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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
MAYANA LEANDRA SOUZA DOS SANTOS
MITIGAÇÃO DA TOXICIDADE DE CÁDMIO POR ZINCO EM PLANTAS JOVENS
DE CACAU
ILHÉUS - BAHIA
2019
ii
MAYANA LEANDRA SOUZA DOS SANTOS
MITIGAÇÃO DA TOXICIDADE DE CÁDMIO POR ZINCO EM PLANTAS JOVENS
DE CACAU
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, da Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora em Produção vegetal.
Área de concentração: Cultivos em Ambiente Tropical Úmido.
Orientador: Prof. Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida.
Co-orientador: Prof. Dr. José Olímpio Souza Junior
ILHÉUS - BAHIA
2019
iii
MAYANA LEANDRA SOUZA DOS SANTOS
MITIGAÇÃO DA TOXICIDADE DE CÁDMIO POR ZINCO EM PLANTAS JOVENS
DE CACAU
Ilhéus, BA, 20 de fevereiro de 2019.
_________________________________________
Prof. Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida
UESC/DCB
(Orientador)
_________________________________________
Prof. Drª. Milena do Amaral Santos - DS
UESC/DCB
_________________________________________
Prof. Dr. Pedro Antônio Oliveira Mangabeira - DS
UESC/DCB
________________________________________
Profª. Drª. Martielly Santana dos Santos - DS
UESC/DCB
_________________________________________
Profª. Drª. Amanda Ferreira Mendes - DS
IFBA/Campus Ilhéus
iv
Aos meus pais, Leda Maria e Joelson Manoel pela valiosa educação familiar que
souberam me dar e à educação formal que puderam me proporcionar, diante todas
as dificuldades enfrentadas ao longo do caminho...
Às melhores amigas e irmãs, Kalyana Leandra e Patrícia Leandra por todo carinho e
amor que nos nutre e une...
À minha sobrinha Victória Leandra que faz parte desse lindo elo chamado família...
Dedico
v
AGRADECIMENTOS
Ao grandioso Deus por estar sempre presente em minha vida, mantendo a
minha fé e me fazendo superar sofrimentos e obstáculos.
À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), pela minha formação
profissional e pelo apoio para a execução deste trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, pela oportunidade
concedida.
Ao Professor orientador Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida, pela orientação do
trabalho que me conduziu à concretização de mais uma importante etapa da minha
vida acadêmica.
Aos colegas de orientação, membros do grupo de pesquisa da Fisiologia
Vegetal, pela colaboração com o trabalho em todas as suas etapas, pelo apoio
acadêmico e emocional, pela companhia e preocupação demonstrada.
Aos funcionários de campo da UESC, em especial ao Zezinho, pela ajuda
diária na etapa de campo e pela constante atenção prestada para a realização do
trabalho.
Aos colegas de trabalho do Instituto Federal de Educação Ciência e
Tecnologia pelo incentivo através de palavras de carinho.
À minha família, por sempre acreditar em mim e me incentivar a buscar
sempre mais.
Enfim, a todos que, de alguma forma, contribuíram para a concretização
desse trabalho em todas as suas etapas. Agradeço!
vi
Quanto maior são as dificuldades a
vencer, maior será a satisfação
(Cícero)
vii
BIOGRAFIA
MAYANA LEANDRA SOUZA DOS SANTOS, filha de Joelson Manoel dos
Santos e Lêda Maria Souza dos Santos, nasceu em Ilhéus, Bahia, Brasil, em 20 de
novembro de 1982. Em 2002 ingressou na Universidade concluindo o curso de
Graduação em Engenharia Agronômica em 2006, pela Universidade Estadual de
Santa Cruz – UESC. Em março de 2007 iniciou o curso de Mestrado em Produção
Vegetal na Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC, concluindo o mesmo em
julho de 2009. Nesse mesmo ano, no mês de fevereiro, iniciou seu trabalho no
Instituto do Meio Ambiente do Estado da Bahia, que posteriormente foi fundido com
o Instituto de Gestão das Águas e se transformou no Instituto do Meio Ambiente e
Recursos Hídricos do Estado da Bahia, aonde permaneceu até 2012. Nesse
interstício, cursou a especialização em engenharia de Segurança do Trabalho,
concluindo em 2011 e também foi aprovada em concurso público para ocupar cargo
de professora do ensino básico técnico e tecnológico no Instituto Federal de
Educação Ciência e Tecnologia do Estado da Bahia, Campus Ilhéus, onde atua.
viii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 4
2.1 Geral ........................................................................................................................... 4 2.2 Específicos ................................................................................................................ 5
3. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 6
3.1 Zn e seus efeitos em plantas ............................................................................... 6 3.2 Cd e seus efeitos em plantas ............................................................................... 7
3.3 Interação Zn e Cd e seus efeitos em plantas ..................................................... 8
3.4 Mecanismos de defesa das plantas aos metais pesados ................................. 9
4. METODOLOGIA ..................................................................................................... 11 4.1 Material vegetal e condições de cultivo ............................................................ 11
4.2 Trocas gasosas foliares ...................................................................................... 16
4.3 Concentrações de Zn e Cd ................................................................................ 16 4.4 Teor de prolina .................................................................................................... 17
4.5 Peroxidação lipídica ............................................................................................ 17
4.6 Metabolismo antioxidativo .................................................................................. 18
4.6.1 Obtenção do extrato bruto .......................................................................... 18 4.6.2 Atividade da dismutase do superóxido (SOD, EC 1.15.1.1) .................... 19
4.6.3 Atividade da catalase (CAT, EC 1.11.1.6) ................................................. 19
4.6.4 Atividade da peroxidase do ascorbato (APX, EC 1.11.1.11) ................... 19 4.6.5 Atividade da peroxidase do guaiacol (GPX, EC 1.11.1.7) ....................... 20
4.7 PCR quantitativo em tempo real ........................................................................ 20
4.8 Análise micromorfológica ................................................................................... 21
4.9 Análise estatística ............................................................................................... 22 5. RESULTADOS ....................................................................................................... 22
5.1 Zn mitiga a toxidez de Cd em folhas por efeito antagônico ............................ 22
5.2 A interação Zn e Cd afeta a eficiência de carboxilação ao longo do tempo . 25 5.3 Prolina atua como importante mecanismo de defesa aos metais pesados .. 30
5.4 Peroxidação de lipídios em resposta ao estresse ........................................... 31
5.5 Resposta ao estresse por meio do metabolismo antioxidativo ...................... 32
5.6 Expressão de genes em resposta ao estresse ................................................ 38 5.7 Alterações micromorfológicas ............................................................................ 40
6. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 43
7. CONCLUSÕES....................................................................................................... 49 8. REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 49
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Dados microclimáticos coletados durante a condução do experimento. Valores médios de temperatura do ar (A), umidade relativa do ar (B) e radiação fotossinteticamente ativa (PAR) (C).
Figura 2 Concentrações de Zn e Cd em folhas (A e B) e raízes (C e D) de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 3 Fatores de Translocação de Zn (A) e Cd (B) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 4 Taxa fotossintética líquida por unidade de área foliar (A) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 5 Condutância estomática ao vapor d‟água (gs) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 6 Transpiração foliar (E) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 7 Eficiência intrínseca do uso da água (A/gs) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 8 Eficiência instantânea do uso da água (A/E) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo
x
teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 9 Eficiência de carboxilação (A/Ci) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 10 Teor de prolina em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 11 Teor de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 12 Atividade da dismutase do superóxido (SOD) em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo as três (A), seis (B), 12 (C), 24 (D), 48 (E) e 96 h (F) após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 13 Atividade de Catalase (CAT) em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo as três (A), seis (B), 12 (C), 24 (D), 48 (E) e 96 h (F) após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 14 Atividade da peroxidase do ascorbato (APX) em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo as três (A), seis (B), 12 (C), 24 (D), 48 (E) e 96 h (F) após aplicação dos tratamentos. Corte em F representa 260 mmol AsA g-1 MS. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 15 Atividade da peroxidase do guaiacol (GPX) em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo as três (A), seis (B), 12 (C), 24 (D), 48 (E) e 96 h (F) após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 16 Expressão relativa de genes relacionados à biossíntese de proteínas intrínseca (PsbA) e extrínseca (PsbO) ao fotossistema 2 (PS2) da fotossíntese e às enzimas do metabolismo antioxidativo (SODCyt,
xi
SODChl e per-1), em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo, as seis (A) e 48 h (B) após aplicação dos tratamentos. Valores médios de três repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05).
Figura 17 Micromorfologia de seções transversais do mesofilo foliar de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. (A) Controle (sem adição de Zn ou Cd), (B) Zn (0,8 mmol kg-1 solo), (C) Zn (1,6 mmol kg-1 solo), (D) Cd (0,4 mmol kg-1 solo), (E) Cd (0,8 mmol kg-1 solo), (F) Zn + Cd (1,2 + 0,2 mmol kg-1 solo), (G) Zn + Cd (0,8 + 0,4 mmol kg-1 solo) e (H) Zn + Cd (0,4 + 0,6 mmol kg-1 solo). Barra: 40 μm.
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Características físico-químicas do solo utilizado para crescimento de plantas jovens seminais do genótipo de cacau CCN 51.
Tabela 2 Adubação de plantio e cobertura para as plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51.
Tabela 3 Distribuição dos tratamentos, sem adição de cádmio (Cd) e zinco (Zn) - controle*, e a combinação de concentrações desses elementos aplicados no solo, na forma de cloreto de cádmio (CdCl2) e cloreto de zinco (ZnCl2).
Tabela 4 Características anatômicas, observadas ao microscópio eletrônico de varredura (MEV), de folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de três repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05).
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LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
A Fotossíntese líquida
gs Condutância estomática ao vapor de água
E Transpiração foliar
A/gs Eficiência intrínseca do uso da água
A/E Eficiência instantânea do uso da água
A/Ci Eficiência de carboxilação
SOD Dismutase do superóxido
GPX Peroxidase do guaiacol
CAT Catalase
APX Peroxidase do ascorbato
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ERO Espécies reativas de oxigênio
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MITIGAÇÃO DA TOXICIDADE DE CÁDMIO POR ZINCO EM PLANTAS JOVENS
DE CACAU
RESUMO
Cádmio (Cd) é um metal traço sem função biológica essencial devido à sua alta toxicidade para plantas, animais e seres humanos, mesmo em baixas concentrações. Por outro lado, o Zn é um nutriente essencial e desempenha importantes funções metabólicas nas plantas. O estudo da interação entre um nutriente e um elemento não essencial pode ser importante para compreensão, análise e melhoria das estratégias de defesa apresentadas pelas plantas. O objetivo desse trabalho foi avaliar a mitigação da toxicidade de Cd por Zn em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51, cultivadas no solo com diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd, por meio de parâmetros fisiológicos, bioquímicos, moleculares e micromorfológicos. O aumento da concentração de Cd no solo alterou a absorção de Cd e Zn pelas raízes do genótipo de cacau CCN 51. O aumento da concentração de Zn no solo promoveu a diminuição da absorção de Cd pelo sistema radicular do genótipo de cacau CCN 51, reduzindo o transporte de Cd para as folhas. As raízes imobilizaram grande parte do Cd em seus tecidos, como estratégia de tolerância, evitando que parte de Cd fosse transportado para parte aérea. As trocas gasosas foliares foram afetadas nas maiores concentrações de Cd (0,4, 0,6 e 0,8 mmol Cd kg-1 solo) combinadas com diferentes concentrações de Zn (0,4, 0,8, 1,2 e 1,6 mmol kg-1 solo), resultando no decréscimo da fixação de CO2. Baixa concentração de Cd favoreceu a fotossíntese sugerindo, portanto, a ocorrência do efeito hormese, ao observar elevada atividade fotossintética na concentração de 0,2 mmol Cd kg-1 solo. Verificou-se que altas concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo promoveram alterações no metabolismo antioxidativo enzimático e não enzimático, na expressão de genes envolvidos na fotossíntese e no metabolismo antioxidativo, evidenciadas pelas respostas das plantas do genótipo de cacau CCN 51, por meio do aumento da atividade das enzimas antioxidativas e do teor de prolina e da redução da peroxidação lipídica. Por fim, a maior concentração de Cd (0,8 mmol kg-1 solo), juntamente com as concentrações intermediárias de Zn + Cd (0,8 + 0,4 e 0,4 + 0,6 mmol kg-1 solo), promoveu redução da espessura do mesofilo foliar e, consequentemente, diminuição das trocas gasosas foliares. Palavras-chave: Theobroma cacao, metal pesado, fotossíntese, estresse oxidativo,
expressão gênica, micromorfologia.
xv
MITIGATION OF CADMIUM TOXICITY BY ZINC IN SEEDLING COCOA PLANTS
ABSTRACT
Cadmium (Cd) is a trace metal without essential biological function due to its high toxicity to plants, animals and humans, even at low concentrations. On the other hand, Zn is an essential nutrient and plays important metabolic functions in plants. Study of the interaction between a nutrient and a nonessential element may be important for understanding, analyzing and improving the defense strategies presented by plants. Main objective of this work was to evaluate the mitigation of Cd by Zn toxicity in young plants of the CCN 51 cocoa genotype, grown in soil with different concentrations of Zn, Cd and Zn+Cd, throught of physiological, biochemical, molecular and micromorphological. Increase in Cd concentration in the soil altered the uptake of Cd and Zn by the roots of the CCN 51 cocoa genotype. Increase of Zn concentration in the soil promoted the decrease of the Cd uptake by the root system of the CCN 51 cacao genotype, reducing the transport of Cd to the leaves. Roots immobilized much of the Cd in their tissues, as a tolerance strategy, avoiding that part of Cd was transported to aerial part. Leaf gas exchanges were affected at the highest concentrations of Cd (0.4, 0.6 and 0.8 mmol Cd kg-1 soil) combined with different concentrations of Zn (0.4, 0.8, 1.2 and 1.6 mmol kg-1 soil), resulting in a decrease in CO2 fixation. Low Cd concentration favored photosynthesis, suggesting, therefore, the occurrence of the hormone effect, when observing high photosynthetic activity in the concentration of 0.2 mmol Cd kg-1 soil. It was verified that high concentrations of Zn, Cd and Zn+Cd in the soil promoted alterations in the enzymatic and non-enzymatic antioxidative metabolism, in the expression of genes involved in photosynthesis and antioxidative metabolism evidenced by the responses of the CCN 51 cacao genotype plants, by increasing the activity of the antioxidative enzymes and the proline content and the reduction of the lipid peroxidation. Finally, the higher concentration of Cd (0.8 mmol kg-1 soil), together with the intermediate concentrations of Zn + Cd (0.8 + 0.4 and 0.4 + 0.6 mmol kg-1 soil), promoted reduction of the thickness of the leaf mesophyll and, consequently, decrease of the leaf gas exchanges. Key words: Theobroma cacao, heavy metal, photosynthesis, oxidative stress, gene expression, micromorphology.
1
1. INTRODUÇÃO
Theobroma cacao é uma espécie perene, arbórea, que produz frutos de
grande importância econômica, em virtude de suas sementes serem a matéria-prima
para um dos produtos mais consumidos no mundo - o chocolate, bem como para
outros derivados e subprodutos, como manteiga, lícor, cosméticos, bebidas finas,
geléias, sorvetes e sucos (ALMEIDA; VALLE, 2010). Essa espécie é cultivada nos
continentes Africano, Americano e Asiático, que produzem aproximadamente 76,1%,
16,3% e 7,6% da produção mundial, respectivamente, com previsão de 4.587 mil
toneladas para a safra 2017/2018. No continente americano, o Brasil se destaca
como um país importante na produção de amêndoas de cacau, cuja produção está
concentrada na região sul do estado da Bahia, com previsão de safra de 170 mil
toneladas (ICCO, 2018).
Após a grande crise da lavoura cacaueira no final da década de 80, devido à
doença conhecida como vassoura de bruxa, causada pelo fungo Moniliophthora
perniciosa, o Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC) vem fazendo seleção de
material em propriedades. As populações usadas na seleção são oriundas, de
populações-base melhoradas no CEPEC e de clones equatorianos (CCN 10 e CCN
51) e o material clonal autocompatível e resistente à vassoura-de-bruxa são
disponibilizados aos produtores (MONTEIRO; AHNERT, 2012). Tal método se
apresentou como uma alternativa rápida e com eficácia, para se obter variedades
melhoradas, especialmente com características de interesse, como elevada
produtividade e resistência a doenças em condições de campo.
O genótipo de T. cacao CCN-51 [Coleccion Castro Naranjal (CCN)], oriundo
do cruzamento do híbrido 'ICS-95 x IMC-67' com um cultivar equatoriano
denominado „Canellos‟, é um dos mais importantes recursos genéticos do Equador
(CASTRO, 1981; BOZA et al., 2014), cujos ancestrais predominantes são os grupos
genéticos Iquitos (45,4%), Criollo (22,2%) e Amelonado (21,5%). Além disso, o
genótipo CCN 51 é autocompatível, apresenta alta produtividade, maior resistência à
vassoura de bruxa [Moniliohthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora] em
relação aos outros genótipos e possui características físicas, químicas e sensoriais,
no produto final, superiores, com alta concentração de gordura em suas amêndoas
(BOZA et al., 2014). Por esse motivo, vem sendo bastante utilizado pelos produtores
de cacau. No Estado da Bahia, a atividade está distribuída em mais de 50
2
municípios sendo responsável por mais de 50% da produção de amêndoas secas de
cacau no Brasil (SODRÉ et al., 2017a), onde características de resistência à doença,
fatores como a fertilidade do solo e a nutrição mineral são relevantes para que essa
cultura obtenha elevada produtividade (SODRÉ et al., 2017b).
Os níveis de metais nos alimentos têm sido uma preocupação da FAO –
Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação e diversos
estudos, buscando identificar esses elementos em sementes e produtos do cacau,
têm sido desenvolvidos ao redor do mundo (DAHIYA et al., 2005; AIKPOPODION et
al., 2013; YANUS et al., 2014; CHAVEZ et al., 2015; VITOLA; CIPROVICA, 2016;
ARGÜELLO et al., 2019). A contaminação no solo pode ocorrer de forma natural ou
por meio de práticas humanas, a exemplo de práticas agrícolas como a aplicação de
pesticidas e fertilizantes fosfatados (ZARCINAS et al., 2004; MENDES et al., 2006;
GRAMLICH et al., 2017), irrigação (CHAVEZ et al., 2015) e atividades em indústrias
de reciclagem de baterias (SCHRECK et al., 2012). Nas plantas, a absorção e o
transporte de longa distância via floema representa o principal caminho para o
acúmulo de metais tóxicos em sementes e grãos (CLEMENS; MA, 2016) podendo
interromper parâmetros fotossintéticos e fotorrespiração, mudando a homeostase
celular (GEORGIADOU et al., 2018) além de causar efeitos adversos à saúde
quando consumidos por animais e humanos haja vista que, uma vez absorvidos pelo
sistema radicular, os metais pesados podem ser transportados para os tecidos,
contaminando partes comestíveis e tornando-se bioacumulativo no organismo
(SCHRECK et al., 2012). Nesse contexto, o zinco e o cadmio são exemplos de
metais pesados que vêm ganhando destaque e avaliados conjuntamente no sentido
de observar o comportamento e possível efeito mitigatório, devido a essa
similaridade, efeitos às plantas, assim como pelo interesse em identificar plantas
fitoacumuladoras (ARAVIND; PRASAD, 2003; HASSAN et al., 2005; SRIDHAR et al.,
2005; SCHRECK et al., 2012; CHERIF et al., 2011; ZHAO et al., 2011; JAMALI et al.,
2014).
Zinco (Zn) é um metal pesado de transição e o 24º mais encontrado na crosta
terrestre (ALLOWAY, 2013). No solo, a sua biodisponibilidade é modulada por
fatores físicos e químicos do solo, e sua solubilidade no solo decresce com o
aumento nos níveis de carbonato de cálcio, óxidos metálicos, pH e baixos níveis de
matéria orgânica e umidade do solo, assim como altas quantidades de fosfato
(CAKMAK et al., 2010). Nas plantas, pode atuar como cofator funcional, estrutural ou
3
regulatório de um grande número de enzimas, ajuda na manutenção da integridade
da membrana celular por meio da interação com fosfolipídios e grupos sulfidrila das
proteínas da membrana (CAKMAK et al., 2010). Dentro desse contexto, em plantas
sob deficiência de Zn, muitas funções fisiológicas dependentes desse micronutriente
essencial não são capazes de funcionar normalmente, afetando a homeostase
celular (HENRIQUES et al., 2012) a exemplo de mudanças bioquímicas nas
membranas, como a permeabilidade e a arquitetura, capaz de proteger contra a
peroxidação de lipídios (CAKMAK et al., 2010), no metabolismo dos carboidratos,
devido ao declínio da fotossíntese (SINGH; PRASAD, 2015). Para superar a
condição de deficiência, as plantas podem aumentar a expressão de genes que
codificam transportadores de zinco bem como de enzimas envolvidas na biossíntese
de quelantes de metais que interferem na absorção do zinco do solo (VAN DE
MORTEL et al., 2006).
O cádmio (Cd) é um metal traço sem função biológica essencial,
caracterizado pela sua alta toxicidade para plantas, animais e humanos mesmo em
baixas concentrações (MA et al., 2003; GRAMLICH et al., 2017). Ocorre na crosta
terrestre em baixas concentrações, geralmente associado ao Zn em depósitos de
sulfito. É encontrado na forma inorgânica Cd2+ apresentando baixo coeficiente de
adsorção e alta mobilidade no sistema solo-planta (CLEMENS e MA, 2016). Está
relacionado à fração ácido-solúvel e ligado à matéria orgânica e, portanto, a sua
disponibilidade no solo pode ser afetada pela alteração do pH do solo e
decomposição de matéria orgânica (PRASAD; HAGEMEYER, 1999; ALLOWAY, et
al., 2013; CHAVEZ et al., 2016), capacidade de troca de cátions e teor de argila
(ALLOWAY, et al., 2013), tornando-o disponível à planta.
A primeira estratégia da planta, em que o Zn pode mitigar a toxidez por metais
pesados é restringindo a entrada de metais através das raízes, reduzindo a
biodisponibilidade de metais no solo ou a absorção por proteínas transportadoras.
Também, podem tolerar e restringir a acumulação por meio da homeostase de
nutrientes, pela limitação da disponibilidade. Ainda, por meio do sistema de defesa
antioxidante (HASSAN et al., 2017). Em função dos elementos metálicos Cd e Zn
serem bastante similares na sua forma iônica como estão disponíveis no solo, o Cd
é capaz de imitar o comportamento de Zn na sua absorção, com maior tendência a
ser absorvido pelas plantas quando as quantidades de Zn no solo são baixas
(KIRKHAM, 2006; MITRA et al., 2015). Dessa forma, a eficiência de translocação de
4
Cd e Zn estão altamente correlacionadas, sugerindo a possibilidade de um
mecanismo de transporte comum para ambos os metais, significando que a
acumulação do Cd nas plantas pode ser modulada pela presença do Zn (WHITING
et al., 2000; HART et al., 2002; XING et al., 2008; LIU et al., 2010). Assim, o Zn pode
ser efetivo na regulação da absorção de Cd (GREEN et al.,2003).
Devido à alta toxicidade dos metais, além dos efeitos à saúde, legislações
têm sido criadas estabelecendo concentrações a limites seguros, limitando a
exportação de sementes de cacau com altos níveis de metais tóxicos. A ICCO –
International Cocoa Organization, estabeleceu regulamento restringindo os níveis do
metal em sua comercialização, que podem variar de 0,1 a 0,8 mg Cd kg-1 MS, a
serem aplicados a partir de 2019, com valores críticos dependentes da porcentagem
de matéria-prima utilizada no produto final (The European Comission, 2014). Outros
países e organizações estabeleceram diferentes níveis admissíveis, a exemplo da
Malásia que estabelece 1,00 mg Cd kg−1, e Austrália, de 0,5 mg Cd−1 (ZARCINAS et
al., 2004). Nesse contexto, temos como hipótese que o Zn atenua a toxicidade de
Cd em mudas de cacau por meio de ajustes morfofisiológicos e moleculares. Para
isso, foram elaborados os seguintes questionamentos: (i) Qual concentração de Zn
favoreceria a atenuação da toxidez por Cd? (ii) Há efeitos sinérgicos ou antagônicos
da relação Zn/Cd? (iii) A mitigação da toxidez de Cd por Zn é evidenciada pelo
aumento da atividade de enzimas antioxidantes?
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar a mitigação da toxicidade de Cd por Zn em plantas jovens do genótipo
de cacau CCN 51, cultivadas no solo com diferentes concentrações de Cd, Zn e
Cd+Zn, por meio de parâmetros fisiológicos, bioquímicos, moleculares e
ultraestruturais.
5
2.2 Específicos
Medir as trocas gasosas, em nível foliar, nos diferentes tratamentos visando
acompanhar a atividade fotossintética e possíveis danos fotooxidativos
causados pelos metais.
Determinar a composição de Zn e Cd, nos diferentes órgãos das plantas, nos
diferentes tratamentos visando avaliar o mecanismo de absorção e
distribuição dos metais na planta.
Avaliar a ultraestrutura celular em folhas dos diferentes tratamentos, utilizando
microscopia eletrônica de varredura (MEV), respectivamente visando observar
alterações ou danos na estrutura intercelular, decorrentes da exposição aos
metais.
Determinar a atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo antioxidativo
em folhas, dos diferentes tratamentos, visando obter resposta do mecanismo
de defesa ao estresse oxidativo.
Analisar a expressão de genes envolvidos no metabolismo antioxidativo e da
fotossíntese, em nível foliar, visando observar os níveis de expressão dos
mesmos.
6
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Zn e seus efeitos em plantas
O Zn é um micronutriente essencial às plantas, ou seja, é um elemento que
está envolvido diretamente no metabolismo da planta, como constituinte de um
composto ou necessário para a ação de um sistema enzimático, que não pode ser
substituído por outro e que, na sua ausência, o ciclo de vida é afetado (ARNON;
STOUT, 1939). Ocorre em altas concentrações nos sistemas biológicos quando
comparados com outros micronutrientes (CAKMAK, 2000). Sua forma natural de
entrada no substrato é através do intemperismo físico ou químico da rocha matriz do
solo, se apresentando como Zn orgânico e inorgânico, e está disponível
principalmente como Zn2+, ou complexado com ligantes orgânicos (BROADLEY et
al., 2007).
Por ser um micronutriente essencial desempenha importantes funções
metabólicas nas plantas, estando associado ao metabolismo dos carboidratos e
desempenha um papel estrutural ou catalítico em várias enzimas, a exemplo da
dismutase do superóxido, desidrogenase, protease, peptidase e fosfoidrolase
(KABATA-PENDIAS, 1985, CHERIF et al., 2010, CHERIF et al., 2011). Além disso,
regula a expressão de genes, mantém a integridade estrutural do ribossomo,
participa do metabolismo de fosfato (KABATA-PENDIAS, 1985, CHERIF et al.,
2010), preserva a orientação estrutural das macromoléculas das membranas
celulares afim de manter a integridade e o funcionamento do transporte de íons
através das mesmas (CAKMAK, 2000; HAFEEZ et al., 2013). Assim, atua cumprindo
importante papel na proteção celular contra efeitos induzidos pelas espécies reativas
de oxigênio (CAKMAK, 2000). As plantas apresentam concentrações tóxicas de Zn
distintas em função da espécie, sendo a faixa de 100 a 400 mg Zn kg-1 de tecido
foliar considerada tóxica para o crescimento da maioria das plantas (KABATA-
PENDIAS, 1985). Plantas de cacau apresentam teor foliar adequado variando entre
20 e 100 mg Zn kg-1 MS (SODRÉ et al., 2017b).
Plantas afetadas por altas concentrações de Zn podem apresentar sintomas
semelhantes à toxidez por outros metais pesados, como cádmio ou chumbo e
podem induzir deficiência de magnésio (Mg) e ferro (Fe) pelo fato dos três metais
7
possuírem raio iônico semelhante (SAGARDOY et al., 2009). Marques e Nascimento
(2014) consideram a alteração na composição mineral como efeitos da toxicidade de
Zn nas plantas, ao observarem a redução dos conteúdos dos nutrientes N, P, K, Ca,
Mg, Cu, Fe, Mn, B, e Mo, cuja deficiência pode induzir a distúrbios em diversos
processos metabólicos, incluindo a fotossíntese e a redução assimilatória de N.
3.2 Cd e seus efeitos em plantas
O Cd é um metal traço não essencial e possui alta toxicidade mesmo em
baixas concentrações (GRAMLICH et al., 2017). Atravessa a raiz através de rotas
apoplásticas ou simplásticas, antes de entrar no xilema e ser translocado para a
parte aérea. Acredita-se que o movimento através do simplasma radicular seja
restrito pela produção de fitoquelatinas e pela compartimentalização de quelatos de
Cd em vacúolos. O aumento das concentrações na rizosfera eleva seu acúmulo na
planta, principalmente nas raízes (LUX et al., 2010). O movimento apoplasmático
para o xilema pode ser restringido pelo desenvolvimento da exoderme, endoderme e
outras barreiras extracelulares. A camada de suberização do sistema radicular como
resposta ao estresse nutricional e regulada por hormônios de estresse, e implica na
plasticidade funcional e anatômica de raízes adultas (BARBERON et al., 2015).
Semelhante a outros metais pesados, é possível que o Cd entre nas células vegetais
através de transportadores de cátions com ampla especificidade de substrato. A
absorção deste metal pesado por membranas plasmáticas vegetais pode ser
mediado pelas proteínas da família ZIP – Zinc-regulated transporter/Iron-regulated
transporter-like Protein (IRT1 e ZNT1), Nramp, CDF e LCT1, bem como através de
canais de cálcio e potássio (PERFUS-BARBEOCH et al., 2002).
Nos vegetais, o acúmulo de Cd pode causar danos à maquinaria
fotossintética, ao metabolismo antioxidativo, à expressão de genes e danos
irreversíveis às células, afetando o crescimento das plantas (LI et al., 2015; ARAÚJO
et al., 2017), sendo que uma das principais vias de absorção de metais pesados
pelas plantas, especialmente o Cd, se dá pela aplicação de fertilizantes fosfatados
(SILVA et al., 2017) o que tem atraído a atenção e aumentado a preocupação dos
pesquisadores, visto que esse metal tem sido encontrado em sementes e produtos à
base de cacau, confirmados através de pesquisas em diversos locais ao redor do
mundo (DAHIYA et al., 2005; AIKPOPODION, et al., 2013; YANUS et al., 2014;
8
CHAVEZ et al., 2015; VITOLA; CIPROVICA, 2016) além dos graves efeitos que
podem ocasionar à saúde.
3.3 Interação Zn e Cd e seus efeitos em plantas
As plantas absorvem elementos essenciais e benéficos do solo, mas devido à
sua seletividade não ser perfeita, podem absorver elementos não essenciais quando
estes estão disponíveis (CLEMENS; MA, 2016). O estudo da interação entre um
nutriente e um elemento não essencial pode ser importante para compreensão,
análise e melhoria das estratégias de defesa por meio de vários parâmetros
(JAMALI, 2014). Cd e Zn têm semelhanças físicas e químicas, uma vez que ambos
pertencem ao grupo II da tabela periódica e geralmente são encontrados associados
nos minérios, competindo um com o outro por vários ligantes (ARAVIND; PRASAD,
2005).
Tanto Zn quanto Cd, em concentrações elevadas, podem ter efeitos
prejudiciais causando a toxicidade em plantas (NADGÓRSKA-SOCHA et al., 2013;
CHEN et al., 2017) ao induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO),
como superóxido (O2•-), radicais hidroxila (OH-) e peróxido de hidrogênio (H2O2).
ERO provoca danos oxidativos em ácidos nucleicos, proteínas, açúcares e lipídios,
que ao interagir com os componentes celulares, levam ao estresse oxidativo em
células e membranas e, em casos mais adversos, à morte celular (GADJEV et al.,
2008), além de causar alterações no aparato fotossintético (CAMBROLLÉ et al.,
2013). No entanto, ERO atua como moléculas de sinalização para a indução de
respostas de plantas a estresses ambientais, a exemplo dos metais (AHMAD et al.,
2008).
Resultados indicam que a adição de Zn ameniza a toxicidade por Cd, em
plantas de Triticum aestivum, quando a razão Zn/Cd é maior que 10/1 e, por outro
lado, maior nível de Zn diminui a toxicidade de Cd nos parâmetros de crescimento
(ZHAO et al., 2011), e também atua no ganho de biomassa, na taxa fotossintética e
teor de clorofila, enquanto diminui o teor de malondialdeído e as atividades das
enzimas antioxidantes em cultivares de arroz (HASSAN, et al., 2005). Em tomate
(Solanum lycopersicum), o estresse por Cd aumenta a atividade de enzimas como
SOD, enquanto CAT, APX e GR têm a atividade reduzida (CHERIF et al., 2011),
além de induzir danos na membrana, e causar estresse oxidativo, indicado pela
9
peroxidação de lipídios e atenuados pelo Zn, na espécie Ceratophyllum demersum
(ARAVIND; PRASAD, 2003).
3.4 Mecanismos de defesa das plantas aos metais pesados
Espécies Reativas de Oxigênio (ERO), a exemplo do O2•- (radical superoxido),
H2O2 (peróxido de hdrogênio), OH- (radical hidroxil), 1O2 (oxigênio singleto), são
formas reduzidas ou ativadas de oxigênio atmosférico (O2) (MITTLER et al., 2011). A
geração de ERO nos vegetais provém do seu metabolismo normal, como a
fotossíntese e respiração (TRIPATHY; OELMÜLLER, 2012) por meio dos
fotossistemas I e II e pigmentos de clorofila dos cloroplastos; enzimas e complexos I,
II e III da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial; matriz, membrana e
processos metabólicos nos peroxissomos. Ainda, da parede celular, membrana
plasmática, retículo endoplasmático e apoplasto (SHARMA et al., 2012).
A exposição a metais pesados, como o Cd, pode causar estresse oxidativo
por meio de vários mecanismos de ação. Os metais pesados podem inativar ou
ativar enzimas do sistema antioxidante (peroxidases, catalases, superóxido
dismutase), responsáveis pela desintoxicação das células. Além da inativação das
enzimas antioxidantes, os metais pesados podem perturbar vias metabólicas
especialmente na membrana do tilacoide e resultar no aumento da formação de
radicais livres e ERO. Estes causam danos aos tecidos pelo aumento de processos
de senescência e peroxidação lipídica (BHADURI; FULEKAR, 2012).
Quando os níveis de espécies reativas de oxigênio são muito altos e a
oxidação se encontra em estágio avançado, podem ocorrer danos em biomoléculas
(SHARMA et al., 2012). Outra consequência da exposição a metais pesados é que o
acúmulo desses elementos nos tecidos vegetais pode resultar na depleção de
antioxidantes não enzimáticos de baixo peso molecular, tais como a glutationa
(GSH), que é consumida na síntese de fitoquelatinas (PC) (BHADURI; FULEKAR,
2012). Fitoquelatinas reduzem a atividade de Cd no citossol, por meio da formação
de complexos Cd-PC. Esses complexos são transportados para o vacúolo
possivelmente por meio de transportadores específicos, presentes no tonoplasto
(SARWAR et al., 2010).
Por outro lado, ERO também se apresenta como moléculas sinalizadoras que
podem desencadear respostas de adaptação e regulação de morte celular
(WINTERBOURN, 2008; KIM et al., 2012). Durante o estresse por metais pesados,
10
diferentes organelas de células vegetais podem biossintetizar o óxido nítrico em
paralelo com as ERO, como nas mitocôndrias e cloroplastos. O óxido nítrico pode
aliviar ERO induzidas por metais pesados, quer estimulando os mecanismos de
defesa ou pela limpeza direta. Contrariamente, o excesso da biossíntese pode levar
ao estresse nitrosativo e causar extenso dano celular (SAHAY; GUPTA, 2017).
Para eliminar ERO e aliviar seus efeitos deletérios, as plantas desenvolveram
diversos mecanismos de proteção, incluindo mecanismos enzimáticos e não
enzimáticos, visando ajustar os seus níveis (MITTLER et al., 2004) e resistir às
condições de estresse. Os principais mecanismos enzimáticos compreendem as
enzimas do metabolismo antioxidativo, que desempenham importante papel no
sistema de defesa antioxidante, como a SOD, que se constitui como a primeira
barreira enzimática contra o estresse oxidativo, convertendo o O2•- em H2O2
(FRIDOVICH, 1995; ZHANG et al., 2017). Esse produto final deve ser removido a fim
de evitar sua conversão em espécies mais reativas como OH-, em que as enzimas
CAT E APX atuam convertendo-o em H2O (PERL-TREVES; PERL, 2002). Além da
GPX eliminando excesso de espécies reativas transformando-as em espécies
menos reativas, convertendo H2O2 em H2O e O2, doando elétrons para o guaiacol
(CHOUDHARY et al., 2017).
Dentre os antioxidantes não enzimáticos, a prolina é um soluto compatível
acumulado em resposta ao estresse, atuando como quelante, protegendo as
enzimas da inibição induzida por zinco e cádmio formando complexos prolina-metal
(SHARMA et al., 1998). O aumento nos níveis de prolina em condições de estresse
é explicado pela redução na atividade de transporte de elétrons, que levaria ao
acúmulo de NADH e H+ (ALIA, 1991), bem como o mecanismo de remoção de ERO
que se dá pela fácil reação entre a prolina e o oxigênio singleto (1O2), contribuindo
na estabilização de proteínas, DNA e membranas (MATYSIK; ALIA BHALU;
MOHANTY, 2002). Apresenta função protetiva por meio da manutenção da
turgescência celular e consequente ajustamento osmótico, protegendo a integridade
da membrana (ASHRAF; FOOLAD, 2007; XU et al., 2009; HAYAT et al., 2012).
Reduz a peroxidação lipídica em células expostas a metais (MEHTA; GAUR, 1999).
Ao contrário, níveis elevados de 1O2 em cloroplastos podem ativar a morte celular
programada (KIM et al., 2012).
A peroxidação lipídica também se mostra como importante indicador de
estresse, cujo mecanismo ocorre quando radicais livres, ao reagir com ácidos graxos
11
poli-insaturados, oxidam lipídios das membranas celulares (AYALA et al., 2014)
formando um radical de ácido graxo, que reage com o oxigênio (O2) para formar um
radical peroxil (ROO•). Este pode reagir com outras moléculas de ácido graxo poli-
insaturado e produzir LOOH (hidroperóxido lipídio) que são decompostos em aldeído
e atacam outras biomoléculas (NIMSE; PAL, 2015). O malondialdeído (MDA) é um
importante produto da peroxidação lipídica da membrana, formado da reação entre
radical livre e um ácido graxo poliinsaturado, e seu teor é considerado um índice do
nível de danos das células. Pode associar com proteínas, ácidos nucleicos,
aminoácidos e outros materiais ativos para formar precipitados químicos insolúveis e
interromper as atividades biológicas normais das células (WANG et al., 2011).
4. METODOLOGIA
4.1 Material vegetal e condições de cultivo
O experimento foi conduzido em casa de vegetação, na Universidade
Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brasil (14° 47‟ S; 39° 13‟ W).
Sementes do genótipo de cacau CCN 51, oriundas de frutos de plantas matrizes
autopolinizadas, com oito a dez anos de idade, do Banco Germoplasma de Cacau
do Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC), da Comissão Executiva do Plano da
Lavoura Cacaueira (CEPLAC), Bahia, Brasil, germinaram diretamente no solo, com
textura franco-arenosa, em vasos com capacidade para 5 L. O pH do solo foi
corrigido previamente, de acordo com suas análises fisicoquímicas e com as
exigências nutricionais do cacau (Tabela 1). Fez-se adubação 15 dias após a
germinação e a cada 15 dias, por cinco vezes durante o cultivo (Tabela 2), de
acordo com resultados da análise de solo, sem adição de Zn.
12
Tabela 1 - Características físico-químicas do solo utilizado para crescimento de
plantas jovens seminais do genótipo de cacau CCN 51.
Atributo Unidade Valor
pH (H2O) - 5,11
P (mg dm-3)
10,4
K 29
Ca2+
(cmolc dm-3)
1,08
Mg2+ 0,37
Al3+ 0,5
H + Al 3,3
S
(mg dm-3)
10,9
Zn 2,17
Fe 165,1
Mn 23,7
Cu 1,05
B 0,17
SB
(cmolc dm-3)
1,52
(t) 2,02
T 4,82
V (%) 31,5
M (%) 24,8
M.O. (dag kg-1) 0,51
P-rem (mg L-1) 41,0
Areia grossa
(kg kg-1)
0,31
Areia fina 0,51
Silte 0,09
Argila 0,08
P, Na, K, Fe, Zn, Mn, Cu (extração: Mehlich 1); Ca, Mg, Al (extração: KCl, 1 mol L-1; H+Al (extração:
acetato de cálcio 0,5 M, pH 7); B (extração: água quente); S (extração: fosfato monocálcico em ácido acético); SB, soma de bases; t, capacidade efetiva de troca de cátions; T, capacidade de troca catiônica a pH 7; V, saturação de base; m, saturação por alumínio; M.O., matéria orgânica; P-rem, fósforo remanescente.
13
Tabela 2 – Adubação de plantio e cobertura para as plantas jovens do genótipo de
cacau CCN 51.
Adubação de plantio
Fertilizante Nutriente Concentração
MAP Purificado P 4,60 (g vaso-1)
KCl PA* K 7,63 (g L-1)
H3BO3 PA B 0,27 (g L-1)
CuSO4.5H2O PA Cu 0,47 (g L-1)
(NH4)6Mo7O24.4H2O PA Mo 0,02 (g L-1)
Adubação de cobertura**
Fertilizante Nutriente Concentração
KCl PA K 1,95 (g L-1)
K2SO4 PA S 2,17 (g L-1)
Ureia N 8,89 (g L-1) *PA: Padrão analítico; **Adubação realizada 15 dias após germinação e em intervalos de 15 dias, por 5 vezes.
Posteriormente, aos 126 dias após o plantio (DAP), ao solo dos vasos
contendo plantas jovens de cacau, foram adicionados 100 mL por vaso, de solução
de 0,4, 0,8, 1,2 e 1,6 mmol Zn kg-1 solo, de 0,2, 0,4, 0,6 e 0,8 mmol Cd kg-1 solo, em
concentrações isoladas, e combinadas de Zn + Cd (0,4 + 0,2; 0,4 + 0,4; 0,4 + 0,6;
0,4 + 0,8; 0,8 + 0,2; 0,8 + 0,4; 0,8 + 0,6; 0,8 + 0,8; 1,2 + 0,2; 1,2 + 0,4; 1,2 + 0,6; 1,2
+ 0,8, 1,6 + 0,2; 1,6 + 0,4; 1,6 + 0,6 e 1,6 + 0,8 mmol kg-1 solo) e controle (sem
adição de Zn e Cd, tendo ZnCl2 e CdCl2 como fontes de Zn e Cd, respectivamente,
perfazendo um total de 25 tratamentos (Tabela 3). Durante todo período
experimental, as plantas foram irrigadas com água de chuva, mantendo o solo
próximo à capacidade de campo.
14
Tabela 3 - Distribuição dos tratamentos, sem adição de cádmio (Cd) e zinco (Zn) -
controle*, e a combinação de concentrações desses elementos aplicados no solo, na forma de cloreto de cádmio (CdCl2) e cloreto de zinco (ZnCl2).
Cd (mmol kg-1 solo)
0 0,2 0,4 0,6 0,8
Zn
(m
mo
l kg
-1 s
olo
)
0 0 + 0 * 0,2 0,4 0,6 0,8
0,4 0,4 0,4 + 0,2 0,4 + 0,4 0,4 + 0,6 0,4 + 0,8
0,8 0,8 0,8 + 0,2 0,8 + 0,4 0,8 + 0,6 0,8 + 0,8
1,2 1,2 1,2 + 0,2 1,2 + 0,4 1,2 + 0,6 1,2 + 0,8
1,6 1,6 1,6 + 0,2 1,6 + 0,4 1,6 + 0,6 1,6 + 0,8
O experimento foi conduzido entre os meses de maio a outubro/2016 e dados
de radiação fotossinteticamente ativa (RFA) foram obtidos através de sensores de
radiação luminosa S-LIA-M003, e temperatura e umidade relativa do ar por meio de
sensores microprocessados Hobo H8 Pro Series (Onset, USA), acoplados à estação
climatológica Hobo Micro Station Data Logger (Onset Computer, Massachusetts,
USA) instalada no interior da casa de vegetação (Figura 1). Durante todo período
experimental (160 dias), as plantas foram irrigadas com água da chuva.
15
Figura 1 – Dados microclimáticos coletados durante a condução do experimento.
Valores médios de temperatura do ar (A), umidade relativa do ar (B) e radiação fotossinteticamente ativa (PAR) (C).
16
4.2 Trocas gasosas foliares A taxa fotossintética líquida por unidade de área foliar (A) e a taxa de
transpiração foliar (E) foram medidos na segunda ou terceira folha completamente
expandida aos 8, 15, 22 e 29 dias após aplicação dos tratamentos (DAAT), entre as
8 e 12 h da manhã utilizando um sistema portátil de medição de fotossíntese LI-6400
(Li-Cor, Nebraska, USA) equipado com fonte de luz artificial 6400-02B Red Blue. A
fonte de luz artificial do sistema foi ajustada para fornecer densidade de fluxo
fotossintético de fótons (PPFD) de 800 µmol m-2 s-1, o fluxo de CO2 foi ajustado para
manter uma concentração de 380 µmol mol-1 no interior da câmara e a temperatura
da câmara foliar foi mantida constante em 28 °C. As leituras foram registradas no
intervalo de 2-3 min (coeficiente de variação de 0,1% a 0,3%). Os valores de A e E
foram medidos a partir dos valores atmosféricos de CO2 (Ca) e de umidade do ar
medidos dentro da câmara e utilizados para calcular e a condutância estomática ao
vapor d‟água (gs), calculada pelo equipamento a partir dos valores de A e E (Von
CAEMMERER; FARQUHAR, 1981). A partir destes foi calculada a eficiência
intrínseca do uso da água (A/gs) e eficiência instantânea do uso da água (A/E)
4.3 Concentrações de Zn e Cd
Plantas jovens de cacau foram coletadas ao final do experimento (37 DAAT) e
separadas em raízes e folhas. As raízes foram submetidas a sucessivas lavagens na
seguinte ordem: água corrente, solução detergente neutra (0,1%), água destilada,
ácido clorídrico (HCl - 3%), e água destilada, para remover os metais que não foram
absorvidos pelo sistema radicular (SOUZA JUNIOR et al., 2011). Imediatamente
após, o material foi colocado separadamente em estufa com circulação forçada de ar
a 70 ± 5 °C até massa constante. Posteriormente, o material vegetal seco foi moído
em moinho de facas tipo Willey, modelo MA-340, usando peneiras de 20 mesh de
abertura de malha. Logo após, o material vegetal moído foi submetido à digestão
nitroperclorica (3:1 v:v). Após a digestão, foram determinadas as concentrações de
Zn e Cd nos diferentes órgãos (raiz e folha) das plantas de todos os tratamentos,
utilizando espectrometria de emissão ótica por plasma indutivamente acoplado (ICP-
OES, Varian 710-ES). Também foram calculados os fatores de translocação (FT) de
Zn e de Cd (FT= teor na parte aérea/teor na raiz) (MARCHIOL et al., 2004), cuja
17
finalidade foi avaliar a capacidade da planta em translocar o metal pesado das
raízes para a parte aérea da planta.
4.4 Teor de prolina
O teor de prolina foi determinado em amostras folares de todos os
tratamentos. Ao tecido foliar liofilizado (35 mg), coletado aos 37 dias AAT e
macerados em nitrogênio líquido, foram adicionados 1 mL de ácido sulfossalicílico
(3%), seguindo de agitação vigorosa em vórtex e de centrifugação a 14000 x g
durante 5 min. Logo após, alíquotas de 0,2 mL do extrato bruto foram transferidas
para tubos de ensaio de vidro, aos quais foram adicionados 0,2 mL de ninhidrina
ácida (1,25 g de ninhidrina; 30 mL de ácido acético glacial; 20 mL de ácido fosfórico
6M) e ácido acético glacial concentrado (BATES et al., 1973). Em seguida, os tubos
foram fechados hermeticamente, agitados em vórtex e incubados em banho-maria a
100 °C por 60 min. Imediatamente após, a reação foi interrompida em banho de
gelo. Após incubação foi adicionado aos tubos 0,4 mL de tolueno, seguido,
novamente, de agitação em vórtex e deixado em repouso até alcançar temperatura
ambiente e separação da fase aquosa. O cromóforo contendo tolueno (fase
superior) foi recuperado com auxílio de pipeta Pasteur de vidro e transferido para
microcubeta de quartzo. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro manual,
em quadruplicatas, a 520 nm, utilizando tolueno como branco. A curva-padrão foi
obtida com L-prolina (PM: 115,13) e o teor de prolina calculado de acordo com
fórmula descrita por Bates et al (1973) com adaptações para leitura em microcubeta
de quartzo e volume de tolueno.
4.5 Peroxidação Lipídica
Os produtos resultantes da peroxidação de lipídios de membranas celulares
foram avaliados como substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS),
principalmente malondialdeído (MDA), de acordo com Cakmak e Horst (1991).
Tecido foliar liofilizado (20 mg), coletado aos 37 DAAT, de todos os tratamentos,
foram macerados em 2 mL de ácido tricloroacético (TCA) a 0,1% (p/v). Em seguida,
o material foi centrifugado a 14000 x g durante 6 min e uma alíquota de 500 µL do
18
sobrenadante foi adicionada a 1,5 mL de solução de ácido tiobarbitúrico (0,5% em
20% de TCA) em tubos de ensaio de vidro. As amostras foram incubadas a 90 °C
durante 20 min e passado esse período, a reação foi interrompida em banho de gelo
o sobrenadante foi transferido para eppendorfs de 2 mL e centrifugados a 14000 x g
durante 4 min, e a absorbância do sobrenadante (280 µl) foi lida a 532 nm e
corrigida para turvação não-específica por subtração da absorbância a 600 nm. A
concentração de TBARS foi calculada a partir do seu coeficiente de extinção de 155
mM cm-1. As leituras foram feitas em espectrofotômetro de placas UV/VIS
SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices).
4.6 Metabolismo antioxidativo
4.6.1 Obtenção do extrato bruto
Para a análise de enzimas relacionadas ao metabolismo antioxidativo, foram
coletadas folhas a segunda ou terceira a partir do ápice de plantas jovens do
genótipo de cacau CCN 51, em intervalos de 3, 6, 12, 24, 48 e 96 h após aplicação
dos tratamentos (AAT). De imediato, o material foi imerso em nitrogênio líquido,
armazenado em ultrafreezer - 80 °C e, posteriormente, liofilizado. Para a extração do
extrato bruto, as amostras liofilizadas foram maceradas em nitrogênio líquido e em
seguida, alíquotas foram pesadas (20 mg ou 40 mg de acordo com as enzimas),
acondicionadas em eppendorf e acrescidas de polivinilpirrolidona (PVP) a fim de
evitar a oxidação do macerado. O material macerado foi ressuspenso em tampão de
extração 20x (tampão fosfato de sódio a 50 mM, pH 6,0 (GPX) ou tampão fosfato de
potássio a 50 mM, pH 7,0 (CAT e APX) e pH 7,8 (SOD). Em seguida, foram
submetidos à ultrasonicação (Ultrasonic processor Gex 130, 130 W), para que
houvesse o rompimento dos tecidos, em pulsos de 8 s, intervalos de 10 s e
amplitude de 70%, seguido de centrifugação a 15000 x g, a 4 °C, durante 15 min.
Por fim, o sobrenadante foi coletado, considerando-o como o extrato bruto,
transferido para eppendorf de 1,5 mL, mantido em isopor com gelo, e utilizado na
sequência, de acordo com o procedimento metodológico.
19
4.6.2 Atividade da dismutase do superóxido (SOD, EC 1.15.1.1)
A atividade de SOD foi determinada seguindo metodologia descrita por
Gianopolitis e Ries (1977), com adaptações. Ao extrato bruto (30 µL) foi adicionado
o tampão de reação (130 µL) contendo tampão fosfato de potássio, 50 mM, pH 7,8,
EDTA, 1 mM e Metionina, 130 mM. A atividade enzimática foi iniciada com a adição
de riboflavina, 1 mM (20 µL) e nitroazul de tetrazólio (NBT), 750 µM (20 µL). Foi
realizada a primeira leitura no escuro, após 5 min, e a segunda leitura aos 20 min,
após a placa ter sido exposta à lâmpada fluorescente de 15 W. Para o branco,
considerou-se o mix sem extrato bruto vegetal. Uma unidade de atividade (UA) foi
determinada para medir a capacidade da enzima de inibir 50% da fotorredução de
NBT à formazana azul. As leituras foram feitas em comprimento de onda de 560 nm,
por 180 s, em intervalos de 30 s, em espectrofotômetro de placas UV/VIS
SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices).
4.6.3 Atividade da catalase (CAT, EC 1.11.1.6)
A atividade de CAT foi determinada seguindo metodologia descrita por Havir e
McHale (1987). A atividade foi medida pela velocidade de consumo de H2O2 na
reação, utilizando-se o tampão de reação, fosfato de potássio a pH 7,0 (175 µL) com
adição do extrato bruto vegetal (5 µL), iniciada pela adição de H2O2 300 mM (20 µL)
e observação do decréscimo no comprimento de onda de 240 nm, por 180 s, em
intervalos de 30 s, contra um branco livre de extrato bruto vegetal e expressa em
mmol H2O2 g-1 MS s-1, usando o coeficiente de extinção molar de 36 M-1 cm-1. Foi
utilizado espectrofotômetro de placas UV/VIS SpectraMax Paradigm Multi-Mode
Microplate Reader (Molecular Devices).
4.6.4 Atividade da peroxidase do ascorbato (APX, EC 1.11.1.11)
A atividade de APX foi determinada seguindo metodologia descrita por
Nakano e Asada (1981). O mix foi composto por tampão fosfato de potássio, 50 mM,
pH 7,0 (154,96 µL), EDTA a 500 mM (0,04 µL), ácido ascórbico a 5 mM (20 µL) e
extrato bruto vegetal (5 µL). A reação foi iniciada pela adição de H2O2 a 300 mM (20
20
µl) e as leituras foram feitas no comprimento de onda de 290 nm, por 180 s, em
intervalos de 30 s, contra um branco livre de extrato bruto vegetal e expressa em
mmol H2O2 g-1 MS s-1. Foi utilizado espectrofotômetro de placas UV/VIS SpectraMax
Paradigm Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices).
4.6.5 Atividade da peroxidase do guaiacol (GPX, EC 1.11.1.7)
A atividade de GPX foi testada de acordo com Kar e Mishra (1976), com
adaptações feitas por Pirovani et al. (2008), medindo a formação de guaiacol em
µmol s-1 g-1 MS durante 180 s, em intervalos de 30 s, em comprimento de onda de
470 nm. A mistura reagente consistiu de tampão de reação GPX contendo guaiacol
40 m mol L-1, H2O2 a 30% e tampão fosfato de sódio a 50 mM, pH 6,0 (140 µL),
tampão fosfato de sódio a 50 mM, pH 6,0 (139 µL) e extrato enzimático bruto (1 µL).
A atividade da enzima foi calculada por meio da equação y = 0,0189 + 0,1284x (R2 =
0,99), originada a partir de curva-padrão para POD-guaiacol determinada por Rehem
et al. (2011). As leituras foram feitas em espectrofotômetro de placas UV/VIS
SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices).
4.7 PCR quantitativo em tempo real A partir da realização de análise Biplot dos dados do metabolismo
antioxidativo, foram selecionados quatro tratamentos combinados de Zn + Cd (1,2 +
0,6; 1,2 + 0,8; 1,6 + 0,6 e 1,6 + 0,8 mmol kg-1 solo), coletados as seis e 48 h AAT,
mais o tratamento controle (sem adição de Zn e Cd). Foi utilizado o mesmo material
coletado e armazenado para o metabolismo antioxidativo. Para extração de RNA, foi
utilizado 20 mg de material macerado em nitrogênio líquido, utilizando o kit
RNAqueous® (Ambion-Apllied Biosystems), seguindo as recomendações do
fabricante. Em seguida, as amostras foram tratadas com DNase I (Thermo Scientific)
e incubadas a 37 °C por 30 min., seguido da adição de EDTA a 50 mM e incubação
a 65 °C por 10 min. Por fim, o RNA das amostras foi quantificado em
espectrofotômetro (Nanodrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific), a
260 e 280 nm, expressos em µg mL-1.
A síntese de cDNA foi realizada a partir de amostras tratadas com DNase I,
utilizando o High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems), de acordo com a
21
recomendação do fabricante. As reações foram incubadas a 37 °C por 60 min, 95 °C
por 5 min e 4 °C por 1 min. Os pares de primers de genes específicos utilizados na
análise de PCR quantitativo em tempo real foram os relacionados à biossíntese das
proteínas do fotossistema 2 (PS2) da fase fotoquímica da fotossíntese (intrínseca -
psbA e extrínseca - psbO) e às enzimas antioxidativas [(Cu-Zn SODCyt e Cu-Zn
SODChl) e peroxidase (per-1)] (SOUZA et al., 2013). A qPCR foi realizado em um
sistema “PCR em tempo real” (modelo ABI 7500, Applied Biosystems), utilizando o
kit Power SYBR® Green/ PCR Master Mix (Applied Biosystems), de acordo com as
instruções do fabricante. Os números da expressão relativa dos genes foram
calculados como o número de vezes em relação à planta controle, utilizando o
método 2–ΔΔCt (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). Os genes envolvidos na biossíntese da
desidrogenase do gliceraldeido-3- fosfato (gapdh), desidrogenase do malato (mdh),
actina e β-tubulina foram utilizados como endógenos.
4.8 Análise Micromorfológica
A análise micromorfológica, usando microscopia eletrônica de varredura
(MEV), foi realizada em seções transversais do mesofilo foliar de plantas jovens do
genótipo de cacau CCN 51, submetidas a concentrações de Zn (0,8 e 1,6 mmol kg -1
solo) e Cd (0,4 e 0,8 mmol kg-1 solo) isolados e combinados [Zn + Cd (1,2 + 0,2
mmol kg-1 solo, 0,8 + 0,4 mmol kg-1 solo e 0,4 + 0,6 mmol kg-1 solo)] aplicadas ao
solo e no tratamento controle (sem adição de Zn e Cd no solo). Foram coletadas a
segunda ou terceira folha madura, a partir do ápice da planta, aos 37 dias após a
aplicação dos tratamentos. A região mediana das folhas foram seccionados e
fixados em glutaraldeído a 2.5%, preparado em tampão cacodilato de sódio a 0,1 M,
pH 7,2. Posteriormente, as secções das folhas foram lavadas três vezes, por 10 min
cada lavagem, no mesmo tampão cacodilato de sódio e desidratados em série
crescente de acetona (50, 60, 70, 80, 90% e três vezes a 100% por 10 min).
Imediatamente após a desidratação, o material foi levado ao ponto crítico
(modelo CPD 030, BAL-TEC), o qual permitiu a retirada de grande parte da água do
tecido vegetal. Em seguida, as amostras foram colocadas em stubs para realização
da metalização, passo que consiste em cobrir o material vegetal com uma fina
camada de ouro de 30 nm de espessura, utilizando o aparelho SPUTTER COATER,
modelo SCD 050, marca BAL-TEC, seguido de observação em MEV, modelo
22
Quanta 250 (FEI Company). Posteriormente, procedeu-se as medições da
espessura dos parênquimas paliçádico (PP) e esponjoso (PE), da epiderme nas
faces adaxial (EAd) e abaxial (EAb), do mesofilo foliar (MF), da folha (ET), além das
medições das aberturas transversal (PET) e longitudinal (PEL) do poro estomático e
do cálculo da densidade estomática (DE).
4.9 Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com 25
tratamentos representados pelas concentrações isoladas de Zn (0,4; 0,8; 1,2; 1,6
mmol kg-1 solo) e Cd (0,2; 0,4; 0,6; 0,8 mmol kg-1 solo), e combinadas de Zn + Cd
(0,4 + 0,2; 0,4 + 0,4; 0,4 + 0,6; 0,4 + 0,8; 0,8 + 0,2; 0,8 + 0,4; 0,8 + 0,6; 0,8 + 0,8; 1,2
+ 0,2; 1,2 + 0,4; 1,2 + 0,6; 1,2 + 0,8, 1,6 + 0,2; 1,6 + 0,4; 1,6 + 0,6 e 1,6 + 0,8 mmol
kg-1 solo) e controle (sem adição de Zn e Cd ao solo), com número variável de
repetições de acordo com o parâmetro avaliado e uma planta por unidade
experimental. Foram utilizadas quatro repetições para as trocas gasosas foliares,
enzimas do metabolismo antioxidativo, teor de Cd e Zn, prolina e peroxidação
lipídica e três repetições para expressão gênica e micromorfologia foliar. Para as
análises micromorfológicas foram selecionados apenas oito tratamentos e para
expressão gênica foram selecionados cinco tratamentos e dois tempos de coleta. Os
dados foram submetidos a ANOVA e as médias comparadas pelo teste de Scott-
Knott (p<0,05).
5. RESULTADOS
5.1 Zn mitiga a toxidez de Cd em folhas por efeito antagônico
Os teores de Zn e Cd, tanto em folhas como em raízes, diferiram
significativamente (p<0,05) entre os tratamentos aos 37 DAAT. O teor de Zn em
raízes (Figura 2C) foi superior em relação às folhas (Figura 2A), incluindo o
tratamento controle. Isto ocorreu principalmente nos tratamentos em que o Zn foi
aplicado isoladamente em todas as concentrações, sem adição de Cd, bem como
naqueles em que foi aplicado de forma combinada com a menor concentração de Cd
(0,2 mmol kg-1 solo). Além disso, foi observado que quanto maior a concentração de
Zn e Cd no solo, maior o acúmulo de Zn em raízes. Por outro lado, verificou-se,
23
também, que as plantas cultivadas na menor concentração do Zn (0,4 mmol kg-1
solo) apresentaram a mesma resposta para a menor concentração de Cd (0,2 mmol
kg-1 solo) em raízes, quando aplicados de forma isolada (Figura 2C). Semelhante ao
Zn, o Cd foi mais absorvido pelas raízes das plantas em relação às folhas, cuja
absorção se intensificou com o aumento da concentração de Cd, variando de 10 a
70% entre os tratamentos, tendo sido maior com o aumento da sua concentração,
isolado ou combinado com quaisquer concentrações de Zn (Figura 2D).
Os teores de Zn em folhas aumentaram com o incremento das concentrações
de Zn (0,8, 1,2 e 1,6 mmol kg-1 solo) aplicado ao solo, de forma isolada ou
combinada com as concentrações de Cd (0,4, 0,6 ou 0,8 mmol kg-1 solo) mais o
tratamento combinado (0,4 mmol Zn kg-1 solo + 0,2 mmol Cd kg-1 solo) que não
apresentaram diferenças significativas (p<0,05) entre si e foram superiores em
relação ao controle, com valores médios de 180 mg Zn kg-1 solo. Por outro lado, os
menores teores foram observados no tratamento controle e nos tratamentos sem
adição de Zn, como esperado, em média 70% menor (Figura 2A).
Os teores de Cd em folhas se elevaram com o aumento das concentrações
de Cd no solo, de forma isolada ou combinada com quaisquer concentrações de Zn.
Além disso, com o aumento da concentração de Zn no solo, principalmente nos
tratamentos com 1,2 e 1,6 mmol Zn kg-1 solo, combinadas com quaisquer de Cd,
houve redução na absorção de Cd pelas raízes e transporte para as folhas, de 49,
46, 33 e 31%, respectivamente, nas concentrações de 0,2, 0,4, 0,6 e 0,8 mmol Cd
kg-1 considerando-se os valores médios das duas menores concentrações, em
relação às duas maiores concentrações do Zn aplicado (Figura 2B).
24
Figura 2 – Concentrações de Zn e Cd em folhas (A e B) e raízes (C e D) de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
O fator de translocação (FT) de Zn (Figura 3A) foi significativamente menor no
tratamento controle, no tratamento submetido ao zinco isoladamente e na menor
concentração de Cd, isolado ou combinado com quaisquer concentrações de Zn. Foi
observado que, no tratamento submetido ao Cd isoladamente, FT de Zn foi superior
e diferiu significativamente em relação aos demais tratamentos, e cerca de 4x maior
que o tratamento controle. FT de Cd (Figura 3B) foi significativamente superior nos
tratamentos submetidos ao zinco isoladamente, não diferiu significativamente com o
aumento da concentração de Zn e Cd e apresentou valores superiores de FT em
relação ao Zinco. Ainda assim, foi possível observar que, nas duas maiores
concentrações de Zn, FT de Cd foi menor em relação aos demais tratamentos.
25
Figura 3 – Fatores de translocação de Zn (A) e Cd (B) em plantas jovens do
genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
5.2 A interação Zn e Cd afeta a eficiência de carboxilação ao longo do tempo
A taxa fotossintética líquida (A) das plantas jovens do genótipo de cacau CCN
51, em diferentes dias AAT, apresentaram diferenças significativas entre si (p<0,05),
em cada um dos dias avaliados, com valores médios variando entre 0,54 e 3,67
µmol CO2 m-2 s-1. As respostas fotossintéticas das plantas, às variações das
concentrações de Zn, Cd e de Zn+Cd no solo, aos 8, 15, 22 e 29 dias AAT,
apresentaram um padrão semelhante entre os tratamentos. O tratamento controle
(sem adição de Zn e Cd ao solo) apresentou os maiores valores médios em relação
aos demais tratamentos, aos 8, 15 e 22 DAAT (Figura 4A, B e C).
26
As plantas submetidas à menor concentração de Cd (0,2 mmol Cd kg-1 solo)
sozinho ou combinado com qualquer uma de Zn (0,4, 0,8, 1,2 e 1,6 mmol Zn kg-1
solo) apresentaram valores médios de A superiores aos demais tratamentos. Por
outro lado, os menores valores médios de A foram observados nas três maiores
concentrações de Cd (0,4, 0,6 e 0,8 mmol Cd kg-1 solo) combinadas com diferentes
concentrações de Zn (0,4, 0,8, 1,2 e 1,6 mmol Zn kg-1 solo) aos 22 e 29 dias AAT
(Figura 4C e D). Entretanto, o decréscimo mais acentuado de A foi aos oito e 15
dias, na maior concentração de Zn (1,6 mmol Zn kg-1 solo) (Figura 4A e B). Do
mesmo modo, foram observadas baixas taxas fotossintéticas nas duas maiores
concentrações de Zn, isoladamente, especialmente aos 29 dias AAT (Figura 4D).
Figura 4 – Taxa fotossintética líquida por unidade de área foliar (A) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
A condutância estomática ao vapor d‟água (gs) diferiu significativamente
(p<0,05) entre os tratamentos, aos 8, 15, 22 e 29 dias AAT. O tratamento controle
apresentou valores médios de gs superiores aos demais tratamentos (Figura 5A).
27
Além disso, aos 22 dias AAT, os tratamentos com adição de Zn e Cd no solo,
isoladamente, não apresentaram diferenças significativas (p<0.05) para os valores
médios de gs, bem como a combinação de quaisquer concentrações de Zn (0,4, 0,8,
1,2 e 1,6 mmol kg-1 solo), associada à menor concentração de Cd (0,2 mmol kg-1
solo) (Figura 5C).
Figura 5 – Condutância estomática ao vapor d‟água (gs) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
A transpiração foliar (E) diferiu significativamente (p<0,05) entre os
tratamentos, cujas respostas das plantas, aos diferentes tratamentos de Zn, Cd e Zn
+ Cd aplicados no solo, foram semelhantes àquelas observadas para gs (Figura 6).
28
Figura 6 – Transpiração foliar (E) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51
submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
A eficiência intrínseca do uso da água (A/gs) apresentou diferenças
significativas entres si, apesar de os valores médios dos tratamentos terem sido
muito próximos nos dias avaliados. A exceção ocorreu aos oito DAAT (Figura 7A),
em que o tratamento com a menor concentração de Zn (0,4 mmol Zn kg-1 solo),
associada à maior concentração de Cd (0,8 mmol Cd kg-1 solo), bem como as
concentrações combinadas de 0,8 mmol Zn kg-1 solo com 0,6 e 0,8 mmol Cd kg-1
solo, que apresentaram maior eficiência intrínseca do uso da água. Resultados
semelhantes foram observados nos dados de eficiência instantânea do uso da água
(A/E) nos diferentes dias avaliados (Figura 8A).
29
Figura 7 – Eficiência intrínseca do uso da água (A/gs) em plantas jovens do
genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Figura 8 – Eficiência instantânea do uso da água (A/E) em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0.05). C - tratamento controle.
30
A eficiência de carboxilação (A/Ci) foi maior nos tratamentos controle e nos
submetidos a pequenas concentrações de Cd, isoladamente ou combinadas com o
Zn, observadas principalmente aos 22 e 29 dias AAT (Figura 9C e D).
Figura 9 – Eficiência de carboxilação (A/Ci) em plantas jovens do genótipo de cacau
CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos oito (A), 15 (B), 22 (C) e 29 (D) dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
5.3 Prolina atua como importante mecanismo de defesa aos metais pesados
Os teores de prolina nas folhas, determinados aos 37 dias AAT, diferiram
significativamente (p<0,05) entre os tratamentos. Os maiores teores médios de
prolina foliar foram observados nas plantas submetidas à maior concentração de Zn
(1,6 mmol Zn kg-1 solo) combinada com as maiores concentrações de Cd (0,4, 0,6 e
0,8 mmol Cd kg-1 solo). Por outro lado, os menores teores de prolina foram
encontrados nas folhas das plantas controle e das plantas submetidos às menores
concentrações de Zn (0,4 e 08 mmol Zn kg-1 solo) sem adição de Cd no solo. Ao
comparar o teor de prolina nas folhas (0,9 µmol g-1 MS) das plantas do tratamento
controle com o teor prolina nas folhas (43,43 µmol g-1 MS) das plantas submetidas à
combinação das maiores concentrações de Zn e Cd (1,6 + 0,8 mmol kg-1 solo),
verificou-se que o aumento no teor de prolina na folha foi superior a 4000% (Figura
31
10). Além disso, as plantas cultivadas nas duas menores concentrações de Cd (0,2 e
0,4 mmol Cd kg-1 solo) e a combinação de cada uma destas com a menor
concentração de Zn (0,4 mmol Zn kg-1 solo) apresentaram respostas semelhantes
com relação ao teor de prolina foliar.
Figura 10 – Teor de prolina em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN
51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
5.4 Peroxidação de lipídios em resposta ao estresse
Foram verificadas diferenças significativas (p<0,05) entre os tratamentos de
Zn, Cd e Zn+Cd aplicados no solo e o teor foliar de substâncias que reagem com o
ácido tiobarbitúrico (TBARS). O maior teor de TBARS (171,26 nm g-1 MS) e,
consequentemente, a maior peroxidação de lipídios de membranas celulares foi
observado no tratamento resultante da combinação da menor concentração de Zn
(0,4 mmol kg-1 solo) combinada com a maior concentração de Cd (0,8 mmol kg-1
solo) (Figura 11), representando aumento de 100% em relação ao controle.
32
Figura 11 – Teor de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em folhas
de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51, submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
5.5 Resposta ao estresse por meio do metabolismo antioxidativo
Foram observadas diferenças significativas (p<0,05) para a atividade da SOD
nas folhas das plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 nos diferentes horários
avaliados. Entretanto, os valores médios foram bastante próximos na maioria dos
tratamentos (Figura 12). As menores atividades de SOD foram verificadas nos
tratamentos controle e nas duas menores concentrações de Zn aplicadas
isoladamente (0,4 e 0,8 mmol kg-1 solo) em todos os horários e no tratamento
combinado da maior concentração de Zn com a menor de Cd (1,6 + 0,2 mmol kg-1
solo).
33
Figura 12 – Atividade da dismutase do superóxido (SOD) em folhas de plantas
jovens do genótipo de cacau CCN 51, submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo as três (A), seis (B), 12 (C), 24 (D), 48 (E) e 96 h (F) após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Verificaram-se, também, diferenças significativas (p<0,05) entre tratamentos
para a atividade de CAT em folhas, nos diferentes horários avaliados AAT. Para a
atividade da CAT em folhas, não ocorreu um padrão de resposta dos tratamentos
nos diferentes horários avaliados. A maior atividade de CAT ocorreu às 3h AAT nos
tratamentos correspondentes a 0,4, 0,8 e 1,6 mg Zn kg-1 solo e nos tratamentos
resultantes da combinação de Zn + Cd (0,8 + 0,4, 1,2 + 0,4 e 1,6 + 0,2 mmol kg -1
solo) (Figura 13A). Houve também elevação na atividade de CAT na maior
34
concentração de Cd (0,8 mmol kg-1 solo) e nas combinações de Zn + Cd (0,4 + 0,4 e
1,6 + 0,2 mmol kg-1 solo) às 6 h AAT, além das concentrações de Zn aplicado
isoladamente (0,4 e 1,2 mmol kg-1 solo) (Figura 13B). O mesmo fato ocorreu às 12 h
AAT em que a maior atividade se deu nas concentrações combinadas de Zn + Cd de
0,4 + 0,2 mmol kg-1 solo (Figura 13C). Às 24h AAT, nas plantas submetidas à
combinação de 1,2 mmol Zn kg-1 solo + 0,2 mmol Cd kg-1 solo (Figura 13D), além do
1,2 mmol Zn kg-1 solo, também já verificado às 6 h e 96 h (Figura 13B, D e F). Ainda
às 96 h AAT, o tratamento combinado 1,2 mmol Zn kg-1 solo + 0,4 mmol Cd kg-1
solo, além do controle e às 48h AAT para a concentração de Cd isolada de 0,4 mmol
Cd kg-1 solo. Por outro lado, as menores atividades ocorreram nos tratamentos
combinados de Zn + Cd (0,8 mmol Zn kg-1 solo + 0,6 mmol Cd kg-1 solo as 3, 6 e 12
h AAT; 1,6 mmol Zn kg-1 solo + 0,8 mmol Cd kg-1 solo as 6 e 12 h AAT; 0,4 mmol Zn
kg-1 solo + 0,6 Cd mmol kg-1 solo e 1,2 Zn mmol kg-1 solo + 0,2 Cd mmol kg-1 solo as
48 h AAT (Figura 13A, B, C e E).
35
Figura 13 – Atividade de catalase (CAT) em folhas de plantas jovens do genótipo de
cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo as três (A), seis (B), 12 (C), 24 (D), 48 (E) e 96 h (F) após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
Diferenças significativas (p<0,05) entre tratamentos de Zn, Cd e Zn+Cd e tempo
de coleta foram observadas, também, para a atividade de APX em folhas de plantas
jovens do genótipo de cacau CCN 51, apresentando um padrão de comportamento
quanto aos tratamentos, nos diferentes horários avaliados. A maior atividade de APX
foi encontrada nas duas maiores concentrações de Cd, sem aplicação do Zn (0,6 e
0,8 mmol kg-1 solo) e quando estas concentrações estavam combinadas com o Zn
(0,4 mmol Zn kg-1 solo + 0,8 mmol Cd kg-1 solo, 0,8 mmol Zn kg-1 solo + 0,6 mmol Cd
36
kg-1 solo, 0,8 mmol Zn kg-1 solo + 0,8 mmol Cd kg-1 solo, 1,2 mmol Zn kg-1 solo + 0,6
mmol Cd kg-1 solo (este último exceto às 48 h) e 1,6 mmol Zn kg-1 solo + 0,6 mmol
Cd kg-1 solo, exceto às 24 h. Este último tratamento sendo superior a todos os
demais às 96 h, 37 vezes superior ao controle. Por outro lado, o tratamento 1,6
mmol Zn kg-1 solo + 0,8 mmol Cd kg-1 solo apresentou um padrão nos horários
avaliados, de baixa atividade enzimática, considerando-se que se trata das duas
maiores concentrações dos metais combinadas (Figura 14F).
37
Figura 14 – Atividade da peroxidase do ascorbato (APX) em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51, submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo as três (A), seis (B), 12 (C), 24 (D), 48 (E) e 96 h (F) após aplicação dos tratamentos. Corte em F representa 260 mmol AsA g-1 MS. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
A atividade foliar de GPX diferiu significativamente (p<0,05) entre tratamentos
de Zn, Cd e Zn+Cd aplicados ao solo e tempo de coleta, em folhas de plantas jovens
do genótipo de cacau CCN 51 (Figura 15). As maiores atividades foram observadas
no tratamento 0,4 mmol Zn kg-1 solo + 0,2 mmol Cd kg-1 solo as três e 12 h AAT
(Figura 15A e C). Este mesmo tratamento também apresentou atividade elevada de
GPX as seis e 96 h AAT (Figura 15B e F). A menor atividade de GPX foi observada
nos tratamentos com as duas maiores concentrações de Zn (1,2 e 1,6 mmol kg-1
38
solo) combinadas com a maior concentração de Cd (0,8 mmol kg-1 solo), que ainda
foram menores que o controle, em todas as horas de coletas avaliadas (Figura 15A-
F).
Figura 15 – Atividade da peroxidase do guaiacol (GPX) em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51, submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo as três (A), seis (B), 12 (C), 24 (D), 48 (E) e 96 h (F) após aplicação dos tratamentos. Valores médios de quatro repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). C - tratamento controle.
5.6 Expressão de genes em resposta ao estresse
Observaram-se diferenças significativas (p<0,05) na expressão relativa dos
genes psbA e psbO, Cu-Zn SODCyt e Cu-Zn SODChl e per-1, em folhas de plantas
jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a concentrações Zn, Cd e Zn+Cd
aplicadas ao solo (Figura 16A e B). Houve indução da expressão relativa às 6 h
AAT, nas folhas de plantas submetidas às maiores concentrações combinadas de
Zn + Cd (1,6 + 0,8 mmol kg-1 solo), para todos os genes avaliados, tendo sido mais
39
expressivos para Cu-Zn SODCyt e, em seguida, Cu-Zn SODChl e para os quais a
concentração combinada de 1,6 + 0,6 mmol kg-1 solo também apresentou indução
da expressão dos referidos genes, no mesmo horário avaliado (Figura 16A). O
mesmo fato ocorreu com as concentrações combinadas de Zn + Cd (1,2 + 0,6 e 1,2
+ 0,8 mmol kg-1 solo) para os genes Cu-Zn SODCyt, Cu-Zn SODChl e per-1, cujas
expressões foram superiores e diferentes significativamente (p<0,05) do tratamento
controle (Figura 16A). Além disso, verificou-se um aumento da expressão relativa do
gene per-1 nas concentrações combinadas de Zn+Cd (1,6 + 0,6 mmol kg-1 solo) 48 h
AAT (Figura 16B). Para os demais casos houve supressão de genes.
Figura 16 – Expressão relativa de genes relacionados à biossíntese de proteínas
intrínseca (PsbA) e extrínseca (PsbO) ao fotossistema 2 (PS2) da fotossíntese e às enzimas do metabolismo antioxidativo (SODCyt, SODChl e per-1), em folhas de plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo, as seis (A) e 48 h após aplicação dos tratamentos. Valores médios de três repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05).
40
5.7 Alterações micromorfológicas
A folha de cacau é caracterizada por apresentar mesofilo constituído de uma
camada de parênquima paliçádico e duas ou três camadas de células, formando o
parênquima esponjoso, e presença de estômatos apenas na face abaxial da folha
(Figura 17A-H). Foram observadas diferenças significativas (p<0,05) entre os
tratamentos, para os parâmetros PP, PE, MF, ET, DE e PEL (Tabela 4). A espessura
do PP foi maior no tratamento controle e nas combinações de concentrações
intermediárias de Zn e Cd (0,8 + 0,4 e 0,4 + 0,6 mmol kg-1 solo). Por outro lado, o PE
foi superior e diferente significativamente (p<0,05) do controle na combinação de 1,2
mmol Zn kg-1 solo + 0,2 mmol Cd kg-1 solo. Resultados semelhantes foram
verificados na ET, na concentração de 0,8 mmol Zn kg-1 solo. Entre todos os
parâmetros, o que chama mais atenção foi a espessura de MF, cujo controle diferiu
e foi superior a todos os demais tratamentos. Por outro lado, os tratamentos com a
maior concentração de Cd (0,8 mmol kg-1 solo) e com concentrações intermediárias
de Zn + Cd (0,8 + 0,4 e 0,4 + 0,6 mmol kg-1 solo), apresentaram os menores valores
de MF. O maior valor de DE foi observado para a combinação 1,2 mmol Zn kg-1 solo
+ 0,2 mmol Cd kg-1 solo, ao passo que o menor valor foi encontrado para a
combinação 0,4 mmol Zn kg-1 solo + 0,6 mmol Cd kg-1 solo. A abertura longitudinal
do poro estomático (PEL) foi superior em todos os tratamentos envolvendo
combinações de Zn+Cd em relação aos demais avaliados.
41
Tabela 4 – Características anatômicas, observadas ao microscópio eletrônico de varredura (MEV), de folhas de plantas jovens do
genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. Valores médios de três repetições (± EP). As letras minúsculas indicam comparação entre os tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05).
Tratamentos
(mmol kg-1)
0 Zn + 0 Cd 16,6 ± 0,6 ns 10,3 ± 0,7 ns 25,6 ± 0,3 a 43,3 ± 4,2 a 68,4 ± 2,1 a 91,4 ± 2,1 a 671 ± 27,4 b 1,5 ± 0,4 ns 3,4 ± 0,4 b 5,3 ± 1,9 ns
0,8 Zn + 0 Cd 17,3 ± 1,1 ns 9,0 ± 1,0 ns 21,5 ± 0,7 b 34,2 ± 1,4 b 57,5 ± 3,6 b 85,1 ± 3,6 a 689 ± 9,1 b 1,8 ± 0,2 ns 3,7 ± 0,3 b 6,9 ± 0,9 ns
1,6 Zn + 0 Cd 13,4 ± 1,3 ns 8,2 ± 2,0 ns 21,1 ± 2,3 b 35,0 ± 1,8 b 54,5 ± 4,0 b 76,3 ± 4,0 b 621 ± 24,2 b 2,2 ± 0,3 ns 3,9 ± 0,0 b 8,8 ± 0,9 ns
0 Zn + 0,4 Cd 15,6 ± 0,8 ns 10,1 ± 0,3 ns 21,9 ± 0,9 b 30,4 ± 1,0 b 53,2 ± 2,1 b 76,0 ± 2,1 b 699 ± 23,7 b 2,3 ± 0,1 ns 3,6 ± 0,4 b 8,2 ± 1,1 ns
0 Zn + 0,8 Cd 17,6 ± 1,2 ns 9,2 ± 0,9 ns 20,8 ± 0,8 b 25,9 ± 1,0 b 44,3 ± 0,9 c 68,9 ± 0,9 b 658 ± 76,3 b 1,8 ± 0,2 ns 3,7 ± 0,3 b 6,9 ± 1,4 ns
1,2 Zn + 0,2 Cd 15,0 ± 1,0 ns 11,9 ± 1,6 ns 20,5 ± 2,1 b 41,4 ± 3,0 a 57,7 ± 3,7 b 83,0 ± 3,7 a 872 ± 36,5 a 1,8 ± 0,2 ns 4,6 ± 0,6 a 8,5 ± 1,9 ns
0,8 Zn + 0,4 Cd 12,4 ± 1,8 ns 8,0 ± 1,1 ns 25,6 ± 0,7 a 24,8 ± 1,3 b 45,7 ± 0,5 c 71,0 ± 0,5 b 648 ± 22,8 b 2,2 ± 0,3 ns 4,9 ± 0,6 a 11,2 ± 2,6 ns
0,4 Zn + 0,6 Cd 14,2 ± 1,1 ns 11,1 ± 0,3 ns 24,4 ± 1,6 a 25,6 ± 2,0 b 47,7 ± 0,4 c 72,2 ± 0,4 b 539 ± 45,7 c 2,4 ± 0,1 ns 4,7 ± 0,2 a 11,5 ± 1,1 ns
(µm) (mm²) (µm) (µm) (µm²) (µm) (µm) (µm) (µm) (µm)
ET DE PET PEL PET x PELEAd EAb PP PE MF
EAd: Epiderme Adaxial; EAb: Epiderme Abaxial; PP: Parênquima Paliçádico; PE: Parênquima Esponjoso; MF: Mesofilo foliar; ET: Espessura Total; DE: Densidade Estomática; PET: Poro Estomático Transversal; PEL: Poro Estomático Longitudinal.
42
Figura 17 – Micromorfologia de seções transversais do mesofilo foliar de plantas
jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas a diferentes concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo aos 37 dias após aplicação dos tratamentos. (A) Controle (sem adição de Zn ou Cd), (B) Zn (0,8 mmol kg-1 solo), (C) Zn (1,6 mmol kg-1 solo), (D) Cd (0,4 mmol kg-1 solo), (E) Cd (0,8 mmol kg-1 solo), (F) Zn + Cd (1,2 + 0,2 mmol kg-1 solo), (G) Zn + Cd (0,8 + 0,4 mmol kg-1 solo) e (H) Zn + Cd (0,4 + 0,6 mmol kg-1 solo). Barra: 40 μm.
43
6. DISCUSSÃO
Os elementos metálicos Zn e Cd acumularam principalmente nas raízes das
plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 em detrimento da parte aérea, cujo
acúmulo foi diretamente proporcional ao aumento das concentrações isoladas ou
combinadas dos metais no solo (Figura 2A). O mesmo fato foi observado por Castro
et al. (2015) em T. cacao „CCN-10 x SCA-6‟, Llatance et al., (2018) em T. cacao e
Luo et al., (2018) nas espécies lenhosas Arundo donax, Broussonetia papyrifera,
Robinia pseudoacacia e Cryptomeria fortunei. Mesmo Cd tendo sido acumulado em
maior quantidade nas raízes, o metal também foi identificado nas folhas em menor
concentração, evidenciando que o mesmo não é totalmente imobilizado nas raízes.
Devido à sua alta mobilidade e alta solubilidade em água, acaba sendo transportado
para a parte aérea, por meio da corrente transpiratória e, em determinadas espécies
vegetais, o seu acúmulo ocorre principalmente nas folhas (SEKARA et al., 2004). As
respostas evidenciadas para FT dos metais (Figura 3A-B) reforçam a ideia de que
um metal pode ser facilmente substituído pelo outro devido à similaridade, quando
foi verificado maior FT de Cd em relação ao Zn.
O aumento da concentração de Zn no solo proporcionou redução no acúmulo
de Cd nas folhas das plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 (Figura 2B),
demonstrando que a mitigação da toxicidade de Cd por Zn em cacau é dependente
da concentração de Zn no solo. Fato semelhante foi observado por Hussain et al.
(2018) em plantas de T. aestivum ao avaliar a mitigação da toxicidade de Cd por Zn.
Além disso, o menor acúmulo de Cd nas folhas pode ser uma estratégia para
proteger as funções fotossintéticas do estresse oxidativo induzido por esse metal
(DIXIT et al., 2001). As diferenças no padrão de alocação de Cd nas diferentes
partes da planta pode variar em função da espécie (BARRAZA et al., 2017) e da
cultivar em questão (GRAMLICH et al., 2017).
O incremento das concentrações de Zn e Cd combinados no solo não
influenciaram no acúmulo de Zn em folhas de cacau, pois com o aumento da
concentração de Cd, para qualquer concentração de Zn, apresentou resposta
semelhante (Figura 2A). Em contrapartida, houve um aumento dos teores de Zn nas
raízes de cacau com o incremento da concentração de Zn e Cd no solo (Figura 2C),
indicando a ocorrência de um possível mecanismo de defesa por imobilização ou
quelação de Zn e Cd na raiz (LUO et al., 2018). De acordo com Pereira et al. (2015),
44
o principal mecanismo de tolerância ao Cd em árvore de Schinus molle foi a
compartimentalização desse elemento metálico nas raízes e a diminuição da
translocação para a parte aérea, por meio da formação de barreiras apoplásticas. A
epiderme da raiz e o córtex também representam barreira física contra a absorção
do excesso de Zn via fluxo no xilema (DI BACCIO et al., 2009). O acúmulo de metais
tóxicos nas raízes pode contribuir para a tolerância das plantas (MARQUES;
NASCIMENTO, 2014), a depender do mecanismo que imobiliza os metais pesados
nas raízes (LUO et al., 2018). Além disso, as raízes podem promover a secreção de
exsudados, a exemplo dos ácidos orgânicos de baixo peso molecular, que
desempenham papel de destoxificação de metais pesados, a exemplo de Cd (ZHU
et al., 2011).
Os menores teores de Cd nas folhas de cacau, nos tratamentos com maiores
concentrações de Zn no solo (Figura 2B), sugerem ainda que Zn protege a planta da
toxicidade por competição com Cd no metabolismo celular da planta. Isto, por sua
vez, confirma a hipótese de que um elemento pode ser modulado pela presença do
outro, devido à sua similaridade química. No presente estudo, observou-se uma
maior tendência de absorção do Cd pelo sistema radicular das plantas de cacau,
quando as quantidades de Zn no solo foram baixas. Fato também verificado por
Whiting et al. (2000), Hart et al. (2002), Green et al. (2003), Kirkham (2006), Xing et
al. (2008) e Liu et al. (2010) ao avaliarem as interações entre Zn e Cd em diferentes
espécies vegetais.
Nas maiores concentrações de Zn e Cd, isolados ou combinados, foi possível
inferir que ambos têm efeito sobre as trocas gasosas foliares das plantas jovens do
genótipo de cacau CCN 51, quando em altas concentrações, evidenciada pela
redução nos valores de A (Figura 4), principalmente para Cd, quando a sua
concentração foi superior a 0,2 mmol Cd kg-1 solo. Entretanto, houve um aumento na
taxa fotossintética na concentração de Cd correspondente a 0,2 mmol kg-1 solo,
combinada com quaisquer concentrações de Zn, principalmente aos 22 e 29 dias
AAT. O mesmo foi observado para Cd, que, sendo um metal não essencial, atua de
forma positiva no ganho de carbono pela planta, em baixas concentrações. Fato
evidenciado por meio da curva A/Ci (Figura 9). Mateos-Naranjo et al. (2008)
consideram que a exposição de plantas ao excesso de Zn pode inibir o transporte de
elétrons em nível de PS2, influenciando a fixação e a assimilação de CO2,
desencadeado pelo declínio da atividade da Rubisco. Por outro lado, o aumento da
45
fotossíntese líquida pode ser o resultado da elevação do teor de Rubisco em baixas
concentrações de Cd, evidenciando seu efeito positivo (JIA et al., 2014).
A redução de A, com o aumento das concentrações de Zn e Cd, pode estar
associada à redução de gs, em função do fechamento dos estômatos, e uma
resistência à difusão de CO2 para a câmera subestomática e, consequentemente,
redução da perda de água por meio da transpiração (Figuras 4 - 6). O mesmo fato
foi observado por Jia et al. (2014), Singh e Prasad (2015), Liu et al. (2016) e Araújo
et al. (2017), que verificaram, em diferentes espécies vegetais, um aumento de A, gs
e E em baixas concentrações de Cd, com posterior declínio com o aumento das
concentrações. Tal mecanismo é conhecido como efeito hormese, que é um
fenômeno que se caracteriza pela concentração-resposta quando há um estímulo
em baixas concentrações e inibição em altas concentrações (JIA et al., 2014). A
redução de A pode ser explicada por uma perturbação no sistema fotossintético da
folha, como a inibição da cadeia de transporte de elétrons do cloroplasto
(MYŚLIWA-KURDZIEL et al., 2004), inibição de enzimas do Ciclo de Calvin
(ARAVIND; PRASAD, 2003; MYŚLIWA-KURDZIEL et al. 2004; LÖSCH, 2004) ou à
redução da concentração de clorofila (MYŚLIWA-KURDZIEL et al., 2004; KÜPPER
et al., 2007).
O aumento da atividade de SOD, nas maiores concentrações de Zn (1,2 e 1,6
mmol kg-1 solo) isoladas, assim como nas concentrações Cd isoladas e de Zn e Cd
combinadas (Figura 12) estão relacionados ao mecanismo de destoxificação de Zn e
Cd, em função do aumento da produção de ERO (CASTRO et al., 2015). Isso
demonstra a capacidade das plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 na
eliminação do excesso de ERO em condições de estresse por Zn e Cd. A atividade
de SOD se constitui como a primeira barreira enzimática contra o estresse oxidativo,
desempenhando um importante papel no sistema de defesa antioxidante,
convertendo o O2•- em H2O2 (FRIDOVICH, 1995; ZHANG et al., 2017). Esse produto
final deve ser removido por CAT, GPX e APX a fim de evitar sua conversão em
espécies mais reativas, como OH-, em que as enzimas CAT E APX atuam
convertendo-o em H2O (PERL-TREVES; PERL, 2002). Fato semelhante foi
observado também por Araújo et al. (2017) e Castro et al. (2015) em plantas jovens
de cacau submetidas à toxicidade de Cd.
As menores atividades de CAT nas folhas de plantas jovens do genótipo de
cacau CCN 51, submetidas às duas maiores concentrações de Cd, especialmente
46
as seis e 12 h (Figura 13), podem ser explicadas pela ação de Cd, que causa
substituição de Fe em sítios ativos da catalase, e pela absorção inadequada de Fe
do solo (BENAVIDES et al., 2005). Além disso, Cd também pode levar à inibição
enzimática interagindo com grupos tiol em sua estrutura (ULUSU et al., 2017) por
ligação a resíduos de cisteína nos seus sítios ativos (D‟ALESSANDRO et al., 2013).
O mesmo fato foi observado também para APX (Figura 14) e GPX (Figura 15) em
todos os horários avaliados. De acordo com Myśliwa-Kurdziel et al. (2004) e Lösch
(2004), a ação de metais como Cd recai sobre as enzimas e proteínas, que contêm
grupos sulfidrilas (SH) ligados entre si por ligações dissulfeto, oxidando esses
grupos, que, ao reagir com S, destroi as ligações dissulfeto, desnaturando a
proteína, resultando na redução da atividade enzimática. Dessa forma, Cd, por sua
semelhança com Zn como cátion divalente, pode substituí-lo nestas enzimas,
resultando, também, em alteração da atividade enzimática (SHAW et al., 2004).
A indução da expressão relativa de todos os genes avaliados (psbA, psbO,
SODCyt, SODChl e per-1), principalmente às 6 h AAT, nas maiores concentrações
combinadas de Zn+Cd aplicados ao solo, revela a capacidade das plantas jovens do
genótipo de cacau CCN 51 de tolerarem concentrações elevadas de Zn e Cd. Pois,
as plantas respondem a estresses ambientais, como metais pesados, provocando a
expressão de genes que codificam proteínas envolvidas na resposta ao estresse
(HASAN et al., 2017). A absorção de Zn+Cd, em altas concentrações, pelas plantas
jovens do genótipo de cacau CCN 51, promoveram danos ao aparato fotossintético
(Figura 4), devido, em parte, a não expressão de psbA e de psbO, 48 h AAT, exceto
no tratamento 1,2 mmol Zn kg-1 solo + 0,8 mmol Cd kg-1 solo (Figura 16). A redução
da atividade fotossintética em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51, com o
aumento da concentração de Cd, e, consequentemente, redução na expressão de
psbA e de psbO, foi também verificado por Araújo et al. (2017). Segundo Araújo et
al. (2017), a repressão do gene psbO é um mecanismo de proteção da proteína D1,
no sentido de evitar danos de PS2. Tal gene é o principal responsável pela
codificação da proteína PsbO, extrínseca ao PS2 (NICKELSEN; RENGSTL, 2013).
O gene psbA codifica a proteína D1, principal proteína intrínseca de PS2, que é
afetada pelo estresse oxidativo induzido pelo Cd (MǾLLER et al., 2007).
A indução da expressão dos genes Cu-Zn SODCyt e Cu-Zn SODChl às 6 h
AAT e a posterior supressão às 48 h AAT (Figura 16), assim como maior atividade
de SOD nas primeiras 3 h AAT, nas maiores concentrações de Cd no solo (Figura
47
12), revelam a eficiência do mecanismo de proteção de SOD na destoxificação de
ERO. Neste caso, os danos oxidativos foram influenciados pela concentração e
tempo de exposição ao Zn e, ou Cd. A resposta na expressão de genes Cu-Zn SOD
pode ser característica da espécie, uma vez que resultados semelhantes na
expressão de genes Cu-Zn SODChl foram obtidos por Araújo et al. (2017) e Castro
et al. (2015), ao avaliar a toxicidade de Cd em plantas jovens do genótipo de cacau
CCN 51 e da progênie de cacau resultante do cruzamento de CCN 10 x SCA 6. Por
outro lado, a atividade de GPX está associada com o gene per-1, que foi
superexpresso na combinação de 1,6 mmol Zn kg-1 solo + 0,8 mmol Cd kg-1 solo as
6 h AAT e de 1,6 mmol Zn kg-1 solo + 0,6 mmol Cd kg-1 solo as 48 h AAT. Este
mecanismo se apresenta como possível defesa contra o excesso de ERO provocada
por altas concentrações de Zn e Cd. Fato semelhante foi também observado por
Castro et al. (2015), ao avaliar a toxicidade de Cd em plantas jovens da progênie de
cacau CCN 10 x SCA 6.
Os maiores teores médios de prolina, observados nas folhas das plantas
jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas à maior concentração de Zn (1,6
mmol kg-1 solo), combinada com as maiores concentrações de Cd (0,4, 0,6 e 0,8
mmol kg-1 solo), e nas maiores concentrações de Zn + Cd (1,6 + 0,8 mmol kg-1 solo)
(Figura 10), indicam a efetividade desse mecanismo não enzimático no controle da
produção de ERO. Este mecanismo de remoção de ERO se dá pela fácil reação
entre a prolina e o oxigênio singleto (1O2), que contribui na estabilização de
proteínas, DNA e membranas (MATYSIK et al., 2002), além de exercer um papel
importante na redução da peroxidação lipídica de membranas celulares. O aumento
do teor de prolina, com o aumento da concentração de Cd, foi também observado
em outras espécies vegetais por Yilmaz e Parlak (2011) e Singh e Prasad (2014).
Cd pode induzir o acúmulo de ERO e, consequentemente, promover a
peroxidação lipídica de membranas celulares (DEY et al., 2007). Porém, no presente
trabalho, não houve peroxidação lipídica de membranas celulares de tecidos foliares
e radiculares nas maiores concentrações de Zn e Cd, a exceção da menor
concentração de Zn associada à maior concentração de Cd (Figura 11). Tal
mecanismo não enzimático é um importante indicador de estresse, a partir do
momento em que os radicais livres reagem com ácidos graxos poliinsaturados das
membranas, oxidando os lipídios (AYALA et al., 2014). Segundo Ulusu et al. (2017)
o aumento da peroxidação lipídica, com o aumento da concentração de Cd, em
48
plantas Petroselinum hortense se deve ao efeito prejudicial dos derivados de ERO.
De modo semelhante, Liu et al., (2016) observaram aumento do teor de MDA,
resultante da peroxidação lipídica, com o aumento do tempo de exposição e da
concentração de Cd.
A exposição das plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 a altas
concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd ocasionou redução na espessura do mesofilo
foliar (Tabela 4). Castro et al., (2015) também observaram redução da espessura do
mesofilo foliar de plantas jovens das progênies de cacau, resultantes dos
cruzamentos de Catongo x Catongo e CCN 10 x SCA 6, submetidas a
concentrações de 8 e 32 mg Cd L-1 em solução nutritiva, decorrentes da redução no
espessamento dos parênquimas paliçádico e esponjoso. De acordo com Chugh e
Sawhney (1999), a compressão de o tecido foliar pode levar ao decréscimo da
capacidade fotossintética na presença de Cd. De fato, no presente trabalho, as
menores taxas fotossintéticas foram observadas nos tratamentos onde houve
redução na espessura do mesofilo foliar, decorrente do aumento da concentração de
Zn, Cd e Zn+Cd.
A redução na densidade estomática foi observada apenas nas folhas das
plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 submetidas às concentrações
combinadas de Zn+Cd (0,4 + 0,6 mmol kg-1 solo) (Tabela 4). Pereira et al. (2015), ao
observarem as características anatômicas das folhas das árvores de Schinus molle,
perceberam aumento da densidade estomática e da espessura do parênquima
esponjoso com o aumento da concentração de Cd. Isto pôde ser confirmado, no
presente trabalho, por meio do aumento das taxas fotossintéticas do genótipo de
cacau CCN 51 no tratamento correspondente a 1,2 mmol Zn kg-1 solo aos 4, 15, 22 e
29 DAAT. Além disso, as folhas das plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51
apresentaram maior espessura do parênquima esponjoso no tratamento controle e
no tratamento com a maior concentração de Zn combinada com a menor
concentração de Cd (1,2 mmol Zn kg-1 solo + 0,2 mmol Cd kg-1 solo) (Tabela 4).
Di Baccio et al. (2009) também observaram aumento da espessura foliar em
Populus sp., com o aumento da concentração de Zn. Segundo Pereira et al. (2015),
a anatomia das folhas das árvores de S. molle, submetidas a pequenas
concentrações de Cd (até 20 µM), apresenta características benéficas, como o
espessamento do mesofilo. Segundo estes autores, o aumento da concentração de
Cd (> 50 µM) promove diminuição da espessura do mesofilo, diminuição do tamanho
49
e da densidade de estômatos, reforçando a ocorrência do efeito hormese, em que a
planta responde positivamente em baixas concentrações e tem efeito prejudicial com
o aumento das mesmas.
7. CONCLUSÕES
Altas concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo promoveram alterações nas
trocas gasosas foliares das plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51,
comprovadas pela redução nas taxas fotossintéticas e eficiência de carboxilação.
Houve absorção diferencial de Zn, Cd e Zn+Cd do solo pelas raízes e
acúmulo em folhas das plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51.
As concentrações de 1,2 e 1,6 mmol Zn kg-1 solo foram capazes de atenuar a
toxidez de Cd, em maior concentração no solo, evidenciadas pela redução do fator
de translocação desse metal nestas duas maiores concentrações de Zn.
As concentrações de Zn, Cd e Zn+Cd no solo interferiram no metabolismo
antioxidativo enzimático e não enzimático, na expressão de genes envolvidos na
fotossíntese e no metabolismo antioxidativo, evidenciadas pelas respostas das
plantas do genótipo de cacau CCN 51, por meio do aumento da atividade das
enzimas antioxidativas e do teor de prolina e da redução da peroxidação lipídica.
Altas concentrações de Cd e Zn no solo interferiram na morfologia foliar do
genótipo de cacau CCN 51, evidenciada pelas alterações anatômicas.
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