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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PRÓ- REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS EM NÓDULOS DE Inga vera Willd.

(LEGUMINOSAE- MIMOSOIDEAE) DO SUL DA BAHIA

HELLEN RIBEIRO MARTINS DOS SANTOS

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Março de 2010

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Dissertação apresentada à

Universidade Estadual de Santa Cruz,

como parte das exigências para

obtenção do título de Mestre em

Genética e Biologia Molecular.

Área de concentração: Genética

e Biologia Molecular

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Março de 2010

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Dissertação apresentada à

Universidade Estadual de Santa Cruz,

como parte das exigências para

obtenção do título de Mestre em

Genética e Biologia Molecular.

Área de concentração: Genética

e Biologia Molecular

APROVADA: 30 de março de 2010

Profa. Dra. Rachel Passos Rezende

DCB – UESC

Dr. Fábio Bueno dos Reis Júnior

CPAC - EMBRAPA

Prof. Dr. Leandro Lopes Loguércio DCB - UESC

Prof. Dr. Eduardo Gross DCAA - UESC (Orientador)

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais, amigos e toda minha família que, com muito carinho e apoio,

não mediram esforços para que eu chegasse até esta etapa de minha vida, dedico.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, que em sua infinita sabedoria soube guiar-me tão sabiamente nesta

jornada.

A meus pais Ananias e Suzete, pelo incentivo, carinho e amor incondicional, bem

como, por acreditarem que este sonho se tornaria realidade.

A meus irmãos Diego, Kellen e Fabiana por estarem sempre presentes nesta

caminhada.

Ao professor Eduardo Gross, por sua orientação, companheirismo, paciência e

atenção dedicados a mim no desenvolvimento deste trabalho, por estar sempre

disponível, mesmo nas horas em que “tempo” era a última palavra existente em seu

vocabulário, e por ter este jeito tão especial como pesquisador, professor e amigo

que cativa a todos ao seu redor.

Aos meus queridos companheiros de laboratório, os “cientistas malucos”, Irailde,

Miguel, Ana Carolina, Raimundo, Everton, Marcos Vinícius, Caroline, James,

Lidiane, Maíra, Marcela, Lucas, Thales e Daniel, pelas muitas discussões,

conselhos, brincadeiras, e ajuda na realização deste trabalho, em especial a Ana

Carolina, Miguel e Irailde, por, juntamente com nosso orientador, se tornarem

parceiros nesta pesquisa e dedicar dias e dias a troca de informações e geração de

conhecimentos.

Às minhas companheiras de serra e montanhas, Caroline Pinheiro, Kalinka Correia e

Profa Daniela Talora, pela imensa ajuda na coleta do material de pesquisa.

Ao amigo Ércio pela disponibilização do material botânico, ao Profo André Amorim

pela identificação das árvores no local de coleta e ao Profo e co-orientador João

Carlos Dias pelo auxílio e sugestões quando necessário.

A todos os meus amigos, companheiros da vida, que por serem muitos, seria injusto

citar qualquer nome, pelo prestígio, atenção, inúmeras risadas, e por me dedicarem

tanto carinho e estarem sempre por perto.

A todos os professores, pelos ensinamentos e pelo apoio recebidos, me permitindo

crescer como estudante e pessoa.

Aos funcionários Dona Carmem e Raimundo pelo convívio e pela preciosa ajuda

quando era preciso.

Ao programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular (PPGGBM), pela

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oportunidade de realização deste mestrado.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa.

Enfim, a todos aqueles não citados, porém importantes, que direta ou indiretamente,

contribuíram para a minha formação, agradeço.

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ÍNDICE

EXTRATO ............................................................................................................................ viii

ABSTRACT ......................................................................................................................... x

1.INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA .................................................................................. 01

2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 04

2.1 A Fixação Biológica de Nitrogênio ........................................................................

2.2 Taxonomia e Diversidade de Rizóbios .................................................................

2.3 Formação dos Nódulos e a Simbiose Rizóbio – Leguminosa ..............................

2.4 Genes relacionados à FBN ..................................................................................

2.5 Uso da taxonomia molecular para estudo de diversidade .....................................

2.6 Beta-rizóbios que nodulam leguminosas ..............................................................

2.7. O gênero Inga Mill. (Leguminosae-Mimosoideae) ................................................

3. MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................

3.1. Coleta de nódulos e material botânico ...................................................................

3.2. Isolamento e cultivo dos rizóbios ............................................................................

3.3. Caracterização morfológica das colônias ...............................................................

3.4. Extração de DNA genômico ....................................................................................

3.5. Amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) ...................................

3.6. Seqüenciamento e análises de diversidade ...........................................................

3.7. Avaliação da Influência de isolados de rizóbio selecionados sobre o

crescimento inicial de plantas de Inga edulis .........................................................

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................

4.1. Caracterização morfológica dos nódulos e das colônias bacterianas ....................

4.2. Análises de agrupamento dos caracteres morfológicos das colônias ....................

4.3. Extração do DNA genômico e amplificação dos genes dos isolados bacterianos..

4.4. Análises da diversidade genética ............................................................................

4.4. Experimento de inoculação de rizóbios em Inga edulis ..........................................

5. CONCLUSÃO ..................................................................................................................

6. REFERÊNCIAS ...............................................................................................................

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EXTRATO

SANTOS, Hellen Ribeiro Martins dos, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz,

Ilhéus, Março de 2010. Diversidade de bactérias em nódulos de Inga vera Willd.

(Leguminosae - Mimosoideae) do sul da Bahia. Orientador: Eduardo Gross. Co -

orientador: João Carlos Teixeira Dias. Colaborador: Marcio Gilberto Cardoso Costa.

Poucas espécies de leguminosas arbóreas que ocorrem no estado da Bahia

foram estudadas quanto a sua nodulação e seus rizóbios simbiontes, apesar da grande importância econômica e ecológica que apresentam tanto essas plantas como tal simbiose. Espécies arbóreas como o gênero Inga, que ocorrem no bioma Mata Atlântica e nas cabrucas do sul da Bahia, representam um pouco desse potencial ainda inexplorado. Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivo estudar a diversidade das bactérias associadas aos nódulos da leguminosa arbórea Inga vera Willd. (Leguminosae – Mimosoideae) presente em um trecho de Mata Atlântica primária do sul da Bahia. Para tanto, nódulos das raízes de 12 árvores desta espécie foram coletados na Reserva Ecológica de Serra Bonita, localizada no município de Camacã (BA), e trazidos para laboratório para isolamento e caracterização de suas bactérias simbiontes. O DNA total desses isolados foi extraído e as regiões que codificam o 16S rDNA e os genes recA, nifH e nodC amplificadas, sendo obtidas seqüências do 16S rDNA e recA. As observações morfo-anatômicas demonstraram que os nódulos radiculares de I. vera são do tipo indeterminado, raramente ramificados. Os dendrogramas UPGMA gerados pelas análises de agrupamento das características morfológicas das colônias bacterianas resultaram na formação de dois grandes grupos, um formado por colônias com coloração amarela, com produção de mucopolissacarídeos e crescimento relativamente rápido (3 – 7 dias), capazes de acidificar o meio de cultura. Outro grupo foi formado por colônias de cor branca, com a capacidade de alcalinizar o meio e de crescimento lento (8 – 12 dias), produzindo pouco ou nenhum muco. A análise das seqüências do 16S rDNA e do gene recA desses isolados, submetidas ao banco de genes para buscar alinhamentos significativos, demonstrou que o primeiro grupo era predominantemente formado por espécies de Burkholderia e o segundo grupo por espécies do gênero Bradyrhizobium. Foi evidenciada ampla diversidade genética de bactérias presentes nos nódulos de I. vera, com isolamento não só de alfarizóbios, Rhizobium e Bradyrhizobium, mas também de betarizóbios

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identificados como sendo Burkholderia, gênero pela primeira vez relatado como associado aos nódulos desta leguminosa arbórea. As análises de diversidade sugeriram que houve uma substancial similaridade entre alguns dos isolados bacterianos de I. vera com Burkholderia nodosa e Bradyrhizobium japonicum. No experimento em que os isolados 26A (identificado como Rhizobium tropici) e 395A (Burkholderia nodosa), provenientes dos nódulos de I. vera, foram inoculados em plântulas de I. edulis, não ocorreu nodulação.Os resultados demonstraram que os nódulos I. vera são colonizados por uma ampla diversidade de bactérias. Palavras-chave: rizóbios, leguminosas arbóreas, 16S rDNA, recA.

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ABSTRACT

SANTOS, Hellen Ribeiro Martins dos, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz,

Ilhéus, Março de 2010. Diversity of bacteria Inga vera Willd. (Leguminosae -

Mimosoideae) nodules on south of Bahia. Advisor: Eduardo Gross. Advisory

Committee Members: João Carlos Teixeira Dias and Marcio Gilberto Cardoso Costa.

Few species of tree legumes that occur on Bahia State were studied about their nodulation and their symbiotic rhizobia, despite of economic and ecological importance that these plants and this symbiosis represent. Tree species as Inga genus, which occur on Mata Atlantica biome and cabrucas of south of Bahia, represents some of this unexplored potential. The aim of present work was to study the diversity of nodule-associated bacteria from leguminous tree Inga vera Willd. (Leguminosae – Mimosoideae), which occur on fragment of primary Atlantic Forest on south of Bahia. Root nodules from 12 trees of this species were collected on Reserva Ecológica de Serra Bonita, localized on the Camacã municipality (BA), and brought to laboratory for symbiotic bacteria isolation and characterization. Total DNA from these bacteria was extracted and regions that codify 16S rDNA and recA, nifH e nodC genes were amplified with only 16S rDNA and recA sequences being obtained. Morpho-anatomical observations demonstrated that I. vera root nodules are of indeterminate type, rarely branched. UPGMA dendrograms generated from cluster analyses of morphological characteristics for bacteria colonies resulted on formation of two large groups, one formed by yellow colonies, with mucopolysaccharide production and relatively fast growth (3 – 7 days) that acidified the culture media. Another group was formed by white colonies, which alkalinized the media and slow growth (8 – 12 days), producing little or none mucous. The sequences analysis from 16S rDNA and recA genes from these isolates, submitted to gen banks to search for significant alignments, demonstrated that the first group were predominantly formed by Burkholderia species and the second group by Bradyrhizobium species. Wide genetic diversity of nodule bacteria from I. vera nodules were observed, not only by alfarhizobia Rhizobium and Bradyrhizobium isolation, but also with betarhizobia identified as Burkholderia genus that is for the first time reported as associated with the nodules of this legume tree. Diversity analyses suggested substantial similarity between some bacterial isolates from I. vera with Burkholderia nodosa and

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Bradyrhizobium japonicum. On experiment that 26A (identified as Rhizobium tropici) and 395A (Burkholderia nodosa) isolates, obtained from I. vera nodules, were inoculated on I. edulis seedlings nodulation not occurred. The results demonstrated that I. vera nodules are colonizeds by a wide diversity of bacteria.

Keywords: Rhizobia, leguminous tree, 16S rDNA, recA.

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1. INTRODUÇÃO

O nitrogênio é considerado elemento essencial para os organismos vivos,

pois juntamente com o carbono, oxigênio e hidrogênio, está presente na composição

das mais importantes biomoléculas, tais como ATP, NADH, NADPH, clorofila, ácidos

nucléicos e proteínas. A fixação do nitrogênio atmosférico em amônia e

posteriormente em compostos orgânicos é uma parte crucial no ciclo do nitrogênio

(HARPER, 1994). A nitrogenase, enzima responsável por essa fixação, tem uma

ampla distribuição taxonômica em organismos procariotos (bactérias e

arqueobactérias). Dentre estas, os rizóbios, bactérias fixadoras de nitrogênio

simbiontes, que formam estruturas hipertróficas (nódulos) nas raízes das

leguminosas, e são conhecidos como os maiores contribuintes para esse processo

(REIS et al., 2006).

Os rizóbios são um grupo de Proteobacterias aeróbicas obrigatórias não

formadoras de endósporos, que possuem a enzima nitrogenase e na simbiose com

as leguminosas cedem amônia e absorvem fotossintatos da planta hospedeira,

estabelecendo assim uma relação mutualística (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002). A

nitrogenase parece estar organizada em um “cluster” no cromossomo ou em

plasmídeo dependendo da espécie bacteriana, com diversos genes denominados de

nif (“nitrogen fixation”) responsáveis por codificar proteínas envolvidas diretamente

no processo da redução do nitrogênio (SPRENT, 2001). Além dos genes nif, em

certos diazotróficos tem sido relatado outros genes tais como o fix e o nod que

codificam proteínas que indiretamente desempenham função essencial na

nodulação em bactérias simbiontes.

Do ponto de vista agronômico, ecológico e econômico, a simbiose entre

rizóbios e leguminosas é muito importante por poder dispensar parcial ou totalmente

a utilização de fertilizantes nitrogenados sintéticos, contribuindo assim para a

nutrição da planta e aumento do nitrogênio disponível no solo (REIS et al., 2006). As

bactérias fixadoras de nitrogênio podem ser simbiontes mutualísticas, como

Rhizobium, Burkholderia e Frankia, ou de vida livre, como Nostoc, Beijerinckia e

Clostridium. Algumas espécies de vida livre são freqüentemente encontradas em

associação com raízes de plantas (como, por exemplo, Azospirillum) e, devido à sua

habilidade de interferir na morfologia das raízes e crescimento das plantas, podem

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ser consideradas rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCPs)

(BALDANI; BALDANI, 2005). As bactérias fixadoras de nitrogênio, portanto, não

pertencem a um grupo filogenético restrito. Segundo classificação a partir do

seqüenciamento do RNA ribossômico existem bactérias fixadoras de nitrogênio entre

as proteobactérias, as cianobactérias, as bactérias Gram positivas e as bactérias

verdes enxofradas (WOESE, 1987). As alfa e betaproteobactérias que se associam

com as raízes de plantas da família Leguminosae (Fabaceae) podem ser referidas,

atualmente como alfarizóbios e betarizóbios (BONTEMPS et al., 2010).

As leguminosas são a terceira maior família de plantas com flores, só sendo

superada pelas Orchidaceae e Asteraceae (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Estima-se

que a família leguminosae possua aproximadamente 20.000 espécies e cerca de

700 gêneros (LEWIS et al., 2003a) e é dividida em três subfamílias:

Caesalpinoideae, Mimosoideae e Papilionoideae, as quais diferem bastante em

relação ao hábito de crescimento de suas espécies, assim como na capacidade de

formar simbiose com bactérias fixadoras de nitrogênio. A subfamília Caesalpinoideae

possui cerca de 3.000 espécies, sendo, a maioria, arbórea tropical, e é dentre as 3

subfamílias, a que engloba a maioria das espécies de leguminosas não nodulíferas

(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

Mimosoideae tem aproximadamente 78 gêneros e mais de 3.000 espécies

distribuídos por todas as regiões tropicais, subtropicais e temperadas quentes do

mundo. A capacidade de formar nódulos nas plantas dessa subfamília está

confirmada para todas as cinco tribos citadas por Polhill e Raven (1981), mas nem

todos os gêneros dentro das tribos nodulam. Três gêneros importantes nesse grupo

são Acacia, Mimosa e Inga, com respectivamente, 1.500, 500 e 300 espécies,

abrangendo, portanto, a maioria das Mimosoideae até então conhecidas (MOREIRA;

SIQUEIRA, 2006; REIS JUNIOR et al, 2006).

Dentre as três subfamílias, a Papilionoideae representa um grupo mais

numeroso, com cerca de 14.000 espécies, na maioria de hábito herbáceo; apesar de

a subfamília também possuir cerca de 4.000 a 5.000 espécies arbóreas (MOREIRA;

SIQUEIRA, 2006). A maioria das espécies dessa subfamília até hoje estudadas

forma nódulos radiculares e algumas até mesmo caulinares (SPRENT, 2001).

As leguminosas apresentam uma grande diversidade anatômica e

morfológica de seus nódulos, mas basicamente, eles podem ser classificados em

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dois tipos: os determinados e os indeterminados, os quais diferem, dentre outras

características, pela presença de um meristema permanente no ápice do nódulo,

nesse caso, classificado como indeterminado. Os diferentes tipos de nódulos

geralmente estão relacionados com a tribo a qual a planta pertence (BALDANI;

BALDANI, 2005).

Devido à importância agronômica e econômica dos rizóbios e com o

surgimento e aplicação de novas técnicas moleculares, esses microrganismos têm

sido intensivamente estudados durante as últimas décadas. Entretanto, poucas

espécies de leguminosas arbóreas que ocorrem no estado da Bahia foram avaliadas

quanto a sua nodulação e seus rizóbios simbiontes, representando assim um

potencial inexplorado, devido ao desconhecimento de suas características

silviculturais, sua produtividade e, denotadamente, sua habilidade em associar-se a

bactérias fixadoras de N2. Neste contexto, estudos mais detalhados sobre as

espécies bacterianas envolvidas nesse processo são necessários e oportunos.

Espécies arbóreas como o gênero Inga, um gênero exclusivamente

neotropical com cerca de 300 espécies arbóreas (PENNINGTON, 1997) que

ocorrem no bioma Mata Atlântica e nas cabrucas do sul da Bahia, representam uma

pequena parte desse potencial ainda a ser descoberto. Dentre as muitas espécies

do gênero, uma que se destaca pela freqüência com que é encontrada nas matas é

Inga vera Willd. Ela é uma das árvores mais típicas do gênero, formadora de matas

ribeirinhas (matas ciliares e galerias) do Brasil, sendo de pequeno porte, perenifólia,

com grande abrangência também na América Central, Colômbia, Argentina e

Uruguai. No Brasil, pode ser encontrada em quase todos os estados, sendo

indicada, principalmente, para revegetação e recuperação de áreas degradadas

(BARBEDO, 1997).

Uma vez que a simbiose do ingazeiro com rizóbios pode suprir, pelo menos

em parte, a necessidade de nitrogênio da planta, e sendo o uso desta de grande

interesse ecológico e florestal, a pesquisa com as bactérias fixadoras de nitrogênio

pode auxiliar na seleção de estirpes mais eficientes para inoculação nas

leguminosas. O presente trabalho teve, portanto, o objetivo de estudar a diversidade

das bactérias presentes nos nódulos da leguminosa arbórea Inga vera Willd.

(Leguminosae – Mimosoideae), coletados em uma mata primária do sul da Bahia.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. A Fixação Biológica de Nitrogênio

A Fixação Biológica do Nitrogênio (FBN) é a conversão de nitrogênio

atmosférico (N2) em amônia (NH3). A maioria dos organismos necessita de uma

fonte de nitrogênio numa forma mais reduzida do que aquela presente na atmosfera,

para que este elemento possa ser assimilado. A exceção são os organismos

fixadores de nitrogênio, conhecidos comumente como diazotróficos. Estes

organismos possuem a enzima nitrogenase que é capaz de reduzir o N2 para a

forma inorgânica combinada NH3 (Figura 1) e que pode então se tornar disponível

para o ambiente e os organismos a eles associados.

N2 + 8H+ + 16ATP + 8e- 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Figura 1 - Esquema da reação de fixação do nitrogênio com mediação pela nitrogenase.

A fixação do nitrogênio pode ser realizada por processos industriais, como o

Haber- Bosch, que contribui com cerca de 25% do nitrogênio fixado utilizado nos

sistemas agrícolas e florestais (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006), e por processos

físicos como relâmpagos, combustão e vulcanismo, cuja contribuição com o total de

nitrogênio fixado é de 10%. Porém, a maior contribuição parece estar na fixação

biológica de nitrogênio, responsável por um total de 65% do total de nitrogênio fixado

anualmente. A diazotrofia, habilidade de reduzir o nitrogênio atmosférico à amônia é

uma característica exclusiva dos domínios Bacteria e Archaea (SAWADA et al.,

2003).

A primeira bactéria fixadora de N2 atmosférico foi descrita em 1889. Desde o

começo, essa descoberta gerou grande impacto e vasta literatura sobre o tema,

sendo até hoje os rizóbios, os diazotróficos mais estudados (REIS et al., 2006).

Quando se faz um comparativo entre o processo de fixação de N2

atmosférico por

via industrial e via biológica, pode-se verificar que a FBN é um processo bem mais

rentável que o indústrial, por ser um mecanismo que não exige a uma alta demanda

energética (consome somente em torno de 2,5% da energia da fotossíntese do

Nitrogenase

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planeta), não causa impacto ambiental, além de ser um recurso renovável e passivo

de manipulação (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

2.2. Taxonomia e Diversidade de Rizóbios

No século XIX, os estudos clássicos de Hellriegel e Wilfarth (1888) foram os

primeiros a estabelecer quem eram os micróbios nos nódulos das raízes que

permitiam às leguminosas obter o nitrogênio do ar. Esses microrganismos foram

isolados ainda em 1888 por Beijerinck, que os nomeou de Bacillus radicicola.

Posteriormente, foram denominados Rhizobium leguminosarum por Frank (1889).

Inicialmente, os pesquisadores consideraram o rizóbio como espécie única, capaz

de nodular todas as leguminosas.

Löhnis e Hansen (1921) sugeriram a divisão do rizóbio em dois grupos de

acordo com a taxa de crescimento em meio de cultura. O termo rizóbio de

crescimento rápido passou a referir-se às bactérias associadas com alfafa, trevo,

feijão e ervilha. As bactérias de crescimento lento foram exemplificadas pelos

rizóbios de soja e caupi. Fred et al. (1932) basearam-se nos hospedeiros e em

algumas diferenças morfológicas e fisiológicas para o reconhecimento de seis

espécies de Rhizobium: R. leguminosarum, R. trifolii, R. phaseoli, R. meliloti, R.

japonicum e R. lupini (VIEIRA, 2007).

Por muitas décadas, a caracterização de espécies de rizóbio foi baseada na

habilidade específica da bactéria em nodular a planta hospedeira. Estudos iniciais

mostraram que cada estirpe ou isolado de rizóbio tinha um determinado grupo de

hospedeiros, ou seja, nodulava certas leguminosas, mas não outras. Isso levou ao

conceito de inoculação cruzada, com as leguminosas sendo agrupadas de acordo

com o rizóbio com o qual elas formavam nódulos. Mais de 20 grupos de inoculação

cruzada foram identificados, com as bactérias do grupo do trevo, alfafa, feijão,

tremoço, ervilha e soja sendo denominadas como espécies separadas de um único

gênero, Rhizobium (ex: R. trifolii para trevo) (VIEIRA, 2007).

Recentemente, outras características têm assumido maior importância na

classificação dos rizóbios por diferentes razões. Os estudos iniciais envolveram,

principalmente, leguminosas de importância agrícola; estudos com leguminosas

menos tradicionais tornaram obscuros os limites da inoculação cruzada. A estirpe

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bacteriana NGR234, por exemplo, originalmente isolada de Lablab purpureus, o

feijão labe-labe, nodula com 34 diferentes espécies de leguminosas e com uma

espécie não-leguminosa (Parasponia andersonii) (STANLEY; CERVANTES, 1991).

Os novos métodos taxonômicos desenvolvidos para comparar estirpes, com

base em diferentes características, resultaram em agrupamentos cada vez mais

distantes daqueles baseados na capacidade específica da bactéria para nodular a

planta hospedeira. Reconhecendo-se as limitações da infecção da planta como o

maior determinante taxonômico, outros caminhos começaram a ser trilhados para

melhor classificar os rizóbios. A taxonomia numérica reforçou as diferenças entre os

grupos de rizóbio de crescimento rápido e lento e levou à consolidação de algumas

espécies dentro de cada grupo. Em 1984, dois gêneros foram descritos, Rhizobium e

Bradyrhizobium. Três espécies foram nomeadas para o gênero Rhizobium: R. loti, R.

meliloti e R leguminosarum. O gênero Bradyrhizobium (“bradus”, grego, significando

lento) compreendeu todas as estirpes de crescimento lento e somente uma espécie

foi nomeada: B. japonicum, o microssimbionte de soja (VIEIRA, 2007).

O notável progresso na taxonomia rizobiana levou à descrição de mais de 40

novas espécies e de quatro gêneros adicionais, Allorhizobium, Azorhizobium,

Mesorhizobium e Sinorhizobium. (VIEIRA, 2007).

Através da realização de vários estudos, sabe-se hoje que muitos gêneros e

espécies de procariotos capazes de realizar a FBN estão distribuídos no ambiente e

associados às plantas. Essas associações podem variar em especificidade,

estrutura, localização e microrganismo responsável. Existe uma diversidade de

bactérias simbióticas, que são capazes de formar nódulos e pertencem

principalmente ao grupo dos rizóbios e do gênero Frankia. Há também bactérias que

colonizam os tecidos internos das plantas – denominadas de bactérias diazotróficas

endofíticas. Um terceiro grupo forma associações superficiais aos tecidos

radiculares, sobrevivem bem no solo e não são caracterizadas como espécie-

específicas, sendo denominadas de associativas (REIS et al.,2006).

A maioria das bactérias diazótróficas está posicionada na subdivisão Alfa de

Proteobactéria, sendo este o subgrupo mais estudado. Dentro desse grupo estão

também posicionadas as bactérias simbióticas dos gêneros Azorhizobium,

Bradyrhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium, além de organismos fototróficos e

metanotróficos, tornando esta subdivisão bastante variável. Na subdivisão Beta são

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encontrados gêneros tais como Burkholderia e Ralstonia. As Gamma

proteobactérias compõem uma menor parte das bactérias diazotróficas descritas. E

a subdivisão Delta das Proteobactérias possui, em sua maioria, bactérias

anaeróbicas obrigatórias redutoras de enxofre, incluindo espécies de Desulfovibrio e

Desulfobacter (REIS et al., 2006).

Apesar dos grandes avanços, muitos estudos estão sendo feitos para a

descoberta de novas bactérias fixadoras de nitrogênio, a fim de ampliar o

conhecimento sobre a diversidade desses microssimbiontes.

2.3. Formação dos Nódulos e a Simbiose Rizóbio – Leguminosa

Os nódulos se apresentam como estruturas hipertróficas nas raízes e,

excepcionalmente, no caule das plantas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002),

especialmente das leguminosas. Do ponto de vista morfo-anatômico, os nódulos

podem ser classificados em dois tipos: determinados e indeterminados. Nódulos

determinados apresentam formato globoso, devido ao limitado desenvolvimento do

meristema. Já os indeterminados são alongados, por causa da presença de um

meristema persistente localizado no seu ápice, que produz continuamente novas

células (PATRIARCA et al., 2002, GAGE et al., 2004, PRELL; POOLE, 2006).

O processo de nodulação é controlado, em grande parte, pela troca de sinais

entre a bactéria simbionte e a planta, bem como pela expressão de genes que se

fazem necessários para as alterações fisiológicas e morfológicas que possibilitam a

simbiose. Nos estádios iniciais de formação dos nódulos radiculares, a espécie

hospedeira libera sinais em sua rizosfera, identificados como compostos fenólicos

(flavonóides e betaínas) que são percebidos pelas bactérias, desencadeando a

expressão coordenada de uma série de genes de nodulação, os chamados genes

(nod), que, a depender da bactéria, podem estar localizados no DNA cromossomal

ou plasmidial. Após a sinalização, os tricomas radiculares são encurvados,

possibilitando, desta maneira, a entrada das bactérias (PATRIARCA et al., 2002,

GAGE et al., 2004). Essa sinalização induz a mitose acelerada de células

hipodérmicas pré-existentes, determinada por fatores estimulantes provenientes da

bactéria. Esse estímulo é dirigido a células localizadas nas proximidades dos pólos

do xilema da planta. No estádio inicial da divisão hipodérmica, forma-se o meristema

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primário do nódulo. Quando a bactéria invade o tricoma radicular, o meristema

primário do nódulo induz a divisão pericíclica, próxima da região do xilema, formando

o meristema secundário do nódulo que se funde ao primário através da ramificação

do cordão de infecção. Tanto as células da planta em divisão quanto às invadidas se

fundem, e as células contendo as bactérias aumentam rapidamente de volume

ficando restritas à zona central ou à apical do nódulo, o qual cresce e se diferencia

(CARDOSO et al., 1992).

A simbiose de rizóbios e leguminosas é, geralmente, considerada como

sendo mutualística. Na verdade, simbioses de rizóbios podem ser parasíticas

(quando há formação de nódulos inefetivos) ou mutualísticas, nesse caso quando os

nódulos são efetivos (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002). Estes últimos precisam manter

o nível de oxigênio baixo, pois a enzima responsável pela fixação de nitrogênio

(nitrogenase) é extremamente sensível a altas concentrações de O2. Para neutralizar

a incompatibilidade de fixação de N2, que é estritamente anaeróbico, e o

metabolismo dos diazotróficos que é aeróbio, esses microrganismos desenvolveram

vários mecanismos para protegerem o sítio da nitrogenase da interferência do

oxigênio, como apresentar uma razão superfície/volume celular menor, o que seria

um modo de impedir o excesso de absorção de O2. Além disso, os nódulos que

fixam nitrogênio apresentam um composto com função e composição semelhante à

hemoglobina, a leg-hemoglobina, que transporta oxigênio para os microrganismos. A

leg-hemoglobina possui uma alta afinidade pelo O2, agindo assim como um tampão,

mantendo a concentração baixa de oxigênio no meio e provendo O2 ao

microssimbionte numa taxa constante (GAGE et al., 2004; MOREIRA; SIQUEIRA,

2002; PRELL; POOLE, 2006).

2.4. Genes relacionados à FBN

Vários genes estão envolvidos no processo de fixação de nitrogênio. Tais

genes parecem estar organizados em “clusters” dentro da célula, exercendo cada

um uma função específica relacionada ao processo de fixação. Muitos são

importantes, porém os principais são os genes nif, fix e nod.

Os nif (“nitrogen fixation”) são genes requeridos para a estrutura, biossíntese

e regulação da nitrogenase e, portanto, encontrados em todos os diazotróficos.

9

Desde sua primeira descrição em Klebsiella pneumoniae (CANNON et al.,1980;

DIXON et al.,1980), tais genes já foram identificados em várias espécies de

dizotróficos associativos (ex. Azospirillum brasilense, A. lipoferum, A. amazonense)

(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Os nif são organizados em várias unidades

transcricionais de regulação. Além dos genes estruturais da nitrogenase (nif HDK),

essas unidades também contêm os genes que controlam as proteínas de transporte

de elétrons (codificam para produtos envolvidos na biossíntese do co-fator Fe-Mo da

nitrogenase), e certos genes reguladores da transcrição (DIXON; KAHN, 2004).

Os genes fix, atuantes no processo da fixação de nitrogênio, são encontrados

em adição aos nif em bactérias simbióticas. E os genes nod requeridos para a

nodulação, só são encontrados em bactérias diazotróficas formadoras de nódulos,

como as do gênero Rhizobium e Bradyrhizobium que formam simbiose com as

leguminosas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

Citam-se mais de 40 genes bacterianos nod envolvidos na nodulação em

diferentes espécies de rizóbios cuja transcrição é ativada por sinais específicos da

planta (MELO; AZEVEDO, 1998, GAGE et al., 2004, PRELL; POOLE, 2006). Os

genes nod codificam aproximadamente 25 proteínas que são necessárias para a

síntese e exportação do fator Nod. O fator Nod é um lipo-oligossacarídeo sinal

constituído de um suporte de quitina, quatro a cinco unidades de N-acetilglicosamina

com um lipídeo ligado ao final não reduzido, e modificações hospedeiro-específica

neste suporte de quitina. Este lipo-oligossacarídeo sinaliza o desenvolvimento de

muitas modificações na planta no início do processo de nodulação, incluindo a

deformação de tricoma radicular, a despolarização da membrana, oscilação do

cálcio intracelular e a iniciação da divisão celular no córtex da raiz, estabelecendo

um meristema e o primórdio do nódulo (GAGE et al., 2004).

Os projetos genoma dos rizóbios têm ampliado expressivamente o

conhecimento dos genes relacionados a FBN. Dentre os diversos genomas

completos de bactérias fixadoras de N2,disponíveis atualmente na base de dados do

NCBI (National Center for Biotechnology Information), pode-se destacar os de

Rhizobium etlii, Rhizobium leguminosarum, Bradyrhizobium japonicum,

Sinorhizobium meliloti, Mesorhizobium loti, Azoarcus sp, Nostoc sp., Frankia sp.,

Ralstonia solanacearum, Cupriavidus taiwanensis, Burkholderia cenocepacia,

Burkholderia phymatum STM815, Burkholderia ambifaria, dentre outros.

10

2.5. Uso da taxonomia molecular para estudo de diversidade

A taxonomia é tida, modernamente, como sinônimo de sistemática e

tradicionalmente dividida em três partes: 1- Classificação dos organismos em grupos

taxonômicos com base na similaridade entre eles; 2-Nomenclatura das unidades

definidas na classificação; 3- Identificação dos organismos desconhecidos (COWAN,

1968; STALEY; KRIEG, 1984).

A espécie é a unidade básica da taxonomia bacteriana, definida como um

grupo de estirpes, incluindo a estirpe tipo, que dividam 70% ou mais de hibridização

DNA-DNA. Uma espécie de bactéria é uma categoria que circunscreve um grupo de

indivíduos (estirpes/isolados) coerentes genomicamente, que dividam um alto grau

de similaridade em muitos aspectos independentes, testados comparativamente sob

condições padronizadas (STACKEBRANDT et al, 2002).

A seqüência de RNA ribossomal 16S tem sido preferencialmente escolhida

para a análise molecular em procariotos, pois está presente em todos esses

organismos, além de derivar de um ancestral comum, parecer geneticamente estável

e apresentar um tamanho adequado para seqüenciamento. O fato de que o RNA

tem uma função conservada durante o agrupamento dos ribossomos e na tradução

protéica sugere uma possível semelhança estrutural entre as seqüências

nucleotídicas codificadoras dos rRNA de diferentes organismos. Essa semelhança

foi posteriormente confirmada demonstrando-se a ocorrência de mudanças de

nucleotídeos coordenadas em posições homólogas de seqüências de rRNA 16S de

origens filogenéticas diversas (WOESE, 1987; VANDAMME et al., 1996).

As moléculas de rRNA apresentam regiões extremamente conservadas entre

todos os organismos que compartilham aquela espécie de rRNA e regiões altamente

variáveis, sendo que o grau de variação nessas regiões específicas pode variar de

um táxon a outro. A presença dessas regiões variáveis oferece grandes

possibilidades para o desenho de sondas genéticas reino-específicas, gênero-

específicas e até espécie ou estirpe-específicas (WOESE, 1987).

Segundo Coenye et al (2005), os métodos genotípicos clássicos usados na

taxonomia bacteriana, como conteúdo G+C, hibridização DNA-DNA e

seqüenciamento 16S rDNA, não são significativamente influenciados por forças que

moldam o genoma dos procariotos. Entre estas forças estão os rearranjos

11

cromossômicos, aquisição de genes (transferência horizontal de genes) e deleções,

que levam a uma grande diversidade na organização e no conteúdo genômico. Uma

vantagem desta abordagem é que seqüências de DNA e produtos gênicos podem

ser comparadas em um contexto evolucionário dentro da sistemática molecular (VAN

BERKUN et al., 2000).

A história evolutiva do gene de 16S rRNA aproxima-se da história evolutiva

do genoma total, tornando-se desta forma, aceitável reconstruir relações

filogenéticas e evolucionárias entre bactérias a partir da divergência das seqüências

entre seus genes de 16S rRNA (VAN BERKUN et al., 2000). Por conta disso, a

molécula da subunidade menor do RNA ribossomal de 16S (16S rRNA) foi

estabelecida como importante marcador universal, e somado a técnicas de

seqüenciamento de DNA e softwares de análise mais acessíveis surgiu uma

taxonomia baseada em DNA, sendo impensável o estudo da diversidade e a

publicação da descrição de uma nova espécie sem a seqüência de nucleotídeos do

gene de 16S rRNA desta espécie para que assim se estabeleça sua correta posição

taxonômica dentro do grupo (YOUNG, 2000).

2.6. Beta-rizóbios que nodulam leguminosas

Estudos recentes demonstraram que espécies bacterianas pertencentes à

Classe Beta das proteobacterias podem nodular e fixar nitrogênio associando-se às

leguminosas (MOULIN et al., 2001; CHEN et al., 2003, 2005 a,b; BARRETT;

PARKER, 2005, 2006; ANDAM, et al., 2007). Esses “beta-rizóbios”, assim

atualmente chamados, apresentam, aparentemente, características semelhantes

quanto à formação dos nódulos, dos bacteróides e fixação de nitrogênio, aos das

bactérias simbiontes pertencentes à Classe Alfa das proteobacterias (os alfa-

rizóbios). Entretanto, apesar de só recentemente evidenciadas e identificadas,

existem descrições de bactérias diferentes dos alfa-rizóbios nos nódulos de

leguminosas desde 1902 (STURTZ et al., 1997), sendo descrita a espécie

Agrobacterium radiobacter (BEIJERINCK; VAN DELDEN, 1902) nas raízes de trevo.

Sturtz et al. (1997) também identificaram nos nódulos das raízes de trevo (Trifolium

pratense L.) bactérias dos gêneros: Agrobacterium, Bacillus, Bortedella,

Curtobacterium, Enterobacter, Phyllobacterium, Pseudomonas e Rhizobium.

12

A partir do ano de 2001, outros gêneros começam a ser descritos com a

capacidade de estabelecer simbiose com leguminosas. Methylobacterium,

pertencente a um ramo distinto das alfaproteobactérias é capaz de nodular

Crotalaria (SY et al., 2001). Rivas et al. (2002) descreveram estirpes de Devosia

capazes de nodular o caule da leguminosa aquática Neptunia, cuja espécie

bacteriana normalmente em simbiose é Allorhizobium umidicola. Neste trabalho os

genes nodC e nifH, envolvidos na nodulação e fixação de nitrogênio,

respectivamente, foram seqüenciados. Representantes do gênero Ochrobactrum

demonstraram capacidade de nodular leguminosa Lupinus albus (TRUJILLO et al.,

2005), e os genes nifH e nodC destas bactérias também tiveram suas seqüências

reveladas neste trabalho, mostrando grande semelhança com os genes de espécies

rizóbios. Há ainda a descrição de bactérias do gênero Phyllobacterium que nodulam

Lupinus (VALVERDE et al., 2005).

Atualmente, houve várias descrições de outras betaproteobactérias

(principalmente as do gênero Burkholderia), que possuem a capacidade de nodular

e fixar nitrogênio em associação com leguminosas e particularmente com as da

subfamília Mimosoideae (CHEN et al., 2003a, 2005a, b; BARRETT; PARKER, 2005,

2006; ELLIOTT et al., 2007).

Burkholderia é um gênero com taxonomia complexa, que inclui atualmente

mais de 50 espécies que colonizam uma grande diversidade de nichos que vão

desde o solo à água até as plantas e animais (BONTEMPS et al., 2010), nove dos

quais estão estreitamente relacionados com um grupo, conhecido como o complexo

Burkholderia cepacia (COENYE; et al., 2001). Até o presente momento, apenas

cinco espécies Burkholderia que nodulam foram descritas: Burkholderia tuberum

(Vandamme et al. 2002), B. phymatum (Vandamme et al. 2002), B. mimosarum

(Chen et al. 2006), B. nodosa (Chen et al. 2007) e B. sabiae (Chen et al. 2008).

O gênero também tem sido isolado dos nódulos de diversas espécies de

Mimosa no Brasil, Costa Rica, Panamá, Taiwan e Venezuela (CHEN et al., 2005).

Essas betaproteobactérias têm grande versatilidade nutricional e apresentam

resistência a antibióticos produzidos por outros microrganismos, ao que se soma a

capacidade de síntese de enzimas pectolíticas, úteis na invasão dos tecidos

vegetais, e a produção de antibióticos, úteis na supressão de outros microrganismos,

conferindo-lhe vantagens competitivas (WILLENS; COLLINS, 1993).

13

Atualmente, o conhecimento sobre Mimosa nodulando beta-rizóbios incluem

Cupriavidus taiwanensis (inicialmente descrita como Ralstonia taiwanensis;

VANDAMME; COENYE, 2004) e Burkholderia spp. C. taiwanensis foi isolada de

nódulos de Mimosa pudica, M.diplotricha e M. pigra (sin. M. pellita), em Taiwan

(CHEN et al., 2001, 2003a, 2005a), de nódulos de M. pudica no norte e no sul da

Índia (VERMA et al., 2004), e algumas cepas de C. taiwanensis e uma Cupriavidus

sp. não identificada, tem sido isoladas de M. pudica e M. pigra no Panamá

(BARRETT; PARKER, 2006). Recentemente, foi reportado também espécies de

Mimosa sendo noduladas por Burkholderia phymatum (ELLIOTT et al., 2007).

Apenas quatro dos isolados de Mimosa descritos, C. taiwanensis (LMG19424 CHEN

et al., 2003b), Burkholderia sp. Br3461 e Map3-5 (CHEN ET AL., 2005a) e

Burkholderia mimosarum PAS44 (CHEN et al., 2005b, 2006), foram confirmadas

através da microscopia, utilizando imunomarcação, como sendo simbiontes de suas

espécies de hospedeiro original (ELLIOTT et al., 2007).

Apesar da grande ocorrência entre as Mimosoideae, bactérias isoladas dos

nódulos de leguminosas da subfamília Papilionoideae, como Cyclopia spp,

Aspallathus spp e Rhynchosia ferulifolia, também foram identificadas como

pertencendo ao gênero Burkholderia (ELLIOTT et al., 2007; GARAU et al., 2009),

revelando a surpreende promiscuidade de gênero no que se refere a sua interação

com as leguminosas.

Além da diversidade de espécies de Burkholderia ser relativamente alta, a

taxonomia e identificação do gênero são complexas, com novas espécies sendo

freqüentemente descritas (COENYE; et al., 2001; COENYE; VANDAMME, 2003).

Espécies estreitamente relacionadas, tais como as do complexo B. cepacia são

difíceis de identificar usando testes fenotípicos e bioquímicos convencionais, e

espécies pertencentes a outros gêneros de betaproteobacterias (incluindo

Pandoraea e Ralstonia) podem ser identificados erroneamente como espécies de

Burkholderia (COENYE; et al., 2001). Embora a análise da seqüência do gene 16S

rRNA seja parte integrante da análise taxonômica de muitos gêneros de bactérias

(VANDAMME et al., 1996), a sua utilidade no gênero Burkholderia é mais limitada,

especialmente dentro do complexo B. cepacia, onde não pode ser usado como um

meio de distinguir com precisão todas as espécies (LIPUMA et al., 1999;

MAHENTHIRALINGAM et al., 2000). Para isso, o gene recA (que codifica a enzima

14

recombinase A), tem sido amplamente aplicado na sistemática bacteriana (KARLIN;

WEINSTOCK; BRENDEL, 1995) e provou ser muito útil para a identificação das

espécies do complexo B. cepacia, com a análise filogenética da variação da

seqüência do gene que permite a discriminação de todas as nove espécies atuais

dentro deste complexo (MAHENTHIRALINGAM et al., 2000).

2.7 O gênero Inga Mill. (Leguminosae-Mimosoideae)

Inga, popularmente conhecido como ingá ou ingazeiro, é um gênero

exclusivamente neotropical com cerca de 300 espécies (PENNINGTON, 1997),

todas de porte arbóreo. O gênero pertencente à subfamília Mimosoideae das

leguminosas é facilmente diagnosticável por apresentar folhas paripinadas (os

demais gêneros do grupo apresentam folhas bipinadas), raque foliar normalmente

alada, nectários foliares entre cada par de folíolos e sarcotesta envolvendo as

sementes (QUEIROZ, 2009). Segundo Mûniz-Meléndez (1978), as sementes de

ingazeiro são vivíparas, a radícula começa seu crescimento antes da abertura do

fruto, quando esse ainda está ligado à planta-mãe e, ao cair sobre o solo, o fruto se

decompõe e as sementes continuam seus processos germinativos. A viviparidade

pode estar relacionada com o elevado teor de água após a maturação das sementes

e/ou com a baixa concentração de substâncias inibidoras presentes no fruto e ou na

própria semente (CHIN et al., 1989).

Todas as espécies de ingá produzem frutos em vagens, que podem atingir

até mais de 1 m de comprimento, dependendo da espécie, mas no geral, a maioria

das espécies possuem frutos com até cerca de 10 – 30 cm de comprimento. A

árvore pode chegar a uma altura de 15 metros, e o ingá, fruto do ingazeiro, é muito

procurado pela fauna e pelo homem por suas sementes envolvidas pela sarcotesta

branca e adocicada (PENNINGTON, 1997). O ingazeiro floresce durante os meses

de agosto e novembro e a maturação dos frutos se dá de dezembro a fevereiro

(LORENZI, 2002).

Dentre as muitas espécies do gênero, uma que se destaca pela freqüência

com que é encontrada nas matas é Inga vera Willd, conhecida popularmente como

ingá (Figura 2). Ela é uma das árvores mais típicas do gênero, formadora de matas

ribeirinhas (matas ciliares e galerias) com ampla distribuição no Brasil, sendo de

http://pt.wikipedia.org/wiki/Nect%C3%A1rio

http://pt.wikipedia.org/wiki/Vagem

http://pt.wikipedia.org/wiki/Fruto

http://pt.wikipedia.org/wiki/Fauna

http://pt.wikipedia.org/wiki/Homem

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Sarcotesta&action=edit&redlink=1

15

pequeno porte (2,5 à 5 m), perenifólia, com grande abrangência também na América

Central, Colômbia, Argentina e Uruguai (QUEIROZ, 2009). No Brasil, pode ser

encontrada em quase todos os estados, sendo muito importante por ser indicada,

principalmente, para revegetação e recuperação de áreas degradadas (BARBEDO,

1997).

Figura 2 - Foto do hábito (A) e das inflorescências (B) de Inga vera Willd. (Extraído de

LORENZI, 2002).

As leguminosas arbóreas nativas representam um potencial inexplorado,

devido ao desconhecimento de suas características silviculturais, sua produtividade

e, denotadamente, sua habilidade em associar-se a bactérias fixadoras de

nitrogênio. O interesse na utilização de ingá para recuperação de áreas degradadas

e/ou recomposição de matas ciliares, é grande. Por isso é de extrema importância

estudos que visem à descoberta da ampla diversidade de micro simbiontes

envolvidos nos processos ecológicos dessa planta.

A B

16

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Coleta de nódulos e material botânico

Amostras de nódulos foram coletadas das raízes de 12 espécimens

(árvores) de Inga vera localizadas em um fragmento de Mata Atlântica primária na

Reserva Ecológica de Serra Bonita, uma RPPN (Reserva Particular do Patrimônio

Natural) localizada no município de Camacã, sul da Bahia (Figura 3). As árvores

estavam em uma trilha no interior da mata e foram previamente identificadas pelo

Prof. Dr. André Amorim (curador do Herbário do CEPEC - Centro de Pesquisas em

Cacau, Itabuna, Bahia) e pela Profa. Dra. Daniela Talora do Departamento de

Ciências Biológicas da UESC - Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia.

Ramos florais dessas plantas estão depositados no Herbário do CEPEC – CEPLAC

(Comissão para Implantação da Lavoura Cacaueira).

No total foram realizadas três coletas, que ocorreram nos períodos de 23 à

26 de julho de 2008, 24 à 27de outubro de 2008 e de 20 à 23 de julho de 2009, a fim

de obter uma coleção significativa dos nódulos e dos isolados bacterianos dessa

espécie de leguminosa arbórea.

Para coleta dos nódulos, a serapilheira foi removida cuidadosamente para

não danificar as raízes. Das raízes secundárias foi retirado o excesso de terra para

que os nódulos pudessem ser coletados. Como o local de coleta era distante do

Laboratório de Monitoramento Ambiental e, para que os nódulos continuassem

viáveis para o isolamento das bactérias, os mesmos foram lavados abundantemente

com água destilada para remoção do excesso de solo e impurezas, sendo as

amostras desinfestadas em etanol 95% por 30 segundos e solução de hipoclorito de

sódio 1% por 3 minutos, seguido de 8 lavagens em água destilada esterilizada. As

amostras de nódulos foram colocadas em tubos eppendorf e devidamente

identificadas com a data da coleta e o número correspondente da planta amostrada.

17

Figura 3 - Localização da Reserva Ecológica de Serra Bonita, onde foram realizadas coletas de leguminosas nodulíferas. (Reproduzido de: http://www.uiracu.org.br/serrabonita2.html)

3.2. Isolamento e cultivo dos rizóbios

Após a coleta das amostras de nódulos das leguminosas, os procedimentos

de isolamento e repique dos isolados bacterianos foram realizados no Laboratório de

Química e Fertilidade do Solo (LQFS) e no Laboratório de Monitoramento Ambiental

da UESC. Os nódulos foram retirados dos tubos Eppendorf e lavados com água

destilada esterelizada, sendo as amostras novamente desinfestadas como descrito

acima (item 3.1). Em seguida, os microrganismos foram isolados em placas de petri

contendo Meio 79 sólido indicado para cultivo de rizóbios (FRED; WAKSMAN, 1928)

e composto por (para 1 L de solução): 10g de glicose, 0,1 g de K2HPO4, 0,4 g de

KH2PO4/L, 0,2 g de MgSO4.7H2O (solução 10%), 0,1 g de NaCl (solução 10%), 0,4 g

de extrato de levedura em pó, 5 mL de solução alcoólica a 0,5% de azul de

bromotimol e 15g de ágar bacteriológico. O pH do meio foi ajustado com NaOH

(solução a 10%) para 6,8 - 7,0. O isolamento foi feito por meio de estrias compostas

para se obter colônias isoladas.

18

3.3. Caracterização morfológica das colônias

Após repique para o mesmo Meio 79 descrito no item 3.2, os isolados foram

caracterizados morfologicamente, seguindo: capacidade de alteração do pH do meio

(ácido, básico ou neutro), cor, quantidade de exopolissacarídeos produzidos (muco),

velocidade de crescimento, forma, borda e elevação da colônia, e depois agrupados

de acordo com a similaridade. Também foi realizado teste de Gram, haja vista que

todos os rizóbios são gram negativos.

Para se calcular os coeficientes de similaridade entre as colônias

bacterianas, foi construída uma matriz de presença e ausência para cada

característica morfológica observada. A análise de agrupamento utilizando o

algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages) e o

índice de Jaccard como coeficiente de similaridade foi realizada no programa PAST

(HAMMER et al., 2001). Esse método de agrupamento hierárquico permitiu que as

unidades fossem agrupadas por um processo que se repete em vários níveis, até se

estabelecer o dendrograma

Os isolados assim caracterizados foram armazenados em cultura pura em

tubos Eppendorf com rosca contendo meio 79 líquido e glicerina 25% (50/50 v/v)

postos em ultrafreezer Nuaire a - 80ºC.

3.4. Extração de DNA genômico

O DNA total dos rizóbios isolados a partir dos nódulos de Inga vera foi

extraído utilizando o protocolo descrito por Edwards (1991) com modificações.

Uma alçada de cada amostra isolada, foi selecionada e posta em tubo

Eppendorf contendo 1 mL de meio TY líquido (triptona 0,5%, extrato de levedura

0,3%, cloreto de cálcio 0,09% e água destilada estéril) por 24 horas, sob agitação

(180 rpm) a 28ºC visando um acréscimo na massa celular. Os tubos foram

centrifugados a 13.000 rpm para concentração das células e descarte do meio TY, e

foi acrescido 400 µL de tampão de extração (Tris HCl pH 7,5 200 mM, EDTA 250

mM, SDS 0,5%), homogeneizado em vórtex e deixado a temperatura ambiente por

cerca de 15 minutos. Em seguida, foi acrescentado 200 µL de acetato de potássio

3M homogeneizando-se a mistura. A mistura foi centrifugada por 5 min a 13.000 rpm

19

e o sobrenadante coletado e dispensado em um novo tubo, no qual foi adicionado

igual volume do sobrenadante em clorofórmio, alcool isoamílico (24:1 v:v). As

amostras foram homogeneizadas no vórtex e centrifugadas por 5 minutos a 13.000

rpm e o sobrenadante novamente coletado e transferido para novo tubo no qual foi

acrescido 0,75 do volume de isopropanol gelado e 0,25 volumes de acetato de

amônia à 10 M. As amostras foram deixadas a temperatura de -20 ºC por no mínimo

1 hora para precipitar o DNA e após centrifugadas por 15 minutos a 13.000 rpm

sendo o sobrenadante descartado. Os tubos foram lavados com etanol 70% por

duas vezes e secados a temperatura ambiente. Após todo o álcool ter evaporado, o

precipitado foi ressuspendido em 50 µL de água ultrapura (mili-Q) e estocado a -20

ºC. Para verificar a eficiência da extração, amostras do DNA foram aplicadas em gel

de agarose a 1% em 1x de tampão TAE (20 mM de Tris-Acetato, 10 mM de acetato

de sódio, 0,5 mM EDTA dissódico, pH 8,0). O rendimento e pureza do DNA extraído

foram avaliados através da estimativa em espectrofotômetro (Shimadzu, SPD-M6A)

pela razão da absorbância à 260 e 280 nm.

3.5. Amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

O DNA genômico dos isolados foi amplificado usando os oligonucleotídeos

iniciadores para reação em cadeia da polimerase (PCR) indicados na tabela 1.

Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação e seqüenciamento dos genes 16S rDNA, recA, nodC e nifH.

Gene Primers Sequências Tamanho do fragmento

Referência

16S 16S F 16S R

5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3

1400 pb WEISBURG et al., 1991

recA bur 3 bur 4

5- GA(AG) AAG CAG TTCGGC AA-3 5- GAG TCG ATG ACG ATC AT-3

380 pb PAYNE et al., 2005

nodC nodCF nodCI

5-AYGTHGTYGAYGACGGTTC-3 5-CGYGACAGCCANTCKCTATTG-3

930 pb LAGUERRE et al., 2001

nifH nifHF nifHI

5-TACGGNAARGGSGGNATCGGCAA-3 5-AGCATGTCYTCSAGYTCNTCCA-3

783 pb LAGUERRE et al., 2001

Procedeu-se então a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a

amplificação do 16S rDNA utilizando tampão 1x, MgCl2 30mM, 0,2 mM dNTP, 0,2

pmol de cada primer, 1U Taq e entre 1 e 2 ug / mL de DNA genômico, a depender

da concentração do DNA total extraído da amostra. O programa utilizado para

20

amplificação do 16S rDNA foi: 94 ºC por 4 min; 35 ciclos de 94 ºC por 30 s, 61 ºC

por 30 s e 72 ºC por 1 min e 30 s; finalizando com 10 minutos de extensão a 72 ºC.

Para a amplificação do gene recA utilizou-se as mesmas condições da reação

anterior, exceto pela concentração de MgCl2 reduzida para 20 mM.

Para os genes nodC e nifH também foi utilizado o mesmo programa descrito

anteriormente, modificando somente a temperatura de anelamento dos primers que

foi de 58 ºC para ambos os genes.

3.6. Seqüenciamento e análises de diversidade

Os produtos da amplificação foram diretamente encaminhados à Macrogen

Corp.– (Rockville, MD, EUA) para seqüenciamento. As seqüencias foram alinhadas

utilizando o programa Clustal_X 2.0 (LARKIN et al., 2007), importados para o BioEdit

4.8.4 (HALL, 1999) e manualmente corrigidos. Os contigs gerados, foram

submetidos à análise de similaridade no banco de dados GenBank através da

ferramenta Blastn para identificação das bactérias.

Para os fragmentos que foram quase completamente seqüenciados e devidamente

alinhados (1416 nucleotídeos do gene 16SrDNA e 385 nucleotídeos do recA),

efetuou-se uma análise de diversidade através do software Phylo_win (GALTIER et

al. 1996) para construção de árvores de neighbour-joining usando o parâmetro 2 de

Kimura (assume taxas diferentes entre transições (A-G, C-T) e transversões (A-C,

A-T, C-G, G-T)..para a correção da distância. O suporte dos ramos da árvore foi

estimado com bootstrap de 1000 repetições.

3.7. Avaliação da Influência de isolados de rizóbio selecionados sobre o crescimento inicial de plantas de Inga edulis

Duas linhagens, uma de alfarizóbio e outra de betarizóbio isoladas

previamente dos nódulos de Inga vera coletados na RPPN de Serra Bonita

(Camacã, Bahia) foram examinadas quanto a sua capacidade em nodular e fixar

nitrogênio em plantas de ingá de metro (Inga edulis Mart.). Sementes dessa espécie

foram utilizadas em virtude da não obtenção de sementes de Inga vera. Vale

salientar que as sementes do gênero Inga são recalcitrantes e apresentam o

comportamento de germinar ainda dentro do fruto, razão pela qual as sementes

21

desse gênero de leguminosa são de difícil obtenção e armazenamento. As sementes

de Inga edulis foram as que se encontravam disponíveis no momento da instalação

do experimento, iniciado em 01 de outubro de 2009. Elas foram coletadas de árvores

matrizes localizadas no município de Coaraci, região sul baiana, (sul 140 38’ 26,5’’/

oeste 390 32’ 50,4’’). As sementes foram trazidas para o LQFS, onde foram

selecionadas visualmente para garantir uniformidade, lavadas abundantemente em

água corrente e lavadas seis vezes com água destilada estéril, sendo logo em

seguida postas pra germinar em vasos plásticos fechados contendo papel de filtro

autoclavado e umedecido com água destilada esterilizada.

Foram instalados no total 5 tratamentos com 6 repetições cada, a saber: (i)

plantas não inoculadas e sem adubação nitrogenada (- N), (ii) plantas não

inoculadas e com adubação nitrogenada (+ N), (iii) plantas inoculadas com

Burkholderia sp. e sem adubação nitrogenada (Burk), (iv) plantas inoculadas com

Rhizobium sp. e sem adubação nitrogenada (Rhiz), (v) plantas inoculadas com uma

mistura de Burkholderia sp. e Rhizobium sp. sem adubação nitrogenada (Mix).

As plântulas com radículas emergidas (cerca de 4 dias após colocadas para

germinar) foram transplantadas para cada vaso (3 por vaso) e nos devidos

tratamentos, inoculadas com 1 mL (contendo aproximadamente 108 células) da

estirpe bacteriana apropriada. Após 14 dias de crescimento o experimento sofreu um

primeiro desbaste (para verificar se já haviam sido formados nódulos radiculares),

deixando apenas 2 plantas por vaso seguido por um desbaste final aos 30 dias,

restando apenas uma planta por vaso.

A higiene cuidadosa durante a preparação dos materiais bem como durante

o experimento foi observada a fim de prevenir a contaminação por outros rizóbios.

As plantas foram crescidas em vasos plásticos com capacidade para 3,0 dm3 os

quais foram lavados com solução de hipoclorito de sódio (1%) antes de serem

preenchidos por uma mistura (1:2 v:v) de areia lavada esterilizada e vermiculita

esterilizada. A mistura foi lavada cinco vezes com água destilada autoclavada

quente para remover qualquer presença eventual de nitrogênio no substrato. Este foi

regado periodicamente com solução nutritiva completa (Quadro 1) (HOAGLAND;

ARNON, 1950).

22

Quadro 1. Solução Nutritiva para crescimento das plantas.

COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA SOLUÇÃO NUTRITIVA

FONTE DE NUTRIENTE

Elemento Concentração (mg.L-1)

K 234,00 KH2PO4; K2SO4

S 208,00 CaSO4 ; MgSO4 ; K2SO4

Ca 80,00 CaSO4

Mg 48,00 MgSO4

P 14,00 KH2PO4

Zn 0,01 ZnSO4

B 0,11 H3B04

Cu 0,005 CuSO4

Mn 0,11 MnSO4

Mo 0,09 Na2MoO4

N (somente para o tratamento + N)

84,00 (NH4) NO3

Fe 0,25 FeEDTA

Fonte: Hoagland e Arnon (1950) modificado.

A superfície do solo foi coberta com pedriscos autoclavados, para evitar

contaminação do solo com microrganismos presentes no ar. Os vasos foram

arranjados em blocos completamente ao acaso em casa de vegetação sob

condições naturais de temperatura e luminosidade (Figura 4). As plantas foram

coletadas após 4 meses de crescimento e separadas em raiz e parte aérea sendo

esta levada a estufa de ventilação forçada (72h a 700C) para obtenção da matéria

seca. A nodulação das raízes foi avaliada conforme Chatel e Parker (1973). As

médias da massa seca, diâmetro do coleto e altura das plantas foram submetidas à

ANOVA, seguida do teste de Tukey (a 5% de significância) utilizando o programa

STATISTICA versão 6.0.

Figura 4 – Vista geral do experimento de inoculação de rizóbios em Inga edulis (plantas com cerca de 30 dias após emergência) que foi instalado na casa de vegetação da UESC, Ilhéus, Bahia.

23

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Caracterização morfológica dos nódulos e das colônias bacterianas

A morfologia dos nódulos amostrados nas três diferentes coletas realizadas

em 12 plantas de Inga vera localizadas na RPPN de Serra Bonita apresentou um

padrão que pode ser assim descrito: nódulos radiculares pediculados, localizados

em raízes laterais, alongados, com 0,1 mm a no máximo 10 mm de comprimento e

entre 5 a 10 mm de largura, raramente ramificados, com coloração externa que varia

do creme (nódulos jovens) ao marrom escuro (nódulos adultos), interior avermelhado

(devido possivelmente à leg-hemoglobina) apresentando crescimento indeterminado

devido a presença de um meristema persistente no ápice do nódulo (Figura 5). As

características morfológicas e anatômicas desses nódulos permitem classificá-los

como caesalpinióide (SPRENT, 2001) ou indeterminado (SPRENT, 2007), o qual é

característico da subfamília Mimosoideae.

Figura 5 – Amostras de nódulos radiculares de Inga vera coletados na Reserva Ecológica de Serra Bonita, Camacã – Bahia.

24

Conforme caracterização morfológica das colônias crescidas em meio de

cultura (Figura 6) foram avaliados um total de 85 isolados bacterianos. A maioria das

colônias bacterianas isoladas (61 %) apresentou coloração amarela, brilhante, com

bordas inteiras, produção de mucopolissacarídeos e tiveram crescimento

relativamente rápido (3 – 7 dias). Uma menor parte (23 %) das colônias possuía cor

branca, crescimento lento (8 – 12 dias), forma circular com bordas lisas e com a

capacidade de alcalinizar o meio, produzindo pouco ou nenhum muco.

Figura 6 - Placas contendo meio de cultura 79 exemplificando o crescimento dos rizóbios isolados. Influência das bactérias no pH do meio. Em A o meio acidificado (coloração amarelada) e em B alcalinizado (coloração azulada). Em C detalhe das colônias de rizóbios e em D crescimento de rizóbios em placa onde não houve modificação aparente no pH do meio (Barras das figuras A, B e D = 2 cm e em C = 1 cm).

25

Na segunda coleta, de 24 a 27 de outubro de 2008, houve a predominância

de bactérias de crescimento rápido, enquanto que na terceira coleta, ocorrida de 20

a 23 de julho de 2009, a maioria das bactérias isoladas dos nódulos apresentou

crescimento lento. As colônias restantes (cerca de 16 %) apresentaram elevado grau

de heterogeneidade, quanto à forma, com bordas lisas ou onduladas, de cor

esbranquiçada ou amarelo esbranquiçado, com pouca produção de muco ou

aparência leitosa, com capacidade de acidificação ou alcalinização do meio e

crescimento variando em média de 8 a 12 dias.

Segundo Moreira e Siqueira (2006), os gêneros de rizóbio descritos até o

momento podem ser diferenciados com base em características culturais e

morfológicas em meio 79 (FRED; WAKSMAN, 1928). Norris (1965) postulou que em

áreas tropicais havia predominância de estirpes de crescimento lento alcalinizantes

(atualmente classificadas no gênero Bradyrhizobium) e em áreas temperadas com

predominância de estirpes com crescimento rápido e acidificantes (atualmente

Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium e Allorhizobium). Essas características

são relacionadas ao crescimento em meio com manitol, mas podem ser

generalizadas para outras fontes de carbono, ou seja, estirpes que acidificam meio

com manitol, também acidificam com outras fontes de carbono.

Tais estirpes, “rápidas acidificantes” e “lentas alcalinizantes” podem ocorrer

tanto em regiões tropicais como temperadas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Foi

verificado no presente estudo sobre diversidade de bactérias isoladas dos nódulos

de I. vera, ambos os tipos destas colônias bacterianas.

4.2. Análises de agrupamento dos caracteres morfológicos das colônias

De acordo com as análises de agrupamento dos caracteres morfológicos

dos isolados previamente identificados com gram-negativos, utilizando o algoritmo

UPGMA e o índice de Jaccard como coeficiente de similaridade, pode-se observar a

formação de 13 grupos distintos e com 100% de similaridade (Figura 7). Neste

dendograma pode- se observar uma tendência de similaridade nas características

morfológicas dos isolados provindos dos nódulos de uma mesma planta, por

exemplo, os isolados 392 G, 392 H, 392 J, 392 M, 392 N, fazendo parte de um único

grupo 100% similares.

26

A B

0 8 16 24 32 40 48 56 64 72

0,32

0,4

0,48

0,56

0,64

0,72

0,8

0,88

0,96

Sim

ilarity

33G

272A

272B

33H

273C

273D

287E

395D

395A

66A

66C

395I

392B

395C

66D

66E

272H

26I

272J

33J

33E

33F

392I

392L

26L

26O

273M

287F

287I

318A

318C

318D

395H

273F

195L

26N

33L

287G

392G

392H

392J

392M

392N

66B

26F

26H

195B

195E

318B

388L

388M

26Q

273J

273N

395E

273I

287H

96D

26G

96I

273L

26M

26A

56D

26D

388G

26J

273E

273G

273H

66F

66H

Figura 7 - Análise de agrupamento a partir da caracterização fenotípica de rizóbios isolados de nódulos de Inga vera, com o algoritmo UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetical averages), utilizando o índice de Jaccard como coeficiente de similaridade.

Formação de 2 grandes grupos com similaridade de 32 % (A, B).

Uma provável explicação para esses agrupamentos provindos de uma mesma

planta pode ser devido às populações bacterianas semelhantes presentes naquele

local (solo) em que a planta se estabeleceu.

Também foram isoladas a partir dos nódulos de I. vera, algumas bactérias

Gram positivas, e os caracteres morfológicos dessas colônias também foram

anotados e utilizados para construir um dendograma a partir da análise de

agrupamento (Figura 8.)

27

0 1,6 3,2 4,8 6,4 8 9,6 11,2 12,8 14,4

0,24

0,32

0,4

0,48

0,56

0,64

0,72

0,8

0,88

0,96

Sim

ilarity

388N

388O

388P

287A

287B

287C

287D

287H

388C

26B

33A

33D

26C

33B

Figura 8 - Dendograma obtido pela análise de agrupamento a partir da caracterização fenotípica de isolados bacterianos Gram positivos associados aos nódulos de Inga vera da RPPN de Serra Bonita (Camacan, BA) com o algoritmo UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetical averages), utilizando o índice de Jaccard como coeficiente de

similaridade.

Muresu et al. (2008) observaram que o interior dos nódulos das

leguminosas podem ser colonizados tanto por diversos gêneros bacterianos

relacionados à fixação biológica de nitrogênio simbiótica, quanto por diversas

espécies de bactérias endofíticas, incluindo bactérias Gram positivas, que co-

habitam essas estruturas. Já há algumas décadas, autores como Philipson e Blair

(1957) encontraram diversas espécies bacterianas, incluindo bactérias Gram-

positivas, nas raízes e nódulos de plantas saudáveis do trevo vermelho. Sturz et al.

(1997) mostrou que a quantificação de rizóbios de nódulos do trevo vermelho,

poderia chegar a 4,3 × 109 UFC g-1 de peso fresco do nódulo, mas que, ao mesmo

tempo, 3,0 × 105 UFC g-1 de endófíticos não rizobianos, pertencentes a 12 diferentes

espécies, poderiam ser cultivados a partir dos mesmos nódulos.

28

Em nódulos de feijão, Mhamdi et al. (2005) encontraram, junto com

Rhizobium, bactérias de gênero Agrobacterium, e Mrabet et al. (2006) provaram que

estes endófitos poderiam invadir novos nódulos em conseqüência da co-inoculação

com rizóbios e afetar o desempenho na nodulação. Não se sabe ao certo a função

destas bactérias endofíticas dentro dos nódulos, todavia, Bai et al. (2003) relataram

que Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis pode naturalmente coabitar nódulos de

soja com Bradyrhizobium japonicum, e que estas bactérias gram-positivas podem

aumentar a produtividade das plantas em experimentos de co-inoculação.

Em vista destas evidências de prováveis funções das bactérias Gram

positivas que coabitam nódulos de leguminosas, todos os isolados de I. vera do

presente estudo, após identificados morfologicamente, foram submetidos à

criopreservação para armazenagem no Banco de Rizóbios da UESC. Futuros

trabalhos quanto à eficiência em fixar nitrogênio atmosférico bem como quanto à

capacidade de promover crescimento em plantas poderão ser realizados com o uso

do material que compõe este banco.

4.3. Extração do DNA genômico e amplificação dos genes dos isolados bacterianos

Foram realizadas extrações de DNA de todos os isolados previamente

caracterizados como Gram-negativos e cujas colônias abrangiam diferentes

morfotipos, com a finalidade de identificá-los molecularmente através do

seqüenciamento dos genes 16S rDNA, recA, nodC e nifH.

Dos 85 isolados analisados, 60 deles que se apresentaram como Gram

negativos, tiveram o DNA genômico extraído com sucesso de acordo com o

protocolo de Edwards (1991) modificado (Figura 9).

29

Figura 9 - Fotografia de gel de agarose a 1% do DNA genômico (seta) extraído de isolados bacterianos dos nódulos de Inga vera. 1. 26S; 2. 26T; 3. 273J; 4. 287C; 5. 287F; 6. 287G;

7. 287H; 8. 287I; 9. 318A; 10. 318B.

O DNA extraído foi amplificado, e o resultado mostrou a presença de

seqüências do 16S rDNA com aproximadamente 1400 pb (Figura 10), sendo que a

molécula completa contém cerca de 1540 pb de nucleotídeos. Já as seqüências do

gene recA, devido ao par de oligonucleotídeos iniciadores utilizado, apresentou o

tamanho de cerca de com 380 pb (Figura 11). Os fragmentos de 930 pb do nodC (

Figura 12) e de 783 pb do gene nifH (Figura 13) também foram amplificados, ou

seja, as bandas obtidas foram todas de tamanho esperado.

Embora a análise da seqüência do gene 16S rDNA possa identificar muitos

gêneros bacterianos, a sua utilidade no gênero Burkholderia é mais limitada,

especialmente dentro do complexo B. cepacia, onde não pode ser usado como um

meio de distinguir com precisão todas as espécies (LIPUMA et al., 1999;

MAHENTHIRALINGAM et al., 2000). Para isso, o gene recA tem sido amplamente

aplicado na sistemática bacteriana (KARLIN; WEINSTOCK; BRENDEL, 1995)

provando ser muito útil para a identificação das espécies do complexo B. cepacia,

com a análise da variação da seqüência do gene que permite a discriminação de

todas as nove espécies atuais dentro deste complexo (MAHENTHIRALINGAM et al.,

2000). Todavia esta abordagem ainda não pode ser aplicada a espécies que

estejam fora do complexo B. cepacia (PAYNE, 2005), sugerindo que a ausência de

amplificação para o gene recA em algumas amostras analisadas neste trabalho

possa ter relação com esta afirmativa, como foi observado nos resultados do gel de

30

agarose (Figura 11) contendo amostras que amplificaram para este gene (272 J;

287E; 272A; 272B; 273C; 273D), todas pertencentes ao complexo B. cepacia, e

amostras que não amplificaram (395A, 33G; 388L; 395D) pertencentes a outros

grupos de Burkholderia que foram identificados após seqüenciamento (Tabela 2).

Figura 10 - Gel de agarose a 1% com amostras amplificadas do 16S rDNA de isolados bacterianos dos nódulos de Inga vera. M: marcador molecular de 1 KB; 1. 26H; 2. 26O 3. 287G; 4. 287i; 5. 392G; 6. 392N; 7. 392J; 8. 392M; 9. 395H; 10. 195E;11. 195L; 12. 392B; 13. 318A ; 14. 318B ; C-. Controle negativo.

Figura 11 - Gel de agarose a 1% com amostras amplificadas do gene recA de isolados bacterianos dos nódulos de Inga vera. M: marcador molecular de 1 KB; 1. 395A; 2. 272 J;

3. 287E; 4. 33G; 5. 388L; 6. 395D; 7. 272A; 8. 272B; 9. 273C; 10. 273D; C-. Controle negativo.

~380 pb

~1400 pb

31

Fragmentos do gene nodC, foram amplificados para maioria dos isolados

analisados. Somente três dos 14 isolados avaliados com este gene, não

amplificaram, sendo eles o: 26A, 318C e 26G (Figura 12). Com relação ao gene nifH,

pode-se observar que de oito amostras analisadas somente o isolado 26A não

amplificou (Figura 13). Segundo Vieira (2007), os genes de nodulação e fixação de

nitrogênio em algumas espécies de rizóbio, tal como os do gênero Rhizobium se

localizam no plasmídeo, e a perda desse plasmídeo por algumas estirpes, em

decorrência por exemplo da exposição a altas temperaturas, faz com que a bactéria

perca esses genes e conseqüentemente sua habilidade para formar nódulos e fixar

nitrogênio, por isso mesmo não sendo amplificado em alguns isolados bacterianos,

como observado através destes resultados.

Figura 12 - Gel de agarose a 1% com amostras amplificadas do gene nodC de isolados bacterianos dos nódulos de Inga vera. M: marcador molecular de 1 KB; 1. 26A; 2. 195L; 3. 318C; 4. 195E; 5. 392G; 6. 26O; 7. 297G; 8. 26N; 9. 26H; 10. 392H;11. 392N; 12. 395C; 13. 26G; 14. 395H; C-. Controle negativo.

Figura 13 - Gel de agarose a 1% com amostras amplificadas do gene nifH de isolados bacterianos dos nódulos de Inga vera. M: marcador molecular de 1 KB; 1. 395H; 2. 272H;

3. 392B; 4. 26A; 5. 392J; 6. 26J; 7. 392M; 8. 318B.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C-

~930 pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8

~783 pb

32

O DNA amplificado da subunidade menor do RNA ribossômico e do

fragmento do gene da recombinase seqüenciados foram então submetidos à

comparação com o banco de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),

através da ferramenta Blastn (NCBI) a qual permitiu serem identificados os gêneros

bacterianos. A grande maioria os isolados submetidos apresentaram elevado grau

de similaridade (acima de 97 %) com as seqüências desses genes bacterianos

depositadas no GenBank (Tabela 1). Dos 60 isolados seqüenciados, 35% foram

identificados como pertencentes a dois gêneros classicamente reconhecidos como

sendo nodulíferos e fixadores de nitrogênio, pertencente à Classe Alfa das

Proteobacterias: Rhizobium (Família Rhizobiaceae) e Bradyrhizobium (Família

Bradyrhizobiaceae). Também desses 60 isolados, 28% foram identificados

molecularmente como pertencentes à Classe Beta das Proteobacterias, mais

especificamente do gênero Burkholderia (Família Burkholderiaceae), que fora

previamente incluído no gênero Pseudomonas, mas que recentemente, além de

terem sido separados de Pseudomonas, foram descobertos como sendo simbiontes

de leguminosas (VIEIRA, 2007). Também foram identificados outros três gêneros

pertencentes a classe das Gamma Proteobactérias: Pectobacterium (5%) e Pantoea

(2%) ambos pertencentes a Família Enterobacteriaceae e Pseudomonas (2%)

(Família Pseudomonadaceae) associados ao nódulos de I. vera.

Os demais gêneros isolados a partir dos nódulos de I. vera ( cerca de 28%)

foram identificados como Paenebacillus e Bacillus (Classe Bacilli), bactérias Gram

positivas comumente encontradas em associação com tecidos vegetais e envolvidas

nos processos de crescimento vegetal (BAI et al., 2003).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

http://en.wikipedia.org/wiki/Bradyrhizobiaceae

33

Tabela 2. Isolados bacterianos obtidos dos nódulos de Inga vera coletados na RPPN de Serra Bonita. São apresentados o nº de acesso no

GenBank, o equivalente (seqüência de nucleotídeos do 16S rDNA) e a espécie mais próxima de cada isolado.

Isolado Nº de acesso

(GenBank) Equivalente mais próximo no Blast

(16S rDNA) Similari-

dade Nº de acesso (Gen Bank)

Espécie mais próxima no Blast (16S rDNA)

Similari-dade

26 A FJ527672.1 Rhizobium tropici strain rif200896 96% FJ527672.1 Rhizobium tropici strain rif200896 96%

26 B EU931557.1 Brevibacillus brevis strain ZFJ-2 99% EU931557.1 Brevibacillus brevis strain ZFJ-2 99%

26 C GQ149481.1 Bacillus cereus strain DS 99% GQ149481.1 Bacillus cereus strain DS 99%

26 G EU364701.1 Bradyrhizobium sp. SA3 strain FP1c 96% EU364712.1 Bradyrhizobium yuanmingense strain R8 99%

26 H EF569648.1 Bradyrhizobium sp. Dr12.2 99% AB300992.1 Bradyrhizobium iriomotense 99%

26 J GU120632.1 Rhizobium miluonense strain CC-BL6 99% GU120632.1 Rhizobium miluonense strain CC-BL6 99%

26 M FJ390934.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6434 99% FJ025098.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6439 99%

26 N FJ390934.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6434 99% FJ025098.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6439 99%

26 0 EF569648.1 Bradyrhizobium sp. Dr12.2 94% AB300992.1 Bradyrhizobium iriomotense 99%

26 S DQ068814.1 Uncultured bacterium clone f6h4 99% AB353048.1 Klebsiella oxytoca 99%

26 T GQ249225.1 Microbacteriaceae bacterium lxb-15 96% GQ249225.1 Microbacteriaceae bacterium lxb-15 96%

33 A EU741095.1 Bacillus sp. 13644B 99% AB271739.1 Bacillus pycnus 98%

33 B FJ535619.1 Bacillus sp. DCR_ME06-32 99% AM747230.1 Bacillus weihenstephanensis strain WSBC 10204 100%

33 D AM910287.1 Paenibacillus sp. R-31009 96% EF694702.1 Paenibacillus terrae isolate EH23-5 98%

33 E EU723241.1 Burkholderia tropica strain TAt-0750 97% EU723241.1 Burkholderia tropica strain TAt-0750 97%

33 F AY128104.1 Burkholderia tropica strain MTo-672 97% AY128104.1 Burkholderia tropica strain MTo-672 97%

33 G NR_027569.1 Burkholderia unamae strain MTl-641 98% NR_027569.1 Burkholderia unamae strain MTl-641 98%

33 H EU998634.1 Burkholderia sp. TS2 95% EU214612.1 Burkholderia cepacia strain yb90 99%

33 J FJ436053.1 Burkholderia tropica strain SCu-6583 98% FJ436053.1 Burkholderia tropica strain SCu-6583 99%

195 B FM173819.1 Pseudomonas sp. CL4.14 96% AM745263.1 Paenibacillus caespitis strain LMG 23879T 99%

195 E DQ354607.1 Bradyrhizobium sp. Lpsp.1b 99% DQ786800.1 Bradyrhizobium japonicum strain WmE3 99%

195 L AJ810377.1 Bradyrhizobium genosp. isolate Cs6040 99% AJ810377.1 Bradyrhizobium genosp. , isolate Cs6040 99%

272 A AB366331.1 Burkholderia sp. SBH-9 99% AM992536.1 Burkholderia cepacia 99%

272 B AB366331.1 Burkholderia sp. SBH-9 99% AM992536.1 Burkholderia cepacia 99%

272 D EF622219.1 Burkholderia tropica strain CICC 10348 96% EF622219.1 Burkholderia tropica strain CICC 10348 96%

272 G FJ769143.1 Burkholderia vietnamiensis strain M6 90% FJ769143.1 Burkholderia vietnamiensis strain M6 90%

Continua...

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=219819702&dopt=GenBank&RID=YYND2GSC01R&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=197311559&dopt=GenBank&RID=YYNSYFWZ01R&log$=nucltop&blast_rank=1

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34


(GenBank) Equivalente mais próximo no Blast

(16S rDNA) Similari-

dade

Nº de acesso (Gen Bank)


Similari-dade

272 H EU399930.1 Rhizobium sp. CAF416 94% FJ405381.1 Rhizobium tropici strain CAF440 99%

272 I FN395278.1 Paenibacillus polymyxa strain FR-W3b1 98% FN395278.1 Paenibacillus polymyxa strain FR-W3b1 98%

272J AJ440714.1 Burkholderia pyrrocinia strain R13058 99% AJ440714.1 Burkholderia pyrrocinia strain R13058 99%

273 A EF634024.1 Paenibacillus polymyxa strain ISSDS-851 99% EF634024.1 Paenibacillus polymyxa strain ISSDS-851 99%

273 C AB366331.1 Burkholderia sp. SBH-9 99% AM992536.1 Burkholderia cepacia 99%

273 D CP000442.1 Burkholderia ambifaria 99% CP000442.1 Burkholderia ambifaria 99%

273 E FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99% FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99%

273 G FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99% FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99%

273 H FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99% FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99%

273 J DQ817187.1 Uncultured bacterium clone aaa69b07 100% GQ983053.1 Citrobacter freundii strain JXMR0908L1 99%

273 L GQ395336.1 Pantoea sp. 96% AY691543.1 Pantoea agglomerans strain ChDC YP1 16S 99%

287 C EU362611.1 Paenibacillus polymyxa isolate TN99 99% EU362611.1 Paenibacillus polymyxa isolate TN99 99%

287 E AB366331.1 Burkholderia sp. SBH-9 99% AM992536.1 Burkholderia cepacia 99%

287 F FJ981664.1 Uncultured bacterium clone OM2 100% FJ768459.1 Staphylococcus epidermidis strain MB 100%

287 G FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 99% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%

287 H FJ025138.1 Burkholderia sp. SEMIA 6413 99% CP001043.1 Burkholderia phymatum 98%

287 I FJ025099.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6396

96% FJ025099.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6396 96%

318 A GU118343.1 Uncultured bacterium clone Gven_I03 80% FJ025099.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6396 99%

318 B FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 99% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%

318 C EF221616.1 Bradyrhizobium sp. JR001 87% AB195988.1 Bradyrhizobium japonicum strain: MA896 99%

388C AB461817.1 Paenibacillus sp. M532 98% EF690415.1 Paenibacillus amylolyticus isolate M18-5 99%

388 G GQ288412.1 Paenibacillus sp. 74% AB073198.1 Paenibacillus popilliae 99%

388 L AF164045.2 Burkholderia tropicalis strain AB98 99% AF164045.2 Burkholderia tropicalis strain AB98 99%

388 M AF164045.2 Burkholderia tropicalis strain AB98 99% AF164045.2 Burkholderia tropicalis strain AB98 99%

392 B AB531411.1 Rhizobium sp. III-19 99% FJ025132.1 Agrobacterium rhizogenes strain SEMIA 6423 99%

392 G FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 100% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%

392 H AB480386.1 Bradyrhizobium sp. D218a 96% AF208515.1 Bradyrhizobium japonicum strain USDA 4 99%

392 I AB245384.1 Paenibacillus panacisoli strain Gsoil 1411 96% AB245384.1 Paenibacillus panacisoli strain: Gsoil 1411 96%

Continua...

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=227439917&dopt=GenBank&RID=RK8PF9K201S&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=205318832&dopt=GenBank&RID=RK8PF9K201S&log$=nucltop&blast_rank=4

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=255519238&dopt=GenBank&RID=JDHM2BG6013&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=11494005&dopt=GenBank&RID=NF86NNMR01N&log$=nucltop&blast_rank=7

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=84453059&dopt=GenBank&RID=JDKUZJEN013&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=84453059&dopt=GenBank&RID=JDKUZJEN013&log$=nucltop&blast_rank=1

35


(GenBank) Equivalente mais próximo no Blast (16S rDNA)

Similari-dade

Nº de acesso (Gen Bank)


Similari-dade

392 J FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 99%* FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%

392 L AB245384.1 Paenibacillus panacisoli 96% AB245384.1 Paenibacillus panacisoli strain: Gsoil 1411 96%

392 M FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 100% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%

392 N FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154

72% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 72%

395 A AM284971.1 Burkholderia nodosa strain R-25485T 99% AM284971.1 Burkholderia nodosa strain R-25485T 99%

395 C GU120632.1 Rhizobium miluonense strain. CC-BL6 94% GU120632.1 Rhizobium miluonense strain. CC-BL6 94%

395 D DQ986324.1 Burkholderia sp. SJ98 98% AY277699.1 Candidatus Burkholderia verschuerenii 98%

395 H FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 99% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%

* Tamanho do fragmento do 16S rDNA sequenciado de aproximadamente 1400 pb.

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=84453059&dopt=GenBank&RID=JJN9PY8C015&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=227439917&dopt=GenBank&RID=JJNJRE0B015&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=205318832&dopt=GenBank&RID=NF8EWUZN01N&log$=nucltop&blast_rank=3

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=205318832&dopt=GenBank&RID=JJNTGW2H015&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=109942350&dopt=GenBank&RID=47HYNPH6013&log$=nucltop&blast_rank=7

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=109942350&dopt=GenBank&RID=47HYNPH6013&log$=nucltop&blast_rank=7

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=226432460&dopt=GenBank&RID=YYT0S9H7014&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=226432460&dopt=GenBank&RID=YYT0S9H7014&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=116048354&dopt=GenBank&RID=RDFKNGDN01N&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=33622538&dopt=GenBank&RID=RKCDWUGN014&log$=nucltop&blast_rank=5

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=227439917&dopt=GenBank&RID=JJP9DNW7015&log$=nucltop&blast_rank=1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=205318832&dopt=GenBank&RID=NF8JDN8J016&log$=nucltop&blast_rank=3

36

4.4. Análises da diversidade genética

A diversidade taxonômica genética dos isolados seqüenciados de I. vera foi

avaliada tomando como base os genes 16S rDNA e recA. Para a construção do

dendograma de diversidade, os isolados foram separados e os contigs alinhados de

acordo com a classe ao qual pertenciam (alfa e betaproteobactérias). Além disso,

foram adicionados como linhagens de referência cinco espécies de bactérias para os

alfarizóbios (Rmiluo - Rhizobium miluonense, Azorhizob - Azorhizobium sp.,

Methylobac - Methylobacterium sp., Bradjap - Bradyrhizobium japonicum e Brad -

Bradyrhizobium sp.) e 2 espécies para os betarizóbios (Cupr - Cupriavidus

taiwanensis e Burk - Burkholderia nodosa) para os dendogramas gerados a partir

das seqüências do 16S rDNA. Três espécies referências do gênero Burkholderia

(Burknodosa - Burkholderia nodosa, Burktropica - Burkholderia tropica e Burkcepacia

- Burkholderia cepacia) foram adicionadas as análises de diversidade feitas a partir

das seqüências parciais do gene recA.

No dendograma correspondente às alfaproteobactérias (Figura 14) foi

observada a formação de 2 clusters distintos e com boa sustentação, um com as

espécies do gênero Rhizobium e o outro com as de Bradyrhizobium. O primeiro

cluster foi formado por 2 isolados, o 26J (99% de similaridade com Rhizobium

miluonense CCBL6), corroborado pela proximidade com a linhagem de referência e

com um suporte de 95%, e pelo isolado 392B (Rhizobium sp. III-19), que de acordo

com a seqüência de nucleotídeos do 16S rDNA, esta mais próxima do grupo das

alfaproteobactérias pertencentes ao gênero Agrobacterium, mais precisamente à

espécie Agrobacterium rhizogenes, com 99% similaridade com a mesma (Tabela 2).

O segundo cluster, foi formado por 11 bactérias do gênero Bradyrhizobium,

formando 2 subgrupos distintos (Figura 14). Foi observado que grande parte dos

isolados deste gênero (54%) formaram um grupo maior com os isolados 395H,

318B, 287G, 392J, 392G e 392M apresentando um bootstrap de 100%, confirmando

o seqüenciamento do 16S rDNA (Tabela 2), no qual todos estes isolados são 99%

semelhantes e pertencentes à mesma linhagem de Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374,

o qual foi isolado dos nódulos de Arachis pintoi (MENNA et al., 2009). Pode-se

observar também que os isolados que estavam bastante próximos dentro desses

37

subgrupos geralmente foram obtidos dos nódulos coletados de uma mesma planta

como, por exemplo, os isolados 26M e 26N ambos 99% semelhantes a

Bradyrhizobium sp. SEMIA 6434, isolado de Inga sp. (MENNA et al., 2009), e os

isolados195E e 195L mais próximos da linhagem de referência Bradyrhizobium

japonicum.

392G

392M

395H

318B43

43

287G

392J

Brad

90

43

67

Bradjap

195E

195L

76

99

92

26H

95

26N

50

26M

54

Methylobac

100

Azorhizob

392B

26J

Rmiluo95

100

88

NJ 1392 sites K2P 1000 repl.0.01

Figura 14 – Dendograma gerado pelo método de neighbour-Joining usando as seqüências do 16S rRNA de alfaproteobactérias isoladas dos nódulos de I. vera. Valores de bootstrap

(1000 repetições) são indicados acima e abaixo dos ramos.Seqüências com 0,01% de dissimilaridade. Os isolados de I. vera são indicados pelos números seguidos de letras. Já as estirpes tipos são: Rmiluo = Rhizobium miluonense; Azorhizob = Azorhizobium sp; Methylobac = Methylobacterium sp.; Bradjap = Bradyrhizobium japonicum; Brad = Bradyrhizobium sp.

38

No dendograma correspondente às betaproteobactérias (Figura 15), pode-

se observar o agrupamento de isolados que pertencem a espécies estreitamente

relacionadas formadoras do complexo Burkholderia cepacia (COENYE;

VANDAMME, 2003) representadas pelos isolados 273D (Burkholderia ambifaria) e

272A, 272B, 273C e 287E, todas altamente similares à espécie Burkholderia cepacia

(como foi observado na Tabela2). Todavia, o isolado 395D (similaridade de 98% com

Burkholderia sp. SJ98) possivelmente representa uma nova espécie do gênero

Burkholderia, haja vista que sua seqüência ficou distante de todas as outras

linhagens do grupo como pode ser observado no dendograma de diversidade do

gene 16S rDNA (Figura 15) e corroborada no dendograma do gene recA (Figura 16).

Além disso, sua similaridade de seqüência para o gene recA é baixa comparada com

as demais espécies depositadas no banco de dados. Uma caracterização adicional,

incluindo a hibridização DNA-DNA e taxonomia numérica, certamente seria

necessária para esclarecer a sua correta identificação, representando um isolado

com grande potencialidade para estudos futuros visando à descoberta da espécie.

Outros agrupamentos incluiram Burkholderia tropicalis com os isolados

388M e 388L, os quais foram obtidos de nódulos coletados da mesma planta na

RPPN de Serra Bonita. O isolado 395A apresentou estreita relação com

Burkholderia nodosa (Burk) uma linhagem de referência para essa espécie, a qual é

comprovadamente nodulífera de diversas espécies de leguminosas arbóreas

brasileiras (CHEN et al, 2007).

Recentes trabalhos vêm demonstrando que diversas espécies de

Burkholderia possuem a capacidade de nodular e fixar nitrogênio em associação

com leguminosas, particularmente com as da subfamília Mimosoideae (CHEN et al.,

2003a, 2005a, b; BARRETT; PARKER, 2005, 2006; ELLIOTT et al., 2007). A maioria

desses estudos foi realizado com beta-rizóbios que nodulam leguminosas do gênero

Mimosa, dentre eles: Cupriavidus taiwanensis (inicialmente descrita como Ralstonia

taiwanensis; VANDAMME; COENYE, 2004) e Burkholderia spp. C. taiwanensis foi

isolada de nódulos de Mimosa pudica, M. diplotricha e M. pigra (sin. M. pellita), em

Taiwan (CHEN et al., 2001, 2003a, 2005a), e de nódulos de M. pudica no norte e no

sul da Índia (VERMA et al., 2004). Algumas estirpes de C. taiwanensis e uma

Cupriavidus sp. não identificada, foram isoladas de M. pudica e M. pigra no Panamá

(BARRETT; PARKER, 2006). Recentemente, foi reportado também espécies de

39

Mimosa sendo noduladas por Burkholderia phymatum (ELLIOTT et al., 2007).

Apenas quatro dos isolados de Mimosa descritos, C. taiwanensis LMG19424 (CHEN

et al., 2003b), Burkholderia sp. Br3461 e Map3-5 (CHEN ET AL., 2005a) e

Burkholderia mimosarum PAS44 (CHEN et al., 2005b, 2006), foram confirmadas

através da microscopia, utilizando imunomarcação, como sendo simbiontes de suas

espécies de hospedeiro original (ELLIOTT et al., 2007). Vale ressaltar, entretanto

que um trabalho recentemente realizado com diversas espécies de Mimosa nativas

do Brasil demonstrou que esse gênero de leguminosas é preferencialmente

nodulado por diversas espécies de Burkholderia (BONTEMPS, 2010).

287E

272B

273C100

272A

100

273D

100

287H

395A

Burk

388L

388M

100

100

88

100

80

395D

89

Cupr

NJ 1411 sites K2P 1000 repl.0.005

Figura 15 – Dendograma gerado pelo método de Neighbour-Joining usando as seqüências parciais do gene 16S rRNA de betaproteobactérias. Valores de Bootstrap (1000 repetições) são indicados acima e abaixo dos ramos. Seqüências com 0,005% de dissimilaridade. Os isolados de I. vera são indicados pelos números seguidos de letras. Já as estirpes tipos são: Cupr = Cupriavidus taiwanensis; Burk = Burkholderia nodosa.

40

A estrutura topológica do dendograma baseado no seqüenciamento do gene

recA (Figura 16) foi bastante congruente com o do gene 16S rDNA, formando 3

subgrupos bem sustentados com valores de bootstrap superiores à 90%. As

seqüências parciais dos genes para recA dos isolados 395A e 33E se alinharam e

aproximaram muito da estirpe Burkholderia nodosa já identificada e isolada dos

nódulos de Mimosa scabrella (CHEN et al. 2005). O isolado 33J apresentou grande

homologia da seqüência do gene recA com a linhagem referência Burkholderia

tropica. Os isolados 272J, 273C, 272A, 33G e 33H compuseram um grupo com

seqüências relativamente similares as do complexo cepacia, como foi também

observado na análise do seqüenciamento do gene 16S rDNA (Tabela 2). É

importante notar a separação no dendograma para o gene recA do isolado 395D

(Burkholderia sp.) das demais linhagens, o que reforça a hipótese de que esse

isolado venha a ser provável candidato a uma nova espécie, como corroborado

pelos resultados no dendograma das seqüências do 16SrDNA acima mostrada

(Figura 15).

33H

33G

272A

53

273C

82

Burkcepaci

52

272J

70

395D

33J

Burktropic100

Burknodosa

395A

33E92

39

100

100

NJ 376 sites K2P 1000 repl.0.01

Figura 16 – Dendograma gerado pelo método de Neighbour-Joining usando as seqüências do recA de betaproteobactérias. Valores de Bootstrap (1000 repetições) são indicados acima e abaixo dos ramos. Seqüências com 0,01% de dissimilaridade Os isolados de I. vera

são indicados pelos números seguidos de letras. Já as estirpes tipos são: Burknodosa - Burkholderia nodosa, Burktropica - Burkholderia tropica e Burkcepacia - Burkholderia cepacia.

41

O estudo da diversidade de bactérias nos nódulos de I. vera, revelado no

presente trabalho, mostrou que grande parte dos nódulos eram colonizados por alfa

e betaproteobactérias. Deste modo, cada um desses dois grupos aqui definidos, é

possível que represente um complexo de espécies estreitamente relacionadas e com

características ecológicas muito semelhantes. Interessantemente, esse é o primeiro

relato de betarizóbios associados aos nódulos de uma espécie de leguminosa

arbórea da Tribo Ingeae. Entretanto, pelo número de isolados de Bradyrhizobium

identificados em I. vera esse gênero parece ser o preferencialmente nodulante nesta

espécie de arbórea.

Analisando a filogenia das leguminosas (WOJCIECHOWSKI, 2003), mais

especificamente a da subfamília Mimosoideae, pode-se observar que, apesar de

espécies do gênero Inga e Mimosa pertencerem a tribos diferentes, Ingeae e

Mimoseae respectivamente, elas são noduladas pelo mesmo gênero de bactérias

(Burkholderia), sugerindo que a diversidade dentro dos betarizóbios pode ser muito

maior do que o esperado quando são analisados diferentes hospedeiros para um

mesmo gênero bacteriano. O presente estudo, também fornece evidências de que,

conforme anteriormente afirmado por Chen et al. (2008), microssimbiontes

geneticamente diferentes podem ser isolados de um único gênero ou espécie

vegetal. No caso de I. vera , por exemplo, os isolados 395A (Burkholderia nodosa) e

395H (Bradyrhizobium sp.) foram isolados de nódulos coletados de uma mesma

planta. Entretanto, vale salientar que existe certa especificidade entre hospedeiro e

microssimbionte na interação rizóbio / leguminosa (HOFFMANN ,2007), e que pode

ser explicada tanto pela troca de sinais, possibilitando o reconhecimento entre as

espécies envolvidas, bem como a expressão de genes que se fazem necessários

para as alterações fisiológicas e morfológicas que auxiliam no funcionamento dessa

simbiose mutualística.

42

4.5. Experimento de inoculação de rizóbios em Inga edulis

Ao longo do experimento de inoculação de uma alfa e outra

betaproteobactéria em plantas de Inga edulis, foi avaliado o crescimento inicial

destas plantas através de dois parâmetros: altura e diâmetro do coleto. É importante

esclarecer que o uso dessa espécie deveu-se ao fato da não obtenção de sementes

de I. vera em tempo hábil para execução do experimento de inoculação.

Foram feitas 4 medidas em diferentes datas (aos 30, 50, 80 e 110 dias após

emergência das plântulas) tanto do diâmetro do coleto, quanto da altura das plantas

(Figuras. 17 e 18, respectivamente). Com isso, pode-se constatar que até aos 50

dias de crescimento não foram observadas diferenças estatisticamente significativas

no crescimento das plantas. Isso se deveu, possivelmente, ao fato de que a semente

de I. edulis apresenta grande conteúdo em reservas nutricionais em seus

cotilédones, os quais sustentam o crescimento inicial dessa espécie.

30 50 80 110

Dias após emergência

2

3

4

5

Dia

mâm

etro

do c

ole

to (c

m)

Rhiz

Burk

Mix

+ N

- N

Figura 17 - Resposta do crescimento em diâmetro do coleto das plantas de Inga edulis inoculadas com os isolados 26A (Rhizobium tropici - Rhiz) e 395A (Burkholderia nodosa -

Burk) e mistura de ambos (Mix) comparados com a das plantas não inoculadas (- N) e fertilizadas com nitrato de amônia (+ N) ao longo de 110 dias. As barras correspondem ao erro padrão (n = 6).

43

Posteriormente, a partir dos 80 dias após emergência das plântulas,

observou-se um aumento tanto do diâmetro do coleto como na altura das plantas do

tratamento fertilizado com nitrato de amônia (+N) que refletiu um crescimento

significativamente maior dessas plantas em comparação as dos demais tratamentos,

as quais se mantiveram com crescimento estagnado ao longo deste período. Ainda

com relação ao acompanhamento na altura das plantas (Figura. 18), verificou-se que

no decorrer dos 110 dias de crescimento, o tratamento controle com adubação

nitrogenda (+N) apresentou um crescimento maior estatisticamente significativo em

relação aos demais tratamentos, passando em média de 13 cm aos 30 dias para

cerca de 23 cm aos 110 dias de crescimento. As plantas dos demais tratamentos se

mantiveram praticamente com a mesma média de altura (13 à 15 cm) entre os 30

até os 110 dias após emergência.

30 50 80 110

Dias após emergência

8

12

16

20

24

Altu

ra (

cm

)

Rhiz

Burk

Mix

+ N

- N

Figura 18 - Resposta do crescimento em altura das plantas de Inga edulis inoculadas com os isolados 26A (Rhizobium tropici - Rhiz) e 395A (Burkholderia nodosa - Burk) e mistura de ambos (Mix) comparados com a das plantas não inoculadas (- N) e fertilizadas com nitrato de amônia (+ N) ao longo de 110 dias. As barras correspondem ao erro padrão (n = 6).

44

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Rhiz Burk Mix N N

Bio

massa (

g/p

lan

ta)

Raiz Parte aérea

Após 120 dias de crescimento, as plantas foram colhidas e a biomassa

(massa seca da raiz e da parte aérea) comparada entre os tratamentos. Nas raízes

das plantas de todos os tratamentos, inclusive naquelas inoculadas com as

proteobactérias, não foi evidenciado nenhum sinal de nodulação. Isso explica o fato

de que os tratamentos inoculados com os isolados 26A e 395A não apresentaram

diferenças estatísticas quanto ao crescimento inicial de Inga edulis (Figura. 18)

quando comparados com o controle (plantas não inoculadas e não fertilizadas com

nitrato de amônia). É importante salientar que essa espécie de arbórea responde

bem à adubação nitrogenada, o que pode ser comprovado pela diferença

estatisticamente maior na biomassa produzida pelas plantas fertilizadas com o

nitrato de amônia (Figura. 19). Estas plantas apresentaram na média 9 g de

biomassa total produzida, valor muito superior (mais de 4 vezes maior) do que os

demais tratamentos, os quais em média resultaram em 2 g de massa seca total por

planta (Figura. 19).

Figura 19 - Produção total de biomassa das plantas de Inga edulis inoculadas com os isolados 26A (Rhizobium tropici - Rhiz) e 395A (Burkholderia nodosa - Burk) e mistura de ambos (mix) comparados com a das plantas não inoculadas (- N) e fertilizadas com nitrato de amônia (+ N) ao longo de 110 dias. As barras correspondem ao erro padrão (n = 6).

45

Outro fato observado que é interessante salientar é que a proporção de

raízes produzidas pelas plantas dos tratamentos inoculados e controle sem

adubação foi bem maior que o investido na parte aérea da planta, comportamento

este reconhecidamente comum para plantas submetidas à privação de nitrogênio

(SOUZA; FERNANDES, 2006).

De acordo com Long (1996), os sinais que mediam a interação entre as

plantas e os rizóbios são conhecidos: a planta exsuda flavonóides que, percebidos

pelo rizóbio, induzem-no a ativar os genes nod, sendo que vários destes codificam

enzimas responsáveis pela biossíntese dos fatores Nod, que são lipo-

oligossacarídeos. Estes lipo-oligossacarídeos são sinais para as plantas, que, na

sua presença, ativam genes que codificam proteínas responsáveis pelo processo de

nodulação. Uma estirpe de Rhizobium, por exemplo, pode infectar somente algumas

espécies de leguminosas, o que é chamado de especificidade

hospedeiro/específica, relatada em estudos prévios que afirmam que Rhizobium

leguminosarum biovar viciae nodula ervilha e que R. leguminosarum biovar trifolii

nodula trevo (REIS et al. 2006). Esse fato pode ter ocorrido com os isolados

selecionados para inocular as sementes de I. edulis, que provieram dos nódulos de

I. vera e que não nodularam a primeira. Aparentemente, a associação efetiva entre

os isolados 26A (Rhizobium tropici - Rhiz) e 395A (Burkholderia nodosa - Burk) e a

leguminosa hospedeira, I. edulis, não ocorreu e, conseqüentemente, não houve

fixação do nitrogênio atmosférico e sua transformação na amônia necessária ao

crescimento da planta.

Outra evidência que aponta para a inefetividade do isolado 26A em nodular a

leguminosa hospedeira, foi a de que, estranhamente, não ocorreu a amplificação do

gene nodC neste isolado, como pode ser observado no gel da amplificação da

Figura 12. Vale ressaltar que, os genes da nodulação de Rhizobium se encontram

no plasmídeo, e a perda desse plasmídeo por algumas estirpes, em decorrência por

exemplo da exposição a altas temperaturas, faz com que a bactéria perca sua

habilidade para formar nódulos (VIEIRA, 2007).

Todos os isolados bacterianos identificados neste trabalho, atualmente,

constituem o Banco de Rizóbios da UESC. Eles poderão fornecer inóculos para as

leguminosas nodulíferas de interesse ecológico e agronômico.

46

5. CONCLUSÃO

Pode ser verificado através deste trabalho que os nódulos radiculares de

Inga vera são do tipo indeterminado, raramente ramificados.

Na caracterização morfológica das colônias bacterianas isoladas a partir dos

nódulos de I. vera, foi observado que a maior parte (61 %) apresentou coloração

amarela, brilhante, com bordas inteiras, produção de mucopolissacarídeos e tiveram

crescimento relativamente rápido (3 – 7 dias).

Foi demonstrada ampla diversidade genética dos isolados presentes nos

nódulos de Inga vera, formados não só por alfaproteobacterias, principalmente

espécies de Bradyrhizobium, mas também por betaproteobacterias identificadas

como sendo Burkholderia, gênero pela primeira vez relatado como associado aos

nódulos desta leguminosa arbórea.

A partir de experimentos realizados em casa de vegetação, constatou-se

que os isolados 26A (Rhizobium tropici) e 395A (Burkholderia nodosa), provenientes

dos nódulos de I. vera, ao serem inoculados em plântulas de Inga edulis não

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