UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

D’AVILA MARIA DE SOUZA ARAÚJO

PERFIL PROTEÔMICO E ESTRESSE OXIDATIVO EM PLANTAS JOVENS DE

CACAU SUBMETIDAS A DOSES DE POTÁSSIO E A

SECA NO SOLO

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Fevereiro de 2017

D’AVILA MARIA DE SOUZA ARAÚJO

PERFIL PROTEÔMICO E ESTRESSE OXIDATIVO EM PLANTAS JOVENS DE

CACAU SUBMETIDAS A DOSES DE POTÁSSIO E A

SECA NO SOLO

Dissertação apresentada à

Universidade Estadual de Santa Cruz,

como parte das exigências para obtenção

do título de Mestre em Produção Vegetal.

Área de Concentração: Produção Vegetal

Linha de Pequisa: Cultivos em Ambiente

Tropical Úmido

Orientador: Prof. Dr. Alex-Alan Furtado de

Almeida

Co-orientador: Carlos Priminho Pirovani

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Fevereiro de 2017

D’AVILA MARIA DE SOUZA ARAÚJO

PERFIL PROTEÔMICO E ESTRESSE OXIDATIVO EM PLANTAS JOVENS DE

CACAU SUBMETIDAS A DOSES DE POTÁSSIO E A

SECA NO SOLO

Dissertação apresentada à

Universidade Estadual de Santa Cruz,

como parte das exigências para obtenção

do título de Mestre em Produção Vegetal.

Área de Concentração: Produção Vegetal.

APROVADA:

_________________________________________

Dra. Vânia Lima de Souza

IFBA

__________________________________________

Dra. Ivanildes Conceição dos Santos

UESC

__________________________________________

Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida

Orientador - UESC

iv

“Aos meus pais Firmino e Maria de Fátima, por acreditarem em mim”.

Dedico

v

AGRADECIMENTOS

Á Deus, toda glória! À Ele, por ter me dado saúde, sabedoria, força e

perseverança;

Aos meus pais Firmino Ferreira Araújo e Maria de Fátima Sousa Araújo, aos

meus irmãos Darcia Araújo, Dayane Araújo, Ruth Araújo, Alberto Araújo e Diego

Costa, pelo amor incondicional, por todo incentivo, pelas orações;

A todos os meus familiares, pelo carinho. Em especial, aos meus tios Pedro,

Claúdio, Luiz, por acreditarem em mim.

Ao meu orientador Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida e ao meu co-orientador

Dr. Carlos Priminho Pirovani, pela confiança e orientação, e pelos exemplos de

dedicação à pesquisa, de competência, integridade e lealdade. Obrigada, professor

Alex-Alan pelos conselhos e ajuda;

Á minha turma de mestrado, em especial aos meus amigos João Paulo e

João Pedro pelo companheirismo, amizade, ajuda incondicional, pelo amparo e

carinho. Vocês tornaram a jornada mais divertida. Levarei vocês sempre comigo;

As minhas colegas Graciele Monteiro, Angra Bomfim, Nathália Lima, Rafaella

do Mar, muito obrigada pelo apoio, pela disponibilidade em me ajudar nas análises e

dúvidas em relação à proteômica, pelo bom convívio diário;

Aos colegas “proteômicos” em especial a Katiúcia que facilitaram às análises

no laboratório e ao Juliano pelo apoio nas análises do espectrômetro de massas;

Aos “fisiologistas” em especial a Júnea, Joedson, Thaíse Tosto, Tainã,

Téssio, Leonardo e Natália Martins pela disponibilidade e boa vontade em me

ajudar, sou muito grata;

Agradeço, ainda, ao técnico de laboratório Horlei pelos conselhos, pelos

sorrisos, pela boa vontade, pela amizade, sem palavras para dizer como sou grata;

Á secretária do PPGPV Carol, pela disponibilidade em me ajudar e

competência.

Ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal da Universidade

Estadual de Santa Cruz, pelo compromisso com a formação dos profissionais;

Aos professores e funcionários do Centro de Biotecnologia e Genética (CBG)

em especial a linda dona Jô, você é muito querida!

vi

A Capes, pela concessão da bolsa ao longo da pós-graduação;

A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para o êxito deste

trabalho, meu eterno agradecimento.

vii

EPÍGRAFE

“Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me

em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras,

enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos”.

(Isaac Newton)

“Cada vez que você faz uma opção está transformando sua essência em alguma

coisa um pouco diferente do que era antes”.

(Clive Staples Lewis)

viii

ARAÚJO, D’avila Maria de Souza, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Fevereiro de 2017. Perfil proteômico e estresse oxidativo em plantas jovens de cacau submetidas a doses de potássio e a seca no solo. Orientador: Prof. Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida. Co-orientador: Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani.

RESUMO

Theobroma cacao é uma espécie perene, preferencialmente alogâmica, de grande importância econômica e considerada intolerante à deficiência hídrica no solo. Várias pesquisas têm demonstra uma relação entre plantas bem nutridas com potássio (K) e tolerância aos efeitos adversos da deficiência hídrica. As principais funções metabólicas de K na planta estão relacionadas à ativação enzimática e à síntese de proteínas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar a influência de doses de K nas respostas diferenciais de dois genótipos de T. cacao (CC 40 - intolerante à seca e PA 13 - tolerante à seca) ao déficit hídrico severo no solo, por meio da análise de mudanças no perfil de proteínas exclusivas e diferencialmente acumuladas, relacionadas à tolerância à seca, e do metabolismo antioxidativo, visando subsidiar, futuramente, a seleção de novos genótipos de T. cacao que possam ser usados em programas de melhoramento de plantas tolerantes à seca. Para os genótipos CC 40 e PA 13 submetidos às doses de 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa foram detectadas 335 e 252 e 202 e 261 proteínas, respectivamente. Os resultados das comparações de perfis proteicos mostraram a existência de expressão diferencial para os tratamentos, apresentando proteínas comuns, exclusivas e diferencialmente expressas. As proteínas associadas ao metabolismo energético, à fotossíntese, ao metabolismo antioxidativo e às respostas aos estresses abióticos foram identificadas a partir dos peptídeos gerados. Algumas dessas proteínas estão diretamente relacionadas aos mecanismos de tolerância à seca, ativados pelas interações entre doses de K e deficiência hídrica no solo. O aumento da dose de K, em condições de deficiência hídrica severa no solo, além de regular a síntese de proteínas foliares relacionadas à tolerância ao estresse hídrico, promoveu o aumento da atividade das enzimas SOD e GPX envolvidas no metabolismo antioxidativo, principalmente para o genótipo de T. cacao PA 13 tolerante à seca. Logo, há uma interação positiva entre dose de K, síntese proteica, metabolismo antioxidativo e tolerância ao déficit hídrico severo em plantas de T. cacao. Palavras-chave: Theobroma cacao, deficiência hídrica, nutrição mineral, 2D-PAGE, espectrometria de massas.

ix

ARAÚJO, D’avila Maria de Souza, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, February, 2017. Proteomic profile and oxidative stress in young cacao plants submitted to doses of potassium and a drought in the soil. Advisor: Prof. Dr.

Alex-Alan Furtado de Almeida. Co-advisor: Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani.

ABSTRACT

Theobroma cacao is a perennial plant species, preferentially alogamous, of great economic importance and considered intolerant to soil water deficiency. Many research has demonstrate a relationship between plants well-nourished with potassium (K) and tolerance to the adverse effects of water deficiency. The main metabolic functions of K in the plant are related to enzymatic activation and protein synthesis. The main objective of this work was to evaluate the influence of K doses on the differential responses of two T. cacao genotypes (CC 40 - drought intolerant and PA 13 - drought tolerant) to severe soil water deficit by means of the analysis of changes in the profile of exclusive and differentially accumulated proteins related to drought tolerance and of the antioxidative metabolism, aiming to subsidize in the future the selection of new T. cacao genotypes that can be used in programs to improve drought tolerant plants. For genotypes CC 40 and PA 13 submitted to doses of 200 and 400 mg K dm-3 soil and severe water deficiency were detected 335 and 252 and 202 and 261 proteins, respectively. The protein profiles comparisons results showed the existence of differential expression to the treatments, presenting common, exclusive and differentially expressed proteins. Proteins associated with energy metabolism, photosynthesis, antioxidant metabolism and responses to abiotic stresses were identified from the generated peptides. Some of these proteins are directly related to the mechanisms of drought tolerance, activated by the interactions between K doses and soil water deficiency. The K dose increase under severe water deficiency conditions in soil, besides regulating the synthesis of foliar proteins related to water stress tolerance stress, promoted an activity increase of the enzymes SOD and GPX involved in the antioxidative metabolism, mainly for the genotype of T. cacao PA 13, which is tolerant to drought. Therefore, there is a positive interaction between K dose, protein synthesis, antioxidative metabolism and tolerance for severe water deficit in T. cacao plants. Keywords: Theobroma cacao, water deficiency, mineral nutrition, 2D-PAGE, mass spectrometry.

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Perfil proteico de amostras foliares de genótipos de T. cacao

contrastantes para a tolerância à seca, submetidos a duas doses de K e a deficiência hídrica severa no solo. M - marcador de peso molecular (14 - 97 KDa) GE Healthcare; 1 – CC 40 submetido a 200 mg K dm-3 solo; 2 – CC 40 submetido a 400 mg K dm-3 solo; 3 – PA 13 submetido a 200 mg K dm-3 solo; 4 – PA 13 submetido a 400 mg K dm-3 solo. ................................................................................................... 31

Figura 2 - Perfil proteico bidimensional de amostras foliares do genótipo de T. cacao

CC 40, submetido a 200 (A) e 400 mg K dm-3 solo (B) e a deficiência hídrica severa no solo. Onde KDa corresponde à massa molecular e pI o ponto isoelétrico de cada spot, variando em 3-10 NL (não linear). .................................................................... 32

Figura 3 - Diagrama de Venn mostrando a distribuição dos spots proteicos de

amostras foliares detectados nos géis 2-D para o genótipo de T. cacao CC 40, submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa. ..................... 33

Figura 4 - Perfil proteico bidimensional de amostras foliares do genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 200 (A) e 400 mg K dm-3 solo (B) e a deficiência hídrica severa no solo. Onde KDa corresponde à massa molecular e pI o ponto isoelétrico de cada spot, variando em 3-10 NL (não linear). .................................................................... 34

Figura 5 - Diagrama de Venn mostrando a distribuição dos spots proteicos de amostras foliares detectados nos géis 2-D para o genótipo de T. cacao PA 13, submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.......... 35

Figura 6 - Distribuição dos spots proteicos, detectados nos mapas 2-D, de acordo

com a massa molecular (MM), para o genótipo de T. cacao CC 40 submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. .................................... 36

Figura 7 - Distribuição dos spots proteicos, detectados nos mapas 2-D, de acordo com a massa molecular (MM), para o genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. ....................................... 36

Figura 8 - Distribuição dos spots proteicos, detectados nos mapas 2-D, de acordo

com o ponto isoelétrico (pI, 3-10 não linear), para o genótipo de T. cacao CC 40 submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.......... 37

Figura 9 - Distribuição dos spots proteicos, detectados nos mapas 2-D, de acordo com o ponto isoelétrico (pI, 3-10 não linear), para o genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.......... 38

Figura 10 - Categorização funcional de proteínas exclusivas, identificadas para o

genótipo de T. cacao CC 40 submetido a 200 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. .......................................................................................................... 54

xi

Figura 11 - Categorização funcional de proteínas exclusivas, identificadas para o

genótipo de T. cacao CC 40 submetido a 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. .......................................................................................................... 54

Figura 12 - Categorização funcional de proteínas diferencialmente acumuladas, identificadas entre os tratamentos com as doses de K (200 e 400 mg dm-3 solo) para o genótipo de T. cacao CC 40 submetido à deficiência hídrica severa no solo. ........ 55

Figura 13 - Categorização funcional de proteínas exclusivas, identificadas para o

genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 200 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. .......................................................................................................... 56

Figura 14 - Categorização funcional de proteínas exclusivas, identificadas para o genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. .......................................................................................................... 56

Figura 15 - Categorização funcional de proteínas diferencialmente acumuladas,

identificadas entre os tratamentos com as doses de K (200 e 400 mg dm-3 solo) para o genótipo de T. cacao PA 13 submetido à deficiência hídrica severa no solo. ........ 57

Figura 16 - Atividade da dismutase do superóxido, em genótipos de T. cacao (CC 40 e PA 13) submetidos a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas e, ou minúsculas não diferem entre si, entre e dentro dos genótipos, respectivamente, pelo teste de Tukey (p≤ 0,05). As barras correspondem aos erros padrões das médias. n=5. ....................... 58

Figura 17 - Atividade da peroxidase do ascorbato, em genótipos de T. cacao (CC 40

e PA 13) submetidos a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas e, ou minúsculas não diferem entre si, entre e dentro dos genótipos, respectivamente, pelo teste de Tukey (p≤ 0,05). As barras correspondem aos erros padrões das médias. n=5. ....................... 59

Figura 18 - Atividade da peroxidase do guaiacol, em genótipos de T. cacao (CC 40 e PA 13) submetidos a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas e, ou minúsculas não diferem entre si, entre e dentro dos genótipos, respectivamente, pelo teste de Tukey (p≤ 0,05). As barras correspondem aos erros padrões das médias. n=5. ....................... 60

Figura 19 - Atividade da fenilalanina amônialiase, em genótipos de T. cacao (CC 40

e PA 13) submetidos a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas e, ou minúsculas não diferem entre si, entre e dentro os genótipos, respectivamente, pelo teste de Tukey (p≤ 0,05). As barras correspondem aos erros padrões das médias. n=5. ................................. 61

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Proteínas exclusivas do genótipo de T. cacao CC 40 submetido a 200 mg

K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo; e proteínas diferencialmente acumuladas entre as doses de K, identificadas por espectrometria de massas (MS/MS), resultantes de amostras foliares coletadas. .............................................. 40

Tabela 2 - Proteínas exclusivas do genótipo de T. cacao CC 40 submetido a 400 mg

K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo, identificadas por espectrometria de massas (MS/MS), resultantes de amostras foliares coletadas. ............................ 43

Tabela 3 - Proteínas exclusivas do genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 200 mg

K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo; e proteínas diferencialmente acumuladas entre as doses de K, identificadas por espectrometria de massas (MS/MS), resultantes de amostras foliares coletadas. .............................................. 45

Tabela 4 - Proteínas exclusivas do genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 400 mg

K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo, identificadas por espectrometria de massas (MS/MS), resultantes de amostras foliares coletadas. ............................ 48

xiii

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS .................................................................................................. v

RESUMO ...................................................................................................................xiii

ABSTRACT ................................................................................................................ ix

LISTA DE FIGURAS.................................................................................................... x

LISTA DE TABELAS ................................................................................................. xii

INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1

REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 5

1.1. Deficiência hídrica como fator limitante para desenvolvimento e produtividade de T. cacao ........................................................................................ 5

1.2. Disponibilidade e funções de K ...................................................................... 7

1.3. Regulação das respostas moleculares ao déficit hídrico no solo ................ 10

1.4. Análise proteômica em plantas .................................................................... 12

1.5. Metabolismo antioxidativo em plantas .......................................................... 13

OBJETIVOS .............................................................................................................. 16

MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 17

3.1. Material vegetal ............................................................................................ 17

3.2. Escolha dos tratamentos e condições de cultivo .......................................... 17

3.3. Aplicação dos tratamentos ........................................................................... 19

3.4. Coleta de material vegetal ............................................................................ 19

3.5. Análise proteômica ....................................................................................... 20

3.5.1 Extração de proteínas totais .................................................................. 20

3.5.2 Quantificação de proteínas totais e eletroforese em gel SDS-PAGE .... 21

3.5.3 Focalização isoelétrica .......................................................................... 22

3.5.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida .................................................... 23

3.5.5 Análise dos géis pelo Software Image Master ....................................... 24

3.5.7 Excisão dos spots e extração de peptídeos........................................... 25

3.5.8 Análise por espectrometria de massas (MS/MS) e identificação das proteínas ............................................................................................................. 26

3.6. Metabolismo antioxidativo ............................................................................ 26

5.6.1 Atividade da dismutase do superóxido (SOD) EC: 1.15.1.1 .................. 27

5.6.2 Atividade de peroxidase do arcosbarto (APX) EC:1.11.1.11 ................. 27

xiv

5.6.3 Atividade de peroxidase do guaiacol (GPX) EC: 1.11.1.7 ..................... 28

5.6.4 Atividade da fenilalanina amônialiase (PAL) EC: 4.3.1.5 ....................... 28

3.7. Delineamento experimental e Análise estatística ......................................... 29

RESULTADOS .......................................................................................................... 30

4.1. Eficiência da extração de proteínas por meio de SDS-PAGE ...................... 30

4.2. Perfis de spots do genótico CC 40, submetido a doses de 200 e 400 mg K dm-3 e deficiência hídrica severa no solo, obtidos por meio de eletroforese bidimensional (2D-PAGE) ...................................................................................... 31

4.3. Perfis de spots do genótico PA 13, submetido a doses de 200 e 400 mg K dm-3 e deficiência hídrica severa no solo obtidos por meio de eletroforese bidimensional (2D-PAGE) ...................................................................................... 33

4.4. Avaliação da distribuição dos spots no gel 2-DE quanto a massa molecular (MM) e o ponto isoelétrico (pI) ............................................................................... 35

4.5. Identificação das proteínas .......................................................................... 38

4.6. Classificação funcional das proteínas dos genótipos CC 40 e PA 13 de T. cacao. .................................................................................................................... 53

4.7. Metabolismo antioxidativo ............................................................................ 57

4.7.1. Atividade de dismutase do superóxido (SOD) ....................................... 57

4.7.2. Atividade de peroxidase do ascorbato (APX) ........................................ 58

4.7.3. Atividade de peroxidase do guaiacol (GPX) .......................................... 59

4.7.4. Atividade de fenilalanina amônialiase (PAL) .......................................... 60

DISCUSSÃO ............................................................................................................. 62

5.1. Perfis proteicos dos genótipos de T. cacao CC 40 e PA 13 ......................... 62

5.2. Proteínas envolvidas em processos metabólicos, catalíticos e fotossíntéticos.............................................................................................63

5.3. Proteínas envolvidas nas respostas de defesa e estresse ........................... 69

5.4. Proteínas envolvidas nos processos de oxidorredução ............................... 71

5.5. Metabolismo antioxidativo ............................................................................ 73

CONCLUSÕES ......................................................................................................... 78

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 79

1

INTRODUÇÃO

Theobroma cacao é considerado como uma das espécies vegetais mais

importante do mundo, pelo valor econômico de suas amêndoas, que são usadas

como matéria-prima na fabricação de chocolate, cosméticos, sorvetes, sucos,

bebidas, etc. (ALMEIDA; VALLE, 2007). Os principais países produtores de T. cacao

são a Costa do Marfim, Gana e Indonésia, sendo o Brasil o sexto maior produtor do

mundo, com 210 mil toneladas (Safra 2015/2016, ICCO).

No entanto, as condições de seca no mundo vêm sendo agravadas pelo

crescente aumento da radiação solar e da temperatura do ar, em virtude das

alterações climáticas globais, promovidas pelo aumento do efeito estufa. Vários

cultivos agrícolas já sofrem com a falta de água em todo o mundo (MORISON et al.,

2008). Dessa forma, a água será considerada como insumo estratégico e

fundamental para o desenvolvimento econômico dos países, principalmente os

essencialmente agrícolas como o Brasil (FRITSCHE-NETO; BORÉM 2011). O T.

cacao é uma espécie considerada intolerante à deficiência hídrica no solo. Além de

afetar a produtividade, a escassez de chuva contribui para a morte de plantas,

principalmente quando a lavoura se encontra em solos com características físicas

associadas à baixa capacidade de armazenamento de água disponível (SOUZA JR.;

MENEZES, 2000).

A nutrição mineral é essencial na manutenção das funções metabólicas em

condições ideais. Para inúmeros cultivos, tem-se verificado que plantas bem nutridas

com potássio (K) se mostram mais tolerantes a deficência hídrica (BOSSHART;

UEXKULL, 1987). Este elemento metálico, considerado essencial às plantas, é

absorvido em maior quantidade que qualquer outro mineral, exceto nitrogênio (N)

(TISDALE; NELSON, 1975). Em condições de campo, as plantas de T. cacao bem

2

supridas com K são mais tolerantes ao déficit hídrico no solo (MARTINS, 1976).

Segundo este autor, o elemento K, que corresponde a cerca de 70% dos nutrientes

da seiva do xilema de T. cacao, está envolvido em várias reações metabólicas,

devido sua capacidade de ativar uma grande variedade de proteínas e enzimas.

Contudo, poucos estudos têm avaliado a função dos nutrientes minerais nos

mecanismos fisiológicos e bioquímicos relacionados com a tolerância à seca

(PASSOS, 1981).

A deficiência hídrica no solo induz respostas moleculares, fisiológicas e

bioquímicas em plantas (SHINOZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007). Os

processos regulatórios são iniciados com a perda de água em nível celular, seguido

dos ajustes de seu metabolismo às novas condições hídricas, podendo ocorrer

inibição do crescimento e mudanças no desenvolvimento da planta, resultando em

alterações na expressão gênica (BRAY, 1993) e, consequentemente, alterações no

acúmulo de proteínas, bem como na atividade de enzimas antioxidantes.

O proteoma de um organismo se refere ao conjunto de proteínas expressas,

que podem sofrer alterações dependendo dos estímulos e condições do ambiente

(SILVA et al., 2007). Portanto, o proteoma reflete a expressão das moléculas que

influenciam diretamente o funcionamento e a bioquímica celular (BORGES, 2013).

As análises proteômicas tem permitido o estudo de processos biológicos a partir da

avaliação do perfil proteico expresso em condição de estresse, seguido de

mapeamento das vias metabólicas e identificação de genes alvos que podem ser

utilizados no melhoramento genético (PANDEY; MANN, 2000; PATTERSON;

AEBERSOLD, 2003). Assim, por meio desta técnica, é possível saber o

compartimento celular onde estas proteínas atuam e suas interações com o

ambiente onde as plantas são cultivadas (GONZALEZ-FERNANDEZ et al., 2010,

2012).

Em condições normais as células vegetais produzem espécies reativas de

oxigênio (EROs). Todavia, a síntese destas moléculas é potencializada em plantas

sob estresse (ALSCHER et al., 2002). O acúmulo de EROs nas células vegetais

podem provocar a oxidação de proteínas, enzimas e lipídios de membranas

celulares, acarretando no aumento do extravasamento de eletrólitos e incremento do

conteúdo de malondialdeido (KOVACIK; BACKOR, 2007), bem como danos

3

fotoinibitorios e fotoxidativos em condições de déficit hídrico (SMIRNOFF, 1995;

ASADA, 1999). Para reduzir os danos provocados por EROs, as plantas

desenvolveram mecanismos de defesa antioxidativo enzimático e não enzimático

constituído por metabólitos antioxidantes (SHARMA et al., 2012). As enzimas do

metabolismo antioxidativo incluem as enzimas dismutases do superóxido (SOD) e

peroxidases, dentre outras, sendo a SOD a primeira enzima no processo de

eliminação de EROs (ZHANG et al., 2010). Entretanto, quando há excesso de

EROs, não eliminadas pelo metabolismo antioxitativo, ocorre o estresse oxitativo

seguido de morte celular (SOUZA et al., 2011).

Apesar de a existência de muitos trabalhos avaliando as respostas de plantas

submetidas à seca, poucos comparam genótipos ou variedades contrastantes

quanto à tolerância ao déficit hídrico no solo (CELLIER et al., 1998; XIAO et al.,

2009). Assim, como poucos têm estudado a função dos nutrientes minerais nos

mecanismos moleculares que conferem tolerância ao déficit hídrico em plantas. Em

estudo realizado por Neves (2014), com os mesmos genótipos de T. cacao

contrastante para tolerância à seca [PA 13 (tolerante à seca) e CC 40 (intolerante à

seca)] submetidos a doses de K e a deficiência hídrica no solo, foi observado que a

maior tolerância à seca atribuída ao genótipo PA 13, em relação ao genótipo CC 40,

foi potencializada pela adição de maiores doses de K (400 mg dm-3) no solo. Onde

se observou um aumento dos teores de K foliar, proporcional ao incremento das

doses de K aplicadas em cada tratamento. Além disso, o referido autor relatou que

esta tolerância está associada, em parte, com a maior capacidade das plantas em

absorver e acumular macro e micronutrientes minerais nas raízes (K, Ca, Mn e Zn) e

folhas (N, Ca, Mg e Mn), associada a capacidade de manter os estômatos

parcialmente abertos, em situações de baixos valores de potencial hídrico no solo (-

0,25 a - 0,51 MPa). Isto, por sua vez, possibilita a manutenção das trocas gasosas

foliares e um balanço positivo de carbono em condições de deficiência hídrica.

Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar, a partir

dos resultados obtidos por Neves (2014), a influência das maiores doses de K nas

respostas diferenciais de dois genótipos de T. cacao (PA 13 - tolerante à seca e CC

40 - intolerante à seca) ao déficit hídrico severo no solo. Para tal, se utilizou como

ferramenta a análise de mudanças no perfil de proteínas exclusivas e

4

diferencialmente acumuladas, relacionadas à tolerância à seca, e do metabolismo

antioxidativo, visando subsidiar, futuramente, a seleção de novos genótipos de T.

cacao que possam ser usados em programas de melhoramento de plantas

tolerantes à seca.

5

REVISÃO DE LITERATURA

1.1. Deficiência hídrica como fator limitante para desenvolvimento e

produtividade de T. cacao

Theobroma cacao é uma espécie lenhosa, com altura que varia entre 4 - 8 m,

típica de clima tropical e faz parte da família Malvaceae (FIGUEIRA et al., 1994;

MONTEIRO; AHNERT, 2012). O Brasil é o sexto maior produtor mundial de T.

cacao, sendo o sul da Bahia, a principal região produtora do Brasil (AGRIANUAL,

2013). O T. cacao é intercultivado em condições de sombra com espécies arbóreas

de interesse econômico, ou em sistema de ‘Cabruca’ na floresta Atlântica da Bahia e

Espírito Santo, Brasil, onde as espécies do sub-bosque são raleadas para a

introdução do cacau, ou como monocultivo a pleno sol com sistema de fertirrigação

por gotejamento, com alta produtividade, visto que se trata de uma espécie de sol,

tolerante ao sombreamento e intolerante ao déficit hídrico (ALMEIDA; VALLE, 2007;

2009).

As mudanças climáticas, principalmente as referentes à quantidade e a

distribuição das chuvas, é uma das principais causas das variações de crescimento,

desenvolvimento e produtividade do cacaueiro (ALVIM, 1977; BALASIMHA, 1988).

Segundo o quarto relatório de avaliação do Grupo de Trabalho 1 (GT1) do “Painel

Intergovernamental sobre Mudanças no Clima” (IPCC, 2007) o Brasil, registrará

aumentos de temperatura mais intensos na parte norte e nordeste e menos intenso

no Sul, devido ao aumento da temperatura média global nos últimos anos,

particularmente, na América do Sul. Assim, a seleção de genótipos de T. cacao

6

tolerantes a condições de seca permitirá maior abrangência das áreas de cultivo em

locais onde antes não seria possível o seu cultivo (PASSOS, 1981).

A deficiência hídrica é um dos estresses ambientais que podem regular o

crescimento e desenvolvimento das plantas, limitando a produção (JONES;

CORLETT, 1992). O déficit hídrico afeta a fotossíntese e aumenta a fotorrespiração,

provocando mudanças na homeostase celular e aumento na produção e acúmulo de

EROs (MILLER et al., 2010). Quando associado a altas temperaturas e, ou em

combinação com outros estresses, causam danos significativos às membranas

celulares e promove a peroxidação lipídica, que em combinação aumenta as

perturbações fisiológicas nas plantas (SILVA et al., 2010).

As respostas ao déficit hídrico variam de forma intra e interespecífica, a

exemplo das espécies Quercus ilex e Q. suber que, ao serem submetidas a seca,

apresentam graus diferentes de tolerância (VAZ et al., 2010). Xiao et al. (2009) ao

estudarem duas espécies de Populus cathayana Rehder, uma originária de região

seca e outra de região úmida, verificaram reduções na fotossíntese líquida (A),

condutância estomática ao vapor de água (gs) e concentração interna de CO2 (Ci)

em nível foliar. Todavia, a população de clima seco permaneceu com os valores de

trocas gasosas foliares significativamente maiores se comparados às plantas de

clima úmido, apresentando maior tolerânca e aclimatação à seca. Isso indica

variabilidade natural da mesma espécie provocada pelas alterações na expressão

gênica. A turgidez celular e a abertura e fechamento de estômatos, que, por sua vez,

reduz as taxas de transpiração (E), A e inibe o metabolismo celular, também são

afetados pela deficiência hídrica (SANTOS et al., 2006; WAKEEL et al., 2011).

A abertura dos estômatos em folhas de T. cacao está associada também com

a umidade relativa do ar (UR), pois os seus estômatos permanecem mais abertos

em alta do que em baixa UR. Em contrapartida, o fechamento dos estômatos não

controla eficientemente a perda de água, provavelmente pela alta transpiração

cuticular (RAJA HARUN; HARDWICK, 1988). De acordo com estes autores, folhas

de T. cacao não possuem altos valores de gs em condições de déficit hídrico e baixa

UR. Já os genótipos de T. cacao que apresentam mecanismo eficiente de regulação

estomática, mostram decréscimo em perda de água por meio de E em condições de

7

deficiência hídrica, sendo considerada uma estratégia de adaptação importante à

seca (BALASIMHA, 1988).

Mesmo sendo respostas indispensáveis para a adaptação da planta à seca no

solo, o fechamento dos estômatos e a redução de área foliar são mecanismos que

podem restringir o crescimento, desenvolvimento e limitar a produtividade das

plantas. Além disso, à medida que a deficiência hídrica aumenta, a diminuição da

fotossíntese deixa de ser atribuída apenas à redução da abertura estomática e a

restrição difusiva de CO2, e passa a ser relacionada também aos mecanismos das

etapas fotoquímica e bioquímica (KANECHI et al., 1996; IRVING; ROBINSON,

2006). Estudos realizados in vivo tem mostrado que o deficit hídrico provoca danos

consideráveis ao centro de evolução do oxigênio (KAWAKAMI; IWAMA, 2009),

assim como a degradação da proteína D1, que acaba inativando os centro de

reação do fotossistema 2 (LIU et al., 2009; ZLATEV, 2009)

Para aumentar o desempenho de T. cacao em regiões com períodos de

déficit hídrico prolongados, é indispensável à identificação e a seleção de

características responsáveis por conferir tolerância ao déficit hídrico e, ou aumento

da eficiência do uso de água (FIGUEIREDO, 2011). As plantas de T. cacao, assim

como de outras espécies vegetais, possuem inúmeros mecanismos de

sobrevivência em condições de deficiência hídrica no solo, os quais podem ser

estudados para identificar genótipos tolerantes que mantêm uma boa produção de

frutos mesmo em condições de baixa disponibilidade de água no solo (GUO et al.,

2010). Como mecanismos podemos citar a eficiência de extração de água no solo, o

ajustamento osmótico, o controle da abertura e fechamento dos estômatos, a

curvatura foliar, o ajustamento de área foliar, a presença de cutícula foliar espessa, a

mudança na razão raiz-parte aérea, as alterações na expressão gênica

(KOZLOWSKI, 1997, 2002), incluindo síntese de proteínas como champeronas,

aquaporinas, etc.

1.2. Disponibilidade e funções de K

O elemento K é essencial na nutrição mineral das plantas e tem como função

principal a manutenção da homeostase celular e dos processos de transporte de

8

solutos via xilema e floema. Além disso, está envolvido na abertura e fechamento

estomático através da absorção e liberação de K entre as células-guarda e células

anexas, que afeta o equilíbrio hídrico da planta (LINDHAUER, 1985). Por outro lado,

o íon K se encontra predominantemente como cátion livre ou como cátion adsorvido

e pode facilmente ser deslocado das células ou dos tecidos vegetais (LINDHAUER,

1985). A alta mobilidade deste elemento metálico nas plantas determina as suas

principais funções e características como o principal cátion que age na neutralização

de cargas e como o mais importante e ativo componente inorgânico osmótico

(CLARKSON; HANSON, 1980).

O íon K+ desempenha funções essenciais, agindo na eficiência fotossintética

e no controle osmótico (MALAVOLTA, 2006). O acúmulo de K e P nos tecidos

foliares de T. cacao contribuem no ajuste osmótico e na manutenção da

turgescência foliar em valores de potencial hídrico foliar menores que - 1,5 MPa

(ALMEIDA, et al., 2002). O funcionamento dos estômatos depende de um

suprimento adequado de K em nível foliar, o qual se move para o interior de suas

células-guarda, promovendo o acúmulo de água, em favor de um gradiente de

potencial hídrico, e o intumescimento das células, seguido da abertura dos

estômatos (TAIZ; ZEIGER, 2009). Isto, por sua vez, possibilita o movimento livre de

gases para o interior e o exterior do mesofilo foliar. Por outro lado, quando o

fornecimento de água é inadequado, o K é bombeado das células-guarda para as

células anexas e os poros estomáticos se fecham completamente para evitar perda

de água (TAIZ; ZEIGER, 2009). Ademais, se a disponibilidade de K é inapropriada,

os estômatos demoram a responder e o vapor d’água é perdido para a atmosfera

(TAIZ; ZEIGER, 2009).

O pH é mantido elevado no estroma sob iluminação, pela entrada adicional de

K+ no citosol mediado pelo fluxo contrário de H+ através do envelope do cloroplasto

(WU et al., 1991). Este fluxo é afetado em condições de estresse hídrico. Durante a

desidratação de cloroplastos isolados perdem-se quantidades significantes de K e

reduz a fotossíntese (PÍER; BERKOWITZ, 1987). Todavia, esta diminuição pode ser

superada por altas concentrações de K extracloroplastídicas (PÍER; BERKOWITZ,

1987). Assim, a importância da reposição de K nas folhas de plantas submetidas a

déficit hídrico ou salinidade está relacionada à necessidade de manter altas

9

concentrações de K+ no estroma (SEM GUPTA et al., 1989). Além disso, nas

células da raiz, o K reduz o potencial hídrico e permite a entrada de água. As células

parenquimáticas do xilema exsudam K dentro dos vasos xilemáticos, reduzindo o

potencial hídrico e, consequentemente, possibilitando a entrada da água, gerando a

pressão radicular (SEM GUPTA et al., 1989).

De acordo com Alvim e Grangier Jr. (1966), o íon K é o nutriente mineral que

apresenta, geralmente, maiores concentrações e acúmulos nos tecidos de T. cacao.

Na seiva do xilema de plantas de T. cacao, o teor de K corresponde a cerca de 70%

do total de nutrientes, alterando um pouco no decorrer do ano (MARTINS, 1976).

Este é um ativador enzimático e um dos principais elementos inorgânicos envolvidos

na qualidade dos frutos (KOLLER, 2006). Segundo Obreza et al. (2008) o K atua

diretamente no aumento da acidez do suco, no tamanho e peso de frutos, na

espessura da casca e na redução dos sólidos solúveis, cuja influência é maior que

qualquer outro nutriente, pois cerca de 70% do K absorvido pela planta se

encontram nos frutos.

Existem genótipos eficientes na absorção de K do solo e genótipos que tem

uma maior produção de matéria seca por unidade de K readquirido, cuja eficiência

de absorção e utilização está interligada (ZHANG et al., 2007). A eficiência de

absorção de K é controlada por mecanismos que dependem da arquitetura da raiz,

da alta capacidade de absorção na superfície dessa raiz e da capacidade de

disponibilizar K não trocável por meio dos exsudados radiculares (RANGEL;

DAMON, 2008). Já a eficiência de utilização é fundamentada em uma eficaz

translocação de K entre os organelos, as células e os órgãos, bem como da

capacidade de utilizar outros íons como substitutos do K (RANGEL; DAMON, 2008).

Diferenças entre a absorção de K e clones de T. cacao já foram comprovadas

(ASONAMING, 1972). Estudos mostram associação entre o acúmulo de K e P em

nível foliar e o ajustamento osmótico em T. cacao submetido à seca no solo

(ALMEIDA et al., 2002). De acordo com estes autores, foram encontradas diferenças

intergenotípicas no ajustamento osmótico para SPA 5, SIAL 70 e TSH 516, quando

submetidos rapidamente ao déficit hídrico. Já em plantas irrigadas de Coffea arabica

houve um aumento na concentração de amido acompanhado de acúmulo de K nas

folhas (MALAVOLTA et al., 1974). Além disso, a severidade da deficiência hídrica

10

resulta em aumento na demanda de K para manter a fotossíntese e proteger os

cloroplastos dos danos oxidativos (CAKMAK, 2005). Segundo Wallingford (1980), as

principais funções metabólicas do K na planta estão relacionadas à ativação

enzimática e síntese de proteínas.

Assim, as funções fisiológicas do K nas plantas estão relacionadas ao seu

papel no metabolismo, na produção de carboidratos, na regulação da absorção de

vários nutrientes minerais, no ajuste da relação entre movimento estomático e água,

na perda de turgescência da célula (MALAVOLTA, 1980) e na tolerância ao estresse

(WANG et al., 2013). De acordo com Wallingford (1980), as funções do K na planta

são divididas em seis áreas: relações com água, energia, translocação de

assimilados, produção de amido, ativação de enzimas e síntese de proteínas. Em

relação à ativação de enzima, a teoria mais aceita é que o íon K combina com

enzimas e altera sua conformação, possibilitando a atividade das enzimas

(WALLINGFORD, 1980). Outra teoria é que o K age como uma ponte entre a

enzima e seu substrato, e, assim, as duas moléculas podem ser alinhadas

adequadamente para a reação (WALLINGFORD, 1980). Assim, plantas com

deficiência de K possuem menor síntese de proteínas e acúmulo de compostos

nitrogenados solúveis como aminoácidos, amidas e nitrato (MARSCHENER, 1986).

Tanaka et al. (1995) verificaram aumento no teor de proteína em Glycine max, com o

aumento de K no solo. Todavia, a síntese de proteínas e a ativação enzimática

influenciada pela adição de K ainda é pouco conhecida.

1.3. Regulação das respostas moleculares ao déficit hídrico no solo

Estresses abióticos e bióticos em plantas provocam mudanças em suas

condições de crescimento que modificam ou prejudicam a homeostase no

metabolismo. Essas mudanças demandam um ajuste das vias metabólicas,

objetivando adquirir um novo estado de homeostase, em um processo denominado

aclimatação ou tolerância (MITTLER, 2006; SUZUKI; MITTLER, 2006).

A deficiência hídrica induz a síntese do fitormônio ácido abscísico (ABA),

responsável pelo fechamento dos estômatos e ativação de genes relacionados à

seca. (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005). No entanto, alguns genes

11

envolvidos na resposta ao estresse parecem não responder ao ABA, o que indica a

existência de vias ABA-dependentes e ABA-independentes de ativação de genes

induzidos por estresses abióticos (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005).

Todavia, os processos moleculares, em resposta ao déficit hídrico, que são mais

rapidamente afetados, como também os mecanismos iniciais da resposta molecular,

ainda não estão bem compreendidos (SHINOSAKI; YAMAGUCHI-SHINOSAKI,

2007). Assim, compreender os mecanismos moleculares em resposta à seca no solo

é necessário na tentativa de aumentar a tolerância a esse estresse por meio de

técnicas moleculares (NAKASHIMA et al., 2014).

As respostas moleculares estão relacionadas à “percepção” do estresse,

transdução do sinal, expressão gênica e alterações metabólicas na planta,

reestabelecendo assim a homeostase celular (WANG et al., 2006). A perda do

volume e da turgescência celular vegetal ou a concentração de solutos provoca

mudanças à conformação de proteínas da parede celular e da membrana plasmática

da célula, ativando rotas de transdução de sinais, e consequentemente à expressão

de genes específicos, transformando assim o fenômeno físico do déficit hídrico em

uma resposta bioquímica (BRAY et al., 2001).

A eficiência da planta em responder e sobreviver à deficiência hídrica

necessita dos mecanismos internos que constituem as respostas celulares

(SHINOSAKI; YAMAGUCHI-SHINOSAKI, 2007). A resposta à ativação de fatores

transcricionais por déficit hídrico leva a ativação de mecanismos de resposta ao

estresse, responsáveis por conferir tolerância às plantas. Entre os mecanismos que

são constantemente regulados estão o movimento da água para dentro e fora das

células através das aquaporinas (ZHANG et al., 2007; MAUREL et al., 2008); a

proteção às células, tecidos e macromoléculas de condições estressantes

(chaperonas) (MA; QIN, 2014); a síntese de enzimas detoxificantes que auxiliam no

equilíbrio metabólico (dismutase do superóxido) e de proteínas transportadores de

membrana (AKHTAR et al., 2012).

Portanto, a tolerância ou aclimatação aos estresses pelas plantas origina-se

da síntese e ativação de proteínas, com funções específicas, tais como a rápida

“percepção” e transmissão de sinais ambientais; a proteção às membranas, as

enzimas e ao DNA das células; o aumento na capacidade de absorção de água do

12

solo; e a redução na perda de água por transpiração (BENKO-ISEPPON et al.,

2005). Porém, expressão de genes, em resposta aos inúmeros estresses abióticos e

bióticos em T. cacao, ainda é pouco conhecida (BAILEY et al., 2005).

1.4. Análise proteômica em plantas

A partir dos avanços moleculares foram surgindo técnicas cada vez mais

modernas, as chamadas “ômicas”, que vão desde o número crescente de

sequênciamento dos genomas, até os estudos trancriptômicos, proteômicos e a

análises metabolômicas (GONZALEZ-FERNANDEZ, 2010). Marc Wilkins em 1994

descreveu o termo “proteômica”, como sendo apenas um “complemento proteico de

um genoma” (WILKINS et al., 1996). Esta definição, atualmente, se refere ao estudo

simultâneo do conjunto total de proteínas de um organismo, assim como a sua

descrição, abundância, variações decorrentes do genótipo, modificações pós-

traducionais, mudanças ambientais, interação proteína-proteína (GONZALEZ-

FERNANDEZ et al., 2010, 2012).

A proteômica “clássica” inclui metodologias baseadas em técnicas de

eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2-DE PAGE), seguida da

identificação das proteínas por espectrometria de massa, que, por sua vez, é uma

abordagem utilizada para comparar o perfil proteico, com a finalidade de detectar e

identificar proteínas exclusivas e diferencialmente expressas (BRANDAO,

BARBOSA; ARRUDA, 2010; VALENTIM-NETO et al., 2015; BALSAMO et al. 2015;

WANG et al., 2015). Todavia, a espectrometria de massas possui algumas

limitações, como sensibilidade, resolução, cobertura e velocidade de captura de

dados, o que evidencia a dificuldade de trabalhar com a diversidade de proteínas e

suas inúmeras propriedades fisiológicas e bioquímicas (HAN et al., 2006).

Entretanto, a proteômica, possibilita obter conhecimentos a respeito dos

mecanismos de tolerância e aclimatação das plantas de T. cacao em condições de

estresse. Além disso, podem ser analisadas as mudanças que ocorrem em nível de

proteína, o que não é possível a partir da sequência genômica (HAN et al., 2006).

Os estudos proteômicos têm sido utilizados para adquirir conhecimentos mais

aprofundados acerca dos processos biológicos de organismos submetidos a

13

estresses bióticos e abióticos. Vários grupos de pesquisa passaram a estudar o

proteoma e os complexos proteicos nas plantas, em nível celular. O estresse biótico

mais avaliado é por patógenos, seguidos dos abióticos por estresse hídrico, metais

pesados, estresse salino e osmótico (JORRINNOVO, 2009). Embora exista

diversidade quanto às espécies analisadas, a maioria dos estudos proteômicos se

concentrou em Arabidopsis thaliana e Oryza sativa (JORRINNOVO, 2009).

Alterações na expressão de genes responsáveis pela síntese de proteínas em

resposta a deficiência hídrica têm sido estudadas em diversas plantas (ALI;

KOMATSU, 2006). Dentre as proteínas diferencialmente acumuladas em resposta a

estresses, as mais sintetizadas são as envolvidas com tolerância ao estresse

oxidativo, considerando que a maioria dos estresses aumentam a produção de

EROs em plantas, cujas maiores concentrações de proteínas estão associadas a

fator de alongamento e a enzima superóxido dismutase em plantas submetidas a

déficit hídrico (ALI; KOMATSU, 2006). Em estudos realizados por Salekdeh et al.

(2002), foram identificadas 16 proteínas diferentemente acumuladas, em resposta a

seca no solo, em plantas de O. sativa.

1.5. Metabolismo antioxidativo em plantas

A deficiência hídrica provoca redução na fotossíntese, levando a diminuição

no uso da radiação solar incidente, resultando no acúmulo de poder redutor

(NADPH) e redução do aceptor final da cadeia de transporte fotossintética de

elétrons (NADP+) (CARVALHO, 2008). O excesso de poder redutor pode causar a

super-redução da cadeia de transporte de elétrons. Nesse processo, pode ocorrer

escape de elétrons, que, por sua vez, reagem com o oxigênio molecular (O2),

originando, assim, as chamadas EROs (CAVATTE et al., 2012).

A deficiência hídrica severa desencadeia uma maior produção e acúmulo de

EROs, que são espécies derivadas da redução do oxigênio molecular (O2), incluindo

alguns radicais livres, tais como superóxido (O2-), radical hidroxila (OH-) e produtos

não-radicais, como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o oxigênio atômico (1O2), entre

outros (GILL; TUTEJA, 2010; SANDALIO et al., 2013, GILL et al., 2015). O aumento

na produção de EROs, chamado de “explosão oxidativa” é uma das respostas mais

rápidas frente aos estresse oxidativo provocado pelo déficit hídrico.

14

As EROs são produzidas normalmente em várias vias metabólicas das

plantas, sendo que os organelos celulares, tais como cloroplastos e mitocôndrios,

são as principais fontes (GILL; TUTEJA 2010; SANDALIO et al., 2013). Além disso, o

peroxissomo também é responsável pela produção de EROs devido à ação das

enzimas do processo de fotorrespiração (DEL RIO et al. 2006). O papel de EROs,

durante o déficit hídrico, parece ter um efeito duplo sob condições de estresses, que

dependem da sua quantidade total celular. Se mantido em níveis relativamente

baixos, é possível que as EROs funcionem como componentes de uma via de

sinalização ao estresse, desencadeando defesa a determinado estresse ou

respostas de aclimatação (CARVALHO, 2008). Entretanto, quando chega em nível

de fitotoxicidade, as EROs se tornam prejudiciais, condição em que o organismo é

incapaz de metabolizar efetivamente o excesso de EROs, e estas, por sua vez, irão

causar uma imediata peroxidação lipídica, oxidação de proteínas, inibição

enzimática e danos em níveis de DNA e RNA (APEL; HIRT, 2004; GILL;TUTEJA,

2010). Danos estes, que provocam a disfunção celular, lesões necróticas ou ainda

morte celular (SHARMA et al., 2012). Os danos oxidativos, como consequência,

traduzem-se nas folhas pelo surgimento de clorose que evoluem para necrose e

abscisão foliar (CAVATTE et al., 2012).

Para diminuir os danos provocados pela produção de EROs, as plantas

desenvolveram uma maquinaria de defesa antioxidante, da qual fazem parte

enzimas e compostos antioxidantes não enzimáticos, que metabolizam EROs e os

produtos de sua reação (GILL; TUTEJA, 2010; HASANUZZAMAN et al., 2012).

Dentre compostos antioxidantes não enzimáticos destacam-se o ácido ascórbico

(ASA), compostos fenólicos, alcalóides, glutationa (GSH), entre outros. Já em

relação ao metabolismo enzimático antioxidativo podemos citar a dismutase do

superóxido (SOD), peroxidase do ascorbato (APX), peroxidase do guaicol (GPX),

fenilalanina amônia liase (PAL), entre outros (HASANUZZAMAN et al., 2012; GILL et

al., 2015). No caso do déficit hídrico, a atividade do sistema enzimático e a produção

de compostos relacionados ao sistema antioxidante das plantas são alteradas

(CHAVES et al., 2002), com o objetivo de evitar ou reduzir os danos provocados

pelo estresse. Além disso, o K tem ação na redução dos efeitos nocivos de EROs

(ABBASI et al., 2014).

15

Dentre as principais enzimas antioxidantes, a SOD se destaca por ser a

primeira linha de defesa contra EROs, catalizando a dismutação de O2- a H2O2 e O2

em todos os compartimentos subcelulares (ALSCHER et al., 2002;. GILL; TUTEJA,

2010). Rahman et al. (2002), observaram o aumento significativo na atividade de

SOD em plantas de Solanum lycopersicum tolerantes e intolerantes ao déficit

hídrico. A seguir, têm-se as enzimas APX e GPX que atuam na conversão do H2O2

em oxigênio e água (APEL; HIRT, 2004). Sendo que a APX catalisa a conversão de

H2O2 para H2O, utilizando na reação um composto não enzimático, o ascorbato, que,

neste caso, é o doador de elétrons para a reação (CAVERZAN et al., 2012). Estas

peroxidases também estão relacionadas ao metabolismo de auxina, nas formações

de lignina e suberina, nos componentes da parede celular e na síntese de

fitoalexinas (COSIO; DUNAND, 2009).

A atividade de SOD e APX, por exemplo, aumentou em genótipos tolerantes

de Triticum aestivum e manteve-se ou reduziu em genótipos intolerantes em

resposta a deficiência hídrica no solo (LASCANO et al., 2001). Por outro lado, a PAL

é precursora do metabolismo secundário dos fenilpropanoides nas plantas, que

estão envolvidos em funções fundamentais como suporte mecânico na forma de

ligninas, proteção contra estresses abióticos e bióticos (MACDONALD; D’CUNHA

2007). Em trabalhos realizados por Phimchan et al. (2014) e Hura et al. (2008) pôde-

se observar uma relação positiva entre os efeitos do déficit hídrico e o aumento da

atividade da PAL em frutos de Capsicum spp e em folhas de Zea mays,

respectivamente.

16

OBJETIVOS

2.1. Geral

Avaliar a influência de doses de K nas respostas diferenciais de dois

genótipos de T. cacao (CC 40 - intolerante à seca e PA 13 - tolerante à seca) ao

déficit hídrico severo no solo, por meio da análise de mudanças no perfil de

proteínas exclusivas e diferencialmente acumuladas, relacionadas à tolerância à

seca, e do metabolismo antioxidativo, visando subsidiar, futuramente, a seleção de

novos genótipos de T. cacao que possam ser usados em programas de

melhoramento de plantas tolerantes à seca.

2.2. Específicos

Extrair e quantificar proteínas foliares dos genótipos de T. cacao CC 40 e PA

13 submetidos a doses de K e ao déficit hídrico severo no solo;

Realizar análise proteômica para identificar as proteínas exclusivas e

diferencialmente acumuladas;

Avaliar a atividade de enzimas envolvidas no metabolimo antioxidativo em

folhas dos genótipos CC 40 e PA 13 submetidos a doses de K e ao déficit hídrico

severo no solo.

17

MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Material vegetal

Foram utilizados dois genótipos de T. cacao (CC 40 e PA 13), provenientes

do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) do Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC)

da Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC). Para obtenção

dos frutos e sementes, as flores dos dois genótipos foram polinizadas manualmente

para que não houvesse polinização cruzada. O pólen do genótipo PA 13 foi

misturado ao pólen de Herrania umbratica para evitar a autoincompatibilidade.

Em experimento anterior, realizado por Santos (2012), verificou-se que

plantas do genótipo PA 13 são mais tolerântes à deficiência hídrica no solo, ao

passo que as plantas do genótipo CC 40 são intolerantes a este fator estressor. O

genótipo PA 13 é originário do Peru, pertence ao grupo Forastero, apresenta (1)

moderada resistência à ação do fungo Phytophthora palmivora; (2) fruto e semente

pequenos, o qual inviabiliza o seu uso como um cultivar comercial; (3) e

autoincompatível. Já o genótipo CC 40 é originário da Costa Rica, apresenta (1)

moderada resistência à ação do fungo Moniliophthora roreri; (2) fruto e semente

pequenos, o qual inviabiliza também o seu uso como um cultivar comercial; (3) e

autocompatível.

3.2. Escolha dos tratamentos e condições de cultivo

A seleção dos tratamentos foi realizada com base nos estudos e resultados

feitos por Neves (2014), ao avaliar as respostas fisiologicas e nutricionais dos

genótipos de T. cacao CC 40 e PA 13 submetidos à três doses de K [100 mg dm-3,

18

200 mg dm-3 (controle) e 400 mg dm-3] e a quatro classes de potenciais hídricos no

solo (ѰWsolo) a partir da capacidade de campo (Classe I= - 0,01 a - 0,03 MPa; Classe

II= - 0,04 a - 0,07 MPa; Classe III= - 0,11 a - 0,19 MPa; e Classe IV= - 0,25 a - 0,51

MPa). Segundo esse autor, os resultados demostraram que a adição de doses

elevadas de K no solo (400 mg dm-3) proporcionou, para ambos os genótipos de T.

cacao, melhor aclimatação fisiológicas e nutricionais, quando submetidos ao déficit

hídrico severo (- 0,25 a - 0,51 MPa). Isto foi evidenciado, principalmente, para o

genótipo tolerante a seca (PA 13), havendo, dessa forma, uma interação positiva

entre o aumento da dose de K (400 mg dm-3) no solo e a tolerância ao déficit hídrico

no solo.

Neste sentido, para avaliar as alterações moleculares e bioquímicas, que

conferem tolerância às plantas de T. cacao à seca, em resposta as elevadas doses

de K aplicadas no solo, foram selecionadas, dos tratamentos e material vegetal de

Neves (2014), plantas de ambos os genótipos de T. cacao (CC 40 e PA 13)

contratantes para a tolerância à seca, submetidas a duas doses de K (200 e 400 mg

dm-3 solo) e a uma classe de potencial hídrico no solo (ѰWsolo, - 0,25 a - 0,51 MPa).

Estas doses de K são consideradas como ideal (200 mg dm-3 solo, controle),

utilizada nas recomendações de adubação usuais, e superior a ideal (400 mg dm-3

solo), ao passo que a classe de ѰWsolo é considerada como déficit hídrico severo.

O experimento realizado por Neves (2014) foi conduzido em condições de

casa de vegetação, no Campus da Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC,

localizada no município de Ilhéus, BA, Brasil. Durante a condução do experimento foi

monitorada a radiação fotossinteticamente ativa (RFA), com o uso de sensores de

radiação luminosa S-LIA-M003 acoplados a estação climatológica Hobo Micro

Station Data Logger (Onset Coputer, Massachusetts, EUA); a temperatura (T) e a

umidade relativa (UR) do ar, por meio de sensores Hobo H8 Pro (Onset Coputer,

Massachusetts, EUA) para caracterização do ambiente de cultivo. Os valores médios

de RFA, T e UR foram de 860 ± 4 µmol fotóns m-2 s-1, 26 ± 2 °C e 80 ± 2 %,

respectivamente.

No experimento, foram utilizados vasos plásticos com capacidade para 12 dm-

3 preenchidos com a mistura (solo + areia na proporção de 2:1 v/v) sendo 8 dm-3 de

solo e 4 dm-3 de areia. O solo e a areia foram pesados conforme a sua proporção na

19

mistura, para que, ao final, cada vaso mantivesse um peso total de 16 kgf.

Posteriormente, foram coletadas amostras do substrato para a determinação da

curva de retenção de água no solo, análise da composição química e

granulométrica. Com base nos resultados da análise química foi feita a calagem,

elevando a saturação por bases a 80% com adição de 21,36 g de calcário dolomítico

em cada vaso.

3.3. Aplicação dos tratamentos

Foram realizadas adubações de plantio e cobertura de acordo com a

metodologia descrita por Neves (2014). As semeaduras dos dois genótipos foram

realizadas diretamente nos vasos. Após a germinação das sementes, as plantas

foram mantidas com Ѱwsolo próximo à capacidade de campo (CC), que teve o seu

teor de umidade estimado em 31%, que correspondeu a um ѰWsolo de -0,002 MPa,

pelo período de 60 dias. Posteriormente, o solo dos vasos foi coberto com lona

plástica preta, para minimizar os efeitos da evaporação da água do solo, e deu

iniciou a aplicação dos tratamentos.

Os tratamentos de adubação com as doses de K e do teor de água no solo

também foram realizados de acordo com os procedimentos metodológicos descritos

por Neves (2014). Onde 50 plantas de cada genótipo e tratamento foram submetidas

às classes de ѰWsolo, iniciado a partir de CC, por meio da suspensão gradativa da

irrigação, por um período de 40 dias, no qual se pôde finalmente verificar o

tratamento considerado déficit hídrico severo (ѰWsolo, - 0,25 a - 0,51 MPa). Durante

este período, o monitoramento da umidade do solo foi realizado, tendo como base

as pesagens diárias dos vasos, seguido pela reposição da água transpirada pelas

plantas, manutendo-se o peso estimado de cada vaso, calculado de acordo com a

curva de retenção de água no solo.

3.4. Coleta de material vegetal

Para as análises moleculares e bioquímicas foram coletadas a segunda e a

terceira folha madura, a partir do ápice do eixo ortotrópico, de ambos os genótipos

20

de T. cacao, quando o ѰWsolo atingiu valores entre - 0,25 a - 0,51 MPa.

Imediatamente após, o material vegetal foi embalado em papel alumínio, imerso em

nitrogênio líquido, armazenado em ultrafreezer a - 80°C, e, posteriormente, liofilizado

e armazenado em freezer a - 20°C.

3.5. Análise proteômica

3.5.1 Extração de proteínas totais

Para extração de proteínas totais, foram usadas amostras foliares liofilizadas,

de ambos os genótipos de T. cacao (CC 40 e PA 13) submetidos às doses de K (200

e 400 mg dm-3) e a deficiência hídrica severa no solo, seguindo o protocolo

desenvolvido por Pirovani et al. (2008), com modificações. Inicialmente, 0,1 g de

folhas foram maceradas, na presença de nitrogênio líquido e 0,07g de

polivinilpirrolidona (PVPP), até atingir a textura de pó fino. Após a maceração, as

amostras foram distribuídas em eppendorfs de 5 mL, para que fossem submetidas

às lavagens. Em seguida, o material foi lavado com acetona a 100% e centrifugado

a 14.000 x g por 10 min a 4 ºC, cujo passo foi repetido seis vezes. Entre uma

lavagem e outra, as amostras foram centrifugadas nas mesmas condições iniciais e

o sobrenadante descartado. Durante todo este processo de extração, as amostras

foram mantidas em banho de gelo. Posteriormente, o pellet foi seco em câmara de

fluxo laminar a temperatura ambiente por 1 h. Em seguida, o pellet foi lavado com

ácido tricloroacético (TCA) a 10% em acetona, contendo β-mercaptoetanol a 0,07%.

As lavagens foram repetidas até que as amostras foliares perdessem a coloração.

Entre uma lavagem e outra, as amostras foram centrifugadas, nas mesmas

condições do passo anterior, e homogeneizadas com o uso de vortex. Logo após,

foram feitas lavagens com TCA a 10% em água, seguida de homogeneização por

sonicação (amplitude 70%, 5 s ligado e 10 s de repouso por 1 min) e posterior

centrifugação para descarte do sobrenadante. Esta etapa foi repetida duas vezes e,

ao final, foi realizada uma primeira precipitação por aproximadamente 1 h a 20 ºC,

usando as mesmas condições de centrifugação. Em seguida, o sobrenadante foi

descartado e as amostras submetidas a lavagens com acetona a 80% por três

21

vezes. A cada lavagem, o precipitado foi ressupendido com o uso do vortex e

sonicado quando necessário. Na última lavagem, o sobrenadante fora descartado e

o pellet seco a temperatura ambiente em câmara de fluxo laminar.

Posteriormente, as amostras foliares foram submetidas a uma segunda

extração, que consistiu, inicialmente, em adicionar ao pó seco, obtido na etapa

anterior, 1 mL de SDS-denso (Tris-HCl 100 mmol L-1, pH 8, sacarose a 30 %, SDS a

2 % e β-mercaptoetanol a 5 %) e 1 mL de fenol a 99%, tamponado com Tris-HCL pH

8. Em seguida, a solução foi homogeneizada, com o uso de vortex, por

aproximadamente 1 min, com intervalos em gelo para manter a temperatura baixa.

Logo após, o conteúdo foi centrifugado a 4ºC por 10 min a 14.000 x g.

Imediatamente após, a fase fenólica (superior), contendo as proteínas, foi então

retirada e acondicionada em um novo tubo de centrífuga (50 mL), onde foram

adicionados 5 mL de acetato de amônio a 0,1 mmol L-1 em metanol gelado e

deixados a -20 ºC overnight. No dia seguinte, os precipitados proteicos foram

recuperados por centrifugação (14.000 x g) a 4ºC por 10 min. Logo após, foram

lavados por 2 vezes com acetato de amônio a 0,1 mmol L-1 em metanol gelado. Logo

após, o pellet foi ressuspendido e centrifugado a cada lavagem sob as mesmas

condições anteriores. Posteriormente, o material foi lavado em acetona a 80% por

duas vezes, seguido da secagem do pellet à temperatura ambiente. Em seguida, o

pellet foi ressuspendido em 300 μL de tampão de reidratação (Ureia 7 M, Tioureia 2

M, CHAPS a 2%, Azul de Bromofenol a 0,002%). No final, as proteínas das

amostras foliares foram estocadas em freezer a - 20ºC até o momento de seu uso.

3.5.2 Quantificação de proteínas totais e eletroforese em gel SDS-PAGE

Os extratos proteicos obtidos foram quantificados com o 2D Quant Kit (GE

Healthcare Life Sciences), seguindo as recomendações do fabricante. O padrão

utilizado foi diferentes concentrações do soro de albumina bovina (BSA), que serviu

como base para gerar uma curva padrão de dosagem para a quantificação das

amostras foliares de T. cacao. Tanto a cuva quanto as amostras foram preparadas

em triplicata, usando microtubos do tipo eppendorf de 2 mL. Inicialmente, foi

adicionado a todos os microtúbos (padrão e amostras) 100 μL de solução

22

precipitante. Logo após, foram adicionados 2 μL das amostras ressuspensas em

tampão de reidratação e as concentrações correspondentes do padrão aos

microtubos da curva, sendo brevemente homogeneizados em vortex.

Posteriormente, foram adicionados 100 μL de solução co-precipitante a cada

microtubo, seguido de homogeneização por inversão. Imediatamente após, os

microtubos foram submetidos à centrifugação a 4 ºC por 15 min a 14.000 x g,

seguido do descarte completo do sobrenadante. Ao pellet foram adicionados 20 μL

de solução de cobre e 80 μL de água destilada e autoclavada, seguido de

homogeneização em vortex, para dissolução do precipitado. Logo após, foram

adicionados 200 μL do “reagente de cor de trabalho” (Reagente A + reagente B) em

todos os eppendorfs e a solução formada foi incubada por 15 a 20 min a

temperatura ambiente. Em seguida, as soluções foram transferidas para microplacas

ELISA e submetidas à leitura em espectrofotômetro (480nm), gerando uma curva

padrão com os valores obtidos referentes à concentração de proteínas nas

amostras.

Logo após as amostras foram analisadas e observadas por mini gel SDS-

PAGE (Dodecil Sulfato de Sódio - Eletroforese em Gel de Poliacrilamida) em

minicubas de eletroforese (Omniphor), com géis de 8 x 10 cm, contendo 12,5% de

acrilamida. Foram utilizados 10 µg de cada amostra e a partir deste gel foi possível

observar o perfil de bandas de proteínas totais.

3.5.3 Focalização isoelétrica

Esta etapa consiste em separar as proteínas pelo seu ponto isoelétrico, ou

seja, as proteínas irão migrar por um gradiente até o ponto em que suas cargas

líquidas irão se igualar a zero. Para tanto, foi necessário um total de 350 μg de

proteínas, previamente solubilizadas em tampão de reidratação, no qual foi

adicionado ditiootreitol (DTT), na concentração de 50 mmol L-1 e 0,5 % de anfólitos

para pH 3-10 não linear (NL) (Amersham Bioscienses). A esta solução foi adicionado

mais tampão de reidratação (quando necessário) até atingir o volume de 250 μL.

Logo após, as amostras proteicas, em triplicatas, foram pipetadas em suporte

específico para focalização, os chamados “sarcófagos” (strip holder), de forma que

23

as extremidades positivas e negativas, dentro dos mesmos, fossem conectadas pela

solução. Posteriormente, as tiras de gel (strips), com gradiente de pH imobilizado 3-

10 NL, 13 cm (Immobiline Dry Strip Gel), foram colocadas, com o auxílio de uma

pinça metálica, em contato direto com a amostra. Em seguida, foi adicionado 1 mL

de óleo mineral (Dry Strip Cover Fluid) sobre as strips para evitar possível

desidratação das mesmas. Os strip holders foram transferidos para o equipamento

de focalização isoelétrica Ettan IPGphor III (GE Healthcare), controlado pelo

software Ettan IPGphor III, com as seguintes configurações: tempo de reidratação de

12 h a 20 °C; condições de corrida: 500 Vh por 1 h, 1000 Vh por 1: 04 h, 8000 Vh

por 2:30 h e 8000 Vh por 40 min.

3.5.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida

As strip, antes de serem submetidas à corrida eletroforética, foram

preparadas para a eletroforese em gel de poliacrilamida, sendo transferidas, ao

término da focalização, para tubos de ensaio, onde foram adicionados 7 mL de

tampão de equilíbrio [uréia a 6 M, Tris-HCl (75 mmol L-1, pH 8,8), glicerol a 30 %,

SDS a 2% e azul de bromofenol a 0,002%, contendo DTT 10 mg mL-1], sendo

equilibradas por agitação suave durante 15 min. Essa fase ajuda a reduzir as pontes

de dissulfeto presentes nas proteínas em conformação terciária e quaternária. A

solução contendo DTT foi descartada em recipiente adequado e uma nova solução

de tampão de equilíbrio, contendo iodoacetamida a 25 mg mL-1, foi adicionada aos

tubos de ensaio e então agitadas suavemente por mais 15 min. Nesta etapa, as

proteínas serão alquiladas. Novamente, a solução foi descartada e a terceira etapa

de equilíbrio foi iniciada, adicionando 7 mL de tampão de corrida 1X (Tris a 0,25 M,

glicina a 1,92 M, SDS a 1%, pH 8,5) aos tubos de ensaio, seguido de agitação por

15 min.

Posteriormente, foi realizada a etapa da eletroforese em gel de poliacrilamida,

onde as proteínas foram separadas de acordo o seu peso molecular. Para este

procedimento, os géis foram submetidos à corrida eletroforética em cuba de

eletroforese SE 600 Ruby (GE Healthcare). Os géis de poliacrilamida a 12,5% foram

confeccionados em triplicata para cada tratamento, utilizando soluções de

24

acrilamida/bisacrilamida a 30 % (29,2 g de acrilamida e 0,8 g de N-metil-bis-

acrilamida), tampão de resolução 1X (Tris-HCl a 0,375 mol L-1, pH 8,8, SDS a 0,1%),

60 μL de persulfato de amônio a 10 % e 6 μL de TEMED (N,N,N',N'-

Tetrametiletilenodiamina). Após a polimerização, foi transferido, aproximadamente, 1

mL de solução selante de agarose (TRIS Base a 25 mmol L-1, glicina a 192 mmol L-1,

SDS a 0,1%, agarose a 0,5% e azul de bromofenol a 0,002%) aos géis, e sobre

esta, um pedaço de papel filtro contendo o marcador de peso molecular Amersham

Low Molecular Weight SDS Calibration Kit for SDS electrophoresis (GE Healthcare).

Em seguida, as strips foram dispostas na parte superior do gel, sendo as

extremidades positivas direcionadas a mesma posição. Logo após, adicionou-se,

então, mais da solução selante até que esta cobrisse toda a strip. Procedeu-se, em

seguida, com a montagem da cuba e a adição de tampão de corrida 1X (Tris Base a

25 mol L-1, glicina a 0,192 mol L-1, dodecil sulfato de sódio – SDS a 1%). Com as

strips prontas e já na cuba, iniciou-se a corrida, seguindo os seguintes parâmetros:

15 mA/gel por 15 min, 40 mA/gel por 30 min e, por fim, 50 mA/gel por 4 h ou até que

ocorresse toda a migração da amostra no gel, que foi acompanhada observando o

deslocamento do selante, assim como do marcador no gel. Imediatamente após, os

géis foram retirados da cuba e fixados em tampão de fixação (etanol a 40 % e ácido

acético a 10 %) por 1 h, seguido da retirada do tampão de fixação e adição de

corante azul de coomassie coloidal (sulfato de amônio a 8 %, ácido fosfórico a

0,08%, Coomassie Blue G-250 a 0,08% e metanol a 20%). Posteriormente, os géis

ficaram corando por cinco a sete dias, com o auxilio de um agitador. Passado este

período, o corante foi devolvido para reutilização e iniciou-se a etapa de lavagens

dos géis com água destilada e autoclavada pelo mesmo período de tempo, sendo

realizadas lavagens diárias e quantas vezes fossem necessárias. Depois de

descorados, os géis foram imersos em solução de ácido acético a 7%, para

conservação dos mesmos até que fossem realizadas as análises seguintes.

3.5.5 Análise dos géis pelo Software Image Master

Nesta etapa, os géis foram digitalizados pelo LabScanner (Amersham

Bioscince) e enviados para o software Image Master 2D Platinum 7.0 (GE

25

healthcare), para posteriores análises. Este programa permite que seja analisada a

quantidade de spots em cada tratamento nos géis bem como o nível em que estes

spots foram expressos. Caracteriza valores de ponto isoelétrico e peso molecular,

permite fazer marcação de cada spot individualmente, além de ser possível

especificar, através de análises, quais spots serão excisados dos géis

posteriormente (diferenciais e exclusivos). As análises foram realizadas dentro de

ambos os genótipos submetidos a déficit hídrico severo no solo, sendo comparados

os diferentes tratamentos com doses de K (200 e 400 mg dm-3 solo), considerando a

dose de 200 mg K dm-3 solo como controle. Os géis foram feitos em triplicata para

cada tratamento, a fim de aumentar a sua reprodutibilidade. Além disso, em cada

triplicata um gel foi escolhido como referência. Todos os géis, dentro de genótipo,

foram sobrepostos para que os spots fossem reconhecidos automaticamente pelo

programa, seguido de algumas modificações manuais. O cálculo de ANOVA foi

utilizado para identificar os perfis proteicos entre os diferentes géis, sendo

considerando valores de p≤ 0,05.

3.5.6 Excisão dos spots e extração de peptídeos

Os spots (diferenciais e exclusivos) de cada tratamento foram excisados do

gel e fragmentados com o auxílio de um bisturi. Logo após, foram descorados com

200 μL NH4HCO3 a 25 mM, contendo acetonitrila a 50%, overnight. O sobrenadante

foi descartado e os fragmentos de gel foram lavados com 200 μL de água Milli-Q e,

posteriormente, desidratados em 100 μL de acetonitrila a 100 % por 10 min, a

temperatura ambiente. Logo após, foram secos usando centrífuga a vácuo no

Concentrator 5301 (Eppendorf) por 20 min. Após secagem, foram adicionados 4 μL

de solução gelada de tripsina Gold (Promega) a 25 ng/μL, e deixados a 4 ºC por 10

min, para absorção da mesma nos fragmentos de gel. Feito isso, foi adicionado uma

solução de NH4HCO3 a 25 mM até cobrir o gel, seguido de encubação a 37 ºC por

16 a 24 h para ação da tripsina. Para a extração peptídica, o sobrenadante de cada

tubo foi coletado e transferido para um novo set de tubos. Em seguida, foram

realizadas duas lavagens com 50 μL de acetonitrila a 50% contendo ácido fórmico a

5 %, sob agitação durante 30 min em termomix Thermo Finemixer (SH2000-DX). Ao

26

final de cada lavagem, os sobrenadantes foram adicionados aos tubos eppendorfs

novos. Ao término da extração, as amostras tiveram o volume reduzido a vácuo até

atingir aproximadamente 30 μL.

3.5.7 Análise por espectrometria de massas (MS/MS) e identificação das

proteínas

Os peptídeos foram analisados por cromatografia de fase-reversa no

nanoAcquity UPLC (WATERS) em duas colunas C18, sendo a primeira uma coluna

”trapping” de 5 μm, 180 μm x 20 mm e a segunda de 1,7 μm 100 μm x 100 mm, sob

um fluxo de 0,6 μL min-1 em uma corrida de 50 min, onde foram coletados 4 μL de

cada amostra.

Os peptídeos foram separados de acordo com um gradiente de acetonitrila,

sendo de 1% até 1 min, de 1% a 50% em 40 min, de 50% a 85% em 5 min,

mantendo-se nessa concentração por mais 2 min, voltando à concentração de 1%

em 1 min e permanecendo nessa condição por 2 min, totalizando 50 min de corrida.

Os peptídeos separados foram ionizados em um capilar sob voltagem de 3000 V

(Micromass Q-TOFmicro), fragmentados no modo positivo com seleção da

intensidade relativa mínima de 10 counts, sendo analisados os 3 íons mais intensos

por cada varredura de 1 s, com energia de colisão variando entre 20 e 95 eV de

acordo com a relação massa/carga (m/z) dos peptídeos.

Os espectros gerados a partir das análises por espectrometria de massas

foram analisados utilizando o software ProteinLynx v 2.3 e comparados contra o

banco de dados do NCBI, por meio da ferramenta MASCOT MS/MS Ion Search

(www.matrixscience.com), As sequências FASTA geradas foram analisadas no

software BLAST2GO (http://www.blast2go.com), o qual forneceu informações

importantes, como ontologia, funções, processos biológicos e localização celular.

3.6. Metabolismo antioxidativo

Para as análises da atividade enzimática, foram usadas amostras foliares

liofilizadas, de ambos os genótipos de T. cacao, cujo tecido vegetal foi macerado em

27

nitrogênio líquido. Logo após, foram pesados 40 mg do macerado em balança

analítica (SHIMADZO – AUW 220), seguido da adição de 0,07 g de PVPP/g de

tecido, para evitar a oxidação do mesmo. Posteriormente, o macerado foi

ressuspenso em 800 μL tampão de extração (específico para cada enzima) e

agitado em vórtex. Em seguida, as amostras foram sonicadas em ultrassonicador de

sonda (Gex 130, 130 W) sob amplitude de 70 %, 10 pulsos de 5 s, com intervalos de

10 s, e submetidos à centrifugação de 14.000 x g por 10 min a 4 °C. Após, o

sobrenadante foi coletado para um novo tubo, obtendo-se o extrato bruto, o qual foi

imediatamente usado. Os ensaios enzimáticos foram realizados no

espectrofotrômetro de microplacas Espectramax Paradigm (Molecular Devices).

5.6.1 Atividade da dismutase do superóxido (SOD) EC: 1.15.1.1

A atividade da enzima SOD foi determinada de acordo Gianopolitis e Ries

(1977) com modificações. A unidade de atividade foi calculada para medir a

capacidade da enzima de inibir 50% da redução fotoquímica do nitroazul de

tetrazólio (NBT), que leva a formação do precipitado formazana azul. Foi utilizado 30

µL do extrato bruto, em tampão de extração, que continha fosfato de potássio a 50

mM, pH 7,8, EDTA (1mM) e metionina a 13 mM. A atividade enzimática teve início

com a adição de riboflavina (1 mM). A primeira leitura ocorreu após a placa ter sido

mantida no escuro por 10 min, e a segunda leitura foi realizada após a placa ter sido

submetida à luz fluorescente de 15 W por mais 20 min. Os brancos foram os poços

que não continham extrato vegetal. As leituras foram lidas em quadruplicatas em

comprimento de onda de 560 nm.

5.6.2 Atividade de peroxidase do arcosbarto (APX) EC:1.11.1.11

A atividade da enzima APX foi realizada de acordo com a metodologia

descrita por Nakano e Asada (1981), com modificações. O tampão para a reação

utilizado foi o de fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,0, acrescido de ascorbato a

0,5mM, EDTA a 0,1mM e H2O2 a 0,1mM. Na reação, a presença da APX no extrato

vegetal (20 μL) reduz a concentração de H2O2 do meio, em função da redução de

28

ácido ascórbico adicionado. O decaimento foi acompanhado no comprimento de

onda de 290 nm por 300 s, com leituras a cada 30 s, numa temperatura de 30ºC. A

análise foi feita em quadruplicata e os valores expressos em mmol H2O2 g-1 MS min-

1.

5.6.3 Atividade de peroxidase do guaiacol (GPX) EC: 1.11.1.7

A determinação da atividade da enzima GPX foi avaliada de acordo com a

metodologia descrita por Pirovani et al. (2008) baseada no aumento do consumo de

guaiacol em μmol s-1 g-1 MS. O tampão de reação utilizado foi composto por fosfato

de sódio a 50 mmol L-1 (pH 6,0), guaiacol a 40 mmol L-1 e peróxido de hidrogênio a

0,06 %. Nesta solução foi adicionado 30 μL do extrato bruto. As leituras de

absorbância foram realizadas em quadruplicadas em comprimento de onda de 470

nm, a 25°C. O consumo de guaiacol, em mmol h-1 g-1 MS, foi calculado com o uso da

equação y= 0,01890 + 1284x (R2 = 0,99) (Rehem et al. 2011) originada a partir de

uma curva padrão para peroxidase-guaiacol.

5.6.4 Atividade da fenilalanina amônialiase (PAL) EC: 4.3.1.5

A atividade da enzima PAL foi realizada com base na diferença de

absorbância resultante da conversão da fenilalanina em ácido trans-cinâmico, como

descrito por Hyodo et al. (1978). Para essa determinação, foi preparado o extrato

enzimático, onde as amostras liofilizadas foram maceradas e a elas adicionou-se

800 μL de tampão borato de sódio a 100 mM, pH 7,0, seguido de sonicação. Logo

após, os extratos foram centrifugados e encubados em banho Maria a 40°C por 1 h.

Logo, em seguida, os sobrenadantes foram utilizados para avaliar a atividade PAL.

Para isto, pipetou-se 50 μL do extrato bruto em tampão de reação contendo borato

de sódio a 100 mM, pH 8,8 e L-fenilalanina a 12 mM. As leituras

espectrofotométricas foram realizadas em quadruplicatas por tratamento e os

brancos não continham L-fenilalanina (tampão borato de sódio a 100 mM). O

comprimento de onda utilizado foi de 290 nm.

29

3.7. Delineamento experimental e análise estatística

O experimento foi conduzido em condições de casa de vegetação em

delineamento experimental inteiramente casualizado com 4 tratamentos (2 genótipos

de T. cacao e 2 doses de K) e 5 repetições, com 10 plantas por unidade

experimental e uma planta por vaso. Fez-se análise de variância e comparação de

média dos tratamentos pelo teste de Tukey (p≤ 0,05), quando necessário.

30

RESULTADOS

4.1. Eficiência da extração de proteínas por meio de SDS-PAGE

Os perfis proteicos em SDS-PAGE tiveram bandas bem definidas, com boa

separação, não apresentando arrasto, o que prejudicaria a observação das

proteínas no gel, confirmando assim, a eficiência do método de extração utilizado

(Figura 1). O rendimento proteico para todos os tratamento foi ajustado para 2,0 μg

de proteínas por μL de amostra. Pôde-se observar no genótipo CC 40 (intolerante)

submetidos às doses de K (200 e 400 mg dm-3 solo) e déficit hídrico severo, uma

distribuição de bandas por todo o gel, o que evidencia a variedade de proteínas

extraídas com um acúmulo proteico nas faixas de 66 e 45 KDa (Figura 1). Ao avaliar

a distribuição das proteínas no genótipo PA 13 (tolerante), submetido aos mesmos

tratamentos, verificou-se também uma distribuição uniforme pelo gel. No entanto, os

perfis proteicos se diferenciaram visivelmente na intensidade das bandas, conforme

o genótipo, sendo que o tratamento com dose superior de K induziu o maior acúmulo

de proteínas totais para ambos os genótipos de T. cacao (amostras 2 e 4).

31

Figura 1 - Perfil proteico de amostras foliares de genótipos de T. cacao

contrastantes para a tolerância à seca, submetidos a duas doses de K e a deficiência hídrica severa no solo. M - marcador de peso molecular (14 - 97 KDa) GE Healthcare; 1 – CC 40 submetido a 200 mg K dm-3 solo; 2 – CC 40 submetido a 400 mg K dm-3 solo; 3 – PA 13 submetido a 200 mg K dm-3 solo; 4 – PA 13 submetido a 400 mg K dm-3 solo.

4.2. Perfis de spots do genótico CC 40, submetido a doses de 200 e 400 mg K

dm-3 e deficiência hídrica severa no solo, obtidos por meio de

eletroforese bidimensional (2D-PAGE)

Com a confirmação da integridade das amostras e eficiência da extração

protéica, evidenciadas em SDS- PAGE, as amostras de proteínas foliares de todos

os tratamentos foram submetidas à separação bidimensional com uma massa final

de 350 µg de proteínas por gel (Figura 2). Os spots se apresentaram bem

focalizados, sem a presença de arraste horizontal ou vertical. A partir do perfil

proteico obtido foi possível detectar, para o genótipo intolerante à deficiência hídrica

no solo (CC 40), 335 e 252 spots para os tratamentos com 200 e 400 mg K dm-3

32

solo, respectivamente (Figura 2 A e B). Também foi possível, por meio do diagrama

de Venn (Figura 3), obter uma comparação entre os tratamentos dentro do mesmo

genótipo, onde, para o este genótipo submetido a 200 mg K dm-3 solo, foram

detectados 172 spots exclusivos, quando comparado com o tratamento de 400 mg K

dm-3 solo, o qual gerou 89 spots exclusivos. Nesta comparação, 114 spots foram

comuns e 49 diferencialmente acumulados entre os dois tratamentos.

Figura 2 - Perfil proteico bidimensional de amostras foliares do genótipo de T. cacao CC 40, submetido a 200 (A) e 400 mg K dm-3 solo (B) e a deficiência hídrica severa no solo. Onde KDa corresponde à massa molecular e pI o ponto isoelétrico de cada spot, variando em 3-10 NL (não linear).

33

Figura 3 - Diagrama de Venn mostrando a distribuição dos spots proteicos de

amostras foliares detectados nos géis 2-D para o genótipo de T. cacao CC 40, submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa.

4.3. Perfis de spots do genótico PA 13, submetido a doses de 200 e 400 mg K

dm-3 e deficiência hídrica severa no solo obtidos por meio de

eletroforese bidimensional (2D-PAGE)

As amostras de proteínas foliares do genótipo tolerante (PA 13), também,

foram submetidas à separação bidimensional com massa final de 350 µg de

proteínas por gel (Figura 4). Os spots se mostraram bem focalizados, sem a

presença de arrastes. A partir do perfil proteico obtido, foi possível detectar, para o

genótipo PA 13, 202 e 261 spots para o tratamento com 200 e 400 mg K dm-3 solo,

respectivamente (Figura 4 A e B). Com o diagrama de Venn (Figura 5), fez-se a

comparação entre os diferentes tratamentos para este genótipo. Ao comparar as

proteínas detectadas no tratamento com 200 mg K dm-3 solo, verificou-se que 123

spots foram exclusivos para o tratamento e que 182 spots foram exclusivos para o

34

tratamento com 400 mg K dm-3 solo, ao passo que 59 spots foram comuns e, destes,

20 spots foram diferencialmente acumulados entre os tratamentos.

Figura 4 - Perfil proteico bidimensional de amostras foliares do genótipo de T. cacao

PA 13 submetido a 200 (A) e 400 mg K dm-3 solo (B) e a deficiência hídrica severa no solo. Onde KDa corresponde à massa molecular e pI o ponto isoelétrico de cada spot, variando em 3-10 NL (não linear).

35

Figura 5 - Diagrama de Venn mostrando a distribuição dos spots proteicos de

amostras foliares detectados nos géis 2-D para o genótipo de T. cacao PA 13, submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.

4.4. Avaliação da distribuição dos spots no gel 2-D quanto a massa

molecular (MM) e o ponto isoelétrico (pI)

A avaliação da distribuição dos spots em relação à MM e pI foi realizada em

todos os tratamentos para ambos os genótipos de T. cacao avaliados. Em relação a

MM, a maioria dos spots detectados nos géis foi visualizada na faixa de 30 a 60 kDa,

tanto para o genótipo CC 40 (intolerante) quanto para PA 13 (tolerante) (Figuras 6 e

7, respectivamente).

36

Figura 6 - Distribuição dos spots proteicos, detectados nos mapas 2-D, de acordo

com a massa molecular (MM), para o genótipo de T. cacao CC 40 submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.

Figura 7 - Distribuição dos spots proteicos, detectados nos mapas 2-D, de acordo

com a massa molecular (MM), para o genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.

37

Quanto ao pI dos spots, detectados para os dois genótipos, verificou-se, para

o genótipo CC 40 (intolerante), que a maior parte deles foi visualizado entre os

valores de 5 a 7, com destaque para o tratamento com 200 mg K dm-3 solo, que teve

a maior percentagem de spots na faixa de pH 5 a 7, sendo mais predominantes na

faixa de pH ácido (Figura 8). Em contrapartida, para o genótipo PA 13 (tolerante), a

grande maioria dos spots se concentrou na faixa de pH, que variou de 4 a 6, com

ênfase para o tratamento com 200 mg K dm-3 solo, que teve a maior percentagem

de spots em pH 5 a 6 (Figura 9).

Figura 8 - Distribuição dos spots proteicos, detectados nos mapas 2-D, de acordo com o ponto isoelétrico (pI, 3-10 não linear), para o genótipo de T. cacao CC 40 submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.

38

Figura 9 - Distribuição dos spots proteicos, detectados nos mapas 2-D, de acordo

com o ponto isoelétrico (pI, 3-10 não linear), para o genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.

4.5. Identificação das proteínas

Os géis 2-D de cada tratamento foram analisados utilizando-se o Image

Master 7.0. O objetivo desta análise foi identificar os spots comuns, exclusivos e

diferenciais de cada tratamento. De acordo com o programa, seguido de algumas

alterações manuais, foi possível detectar aproximadamente 1.050 spots (entre

comuns, diferenciais e exclusivos) e 704 spots, dos quais foram excisados dos géis

os spots exclusivos e diferencialmente acumulados de cada tratamento (200 e 400

mg K dm-3 solo) para as análises por espectrometria de massas. A partir das

proteínas identificadas, foi possível compreender a influência do K sobre o

metabolismo da planta submetida à deficiência hídrica severa no solo.

Foram submetidos à espectrometria de massas os spots exclusivos e

diferencialmente acumulados. Das proteínas identificadas, as que foram

estatisticamente significativas (p≤ 0,05 e variação de intensidade (fold) ≥ 2,0), tanto

Infectado

Infec + SAC

Infec + GLI

Infec + AS

39

para CC 40 quanto para PA 13, foram somando 232 proteínas. Para o genótipo

intolerante (CC 40) a deficiência hídrica no solo foram identificadas 97 proteínas, ao

passo que para o genótipo tolerante (PA 13) foram identificadas 135 proteínas, entre

exclusivas e diferencialmente acumuladas, gerando, portanto, quatro listas, uma

para cada genótipo submetido a doses de K e a deficiência hídrica severa no solo

(Tabela 1, 2, 3 e 4). Nas séries de comparações entre as proteínas diferencialmente

acumuladas, a partir da dose superior de K, verificou-se a presença de 11 e 4

proteínas up reguladas para o genótipo CC 40 e PA 13, respectivamente. As

proteínas listadas apresentaram homologia com sequências proteicas encontradas

no banco de dados do NCBInr, por meio da ferramenta MASCOT MS/MS Ion

Search.

40

Tabela 1 - Proteínas exclusivas do genótipo de T. cacao CC 40 (intolerante) submetido a 200 mg K dm-3 solo e a deficiência

hídrica severa no solo; e proteínas diferencialmente acumuladas entre as doses de K, identificadas por espectrometria de massas (MS/MS), resultantes de amostras foliares coletadas.

N° SPOT N° ACESSO NOME DA PROTEÍNA MM1 pl2 N3 SCOR4

PROCESSOS METABÓLICOS

(BIOSSÍNTESE E CATABOLISMO)

2 GLNA4_PHAVU Glutamine synthetase leaf isozyme, chloroplastic OS** 47502 6.77 2 158

5 GLGS_ARATH Glucose-1-phosphate adenylyltransferase small* 56957 6.13 6 210

6 MDHG_CUCSA Malate dehydrogenase, glyoxysomal OS** 38057 8.82 15 241

8 XP_017980600.1 PREDICTED: phosphoglycerate kinase, chloroplastic** 51447 8.49 7 522

24 CDP02122.1 Unnamed protein product* 42623 8.44 1 97

31 EOX97285.1 Malate dehydrogenase isoform 1* 41725 9.00 10 592

32 EOY03376.1 Voltage dependent anion channel 1* 29642 8.39 5 418

35 RNS6_PYRPY Ribonuclease S-6 OS* 26783 9.17 15 72

125 EOX97859.1 Fructose-bisphosphate aldolase 1* 43279 8.43 7 485

132 EFTUA_NICSY Elongation factor TuA, chloroplastic OS* 52152 6.34 1 70

136 EOY32823.1 Alanine:glyoxylate aminotransferase isoform 1* 44620 7.62 10 699

159 EOY02403.1 Carbonic anhydrase 1 isoform 2* 35284 8.35 17 854

382 GME_ARATH GDP-mannose 3,5-epimerase OS 43130 5.85 6 137

385 TRMB_ROSDO tRNA (guanine-N(7)-)-methyltransferase OS 26515 9.54 14 77

41

PROCESSOS FOTOSSINTÉTICOS

44 AAB01121.1 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,

partial (chloroplast)* 53250 5.74 4 242

74 EOX93083.1 Photosystem II subunit P-1* 28666 8.65 22 871

77 FTSH2_ORYSJ ATP-dependent zinc metalloprotease FTSH 2, chloroplastic OS* 72607 5.54 28 555

87 RPE_ORYSJ Ribulose-phosphate 3-epimerase, chloroplastic OS* 29248 8.65 4 139

88 RRF_SACD2 Ribosome-recycling factor OS=Saccharophagus degradans* 20655 5.59 13 54

95 ATPB_COFAR ATP synthase subunit beta, chloroplastic OS* 53690 5.36 2 52

100 CYSK_CITLA Cysteine synthase OS** 34492 6.25 2 65

103 PSBO_SOLTU Oxygen-evolving enhancer protein 1, chloroplastic OS* 35595 5.84 3 75

108 PST2_GOSHI Photosystem II 5 kDa protein, chloroplastic* 11173 10.37 4 55

126 ATPG_VIGUN ATP synthase subunit gamma, chloroplastic (Fragment) OS* 13130 4.64 1 78

131 EOY17906.1 Sedoheptulose-bisphosphatase** 42692 6.56 16 674

144 ATPB_EUCGG ATP synthase subunit beta, chloroplastic OS** 53752 5.29 103 3202

148 YP_004021323.1 ATP synthase CF1 beta subunit** 53693 5.29 27 1291

259 gi|590602386 Light harvesting complex of photosystem II 5 isoform 1 31139 5.74 2 135

345 ATPBM_HEVBR ATP synthase subunit beta, mitochondrial OS 60335 5.95 5 153

323 ATPA_AMBTC ATP synthase subunit alpha, chloroplastic OS 55387 5.25 3 118

340 MUTS2_LEUCK Endonuclease MutS2 OS 87706 5.68 3 42

383 gi|590562472 Sedoheptulose-bisphosphatase 42692 6.56 10 348

42

RESPOSTAS DE DEFESA E ESTRESSE

46 CPNB3_ARATH Chaperonin 60 subunit beta 3, chloroplastic OS** 63627 5.73 19 552

37 GBLPA_ARATH Receptor for activated C kinase 1A OS* 36124 7.62 6 141

264 CPNB3_ARATH Chaperonin 60 subunit beta 3, chloroplastic OS 63627 5.73 9 244

348 CH60B_ARATH Chaperonin CPN60-like 1, mitochondrial OS 62339 6.37 3 52

372 ARGI1_ARATH Arginase 1, mitochondrial OS 37549 6.11 8 146

PROTEÍNAS DE OXIDORREDUÇÃO

93 G3P_PHARH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase OS* 36288 5.79 2 82

54 XP_017974137.1 PREDICTED: 2-methylene-furan-3-one reductase* 34118 5.71 6 498

319 PRXQ_POPJC Peroxiredoxin Q, chloroplastic OS 23516 9.62 11 275

112 EOY16019.1 Annexin 1* 36094 6.34 3 186

OUTRAS FUNÇÕES

65 ASP_THECC 21 kDa seed protein OS** 24430 5.7 3 53

408 RK34_CYAPA 50S ribosomal protein L34, cyanelle 5426 12.31 59 70

409 gi|78498932 high molecular weight glutenin, partial 977 10.99 18 65 1MM, corresponde aos valores de massa molecular (kDa);

2pI ao ponto isoelétrico estimados pelo programa Image Master 2D Platinum 7.0;

3N, corresponde

ao número de peptídeos sequenciados por MS/MS; 4Score corresponde ao valor da cobertura calculada pelo Mascot.

* Proteínas diferencialmente acumuladas e “down-regulation” entre os tratamentos com doses de K. **Proteínas “up-regulation” nos tratamento com dose superior de K (400 mg dm

-3 solo).

43

Tabela 2 - Proteínas exclusivas do genótipo de T. cacao CC 40 (intolerante) submetido a 400 mg K dm-3 solo e a deficiência

hídrica severa no solo, identificadas por espectrometria de massas (MS/MS), resultantes de amostras foliares coletadas.

N° SPOT N° ACESSO NOME DA PROTEÍNA MM1 pl2 N3 SCOR4

PROCESSOS METABÓLICOS

(BIOSSÍNTESE E CATABOLISMO)

161 BCA3_ARATH Beta carbonic anhydrase 3 OS 29217 6.54 3 100

178 EOY18135.1 Triosephosphate isomerase isoform 1 32446 8.05 3 193

195 JAU15757.1 50S ribosomal protein L6, chloroplastic 24948 9.94 1 94

211 XP_007026120.1 Predicted: aminomethyltransferase, mitochondrial 44708 8.86 2 130

214 RPOK_METAC DNA-directed RNA polymerase subunit K OS 6615 9.86 6 70

222 XP_008787626.1 Predicted: low quality protein: DNA ligase 6-like 158222 6.94 1 54

PROCESSOS FOTOSSINTÉTICOS

241 RPE_ORYSJ Ribulose-phosphate 3-epimerase, chloroplastic OS 29244 8.65 1 85

242 Q9XQJ6.1 Ribulose bisphosphate carboxylase large chain 52553 6.24 6 426

246 RBL_SOLBU Ribulose bisphosphate carboxylase large chain OS 53397 6.55 21 406

RESPOSTAS DE DEFESA E ESTRESSE

184 BLUF_ECOLI Blue light- and temperature-regulated antirepressor BluF OS 45551 5.04 1 46

PROTEÍNAS DE OXIDORREDUÇÃO

200 SARED_ESCCA Sanguinarine reductase OS 29615 4.97 6 231

207 G3PB_ARATH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPB, chloroplastic

OS 48086 6.33 2 49

44

OUTRAS FUNÇÕES

168 UVRC_CLOK5 UvrABC system protein C OS 72913 9.16 2 43

212 RADL3_ARATH Protein RADIALIS-like 3 OS 9357 8.15 1 43 1MM, corresponde aos valores de massa molecular (kDa);

2pI ao ponto isoelétrico estimados pelo programa Image Master 2D Platinum 7.0;

3N, corresponde

ao número de peptídeos sequenciados por MS/MS; 4Score corresponde ao valor da cobertura calculada pelo Mascot.

45

Tabela 3 - Proteínas exclusivas do genótipo de T. cacao PA 13 (tolerante) submetido a 200 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica

severa no solo; e proteínas diferencialmente acumuladas entre as doses de K, identificadas por espectrometria de massas (MS/MS), resultantes de amostras foliares coletadas.

N° SPOT N° ACESSO NOME DA PROTEÍNA MM1 pl2 N3 SCOR4

PROCESSOS METABÓLICOS

(BIOSSÍNTESE E CATABOLISMO)

0 XP_017971644.1 PREDICTED: glutamate--glyoxylate aminotransferase 2 isoform X1 53956 5.68 11 866

12 GGT1_ARATH Glutamate--glyoxylate aminotransferase 1 OS* 53780 6.49 3 69

33 YP2_CAEEL Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase 2 OS* 18808 8.23 6 157

55 EOY14797.1 Isoflavone reductase-like protein 4 isoform 1** 34864 6.16 11 918

61 GGT1_ARATH Glutamate--glyoxylate aminotransferase 1 OS** 53780 6.49 1 74

71 GLNA4_PHAVU Glutamine synthetase leaf isozyme, chloroplastic OS* 47502 6.77 2 89

75 KPPR_ARATH Phosphoribulokinase, chloroplastic OS* 44721 5.71 24 790

76 MDHG_CUCSA Malate dehydrogenase, glyoxysomal OS* 38057 8.82 15 241

288 SERC_DROME Probable phosphoserine aminotransferase OS 39686 8.25 1 40

302 EOY02403.1 Carbonic anhydrase 1 isoform 2 35284 8.35 15 852

308 EOY18135.1 Triosephosphate isomerase isoform 1 32446 8.05 2 188

364 EOY32823.1 Alanine:glyoxylate aminotransferase isoform 1 44620 7.62 4 275

365 EOX97859.1 Fructose-bisphosphate aldolase 1 43279 8.43 8 695

367 EOY15532.1 Serine hydroxymethyltransferase 2 isoform 1 57172 8.58 5 370

368 EOX91867.1 Serine transhydroxymethyltransferase 1 isoform 2 47274 9.01 7 494

46

PROCESSOS FOTOSSINTÉTICOS

8 P2SAF_ORYSJ Photosystem II stability/assembly factor HCF136, chloroplastic OS* 45498 9.02 17 690

13 ATPA_GOSHI ATP synthase subunit alpha, chloroplastic OS* 55437 5.25 19 567

20 CYSK_CITLA Cysteine synthase OS** 34492 6.25 2 65

38 EOX93083.1 Photosystem II subunit P-1* 26979 8.65 7 596

51 RBL_ANEME Ribulose bisphosphate carboxylase large chain (Fragment)** 46840 6.57 1 53

261 XP_007034724.1 PREDICTED: photosystem I reaction center subunit II, chloroplastic 23284 9.60 5 409

276 AGL10062.1 Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,

partial (plastid) 40855 6.57 1 64

299 EOX93083.1 Photosystem II subunit P-1 28666 8.65 5 438

342 RUB1_BRANA RuBisCO large subunit-binding protein subunit alpha, chloroplastic

(Fragment) 57714 4.84 17 673

345 XP_007044097.1 PREDICTED: ATP-dependent zinc metalloprotease FTSH 2,

chloroplastic 74454 6.11 7 574

RESPOSTAS DE DEFESA E ESTRESSE

35 KHG19313.1 Proteasome subunit beta type-2-A -like protein* 22648 5.85 2 136

290 EOY33876.1 HSP20-like chaperones superfamily protein 17796 5.97 1 78

321 EFTU_SULMW Elongation factor Tu OS 43892 6.44 1 52

339 CH60A_ARATH Chaperonin CPN60, mitochondrial OS 61584 5.66 6 45

341 EF1A2_DAUCA Elongation factor 1-alpha OS 49629 9.2 8 48

353 XP_017973703.1 PREDICTED: thylakoid lumenal 17.4 kDa protein, chloroplastic 25977 8.72 2 212

47

359 EOY04195.1 Ribulose bisphosphate carboxylase (small chain) family protein

isoform 1 21647 9.22 8 324

377 CAC87366.1 ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase, partial (chloroplast) 52398 6.22 22 890

PROTEÍNAS DE OXIDORREDUÇÃO

285 SODCP_PETHY Superoxide dismutase [Cu-Zn], chloroplastic OS 22418 6.17 3 66

56 XP_017978306.1 PREDICTED: ferredoxin--NADP reductase, leaf isozyme,

chloroplastic 46018 9.02 12 929

296 BAS1_ORYSJ 2-Cys peroxiredoxin BAS1, chloroplastic OS 28311 5.67 8 183

OUTRAS FUNÇÕES

46 EOY07495.1 NAD(P)-binding Rossmann-fold superfamily protein isoform 1* 36499 9.29 3 230

273 PRTS4_SCYCA Protamine S4 OS 4107 11.69 4 47

282 ASP_THECC 21 kDa seed protein OS 24430 5.7 8 96

350 RRF_SACD2 Ribosome-recycling factor OS=Saccharophagus degradans 20655 5.59 13 54

356 YEIN_SCHPO Uncharacterized protein C27E2.14 OS 4173 11.88 14 80

1MM, corresponde aos valores de massa molecular (kDa);

2pI ao ponto isoelétrico estimados pelo programa Image Master 2D Platinum 7.0;

3N, corresponde

ao número de peptídeos sequenciados por MS/MS; 4Score corresponde ao valor da cobertura calculada pelo Mascot.

* Proteínas diferencialmente acumuladas e “down-regulation” entre os tratamentos com doses de K. **Proteínas “up-regulation” nos tratamento com dose superior de K (400 mg dm

-3 solo).

48

Tabela 4 - Proteínas exclusivas do genótipo de T. cacao PA 13 (tolerante) submetido a 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica

severa no solo, identificadas por espectrometria de massas (MS/MS), resultantes de amostras foliares coletadas.

N° SPOT N° ACESSO NOME DA PROTEÍNA MM1 pl2 N3 SCOR4

PROCESSOS METABÓLICOS

(BIOSSÍNTESE E CATABOLISMO)

01 EOY09152.1 Esterase d, s-formylglutathione hydrolase 32165 6.25 2 130

87 XP_008787626.1 PREDICTED: low quality protein: DNA ligase 6-like 158222 6.94 1 58

88 EOY18135.1 Triosephosphate isomerase isoform 1 32446 8.05 8 490

89 EOY02403.1 Carbonic anhydrase 1 isoform 2 35284 8.35 11 600

92 TCPQ_ARATH Complex protein 1 subunit theta OS 59472 5.25 3 60

106 EOY29378.1 Aspartate aminotransferase 50989 8.94 10 433

113 EOY06834.1 Mitochondrial lipoamide dehydrogenase 1 54234 7.23 10 757

129 EOY13706.1 Aldolase-type TIM barrel family protein isoform 1 40802 9.34 9 529

134 EOX97859.1 Fructose-bisphosphate aldolase 1 43279 8.43 3 217

143 RPOB_SORC5 DNA-directed RNA polymerase subunit beta OS 155291 5.4 1 48

146 EOY15112.1 Thioredoxin superfamily protein 52817 9.19 1 57

162 KHG20119.1 Triosephosphate isomerase, cytosolic 18362 5.63 3 162

179 EOX97285.1 Malate dehydrogenase isoform 1 41725 9.00 11 447

184 EOX97859.1 Fructose-bisphosphate aldolase 1 43279 8.43 10 617

197 EOY17906.1 Sedoheptulose-bisphosphatase 42692 6.56 13 660

202 EOX90904.1 Fructose-bisphosphate aldolase 2 isoform 1 43182 8.14 4 185

49

204 AGB05600.1 Fructose-bisphosphate aldolase 3 43094 8.44 5 296

209 EOY16613.1 Alcohol dehydrogenase 1 isoform 1 42553 6.56 6 324

212 XP_017980600.1 PREDICTED: phosphoglycerate kinase, chloroplastic 51447 8.49 13 1002

213 GCST_PEA Aminomethyltransferase, mitochondrial OS 44257 8.79 2 106

215 ADV04491.1 Beta-actin 41924 5.39 7 429

216 GLNA4_PHAVU Glutamine synthetase leaf isozyme, chloroplastic OS 47502 6.67 5 61

220 GME_ARATH GDP-mannose 3,5-epimerase OS 43130 5.85 7 157

221 EOX92230.1 Alanine:glyoxylate aminotransferase 2 isoform 1 53546 8.64 4 350

226 XP_017971644.1 PREDICTED: glutamate--glyoxylate aminotransferase 2 isoform X1 53956 5.68 11 536

241 EOY04747.1 Phosphoglycerate mutase, 2,3-bisphosphoglycerate-independent

isoform 2 48133 5.90 7 407

PROCESSOS FOTOSSINTÉTICOS

10 XP_007033270.1 PREDICTED: ribulose bisphosphate carboxylase small chain,

chloroplastic 21174 9.22 10 349

14 EOY34440.1 RuBisCO large subunit-binding protein subunit alpha isoform 1 64075 5.06 23 1345

91 RBL_MORIN Ribulose bisphosphate carboxylase large chain OS 53091 6 12 341

114 AAM55983.1 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,

partial (chloroplast) 47796 6.97 3 195

122 RUBB_PEA RuBisCO large subunit-binding protein subunit beta, chloroplastic

OS 63287 5.85 20 154

124 ATPB_ACRAL ATP synthase subunit beta, chloroplastic OS 53809 5.29 8 145

50

147 EOX93083.1 Photosystem II subunit P-1 28666 8.65 7 332

149 EOY12785.1 Light-harvesting chlorophyll B-binding protein 3 28713 5.65 3 218

151 EOY08762.1 Mog1/PsbP/DUF1795-like photosystem II reaction center PsbP

family protein 33616 8.81 5 195

154 XP_007039689.1 REDICTED: ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit-

related protein 4, chloroplastic 33379 9.07 6 266

160 EOY16965.1 Light harvesting complex of photosystem II 5 isoform 1 31139 5.74 7 543

186 XP_007026083.1 PREDICTED: ATP synthase gamma chain, chloroplastic 41685 5.57 14 708

240 XP_014660094.1 PREDICTED: low quality protein: ATP synthase subunit beta,

chloroplastic-like 54504 5.02 2 106

248 EOY26303.1 Vacuolar ATP synthase subunit A isoform 1 73558 5.64 14 1060

RESPOSTAS DE DEFESA E ESTRESSE

11 EOY33876.1 HSP20-like chaperones superfamily protein 17796 5.97 4 247

112 EOY11131.1 DNA-damage-repair/toleration protein (DRT102) 34891 5.18 7 328

142 XP_006387303.1 17.5 kd heat shock family protein 18321 5.31 4 228

153 XP_017977172.1 PREDICTED: proteasome subunit beta type-4 27716 7.03 7 323

171 DEGP1_ARATH Protease Do-like 1, chloroplastic OS 46816 6 3 133

194 PSA2A_ARATH Proteasome subunit alpha type-2-A OS 25685 5.53 1 93

223 KCNH1_BOVIN Potassium voltage-gated channel subfamily H member 1 OS 111874 7.28 1 45

225 KAX1D_LEIQH Potassium channel toxin alpha-KTx 1.13 OS 4657 9.08 2 107

51

PROTEÍNAS DE OXIDORREDUÇÃO

08 EOX90844.1 Ferredoxin-NADP(+)-oxidoreductase 2 41685 8.84 6 491

86 Y1669_ARATH Uncharacterized oxidoreductase At1g06690, chloroplastic OS 41529 8.85 3 58

108 EOY15330.1 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B subunit 48483 6.76 10 653

172 XP_017978306.1 PREDICTED: ferredoxin--NADP reductase, leaf isozyme,

chloroplastic 46018 9.02 5 303

173 XP_017978306.1 PREDICTED: ferredoxin--NADP reductase, leaf isozyme,

chloroplastic 46018 9.02 6 420

190 EOY00474.1 Quinone oxidoreductase-like protein isoform 1 40770 9.04 4 283

196 EOY02670.1 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C2 isoform 2 36856 8.51 13 875

199 XP_007041810.1 PREDICTED: glycerate dehydrogenase 42522 7.60 8 469

200 G3PB_ARATH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPB, chloroplastic

OS 48086 6.33 2 49

228 EOY20678.1 Aldehyde dehydrogenase family 2 member B4 62275 7.63 8 506

251 HSP7E_ARATH Heat shock 70 kDa protein 5 OS 70870 5.3 2 84

OUTRAS FUNÇÕES

03 XP_017974004.1 PREDICTED: 21 kDa seed protein-like 24417 5.84 4 255

12 BAF06021.1 Os01g0723400, partial 65639 8.59 1 60

93 KRH00323.1 hypothetical protein GLYMA_18G206200 24596 5.91 1 73

95 EOX98378.1 Plant basic secretory protein (BSP) family protein, putative 26308 5.17 4 271

101 Y3735_BREBN UPF0296 protein BBR47_37350 OS 9540 5.77 1 42

52

109 EOY12416.1 Uncharacterized protein TCM_030938 309414 5.19 8 550

111 OIW02832.1 hypothetical protein TanjilG_29608 28502 7.67 1 70

116 KVI00009.1 hypothetical protein Ccrd_021776 48291 9.20 1 53

120 EOY08233.1 Tubulin/FtsZ family protein isoform 1 50847 5.66 4 309

121 EOY15776.1 NAD(P)-binding Rossmann-fold superfamily protein 44453 5.10 3 185

123 EOY03621.1 Insulinase (Peptidase family M16) protein isoform 1 59199 6.49 4 246

136 XP_017985378.1 PREDICTED: uncharacterized protein LOC18593551 29924 5.84 6 388

137 CBI23176.3 Unnamed protein product, partial 36471 5.53 3 239

140 KJB31985.1 Hypothetical protein B456_005G217500 16601 5.91 2 170

144 EOY21247.1 21 kDa seed 24264 5.71 2 143

163 EOY07495.1 NAD(P)-binding Rossmann-fold superfamily protein isoform 1 36499 9.29 2 115

166 EOY31905.1 Voltage dependent anion channel 4 37508 9.22 4 259

177 EOY03376.1 Voltage dependent anion channel 1 29642 8.39 8 648

218 KQL02397.1 Hypothetical protein SETIT_013768mg 47980 8.43 2 124

250 EOX96247.1 Transketolase 81006 6.34 18 967

254 EOY30280.1 Germin protein subfamily 3 member 3 29756 9.54 1 70 1MM, corresponde aos valores de massa molecular (kDa);

2pI ao ponto isoelétrico estimados pelo programa Image Master 2D Platinum 7.0;

3N, corresponde

ao número de peptídeos sequenciados por MS/MS; 4Score corresponde ao valor da cobertura calculada pelo Mascot.

53

4.6. Classificação funcional das proteínas dos genótipos CC 40 e PA 13 de T.

cacao

A classificação funcional das proteínas identificadas foi realizada a partir de

análises do Gene Ontology pelo software Blast2GO, onde foi possível categorizá-las

em cinco grandes grupos de acordo com suas funções e sua participação em

processos biológicos. A maior parte das proteínas exclusivas e diferencialmente

acumuladas, identificadas no genótipo intolerante (CC 40), está relacionada aos

processos metabólicos e fotossintéticos (Figura 10, 11 e 12). Das proteínas

classificadas nos processos metabólicos celulares, algumas estão associadas ao

metabolismo energético, tais como: sintetase da glutamina (spot 2), aldolase da

frutose-bisfosfato (spot 365) e quinase do fosfoglicerato (spot 8). Já as proteínas

envolvidas nos processos fotossintéticos, podemos citar as ATPases (spots 77, 95,

126, 144, 148, 323 e 345). Foram ainda identificadas proteínas relacionadas ao

estresse, como champeronas (spot 264 e 348) e desidrogenase do gliceraldeído-3-

fosfato GAPA (spot 207) e proteínas envolvidas na desintoxicação celular, como a

peroxiredoxina Q cloroplastídica (spot 319).

54

Figura 10 - Categorização funcional de proteínas exclusivas, identificadas para o

genótipo de T. cacao CC 40 submetido a 200 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.

Figura 11 - Categorização funcional de proteínas exclusivas, identificadas para o

genótipo de T. cacao CC 40 submetido a 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.

55

Figura 12 - Categorização funcional de proteínas diferencialmente acumuladas,

identificadas entre os tratamentos com as doses de K (200 e 400 mg dm-

3 solo) para o genótipo de T. cacao CC 40 submetido à deficiência hídrica severa.

No genótipo tolerante à seca (PA 13) grande parte das proteínas exclusivas

e diferencialmente acumuladas identificadas está envolvida em processos

metabólicos celulares e processos fotossintéticos (Figura 13, 14 e 15). Entre as

proteínas classificadas em processos metabólicos, algumas estão relacionadas com

metabolismo energético: aminotransferase do glutamato-glioxilato (spots 0 e 12),

sintase da cisteína (spot 20), sintetase da glutamina (spot 71) e desidrogenase do

malato (spot 76). Já as proteínas envolvidas nos processos fotossintéticos, podemos

citar a ribulose 1,5 bisfosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco) (spot 51, 10 e 91).

Além disso, foram identificadas, também, proteínas envolvidas nas respostas ao

estresse como a subfamília do canal de tensão de potássio H-membro (spot 223) e a

toxina de canal de potássio alfa-KTx (spot 225), associadas aos canais de K

encontrados no presente trabalho; a proteína de choque térmico (spot 251) e a

chaperonina CPN60 mitocondrial (spot 339). Foram ainda identificadas proteínas

atuantes em processos de oxidorredução, como a redutase da ferredoxina-NADP

(spot 8) e as proteínas envolvidas no metabolismo antioxidativo, como a dismutase

do superóxido (spot 285).

56

Figura 13 - Categorização funcional de proteínas exclusivas, identificadas para o

genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 200 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.

Figura 14 - Categorização funcional de proteínas exclusivas, identificadas para o genótipo de T. cacao PA 13 submetido a 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo.

57

Figura 15 - Categorização funcional de proteínas diferencialmente acumuladas,

identificadas entre os tratamentos com as doses de K (200 e 400 mg dm-

3 solo) para o genótipo de T. cacao PA 13 submetido à deficiência hídrica severa.

4.7. Metabolismo antioxidativo

A atividade de enzimas antioxidantes como SOD, APX, GPX e PAL, que

apresentam grande potencial de proteção contra os danos provocados pelo estresse

oxidativo, foi analisada para todos os tratamentos e para ambos os genótipos de T.

cacao. No presente trabalho, foram observadas diferenças significativas (p≤ 0,05)

para as atividades de SOD, APX, GPX e PAL em nível foliar, demonstrando a

influência de doses de K nas respostas dos genótipos de T. cacao ao déficit hídrico

severo no solo.

4.7.1. Atividade de dismutase do superóxido (SOD)

A atividade de SOD apresentou diferenças significativas (p≤ 0,05) entre os

tratamentos para doses de K e deficiência hídrica severa no solo dentro de cada

genótipo (Figura 16). Em relação aos genótipos avaliados, o PA 13 (tolerante)

apresentou aumento significativamente (p≤ 0,05) maior da atividade de SOD para o

58

tratamento com 400 mg K dm-3 solo (9,22 UA mg-1 MS) se comparado ao tratamento

com 200 mg K dm-3 solo (3,59 UA mg-1 MS). Além disso, foi observado, também,

aumento significativo (p≤ 0,05) da atividade de SOD para o genótipo CC 40

(intolerante) submetido a dose de 400 mg K dm-3 solo (8,27 UA mg-1 MS) se

comparado ao tratamento com dose de 200 mg K dm-3 solo (2,5 UA mg-1 MS). Isto

Indica, por sua vez, que a dose superior de K influenciou o aumento da atividade de

SOD em ambos os genótipos de T. cacao submetidos à deficiência hídrica severa no

solo.

Figura 16: Atividade da dismutase do superóxido, em genótipos de T. cacao (CC 40 e PA 13) submetidos a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas e, ou minúsculas não diferem entre si, entre e dentro dos genótipos, respectivamente, pelo teste de Tukey (p≤ 0,05). As barras correspondem aos erros padrões das médias. n=5.

4.7.2. Atividade de peroxidase do ascorbato (APX)

Para ambos os genótipos, a atividade de APX foi significativamente (p≤ 0,05)

maior no tratamento com dose ideal de K (200 mg dm-3 solo), do que nos

59

tratamentos com 400 mg K dm-3 solo (Figura 17). Ao observar o tratamento com 400

mg K dm-3 solo, verificou-se que a atividade de APX apresentou pouca diferença

para o genótipo intolerante (CC 40) (6 mmol ascorbato g-¹ MS), em relação ao

genótipo tolerante (PA 13) (5 mmol ascorbato g-¹ MS), quando submetido à

deficiência hídrica severa.

Figura 17 - Atividade da peroxidase do ascorbato, em genótipos de T. cacao (CC 40 e PA 13) submetidos a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas e, ou minúsculas não diferem entre si, entre e dentro dos genótipos, respectivamente, pelo teste de Tukey (p≤ 0,05). As barras correspondem aos erros padrões das médias. n=5.

4.7.3. Atividade de peroxidase do guaiacol (GPX)

A atividade de GPX foi analisada em meio de reação contendo guaiacol como

o único doador de elétrons para a redução de H2O2. A atividade de GPX apresentou

diferenças significativas (p≤ 0,05), tanto quando comparados entre os genótipos

quanto dentro dos tratamentos (Figura 18). Verificou-se que a atividade de GPX teve

aumento significativamente (p≤ 0,05) maior em ambos os genótipos quando

60

submetidos a 400 mg K dm-3 solo, sendo que o genótipo tolerante (PA 13) (643,7

mmol guaiacol g-1 MS min-1) teve maior atividade de GPX, quando comparado com o

genótipo intolerante (CC 40) (493 mmol guaiacol g-1 MS min-1). Isto pode ser um

indicativo de que este genótipo usou desta enzima para diminuir o estresse oxidativo

causado pelo déficit hídrico severo no solo. Por outro lado, a atividade de GPX, para

o tratamento com 200 mg K dm-3 solo, foi menor nos dois genótipos, sendo que a

diminuição mais drástica foi para o genótipo PA 13.

Figura 18 - Atividade da peroxidase do guaiacol, em genótipos de T. cacao (CC 40 e

PA 13) submetidos a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas e, ou minúsculas não diferem entre si, entre e dentro dos genótipos, respectivamente, pelo teste de Tukey (p≤ 0,05). As barras correspondem aos erros padrões das médias. n=5.

4.7.4. Atividade de fenilalanina amônialiase (PAL)

Com relação à atividade de PAL, houve diferenças significativas (p≤ 0,05),

entre os tratamentos para o genótipo CC 40 (intolerante), onde no tratamento com

200 mg K dm-3 solo, foi possível verificar uma maior atividade da PAL em condições

61

de deficiência hídrica severa (Figura 19). Por outro lado, o genótipo PA 13 (tolerante)

não apresentou diferença significativa (p≤ 0,05) entre os tratamentos de 200 e 400

mg K dm-3.

Figura 19: Atividade da fenilalanina amônialiase, em genótipos de T. cacao (CC 40

e PA 13) submetidos a 200 e 400 mg K dm-3 solo e a deficiência hídrica severa no solo. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas e, ou minúsculas não diferem entre si, entre e dentro os genótipos, respectivamente, pelo teste de Tukey (p≤ 0,05). As barras correspondem aos erros padrões das médias. n=5.

62

DISCUSSÃO

5.1. Perfis proteicos dos genótipos de T. cacao CC 40 e PA 13

No presente trabalho, foi obtido um perfil proteico distindo para cada genótipo,

referente às alterações nos padrões de acúmulo de proteínas e, ainda, as diferenças

entre os tratamentos com as doses de K no mesmo genótipo (Figuras 2 e 4). Notou-

se que o genótipo CC 40 (intolerante) obteve maior acúmulo de spots, quando

comparado ao genótipo PA 13 (tolerante). Em relação aos diagramas de Venn, os

quais mostram a ocorrência dos spots exclusivos, comuns e diferencialmente

acumulados, observou-se maior acúmulo de proteínas no genótipo CC 40 (Figura 3)

quando submetido à dose ideal de K. No entanto, o genótipo PA 13 (Figura 5)

apresentou maior quantidade de proteínas sendo expressas e induzidas no

tratamento com dose superior de K. Indicando que a dose superior de K aplicada no

solo potencializou o acúmulo de proteínas no genótipo tolerante submetido à

deficiência hídrica severa, estudado no presente trabalho. Estudos realizados por

Cramer et al. (2013) com Vitis vinifera Cabernet Sauvignon expostas a déficit hídrico

progressivo, também, verificaram mudanças no perfil proteico e acúmulo de várias

proteínas anterior aos processos fisiológicos, como a condutância estomática (gs) e

fotossíntese (A). Indicando que as plantas de V. vinifera apresentaram, com

antecedência, uma “percepção” de sinal ao estresse por déficit hidrico, aparentando

aclimatar-se ao mesmo. Respostas semelhantes às alterações no perfil proteico de

plantas foram observadas em folhas (LIMA et al., 2002) e raízes de Coffea

canephora submetidas a déficit hídrico no solo (SOARES, 2008).

Em estudo realizado por Neves (2014), com os mesmos genótipos de T.

cacao avaliados no presente trabalho, observou-se que a tolerância ao déficit hídrico

63

severo, atribuído ao genótipo tolerante (PA 13), em relação ao genótipo intolerante

(CC 40), e potencializado pela adição de doses elevadas K no solo, está

relacionada, em parte, com a sua maior capacidade de absorção e acumulação de

macro e micronutrientes minerais pelas plantas como K e Mn. Este último elemento

metálico desempenha um papel chave no aparato fotossintético, ou seja, atua na

síntese de ATP, nas reações da RuBP-carboxilase, na biossíntese de ácidos graxos,

lipídeos e proteínas e na oxidação da molécula de água, separando o oxigênio do

hidrogênio, associado ao PS2, e no transporte de elétrons da molécula de água

para a molécula de clorofila (PFEFFER et al., 1986; LIDON; BARREIRO; RAMALHO,

2004). Além disso, o Mn participa também da síntese de proteínas, como

componente estrutural dos ribossomos e ativador da RNA-polimerase, da oxidação

da molécula de água, do complexo de evolução do oxigênio e do alongamento

celular, além de influenciar no nível do ácido indol acético (MARSCHNER, 1986).

Provavelmente, o acúmulo de K e Mn nos tecidos foliares de ambos os genótipos de

T. cacao promoveu maior síntese e acúmulo de proteínas, bem como o aumento da

atividade de enzima do metabolismo antioxidativo.

5.2. Proteínas envolvidas em processos metabólicos, catalíticos e

fotossíntéticos

As proteínas identificadas, em ambos os genótipos de T. cacao, foram

categorizadas de acordo com os processos biológicos dos quais participam.

Observaram-se inúmeras alterações na composição de proteínas exclusivas e

diferencialmente acumuladas relacionadas em diversas vias metabólicas, que estão

diretamente associadas ao estresse abiótico, e, em alguns casos, especificamente a

resposta ao déficit hídrico.

O processo de tolerância ou aclimatação das plantas ao déficit hídrico envolve

uma variedade de mecanismos complexos que se iniciam com a “percepção” da

planta ao estresse, a partir da qual ocorre ativação de vias de transdução de sinais

que, consequentemente, desencadeiam a síntese de proteínas e outros compostos

(SHULAEV et al., 2008). Essas proteínas induzem uma cascata de sinalização que

se traduzem em respostas bioquímicas e fisiológicas como o fechamento

64

estomático, redução do crescimento celular e da atividade fotossintética e ativação

da respiração. Assim, quando uma planta é submetida a estresse, a mesma tende a

promover, prioritariamente, à síntese de proteínas relacionadas às respostas ao

estresse (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2007).

No presente trabalho, a maior parte das proteínas identificadas, em ambos os

genótipos de T. cacao e tratamentos, estão relacionadas com atividade metabólica

(Figuras 10, 11, 12, 13, 14 e 15). A via glicolítica desempenha função central no

metabolismo energético celular e no fornecimento de esqueletos de carbono para a

síntese de diversos compostos celulares, sendo as proteínas dessa via as mais

sintetizadas em diferentes organismos (COBOS et al., 2010). Em estudos realizados

por Ford et al. (2011) e por Lenka et al. (2011), avaliando plantas de

Triticum aestivum e de Oryza sativa, respectivamente, tolerantes e intolerantes a

deficiência hídrica, verificaram um aumento na síntese e acúmulo de proteínas

relacionadas à via glicolítica em resposta à deficiência hídrica. Resultados

semelhantes foram encontrados em Selaginella lepidophylla, uma antiga linhagem

de plantas que podem resistir à desidratação por completo durante anos e é capaz

de ativar o seu metabolismo após somente algumas horas de reidratação

(ITURRIAGA et ali., 2006). Proteínas da via glicolítica, como aldolase da fructose-

bisfosfato (spots 125 de CC 40 e 365, 134, 202 e 204 de PA 13), foram identificadas

neste trabalho.

A proteína álcool desidrogenase (ADH) foi identificada no genótipo tolerante

(PA 13) submetido à dose superior de K (spot 209). Estudos realizados por Wong et

al. (2006) com Thellungiella salsuginea mostraram que transcritos desta proteína

foram diferencialmente acumulados em condições de alta salinidade, baixas

temperaturas e deficiência hídrica. Por outro lado, de acordo com Bertolde et al.

(2014), houve um aumento significativo na atividade da enzima ADH em genótipo de

T. cacao tolerante ao alagamento do solo, quando submetido ao alagamento por 24

h, em comparação com o genótipo intolerante (CC 40). Em outro trabalho, realizado

por esta mesma autora, verificou-se que o genótipo intolerante ao alagamento

apresentou expressão de proteínas envolvidas na via glicolítica em raízes após 96 h

de inundação (BERTOLDE et al., 2010). Além disso, Liu et al. (2013) também

observaram, em plantas de Zea mays, um aumento significativo da expressão de

65

ADH ao combinar os estresses hídrico e térmico. Estes autores verificaram, também,

que o ácido abscisico (ABA) favoreceu o aumento da atividade de ADH,

evidenciando a importância desta proteína em resposta a estresses ambientais.

Ademais, outros trabalhos com Arabidopsis thaliana, submetidas a estresses

abióticos, mostraram altos níveis transcricionais do gene, que codifica a proteína

ADH, refletindo na elevada atividade da enzima em plantas (PAPDI et al., 2008).

Ainda, em relação às proteínas do metabolismo, foram observadas proteínas

relacionadas à síntese de aminoácidos como aminotransferase da alanina (spot 136

de CC 40 e spots 364 e 221 de PA 13), e sintetase da glutamina (GS) (spot 2 de CC

40 e spots 71 e 216 de PA 13). A enzima GS age no metabolismo do nitrogênio

catalisando, por meio do uso de moléculas de ATP, a condensação de amônio e

glutamato em glutamina, além de possuir a função na regulação das concentrações

de prolina, um osmoprotetor (CÁNOVAS et al., 1998). A prolina pode ser sintetizada

a partir de glutamato ou da ornitina, mas as plantas em condições de estresse

ambiente sintetizam prolina predominantemente a partir do glutamato via atividade

da enzima Δ1- pirrolina-5- carboxilato (P5C) por duas reduções sucessivas

catalisadas pelas enzimas P5C sintetase (P5CS), que corresponde a etapa

enzimática limitante da biossíntese de prolina e P5C redutase (P5CR) (DELAUNEY;

VERMA, 1993; VERBRUGGEN; HERMANS, 2008). A prolina possui função no

ajuste da pressão osmótica celular, na detoxificação de EROs, preservação da

integridade de membranas e estabilização de enzimas e proteínas (IRFAN DAR et

al., 2016). Em plantas transgênicas de Nicotiana tabacum com o gene mutado

VaP5CS129A sintetizam e acumularam mais prolina, resultando em maior tolerância

a salinidade, deficiência hídrica e altas temperaturas (HONG et al., 2000; GUBIS et

al., 2007; CVIKROVÁ et al., 2012), bem como a outros estresses abióticos (BORGO

et al., 2015).

Signorelli et al. (2014) reportaram que a prolina atua como um detoxificador

de EROs, mais especificamente de OH- em plantas submetidas à estresse, onde

pelo menos 2 OH são consumidas por molécula de prolina, diminuindo os danos

provocados pela OH-, uma vez que esse radical é o mais reativo dentre as EROs.

Inúmeros estudos demostram a prolina como molécula chave para a compreensão

das respostas a estresses abióticos (IRFAN DAR et al., 2016), pois a mesma é

66

sintetizada e acumulada em várias espécies submetidas à estresses como

salinidade (YOSHIBA et al., 1995), frio, deficiência nutricional (HARE; CRESS,

1997), níveis tóxicos de metais pesados (SCHAT et al., 1997), elevada acidez do

meio (HARE; CRESS, 1997), deficiência hídrica no solo (CHOUDHARY et al., 2005)

e ataque por patógenos (REHMAN et al., 2014). Xu et al. (2009) demostraram que a

ação da prolina frente a diminuição da toxicidade em plantas por metais pesados

está relacionada com aumento da atividade da SOD e com o aumento da

concentração de GS.

Em trabalho realizado por Mesquita (2013) foi possível verificar aumento dos

níveis de alguns metabólitos em folhas submetidas a déficit hídrico, como o

aminoácido glutamina. Hongmei et al. (2009) observaram em plantas com

superexpressão de GS um aumento na concentração de aminoácidos totais e

nitrogênio em toda a planta associado a uma maior tolerância à seca no solo. Neste

trabalho, a enzima GS foi up acumulada no genótipo intolerante (CC 40), na dose

superior de K, sugerindo que a maior dose de K no solo pode afetar

significativamente o acúmulo desta enzima, reforçando sua importância em conferir

maior tolerância às plantas em condições de déficit hídrico severo no solo.

A desidrogenase do malato (spots 20, 31 e 76 de CC 40 e spot 179 de PA 13)

é um exemplo de proteína superexpressa em condições de seca no solo. No

entanto, esta enzima foi encontrada up regulada apenas no genótipo intolerante

(spot 20 de CC 40) a deficiência hídrica no solo, submetido à dose superior de K.

Esta enzima está envolvida no metabolismo do malato, o qual pode asser uma

importante válvula metabólica para renovar o NADP cloroplastídico, necessário para

as reações fotoquímicas, evitando excesso de poder redutor neste organelo, o qual

poderia resultar em maior dano oxidativo (BISCHOF et al., 2003). Além disso,

segundo Camargo et al. (2000), a atividade do sistema enzimático desidrogenase do

malato está relacionado à exposição de organismos aos diferentes estresses

ambientais, pois favorecem a manutenção e produção de ATP.

A expressão de proteínas de fator de alongamento foi identificada em ambos

os genótipo de T.cacao avaliados em condições de déficit hídrico severo (spot 132

de CC 40 e spots 321 e 341 de PA 13). Essas proteínas são importantes na fase de

alongamento, no processo de tradução, durante a síntese protéica. Alguns estudos

67

demonstraram que inúmeras proteínas relacionadas com a síntese de proteínas

aumentam em plantas sob deficiência hídrica, incluindo os fatores de alongamento

da tradução de proteínas, sendo verificado este aumento em condições de estresse

osmótico, contribuindo para uma maior tolerância ao estresse (NDIMBA et al., 2005;

YOSHIMURA et al., 2008). Ainda, em trabalhos com plantas de Z. mays foi

observado aumento na quantidade do fator de alongamento em condições de

estresse térmico (MORIARTY et al., 2002).

Por outro lado, foram identificadas, proteínas do complexo de evolução do

oxigênio (spot 103 de CC 40) responsáveis pela estabilidade do fotossistema 2

(PS2) e a proteína ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco) (spots 87,

44, 241, 242 e 246 de CC 40 e spot 342 de PA 13) da fase bioquímica da

fotossíntese. Houve maior acúmulo das proteínas do complexo de evolução do

oxigênio em resposta ao déficit hídrico (BLODNER et al., 2007). Além do mais, seu

acúmulo pode estar associado com a rapidez da dissociação das proteínas de PS2,

indicando a presença de danos neste sistema (CHENPING; HUANG, 2010);

No presente trabalho, a up acumulação de proteínas fotossintéticas foi

observada, a exemplo da Rubisco (spots 41 e 18 de CC 40 e spot 51 de PA 13), que

se trata da enzima mais abundante dos tecidos vegetais. A Rubisco é uma das

principais enzimas responsável pela assimilação de carbono na fase bioquímica da

fotossíntese e atua, ainda, como enzima catalítica, beneficiando as células por meio

do fornecimento de esqueletos de carbono e energia, e pode também ser utilizada

em respostas de defesas a estresses subsequentes (SPREITZER; SALVUCCI,

2002). Os estresses ambientais podem provocar inativação reversível ou irreversível

na Rubisco. Quando a inativação é do tipo irreversível a Rubisco é degradada por

completo e substituída por subunidades resintetizadas para restabelecer totalmente

a função fotossintética (ECKARDT; PELL, 1995). Ali e Komatsu (2006) trabalharam

com déficit hídrico em Zea mays, e observam redução na expressão de isoenzimas

da Rubisco. Todavia, Gorantla (2005) estudando um cultivar de Z. mays, tolerante a

deficiência hídrica no solo, encontrou aumento na expressão, dentre outros genes

associados ao deficit hídrico, da subunidade maior da Rubisco. Outros trabalhos

evidenciam o surgimento de fragmentos da Rubisco resultantes da degradação na

presença de estresse hídrico (RAKWAL; KOMATSU, 2000; SALEKDEH et al., 2002).

68

O acúmulo de Rubisco foi diferencial em ambos os genótipos de T. cacao

para a dose superior de K, o que pode indicar que a expressão da mesma é afetada

pelo estresse causado pela deficiência hídrica severa e potencializada em plantas

submetidas a doses superiores de K. A proteína ativase da Rubisco também foi

encontrada up acumulada no genótipo intolerante (CC 40, spot 18), demonstrando

que a dose superior de K pode influenciar a regulação desta proteína em plantas

submetidas à deficiência hídrica no solo. No entanto, alguns estudos mostraram

perdas da atividade da Rubisco em plantas submetidas à deficiência hídrica, nas

quais também observaram redução na atividade da enzima ativase da Rubisco

(CHAVES et al., 2003). Segundo Portis et al. (2007) a enzima ativase da Rubisco

está relacionada com a síntese da principal enzima envolvida no processo

fotossintético (Rubisco), além de permitir a ativação da mesma.

Ainda, em relação à fotossíntese, foi encontrada em ambos os genótipos de

T. cacao, a enzima sintase do ATP (spots 77, 95, 126, 323 e 345 de CC 40 e spots

13 e 124 de PA 13), essencial para a produção de ATP a partir de ADP + Pi

(BARACCA et al., 2000). Esta enzima é responsável por vários mecanismos de

regulação, modulando sua atividade segundo as mudanças ambientais (KONNO et

al., 2006). O acúmulo de proteínas relacionadas ao balanço energético em plantas é

modificado em resposta ao déficit hídrico, principalmente porque os fatores

transcricionais são regulados por sinais ocasionados pelos estresses abióticos como

ABA e ATP/NADPH (LAWLOR; TERAZA, 2009). Pois, as plantas demandam uma

grande quantidade de ATP respiratório em condições de déficit hídrico, para

compensar as baixas taxas de produção de ATP nos cloroplastos, cuja demanda

pode ser exigida para resistir os mecanismos de reparo (FLEXAS et al., 2005).

Soares (2008) observou em raízes de Coffea canephora, em condições de

deficiência hídrica no solo, que o aumento no acúmulo de proteínas glicolíticas e do

ciclo de Krebs indica o papel da respiração como mecanismo de drenagem de

excesso de poder redutor, quando ocorre redução da fotossíntese líquida. Essa

enzima foi up acumulada no genótipo intolerante de T. cacao (CC 40) submetido a

deficiência hídrica severa no solo, sugerindo que a dose superior de K influenciou na

regulação dessa enzima.

69

5.3. Proteínas envolvidas nas respostas de defesa e estresse

A proteína receptora de quinase (spot 37), encontrada no génotipo CC 40

(intolerante), provavelmente revela a resposta à percepção e a transdução de sinais

realizada pela quinase. A ativação de inúmeros fatores de transcrição e a regulação

da expressão gênica, em plantas submetidas a estresse hídrico, depende da

fosforilação da proteína mediada pelas proteínas quinases (MAATHUIS, 2009). Além

disso, a ativação da cascata de sinalização intracelular regula as inúmeras

modificações bioquímicas e fisiológicas. Estas proteínas são importantes fatores de

transdução de sinais que têm um papel essencial na aclimatação aos estresses

ambientais em organismos eucarióticos (DIÉDHIOU et al., 2008; TAYLOR et al.,

2013).

As proteínas de choque térmico, também conhecidas como chaperonas

moleculares (HSP), estão envolvidas em diversas funções celulares, das quais se

destacam a de enovelamento (folding) correto de proteínas e o direcionamento das

proteínas defeituosas para o proteassoma (WANG et al., 2004; SCARPECI et al.,

2008). Essas proteínas são responsáveis pela proteção, reparo e degradação de

elementos danosos à célula, especialmente proteínas, durante muitos estresses

abióticos (PARSELL LINDQUIST, 1994; HAMILTON; HECKATHORN, 2001). As

HSPs são sintetizadas e acumuladas em tecidos muito desidratados e auxiliam no

enovelamento proteico (SCHÖFFL et al. 1998). Sua síntese é aumentada

significativamente quando proteínas não são corretamente formadas e a

concentração de ATP é limitada (KABAKOV; GABAI, 1997). No decorrer do estresse

provocado pelo déficit hídrico, uma estratégia de sobrevivência a essa condição é

também impedir a síntese de proteínas mal enoveladas, mantendo as proteínas em

suas conformações funcionais e prevenindo acumulação de proteínas não nativas

(WANG et al. 2003). Vários estudos sugerem que as proteínas de choque térmico

interagem com outros mecanismos de resposta aos estresses, como deficiência

hídrica, mecanismos estes que atuam coordenadamente ou sinergicamente para

prevenir ou eliminar danos celulares e instaurar a homeostase celular (WANG et al.

2004).

70

As proteínas HSPs apresentam níveis diferentes de expressão e acumulação,

onde uma mesma HSP, a depender de sua isoforma, pode responder de maneira

diferente ao estresse (ZAMANY et al., 2012). No presente trabalho, observou-se que

as doses de K também influenciaram a síntese de proteínas de choque térmico.

Notou-se que, para ambos os tratamentos com K e em condição de deficiência

hídrica severa, foram encontradas chaperonas, tanto para o genótipo intolerante (CC

40, spots 46 e 348) quanto para o genótipo tolerante (PA 13, spots 290, 339 e 11).

Entretanto, o genótipo CC 40 submetido à dose superior de K foi o que apresentou

maior acúmulo destas proteínas (spot 46 - “up-regulation”), indicando que a maior

dose de K influenciou na aclimatação do genótipo intolerante a seca no solo. Em

estudos realizados por Guo et al. (2014), foram demonstrados os efeitos das

proteínas HSP em Ammopiptanthus mongolicus, a qual sobrevive no deserto da Ásia

Central em condições de déficit hídrico, salino e alcalino. Estes autores constataram

que essas proteínas exercem função na mediação da tolerância à seca, frio e calor.

A proteína HSP 70 kDa é necessária para o fechamento estomático e ainda

para as respostas transcricionais e fisiológicas moduladas pelo ABA (CLEMENT et

al., 2011). Foi identificado a proteína HSP 70 kDa no genótipo tolerante de T. cacao

(PA 13) submetido a dose superior de K (spot 251), podendo estar associada, então,

com a redução na condutância estomática observada em condições de déficit

hídrico, como relatado em trabalho realizado por Neves (2014). Neste trabalho foi

demonstrado que esse genótipo possui mecanismos mais eficientes de controle na

abertura e fechamento de estômatos, que permite a regulação de sua transpiração e

a existência de um balanço positivo de carbono em condições de baixos potenciais

hídricos no solo (- 0,25 a - 0,51 MPa).

Ademais, observou-se, também, a presença da proteína protease (spot 171),

no genótipo tololerante (PA 13), envolvida na degradação de proteínas

ubiquitinizadas. Segundo Lee (2012), a degradação de proteínas desempenha um

papel importante em todos os organismos celulares, no controle seletivo de

proteínas reguladoras e na remoção de proteínas que não são mais necessárias.

Além disso, a capacidade celular para degradar proteínas oxidadas, aumenta a

tolerância ao estresse oxidativo (KUREPA et al., 2009). Também foi possível

identificar, para ambas as doses de K, um complexo de protease multicatalítica, o

71

proteassoma, no genótipo tolerante (PA 13, spots 35, 153 e 194 das doses ideal e

superior, respectivamente). Este é responsável pela degradação seletiva de

proteínas reguladoras, e é fundamental na regulação de processos celulares,

incluindo as respostas de defesa e tolerância ao estresse provocado pela deficiência

hídrica (LECHNER et al., 2006; PAQUIS et al., 2011).

Além destas proteínas, foram identificadas duas outras proteínas relacionadas

a canais iônicos, como os canais de potássio, no genótipo de T. cacao tolerante

submetido à dose superior de K (spots 223 e 225 de PA 13). Segundo Nurberguer et

al. (1999), a alteração do potencial transmembrana é uma das primeiras respostas

das células vegetais, após o estresse. Isto ocorre devido à alcalinização extracelular,

onde o influxo de H+ e Ca2+ e o efluxo de K+ e Cl- levam a sua despolarização.

Canais de K+ são essenciais para a homeostase celular de íons, a regulação

osmótica e a estabilidade das células. As plantas absorvem K através do sistema de

baixa afinidade, no qual canais de K+ desempenham função no transporte de K para

o interior da célula (ADAMS; SHIN, 2014). O funcionamento correto destes canais

depende da percepção, da transdução de sinais, do controle da atividade destes

canais na membrana plasmática, como também da regulação do seu número. Logo,

quando ocorre efluxo de K+ durante o déficit hídrico, a célula tende a se

desestabilizar, como resposta a este estresse, e os mecanismos de defesa são

disparados até que a atividade e a concentração iônica sejam normalizadas (KOERS

et al., 2011).

5.4. Proteínas envolvidas no processo de oxidorredução

No presente trabalho, ambos os genótipos de T. cacao apresentaram

proteínas envolvidas no processo de oxidorredução. Este fato está diretamente

relacionado ao processo de destoxificação celular, uma vez que o estresse oxidativo

é uma das repostas mais rápidas observadas em plantas submetidas a estresses

abióticos e bióticos (ZHANG; ERVIN, 2004). A dismutase do superóxido (SOD)

encontrada neste trabalho (spot 285 de PA 13) é uma enzima que apresenta

capacidade de catalisar a dismutação do O2ˉ produzindo o O2 e o H2O2, sendo

72

considerada a primeira resposta da planta frente ao estresse oxidativo (WANG et al.,

2013), provocado pela deficiência hídrica no solo.

Além da SOD, foi identificada, ainda, neste trabalho, a proteína

desidrogenase do gliceraldeido-3-fosfato (3-PGAL) (spots 93 e 207 de CC 40 e spot

108 de PA 13), que, além de ser uma proteína importante da via glicolítica, como

discutida anteriormente, também está relacionada a outras funções celulares.

Ademais, estas proteínas podem funcionar como transdutores de sinais de EROs

em resposta ao estresse abiótico, uma vez que as 3-PGAL possuem sítios

catalíticos de resíduos de cisteínas que podem ser oxidados por moléculas como

H2O2 (GUO, et al., 2012). Esta enzima, por sua vez, cataliza a interconversão de 1,3-

bisfosfoglicerato em gliceraldeido 3-fosfato, uma etapa dependente de NAD(P) tanto

na glicólise quanto no ciclo de Calvin-Benson, sendo esta reação um centro de

integração de sinal entre reações de oxidorredução (SPARLA et al., 2005). Além

disso, algumas funções não glicolíticas, como regulação da transcrição e apoptose,

tem sido atribuídas às enzimas glicolíticas, onde outras funções propõem uma

ligação com sensores metabólicos (KIM; DANG, 2005; HARA; SNYDER, 2006;

COLELL et al., 2007) na qual, o gliceraldeido-3-fosfato é o precursor da via do metil-

eritrol fosfato que é responsável pela biossíntese de ABA nos plastídeos (MUÑOZ-

BERTOMEU et al., 2011).

A proteína peroxiredoxina (spot 319 de CC 40 e spot 296 de PA 13) foi

encontrada em ambos os genótipos de T. cacao neste trabalho. As peroxiredoxinas

são capazes de degradar peróxidos, sendo sensíveis à oxidação (POYNTON;

HAMPTON, 2013). Estas proteínas participam na proliferação celular, diferenciação,

apoptose e fotossíntese (CAPORALETTI et al., 2007). Além disso, foi observado que

estas proteínas também podem atuar como chaperonas ou como reguladores do

ciclo celular (PHALEN et al., 2006; TROTTER et al., 2008; KÖNIG et al., 2013). O

aumento no acúmulo desta proteína foi demonstrado em inúmeros trabalhos em

plantas em condições de déficit hídrico (ALI; KOMATSU, 2006; HAJHEIDARI et al.,

2005; HAJHEIDARI et al., 2007; CHO et al., 2012).

No presente trabalho, a enzima redutase da isoflavona foi identificada no

genótipo PA 13 (tolerante à deficiência hídrica). Foi demonstrado que genes

responsáveis pela síntese desta enzima são induzidos em condições de estresses

73

abióticos e bióticos em raízes, conferindo tolerância ao estresse oxidativo (SHOJI et

al., 2002; KIM et al., 2003; KIM et al., 2008; KIM et al., 2010; YAMAGUCHI et al.,

2010). Estudos em plantas sob déficit hídrico, demonstraram aumento no acúmulo

de flavonóides, compostos não enzimáticos de defesa contra danos oxidativos

(HERNÁNDEZ et al. 2009). Interessantemente, está enzima foi encontrada up

acumulada apenas no genótipo de T. cacao tolerante à deficiência hídrica (spot 55

de PA 13), sugerindo que a mesma auxilia na tolerância ao estresse oxidativo

provocado pela deficiência hídrica e que maiores doses de K solo pode potencializar

o acúmulo desta enzima nas plantas.

A enzima oxidoredutase da quinona foi encontrada no genótipo de T. cacao

tolerante (PA 13) submetido à dose superior de K (spot 190). Esta enzima atua

como transportadora de elétrons no interior de membranas tilacóides e da

membrana interna mitocondrial nas cadeias de transporte de elétrons da

fotossíntese e respiração, respectivamente (CRAMER et al., 1991). Estudos relatam

o aumento na expressão desta proteína em plantas sob estresses ambientais

(CASTILLEJO et al., 2008; NOURI; KOMATSU, 2010). Possivelmente, o aumento no

acúmulo desta proteína esteja relacionado com a sua função na conexão quimio-

osmótica, prevenindo a célula de danos causados pela formação de EROs (BAN et

al., 1992).

A enzima redutase da ferredoxina-NADPH (spots 08 e 56 de PA 13) foi

identificada no presente trabalho. Esta catalisa a transferência de elétrons da

ferrodoxina reduzida pelo fotossistema 1 (PS 1) para o NADP+, fornecendo NADPH

que é indispensável para as etapas de assimilação de dióxido de carbono (SHIN;

ARNON, 1965). Além disso, vários outros trabalhos mencionam sua importância

como enzima antioxidante utilizada na manutenção da homeostase celular em

condições de estresses ambientais (PALATNIK et al., 1997; VALDERRAMA et al.,

2006; RODRIGUEZ et al., 2007).

5.5. Metabolismo antioxidativo

As EROs, como peróxido de hidrogênio, hidroxilas, radicais superoxido,

oxigênio singleto, etc., são produzidas nas células vegetais em condições normais

74

(MILLER et al., 2010). Em condições de deficiência hídrica no solo, as plantas

tendem a aumentar a produção de EROs, como uma das primeiras respostas da

planta ao estresse (GUO et al., 2010). Essas moléculas agem em várias cascatas de

sinalização tanto up como downstream e a extensão de seu acúmulo determina o

seu papel na célula, uma vez que, a depender da intensidade de sua produção,

podem atuar como importantes moléculas de transdução de sinal, quando down

reguladas ou up acumuladas como moléculas tóxicas (MILLER et al., 2010). Para

minimizar os danos provocados pelo estresse oxidativo, as plantas possuem

sistemas antioxidantes enzimático e não-enzimático como proteção à presença

destes radicais livres nos tecidos vegetais (MUNNÉ-BOSCH et al. 2013). Entretanto,

o funcionamento desses sistemas pode ser interrompido em condições de estresse,

como o déficit hídrico, induzindo maior acúmulo de EROs. O acúmulo de EROs

promove o estresse oxidativo, que afeta negativamente o crescimento, o

desenvolvimento e, ou a produtividade das plantas (MITTLER, 2002) devido aos

danos provocados em membranas e macromoléculas celulares (GILL; TUTEJA,

2010), como quebra na cadeia do DNA e oxidação de proteínas (ARGUIRRE et al.,

2005). Além disso, muitos estudos apontam que os danos provocados pela

deficiência hídrica severa no solo induzem o estresse oxidativo, resultado da alta

produção e acúmulo EROs (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2006). Dentre as enzimas

do metabolismo antioxidativo, destacam-se a SOD, APX e GPX, associada à

proteína de defesa PAL (SCANDALIOS, 2005), as quais foram avaliadas neste

trabalho. O aumento da atividade destas enzimas pode estar associado com a

tolerância à seca em plantas C. canephora (LIMA et al., 2002).

No presente trabalho, a atividade de SOD (Figura 16) se apresentou

significativamente (p≤ 0,05) mais elevada em ambos os genótipos de T. cacao para

o tratamento com dose superior de K, quando comparada com a atividade de APX,

GPX e PAL, principalmente para o PA 13 (tolerante), indicando que o maior acúmulo

desta proteína foi potencializado pelas doses elevadas de K. A SOD, considerada a

primeira barreira enzimática em combate ao estresse oxidativo, converte O2− em

H2O2 (HOSSAIN et al., 2009), o qual pode ser posteriormente transformado em água

pelas peroxidases (PODs) (LIU, 2006). As plantas tolerantes ao déficit hídrico

apresentam mecanismos de defesa mais eficazes para eliminar EROs do que os

75

intolerantes (PINHEIRO et al., 2004). Portanto, o aumento na atividade de SOD é

conhecido por conferir proteção e tolerância ao estresse oxidativo (JALEEL et al.,

2007). De acordo com Malavolta (2006), as plantas têm uma alta exigência de K e

uma das razões é a necessidade de manter um alto teor de K no citoplasma, para

garantir, principalmente, a atividade enzimática, bem como a manutenção do

sistema antioxidativo. Segundo Wallingford (1980), algumas das funções

bioquímicas de K na planta estão relacionadas à ativação de enzimas e à síntese de

proteínas. Este fato pode justificar a identificação da enzima SOD por espectrometria

de massas (spot 285 de PA 13) e a maior atividade desta enzima em plantas de T.

cacao submetidas a déficit hídrico severo, onde foram observadas diferenças

significativas para a atividade desta enzima, tanto entre os genótipos como dentro

dos tratamentos com as doses de K.

Alguns trabalhos com A. thaliana mostraram aumento na atividade de SOD

em resposta a estresses abióticos como déficit hídrico (JUNG, 2004). Além disso,

aumento na atividade desta enzima, em folhas de plantas sob estresse, tem sido

amplamente relatado (WANG; LI, 2008). Silva et al. (2012), em estudos realizados

com plantas de Jatropha curcas submetidas a diferentes regimes hídricos, relataram

aumento na atividade de SOD, indicando que SOD desempenhou um grande papel

na remoção do O2−, quando as plantas sofreram estresse hídrico. Os estudos

realizados por Neves (2014), com os mesmos genótipos de T. cacao submetidos à

deficiência hídrica e a doses elevadas de K no solo, mostraram maior capacidade de

absorção e acúmulo de Mn pelas plantas, sendo que o genótipo tolerante (PA 13)

apresentou maior acúmulo. Este elemento metálico apresenta um papel catalisador

na atividade de SOD, para proteção das plantas contra EROs e de outras enzimas

(HÄNSCH; MENDEL, 2009). Isto, por sua vez, contribue para a tolerância à

deficiência hídrica em plantas e comprova a influência das doses mais elevadas de

K no solo com o aumento da atividade de SOD. Além disso, Upadhyaya et al. (2012)

observaram que o acúmulo de K e Mn em plantas de Camellia sinenseis

apresentaram respostas positivas ao crescimento e metabolismo antioxidativo,

durante o processo de recuperação de deficiência hídrica.

Após dismutação do O2− em H2O2 pela SOD, outras enzimas, como as

peroxidases (PODs), que transformam H2O2 em H2O e O2, são acionadas para

76

eliminar o H2O2 que é altamente tóxico para célula (GILL; TUTEJA, 2010). O

acúmulo destas enzimas antioxidantes nos tecidos vegetais está diretamente

relacionado à tolerância ao estresse (GILL; TUTEJA, 2010). A enzima APX é

considerada de maior eficiência na degradação do H2O2 (MADHUSUDHAN et al.,

2003). No presente trabalho, a atividade das peroxidases APX e GPX foi diferencial

entre os genótipos e entre os tratamentos. Para ambos os genótipos, APX

apresentou maior atividade nos tratamentos com dose ideal de K e deficiência

hídrica severa. Em contrapartida, CC 40 (intolerante) apresentou maior acúmulo de

APX, quando comparado ao PA 13, indicando que este genótipo apresenta,

naturalmente, uma maior ação de APX. Isto sugere que a produção dessa enzima,

na condição de dose ideal de K, já foi suficiente para manter a degradação H2O2 e

proteger a célula dos efeitos danosos provocados pelo estresse oxidativo em ambos

os genótipos. Além disso, respostas semelhantes também foram encontradas em

estudos com Saccharum officinarum, quando submetida à deficiência hídrica

(PATADE et al., 2011; CIA et al., 2012). Ademais, o incremento na atividade de APX

ocorre tanto em condições de déficit hídrico moderado quanto severo (SANKAR et

al., 2007; AZEVEDO NETO et al., 2009; AKCAY et al., 2010; PEREIRA et al., 2012).

Em contrapartida, para a atividade de GPX, o efeito foi inverso em relação à

atividade de APX. Os tratamentos com dose superior de K e deficiência hídrica

severa apresentaram maior atividade de GPX em relação aos demais tratamentos.

Além disso, o genótipo tolerante mostrou maior atividade de GPX se comparado

com o genótipo intolerante. Isto, por sua vez, indica que GPX é uma das

peroxidases mais importante para PA 13 (tolerante) na destoxificação de EROs, em

condições de déficit hídrico severo e de doses elevadas de K no solo. Aumento

similar de atividade de PODs também foi observado e relatado em outras pesquisas

envolvendo deficiência hídrica (RATNAYAKA et al., 2003; NAZARLI et al, 2011;

GHOLAMI et al., 2012). Em estudos realizados por Santos et al. (2014), com

genótipos de T. cacao contrastantes para à tolerância ao déficit hídrico no solo,

observaram aumento na atividade da enzima GPX em 81% dos genótipos

submetidos ao déficit hídrico do solo. Além disso, estes autores verificaram reduções

significativas na atividade desta enzima para os genótipos com moderada tolerância

e intolerantes à seca. Portanto, estes resultados reforçam o fato de que as plantas

77

buscam desenvolver diferentes mecanismos de proteção e adaptação a situações

de estresse.

Zhao et al. (2005) observaram que as plantas submetidas à estresse biótico

apresentaram alta atividade de PODs e PAL, em relação as plantas controle.

Segundo Chakraborty et al. (2001), a atividade de PAL aumenta em resposta a

diferentes tipos de estresse, sendo considerada por muitos autores como a “proteína

do estresse”, que, por sua vez, se relaciona com desenvolvimento de mecanismos

de proteção e adaptação de plantas a situações adversas. A PAL é a enzima chave

na via dos fenilpropanóides e seus derivados (SCHWAN-ESTRADA et al., 2008),

uma rota envolvida na síntese de compostos fenólicos em vegetais (TAIZ; ZEIGER,

2013). Estes compostos são precursores da lignina e do ácido salicílico, que atuam

na defesa estrutural e no processo de sinalização em resposta aos estresses

abióticos (BONAS; LAHAYE, 2002). Portanto, a expressão de PAL em plantas está

diretamente relacionada com a tolerância a diversos fatores bióticos e abióticos, cujo

estresse hídrico promove o aumento nas concentrações de metabólitos secundários

em plantas (CHAKRABORTY et al., 2001). A atividade de PAL foi elevada em

ambos os genótipos de T. cacao submetidos aos tratamentos de doses de K e

deficiência hídrica severa no solo, tendo como destaque o tratamento com dose

ideal de K, onde se verificou a maior atividade de PAL para o genótipo CC 40

(intolerante). Assim, pode-se dizer que os mecanismos de defesa e de produção de

metabólitos secundários foram ativados, contribuindo para uma maior tolerância à

deficiência hídrica severa na presença de K.

78

CONCLUSÕES

O aumento da dose de K, em condições de deficiência hídrica severa no solo,

além de regular a síntese de proteínas foliares relacionadas à tolerância ao estresse

hídrico, promoveu o aumento da atividade das enzimas SOD e GPX envolvidas no

metabolismo antioxidativo, principalmente para o genótipo de T. cacao PA 13

tolerante à seca. Logo, há uma interação positiva entre dose de K, síntese proteica,

metabolismo antioxidativo e tolerância ao déficit hídrico severo em plantas de T.

cacao.

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