHI e SalI para o gene Tc05_g005710
(WRKY44) mostrados na Tabela 1. Essas enzimas estão presentes também no
sítio de clonagem do plasmídio pCAMBIA importantes para a ligação do
fragmento de interesse (Figura 3).
98
Figura 3. Vetor pCAMBIA 1381Z e estratégia de clonagem. A. Mapa do vetor de expressão
de plantas pCambia 1381Z. MCS indica a região do sítio múltiplo de clonagem “polylinker”,
onde o cassete de interesse é inserido. B. T-DNA do vetor sem inserto que é inserido na planta.
C. Estratégia de clonagem do inserto do promotor bZIP inserido no sítio BamHI/ HindIII do
vetor de expressão para regular a expressão do GUS.
99
Tabela 1. Primers utilizados para amplificação dos promotores bZIP1, bZIP2 e WRKY.
Na tabela é mostrada a sequência de nucleotídeos com o sítio das enzimas de restrição utilizadas
(BamHI, HindIII e SalI) sublinhados. Tm, corresponde a temperatura de anelamento em NaCl a
50 mmol.L-1
, indicada pelo fabricante.
Amplificação, clonagem e sequenciamento dos promotores
A amplificação dos promotores do cacau foi realizado a partir do DNA
genômico (DNAg) do cacaueiro. Para isso, o genótipo ICS100 foi usado para a
extração do DNA a partir do protocolo de Doyle e Doyle (1987). A extração
para as folhas de cacau mostrou um íntegro DNA (Figura 4). O DNAg da
variedade Criollo B97 obtido do CIRAD também foi utilizado buscando uma
melhor otimização na amplificação. O DNAg foi usado como molde para
amplificação por PCR da região promotora dos genes de fatores de transcrição
de cacau Tc05_g027410 (bZIP1), Tc02_g006520 (bZIP2) e Tc05_g005710
(WRKY44) para a amplificação de fragmentos de tamanhos 1340 pb, 1512 pb e
2000 pb, respectivamente com os primers específicos (Tabela 1). Houve
amplificação para os genes bZIP2 e WRKY44, porém uma única banda do
tamanho esperado foi observada apenas para bZIP2. O WRKY44 apresentou
bandas inespecíficas, enquanto o bZIP1 não amplificou (Figura 5). Desse
modo, o WRKY44 foi purificado do gel tentando cortar a banda de interesse e
purificando para obter somente um fragmento, mas esse método não foi
eficiente para esse gene e, portanto ele foi descartado das próximas etapas.
A região promotora amplificada por PCR do gene bZIP2 foi purificada e
ligada pela enzima T4 ligase ao vetor pGEM T easy para posterior
sequenciamento. Após a ligação, o vetor recombinante (bZIP2-pGEM T easy)
foi inserido em E. coli das estirpes TOP10 por transformação de bactéria por
100
choque térmico para a multiplicação do plasmídio e foi usado a selação branca
e azul para indicar colônias transformadas. A Figura 6 mostra o resultado de
PCR de quatro colônias transformadas e uma não transformada, indicando a
presença do inserto de aproximadamente 1500 pb como esperado quando
comparado com controle positivo. Com isso, o plasmídeo recombinante das
colônias transformadas foi extraído usando Kit de extração plasmidial da
BIONEER. Esse plasmídeo foi então utilizado no sequenciamento do promotor
bZIP2. Primers específicos que amplificam a região entre T7 RNA polimerase e
SP6 RNA polimerase do vetor foram usados. Nessa região encontra-se o sítio
múltiplo de clonagem onde o fragmento de interesse foi inserido. Com o
resultado do sequenciamento e BLAST no NCBI pode ser confirmada a
identidade do fragmento do promotor bZIP2. Posteriormente, o fragmento
bZIP2 e o vetor de expressão em planta pCambia 1381Z foram digeridos, em
reações separadas, com as enzimas BamHI e HindIII e purificados criando,
desta maneira, pontas coesivas que facilitam a ligação entre eles.
Figura 4. Extração de DNA. DNA extraído de folhas do genótipo de cacau ICS100. Mw. Marcador de peso molecular 1Kb (Invitrogen). 1, 2 e 3. Triplicata biológica DNA ICS100.
101
Figura 5. Amplificação dos promotores bZIP1, bZIP2 e WRKY44. Mw. Marcador de peso molecular 1Kb (Invitrogen). 1. Controle negativo bZIP1. 2 a 6. PCR com primers bZIP1 7. Controle negativo bZIP2. 8 a 12. Amplificação de bZIP2 nas mesmas temperaturas. 13. Controle negativo WRKY44. 14 a 17. Amplificação de WRKY44. As temperaturas de 54, 56, 58, 60 e 62 °C foram usadas.
Figura 6. PCR de colônia das bactérias transformadas em E.coli TOP10. Transformação de bactérias E. coli com plasmídeo recombinante bZIP2-pGEM T-Easy e confirmação com primers específicos para o promotor bZIP.. Mw. Marcador de peso molecular de 1Kb (Invitrogen). 1. Controle negativo. 2 a 6. Colônias transformadas apresentaram fragmento contendo 1500 pb (tamanho promortor bZIP2) 7. Colônia controle não transformada, ausência do fragmento.
102
Transformação de Agrobacterium tumefaciens, inoculação e cultivo in
planta
Após o processo de amplificação, confirmação da identidade do inserto e
clonagem no vetor pCAMBIA, o plasmídeo recombinante bZIP2-pCAMBIA
1381Z foi inserido na Agrobacterium tumefaciens EHA105 via transformação
por choque térmico. Após isso, colônias selecionadas com os antibióticos
kanamicina e rifampicima (50mg/ml) foram confirmadas por PCR com os
primers específicos de amplificação do promotor, e então analisadas em gel de
agarose 1% (Figura 7). As colônias das canaletas 2, 4, 5, 6, 8 e 9
apresentaram uma banda no tamanho esperado indicando estarem
transformadas. A colônia 4 foi usada para preparar o pré-inóculo de agrobatéria
para transformação em plantas contendo o cassete de expressão bZIP2-
pCAMBIA1381Z. Agrobactéria contendo o plasmídeo pCAMBIA1381Z sem
nenhum inserto e também contendo o plasmídeo pCAMBIA2301 foram usados
como controles.
Figura 7. Confirmação por PCR das colônias transformadas em Agrobacterium.
Mw. Marcador de peso molecular de 1Kb (Invitrogen). 1. Controle negativo sem DNA.
2. Controle positivo com DNAg de cacau 3 a 11. Colônias transformadas com cassete
de expressão bZIP2-pCAMBIA1381Z apresentaram fragmento de aproximadamente
1500 pb ao contrário das colônias não transformadas.
103
A cultivar MicroTom do tomate foi usado para o cultivo in vitro de plantas
transgênicas por ser um bom modelo de estudo da interação cacau-M.
perniciosa, pois pertence à família Solanaceae e é facilmente infectado por M.
perniciosa (biótipo S). O tabaco também foi incluído na cultura de tecidos como
estratégia para obtenção de plantas para testes funcionais mais rápidos como
a atividade da proteína indutora de etileno e necrose (NEP) nas folhas por
serem mais resistentes a estresses causados in vitro. A transformação de cada
cultura e seu cultivo foi realizada de acordo com seus respectivos protocolos
que já são bem estabelecidos em meio nutritivo sintético MS (MURASHIGE;
SKOOG, 1962). As sementes foram desinfestadas com álcool a 70%,
hipoclorito de sódio a 2,5% e germinadas para crescimento (Figura 8A), sendo
que os cotilédones e hipocótilos das plântulas, no caso do tomate foram
utilizadas como explantes na transformação com a agrobactéria na cultura de
tecidos (Figura 8B e 8C). Para o tabaco foram utilizadas as folhas. Os
explantes foram imersos na suspensão diluída de bactérias, sendo colocados
em seguida em meios de co-cultivo contendo nutrientes por um período para
que a agrobactéria insira seu T-DNA na planta. Passado esse período, os
explantes foram colocados no meio de regeneração seletivo, contendo o
hormônio regulador do crescimento, ácido indolil-3-acético (AIA), onde calos
foram induzidos (Figura 8D). Após essa fase, os explantes foram transferidos
para o meio seletivo de alongamento de brotos, utilizando agora o regulador
zeatina (1,0 mgL-1) (Figura 8E). Brotos diferenciados e alongados, (aprox.1
cm), foram transferidos para Magentas contendo o meio seletivo de
enraizamento com Ácido indolbutírico (AIB) que induzirá a formação de raízes
(Figura 8F). Para o tabaco, os reguladores de crescimento utilizados são o 2,4
ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) e 6-benzilaminopurina (BAP), para indução
de calos e crescimentos de brotos respectivamente.
O meio de todas as etapas foram suplementados com 100 mgL-1 de
canamicina e 300 mgL-1 de Timentin para seleção das plantas transgênicas.
Plantas não transformada foram usadas como controle. Um teste do ensaio
histoquímico de 20 plantas foi realizado identificando 5 plantas transformadas.
Nesse ensaio, a clivagem do X-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-
glucuronídeo) pela β-glucuronidase (GUS) forma um precipitado insolúvel azul
104
no tecido da planta transformada (Figura 9). Após o crescimento das raízes,
atingindo um tamanho ideal, as plantas serão aclimatadas e depois levadas
para a casa de vegetação para posteriores experimentos de inoculação das
plantas de tomate com o fungo M. perniciosa para análise do promotor de bZIP
e também testar a atividade da proteína fúngica NEP indutora de necrose nas
folhas das duas culturas em plantas trangênicas e controle.
Figura 8. Etapas do cultivo in vitro do tomate Micro Tom. A. Germinação das sementes. B. Crescimento das plântulas para obtenção de explantes C. Cortes dos explantes obtidos do cotilédone e hipocótilo das plântulas de tomate D. Indução de calos e regeneração E. Alongamento dos brotos F. Enraizamento da planta.
105
Figura 9. Detecção da atividade do GUS pelo ensaio histoquímico. A. Plantas-controle não transformadas, portanto não expressam o GUS. B. Expressão do GUS em folhas de tomate transformadas com Agrobacterium tumefaciens contendo plasmídeo recombinante.
4. Conclusão
A análise do promotor identificou cis-elementos nos três fatores de
transcrição que são conhecidos para serem elementos regulatórios na resposta
tanto bióticos como abióticos. Somente promotor do gene Tc02_g006520
amplificou um fragmento único de aproximadamente 1500 pares de bases,
confirmando sua identidade por sequenciamento, sendo usado na construção
do cassete de transformação de plantas. Plantas transgências foram
confirmadas com o promotor do gene bZIP Tc02_g006520, mas análises
futuras para confirmar a expressão do transgene em resposta à infecção com o
M. perniciosa ainda precisam ser realizadas.
106
5. Referências Bibliográficas
BHATTARAI, K. K. et al. WRKY72-type transcription factors contribute to basal immunity in tomato and Arabidopsis as well as gene-for-gene resistance mediated by the tomato R gene Mi-1. The Plant Journal, v.63, n.2, p.229-240. 2010.
COSTA, M. G. C. et al. Transformação genética de cultivares de tomateiro industrial mediada por Agrobacterium tumefaciens. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, v.12, p.107-118. 2000.
ESTES, K. A. et al. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.107, n.5, p.2153-2158. 2010.
FRARY, A. The use of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation in the map-based cloning of tomato genes and an analysis of factor affecting transformation efficiency. Cornell University, Ithaca, p.165p. 1995.
GUAN, Y. et al. Identification and characterization of bZIP-type transcription factors involved in carrot (Daucus carota L.) somatic embryogenesis. The Plant Journal, v.60, n.2, p.207-217. 2009.
LOPES, M. A. et al. Expression analysis of transcription factors from cacao-Moniliophthora perniciosa interaction. Genetics and Molecular Research, v.9, p.1279-1297. 2010.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, v.15, n.3, p.473-497. 1962.
RINERSON, C. I. et al. The evolution of WRKY transcription factors. BMC Plant Biology, v.15, p.66. 2015.
107
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS
AGRIANUAL. Anuário da agricultura brasileira. São Paulo. 2004 (Consultoria & Comércio)
AGRIOS, G. N. Plant pathology. San Diego. 1997. 635 p.
AGRIOS, G. N. Plant pathology. Amsterdam [etc.]: Elsevier Academic Press. 2005
AIME, M. C.; PHILLIPS-MORA, W. The causal agents of witches' broom and frosty pod rot of cacao (chocolate, Theobroma cacao) form a new lineage of Marasmiaceae. Mycologia, v.97, n.5, September 1, 2005, p.1012-1022. 2005.
ALBER, T. Structure of the leucine zipper. Current Opinion in Genetics & Development, v.2, n.2, p.205-210. 1992.
ALONSO, R. et al. A Pivotal Role of the Basic Leucine Zipper Transcription Factor bZIP53 in the Regulation of Arabidopsis Seed Maturation Gene Expression Based on Heterodimerization and Protein Complex Formation. The Plant Cell, v.21, n.6, p.1747-1761. 2009.
ALVAREZ, J. C. Efeito do desequilíbrio hormonal na supressão das respostas de defesa do cacaueiro durante as etapas iniciais da infecção pelo fungo Moniliohphthora perniciosa. Tese de Doutorado2013.
ALVERSON, W. S. et al. Phylogeny of the core Malvales: evidence from ndhF sequence data. American Journal of Botany, v.86, n.10, October 1, 1999, p.1474-1486. 1999.
ALVES, M. S. et al. Plant bZIP Transcription Factors Responsive to Pathogens: A Review. International Journal of Molecular Sciences, v.14, n.4, p.7815-7828. 2013.
ALVIM, R.; NAIR, P. K. R. Combination of cacao with other plantation crops: an agroforestry system in Southeast Bahia, Brazil. Agroforestry Systems, v.4, n.1, p.3-15. 1986.
108
ARGOUT, X. et al. Towards the understanding of the cocoa transcriptome: Production and analysis of an exhaustive dataset of ESTs of Theobroma cacao L. generated from various tissues and under various conditions. BMC Genomics, v.9, n.1, p.512. 2008.
ARGOUT, X. et al. The genome of Theobroma cacao. Nat Genet, v.43. 2011.
BAENA-GONZALEZ, E. et al. A central integrator of transcription networks in plant stress and energy signalling. Nature, v.448, n.7156, p.938-942. 2007.
BAILEY, T. L. et al. MEME Suite: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Research, v.37, n.Web Server issue, p.W202-W208. 2009.
BARAKAT, A.; MATASSI, G.; BERNARDI, G. Distribution of genes in the genome of Arabidopsis thaliana and its implications for the genome organization of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.95, n.17, p.10044-10049. 1998.
BASTOS, C. N. Potential of Trichoderma viride for control of cocoa witches’ broom (Crinipellis perniciosa). Fitopatologia Brasileira, v.21, p.509-512. 1996.
BASTOS, C. N.; EVANS, H. C. A new pathotype of Crinipellis perniciosa (witches' broom disease) on solanaceous hosts. Plant Pathology, v.34, n.2, p.306-312. 1985.
BASTOS, C. N.; EVANS, H. C.; SAMSON, R. A. A new hyperparasitic fungus, Cladobotryum amazonense, with potential for control of fungal pathogens of cocoa. Transactions of the British Mycological Society, v.77, n.2, p.273-278. 1981.
BASTOS, E. Cacau, a riqueza agrícola da América. São Paulo. 1987. 103 p.
BHATTARAI, K. K. et al. WRKY72-type transcription factors contribute to basal immunity in tomato and Arabidopsis as well as gene-for-gene resistance mediated by the tomato R gene Mi-1. The Plant Journal, v.63, n.2, p.229-240. 2010.
BIRKENBIHL, R. P.; DIEZEL, C.; SOMSSICH, I. E. Arabidopsis WRKY33 Is a Key Transcriptional Regulator of Hormonal and Metabolic Responses toward Botrytis cinerea Infection. Plant Physiology, v.159, n.1, p.266-285. 2012.
109
BLANC, G.; WOLFE, K. H. Functional Divergence of Duplicated Genes Formed by Polyploidy during Arabidopsis Evolution. The Plant Cell, v.16, n.7, July 1, 2004, p.1679-1691. 2004.
BLOMSTER, T. et al. Apoplastic Reactive Oxygen Species Transiently Decrease Auxin Signaling and Cause Stress-Induced Morphogenic Response in Arabidopsis. Plant Physiology, v.157, n.4, December 1, 2011, p.1866-1883. 2011.
CANNON, S. B. et al. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology, v.4, n.1, p.1-21. 2004.
CARVALHO, C. G. P. D. et al. Avaliação e seleção de híbridos de cacaueiro em Rondônia. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.36, p.1043-1051. 2001.
CEPLAC. Cacau: informações de mercado. Brasília. Informe técnico, v.12, p.1-12. 2011.
CEPLAC. Biofungicida Tricovab será lançado no Dia Internacional do Cacau. Disponível em:http://www.ceplac.gov.br/restrito/lerNoticia.asp?id=2080 2013.
CHAVES, F. C.; GIANFAGNA, T. J. Necrotrophic phase of Monihophthora perniciosa causes salicylic acid accumulation in infected stems of cacao. Physiol Mol Plant Pathol, v.69. 2006.
CHEESMAN, E. E. Notes on the Nomenclature, Classification and Possible Relationships of Cacao Populations: IPC Science and Technology Press {. 1944
CHEN, C.; CHEN, Z. Isolation and characterization of two pathogen- and salicylic acid-induced genes encoding WRKY DNA-binding proteins from tobacco. Plant Mol Biol, v.42. 2000.
CHEN, C.; CHEN, Z. Potentiation of developmentally regulated plant defense response by AtWRKY18, a pathogen-induced Arabidopsis transcription factor. Plant Physiol, v.129. 2002.
CHEN, L.; ZHANG, L.; YU, D. Wounding-Induced WRKY8 Is Involved in Basal Defense in Arabidopsis. Molecular Plant-Microbe Interactions, v.23, n.5, 2010/05/01, p.558-565. 2010.
110
CHEN, W. et al. Expression profile matrix of Arabidopsis transcription factor genes suggests their putative functions in response to environmental stresses. Plant Cell, v.14. 2002.
CHEN, Z. et al. Pseudomonas syringae type III effector AvrRpt2 alters Arabidopsis thaliana auxin physiology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.104, n.50, p.20131-20136. 2007.
CHEONG, Y. H. et al. Transcriptional profiling reveals novel interactions between wounding, pathogen, abiotic stress, and hormonal responses in Arabidopsis. Plant Physiol, v.129. 2002.
CHOI, H.-I. et al. ABFs, a Family of ABA-responsive Element Binding Factors. Journal of Biological Chemistry, v.275, n.3, January 21, 2000, p.1723-1730. 2000.
CHOI, I.-G.; KIM, S.-H. Evolution of protein structural classes and protein sequence families. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.103, n.38, September 19, 2006, p.14056-14061. 2006.
COLEMAN, S. T.; TSENG, E.; MOYE-ROWLEY, W. S. Saccharomyces cerevisiae Basic Region-Leucine Zipper Protein Regulatory Networks Converge at the ATR1 Structural Gene. Journal of Biological Chemistry, v.272, n.37, September 12, 1997, p.23224-23230. 1997.
CORRÊA, L. G. G. et al. The Role of bZIP Transcription Factors in Green Plant Evolution: Adaptive Features Emerging from Four Founder Genes. PLoS ONE, v.3, n.8, p.e2944. 2008.
COSTA, M. G. C. et al. Transformação genética de cultivares de tomateiro industrial mediada por Agrobacterium tumefaciens. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, v.12, p.107-118. 2000.
COUTO, V. D. A. O território do cacau no contexto da mundialização. Bahia Análises & Dados, v.9, p.38-52. 2000.
CUENCA, M. A. G.; NAZÁRIO, C. C. Importância Econômica e Evolução da Cultura do Cacau no Brasil e na Região dos Tabuleiros Costeiros da Bahia entre 1990 e 2002. Embrapa Tabuleiros Costeiros, v.72, p.25. 2004.
111
DA HORA JUNIOR, B. T. et al. Transcriptomics and systems biology analysis in identification of specific pathways involved in cacao resistance and susceptibility to witches' broom disease. Molecular BioSystems, v.8, n.5, p.1507-1519. 2012.
DE ARRUDA, M. C. C. et al. Comparison of Crinipellis perniciosa isolates from Brazil by ERIC repetitive element sequence-based PCR genomic fingerprinting. Plant Pathology, v.52, n.2, p.236-244. 2003.
DE OLIVEIRA CEITA, G. et al. Involvement of calcium oxalate degradation during programmed cell death in Theobroma cacao tissues triggered by the hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa. Plant Science, v.173, n.2, p.106-117. 2007.
DELTEIL, A. et al. Building a mutant resource for the study of disease resistance in rice reveals the pivotal role of several genes involved in defence. Molecular Plant Pathology, v.13, n.1, p.72-82. 2012.
DENANCÉ, N. et al. Disease resistance or growth: the role of plant hormones in balancing immune responses and fitness costs. Frontiers in Plant Science, v.4, p.155. 2013.
DEPPMANN, C. D. et al. Dimerization specificity of all 67 B-ZIP motifs in Arabidopsis thaliana: a comparison to Homo sapiens B-ZIP motifs. Nucleic Acids Research, v.32, n.11, p.3435-3445. 2004.
DIAS, C. V. et al. Hydrogen peroxide formation in cacao tissues infected by the hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa. Plant Physiology and Biochemistry, v.49, n.8, p.917-922. 2011.
EDGAR, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research, v.32, n.5, March 1, 2004, p.1792-1797. 2004.
ELLENBERGER, T. Getting a grip on DNA recognition: structures of the basic region leucine zipper, and the basic region helix-loop-helix DNA-binding domains. Current Opinion in Structural Biology, v.4, n.1, 1994/01/01, p.12-21. 1994.
ESTES, K. A. et al. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.107, n.5, p.2153-2158. 2010.
112
EULGEM, T. et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends Plant Sci, v.5. 2000.
EULGEM, T.; SOMSSICH, I. E. Networks of WRKY transcription factors in defense signaling. Curr Opin Plant Biol, v.10. 2007.
EVANS, H. C. Pleomorphism in Crinipellis perniciosa, causal agent of witches' broom disease of cocoa. Transactions of the British Mycological Society, v.74, n.3, p.515-523. 1980.
EVANS, H. C. Witches' broom disease: a case study. Cocoa Growers' Bulletin, n.32, p.5-19. 1981.
FAO. Food and Agriculture Organization of the United Nations FAOSTAT 2011.
FAO. Food and Agriculture Organization of the United Nations FAOSTAT http://www.fao.org/ 2012.
FAO. Food and Agriculture Organization of the United Nations FAOSTAT http://www.fao.org/ 2015.
FASSLER, J. et al. B-ZIP Proteins Encoded by the Drosophila Genome: Evaluation of Potential Dimerization Partners. Genome Research, v.12, n.8, p.1190-1200. 2002.
FIORILLI, V. et al. Global and cell-type gene expression profiles in tomato plants colonized by an arbuscular mycorrhizal fungus. New Phytol, v.184, p. 975-987. 2009.
FOSTER, R.; IZAWA, T.; CHUA, N. H. Plant bZIP proteins gather at ACGT elements. The FASEB Journal, v.8, n.2, February 1, 1994, p.192-200. 1994.
FRARY, A. The use of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation in the map-based cloning of tomato genes and an analysis of factor affecting transformation efficiency. Cornell University, Ithaca, p.165p. 1995.
FU, Z. Q.; DONG, X. Systemic Acquired Resistance: Turning Local Infection into Global Defense. Annual Review of Plant Biology, v.64, n.1, p.839-863. 2013.
113
FUJITA, M. et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses: a current view from the points of convergence in the stress signaling networks. Current Opinion in Plant Biology, v.9, n.4, p.436-442. 2006.
GALLOU, A. et al. Transcriptional regulation of defence genes and involvement of the WRKY transcription factor in arbuscular mycorrhizal potato root colonization. Funct Integr Genomics, v.12. 2012.
GARCIA, O. et al. Characterization of necrosis and ethylene-inducing proteins (NEP) in the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches' broom in Theobroma cacao. Mycol Res, v.111, n.Pt 4, Apr, p.443-55. 2007.
GESTEIRA, A. S. et al. Comparative analysis of expressed genes from cacao meristems infected by Moniliophthora perniciosa. Ann Bot, v.100, n.1, Jul, p.129-40. 2007a.
GESTEIRA, A. S. et al. Comparative Analysis of Expressed Genes from Cacao Meristems Infected by Moniliophthora perniciosa. Ann Bot (Lond), v.100. 2007b.
GOFF, S. A. et al. A Draft Sequence of the Rice Genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science, v.296, n.5565, 2002-04-05 00:00:00, p.92-100. 2002.
GOHLKE, J.; DEEKEN, R. Plant responses to Agrobacterium tumefaciens and crown gall development. Frontiers in Plant Science, v.5, p.155. 2014.
GOMEZ, S. K. et al. Medicago truncatula and Glomus intraradices gene expression in cortical cells arboring arbuscules in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. BMC Plant Biol, v.9, p.10. 2009.
GRIFFITH et al. Witches' brooms and frosty pods: two major pathogens of cacao. Wellington, NOUVELLE-ZELANDE: Scientific and Industrial Research Publishing, v.41. 2003. 13 p.
GRUNEWALD, W. et al. Tightly controlled WRKY23 expression mediates Arabidopsis embryo development. EMBO Reports, v.14, n.12, p.1136-1142. 2013.
GUAN, Y. et al. Identification and characterization of bZIP-type transcription factors involved in carrot (Daucus carota L.) somatic embryogenesis. The Plant Journal, v.60, n.2, p.207-217. 2009.
114
GUO, C. et al. Evolution and expression analysis of the grape (Vitis vinifera L.) WRKY gene family. J Exp Bot, v.65. 2014.
HARA, K. et al. Rapid systemic accumulation of transcripts encoding a tobacco WRKY transcription factor upon wounding. Mol Gen Genet, v.263. 2000.
HORI, K. et al. Klebsormidium flaccidum genome reveals primary factors for plant terrestrial adaptation. Nat Commun, v.5. 2014.
JAKOBY, M. et al. bZIP transcription factors in <em>Arabidopsis</em>. Trends in Plant Science, v.7, n.3, p.106-111. 2002.
JALALI, B. L.; BHARGAVA, S.; KAMBLE, A. Signal transduction and transcriptional reglulation of plant defense responses. Journal Phytopathology, v.154, p.65-74. 2006.
JIANG, W.; YU, D. Arabidopsis WRKY2 transcription factor mediates seed germination and postgermination arrest of development by abscisic acid. BMC Plant Biol, v.9. 2009.
JIANG, Y. et al. Genome-wide identification and characterization of the Populus WRKY transcription factor family and analysis of their expression in response to biotic and abiotic stresses. J Exp Bot, v.65. 2014.
JOHNSON, C.; BODEN, E.; ARIAS, J. Salicylic Acid and NPR1 Induce the Recruitment of trans-Activating TGA Factors to a Defense Gene Promoter in Arabidopsis. The Plant Cell, v.15, n.8, p.1846-1858. 2003.
KANKOFER, M. Antioxidative Defence Mechanisms Against Reactive Oxygen Species in Bovine Retained and Not-Retained Placenta: Activity of Glutathione Peroxidase, Glutathione Transferase, Catalase and Superoxide Dismutase. Placenta, v.22, n.5, p.466-472. 2001.
KHONG, G. et al. Modulating rice stress tolerance by transcription factors. Biotechnol Genet Eng Rev, v.25, p.381-403. 2008.
KHONG, G. N. et al. Modulating Rice Stress Tolerance by Transcription Factors
Biotechnol Genet Eng. Rev., v.25, p.381-403. 2008.
115
KILARU, A.; BAILEY, B. A.; HASENSTEIN, K. H. Moniliophthora perniciosa produces hormones and alters endogenous auxin and salicylic acid in infected cocoa leaves. FEMS Microbiology Letters, v.274, n.2, 2007-09-01 00:00:00, p.238-244. 2007.
KILARU, A.; HASENSTEIN, K. H. Development and Pathogenicity of the Fungus Crinipellis perniciosa on Interaction with Cacao Leaves. Phytopathology, v.95, n.1, Jan, p.101-7. 2005.
KIM, K. C.; FAN, B.; CHEN, Z. Pathogen-Induced Arabidopsis WRKY7 Is a Transcriptional Repressor and Enhances Plant Susceptibility to Pseudomonas syringae. Plant Physiol, v.142. 2006.
KOLATTUKUDY, P. E. et al. Surface signaling in pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.92, n.10, p.4080-4087. 1995.
KOVTUN, Y. et al. Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.97, n.6, p.2940-2945. 2000.
KUNKEL, B. N.; BROOKS, D. M. Cross talk between signaling pathways in pathogen defense. Curr Opin Plant Biol, v.5. 2002.
LAWRENCE, J.; CAMPÊLO, A. M.; FIGUEIREDO, J. Enfermidades do cacaueiro. II-Doenças fúngicas que ocorrem nas folhas, ramos e tronco. Agrotrópica, v.3, p. 1-14. 1991.
LEAL, G. A.; ALBUQUERQUE, P. S. B.; FIGUEIRA, A. Genes differentially expressed in Theobroma cacao associated with resistance to witches’ broom disease caused by Crinipellis perniciosa. Molecular Plant Pathology, v.8, n.3, p.279-292. 2007.
LEE, S. C. et al. Functional roles of the pepper pathogen-induced bZIP transcription factor, CAbZIP1, in enhanced resistance to pathogen infection and environmental stresses. Planta, v.224, n.5, p.1209-1225. 2006.
LEWIS, L. A.; MCCOURT, R. M. Green algae and the origin of land plants. American Journal of Botany, v.91, n.10, October 1, 2004, p.1535-1556. 2004.
116
LI, J. et al. WRKY70 modulates the selection of signaling pathways in plant defense. Plant J, v.46. 2006.
LI, J. et al. The WRKY70 transcription factor: a node of convergence for jasmonate-mediated and salicylate-mediated signals in plant defense. Plant Cell, v.16. 2004.
LI, Q. et al. Expression of Brassica napus TTG2, a regulator of trichome development, increases plant sensitivity to salt stress by suppressing the expression of auxin biosynthesis genes. Journal of Experimental Botany, June 12, 2015. 2015.
LITHOLDO, C. G. et al. Differential expression of jasmonate biosynthesis genes in cacao genotypes contrasting for resistance against Moniliophthora perniciosa. Plant Cell Reports, v.34, n.10, p.1747-1759. 2015.
LOGUERCIO, L. L. et al. Selection of Trichoderma stromaticum isolates for efficient biological control of witches’ broom disease in cacao. Biological Control, v.51, n.1, p.130-139. 2009.
LOPES, M. A. et al. Expression analysis of transcription factors from cacao-Moniliophthora perniciosa interaction. Genetics and Molecular Research, v.9, p.1279-1297. 2010.
LYNCH, M.; CONERY, J. S. The evolutionary fate and consequences of duplicate genes. Science, v.290, p.1151-1155. 2000.
MAERE, S. et al. Modeling gene and genome duplications in eukaryotes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.102, n.15, April 12, 2005, p.5454-5459. 2005.
MAOR, R. et al. In planta production of indole-3-acetic acid by Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene. Appl Environ Microbiol, v.70. 2004.
MAOR, R.; SHIRASU, K. The arms race continues: battle strategies between plants and fungal pathogens. Curr Opin Microbiol, v.8. 2005.
MARELLI, J.-P. et al. Infection Biology of Moniliophthora perniciosa on Theobroma cacao and Alternate Solanaceous Hosts. Tropical Plant Biology, v.2, n.3, p.149-160. 2009.
117
MEI, C. et al. Inducible Overexpression of a Rice Allene Oxide Synthase Gene Increases the Endogenous Jasmonic Acid Level, PR Gene Expression, and Host Resistance to Fungal Infection. Molecular Plant-Microbe Interactions, v.19, n.10, 2006/10/01, p.1127-1137. 2006.
MEINHARDT, L. W. et al. Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches' broom disease of cacao: what's new from this old foe? Mol Plant Pathol, v.9. 2008.
MENEZES, J. A. D. S.; CARMO-NETO, D. A modernização do Agribusiness Cacau. 1993. 223 p.
MESKIENE, I. et al. Stress-induced Protein Phosphatase 2C Is a Negative Regulator of a Mitogen-activated Protein Kinase. Journal of Biological Chemistry, v.278, n.21, May 23, 2003, p.18945-18952. 2003.
MICHELI, F. et al. Functional genomics of cacao. In: K. Jean-Claude. e D. Michel (Ed.). Advances in botanical research. Londres: Academic Press, v.55, 2010. Functional genomics of cacao, p.119-177
MOTAMAYOR, J. C. et al. Cacao domestication II: progenitor germplasm of the Trinitario cacao cultivar. Heredity, v.91, n.3, p.322-330. 2003.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, v.15, n.3, p.473-497. 1962.
NAKAMINAMI, K. et al. RNA regulation in plant abiotic stress responses. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms, v.1819, n.2, p.149-153. 2012.
NAVARRO, L. et al. A Plant miRNA Contributes to Antibacterial Resistance by Repressing Auxin Signaling. Science, v.312, n.5772, 2006-04-21 00:00:00, p.436-439. 2006.
NIJHAWAN, A. et al. Genomic Survey and Gene Expression Analysis of the Basic Leucine Zipper Transcription Factor Family in Rice. Plant Physiology, v.146, n.2, February 1, 2008, p.333-350. 2008.
ORCHARD, J. et al. Changes in morphology and measurement of cytokinin levels during the development of witches' brooms on cocoa. Plant Pathology, v.43, n.1, p.65-72. 1994.
118
PANDEY, S. P.; SOMSSICH, I. E. The Role of WRKY Transcription Factors in Plant Immunity. Plant Physiology, v.150, n.4, August 1, 2009, p.1648-1655. 2009.
PATROCINIO, N. G. R. B. et al. Temporal genetic characterization of isolates of Moniliophthora perniciosa in southeast of Bahia, Brazil. Agrotrópica, v.24 (3), p.168-178. 2012.
PEREIRA, J. L. et al. Primeira ocorrência da vasspura-de-bruxa na principal região produtora de cacau do Brail. Agrotópica, v.1, p.70-81. 1989.
PEREIRA, P. R. G. Relação da qualidade do cacau no mercdo atual e no mundo. http:/www.ceplac.gov.br/radar/semfaz/mercadoatual.htm/htm 2012.
PÉREZ-RODRÍGUEZ, P. et al. PlnTFDB: updated content and new features of the plant transcription factor database. Nucleic Acids Research, v.38, n.suppl 1, January 1, 2010, p.D822-D827. 2010.
PHUKAN, U. J.; JEENA, G. S.; SHUKLA, R. K. WRKY Transcription Factors: Molecular Regulation and Stress Responses in Plants. Frontiers in Plant Science, v.7, 2016-June-3. 2016.
PIETERSE, C. M. J. et al. Hormonal Modulation of Plant Immunity. Annual Review of Cell and Developmental Biology, v.28, n.1, p.489-521. 2012.
PIRES, A. B. L. et al. Early development of Moniliophthora perniciosa basidiomata and developmentally regulated genes. BMC Microbiology, v.9, n.1, p.158. 2009.
POMELLA, A. W. V. et al. Trichoderma stromaticum for management of witches' broom of cacao in Brazil. Biological Control: A global perspective case studies from around the world. C. In: Vincent, M. S. Goettel, et al. CABI Publishing, Wallingford, UK 210-217 p. 2007.
POSADA, D.; CRANDALL, K. A. MODELTEST: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics, v.14, n.9, January 1, 1998, p.817-818. 1998.
PRUSTY, R. et al. The plant hormone indoleacetic acid induces invasive growth in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.101, n.12, p.4153-4157. 2004.
119
PURDY, L.; SCHMIDT, R. Status of cacao witches' broom: biology, epidemiology, and management. Annual Review of Phytopathology, v.34, n.1, p.573-594. 1996.
QIU, Y.; YU, D. Over-expression of the stress-induced OsWRKY45 enhances disease resistance and drought tolerance in Arabidopsis. Environ Exp Bot, v.65. 2009.
RIAÑO-PACHÓN, D. et al. PlnTFDB: an integrative plant transcription factor database. BMC Bioinformatics, v.8, n.1, p.1-10. 2007.
RINERSON, C. I. et al. The evolution of WRKY transcription factors. BMC Plant Biology, v.15, p.66. 2015.
RINERSON, C. I. et al. The WRKY transcription factor family and senescence in switchgrass. BMC Genomics, v.16, p.912. 2015.
ROBATZEK, S.; SOMSSICH, I. E. A new member of the Arabidopsis WRKY transcription factor family, AtWRKY6, is associated with both senescence- and defence-related processes. Plant J, v.28. 2001.
ROBERT-SEILANIANTZ, A.; GRANT, M.; JONES, J. D. G. Hormone Crosstalk in Plant Disease and Defense: More Than Just JASMONATE-SALICYLATE Antagonism. Annual Review of Phytopathology, v.49, n.1, p.317-343. 2011.
ROBERT-SEILANIANTZ, A. et al. Pathological hormone imbalances. Current Opinion in Plant Biology, v.10, n.4, p.372-379. 2007.
RODGERS-MELNICK, E. et al. Contrasting patterns of evolution following whole genome versus tandem duplication events in Populus. Genome Research, v.22, n.1, p.95-105. 2012.
RUSHTON, P. J. et al. WRKY transcription factors. Trends Plant Sci, v.15. 2010.
SAITOU, N.; NEI, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, v.4, n.4, July 1, 1987, p.406-425. 1987.
120
SANTOS FILHO, L. P. Produção de cacau e a vassoura-de-bruxa na Bahia. Agrotópica., v.20, p. 73-82. 2008.
SCARPARI, L. M. Biochemical changes during the development of witches' broom: the most important disease of cocoa in Brazil caused by Crinipellis perniciosa. Journal of Experimental Botany, v.56, n.413, p.865-877. 2005.
SCHMUTZ, J. et al. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean. Nature, v.463, n.7278, p.178-183. 2010.
SCHWECHHEIMER, C.; ZOURELIDOU, M.; BEVAN, M. W. PLANT TRANSCRIPTION FACTOR STUDIES. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v.49, n.1, p.127-150. 1998.
SCHWEIGHOFER, A. et al. The PP2C-Type Phosphatase AP2C1, Which Negatively Regulates MPK4 and MPK6, Modulates Innate Immunity, Jasmonic Acid, and Ethylene Levels in Arabidopsis. The Plant Cell, v.19, n.7, p.2213-2224. 2007.
SENA, K. F.; ALEMANNO, L.; GRAMACHO, K. P. The infection process of Moniliophthora perniciosa in cacao. Plant Pathology, v.63, n.6, p.1272-1281. 2014.
SHEN, H. S. et al. OsWRKY30 is activated by MAP kinases to confer drought tolerance in rice. Plant Mol Biol, v.80. 2012.
SILVA NETO, P. J. E. A. Sistema de produção de cacau para a Amazônia brasileira. CEPLAC. 1999.
SILVA, S. D. V. M. et al. Resistencia do cacaueiro a Crinipellis perniciosa: produção de basidiomas outra variavel para avaliacao. Fitopatologia Brasileira, v.27, p.167. 2002.
SILVEIRA, A. B. et al. The Arabidopsis AtbZIP9 protein fused to the VP16 transcriptional activation domain alters leaf and vascular development. Plant Science, v.172, n.6, p.1148-1156. 2007.
SINGH, K. B.; FOLEY, R. C.; OÑATE-SÁNCHEZ, L. Transcription factors in plant defense and stress responses. Current Opinion in Plant Biology, v.5, p.430-436. 2002.
121
SODRÉ, G. A. A espécie Theobroma cacao: novas perspectivas para a multiplicação de cacaueiro. Rev. Bras. Frutic. , v.29. 2007.
SORNARAJ, P. et al. Basic leucine zipper (bZIP) transcription factors involved in abiotic stresses: A molecular model of a wheat bZIP factor and implications of its structure in function. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, v.1860, n.1, Part A, p.46-56. 2016.
SOUZA, C. A. S.; DIAS, L. A. S. Melhoramento ambiental e sócio-economia. In: L. a. S. Dias (Ed.). Viçosa: FUNAPE - UFG, 2001. Melhoramento ambiental e sócio-economia, p.1-47
SREENIVASAN, T. N.; SABYDEEN, S. Modes of penetration of young cocoa leaves by Crinipellis perniciosa. St. Paul, MN, ETATS-UNIS: American Phytopathological Society, v.73. 1989
TAJ, G. et al. MAPK Signaling Cascades and Transcriptional Reprogramming in Plant–Pathogen Interactions. In: R. K. Gaur e P. Sharma (Ed.). Approaches to Plant Stress and their Management. New Delhi: Springer India, 2014. MAPK Signaling Cascades and Transcriptional Reprogramming in Plant–Pathogen Interactions, p.297-316
TEIXEIRA, P. J. P. L. et al. High-Resolution Transcript Profiling of the Atypical Biotrophic Interaction between Theobroma cacao and the Fungal Pathogen Moniliophthora perniciosa. The Plant Cell Online, November 4, 2014. 2014.
ULKER, B.; SOMSSICH, I. E. WRKY transcription factors: from DNA binding towards biological function. Curr Opin Plant Biol, v.7. 2004.
VALENZUELA B, A. El chocolate, un placer saludable. Revista chilena de nutrición, v.34, p.180-190. 2007.
VILLELA-DIAS, C. et al. Nep1-like protein from Moniliophthora perniciosa induces a rapid proteome and metabolome reprogramming in cell of Nicotiana benthamiana. Physiologia Plantarum, v.150, p.1-17. 2014.
VIRGENS FILHO, A. C. et al. A CEPLAC e a crise da lavoura cacaueira. Ilhéus. 1993. 30p p.
WAN, J.; ZHANG, S.; STACEY, G. Activation of a mitogen-activated protein kinase pathway in Arabidopsis by chitin. Molecular Plant Pathology, v.5, n.2, p.125-135. 2004.
122
WANG, J. et al. Genome-wide Expansion and Expression Divergence of the Basic Leucine Zipper Transcription Factors in Higher Plants with an Emphasis on SorghumF. Journal of Integrative Plant Biology, v.53, n.3, p.212-231. 2011.
WANG, Q. et al. WRKY gene family evolution in Arabidopsis thaliana. Genetica, v.139, n.8, p.973-983. 2011.
WANG, Y. et al. MCScanX: a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity. Nucleic Acids Research, v.40, n.7, p.e49-e49. 2012.
WANG, Z. et al. Genome-wide analysis of the basic leucine zipper (bZIP) transcription factor gene family in six legume genomes. BMC Genomics, v.16, p.1053. 2015.
WARREN, A. J. Eukaryotic transcription factors. Current Opinion in Structural Biology, v.12, n.1, p.107-114. 2002.
WEISTE, C.; DRÖGE-LASER, W. The Arabidopsis transcription factor bZIP11 activates auxin-mediated transcription by recruiting the histone acetylation machinery. Nat Commun, v.5. 2014.
ZANDER, M. et al. Arabidopsis thaliana class-II TGA transcription factors are essential activators of jasmonic acid/ethylene-induced defense responses. The Plant Journal, v.61, n.2, p.200-210. 2010.
ZHANG, J.; PENG, Y.; GUO, Z. Constitutive expression of pathogen-inducible OsWRKY31 enhances disease resistance and affects root growth and auxin response in transgenic rice plants. Cell Res, v.18. 2008.
ZHOU, J.-M. et al. NPR1 Differentially Interacts with Members of the TGA/OBF Family of Transcription Factors That Bind an Element of the PR-1 Gene Required for Induction by Salicylic Acid. Molecular Plant-Microbe Interactions, v.13, n.2, 2000/02/01, p.191-202. 2000.
ZHOU, M.; MEMELINK, J. Jasmonate-responsive transcription factors regulating plant secondary metabolism. Biotechnology Advances.
ZHU, X. et al. WRKY transcription factors in wheat and their induction by biotic and abiotic stress. Plant Mol Biol Report, v.31. 2013.