universidade estadual de santa cruznbcgib.uesc.br/genetica/admin/images/files/lucas aragão da...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
Obtenção de híbridos e poliploides em Citrus via déficit
hídrico
LUCAS ARAGÃO DA HORA ALMEIDA
ILHÉUS-BAHIA-BRASIL
Fevereiro de 2017
LUCAS ARAGÃO DA HORA ALMEIDA
Obtenção de híbridos e poliploides em Citrus via déficit
hídrico
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz como parte das
exigências para a obtenção do título de
Doutor em Genética e Biologia
Molecular.
Área de Concentração: Melhoramento
Genético
Orientador: Dr. Abelmon da Silva
Gesteira
ILHÉUS-BAHIA-BRASIL
Fevereiro de 2017
A447 Almeida, Lucas Aragão da Hora.
Obtenção de híbridos e poliploides em citrus via déficit hídrico / Lucas Aragão da Hora Almeida. – Ilhéus, BA: UESC, 2017.
viii, 67 f. : il. Orientador: Abelmon da Silva Gesteira. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular. Referências: f. 59-67.
1. Cítricos. 2. Porta-enxertos. 3. Genômica. 4. Apomixia. I. Título.
CDD 634.304
LUCAS ARAGÃO DA HORA ALMEIDA
OBTENÇÃO DE HÍBRIDOS E POLIPLOIDES EM Citrus VIA
DÉFICIT HÍDRICO
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz como parte das
exigências para a obtenção do título de
Doutor em Genética e Biologia
Molecular.
Área de Concentração: Melhoramento
Genético
APROVADA: Ilhéus - Bahia, 20 de fevereiro de 2017.
________________________________
Marcio Gilberto Cardoso Costa
(UESC)
________________________________
Uilson Vanderlei Lopes
(CEPLAC)
________________________________
Maria Angélica Pereira de Carvalho
Costa (UFRB)
________________________________
Edson Perito Amorim
(CNPMF)
________________________________
Abelmon da Silva Gesteira
(UESC/CNPMF - Orientador)
i
A todos que me acompanharam nesta
jornada de trinta anos de dedicação e
trabalho.
OFEREÇO
A minha família pelo apoio e carinho
durante toda a caminhada...
Minha noiva Soraya pelo apoio
Minha avó Isabel (Bebé)
in memorian
DEDICO
ii
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Maria da Gloria, Antonio Aragão e meu irmão Leandro Aragão,
pela compreensão e apoio incondicionais que me incentivaram e tornaram
possível a realização deste sonho.
À minha noiva Soraya, pelo apoio diário, incentivo, carinho e companheirismo
inimaginável.
Aos meus tios especialmente: Dinalva, Arnoldo, Delson, Deza e Iara, primos e
primas, pelo apoio durante minha vida acadêmica.
Ao Prof° Dr. Abelmon pela orientação, dedicação, paciência e incentivo que
muito contribuíram para a realização deste trabalho.
Ao Prof° Dr. Maurício pela co-orientação, sugestões e pelos dois anos de
ensinamentos.
A equipe citros pela ajuda, especialmente a Diana, Dayse, Liziane, Nayara,
Maria, Edilan e Lais pelo companheirismo.
A UESC e Embrapa pela oportunidade e infra-estrutura disponível para o
desenvolvimento deste trabalho.
Aos membros da banca examinadora pelas contribuições.
Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular, pelos importantes ensinamentos à minha formação profissional.
À Fapesb pelo suporte financeiro.
Aos funcionários da Embrapa Mandioca e Fruticultura, especialmente o Senhor
Getúlio, pela ajuda na identificação e apoio nos trabalhos de campo.
À todos que de alguma forma contribuíram e torceram por mim e pelo sucesso
deste trabalho, minha sincera gratidão.
iii
ÍNDICE
EXTRATO .................................................................................................................. iv
ABSTRACT ................................................................................................................ vi
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1
Objetivos ...................................................................................................................... 3
1.1.1Geral ..................................................................................................................... 3
1.1.2 Específicos ........................................................................................................... 3
2. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 4
2. 1 Mercado citrícola brasileiro .................................................................................... 4
2.3 Poliploidização ........................................................................................................ 4
2.4 Poliploidia no gênero Citrus .................................................................................... 7
2.5 Hormônios e carboidratos e duplicação do genoma ................................................. 9
2.6 Poliembrionia e melhoramento genético ................................................................ 11
CAPÍTULO 1: Déficit hídrico como estratégia para obtenção de poliploides em
citros ......................................................................................................................... 13
CAPÍTULO 2: Water deficit increases the frequency of hybrid citrus with
polyembryonic female parents.................................................................................. 40
3. CONCLUSÕES GERAIS............................................................................................58
4. REFERÊNCIAS .........................................................................................................59
iv
EXTRATO
ALMEIDA, Lucas Aragão da Hora, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,
Fevereiro de 2017. Obtenção de poliploides e aumento da frequência de híbridos
zigóticos em Citrus via déficit hídrico. Orientador: Abelmon da Silva Gesteira.
A citricultura tem grande importância para economia brasileira e mundial. O mercado
citrícola, além da produção de frutas para utilização pela indústria de suco concentrado
e pronto para beber está se expandindo com o uso de frutas de mesa, principalmente as
tangerinas. Esta nova vertente comercial da citricultura preza frutas com coloração
atrativa e ausência de sementes. Assim o desenvolvimento de novas variedades
triploides torna-se peça chave para acompanhar as mudanças do mercado citrícola.
Outra preocupação é a uniformidade de porta-enxertos utilizados nos pomares
brasileiros. A baixa variabilidade genética pode ser um problema para manutenção das
plantações, uma vez que, ficam vulneráveis as doenças, pragas e variações ambientais,
entre elas a seca. Neste sentido, a utilização de porta-enxertos tetraploides como
Limoeiro ‘Cravo Santa Cruz’(LCRSTC) e a tangerineira ‘Sunki seleção
Tropical’(TSKTR) podem auxiliar, uma vez que possuem aspectos morfológicos e
fisiológicos superiores aos indivíduos diploides, como a tolerância a seca. Porém a
diversificação do pool genético dos porta-enxertos esbarra na poliembrionia, comum em
citros que apesar de ser utilizado na multiplicação das variedades de interesse acaba
interferindo no desenvolvimento de novos genótipos que alargariam a base genética
destes porta-enxertos. Visto isso foi desenvolvida uma metodologia com objetivo de
aumentar a frequência de triploides nas tangerineiras ‘Dancy’ (TD), ‘Fortune’ (TF) e
‘Cravo’ (TC) e obtenção de tetraploides nos genótipos LCRSTC e TSKTR além de
aumentar a frequência de híbridos zigóticos nestes últimos. O experimento foi realizado
durante os anos de 2013 a 2015. Formam utilizadas 20 plantas de cada genótipo em
ambos experimentos em delineamento inteiramente casualizado e aplicados três regimes
hídricos a saber: 20%, 40% e 100% da capacidade de campo (CC) em delineamento
inteiramente casualizado. As plantas foram monitoradas diariamente através de sondas
TDR e leituras pontuais durante os meses de floração com auxilio do Analisador de
fotossíntese LCCroSD, IRGA para verificação das condições fisiológicas. No período
de emissão de flores, os genótipos LCRSTC e TSKTR foram polinizados com Poncirus
v
trifoliata (L.) Raf. como parental masculino. Enquanto as tangerineiras foram
intercruzadas com TD e TC, priorizando TF como parental feminino e masculino.
Foram coletadas folhas maduras de diferentes ramos de três plantas por genótipo dentro
de cada tratamento para identificação e quantificação de hormônios e açúcares. Após a
germinação das sementes produzidas dos cruzamentos foram coletadas folhas para
confirmação do nível de ploidia utilizando um citômetro de fluxo. No experimento
visando obtenção de tetraploides foi realizada a contagem de plântulas híbridas e
nucelares germinados por sementes. Verificou-se que os hormônios avaliados
apresentaram variações significativas quanto às concentrações entre e dentro dos
genótipos e tratamentos, principalmente o ácido abscísico (ABA). Foram encontrados
27 híbridos triploides distribuídos entre os tratamentos de déficit hídrico. As maiores
frequências de surgimento de triploides foram verificadas no tratamento 20% da
hibridação TF x TD, obtendo 1,6% e 1,2% nos tratamentos 20% e 40% de CC e 1,5%
no controle. Seis tetraploides foram encontrados no genótipo TSKTR. Houve aumento
da frequência de híbridos zigóticos no genótipo TSKTR, aproximadamente 22%, no
tratamento de déficit hídrico de 20% de CC. Assim pode-se sugerir que o déficit hídrico
influencia na formação de poliploides, porém alterações nos gametas ou células
somáticas são causadas por múltiplos fatores, entre eles o genótipo utilizado no
cruzamento. Além disso, o aumento de frequência de híbridos no TSKTR sugere que os
mecanismos de defesa e sobrevivência diante do déficit hídrico influenciam na
formação de híbridos em variedades poliembriônicas.
Palavras-chave: duplicação genômica, porta-enxertos, apomixia
vi
ABSTRACT
ALMEIDA, Lucas Aragão da Hora, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,
Fevereiro de 2017. Obtaining polyploids and increasing the frequency of zygotic
hybrids in Citrus via water deficit. Orientador: Abelmon da Silva Gesteira
Citriculture has a great importance for the Brazilian and the world economy. The citrus
market, in addition to fruit production for the concentrated juice and ready-to-drink
industry, is expanding with the use of table fruits, mainly the mandarins. This new
commercial aspect of the citrus crop values fruits with attractive coloration and absence
of seeds. Thus the development of new triploid varieties becomes a key part to folow
the changes in the citrus market. Another concern is the uniformity of the rootstocks
used in Brazilian orchards. The low genetic variability can be a problem for planting
safety, since diseases, pests and environmental variations, such as drought, become
vulnerable. In this sense, the use of tetraploid rootstocks such as Limoeiro 'Cravo Santa
Cruz' (LCRSC) and 'Sunki tropical selection' (TSKTR) may help, since they have
morphological and physiological aspects superior to diploid individuals. However, the
diversification of the genetic pool of rootstocks bumps on the polyembryony, common
in citrus that despite being used in the multiplication of the varieties of interest ends up
interfering in the development of new genotypes that would broaden the genetic base of
these rootstocks. In order to increase the frequency of triploids in 'Dancy' (TD),
'Fortune' (TF) and 'Cravo' (TC) mandarin, tetraploids were obtained in the genotypes
LCRSTC and TSKTR, besides increasing the frequency of zygotic hybrids in the latter.
The experiment was carried during the years 2013 to 2015. Three water regimes were
applied: 20%, 40% and 100% of pot capacity (CC) in a completely randomized design.
The plants were monitored daily through TDR probes and spot readings during the
months with the aid of LCCroSD photosynthesis analyzer, IRGA to verify the
physiological conditions. During the flowering period, the genotypes LCRSTC and
TSKTR were pollinated with Poncirus trifoliata (L.) Raf. a male parent. While the
mandarin were intercrossed prioritizing TF as female and male parent. Mature leaves of
different branches of three plants were collected per genotype within each treatment for
identification and quantification of hormones and sugars. After the germination of the
seeds produced from the crosses, leaves were collected to confirm the level of ploidy
using a flow cytometer. In the experiment to obtain tetraploids it was also carried out
the counting of hybrids germinated by seeds. It was verified that the evaluated
hormones presented significant variations as the concentrations between and within the
genotypes and treatments, mainly abscisic acid (ABA). We found 27 triploid hybrids
distributed among the water deficit treatments. The highest frequencies of treatment of
triploids were treated 20% of the TF x TD hybridization, obtaining 1.6% and 1.2% in
treatments 20% and 40% of CC and 1.5% in control. Six tetraploids only in the TSKTR
genotype. There was an increase in the frequency of zygotic hybrids in the TSKTR
genotype, approximately 22%. Thus it can be suggested that the water deficit influences
vii
the formation of polyploids, but changes in the gametes or somatic cells are caused by
multiple factors, among them the genotype used in the crossing. In addition, the
increased frequency of hybrids in the TSKTR suggests that the defense and survival
mechanisms in the face of water deficit influence the formation of hybrids in
polyembryonic varieties.
Key words: Genomic duplication, Rootstocks, Apomictic.
1
1. INTRODUÇÃO
Os citros estão entre as frutas mais produzidas no mundo, sendo importante tanto para
o mercado interno quanto externo de diversos países. Entre os produtos gerados dessa espécie
estão o suco simples, concentrado e uma crescente vertente para frutas de mesa (MACHADO
et al., 2011). A posição entre as principais frutas consumidas está vinculada a novas
tecnologias que ao longo do tempo tiveram impacto na produtividade e aperfeiçoamento das
políticas de mercado, tanto interno quanto externo (DHAMODHARAN et al., 2016).
Dentre essas tecnologias está o desenvolvimento de variedades com poucas ou
nenhuma semente, promissoras no mercado de frutas frescas. Estas frutas são resultado de
programas de melhoramento como os desenvolvidos em países do mediterrâneo, em centros
de pesquisa como o CIRAD (Centro de Cooperação Internacional em Pesquisa Agronômica
para o Desenvolvimento) na França e em instituições de pesquisa nos Estados Unidos.
Estudos realizados neste último país, revelaram uma tendência na formação de poliploides
induzidos por baixas temperaturas. O frio induz erros meióticos, gerando gametas não
reduzidos e consequentemente poliploides (RANNEY e JONES 2008). No Brasil, por estar
em zona tropical, se consegue tal estresse em poucas regiões, porém outras interferências
abióticas podem induzir a poliploidização, a exemplo do déficit hídrico, comum em diversas
partes do país. A seca é caracterizada pela redução da quantidade de água no solo, devido a
períodos de sem chuva em quantidade significativa, além da perda de água por transpiração e
evaporação. Essa restrição hídrica interfere no metabolismo celular, no fechamento
estomático, fotossíntese e alterações a ela vinculadas (JALEEL et al., 2009).
Assim com as crescentes demandas para produção de frutas cítricas sem sementes,
cresce o interesse por novas metodologias para alcançar esses resultados com menor custo e
mão de obra menos qualificada. Estudos relatam que estresses abióticos interferem tanto na
formação do gametófito masculino quanto no feminino (SAINI, 1997), causando erros
meióticos, formando gametas desbalanceados, e mitóticos, resultando na duplicação do
genoma em células somáticas. Nos dois casos são formados poliploides.
A poliploidia é um fenômeno comum em plantas, porém ocorrem em baixa frequência
sendo considerado um mecanismo de especiação e adaptação (BROWNFIELD e KÖHLER
2011). Em citros existem registros de triploides, tetraploides, hexaploides e octaploides que
ocorrem espontaneamente (USMAN et al., 2006). Indivíduos triploides são obtidos
basicamente por cruzamentos entre indivíduos tetraploides e diploides ou entre dois diploides
em que um dos parentais produza gametas não reduzidos (2n). Com o genoma desbalanceado,
2
formando univalentes e bivalentes, as plantas não conseguem formar sementes viáveis
(ALEZA et al., 2012).
Assim como o estresse abiótico pode causar alterações meióticas, erros mitóticos
também são comuns. Nestes casos o genoma completo de células somáticas, do zigoto ou
células jovens embrionárias, é duplicado sem que ocorra a divisão em células filhas, formando
indivíduos tetraploides (RAMSEY e SCHEMSKE 1998). Outra forma de obtenção destes
poliploides é a utilização da fusão de núcleos e cruzamentos entre gametas não reduzidos
tanto do genitor masculino quanto do feminino. Estes indivíduos tetraploides são geralmente
utilizados em novos cruzamentos com diploides para obtenção de triploides e também como
porta enxertos.
Porta enxertos tetraploides possuem algumas vantagens em relação aos seus parentais
diploides, como maior controle estomático, baixa taxa de transpiração e menor crescimento
(ALLARIO et al., 2013). Assim são mais tolerantes ao déficit hídrico além de permitem o
adensamento dos pomares cítricos visto que são ananicantes.
O desenvolvimento de novas variedades de porta-enxerto é fundamental para
diversificação e segurança dos pomares de citros, uma vez que influencia na qualidade do
fruto e na tolerância a estresses bióticos e abióticos (GERRA et al., 2014). Porém este
processo esbarra na poliembrionia, surgimento de múltiplos embriões em uma única semente.
Esse fenômeno acaba produzindo uma competição entre os embriões adventícios e o zigótico,
geralmente inibindo o desenvolvimento do ultimo.
A poliembrionia dificulta a identificação da planta derivada do zigoto, uma vez que
surgem outras plantas, geralmente idênticas na mesma semente. Essa reprodução assexuada
das células da parede do saco embrionário é conhecida como apomixia (SOARES FILHO et
al., 2014). Assim, o aumento da frequência de híbridos em sementes poliembriônicas pode ser
influenciado por fatores abióticos, entre eles o déficit hídrico (MOREIRA et al., 2010). Os
estresses estão envolvidos na expressão de cascatas de genes que proporcionam a formação de
células competentes na parede do saco embrionário responsáveis pela formação dos embriões
nucelares (KUMAR et al., 2014).
Assim o déficit hídrico pode ser utilizado para auxiliar os programas de melhoramento
de citros a ampliar a base genética de porta-enxertos comerciais, aumentando a segurança e a
produtividade dos pomares. Logo sugere-se que o déficit hídrico promove alterações
meióticas e por fim a formação de gametas não reduzidos em citros além de influenciar na
frequência de embriões zigóticos em variedades poliembriônicas.
3
Objetivos
1.1.1Geral
Verificar o efeito do déficit hídrico como agente indutor de duplicações em células somáticas
e reprodutoras visando formação de poliploides, além de aumentar a frequência de híbridos
zigóticos em genótipos apomíticos.
1.1.2 Específicos
Cap. I – Metodologia de desenvolvimento de poliploides em citros via déficit hídrico
Desenvolvimento de método para obtenção de genótipos tetraploides, com
potencial para uso como porta-enxerto, induzidos por deficiência hídrica;
Desenvolvimento de método para obtenção de genótipos triploides, com potencial
para uso como variedade de frutos de mesa sem semente, induzidos por deficiência
hídrica;
Estimar o nível de déficit hídrico necessário para provocar alterações nos
mecanismos de divisão celular e formação de gametas não reduzidos;
Aumentar a frequência de formação de poliploides nos tratamentos avaliados.
Cap. II – Uso do déficit hídrico para aumentar a frequência de híbridos em variedades de
porta-enxertos poliembriônicas.
Utilizar o déficit hídrico durante as polinizações para aumentar a frequência de
híbridos em limoeiro ‘Cravo Santa Cruz’ e tangerineira ‘Sunki Tropical’;
Verificar eficácia da variedade Poncirus Trifoliata com marcador morfológico;
Estudar a relação entre déficit hídrico e desenvolvimento de híbridos zigóticos.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2. 1 Mercado citrícola brasileiro
O mercado citrícola gera renda para grandes e pequenos agricultores, além de
participar de diversos segmentos da economia como produção de máquinas, transportes, mão
de obra terceirizada, mercado de frutas frescas e indústria (MACHADO et al., 2011). As
plantações de citros ocupam cerca de 665 mil hectares no Brasil, produzindo
aproximadamente 17 milhões de toneladas dessa fruta, o que deixa o país entre os principais
produtores do mundo (IBGE 2015).
O Brasil está em primeiro lugar entre os países produtores de laranja, seguido da China,
sendo essa posição sustentada principalmente pela produção de suco concentrado (FAO,
2014). Dentre os estados produtores se destacam São Paulo como maior produtor de laranja,
produzindo aproximadamente 12 milhões de toneladas, que exporta cerca de 77% dessa
produção como suco concentrado, seguido de Minas Gerais com 5,90% da produção. A Bahia
em terceiro com aproximadamente 5,75% da produção (IBGE 2015). Novos segmentos estão
surgindo na citricultura, entre eles a comercialização de frutas frescas que agregam maior
valor ao fruto. Entre estas, as tangerinas que tem como principal pais produtor a China com
aproximadamente 54% da produção mundial seguida da Espanha com 8% (FAO, 2014).
A busca por alimentos saudáveis e orgânicos influencia também o mercado de frutas.
Novas tendências do consumo de frutas frescas com adequadas características visuais, como a
coloração, cheiro, ausência de sementes e fácil remoção da casca tendem aumentar no futuro.
Dentre essas frutas se destacam as tangerinas triploides que possuem pouca ou nenhuma
semente (VARDI et al., 2008).
Seguindo esta linha, países como a Espanha já exploram o mercado de frutas frescas,
utilizando como produto principal as tangerinas sem sementes que rendem cerca de US$ 1,3
bilhões em laranjas de mesa e US$ 1,7 bilhões em frutas in natura tipo tangerina em 2011
(FAO, 2014).
2.3 Poliploidização
A presença de mais de dois conjuntos básicos de cromossomos no núcleo das células,
ou seja, duplicação do material genético é conhecido como poliploidia (STORME e GEELEN
2013), fenômeno considerado de grande relevância no processo de especiação e evolução do
genoma das angiospermas (ADAMS e WENDEL 2005; MADLUNG, 2013; WANG et al.,
5
2016). Sugere-se que a maioria das angiospermas descende de ancestrais que passaram por
poliploidização, sendo consideradas paleopoliploides (ADAMS e WENDEL, 2005; ARRIGO
e BARKER, 2012). Apesar dos eventos de poliploidização serem encontrados em outros seres
vivos, como anfíbios e peixes o ganho evolutivo está representado principalmente em mono e
dicotiledôneas (BROWNFIELD e KÖHLER, 2011; ROULIN et al., 2013).
O aumento do genoma em plantas é submetido ao processo de seleção natural e muitas
vezes são excluídos devido à baixa fertilidade e viabilidade (BALDWIN e HUSBAND 2013).
Barreiras reprodutivas devido à infertilidade (TAMAYO-ORDÓÑEZ et al., 2016), floração
em períodos diferentes dos parentais diploides (LEVIN, 2013) e ocupação de territórios
excludentes de indivíduos com baixa tolerância a estresse (RAMSEY, 2011) são alguns dos
motivos pelos quais os poliploides são extintos ou se destacam dentro das populações. Porém
a duplicação do genoma pode ter auxiliado na perpetuação da espécie, pois é sabido que
indivíduos poliploides possuem maior plasticidade fenotípica quando comparados com seus
parentais diploides, o que favorece o processo de especiação (LEVIN, 1983).
Apesar da inviabilidade reprodutiva que o aumento do genoma pode conferir ao
individuo, muitas vezes essa mutação permite novas funções (neofuncionalização) ao material
genético duplicado (OSBORN et al., 2003). Além disso, os pares de genes podem
compartilhar a mesma função, subfuncionalização, já que são homólogos, o que pode
potencializar a resposta transcricional (ADAMS e WENDEL 2005; ALLARIO et al., 2013).
Sendo assim o processo de poliploidização pode ter importância na evolução das plantas
vasculares, sendo um importante fator adaptativo.
Outra vertente preconiza que partes do genoma duplicado são passadas para próximas
gerações principalmente quando exercem funções diferentes no organismo. Estes estudos
foram confirmados em Arabidopsis que apresentou 62% dos genes que duplicados no
processo de poliploidização divergem quanto à funcionalidade no organismo. Esses genes
permanecem na população durante a evolução enquanto aqueles que exercem a mesma função
de seu ancestral são descartados (BLANC e WOLFE 2004). Assim duplicação do genoma em
células eucarióticas é responsável por moldar o genoma durante as gerações (ROULIN et al.,
2013).
O surgimento de indivíduos poliploides esta vinculada a dois caminhos, a duplicação
somática e formação de gametas não reduzidos. Em células somáticas esse fenômeno ocorre
devido da duplicação do material genético na interfase, sem que a célula finalize a mitose com
a divisão em duas células filhas iguais, endomitose, isto ocorre devido a falhas na sinalização
do ciclo celular entre as fases G2 e M. Já a formação dos gametas, apesar da meiose ocorrer
6
normalmente, nesses casos, como o material genético já está duplicado, são formados
bivalentes e por fim gametas 2n (TAMAYO-ORDÓÑEZ et al., 2016).
A formação de poliploides via gametas pode acontecer com a duplicação antes da
meiose, chamada de pré-meiótica, já mencionada ou pós-meiótica, nos dois casos serão
formados gametas com número de cromossomos desbalanceados. Alterações pós-meióticas
podem ser divididos em duplicação, considerado mais comum, restituição e fusão de gametas
diploides (TAMAYO-ORDÓÑEZ et al., 2016).
Assim indivíduos poliploides podem ser formados a partir da duplicação do genoma
em células somáticas ou cruzamento intraespecífico sendo classificados como autopoliploides
ou da fusão de gametas não reduzidos de espécies diferentes conhecidos como alopoliploides
que geralmente restauram a viabilidade reprodutiva. Apesar de ambos gerarem poliploides a
meiose restitucional ou também conhecida como não reducional é mais encontrada em
plantas, principalmente quando submetidas a estresses, que a duplicação do genoma antes dos
processos de mitose ou meiose (STORME e GEELEN 2013).
Outras formas de obtenção de poliploides são as vias artificiais como fusão de
protoplasma e utilização de substâncias químicas inibidoras da formação do fuso como a
colchicina. A eficácia desses métodos depende do tipo explante, duração do tratamento e
concentração (ZENG et al., 2006).
Alterações ambientais são responsáveis por diversas mudanças fisiológicas e
metabólicas nas plantas, influenciando no período reprodutivo e sobrevivência (OSAKABE et
al., 2014). O déficit hídrico está entre os fatores que determinam geograficamente as áreas
produtivas em todo mundo, sendo um dos fatores abióticos responsáveis pela diminuição da
produtividade, crescimento e danos celulares (SHANKER e VENKATESWARLU 2011).
O déficit hídrico esta ligado a respostas metabólicas rápidas em plantas vasculares,
principalmente pela produção de hormônios como ABA que podem influenciar nos processos
mitóticos e meióticos. Este hormônio e a temperatura são responsáveis na ativação de
complexos envolvendo ciclinas e proteínas quinases dependente de ciclinas, que induzem
cascatas de sinalização e permitem a mudança da fase G1 para S na interfase. Além disso,
estas proteínas são reguladoras do ciclo celular como todo, fazendo com que o mesmo avance
de forma ordenada. Interferências nos complexos envolvendo ciclinas podem causar falhas no
ciclo celular resultando na duplicação do genoma (TAMAYO-ORDÓÑEZ et al., 2016).
7
2.4 Poliploidia no gênero Citrus
Análises citogenéticas tem confirmado que o número básico de cromossomos desta
família em indivíduos diploides é nove, apesar disso é encontrada uma grande variação
devido ao surgimento de indivíduos poliploides, tanto naturais quanto induzidos (GUERRA,
2009). Em citros há registros da poliploidia nos níveis de tri, tetra, penta, hexa e octaploide
(ALEZA et al., 2012a). A duplicação do genoma confere a estas plantas adaptabilidade
genética, tolerância a estresses bióticos e abióticos alem de influenciar na produtividade e
qualidade dos frutos (SHAFIEIZARGAR et al., 2011). Entre os poliploides comuns em citrus
estão os triploides e tetraploides, que surgem espontaneamente, porém em baixa frequência
(JASKANI et al., 2007).
As plantas triploides de Citrus são geralmente estéreis, o que favorece o surgimento de
frutos com poucas ou sem sementes, altamente comerciais, valorizados e com expressiva
tendência a se manter no mercado de frutas frescas. Além disso, as flores masculinas são
geralmente férteis, o que possibilita o cruzamento com outras variedades comerciais que
podem auxiliar nos programas de melhoramento genético desta espécie (ALEZA et al.,
2012b).
A formação de triploides geralmente está vinculada a erros meióticos e consequente
formação de gametas não reduzidos que tornam, a depender do grau de triploidização, a prole
pouco o totalmente infértil. A falta de sementes nestas plantas acaba direcionando a energia
que seria utilizada na formação das mesmas para outras partes da planta, como aumento no
tamanho e durabilidade das flores. Apresentam também maior vigor em relação aos parentais
diploides, como folhas mais espessas e escuras além do aumento da biomassa (WANG et al.,
2016).
A obtenção de plantas triploides em citros está relacionada também ao parental
diploide utilizado (ALEZA et al., 2010a), sendo que as combinações que utilizam como
parental feminino indivíduos tetraploides tem maior sucesso no surgimento de triploides que
quando são utilizados tetraploides como parental masculino. Porém essa técnica possui
limitações devido às dificuldades geradas pela poliembrionia, comum a maioria dos citros,
que formam sementes apomíticas em que embriões nucelares passam a competir com o
zigótico. Essa barreira pode ser superada pelos programas de melhoramento genético
utilizando indivíduos tetraploides não apomíticos, porém restringe o uso de genótipos
potenciais (MACHADO et al., 2011; ALEZA et al., 2012a).
A obtenção de poliploides em citros pode seguir caminhos diferentes. A partir de
cruzamentos podem surgir gametas não reduzidos de um ou dos dois parentais diploides
8
formando um tri ou tetraploide, além da união de gametas tetra com um parental diploide
resultando em triploides. Existe ainda a tetraploidização de células nucelares, uma vez que a
maioria dos Citrus são apomíticos (ALEZA et al., 2012b).
Mutações no pólen são consideradas fenômenos raros em citros, assim estudos
mostraram maior frequência na duplicação de células nucelares. Esse aumento do genoma
pode ter origem de mutações em tecidos em partes da planta (ramos). Estas células dobram
seu numero cromossômico geralmente pela duplicação do material genético na interfase sem
completar o ciclo mitótico. Outra forma é a duplicação dos tecidos nucelares nas sementes,
durante o período embrionário e na formação ou estágios finais do zigoto (MORILLON et al.,
2011).
Os indivíduos cujo diploide foi duplicado uma vez são chamados de tetraploides. Em
citros estes possuem grande destaque, tanto pelo uso nas hibridações para formação de
triploides como para utilização como porta-enxertos (GUERRA et al., 2016). Esses porta-
enxertos tetraploides possuem características singulares que os tornam importantes no atual
cenário do parque citrícola brasileiro e mundial. Dentre as vantagens estão o aumento do
número de plantas por área, uma vez que são ananicantes. Ainda, por ter seu genoma
duplicado, favorecem a recombinação e consequente variabilidade genética entre os porta-
enxertos comerciais, o que pode ajudar a suprir a necessidade por materiais mais rústicos e
tolerantes a estresses e doenças (GUERRA, 2014).
Os genótipos tetraploides de citros possuem maior tolerância a ambientes salinos
(SHAFIEIZARGAR et al., 2011) e com restrição hídrica (HUSSAIN et al., 2011). A
eficiência hídrica é consequência do aumento no tamanho dos estômatos e diminuição da
densidade reflete na redução da condutância, transpiração e taxas fotossintéticas. Além disso,
a maior espessura das raízes sugere uma melhoria na absorção da umidade (SYVERTSEN et
al., 2000; ALLARIO et al., 2013), favorecendo a sobrevivência em ambientes áridos ou com
índices pluviométricos baixos.
Indivíduos diploides apresentam maior resposta transcricional diante de estresse
hídrico, porém os genes envolvidos nas respostas hormonais e metabólicas são menos
reprimidos em indivíduos tetraploides, favorecendo maior amplitude na resposta a este déficit
(ALLARIO et al., 2013). Assim o porta-enxerto se torna extremamente importante para
segurança dos pomares diante das variações climáticas.
Estudos comparando diferentes parentais durante o decorrer dos anos mostraram que
efeitos ambientais estão envolvidos no aumento ou diminuição do número de híbridos
poliploides. Sugerindo que a poliploidização é dependente das condições ambientais assim
9
como dos parentais utilizados no cruzamento (ALEZA et al., 2012a). Outros estudos também
sugerem que a temperatura e amplitude térmica podem danificar o pólen, afetando a
produção, tamanho e germinação além de comprometer a fertilidade causando a
poliploidização (GUERRA et al. 2016; WANG et al., 2016).
2.5 Hormônios e carboidratos e multiplicação do genoma
As plantas são organismos sésseis que conseguem regular crescimento e
desenvolvimento com base nas condições ambientais impostas pelo meio. Neste processo
esses indivíduos dispõem de vários artifícios bioquímicos, fisiológicos e moleculares para
garantir a sobrevivência e perpetuação da espécie (OSAKABE et al., 2014).
As respostas fisiológicas ao déficit hídrico, como fechamento estomático e redução
das taxas fotossintéticas são reguladas pelas concentrações de hormônios, principalmente
ácido abscísico (ABA), que é produzido nas raízes e folhas e tem papel fundamental no
mecanismo de sinalização e adaptação da planta ao estresse (REDDY et al., 2004;
RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010). Nos tetraploides as concentrações de ABA, em
indivíduos submetidos a estresse hídrico, são superiores quando comparados com diploides,
esse aumento está ligado a maior expressão de genes relacionados à biossíntese deste
hormônio (ALLARIO et al., 2013; DEL POZO e RAMIREZ-PARRA 2014).
Dentre as funções do ABA estão a regulação da abertura estomática diante de
situações de estresse hídrico, evitando a perda e auxiliando no uso eficiente da água. Outros
hormônios também estão envolvidos nesta regulação entre ele o ácido salicílico (AS)
(ACHARYA e ASSMANN 2009). O fechamento estomático, induzido pela concentração de
ABA no xilema das plantas vasculares, reduz a condutância estomática, limita o crescimento
foliar, transpiração e trocas gasosas entre as folhas e o meio o que interfere também na
diminuição de fotoassimilados (NEVES et al., 2013; OSAKABE et al., 2014).
Apesar das respostas fisiológicas das plantas aos variados estresses envolverem outros
hormônios, o ABA está envolvido em grande parte dos mecanismos de tolerância a estresses e
ciclos metabólicos da planta, sendo responsável também pela síntese de proteínas,
crescimento de raízes, desenvolvimento e dormência de sementes, morfogênese embrionária e
regulação gênica que auxilia no balanço hídrico celular evitando colapso diante do estresse
hídrico (SREENIVASULU et al., 2012).
As vias de sinalização que incluem a síntese de hormônios responsáveis pelas respostas
fisiológicas ao estresse, como genes envolvidos na biossíntese de ABA, estão vinculados
também às concentrações de açúcares nos tecidos. O sistema de regulação fisiológico e
10
bioquímico formado pela interação entre os hormônios e açúcares permite que respostas
celulares individuais possam ser passadas para todo organismo (KOCH, 2004).
As plantas são conhecidas por ter a habilidade de converter energia solar em
moléculas orgânicas através da fotossíntese (RUAN 2014). Entre os produtos da fotossíntese
estão as principais moléculas de armazenamento em células vegetais, o amido. Este
carboidrato pode ser convertido em momentos de estresse, como o déficit hídrico, em
açúcares que serão utilizados para manutenção do metabolismo celular (KEMPA et al., 2008).
Os carboidratos, moléculas primárias de armazenamento mais abundantes nos
organismos, são compostas por unidades monoméricas, os açúcares, entre elas a sacarose.
Este açúcar é considerado um dos principais substratos para respiração em células vegetais. A
sacarose é metabolizada na glicólise, em frutose e glicose utilizadas na rota glicolítica,
(RAVEN, 1996) gerando energia para célula (TAIZ e ZEIGER, 2004).
A sacarose é transportada pelo floema, sendo essencial no deslocamento de moléculas
de sinalização, transporte de nutrientes e água tanto para o meristema radicular quanto apical
(RUAN et al., 2012). Este açúcar é a principal molécula que auxilia nas respostas a estresses,
crescimento e desenvolvimento das plantas vasculares, a partir do seu metabolismo é possível
a geração de energia além de amido, celulose, frutano, proteínas e compostos antioxidantes
(RUAN, 2014).
As concentrações de sacarose e seu metabolismo são determinados pela intensidade e
duração do estresse (WASEEM et al., 2011). Dentre os caminhos que as plantas seguem para
buscar um ajuste metabólico e fisiológico diante de uma agente estressante, como o déficit
hídrico, estão o aumento nas concentrações de açúcares, envolvidos na biossíntese e
sinalização de hormônios como o ácido abscísico (ABA) (KOCH 2004), hormônio
considerado universal, responsável dentre outras coisas na inibição do ciclo celular e aborto
de sementes (SREENIVASULU et al., 2012). Outro açúcar, a glicose, gerada a partir da
hidrólise da sacarose também está correlacionado à atividade mitótica em cotilédones
(ROLLAND et al., 2006).
As altas concentrações de ABA promovem o aumento da expressão de genes
inibidores de cinases dependentes de ciclinas (KRP). Este inibidor impede que as células
entrem na fase mitótica, porém permitem a duplicação do material genético na fase S da
interfase. Esta interferência ocorre devido inibição da formação do complexo cinase
dependentes de ciclinas/ciclina, provocando a passagem da fase S para G sem que a divisão
mitótica. Este alteração do ciclo celular, por fim, torna possível a endo duplicação e formação
11
de indivíduos com múltiplas cópias do genoma no núcleo de suas células (Sreenivasulu et al.,
2010).
Em citros foi verificado o aumento de açúcares em plantas sobre déficit hídrico,
indicando a importância de carboidratos e seus derivados no funcionamento do metabolismo
desta espécie (PEDROSO et al., 2014). Logo percebe-se a importância dos açúcares no
metabolismo celular e suas consequências diante de estresses como o déficit hídrico, que
podem provocar alterações no ciclo celular.
2.6 Poliembrionia e em citrus
Programas de melhoramento de citros são favorecidos pela facilidade na hibridação
entre as espécies de citros, porém encontram barreiras como a poliembrionia, ao longo do
período reprodutivo das plantas e a alta heterozigose dos híbridos, esta última pode ser
classificada também como uma característica importante, uma vez que gera variabilidade
genética (SOARES FILHO et al., 2002).
O fenômeno da poliembrionia se refere à presença de vários embriões por semente,
levando o surgimento de mais de um seedling (KOLTUNOW et al., 1996), sendo
classificados de acordo com a origem das células embrionárias em gametofítica e esporofítica.
Em parte, as duas formas são mecanismos de reprodução assexuada, ou seja, apomixia
(ALEZA et al., 2010b; TRAPERO et al., 2014). Neste caso o número de embriões nucelares
pode variar sendo considerado espécie-dependente (MONDAL e SAHA 2014).
A apomixia é comum entre algumas espécies de plantas, entre elas os citros, sendo
caracterizada pelo desenvolvimento de embriões a partir de células somáticas (NAKANO et
al., 2012). Os embriões nucelares se desenvolvem a partir de células do saco embrionário,
logo, seu surgimento está atrelado a uma fertilização anterior. Estes embriões passam a
competir com o embrião zigótico, geralmente único, o que leva geralmente à inibição do seu
desenvolvimento (ALEZA et al., 2010b). Esta característica geralmente é utilizada como uma
ferramenta pelos programas de melhoramento para propagação clonal de espécies de
interesse, uma vez que sua prole possui o mesmo material genético do parental (NAKANO et
al., 2012).
O desenvolvimento de clones a partir das células somáticas, apesar de suas vantagens,
principalmente nos programas de melhoramento que utilizam isso para manter as
características genéticas de porta enxertos, criam barreiras em determinados cruzamentos pela
12
dificuldade de identificação e sobrevivência de híbridos (ANDRADE-RODRÍGUEZ et al.,
2004).
Para facilitar a identificação e seleção de híbridos são utilizadas técnicas como RAPD
(Random amplified polymorophic DNA) (ANDRADE-RODRÍGUEZ et al., 2004), ISSR-PCR
(Inter simple sequence repeats), citometria de fluxo, análises de isoenzimas (TUSA et al.,
2002) e cromatografia gasosa (MONDAL e SAHA 2014). Porém a depender do cruzamento
essa seleção pode ser realizada morfologicamente. Entre os genótipos utilizados para este tipo
de seleção está o Poncirus trifolata que possui folha trifolioladas como característica
dominante. Assim indivíduos que apresentam este tipo de folha são híbridos e pode ser
identificado entre os nucelares que possuem as mesmas características da planta mãe
(SOARES FILHO et al., 2014).
13
CAPÍTULO 1
Déficit hídrico como estratégia para obtenção de poliploides em citros
Artigo será submetido à revista Scientia Horticulturae
14
Déficit hídrico como estratégia para obtenção de poliploides em citros
Resumo
A poliploidia é um fenômeno natural em plantas vasculares, sendo responsável por grande
parte das adaptações aos estresses bióticos e abióticos. Entre as mudanças provocadas pela
multiplicação do genoma em citros estão o aborto de sementes em indivíduos triploides e
maior rusticidade em tetraploides. Sendo assim, foi desenvolvida uma metodologia para
aumentar a frequência de poliploides em tangerineiras, visando o mercado de frutas frescas, e
porta-enxertos para diversificação da base genética dos pomares. Foram utilizados dois níveis
de déficit hídrico, 20% e 40% da capacidade de campo (CC) além do tratamento controle com
plantas em condições de plena irrigação em delineamento inteiramente casualizado. O
experimento foi realizado em telado anti-afídeo e foi monitorada a umidade do solo através de
sondas TDR diariamente e as condições fisiológicas durante os meses de floração com auxilio
do Analisador de fotossíntese LCCroSD, IRGA. Foram selecionadas 20 plantas de cada
parental, tangerineira ‘Fortune’, ‘Dancy’ e ‘Cravo’ e cruzados entre si para indução de
triploides, enquanto o limoeiro ‘Cravo Santa Cruz’ e a tangerineira ‘Sunki Tropical’ para
formação de tetraploides foi utilizando o Poncirus trifoliata como parental masculino e
marcador morfológico. Folhas maduras foram retiradas de três plantas por genótipo dentro de
cada tratamento para identificação e quantificação de hormônios e açúcares durante o período
de floração. Foram coletados 521 frutos e destes aproximadamente 4600 seedlings foram
avaliados por citometria de fluxo identificando seis tetraploides formados da hibridação entre
P. trifoliata e TSKTR e 27 triploides distribuídos entre os tratamentos e genótipos de
tangerineiras. Foi verificado um aumento nas concentrações de hormônios e carboidrato
ligados a respostas fisiológicas, como ABA e sacarose, nos tratamentos de déficit.
Palavras-chave:Porta-enxerto, Tangerineiras, Hormônios.
Introdução
A presença de dois ou mais conjuntos de cromossomos, formando indivíduos
poliploides, é considerada uma importante ferramenta de especiação e evolução
(BROWNFIELD; KÖHLER, 2011; ARRIGO; BARKER, 2012), principalmente em plantas
com flores e alguns animais (OSBORN et al., 2003). Estudos genômicos indicam que cerca de
35% das plantas diploides podem ter passado por processos de poliploidização, sendo
15
chamados de paleopoliploides. A multiplicação do genoma pode proporcionar aos indivíduos
novas capacidades adaptativas, uma vez que podem ser utilizado os genomas por inteiro ou
parte deles, processo conhecido como subfuncionalização (ALLARIO et al., 2013),
contribuindo para o aumento da diversidade (ARRIGO; BARKER, 2012). Assim, a
poliploidia pode conferir as plantas maior amplitude de respostas aos estresses diários.
Os eventos de poliploidização podem ocorrer a partir da hibridação entre indivíduos da
mesma espécie, fenômeno conhecido como endoduplicação que geram autopoliploides.
Outras formas de obtenção são cruzamentos entre indivíduos de espécies diferentes,
chamados de alopoliploides (OTTO, 2007; TAMAYO-ORDÓÑEZ et al., 2016).
Normalmente os indivíduos diploides (2n) formam gametas haploides (n) que se juntam no
processo de fecundação formando um descendente diploide. Porém, em alguns casos (0,89%
em angiospermas), os gametas são gerados sem a redução do número de cromossomos
levando ao surgimento de poliploides. Raramente também pode ocorrer a duplicação do
material genético em células somáticas (MOGHE; SHIU, 2014).
O genêro Citrus, família Rutacea, em sua forma diploide possui número básico de
cromossomos x = 9 (HYNNIEWTA et al., 2011), assim indivíduos diploides apresentam
2n=2x=18. Na natureza são encontradas variações a exemplo de indivíduos triploides
(2n=3x=27) e tetraploides (2n=4x=36) (ALEZA et al., 2011, GUERRA et al., 2016).
O crescente aumento do mercado de frutas frescas impulsiona pesquisas visando a
criação de frutas sem sementes, mais coloridas e saborosas. Dentre estas estão os citros, em
especial as tangerinas, que possuem expressiva exportação por países como a Espanha, que
chegaram a arrecadar cerca de 1,7 bilhões de dólares (FAO, 2013).
Os indivíduos poliploides de Citrus se diferenciam de seus parentais diploides por
características como taxa de crescimento e morfologia (RAMSEY, 2011, ALLARIO et
al.,2012). A duplicação do genoma pode proporcionar tolerância a fatores abióticos e bióticos,
o que permite a exploração de territórios onde os parentais diploides não estão aptos.
Dentre as características morfológicas em indivíduos tetraploides estão: folhas maiores
e mais largas, cor mais intensa, menor crescimento (GUERRA et al.,2014) e tolerância ao
déficit hídrico (ALLARIO et al., 2012). Alterações estruturais também estão ligadas ao
aumento do número de cromossomos, como aumento do volume celular, tamanho e número
de estômatos por área de folha, diâmetro dos grãos de pólen e sementes grandes (OTTO e
WHITTON, 2000).
A geração de indivíduos tetraploides em citros é importante para os programas de
melhoramento genético, uma vez que alguns genótipos podem ser utilizados em cruzamentos
16
para geração de triploides e outros como alternativa de porta-enxerto. Estes indivíduos
triploides são considerados estéreis, porém produzem frutos com poucas ou nenhuma semente
(ZHU et al., 2009; ALEZA et al., 2010), sendo o foco de vários programas de melhoramento
de citros ao redor do mundo.
Os fatores que promovem os eventos de duplicação são variados, entre eles a baixa
temperatura, amplitude térmica, danos no sistema reprodutor masculino e feminino
(GUERRA et al., 2016), e a escolha do genótipo do parental feminino (ALEZA et al., 2010).
No Brasil apesar de seu vasto território, poucas áreas atendem as premissas para
geração de poliploides naturais de citros. Porém, assim como outros estresses promovem a
duplicação do genoma, o déficit hídrico, realidade brasileira em diversos estados, pode ser
utilizado para esse fim. Estudos revelam que a restrição hídrica pode causar danos nos
gametófitos feminino, interferindo no desenvolvimento e em alguns casos aborto dos óvulos,
também afeta gametófito masculino provocado esterilidade do pólen (SAINI, 1997). Estas
alterações podem favorecer o surgimento de poliploides em citros.
Outra vertente de utilização de poliploides é o possível uso como porta-enxertos
tetraploides que possuem características agronômicas de interesse e podem promover a
diversificação e segurança do parque citrícola brasileiro. Estes indivíduos são gerados pela
duplicação do material genético de células somáticas ou por hibridação de gametas não
reduzidos (ALLARIO et al., 2012). Porta-enxerto tetraploides imprime a redução de tamanho
das copas neles enxertados, favorecendo o adensamento dos pomares e diminuindo os custos
com a colheita. Além disso, possuem melhores e mais rápidas respostas a estresses como seca,
salinidade e a algumas doenças (SHAFIEIZARGAR et al., 2013).
Sabendo da importância do desenvolvimento de tangerinas sem sementes que
alavanquem o comércio de frutas frescas brasileiras e criação de novos porta-enxertos para
diversificação, proteção e aumento do rendimento dos pomares, foi objetivo deste trabalho
desenvolver uma metodologia utilizando o déficit hídrico para obtenção de triploides e
tetraploides em citros.
Material e métodos
As variedades utilizadas pertencem ao Banco de Germoplasma de Citros da Embrapa
Mandioca e Fruticultura (CNPMF), localizado em Cruz das Almas-BA. Foram utilizados três
clones de tangerineira, a saber: tangerineira ‘Fortune’, tangerineira ‘Dancy’ e tangerineira
‘Cravo’ visando obtenção de triploides. Estes genótipos foram selecionados de acordo a
17
características de interesse para o mercado de frutas frescas, como tamanho do fruto e
coloração. Para obtenção de tetraploides fora utilizados o limoeiro ‘Cravo’ (C. limonia
Osbeck) seleção 'Santa Cruz' (LCRSTC), genótipo utilizado na maioria dos pomares
brasileiros e a tangerineira 'Sunki' seleção 'Tropical' (TSKTR). Os dois genótipos são
poliembriônicos permitindo a seleção dos seedlings nucelares.
O experimento foi realizado em telado antiafídeo durante os anos de 2013 a 2015. As
plantas foram acondicionadas em vasos de 45L contendo uma mistura de duas partes de areia
lavada, uma parte do solo e das duas partes de Rendmax Citrus, substrato comercial de casca
de pinheiro. Todos os genótipos foram enxertados no híbrido TSK x (RL x PT) – 059, onde
TSK se refere a tangerineira 'Sunki' , RL a limoeiro ‘Cravo' e PT as espécies P. trifoliata. Este
híbrido foi obtido pelo Programa de Melhoramento de Citros da Embrapa- CBP Citrus.
No mês de julho de 2014, que antecedem o período de floração os vasos foram
fechados com papel alumínio e, instaladas sondas TDR (Reflectometria no Domínio do
Tempo) para acompanhamento da umidade do solo. As sondas de TDR foram confeccionadas
artesanalmente, contendo três hastes de aço inoxidável de 0,003 m de diâmetro, 0,15 m de
comprimento, espaçadas de 0,022 m, isoladas com resina de poliéster, com cabos coaxiais
RG58 (50 ohms) de 0,75 m de comprimento (SANT'ANA et al., 2012). Em seguida a
irrigação foi suspensa em todas as plantas até que alcançassem a murcha com potencial
matricial do solo de -1,5 Mpa, equivalente a aproximadamente 10% da capacidade de campo
(CC). Após o déficit, foram reirrigadas para indução da formação de gemas florais,
coincidindo com o período de floração de plantas in vivo no Banco de Germoplasma da
CNPMF. Após isso foram iniciados os tratamentos de 20%, 40% de umidade a partir da CC e
controle com plantas mantidas em 100% CC. O estresse inicial foi realizado entre os meses de
fevereiro e março de 2014 sendo mantidos os tratamentos até a floração. O delineamento
experimental foi o inteiramente casualizado, utilizando 20 plantas de cada clone selecionado.
Entre setembro e novembro de 2014, período de emissão de flores, formam
mensurados, uma vez ao mês, as trocas gasosas: fotossíntese (A), Transpiração (E) e
condutância estomática (gs) com auxilio do Analisador de fotossíntese LCCroSD, IRGA para
confirmação do estado fisiológico das plantas. Neste período cerca de 30 foram emasculadas
no período da manhã antes da antese, realizado a hibridação manual obedecendo aos
cruzamentos pré-determinados e identificadas para controle (Tabela 1). Após a polinização
todas as plantas voltaram a CC para dar prosseguimento ao desenvolvimento dos frutos. Os
genótipos selecionados para a produção de portas-enxerto tetraploides, LCRSTC e TSKTR,
18
foram hibridados com o Poncirus trifoliata devido a diferenciação dos indivíduos zigóticos
por ter folhas trifolioladas, característica dominante desta espécie.
Tabela 01. Parentais utilizados em hibridações manuais em clones diploides submetidos a dois
tratamentos de déficit hídrico visando obtenção de tangerineiras triploides e portas-enxerto
tetraploides.
Parental Feminino Parental Masculino
Obtenção de Triploides
Tangerineira 'Fortune' Tangerineira 'Cravo'
Tangerineira 'Dancy'
Tangerineira 'Cravo' Tangerineira 'Fortune'
Tangerineira 'Dancy' Tangerineira 'Fortune'
Obtenção de Tetraploides
Limoeiro Cravo Santa Cruz Poncirus trifoliata
Tangerineira Sunki Tropical
Os frutos quando maduros, aproximadamente cinco meses após a polinização, foram
coletados e as sementes retiradas e lavadas em cal virgem para retirada da mucilagem. As
sementes foram contadas, pesadas e classificadas em pequenas (1/3 a 1/6 do tamanho normal),
murchas e normais. As murchas foram descartadas, as normais levadas para plantio direto em
substrato Vivatto Plus e as pequenas encaminhadas para o laboratório de Cultura de Tecidos
da Embrapa Mandioca e Fruticultura. Sob condições assépticas os embriões foram isolados e
colocados em tubos de ensaio para germinação in vitro, contendo meio de cultura constituído
de sais do MS (MURASHIGE; SKOOG,1962), vitaminas do meio B (100 mg/L de mio-
inositol, 10 mg/L cloridrato de piridoxina, 5 mg/l ácido nicotínico, 10 mg/l de cloridrato de
tiamina, 2 mg/L glicina), com 25 g L-1 de sacarose, 0.3 mg L-1 e 2,4 g/L de Phytagel e pH
ajustado para 5,8. e mantidas em sala de crescimento a 25ºC ± 2ºC e 16 horas de irradiância
(35 µmol m-2 s-1). Após 75 dias da germinação os seedlings foram levados para casa de
vegetação.
Após a aclimatação e germinação das sementeiras foi coletada uma folha madura de
cada seedeling para confirmação do nível de ploidia com auxilio de um citômetro de fluxo
Attune (Acoustic focusing cytometric) da marca Life. Foi utilizado o protocolo de Dolezel et
al., (2007) com as seguintes modificações: foram realizados testes com a espécie Crotalária-
breviflora comparado-a com um padrão de citros (Tangerineira ‘Sunki Tropical’) para
definição do conteúdo de DNA. A análise foi realizada utilizando amostras de três de
fragmentos de folhas de citros (2C = 0.70 pg de DNA) comparando-as com o conteúdo da
Crotalária-breviflora (2C = 2,02 pg de DNA). As amostras foram maceradas em placa de
19
petri sobre gelo na presença de 1 ml de tampão de isolamento de núcleos (LB01, Galbraith’s
buffer, Tris.MgCl2 buffer) e depois acrescentado 0,20µL de iodeto de propídeo usado para
corar o DNA.
O cálculo para determinar o conteúdo de DNA das amostras desconhecidas foi
realizado segundo Dolezel et al. (2007), utilizando a fórmula :
Sample 2C value (DNA pg) = Sample mean peak position x Reference 2C value
Reference 2C mean peak position
Todas as sementes foram contadas e cerca de 100 sementes medidas e pesadas em
cada combinação. Os dados foram analisados utilizando cada fruto como unidade
experimental e as médias comparadas pelo teste Tukey (P≤0,05) no programa Sisvar versão
5.3.
Foram coletadas folhas maduras de diferentes ramos de três plantas por genótipo
dentro de cada tratamento para identificação e quantificação de hormônios e açúcares com
base nos dados obtidos do IRGA.
Determinaram-se os teores de ácido indolacético endógeno (IAA), ácido salicílico
(SA) e ácido abscísico (ABA) por cromatografia gasosa em espectrometria de massa em
tandem (GC-MS-SIM). Amostras de folhas e raízes (50-100 mg FW) foram extraídas como
descrito por Rigui et al. (2015). Cerca de 0.25 μg de cada padrão marcado [2H6] ABA
(OlChemIm Ltd.), [13
C6] IAA (Cambridge Isotopes, Inc.) e [2H6] SA (Cambridge Isotopes,
Inc.) foram adicionados a cada amostra como padrões internos.
Para quantificação de ABA, alíquotas do extrato foram metiladas tal como descrito em
Rigui et al. (2015). Para quantificação de IAA e SA, as alíquotas foram evaporadas,
ressuspensas em 50 mL de piridina seguido por uma derivatização de 60 min a 92ºC usando
50 mL N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide (with 1% tert-
Butyldimethylchlorosilane).
A análise foi realizada num cromatógrafo de gás acoplado a um espectrometro de
massa (modelo GCMS-QP2010 SE, Shimadzu) no modo de monitorização iônica seletiva. O
cromatógrafo foi equipado com uma coluna capilar de sílica fundida (30m, ID 0.25 mm,
0.50 mm thick internal film) DB-5 MS e fase estacionária usando hélio como gás
transportador a uma taxa de fluxo de 4.5 mL min–1
no seguinte programa: 2 min a100oC,
seguindo de uma rampa de 10oC min
–1 para 140
oC, 25
oC min
–1 para 160
oC, 35
oC min
–1 para
250oC, 20
oC min
–1 para 270
oC e30
oC min
–1 para 300
oC. A temperatura do injetor foi de
250°C e foram utilizados os seguintes parâmetros de funcionamento da MS: tensão de
20
ionização, 70 eV (Ionização por impacto de elétrons); temperatura da fonte de íons, 230°C;
temperatura da interface, 260°C. Íons com uma relação massa / carga (m/z) de 244, 202 e 130
(correspondente a endógenos IAA); 250, 208 e 136 (correspondente a [13
C6]-IAA); 309, 195 e
209 (correspondente a endógenos SA); 315, 201 e215 (correspondente a [2H6] SA); 190, 162 e
134 (correspondente a endógenos ABA), e 194, 166 e 138 (correspondente a [2H6] ABA),
foram monitoradas. As concentrações endógenas foram calculadas com base nos
cromatogramas m/z 244 e 250 para IAA, 309 e 315 para SA e 190 e 194 para ABA.
Para açúcares solúveis que perfilam amostras de folhas e raízes (50-100 mg FW)
foram extraídos como descrito em Freschi et al. (2010). O resíduo sobrenadante foi
ressuspenso em 50 μL de piridina e derivatizado para 40 min a 60 °C com 20 µL de N,O-bis
(trimethylsilyl) trifluoroacetamide com 1% de trimethylchlorosilane. Os extratos de
trimethylsilylated foram analisados por GC-MS (modelo GCMS-QP2010 SE, Shimadzu) e
corrente iônica total.
As concentrações de hormônios e açúcares foram obtidas a partir de folhas frescas e os
dados transformados com base no peso seco, retirando-se a porcentagem média de água
referente a cada tratamento.
Resultados
Foram coletados 222 frutos de tangerineiras ‘Fortune’, ‘Cravo’ e ‘Dancy’ e comparado
as médias de tamanho médio de sementes entre os tratamentos pelo teste de Tukey (P≤0,05)
(Tabela 2). Porém entre os diferentes cruzamentos, considerando a TF como parental
masculino as sementes encontradas foram maiores na combinação TD x TF e quando
utilizado TF como genitor feminino TF x TD foi superior. O peso das sementes apresentou
diferença significativa entre e dentro dos tratamentos.
21
Tabela 02. Comparação do tamanho e peso de sementes extraídas de frutos de tangerineiras
‘Dancy’ (TD), ‘Fortune’(TF) e ‘Cravo’ (TC) pelo teste de médias Tukey a 5% de
probabilidade submetidas a dois tratamentos de déficit hídrico, 20% e 40% da capacidade de
campo.
Variável Cruzamento Tratamentos
20% 40% 100%
Tam
anho
(mm
)
TD x TF 13.04aA 12.28aA 11.43aA
TC x TF 11.60bA 11.86aA 12.41aA
TF x TC 11.06bA 12.24aA 12.27aA
TF x TD 13.66aA 12.91aA -
Pes
o (
g) TD x TF 2.32aB 4.55aAB 4.71aA
TC x TF 3.11aB 3.44aAB 5.19aA
TF x TC 1.97aC 8.84aA 5.67aB
TF x TD 2.72aA 1.96bA - *Médias seguidas das mesmas letras maiúscula nas linhas não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey e minúsculas nas colunas pertencem ao mesmo grupo pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
Os frutos gerados do cruzamento em que o parental masculino foi TF geraram 1506
sementes, destas 47 foram pequenas. Quando TF foi utilizado como parental feminino foram
obtidas 2481 sementes normais e 30 pequenas. As sementes classificadas como murchas
foram descartadas (Tabela 03).
Entre as sementes pequenas das tangerineiras germinadas in vitro utilizando a TF
como genitor feminino e TD como masculino, foram obtidos quatro indivíduos triploides no
tratamento 40% de CC (Tabela 03). Outros cinco indivíduos triploides foram encontrados no
mesmo tratamento (40% de CC), porém a partir de sementes normais, germinadas em casa de
vegetação. No tratamento 100% de CC foram encontrados cinco triploides, três entre as
sementes normais e dois em pequenas. O tratamento 20% gerou apenas dois triploides
encontrados em sementes normais. Nas hibridações com TC foi gerado apenas um triploide de
sementes normais no tratamento 20% de CC. Considerando o genótipo TF como parental
masculino foram encontradas 11 sementes pequenas na hibridação com TC, destas 45%
geraram triploides. No tratamento 20% de CC foram encontrado dois triploides oriundos de
sementes pequenas e dois de normais. No tratamento 40% de CC foi encontrado um indivíduo
triploide entre as sementes normais. Na hibridação com a TD foi encontrado apenas um
indivíduo triploide no tratamento 20% de CC entre as sementes normais (Tabela 03).
22
Tabela 03. Quantificação do número de frutos, sementes, tamanho médio das sementes e
triploides encontrados a partir de cruzamentos entre as tangerineiras ‘Fortune’(TF), ‘Dancy’
(TD) e ‘Cravo’ (TC) nos tratamentos de déficit hídrico 20%, 40% da CC e controle.
Parental Triploides 3x
♀ ♂
Tratamento
Número
de
Frutos
Número
de
sementes
Numero
de
sementes
pequenas
Tamanho
Médio
Sementes
pequenas(%)
Sementes
normais(%)
TD TF
20% 53 669 13 13.55 ± 0.18 - 0,1
40% 13 131 7 12.72 ±0.27 - -
100% - - - - - -
TC TF
20% 27 303 7 11.21±0.19 28,0 0,7
40% 13 258 - 12.48±0.15 - 0,4
100% 8 173 4 12.26±0.14 - 0,6
TF
TD
20% 7 129 5 12.47±0.26 - 1,6
40% 41 1103 21 12.48±0.24 19,0 0,5
100% 12 326 5 11.51±0.18 40,0 0,9
TC
20% 27 686 9 11.4±0.19 - 11,0
40% 6 132 1 11.72±0.18 - -
100% 11 168 1 12.96±0.20 - -
A citometria de fluxo foi realizada em mais de 2000 seedlings comparando o conteúdo
de DNA de citros (2C=0,70 pg) com Crotalária-breviflora (2C=2,02 pg). As amostras triplas
de citros quando apenas materiais diploides estavam presentes apresentavam dois picos, um
representando a C. breviflora e o outro o citros. As amostras que acusavam a presença de
poliploides apresentavam um terceiro pico, então eram selecionados os poliploides (3C=1,00
pg) em uma nova análise individual (Figura 01).
Figura 01. Gráficos da análise de citometria de fluxo do book contendo duas amostras de
citros e uma de C. breviflora. (a) Amostra tripla com presença de híbrido tetraploide
representado pelo segundo pico, (b) amostra tripla com híbrido triploide (segundo pico).
23
Foram avaliadas as concentrações de açúcares como sacarose, frutose, galactose e
glicose (Figura 02 A, B, C e D), além de hormônios como ácido abscísico (ABA), ácido
indolacético (AIA) e ácido salicílico (Figura 3 A, B e C) das folhas dos genótipos
selecionados nos diferentes tratamentos de déficit hídrico.
Figura 2. Análise da concentração de sacarose (A), frutose (B), galactose (C) e glicose (D) das
folhas de tangerineiras ‘Cravo’ (TC), ‘Dancy’ (TD) e ‘Fortune’ (TF) coletadas em plantas
submetidas a dois tratamentos de déficit hídrico 20, 40% de CC e controle. *As médias seguidas das
mesmas letras maiúsculas não apresentam diferença significativa dentro dos tratamentos. As médias seguidas de letras
minúsculas comparam os genótipos entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
Foi verificado um aumento significativo de sacarose, frutose, glicose no tratamento
20% de CC nos genótipos avaliados quando comparados individualmente nos tratamentos,
com exceção da galactose que obteve diferença significativa, quando comparados os
tratamentos, apenas no genótipo TF, apresentando maior concentração no tratamento 20% de
CC em relação ao 40% de CC e controle. A avaliação entre genótipos mostrou que as
tangerineiras TC e TD possuem maior produção de sacarose em relação à tangerineira
‘Fortune’, destacando a maior produção em tangerineira ‘Cravo’ (Figura 2 A).
Quando comparados individualmente os genótipos TD e TF apresentaram maior
concentração de frutose no tratamento 20% de CC, o que está ligado a maior concentração de
sacarose nesses tratamentos (Figura 2 B), exceto para TC que não houve diferença
24
significativa entre os tratamentos. Quando avaliado a concentração de galactose, houve uma
alteração em relação aos açúcares anteriores. As concentrações em TD divergiram
significativamente, apresentando menor concentração em 20% de CC. Além disso, em TC
tanto os tratamentos 100% e 20% de CC foram significativamente superiores ao 40% de CC.
Em TF houve diferença significativa entre o tratamento 20% de CC, apresentando com maior
concentração que os demais (Figura 2 C). Quanto à concentração de glicose, o tratamento
controle de TC não diferiu do 20% de CC, porém no demais genótipos as concentrações
foram significativamente maiores no 20% (Figura 2 D).
Os hormônios avaliados apresentaram variações significativas quanto às concentrações
entre e dentro dos genótipos e tratamentos. As concentrações do hormônio ABA foram
significativamente superiores para os genótipos TD e TF no tratamento 20% de CC. Não
houve diferença significativa entre os genótipos quanto a concentração de ABA no tratamento
100% de CC (Figura 3 A).
Figura 3. Análise da concentração de hormônios: A-ácido absísico (ABA), B-ácido
indoloacético (AIA) e C-ácido salicílico nas folhas de tangerineiras ‘Cravo’ (TC), ‘Dancy’
(TD) e ‘Fortune’ (TF) coletadas em plantas submetidas a dois tratamentos de déficit hídrico
20, 40% de CC e controle. *As médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não apresentam diferença
significativa dentro dos tratamentos. As médias seguidas de letras minúsculas comparam os genótipos entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
25
As concentrações de AIA contrastaram significativamente em relação aos demais
hormônios. Foi verificado um aumento na concentração no tratamento 100% de CC em
relação à ABA e AS. Quando analisado as diferenças entre os genótipos a variedade TC se
destacou com maior concentração que TD e TF nos tratamentos 100% e 20% de CC, sendo
que em 40% não houve diferenças na concentração entre os genótipos avaliados (Figura 3 B).
As concentrações de AS apresentaram diferenças significativas no tratamento 20% de CC
para o genótipo TF, sendo as maiores concentrações encontradas neste tratamento e 40% de
CC em TC e TD. Considerando o tratamento controle, se destacaram os genótipos TD e TF
(Figura 3 C).
No experimento visando a obtenção de porta-enxertos tetraploides foram gerados 299
frutos, 141 de LCRSTC e 158 de TSKTR. As classificações das sementes extraídas e forma
de plantio seguiram os parâmetros e do experimento já descrito anteriormente neste trabalho.
Apesar do grande número de sementes encontradas em LCRSTC nos três tratamentos de
déficit, não foram encontrados seedlings tetraploides. Foram verificados aproximadamente
2600 seedlings por citometria de fluxo identificando quatro tetraploides formados da
hibridação entre P. trifoliata e TSKTR no tratamento 20% de CC e dois no 40% de CC
(Tabela 04). Entre os genótipos houve diferença significativa apenas para peso no tratamento
40% pelo de Tukey (P≤0.05). Porém dentro dos tratamentos houve diferença significativa no
tamanho das sementes para ambos os genótipos avaliados e para peso apenas no TSKTR
(Figura 4).
Tabela 04. Número de frutos, sementes, tamanho médio das sementes e tetraploides (4x)
encontrados a partir de cruzamentos dos genótipos limoeiro ‘Cravo Santa Cruz’ (LCRSTC) e
Tangerineira ‘Sunki Tropical’ (TSKTR) com Poncirus trifoliata submetidos a dois
tratamentos de déficit hídrico, 20%, 40% de CC e controle.
Parental Tratamento Número de
Frutos
Número de
Sementes
Tamanho
Médio Tetraploides (%)
♀ ♂
LC
RS
TC
Poncirus
trifoliata
20% 104 721 9.97±0.10 -
40% 30 255 9.53±0.09 -
100% 7 52 9.80±0.23 -
TS
KT
R
Poncirus
trifoliata
20% 85 992 9.26±0.08 0,4
40% 68 773 9.63±0.10 0,3
100% 5 88 10.16±0.21 -
26
Figura 4. Efeito dos tratamentos de déficit hídrico 20% e 40% de CC comparado ao controle
no tamanho e peso médio de 50 sementes nos genótipos limoeiro ‘Cravo Santa Cruz’
(LCRSTC) e Tangerineira ‘Sunki Tropical’ (TSKTR). *As médias seguidas da mesma letra não apresentam
diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
O acompanhamento do estado fisiológico das plantas durante os meses de floração
apresentou variações dentro dos tratamentos, porém não apresentou diferenças significativas
entre os genótipos. Diante dos dados analisados, houve efeito significativo apenas para o fator
umidade, independente do parâmetro analisado, A, E e gs (Anexo 1).
Figura 05. Médias das repostas fisiológicas: fotossíntese (A), Trasnspiração (B) e condutância
estomática (C) em tangerineiras ‘Dancy’, ‘Fortune’ e ‘Cravo’ submetidas a dois tratamentos
de déficit hídrico e controle. *As médias seguidas da mesma letra não apresentam diferença significativa
pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
Independente do genótipo avaliado as melhores respostas aos parâmetros analisados
foram verificadas no tratamento controle, 100% de CC (Figura 05).
Utilizando LCRSTC e TSKTR não foi observada interação entre a umidade e os
genótipos, sendo altamente significativo apenas o fator umidade nos três parâmetros avaliados
27
e diferença significativa entre os genótipos para transpiração pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade (Anexo 2). Este ultimo, o LCRSTC, apresentou médias superiores ao TSKTR.
As médias obtidas para os parâmetros utilizados para mensurar o estádio fisiológico
dos genótipos selecionados nos diferentes tratamentos apresentou diferenças significativas
entre os tratamentos 20% e 40% de CC em relação ao controle (100% de CC). Porém, para
condutância e transpiração o tratamento 40% de CC não difere estatisticamente do 100% de
CC (Figura 06).
Figura 06. Médias das repostas fisiológicas fotossíntese (A), transpiração (B) e condutância
(C). em limoeiro ‘Cravo Santa Cruz’ (LCRSTC) e tangerineira ‘Sunki Tropical’(TSKTR)
submetidas a dois tratamentos de déficit hídrico 20, 40% de CC e controle*As médias seguidas da
mesma letra não apresentam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
Na análise de açúcares ambos os genótipos avaliados individualmente o tratamento
20% de CC se destacou com maior concentração de sacarose e glicose. Quando a comparação
foi realizada entre os genótipos, a tangerineira Sunki Tropical apresentou maiores
concentrações de sacarose, frutose, glicose e galactose em todos os tratamentos analisados. A
TSKTR apresentou diferença significativa entre o tratamento 20% de CC com maior
concentração de sacarose em relação aos demais (Figura 7 A e B).
28
Figura 7. Concentração média de sacarose, frutose e glicose (A) e galactose (B) em folhas de
limoeiro ‘Cravo Santa Cruz’ (LCRSTC) e tangerineira ‘Sunki Tropical’ (TSKTR) submetidas
a dois tratamentos de déficit hídrico 20, 40% de CC e controle. *As médias seguidas das mesmas letras
maiúsculas não apresentam diferença significativa dentro dos tratamentos. As médias seguidas de letras minúsculas
comparam os genótipos entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
A avaliação da concentração dos hormônios presentes nas folhas dos genótipos
LCRSTC e TSKTR mostrou que as concentrações de ABA são maiores no tratamento 20% da
CC. Além disso, quando comparados os genótipos foi encontrado maiores concentrações
desse hormônio em TSKTR. Não houve diferença significativa para LCRSTC quando
avaliado a concentração de AIA nos diferentes regimes hídricos, porém no genótipo TSKTR
as plantas controle apresentaram maior concentração que os tratamentos de déficit. Assim
como o AS apresentou maior concentração no genótipo TSKTR em todos os tratamentos.
A
B
29
Quando comparado individualmente o genótipo LCRSTC apresentou maior concentração de
AS em 20% de CC (Figura 8).
Figura 8. Concentrações de hormônios nas folhas de limoeiro ‘Cravo Santa Cruz’ (LCRST) e
tangerineira ‘Sunki Tropical’ (TSKTR) em dois tratamentos de déficit hídrico, 20 e 40% de
CC e controle. *As médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não apresentam diferença significativa
dentro dos tratamentos. As médias seguidas de letras minúsculas comparam os genótipos entre os tratamentos
pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
Discussão
Houve uma tendência ao aumento do no número de sementes quando TF foi utilizado
como parental feminino e TD como masculino, condição diferente apenas no tratamento 20%
de CC em que o cruzamento com TC obteve maior média. Aleza et al. (2012) utilizando o
genótipo ‘Fortune’ como genitor feminino e tangelo ‘Orlando’ como masculino alcançou
aproximadamente 18 sementes por fruto. Neste trabalho houve um aumento do número de
sementes por fruto, em media 24, independente do tratamento de déficit hídrico. Esta variação
pode estar vinculada aos parentais utilizados nos cruzamentos além de efeitos ambientais.
Trabalhos utilizando a tangerineira ‘Fortune’ para desenvolvimento de híbridos poliploides
mostram variações do número de sementes pequenas encontradas por fruto de acordo ao
parental utilizado e período avaliado (ALEZA et al., 2010).
30
Neste experimento a quantidade de sementes produzidas na tangerineira ‘Sunki’
seleção Tropical foi em média 13,6 (Tabela 4). Resultados similares quanto à quantidade de
sementes por fruto em limoeiro ‘Cravo Santa Bárbara’ (C. limonia Osb.) 7,6 e tangerineira
‘Sunki’ (C. sunki Hort. ex Tan.) 5,7 foram encontrados por Soares Filho et al. (2002). A
diferença entre o número de sementes está relacionada ao cruzamento (TOOLAPONG et
al.,1996) e efeitos ambientais, visto que neste experimento as plantas foram submetidas a
restrição hídrica durante o período de floração.
A quantidade de sementes pequenas geradas por fruto durante o experimento com
tangerineiras quando TF foi utilizada como genitor feminino variou entre os tratamentos de
déficit. A maior frequência relativa de sementes pequenas foi encontrada na CC de 40%, onde
foram encontradas cerca de 1,5% e 2% nos cruzamentos com TD e TC respectivamente.
Quando o genótipo TF foi utilizado como parental masculino as maiores frequências também
foram encontradas no tratamento 40% de CC com 4,5% e 3,6% nos cruzamentos utilizando os
parentais masculinos TD e TC respectivamente.
Estes valores são inferiores aos encontrados por Aleza et al. (2010) utilizando a
‘Fortune como parental feminino em que encontrou aproximadamente 3 sementes pequenas
por fruto, destas cerca de 2,54 eram híbridos triploides. Usman et al. (2006) trabalhando com
ocorrência espontânea de poliploides utilizado diferentes cruzamentos de tangerineiras no
Paquistão encontrou híbridos triploides espontâneos a partir de sementes pequenas nos cinco
genótipos avaliados. Porém em um dos cruzamentos envolvendo a tangerineira
‘Kinnow’(Citrus reticulata Blanco) foi encontrada a maior quantidade de sementes pequenas,
mas foi inferior em frequência de triploides em relação a outros cruzamentos, enquanto o
genótipo com menor número de sementes pequenas obteve a maior frequência de triploides.
Isso mostra que a obtenção de sementes pequenas não implica necessariamente na
formação de triploides, fato observado também neste trabalho, onde no cruzamento em que o
clone TF foi hibridado com TD no tratamento 20% de CC gerou 1,6% de híbridos triploides a
partir de sementes classificadas como normais (Tabela 3). Esta frequência foi superior à
verificada por Aleza et al. (2011) testando a influência de diferentes regiões e condições
ambientais na multiplicação do genoma na variedade ‘Carrizo’, encontrando a frequência de
0,9% de híbridos tetraploides oriundos de seedlins da Bahia. Os mesmos autores sugerem que
as baixas temperaturas influenciam na multiplicação do genoma, porém Gerra et al. (2016)
afirmam que apesar da variação da amplitude térmica influenciar na ploidia, não se pode
confirmar quais fatores ou fator isolado responsável pela indução dos eventos de
poliploidização. Assim, apesar da importância econômica e empenho dos programas de
31
melhoramento genético, os mecanismos associados a poliploidização ainda permanecem
desconhecidos.
A redução do tamanho das sementes esta ligado ao balanço numérico do endosperma,
em que o desenvolvimento normal segue a proporção 2:1 materno para paterno em espécies
de plantas diploides como o citros. Nestes casos o desenvolvimento do endosperma é normal
(CARPUTO et al., 2003). Os indivíduos que passam por poliploidização estão fora desta
proporção e o endosperma é degenerado o que provoca a redução do tamanho da semente.
Porém neste trabalho as sementes classificadas como normais também geraram poliploides,
logo pode-se sugerir que outras alterações além do desbalanço do endosperma estão ligadas
ao processo de poliploidização.
A redução no tamanho da semente e a relação com o aumento dos conjuntos
cromossômicos também foi verificada nos cruzamentos visando o desenvolvimento de
tetraploides. Dentre as vantagens de se obter tetraploides em citros estão a divisão da função
antes exercida, pelos pares de genes duplicados, fenômeno conhecido como
subfuncionalização, além da possibilidade da ocorrência da neofuncionalização em que o par
de genes duplicado exerce nova função no organismo (RENSING, 2014; ADAMS e
WENDEL, 2005; MOGHE e SHIU, 2014; ARRIGO e BARKER, 2012).
Os indivíduos tetraploides no genótipo TSKTR foram encontrados nos tratamentos
20% e 40% de CC com frequência de 0,4% e 0,25% respectivamente. As sementes nestes
tratamentos foram significativamente menores em relação ao controle. Os eventos de
tetraploidização podem ocorre a partir da fecundação de dois gametas não reduzidos resultado
de alterações na meiose (BROWNFIELD e KÖHLER, 2011) e de mutações em células
nucelares com a duplicação do material genético sem que ocorra a mitose (GUERRA et al.,
2016). Os resultados obtidos neste experimento são provenientes da duplicação de células
somáticas, já que os genótipos foram fecundados com pólen de P. trifoliata dominante para o
formato da folha trifoliolada, o que facilitou a identificação e seleção dos seedlings nucelares.
No genótipo LCRSTC não foram encontrados indivíduos tetraploides ao contrário do
TSKTR. Esta diferença pode estar ligada a mecanismos de sobrevivência distintos ao estresse
hídrico, em que o genótipo TSKTR parece assegurar a sobrevivência da planta (SANTANA-
VIEIRA et al., 2016). Segundo Waseem et al. (2011) a adaptação a seca envolve diversos
processos biológicos complexos, entre elas controle da expressão gênica, redução de
crescimento, aumento de ABA e alterações fisiológicas como fechamento estomático,
aumento do crescimento das raízes para ampliar a área de captação de nutrientes. Santana-
Vieira et al. (2016) trabalhando com tangerineira ‘Sunki’ seleção Maravilha e limoeiro
32
‘Cravo’ concluíram que os mecanismos de sobrevivência destes genótipos são diferentes.
Afirmam ainda que a ‘Sunki’ Maravilha possui estratégias de sobrevivência a períodos de
restrição hídrica superiores ao Limoeiro ‘Cravo’ pois plantas enxertadas em ‘Sunki’
apresentaram mecanismos para prevenir danos celulares, manutenção do metabolismo e
turgor. Estes dados reforçam a hipótese que as mutações que culminam na duplicação do
conjunto de cromossomos em células somáticas podem estar associadas a mecanismos de
sobrevivência. Visto que aumento da ploidia confere diversas vantagens fisiológicas, com
maior flexibilidade para superar flutuações ambientais, proporcionado a ocupação de novos
habitat que seus parentais diploides não conseguem povoar (MADLUNG, 2013).
As concentrações de hormônios e açúcares avaliados a partir das folhas dos genótipos
selecionados nos diferentes tratamentos reforçam a situação fisiológica das plantas utilizadas
no experimento e seus mecanismos de sobrevivência em períodos de déficit hídrico. A fixação
de carbono e a transformação da energia luminosa em química, rica em açúcares, pelas
plantas além da produção do oxigênio é primordial para sobrevivência dos seres vivos. Estas
moléculas de açúcar auxiliam, principalmente nos vegetais e microoganismos, na tolerância as
mudanças ambientais tanto diárias quanto as prolongadas. A regulação metabólica, resistência
a estresse, crescimento, sinalização entre outras funções celulares estão vinculadas aos
açúcares, sendo que os organismos autotróficos, fotossintetizantes podem ser classificados
tanto como fontes quanto como importadores de açúcares para suprir as necessidades de seus
tecidos e órgãos (ROLLAND et al., 2006).
Os açúcares possuem grande relevância no crescimento, desenvolvimento e regulação
das plantas. Estes fazem parte da estrutura dos ácidos nucleicos DNA e RNA, são utilizados
como substratos para síntese de macromoléculas e estão presentes na estrutura paredes
celulares além de serem necessários no funcionamento de proteínas e lipídios (YU 1999).
A produção e manutenção dos açúcares está diretamente vinculada a fotossíntese, assim
perturbações bióticas e/ou abióticas que interfiram no processo fotossintético comprometem
também o suprimento de carboidratos nas células. Segundo Reddy et al. (2004) o aumento das
concentrações dos açúcares está ligada a resposta fisiológica das plantas quando submetidas a
restrição hídrica que provocam mudanças no processo fotossintético culminando em
alterações nas concentrações de amido e açúcares. O aumento de frutose e glicose estão
diretamente ligadas ao aumento de sacarose. Já nas células onde será utilizada, a sacarose é
hidrolisada por enzimas invertases em frutose e glicose, o que justifica o aumento destes
açúcares. Segundo Santana-Vieira et al. (2016), trabalhando com diferentes combinações de
porta-enxertos e copas comerciais de citros, verificaram que o déficit hídrico foi responsável
33
pelo aumento de carboidratos tanto em nas raízes quanto nas folhas, resultados semelhantes
aos encontrados neste experimento.
Dentre os hormônios encontrados nas folhas estão o ABA responsável pela sinalização
diante de estresses como a restrição hídrica, induzindo o fechamento estomático,
influenciando na redução da perda de água, transpiração e trocas gasosa o que culmina
também na diminuição das taxas fotossintéticas (OSAKABE et al., 2014). Segundo
Sreenivasulu et al. (2012) os estresses abióticos como seca, salinidade e frio estão envolvidos
na regulação positiva de ABA nas plantas vasculares que pode influenciar na expressão de
genes. Os autores salientam que o ABA é considerado um hormônio universal responsável
pela reprogramação transcricional diante de estresses tanto em respostas rápidas quanto sobre
déficit hídrico prolongado. Segundo Tamayo-Ordóñez et al. (2016) os fatores baixa
temperatura, escuridão e hormônios responsáveis pelo crescimento, como o ABA, interferem
na expressão de genes reguladores dos processos mitóticos e meióticos provocando o
surgimento de gametas não reduzidos e duplicações somáticas.
Estudos relacionam as concentrações de ABA com a expressão de genes inibidores de
cinases dependentes de ciclinas (Kip-regulated inhibitor-KRP). Os complexos formados entre
ciclinas e cinases depedentes de ciclinas (CDKs, cyclin-dependent kinases) são responsáveis
pela regulação e continuidade do ciclo mitótico em células eucariontes. Assim interferências
neste complexo proteico, ciclina-CDK, permitem a duplicação do material genético porém a
célula não entra no ciclo mitótico, alternando assim entre as fases S para G1 do ciclo celular,
tornando-se poliploide (INZE, DE VEYLDER, 2006). Logo as maiores concentrações de
ABA nos tratamentos de déficit hídrico podem ter influenciado no complexo ciclina-CDK e
duplicação do material genético de embriões nucelares em tangerineira ‘Sunki Tropical’.
Sreenivasulu et al. (2010) trabalhando com cevada concluiu que baixas concentrações
de ABA estão ligadas ao menor desenvolvimento do endosperma, folhas e frutos sugerindo a
participação deste hormônio também na organogênese. Este experimento mostrou que a
TSKTR possui mecanismos de resposta ao estresse mais eficientes, uma vez que as
concentrações de ABA são maiores no tratamento 20% de CC quando comparados a LCRST,
assim como entre as tangerineiras a TD se sobressaiu diante das demais no tratamento 40% de
CC.
Por estar envolvido na resposta estomática, o ABA também influencia na concentração
de outros hormônios, entre eles o ácido salicílico (SA), envolvido na defesa contra patógenos
e florescimento. Acharya e Assmann (2009) concluíram que a interação entre o ABA e SA
34
são responsáveis também pela regulação do fechamento estomático evitando a entrada de
patógenos e auxiliando no processo de tolerância ao déficit hídrico.
O ácido indoloacético (AIA), outro hormônio encontrado nas folhas dos genótipos
avaliados, faz parte da classe de hormônios vegetais, auxinas, responsáveis pela divisão
celular e diferenciação dos tecidos (ACHARYA e ASSMANN 2009), retardo da senescência
foliar (KUSABA et al.,2013) e regulação do crescimento inflorescências em arroz
(KHANNA-CHOPRA e SINGH, 2015). Apesar das baixas concentrações, este hormônio não
influencia na formação dos frutos em citros (VARDI et al., 2008), o que pode ser confirmado
neste experimento, visto que a maior produção de frutos foi encontrada nos tratamentos 20 e
40% de CC onde as concentrações de AIA foram significativamente menores que o
tratamento controle. As concentrações de AIA diminuem quando as plantas são submetidas ao
déficit hídrico, porém este hormônio tem papel fundamental na tolerância ao estresse, uma
vez que é responsável pela quebra de dominância apical em raízes (FAROOQ et al., 2009).
As informações geradas neste experimento mostram a tendência dos efeitos do déficit
hídrico na frequência de triploides e tetraploides. A metodologia utilizando o déficit hídrico a
40% de CC em tangerineiras e 20% na tangerineira ‘Sunki’ sugere que tanto a formação de
gametas não reduzidos quanto a duplicação dos do genoma podem estar vinculados também a
este estresse. Novos trabalhos devem ser realizados com estresses combinados para promover
o aumento na resposta fisiológica e metabólica dos genótipos de citros de interesse comercial,
para aumentar a frequência de poliploides em hibridações específicas.
Referências
Acharya, B. R. & Assmann, S. M. Hormone interactions in stomatal function. Plant
Molecular Biology, v. 69, n.4, p. 451–462, 2009.
Adams, K. L. & Wendel, J. F. Polyploidy and genome evolution in plants. Current Opinion
in Plant Biology, v. 8, n. 2, p. 135–41, 2005.
Aleza, P., Froelicher, Y., Schwarz, S., Agustı´, M., Hernandez, M., Juarez, J., Luro, F.,
Morillon, R., Navarro, L., Ollitrault, P. Tetraploidization events by chromosome doubling of
nucellar cells are frequent in apomictic citrus and are dependent on genotype and
environment. Annals of Botany, v.108, p. 37–50, 2011.
35
Aleza, P., Juárez, J., Cuenca, J., Ollitrault, P., & Navarro, L. Recovery of citrus triploid
hybrids by embryo rescue and flow cytometry from 2x x 2x sexual hybridisation and its
application to extensive breeding programs. Plant Cell Reports, v. 29, n. 9, p. 1023–34,
2010.
Aleza, P., Juárez, J., Cuenca, J., Ollitrault, P., & Navarro, L. Extensive citrus triploid hybrid
production by 2x×4x sexual hybridizations and parent-effect on the length of the juvenile
phase. Plant Cell Reports, v.31, n. 9, p. 1723–35, 2010.
Allario, T., Brumos, J., Colmenero-Flores, J. M., Iglesias, D. J., Pina, J. a, Navarro, L., Talon,
M.; Ollitrault, P., Morillon, R.. Tetraploid Rangpur lime rootstock increases drought tolerance
via enhanced constitutive root abscisic acid production. Plant, Cell & Environment, v.36,
n.4, p.856–68, 2012.
Arrigo, N. & Barker, M. S.. Rarely successful polyploids and their legacy in plant genomes.
Current Opinion in Plant Biology, v.15, n.2, p.140–6, 2012.
Brownfield, L. & Köhler, C.. Unreduced gamete formation in plants: mechanisms and
prospects. Journal of Experimental Botany, v.62, n.5, p.1659–68, 2011.
Carputo, D., Frusciante, L., & Peloquin, S. J. The role of 2n gametes and endosperm balance
number in the origin and evolution of polyploids in the tuber-bearing Solanums. Genetics,
v.163, n.1, p.287–294, 2003.
Dolezel, J., Greilhuber, J., & Suda, J. (2007). Estimation of nuclear DNA content in plants
using flow cytometry. Nature Protocols, v.2, n.9, p.2233–44.
FAO, 2013. Atualizado em 30/08/2013. Consultado em 18/11/2016
Farooq M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D. and Basra, S.M.A. Plant Drought Stress:
Effects, Mechanisms and Management. Agronomy for Sustainable Development.v. 29, n.1,
p. 185–212, 2009.
Guerra, D., Schifino-Wittmann, M. T., Schwarz, S. F., Weiler, R. L., Dahmer, N., & Souza, P.
V. D. De. Tetraploidization in citrus rootstocks: effect of genetic constitution and
environment in chromosome duplication. Crop Breeding and Applied Biotechnology, v.16,
n.1, p. 35–41, 2016.
36
Guerra, D., Teresa, M., Wittmann, S., Schwarz, S. F., Vitor, P., Souza, P.D. V., Gonzatto,
M.P. Weiler, R. L. Comparison between diploid and tetraploid citrus rootstocks :
morphological characterization and growth evaluation. Bragantia, v.73, n.1, p. 1–7, 2014.
Hynniewta, M., Malik, S. K., Rao, S. R. Cytogenetics Karyological studies in ten species of
Citrus ( Linnaeus , 1753) ( Rutaceae ) of North-East India. CompCytogen, v.5, n.4, p. 277–
287, 2011.
Inze, D., De Veylder, L. Cell cycle regulation in plant development. Annu. Rev. Genet., v.40,
n.77, p.105, 2006.
Kusaba, M., Tanaka, A., & Tanaka, R. Stay-green plants: what do they tell us about the
molecular mechanism of leaf senescence. Photosynthesis Research, v.117, n.1-3, p. 221–34,
2013.
Madlung, A. Polyploidy and its effect on evolutionary success: old questions revisited with
new tools. Heredity, v.110, n.2, p. 99–104, 2013.
Moghe, G. D., & Shiu, S.-H. The causes and molecular consequences of polyploidy in
flowering plants. Annals of the New York Academy of Sciences, p. 1–19, 2014.
Murashige, T.; Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco
tissue cultures. Physiologia Plantarum, v. 15, n. 3, p. 473-497, 1962.
Osakabe, Y., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K., & Tran, L.-S. P. ABA control of plant
macroelement membrane transport systems in response to water deficit and high salinity. New
Phytologist, v.202, n.1, p.35–49, 2014.
Osborn, T. C., Chris Pires, J., Birchler, J. a., Auger, D. L., Jeffery Chen, Z., Lee, H.-S.,
Comai, L., Madlung, A., Doerge, R.W., Colot, V., Martienssen, R. A. Understanding
mechanisms of novel gene expression in polyploids. Trends in Genetics, v.19, n.3, p.141–
147, 2003.
Otto, S. P. The evolutionary consequences of polyploidy. Cell, v.131, n.3, p.452–62, 2007.
Otto, S. P., & Whitton, J. Polyploid Incidence and Evolution. Annual Review of Genetics,
v.34, p.401–437, 2000.
37
Ramsey, J. (). Polyploidy and ecological adaptation in wild yarrow. PNAS, v. 108, n.17,
7096–7101, 2011.
Rensing, S. A. Gene duplication as a driver of plant morphogenetic evolution. Current
Opinion in Plant Biology, v.17, p.43–48, 2014.
Saini, H. S. Effects of water stress on male gametophyte development in plants. Sex Plant
Reprod, v.10, p.67–73, 1997.
Sant'Ana, J.A.V., Coelho, E.F., Silva Junior, J.J., Santana Junior, E.B., Veinromber Junior,
L.A.A. Desempenho de sondas de TDR manufaturadas de diferentes comprimentos de hastes.
Revista Brasileira de Ciências do Solo, v.36, p.1123-1129, 2012.
Santana-Vieira, D.D.S., Freschi, L., Almeida, L.A.H., Neves, D.M., Moraes, D.H.S., Santos,
L.M., Bertolde, F.Z., Soares Filho, W.S., Coelho Filho, M.A., Gesteira, A.S. Survival
strategies of citrus rootstocks subjected to drought. Scientific Reports, v.6, p.38775 2016.
Shafieizargar, A., Awang, Y., Juraimi, A. S., & Othman, R. Comparative studies between
diploid and tetraploid Dez Orange [Citrus sinensis ( L .) Osb .] under salinity stress.
Australian Journal of Crop Science, v.7, n.10, p.1436–1441, 2013.
Sreenivasulu N., Radchuk, V., Alawady, A., Borisjuk, L., Weier, D., Staroske,N., Fuchs, J.,
Miersch, O., Strickert, M., Usadel, B., Wobus, U., Grimm, B., Weber, H. and Weschke, W.
De-regulation of abscisic acid contents causes abnormal endosperm development in the barley
mutant seg8. Plant Journal, v.64, n.4, p.589–603, 2010.
Sreenivasulu, N., Harshavardhan, V. T., Govind, G., Seiler, C., & Kohli, A. Contrapuntal role
of ABA: Does it mediate stress tolerance or plant growth retardation under long-term drought
stress? Gene, v.506, n.2, p.265–273, 2012.
Tamayo-Ordóñez, M. C., Espinosa-Barrera, L. a., Tamayo-Ordóñez, Y. J., Ayil-Gutiérrez, B.,
& Sánchez-Teyer, L. F. Advances and perspectives in the generation of polyploid plant
species. Euphytica, 2016.
Toolapong, P., Komatsu, H., & Iwamasa, M. Triploids and haploid progenies derived from
small seeds of “Banpeiyu”, a pummelo, crossed with “Ruby Red” grapefruit. Journal of the
Japanese Society for Horticultural Science, v.65, n.2, p.255–260, 1996.
38
Tripathi, B.N., Muller, M. (eds.), Stress Responses in Plants. Chapter 11 Renu Khanna-
Chopra and Kalpana Singh. Drought Resistance in Crops: Physiological and Genetic Basis of
Traits for Crop Productivity 2015
Usman, M., Saeed, T., Khan, M. M., & Fatima, B. Occurrence of spontaneous polyploids in
Citrus. Hort. Sci. , v.33, n.3, p.124–129, 2006.
Vardi, A., Levin, I., Carmi, N., Sciences, P., & Box, P. O. Induction of Seedlessness in
Citrus : From Classical Techniques to Emerging Biotechnological Approaches. Journal of
the American Society for Horticultural Science, v.133,n.1, p.117–126, 2008.
Waseem, M., Ali, A., Nadeem, M. A., Ayub, M., Tanveer, A., & Ahmad, R. Mechanism of
drought tolerance in plant and its management through. Continental J. Agricultural Science,
v.5, n.1, p.10–25, 2011.
Zhu, S., Song, J., Hu, Z., Tan, B., Xie, Z., & Yi, H. Ploidy variation and genetic composition
of open- pollinated triploid citrus progenies. Botanical Studies, v.50, p.319–324, 2009.
39
Anexo
Anexo 1. Resumo da análise de variância para os parâmetros Fotossíntese (A, µmols.m-2.s-1),
Transpiração (E, µmols.m-2.s-1) e Condutância estomática (gs, mmols.m-2.s-1 ) obtidos
durante os meses de floração das tangerineiras ‘Fortune’(TF), ‘Dancy’(TD) e ‘Cravo’.
FV GL QM
A E gs
Genótipo 2 0.23541 ns
0.02551 ns
0.00021 ns
Umidade 2 7.80571** 0.60437** 0.00149**
Genótipo*Umidade 4 0.72960 ns
0.33756 ns
0.00008 ns
Erro 9 0.27216 ns
0.02838 ns
0.00006 ns
CV (%)
11.62 13.97 12.91
Média Geral 4.48 1.20 0.06
** significativo a 1% de probabilidade pelo teste F, ns
não significativo a 5% de probabilidade
Anexo 2. Resumo da análise de variância para os parâmetros Fotossíntese (A, µmols.m-2.s-1),
Transpiração (E, µmols.m-2.s-1) e Condutância estomática (gs, mmols.m-2.s-1 ) obtidos
durante os meses de floração dos genótipos RL e ST.
FV GL QM
A E gs
Genótipo 1 0.26402ns
0.54427* 0.00000 ns
Umidade 2 7.44430** 0.51585** 0.00138*
Gen*Umidade 2 0.25487 ns
0.08404 ns
0.00012 ns
Erro 12 0.70185 ns
0.08248 ns
0.00025 ns
CV% 20.23 25.99 29.36
Média Geral 4.14 1.10 0.05 ** significativo a 1% de probabilidade pelo teste F,
ns não significativo a 5% de probabilidade
40
CAPITULO 2
Water deficit increases the frequency of hybrid citrus with polyembryonic
female parents
Artigo submetido à Crop Breeding and Applied Biotechnology em 28/11/2016
41
Water deficit increases the frequency of hybrid citrus with polyembryonic female
parents
Abstract
The aim of this study was to develop a methodology that uses water deficit induction to
increase the frequency of hybrids in 'Sunki' mandarin Tropical selection and ‘Santa Cruz
Rangpur’ lime, varieties that have a high and an intermediate level of polyembryony,
respectively. The experiment examined the ‘Sunki Tropical’ mandarin and ‘Santa Cruz
Rangpur’ lime genotypes at three water stress intensities: 20, 40 and 100% of the pot capacity
(PC). The generated fruits were harvested, and the seeds were counted. After germination, the
number of nucellar and hybrid seedlings was determined. For ‘Santa Cruz Rangpur’ lime
genotype, the highest hybrid frequency generated was 64.2%, which occurred at a PC of 40%
and exceeded by 12% that occurring at a PC of 100%. For ‘Sunki Tropical’ mandarin, the
highest observed hybrid frequency was 21.75%, which occurred at a PC of 20% and was more
than double the hybrid frequency of 8.57% observed at 100% of the PC.
Keywords: Plant breeding, rootstock, apomixis, drought, Citrus spp
INTRODUCTION
Most plant species are perpetuated by zygotic embryogenesis, but some, such as citrus,
are able to spread naturally from somatic cells, a phenomenon called apomixis (Nakano et al.
2013). Polyembryony is a type of apomictic reproduction that is responsible for generating
more than one embryo per seed (Chen et al. 2008, Soares Filho et al. 2014). This peculiarity
allows the multiplication of interesting genotypes, especially in the case of rootstocks, by
generating clones formed from the nucellar tissue of the mother plant.
42
The significant geographic spread of citrus (Citrus L. and related genera) and increased
incidence of diseases, pests and climate change plaguing this culture, direct efforts to the
development of cultivars tolerant and/or resistant to stress of biotic and abiotic nature.
Among the solutions is the diversification of rootstocks, especially those from crosses with
Poncirus trifoliata (L.) Raf., an important species in the development of new varieties
because of their tolerance to certain biotic stresses (Ollitrault 2012).
The progeny obtained from crosses involving P. trifoliata have the potential to generate
rootstocks capable of reducing the size of scion, in addition to enabling disease resistance, the
production of high quality fruit and tolerance to cold, alkalinity, salinity and drought (Passos
et al. 2006, Grosser et al. 2007, Hussain et al. 2012, Castle et al. 2015). The good performance
of hybrid rootstocks generated from crosses with P. trifoliata can not only produce stable and
productive orchards but also enable their expansion into non-producing regions, with positive
effects on the income of growers. In addition, hybridizations with P. trifoliata are routine
because this species is associated with a dominant, readily evident, morphological marker,
which is the presence of leaves with trifoliate blades, allowing the early identification of
zygotic seedlings derived from crosses with female parents whose leaf blades are simple
(Soares Filho et al. 2014).
The process of obtaining hybrids is restricted by the high polyembryony of certain
female parents, the high heterozygosity that is common to most citrus species, and the long
period needed to assess the generated individuals (Soares Filho et al. 2014). Referring to
polyembryony, the presence of many nucellar embryos in the same seed and their subsequent
competition with the zygotic embryo hinder the survival of the zygotic embryo and may lead
to the elimination of individuals with potential for agronomical use. This phenomenon is
evident in female parents with otherwise outstanding agronomic qualifications as rootstock,
such as the 'Sunki' mandarin [C. sunki (Hayata) hort. ex Tanaka] Tropical selection, whose
polyembryony approaches 100%, unlike the common 'Sunki', which presents a low degree of
43
polyembryony, less than 20% (Soares Filho et al. 2002). This situation limits the recovery of
hybrids (Soares Filho et al. 2014) and thereby constructs a barrier to the development of new
rootstocks.
The 'Sunki Tropical' mandarin plant has advantages over the common 'Sunki' mandarin
regarding its use as rootstock, including more seeds per fruit and high polyembryony (Soares
Filho et al. 2002). These characteristics, which are associated with good drought tolerance and
resistance to Phytophthora gummosis according to observations made in commercial field
orchards, show a possible superiority of 'Sunki Tropical' over the common 'Sunki’ in the
generation of good varieties of rootstock by hybridization. In this context, it is of paramount
importance to develop methods to control the high polyembryony rates recorded in 'Sunki
Tropical' and other varieties of citrus, such as 'Cleopatra' mandarin (C. reshni hort. ex
Tanaka), which have the capacity in crosses to generate individuals with great potential for
use as rootstocks.
In Brazil citrus orchards mostly use the rootstock ‘Santa Cruz Rangpur’ because it has
agronomic characteristics of interest such as good productivity in periods of drought, rusticity
and tolerance to certain diseases (Oliveira et al., 2008).
The aim of this study was to develop a strategy using water deficit induction to
increase the frequency of hybrids in female parent with high rates of polyembryony, based on
the 'Sunki' mandarin 'Tropical' selection.
MATERIALS AND METHODS
The experiment was developed in an anti-aphid greenhouse at Embrapa Cassava and
Fruits, municipality of Cruz das Almas, BA, Brazil (lat 12° 40’ 39” N, long 39° 06’ 23” and
alt 260m asl), between 2013 and 2015. The work was based on two varieties obtained by the
Citrus Breeding Program of Embrapa Cassava and Fruits - CBP: Rangpur lime (C. limonia
Osbeck) 'Santa Cruz' selection ‘Santa Cruz Rangpur’ lime and ‘Sunki Tropical’ mandarin.
These varieties, which are commercially used as rootstocks for citrus growers, were grafted
44
onto hybrid CSM x (RL x PT) - 059, where CSM refers to the common 'Sunki' mandarin, RL
to 'Rangpur' lime and PT to the species P. trifoliata. This hybrid was also obtained by CBP.
The climatic variables, including air temperature, relative humidity and radiation, were
monitored with the aid of a weather station installed at the experimental site. The average
maximum and minimum temperature ranged 23°C within the four months of the pollinations.
The relative humidity ranged from 91.4 to 40.0% between October and November (Figure 1).
Gas exchanges were measured occasionally during the pollination period to confirm the
physiological condition of the plants (Figure 2).
The soil consisted of a mixture of two parts of washed sand, one part of soil and two
parts of Rendmax Citrus, a commercial pine bark substrate (2:1:2). The matric potential was
estimated at the Soil Physics Laboratory of Embrapa Cassava and Fruit, based on the Van
Genuchten model (1980) and humidity values.
The experiment was conducted in a completely randomized design using a factorial 2 x
3 arrangement (2 pre-selected genotypes x 3 stress intensities). The 3 stress intensity
treatments each used 20 two-year-old plants per genotype packed in 45 L pots, which were
covered with aluminium foil to prevent evaporation.
Before the beginning of the experiment, all the plants were kept at 100% of the pot
capacity (PC). Before starting treatment, all the plants were subjected to an initial water
deficit, with irrigation suspended to the wilting point, which occurred at approximately 10%
of the available water fraction of the pot. After reaching this moisture level, 10 days were
allowed to pass before irrigation was resumed to induce flowering. Following this 10-day
period, the plants were hydrated to three levels of water stress, namely, severe, moderate and
no water stress (control) at 20, 40 and 100% of the PC, respectively.
The soil water content was accessed using time domain reflectometry (TDR) probes
constructed by hand and containing three stainless steel rods 0.003 m in diameter, 0.15 m
long, spaced 0.022 m apart, insulated with polyester resin and fitted with RG58 coaxial cables
45
(50 ohms) 0.75 m long. The plants were irrigated every two days based on the data obtained
from the TDR readings, replacing only the amount of water required to stabilize the
treatments.
During the plant flowering period, which occurred when the plants were three years old,
gas exchanges were monitored for photosynthesis (A), transpiration (E) and stomatal
conductance (gs) using an infrared gas analyzer (IRGA, LCpro-SD photosynthesis analyzer).
During that period, the tops of 'Rangpur Santa Cruz' lime and 'Sunki Tropical' mandarin were
pollinated with P. trifoliata (PT). The pollinations were always manually performed in the
morning and identified for control. Between September and December 2014, approximately
30 flowers were pollinated in plants of each genotype. Some pollination events were aborted,
and others were chopped due to the accumulation of fruit on the branch. After the pollination
period, all the plants were irrigated to 100% of the PC. Routine cultivation treatments were
carried out throughout the period for pest control.
Between April and June 2015, 299 fruits (Table 1) were collected: 141 ‘Santa Cruz
Rangpur’ lime and 158 ‘Sunki Tropical’ mandarin derived from controlled pollinations that
were distributed among the water deficit treatments. The seeds were extracted, placed in
whitewash solution (calcium hydroxide and magnesium hydroxide), then washed in running
water to remove the mucilage and stored in the shade over newsprint to dry for one day. The
seeds were separated and counted by genotype and treatment to determine the number of
fruits per treatment and the number of seeds per fruit as well as the median size and weight of
50 seeds.
After drying, the seeds were classified as unviable when shrivelled, small when they
reached one-third (1/3) to one-sixth (1/6) of normal size, and normal. The shrivelled seeds
were discarded, and the normal ones were sown directly in seedbeds containing pine bark
substrate. The small seeds were brought to the Tissue Culture Laboratory of Embrapa Cassava
and Fruits for in vitro germination. After disinfection, the seeds were grown in test tubes
46
containing approximately 10 mL of WPM medium, which was supplemented with 25 g.L-1
of
sucrose, solidified with 7 g.L-1
of agar and adjusted to pH 5.8 before autoclaving. The tubes
were kept in a growth room at a temperature of 27± 1°C and a photon flux density of 30
µmol.m-2
.s-1
under a 16-hour photoperiod for 45 days. Acclimatization was conducted in a
greenhouse with controlled ventilation.
The effects of treatments in genotypes were evaluated through analysis of variance and
the means compared by Tukey (P<0.05) test using the statistical program genes (Cruz 2006).
RESULTS AND DISCUSSION
When compared with the control treatment (100% of the PC), an increase of the greatest
magnitude in fruit number and, consequently, in the amount of available seed was observed in
both genotypes for the most severe water deficit treatment, the 20% of PC treatment, followed
by lesser increases for the 40% of PC treatment. These results confirm the observations of
(Chica and Albrigo 2013), indicating that flowering in citrus is stimulated by water scarcity,
as well as by low temperatures. These abiotic effects promote the differentiation of
reproductive vegetative buds, increasing the number of flower buds and thus the development
of more flowers and fruits (Santos et al. 2004, Iglesias et al. 2007). Another notable trend in
both genotypes was a reduction in average seed weight with an increased severity of water
deficit due to the emergence of lighter seeds in the 20% of PC treatment (Table 2).
In fruit plants, the induction of flowering after drought is common (Nakajima et al. 1993,
Cuevas et al. 2008, Chang et al. 2014), and flowering is the determining phenological stage
for productivity (García-Tejero et al. 2011). Responses to water stress are known to be
associated with changes that lead to reproductive cycle manifestation, determining the
cessation of sprout growth and the stimulation of reproductive bud formation, with the
manifestation of this process influenced by the intensity and duration of stress, as well as the
plant species (Cuevas et al. 2008, Ávila et al. 2012). The hydraulic discontinuity present in the
47
basal structure of flowers and leaf sheaths causes the response amplitude to be greater in
flowers than in other parts of the plant, even under stress. This slows the loss of water,
ensuring the development of flowers and favouring the production of fruits (Saini 1997).
However, as Sunki Maravilha seeds have become smaller and lighter by reducing the amount
of water supplied in water deficit treatments. These results explain the increased frequency of
hybrids found in this treatment. Lighter seeds may favor the zygotic embryo in competition
with nucellars.
The number of seeds extracted was 1028 for ‘Santa Cruz Rangpur’ lime and 1653 for
‘Sunki Tropical’ mandarin. Twenty ‘Santa Cruz Rangpur’ lime seeds were classified as small
seeds and were sent for in vitro germination. The shrivelled seeds were discarded, and the
normal ones were planted directly in the seeding. For the normal ‘Santa Cruz Rangpur’ lime
seeds that germinated, the observed frequency in the 20% PC treatment was 54.46% for
hybrids and 45.53% for nucellar individuals, and in the 40 and 100% PC treatments, the
observed frequencies were 64.21 and 52.63% for hybrids and 37.78 and 47.36% for nucellar
seedlings, respectively (Table 1). The total seed number does not match the plant number due
to polyembryony (some seeds generated more than two seedlings).
In the ‘Sunki Tropical’ mandarin genotype, 54 small seeds were found. Of these, only
six derived from the 20% of PC treatment, generating four hybrid and two nucellar seedlings.
Of the remaining small seeds, 30 originated from the 40% of PC treatment, generating eight
hybrid and 22 nucellar seedlings. The normal seed in the 20% of PC treatment generated
21.75% hybrid and 78.24% nucellar seedlings, whereas the 40 and 100% of PC treatments
formed 15.33 and 8.57% hybrid seedlings, respectively, compared with 84.66 and 91.42%
nucellar seedlings (Table 1).
In this study, it was found that water stress promoted the formation of hybrids in 'Sunki
Tropical' female parent despite the high rate of polyembryony presented by this mandarin.
Thus, water stress can be considered an important tool in stimulating the generation of zygotic
48
individuals. The rootstock of 'Sunki Tropical' has behaved excellently in combination with
various scions, which qualifies this rootstock for use in crosses aimed at obtaining hybrid
rootstock varieties. In female parents, the genetic contribution of this rootstock to the
formation of zygotic individuals has been observed for not only nuclear but also cytoplasmic
genes.
The development of hybrid rootstock varieties, aiming to expand the gene pool present in
commercial orchards, is of great value for improving the sustainability of citrus. With climate
change and the increased incidence of many diseases and pests, the importance of developing
methodologies that encourage the formation of hybrids using parents endowed with high
horticultural value is evident. Among these, as already mentioned, are female parents whose
seeds show high levels of polyembryony, with the restricted generation of hybrids due to the
frequent formation of embryos of apomictic origin and the infrequent development of zygotic
individuals. Kumar et al. (2014), studying the relation between abiotic stress and the
manifestation of polyembryony, found that the development of nucellar cells occurs during
the pre-anthesis phase, when the genes responsible for the formation of apomictic embryos
would be expected to remain active. These authors comment that abiotic stress is linked to the
signalling and triggering of gene expression cascades responsible for the production of
reactive oxygen species (ROS) and H2O2. These products are responsible for the emergence of
genetically competent groups of cells that form the nucellar embryos.
Soares Filho et al. (2014) demonstrated that the degree of polyembryony is inversely
proportional to the number of hybrids formed from controlled crosses. This demonstration
was based on the results of crosses involving female parents with different degrees of
polyembryony, which ranged from 8% to nearly 100% in 'Sunki Florida' mandarin, as verified
in the following mandarins: 'Sunki Tropical' (94 %), 'Sunki Maravilha' (97%), 'Cleopatra'
(98%) and 'Dancy' (99%) (C. tangerina Tanaka). Therefore, to ensure success in the
production of hybrids, extreme situations exist warranting the use of monoembryonic female
49
parents, whose seeds, as a rule, produce just one embryo of sexual origin (Chen et al. 2008,
Soares Filho et al. 2012).
Studies to establish the frequency of hybrids in citrus are found in the literature in relation
to the genetic improvement of culture stocks (Soares Filho et al. 2014, Soares Filho et al.
2007, Oliveira et al. 2000). In the present study, the frequency of hybrids generated in the
cross 'Rangpur Santa Cruz' x P. trifoliata showed no significant variation between the 40 and
100% of PC water deficit treatments, with 64.21 and 52.63% hybrids, respectively (Table 1).
These hybrid frequencies exceeded those found by Soares Filho et al. (2014) in a cross
between 'Rangpur Santa Cruz', as female parent, and citrangequat 'Thomasville' [Fortunella
margarita (Lour.) Swingle x citrange (C. sinensis x P. trifoliata) 'Willits'], which produced a
hybrid frequency of approximately 22%. Although the male parents were different, it can be
assumed that the higher frequency of hybrids detected in the current study reflects the limited
environment for the development of roots, once the plants were grown in pots.
Comparing the crosses 'Rangpur Santa Cruz' lime x P. trifoliata and 'Sunki Tropical'
mandarin x P. trifoliata, a significant increase in the frequency of hybrids was verified in the
second cross with water stress treatment (Table 1), which may infer that water scarcity
triggered survive mechanisms in this mandarin that favoured the perpetuation of its gene pool
by generating variability, via hybridization, allowing the possible emergence of individuals
with higher survivability in environments subject to this stress. Oliveira et al. (2015), working
with the 'Rangpur Santa Cruz' lime and the 'Sunki Maravilha' mandarin, found that water
stress caused changes in the abundance of proteins in the roots of both genotypes, with major
changes noticed in the mandarin. Santana-Vieira et al. (2016) found differences between these
genotypes in their drought tolerance mechanisms, indicating that this behaviour of 'Sunki
Maravilha' acts to ensure plant survival and to maintain active metabolic processes, doing so
through the establishment of survive mechanisms with strategies that include tolerance to
dehydration, the optimization of water use, and the reduction of photosynthesis and stomatal
50
conductance. In the present study, the response of 'Sunki Tropical' mandarin to water stress
favoured sexual embryo development, contrary to its behavior in the presence of a normal
water supply, when this genotype, through seeds with a high rate of polyembryony, generated
few zygotic embryos. These observations indicate that subjecting Citrus sunki to water
scarcity triggered mechanisms that contributed to plant survival and gene pool preservation,
whereas under the same conditions, C. limonia attempted to maintain its metabolism up to the
limit of water availability.
To aid citrus breeding programmes, this study provides information that enables the
generation of representative quantities of hybrids in controlled crosses using female parents
with high levels of polyembryony subjected to a water deficit. This information was verified
in crosses with 'Sunki Tropical' mandarin as the female parent, in which a hybrid frequency of
approximately 22% was obtained with the application of relatively severe water stress through
the 20% of PC treatment.
ACKNOWLEDGEMENTS
This research is supported by National Council for Scientific and Technological Development
– CNPq and Fapesb. We are grateful to technical assistants Liziane Marques dos Santos and
Maria Aparecida dos Santos de Jesus, for their kind support.
REFERENCES
Ávila C, Guardiola JL and Nebauer SG (2012). Response of the photosynthetic apparatus to a
flowering-inductive period by water stress in Citrus. Trees - Structure and Function 26:
833–840.
Castle WS, Bowman KD, Grosser JW, Futch SH and Graham JH (2015) Florida Citrus
Rootstock Selection Guide. 3rd ed. 1 How to Use the Rootstock Selection Guide Key to
Symbols, pp.2–4.
51
Chang Y, Chang Y and Lin L (2014) Response of Shoot Growth, Photosynthetic Capacity ,
Flowering , and Fruiting of Potted “ Nagami ” Kumquat to Different Regulated Deficit
Irrigation. Horticulture, Environment, and Biotechnology 56: 444–454.
Chen C, Lyon MT, O’Malley D, Federici CT, Gmitter J, Grosser JW and Gmitter FG (2008)
Origin and frequency of 2n gametes in Citrus sinensis × Poncirus trifoliata and their
reciprocal crosses. Plant Science 174: 1–8.
Chica EJ and Albrigo LG (2013) Cool temperature and water deficit interact during floral
induction in Citrus. Proceedings of the Florida State Horticultural Society 126:45–50.
Cruz CD (2006) Programa Genes: Biometria. Editora UFV. Viçosa (MG), p. 382.
Cuevas J, Hueso JJ and Rodríguez MC (2008) Deficit irrigation as a tool for manipulating
flowering date in Loquat ( Eriobotrya japonica Lindl.). In: Agricultural Water Management
Research Trends, pp 237–253.
Farooq M, Wahid A, Kobayashi N, Fujita D and Basra SMA (2009) Plant SMaB. Plant
drought stress : effects , mechanisms and management. Review article. Agronomy for
Sustainable Development, Springer Verlag 29: 185–212.
García-Tejero I, Durán-Zuazo VH, Arriaga-Sevilla J and Muriel-Fernández JL (2011). Impact
of water stress on citrus yield. Agronomy for Sustainable Development 32: 651–659.
Grosser J, Graham J and Hoyte A (2007). Continued development of rootstocks tolerant of the
phytophthora-diaprepes complex via greenhouse screening. Proceedings of the Florida State
Horticultural Society, pp.103–109.
Hussain S, Curk F, Dhuique-Mayer C, Urban L, Ollitrault P, Luro F and Morillon R (2012)
Autotetraploid trifoliate orange (Poncirus trifoliata) rootstocks do not impact clementine
quality but reduce fruit yields and highly modify rootstock/scion physiology. Scientia
Horticulturae 134: 100–107.
52
Iglesias DJ, Cercós M, Colmenero-Flores JM, Naranjo MA, Ríos G, Carrera E, Ruiz-Rivero
O, Lliso I, Morillon F, Tadeo FR and Talon M (2007) Physiology of citrus fruiting. Brazilian
Journal of Plant Physiology 19: 333–362.
Kumar V, Malik SK, Pal D, Srinivasan R, Bhat SR (2014) Comparative transcriptome
analysis of ovules reveals stress related genes associated with nucellar polyembryony in
citrus. Tree Genetics and Genomes 10: 449–464.
Nakajima Y, Susanto S and Hasegawa K (1993) Influence of Water Stress in Autumn on
Flower Induction and Fruiting in Young Pomelo Trees (Citrus grandis (L.) Osbeck). Journal
of the Japanese Society for Horticultural Science 62: 15-20.
Nakano M, Kigoshi K, Shimizu T, Endo T, Shimada T, Fujii H and Omura M (2013)
Characterization of genes associated with polyembryony and in vitro somatic embryogenesis
in Citrus. Tree Genetics and Genomes 9: 795–803.
Oliveira RP, Novelli VM and Machado MA (2000) Frequência de híbridos em cruzamento
entrE tangerina “Cravo” e laranja “Pêra”: Análise de marcadores morfológicos e RAPD.
Pesquisa Agropecuaria Brasileira 35: 1895–1903.
Oliveira RP, Soares Filho WS, Passos OS, Scivittar OWB, Rocha PSG (2008) Porta-enxertos
para citros. Embrapa Clima Temperado – Documento, 226. Pelotas – Rio Grande do Sul.
Oliveira TM, da Silva FR, Bonatto D, Neves DM, Morillon R, Maserti BE, Coelho Filho MA,
Costa MGC, Pirovani CP and Gesteira AS (2015) Comparative study of the protein profiles of
Sunki mandarin and Rangpur lime plants in response to water deficit. BMC Plant Biology
15: 69.
Ollitrault P and Navarro L (2012) Citrus. In: M.L. Badenes and D.H. Byrne (eds.), Fruit
Breeding, Handbook of Plant Breeding. 8: 623-662.
Passos OS, Peixouto LS, Santos LC, Caldas RC and Soares Filho WS (2006) Caracterização
de híbridos de Poncirus trifoliata e de outros porta-enxertos de citros no Estado da Bahia.
Revista Brasileira de Fruticultura 28: 410-413.
53
Saini HS (1997) Effects of water stress on male gametophyte development in plants. Sex
Plant Reprod 10: 67–73.
Santana-Vieira DDS, Freschi L Almeida LAH, Neves DM, Moraes DHS, Santos LM,
Bertolde FZ, Soares Filho WS, Coelho Filho MA, and Gesteira AS (2016) Survival strategies
of citrus rootstocks subjected to drought. Scientific Reports 6, 38775, 2016.
Santos CH dos, Klar AE, Grassi Filho H, Rodrigues JD and Pierre FC (2004) Indução do
florescimento e crescimento de tangerineira “Poncã” (Citrus reticulata Blanco) em função da
irrigação e da aplicação de paclobutrazol. Revista Brasileira de Fruticultura 26: 8–12.
Soares Filho WDS, Ledo CADS, Quintela MP, Mattos LA, Passos OS and Souza ADS (2007)
Cruzamentos em citros: frequência e vigor de híbridos. Revista Brasileira de Fruticultura
29: 393–398.
Soares Filho WS, Souza U, Ledo CAS, Santana LGL and Passos OS (2014) Poliembrionia e
potencial de obtenção de híbridos em citros. Revista Brasileira de Fruticultura 36: 950-956.
Soares-Filho WS, Diamantino MSAS, Moitinho EDB, Cunha-Sobrinho AP and Passos OS
(2002) “ Tropical ”: Uma Nova Seleção De Tangerina “ Sunki .” Revista Brasileira de
Fruticultura 24: 127–132.
.
54
TABLE 1
Table 1. Distribution of fruits and seeds in crossings under three moisture regimes and Seeds germinated by direct planting and the frequency of hybrid 2
and nucellar seedlings for ‘Santa Cruz Rangpur’ lime and ‘Sunki Tropical’ mandarin genotypes. 3
Genotype Hydric
regime
Fruit
number
Seed
number
Seed/ Weight of 50 Average size
(mm)
Total de seedlings Frequency of
hybrids (%)
Frequency of
nucella (%)
Not germinated
seeds fruit Seed (g) Hybrid Nucella
Sunki
Tropical’
mandarin
20% 85 992 12 6.89 9.29 248 892 21.75 78.24 243
40% 68 773 11 6.13 9.49 134 740 15.33 84.66 81
100% 5 88 18 6.52 10.06 3 32 8.57 91.42 56
‘Santa
Cruz
Rangpur’
Lime
20% 104 721 8 5.94 10.09 134 112 54.46 45.53 418
40% 30 255 9 5.88 9.61 61 34 64.21 35.78 228
100% 7 52 7 5.92 9.79 10 9 52.63 47.36 25
1 ‘Sunki Tropical’ mandarin [C. sunki (Hayata) hort. ex Tanaka]; ‘Santa Cruz Rangpur’ lime (Citrus limonia Osbeck). 4
55
Table 2. Effect of drought treatments in size and average weight of 50 seeds in ‘Santa
Cruz Rangpur’ lime and ‘Sunki Tropical’ mandarin.
100% 40% 20%
Genotype Size (mm) Weight(g) Size(mm) Weight(g) Size(mm) Weight(g)
‘Santa Cruz Rangpur’ lime 9.96abA 0.88aB 9.36bA 1.01aA 10.06aA 0.81aA
‘Sunki Tropical’ mandarin 10.23aA 2.29aA 9.65bA 1.67bA 9.21cA 1.63cA
* Means followed by the same capital letters on the lines do not differ statistically from
each other by F test and lower in columns belong to the same group by Tukey test at 5%
probability.
56
FIGURE
Figure 1. Weather conditions in an anti-aphid screen house between September and
November 2014. Air relative humidity data (%) and maximum and minimum
temperature data are represented by bars and lines, respectively.
57
Figure 2. Photosynthetic rate, stomatal conductance and transpiration rate during water
deficit treatments through the pollination period in genotypes ‘Rangpur Santa Cruz’
lime Citrus limonia Osbeck (a, b and c) and ‘Sunki Tropical’ mandarin C. sunki
(Hayata) hort. ex Tanaka (d, e and f).
58
3. CONCLUSÕES GERAIS
O experimento revelou que o peso e o tamanho das sementes das tangerineiras
não é influenciado pelo ambiente, porém é dependente de fatores genéticos, ou seja, a
maior frequência de híbridos triploides está vinculada aos genótipos hibridados. Este
resultado foi verificado com o aumento de indivíduos triploides quando foi utilizado a
tangerineira ‘Fortune’ como parental tanto feminino quanto masculino. Outra
observação mostrou que apesar do reduzido número de sementes pequenas, o déficit
hídrico pode ter influenciado na formação de triploides em sementes consideradas
normais. Esta informação sugere que a fecundação de gametas normais com não
reduzidos podem gerar sementes com tamanho normal, além das pequenas já
mencionadas na literatura.
As avaliações realizadas com intuito de formar tetraploides mostraram que a
TSKTR desenvolveu, a partir de células nucelares, indivíduos tetraploides. Este
resultado pode ser considerado um mecanismo de sobrevivência, pois na contagem de
híbridos zigóticos formados este genótipo também apresentou aumento da frequência
em relação ao LCRSTC neste mesmo experimento e quando comparados com dados já
publicados na literatura. Assim, os mecanismos de tolerância e sobrevivência diferentes
do genótipo TSKTR, influenciam na duplicação do genoma e formação de poliploides.
Esta metodologia pode ser utilizada e aprimorada por programas de melhoramento
genético que visem a obtenção de tetraploides em variedades de porta-enxerto.
Em todos os genótipos houve diferença significativa nas concentrações de
hormônios entre os tratamentos. Sendo encontrado maiores concentrações 20% de CC
principalmente de ABA, resposta esperada uma vez que esse hormônio está vinculado a
resposta ao estresses hídrico. As concentrações de açúcares também diferiram entre os
tratamentos revelando a influência destes compostos na regulação química destas
plantas para adaptação as mudanças ambientais. Esta variação é reflexo de mecanismos
de defesa ao déficit hídrico, interferindo na formação de gametas, causando a não
redução em tangerineiras e duplicando o genoma em células somáticas nucelares. Além
disto, o estresse hídrico aumentou a frequência de híbridos no genótipo TSKTR,
altamente poliembrionia, o que sugere a diminuição da competição entre embriões
zigóticos e nucelares, o que favorece a obtenção de híbridos a partir de variedades de
interesse para programas de melhoramento genético de citros.
59
4. REFERÊNCIAS
Acharya, B. R.; Assmann, S. M. Hormone interactions in stomatal function. Plant
Molecular Biology, v.69, n.4, p.451–462, 2009.
Adams, K. L.; Wendel, J. F. Polyploidy and genome evolution in plants. Current
Opinion in Plant Biology, v.8, n.2, p.135–41, 2005.
Aleza, P., Juárez, J., Hernández, M., Ollitrault, P., Navarro, L. Implementation of
extensive citrus triploid breeding programs based on 4x x 2x sexual hybridisations.
Tree Genet Genomes. v.8, n.6, p.1293–306, 2012.
Aleza, P.; Juárez, J.; Cuenca, J.; Ollitrault, P.; Navarro, L. Extensive citrus triploid
hybrid production by 2x×4x sexual hybridizations and parent-effect on the length of the
juvenile phase. Plant Cell Reports, v.31, n.9, p.1723–35, 2012b.
Aleza, P.; Juárez, J.; Cuenca, J.; Ollitrault, P.; Navarro, L.. Recovery of citrus triploid
hybrids by embryo rescue and flow cytometry from 2x x 2x sexual hybridisation and its
application to extensive breeding programs. Plant Cell Reports, v.29, n.9, p.1023–34,
2010a.
Aleza, P.; Juárez, J.; Hernández, M.; Ollitrault, P.; Navarro, L. Implementation of
extensive citrus triploid breeding programs based on 4x x 2x sexual hybridisations.
Tree Genetics and Genomes, v.8, n.6, p.1293–1306, 2012a.
Aleza, P.; Juárez, J.; Ollitrault, P.; Navarro, L. Polyembryony in non-apomictic citrus
genotypes. Annals of Botany. v. 106, n.4, p. 533–45, 2010b.
Allario, T., Brumos, J., Colmenero-Flores, J. M., Iglesias, D. J., Pina, J. a, Navarro, L.,
Talon, M.; Ollitrault, P.; Morillon, R. Tetraploid Rangpur lime rootstock increases
drought tolerance via enhanced constitutive root abscisic acid production. Plant, Cell &
Environment, v.36, n.4, p. 856–68, 2013.
60
Allario, T., Brumos, J., Colmenero-Flores, J. M., Iglesias, D. J., Pina, J. a, Navarro, L.,
Talon, M.; Ollitrault, P.; Morillon, R. Tetraploid Rangpur lime rootstock increases
drought tolerance via enhanced constitutive root abscisic acid production. Plant, Cell &
Environment, v.36, n.4, p. 856–68, 2013.
Allario, T.; Brumos, J.; Colmenero-Flores, J. M.; Iglesias, D. J.; Pina, J. a; Navarro, L.,
Talon, M.; Ollitrault, P.; Morillon, R. Tetraploid Rangpur lime rootstock increases
drought tolerance via enhanced constitutive root abscisic acid production. Plant, Cell &
Environment, v.36, n.4, p. 856–68, 2013.
Andrade-Rodríguez, M.; Villegas-Monter, A.; Carrillo-Castañeda, G.; García-
Velázquez, A. Polyembryony and identification of Volkamerian lemon zygotic and
nucellar seedlings using RAPD. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 39, n.6, p.551–
559, 2004
Arrigo, N.; Barker, M. S. Rarely successful polyploids and their legacy in plant
genomes. Current Opinion in Plant Biology, v.15, n.2, p. 140–6, 2012.
Baldwin, S. J.; Husband, B. C. The association between polyploidy and clonal
reproduction in diploid and tetraploid Chamerion angustifolium. Molecular Ecology,
v.23, p.1806–1819, 2013.
Blanc, G.; Wolfe, K.H. Functional divergence of duplicated genes formed by
polyploidy during Arabidopsis evolution. Plant Cell, v.16, p.1679-1691, 2004.
Brownfield L, Köhler C. Unreduced gamete formation in plants: mechanisms and
prospects. Journal of Experimental Botany, v. 62, n.5, p.1659–1668, 2011.
Brownfield, L., Köhler, C. Unreduced gamete formation in plants: mechanisms and
prospects. Journal of Experimental Botany, v.62, n.5, p. 1659–68, 2011.
Del Pozo, J. C.; Ramirez-Parra, E. Deciphering the molecular bases for drought
tolerance in Arabidopsis autotetraploids. Plant, cell & environment, v.37, n.12,
p.2722-37, 2014.
61
Dhamodharan, M., Devadoss, S., Luckstead, J. Imperfect competition, trade policies,
and technological changes in the orange juice market. Journal of Agricultural and
Resource Economics, v.41, n. 2, p.189–203, 2016.
Food and Agricultural Organization. “FAOSTAT.” 2014. Rome: FAO. Available online
at http://faostat.fao.org/default.aspx
Fraire-Velázquez, S., Rodríguez-Guerra, R., Sánchez-Calderón, L. Abiotic and Biotic
Stress Response Crosstalk in Plants. IN: Shanker, A. K. and Venkateswarlu, B. (2011.).
Guerra, D., Schifino-Wittmann, M. T., Schwarz, S. F., Weiler, R. L., Dahmer, N., &
Souza, P. V. D. De. Tetraploidization in citrus rootstocks: effect of genetic constitution
and environment in chromosome duplication. Crop Breeding and Applied
Biotechnology, v.16, n.1, p. 35–41, 2016.
Guerra, D., Teresa, M., Wittmann, S., Schwarz, S. F., Vitor, P., Souza, P.V. D.,
Gonzatto, M.P., Weiler, R. L. Comparison between diploid and tetraploid citrus
rootstocks : morphological characterization and growth evaluation. Bragantia, v.73,
n.1, p.1–7, 2014.
Guerra, M. Chromosomal Variability and the Origin of Citrus Species Chapter 2 In:
Genetic Diversity Editors: C. L. Mahoney and D. A. Springer ISBN 978-1-60741-176-
5. 2009.
Hussain, S., Curk, F., Dhuique-mayer, C., Urban, L., Ollitrault, P. Autotetraploid
trifoliate orange ( Poncirus trifoliata ) rootstocks do not impact clementine quality but
reduce fruit yields and highly modify rootstock / scion physiology. Scientia
Horticulturae, v.134, p. 100–107, 2012.
IBGE, Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Produção Agrícola Municipal,
2015. Acesso em: 27/09/2016. Disponível em:
http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/pesquisas/pesquisa_resultados.php?id_pesquisa
=44
62
Jaskani, M.J., Khan, I.A., Khan, M.M. and Abbas, H. Frequency of triploids in different
interploidal crosses of citrus. Pakistan Journal of Botany, v.39,n.5, p.1517–1522,
2005.
Kempa, S., Krasensky, J., Dal Santo, S., Kopka, J., Jonak, C. A central role of abscisic
acid in stress-regulated carbohydrate metabolism. PLoS One, v.3, n.12, p. e3935, 2008.
Koch, K. Sucrose metabolism: Regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar
sensing and plant development. Current Opinion in Plant Biology. v. 7, n.3, p. 235–
246, 2004.
Koltunow, a M.; Hidaka, T.; Robinson, S. P. (1996). Polyembryony in Citrus.
Accumulation of seed storage proteins in seeds and in embryos cultured in vitro. Plant
Physiology, v.110, n.2, p.599–609, 1996.
Kumar, V., Malik, S.K., Pal, D., Srinivasan, R., Bhat, S.R. Comparative transcriptome
analysis of ovules reveals stress related genes associated with nucellar polyembryony in
citrus. Tree Genetics and Genomes, v.10, n.3, p.449–464, 2014.
Levin, D. A. The timetable for allopolyploidy in flowering plants. Annals of Botany,
v.112, n.7, p.1201–8, 2013.
Levin, D.A. Polyploidy and novelty in flowering plants. The American Naturalist, v.
122, n.1, p.1-25, 1983.
Machado, M. A., Cristofani-yaly, M., & Bastianel, M. Breeding , genetic and genomic
of citrus for disease resistance. Revista Brasileira de Fruticultura, v.205, p.158–172,
2011.
Machado, M.A., Cristofani-yaly, M., Bastianel, M. Breeding , genetic and genomic of
citrus for disease resistance. Revista Brasileira de Fruticultura, v.205, p.158–72,
2011.
Madlung, A. Polyploidy and its effect on evolutionary success: old questions revisited
with new tools. Heredity, v.110, n.2, p.99–104, 2013.
63
Mondal, B. e Saha, R. Identification of zygotic and nucellar seedlings of Citrus
reticulata and Citrus aurantifolia using RAPD. International Journal of Advanced
Biotechnology and Research, v.5, n.1, p. 25-30, 2014.
Moreira, R.A., Ramos, J.D., Cruz, M.C.M. Caracterização de frutos e poliembrionia em
sementes de Flying Dragon e hibridos de porta-enxerto de citros. Revista Brasileira de
Fruticultura, v. 32, n.2, p.486-492, 2010.
Morillon, R., Navarro, L., & Ollitrault, P. Tetraploidization events by chromosome
doubling of nucellar cells are frequent in apomictic citrus and are dependent on
genotype and environment. Annals of Botany, v.108, p.37–50,2011.
Nakano, M., Shimada, T., Endo, T., Fujii, H., Nesumi, H., Kita, M., Ebina M., Shimizu
T.; Omura, M. Characterization of genomic sequence showing strong association with
polyembryony among diverse Citrus species and cultivars, and its synteny with Vitis
and Populus. Plant Science : An International Journal of Experimental Plant
Biology, v.183, p.131–42, 2012.
Navarro, L.; Juárez, J.; Aleza, P.; Pina, J. A.; Olivares-Fuster, O.; Cuenca, J.; Julve, J.
M. Programa de obtención de híbridos triploides de mandarino en España. Phytoma, n.
170, p.36-41, 2005.
Neves, D. M., Filho, M. a C., Bellete, B. S., Silva, M. F. G. F., Souza, D. T., Soares
Filho, W.S., Costa, M.G.C., Gesteira, A. S. Comparative study of putative 9-cis-
epoxycarotenoid dioxygenase and abscisic acid accumulation in the responses of Sunki
mandarin and Rangpur lime to water deficit. Molecular Biology Reports, v.40, n.9,
p.5339–49, 2013.
Osakabe, Y., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K., Tran, L.-S. P. ABA control of
plant macroelement membrane transport systems in response to water deficit and high
salinity. New Phytologist, v.202, n.1, p.35–49, 2014.
64
Osborn, T. C., Chris Pires, J., Birchler, J. A., Auger, D. L., Chen, Z. J., Lee, H. S.,
Comai , L.; Madlung, A.; Doerge, R.W.; Colot, V. Martienssen, R. A. Understanding
mechanisms of novel gene expression in polyploids. Trends in Genetics, v.19, n.3,
p.141–147, 2003.
Pedroso, F. K., Prudente, D. A., Bueno, A. C. R., Machado, E. C., Ribeiro, R. V.
Drought tolerance in citrus trees is enhanced by rootstock-dependent changes in root
growth and carbohydrate availability. Environmental and Experimental Botany,
v.101, p. 26-35, 2014.
Ramsey, J. Polyploidy and ecological adaptation in wild yarrow. PNAS, v.108, p.
7096–7101, 2011.
Ramsey, J., Schemske, D.W. Pathways, Mechanisms, and Rates of Polyploid Formation
in Flowering Plants. Annu Rev Ecol Syst, v.29, n.1, p.467–501, 1998.
Ranney, T. G., & Jones, J. R. Understanding polyploidy: insights into the evolution and
breeding of Azaleas. The Azalean, p.81–84, 2008.
Raven, P.H., Evert, R.F., Eichhorn, S.E. Biologia Vegetal. ed.5. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan. 1996.
Reddy, A. R., Chaitanya, K. V., Vivekanandan, M. Drought-induced responses of
photosynthesis and antioxidant metabolism in higher plants. Journal of Plant
Physiology, v.161, n.11, p.1189–1202, 2004.
Rodríguez-Gamir, J., Primo-Millo, E., Forner, J. B., Forner-Giner, M. A. Citrus
rootstock responses to water stress. Scientia Horticulturae, v.126, n.2, p. 95–102,
2010.
Rolland, F., Baena-Gonzalez, E., Sheen, J. Sugar sensing and signaling in plants:
Conserved and Novel Mechanisms. Annu Rev Plant Biol, v.57, n.1, p.675–709, 2006.
Ruan, Y-L. Sucrose metabolism: gateway to diverse carbon use and sugar signaling.
Annu Rev Plant Biol, v.65, p.33–67, 2014.
65
Ruan, Y-L., Patrick, J.W., Bouzayen, M., Osorio, S., Fernie, A.R. Molecular regulation
of seed and fruit set. Trends Plant Sci, v.17, p.656–65, 2012.
Shafieizargar, A., Awang, Y., Juraimi, A. S., & Othman, R. Comparative studies
between diploid and tetraploid Dez Orange [ Citrus sinensis ( L .) Osb .] under salinity
stress. Austrian Journal of Crop Science, v.7, n.10, p.1436–1441, 2011.
Soares Filho, W.S., D. E. H. E. M., Alberto, C., Gomes, L., Santana, L., & Passos, O.
S.. Poliembrionia e potencial de obtenção de híbridos em citros. Revista Brasileira de
Fruticultura, v.36, n.4, p. 950–956, 2014.
Soares Filho, W.S., Medrado, A.C.M., Cunha, M.A.P., Sobrinho, A.P.C., Passos, O.S.
Frequência de híbridos em cruzamentos controlados de citros: cultivo de sementes
versus cultivo in vitro de embriões. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.37, n.7, p.
981-988, 2002.
Soares Filho, W.S., Souza, U., Ledo, C.A.S, Santana, L.G.L., Passos, O. S.
Poliembrionia e potencial de obtenção de híbridos em citros. Revista Brasileira de
Fruticultura, v. 36, n. 4, p.950-956, 2014.
Spurling, M.B. Citrus in the Pacific area. In: Internacional Citrus Symposium, 1ed.
Riverside. Proceedings... Riverside, CA: University of California, v. 1, p.93-101, 1969.
Sreenivasulu, N., Harshavardhan, V.T., Govind, G., Seiler, C., Kohli, A. Contrapuntal
role of ABA: Does it mediate stress tolerance or plant growth retardation under long-
term drought stress? Gene, v.506, n.2, p.265–73, 2012.
Sreenivasulu, N., Radchuk, V., Alawady, A., Borisjuk, L., Weier, D., Staroske, N.,
Fuchs, J., Miersch, O., Strickert, M., Usadel, B., Wobus, U., Grimm, B., Weber, H.,
Weschke, W. De-regulation of abscisic acid contents causes abnormal endosperm
development in the barley mutant seg8. The Plant Journal, v.64, n.4, p.589–603, 2010.
66
Syvertsen, J. P., Lee, L. S., Grosser, J. W. Limitations on growth and net gas exchange
of diploid and tetraploid Citrus rootstock cultivars grown at elevated CO2. Journal of
the American Society for Horticultural Science, v.125, n.2, p. 228–234, 2000.
Taiz, L., Zeiger, E. Fisologia Vegetal. 3ed. Porto Alegre, Artmed, 2004.
Tamayo-Ordóñez, M. C., Espinosa-Barrera, L. a., Tamayo-Ordóñez, Y. J., Ayil-
Gutiérrez, B., & Sánchez-Teyer, L. F. Advances and perspectives in the generation of
polyploid plant species. Euphytica, 2016.
Tamayo-Ordóñez, M.C., Espinosa-Barrera, L. A., Tamayo-Ordóñez, Y.J., Ayil-
Gutiérrez, B., Sánchez-Teyer, L.F. Advances and perspectives in the generation of
polyploid plant species. Euphytica. 2016.
Trapero, C., Barranco, D., Martín, A., Díez, C. M. Occurrence and variability of sexual
polyembryony in olive cultivars. Scientia Horticulturae, v.177, p.43–46, 2014.
Tusa, N., Abbate, L., Ferrante, S., Lucretti, S., Scarano, M.T. Identification of zygotic
and nucellar seedlings in citrus interploid crosses by means of isozymes, flow cytometry
and ISSR-PCR. Cell Mol Biol Lett, v.7, n.2, p. 703-8, 2002.
Usman, M., Saeed, T., Khan, M.M., Fatima, B. Occurrence of spontaneous polyploids
in Citrus. Horticultural Science, v.33, n.3, p.124–129, 2006.
Wang, X., Cheng, Z. M. M., Zhi, S., & Xu, F.. Breeding triploid plants: A review.
Czech Journal of Genetics and Plant Breeding, v.52, n.2, p.41–54, 2016.
Waseem, M., Ali, A., Nadeem, M.A., Ayub, M., Tanveer, A., Ahmad, R. Mechanism of
drought tolerance in plant and its management through different methods. Continental
J. Agricultural Science, v.5, n.1, p.10–25, 2011.
Zeng, S. H., Chen, C. W., Hong, L., Liu, J. H., & Deng, X. X.. In vitro induction,
regeneration and analysis of autotetraploids derived from protoplasts and callus treated
67
with colchicine in Citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v.87, n.1, p.85–93,
2006.
JALEEL, C. A., MANIVANNAN, P., WAHID, A., FAROOQ, M., AL-JUBURI, H. J.,
SOMASUNDARAM, R., PANNEERSELVAM, R. Drought Stress in Plants : A Review on
Morphological Characteristics and Pigments Composition. International Journal of
Agriculture & Biology, v.11, p. 100–5, 2009.