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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA
MOLECULAR
APLICAÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE EXTRATO DE CASCAS DO FRUTO DE CACAU: MECANISMO DE AÇÃO, ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E NÃO
GENOTÓXICA
REGINEIDE XAVIER SANTOS
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Novembro de 2013
REGINEIDE XAVIER SANTOS
APLICAÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE EXTRATO DE CASCAS DO FRUTO DE CACAU: MECANISMO DE AÇÃO, ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E NÃO
GENOTÓXICA
Tese apresentada à Universidade Estadual
de Santa Cruz, como parte das exigências
para obtenção do título de Doutor em
Genética e Biologia Molecular.
ILHÉUS – BAHIA – BRASILNovembro de 2013
REGINEIDE XAVIER SANTOS
Aplicação biotecnológica do extrato de cascas do fruto de cacau: mecanismo
de ação, atividade antimicrobiana e não genotóxica
Tese apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz, como
parte das exigências para obtenção do título
de Doutora em Genética e Biologia
Molecular.
Área de concentração: Biotecnologia
APROVADA: 21 de Novembro de 2013
Prof. Dra. Jane Marlei Boeira Prof. Dr. Dirceu Joaquim Costa
(UERGS / RS) (UESB / BA)
Prof. Dr. Sonia Cristina Melo Prof. Dr. Luiz Carlos Salay
(UESC / BA ) (UESC / BA)
Prof. Dra. Cristina Pungartnik
(UESC – Orientadora)
(...) Pois de tudo fica um pouco.
Fica um pouco de teu queixo
No queixo de tua filha.
De teu áspero silêncio
Um pouco ficou, um pouco
nos muros zangados,
nas folhas, mudas, que sobem.
Ficou um pouco de tudo
nos pires de porcelana,
dragão partido, flor branca,
ficou um pouco
de ruga na vossa testa,
retrato.
(...) E de tudo fica um pouco.
(Resíduo)
Drummond de Andrade
Dedico este trabalho a meu
esposo: JÓ, pela paciência,
incentivo, e acima de tudo pela
amizade!!!!
AGRADECIMENTOS
"Cada um que passa em nossa vida, passa sozinho, pois cada pessoa é única e nenhuma substitui outra.
Cada um que passa em nossa vida passa sozinho, mas não vai só, nem nos deixa só. Leva um pouco de nós mesmos, deixa um pouco de si mesmo.
Há os que levam muito, mas há os que não levam nada. Essa é a maior responsabilidade de nossa vida, e a prova de que duas almas não se encontram ao acaso"
(Antoine de Saint-Exupéry)
Agradeço...
Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos.
À minha orientadora Dra. Cristina Pungartnik, TODO MEU CARINHO por encontrar
não só uma orientadora de excelência, mas com uma verdadeira amiga, “mãezona”
e mestra, que deixará ensinamentos de profissionalismo e amizade, para uma vida
inteira.
Ao Dr. Martin Brendel, pela valiosa colaboração e oportunidade de aprender e de
fazer ciência com excelência.
Ao Dra. Grace Gosmann (UFRGS) pela co-orientação, apoio concedido ao meu
aperfeiçoamento profissional, sempre prestativa.
À minha 2a co-orientadora, Aline Zimmer (UFRGS), foi ela que me ensinou tudo
sobre o CLAE. Pessoa de excelente convívio!
À DEUS, pela vida pela minha família e por todas as bênçãos que recebo todos os
dias.
Ào meu esposo, amigo, companheiro... Jó, pela paciência, por estar SEMPRE ao
meu lado, pelos muitos cuidados, por me proporcionar muitos instantes de alegria e
paz em momentos de muito estresse.
Àos meus para sempre amores Lupita, Joannes e Joice com as minhas ausências,
sempre com um sorriso e carinho, cada uma do seu jeito.
Às minhas sempre amigas e companheiras Tati, Gabí e Sônia pelo companheirismo
e apoio técnico nos trabalhos.
À Diêgo pelas ajudas imensuráveis nos experimentos, IC de total competência.
Os meus agradecimentos se estendem ao pessoal do LaFiS da UFRGS e a Dani
Trentin pelos ensinamentos dos ensaios antibacteriano.
Ao universo de pessoas que me ajudaram em todo o processo de pesquisa, sem
todos vocês não haveria nada nestas páginas.
À todos muito obrigada!
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................... i
RESUMO................................................................................................................. ii
ABSTRACT............................................................................................................. iv
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................... 3
2.1 Theobroma cacao L....................................................................................... 3
2.2 AS CASCAS DO T. cacao.............................................................................. 9
2.3 BIOTRANSFORMAÇÃO................................................................................ 12
2.4 ANTIMICROBIANOS..................................................................................... 15
2.5 GENOTOXICIDADE ..................................................................................... 17
3. OBJETIVOS........................................................................................................ 26
3.1 GERAL............................................................................................................... 26
3.2 ESPECÍFICOS................................................................................................... 26
4. CAPÍTULO I ………………………………………………………...................…….. 27Patente: Privilégio de Inovação - Extrato da casca do fruto do cacaueiro: obtenção e uso agrícola.......................................................................................... 28
4. CAPÍTULO II…………………………………………………………....................… 50Antimicrobial Activity of Fermented Theobroma cacao Pod Husk Extract (CHE)....................................................................................................................... 51
4. CAPÍTULO III…………………………………………………………....................… 67Fermented Theobroma cacao Pod Husk Extract: Genotoxicity in Yeast, bacteria and mammalian cell................................................................................................. 68
5. DISCUSSÃO GERAL.......................................................................................... 91
6. CONCLUSÕES................................................................................................... 997. PERSPECTIVAS................................................................................................. 1008. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 101
ANEXOS.................................................................................................................. 119
LISTA DE ABREVIATURAS
4NQO Óxido de 4-nitroquinoleína
A AdeninaATP Adenosina tri-fosfato
C Citosina
CAT Catalase
CCD Cromatografia em camada delgada
Cepec Centro de Pesquisa do Cacau
Ceplac Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira
CO2 Dióxido de carbono
dag Unidade de medida decagrama (101 g)
G Guanina
H2O2 Peróxido de hidrogênio
H2SO4 Ácido Sulfurico
m Unidade de medida metro
Na2SO4 Sulfato de sódio
NAD Nicotina adenina dinucleotídeo
NAD+ Nicotina adenina dinucleotídeo (oxidado)
NADH Nicotina adenina dinucleotídeo (reduzido)
NER Reparação por excisão de nucleotídeo
T Timina
t Tonelada
TSH Trinidad Select Hybrid
UVC Radiação ultravioleta (254nm)
V79 Células de fibroblastos de pulmão de Hamster Chinese
i
RESUMO
SANTOS, Regineide Xavier, DS, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Novembro
de 2013. Possíveis aplicações biotecnológicas do extrato de cascas de cacau:
mecanismo de ação, atividade antimicrobiana e não genotóxica. Orientadora: Dra.
Cristina Pungartnik. Co-orientador: Dra. Grace Gosmann. Colaborador: Dr. Martin Brendel.
O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma planta originaria da América do Sul e
Central tendo seu cultivo se espalhado por todo mundo. Na região sul do estado da Bahia
se cultivam mais de 400.000 ha de T. cacao com produção de grande quantidade de
cascas do fruto de cacau após o beneficiamento da fruta, que ficam depositadas no
mesmo local das plantações. O objetivo deste trabalho foi identificar possíveis aplicações
biotecnológicas para o extrato da casca do fruto do cacau fermentada e atestar a
seguridade de uso para humanos e no meio ambiente. O extrato da casca do fruto do
cacau foi obtido por fermentação, com algumas etapas muito importantes, como umidade
e aeração. As cascas durante o processo foi constantemente revolvidas para promover a
aeração, mantidas com umidade em torno de 50 a 60%. A temperatura observada durante
o processo fermentativo ficou entre 60 a 70oC e, por volta dos noventa dias o extrato da
casca do fruto do cacau foi recolhido e colocado para secar em estufa. As análises
químicas no extrato da casca do fruto do cacau, evidenciaram teores macro e
micronutrientes de importância para suprir a necessidade de elementos requeridos
durante o crescimento de mudas do cacaueiro, os quais em alguns solos se encontram
em valores muito baixos. No extrato da casca do fruto do cacau foram realizados ensaios
para a identificação do potencial antimicrobiano e genotóxico, usando os testes de
Salmonella/microssoma, testes de mutações reversas e recombinação em
Saccharomyces cerevisiae e o ensaio Cometa em células de mamíferos V79, além de
análises fitoquímicas para identificação da sua composição. Durante os ensaios com o
extrato da casca do fruto do cacau verificou-se atividade antibacteriana com graus
variados em cepas microbianas Gram-negativas (Pseudomonas aeruginosa e Salmonella
choleraesuis) e também antifúngica em S. cerevisiae (mutantes defectivos para o
transporte de metais) e em Moniliophtora perniciosa fungo que causa grandes prejuízos
às lavouras cacaueira. As análises fitoquímicas preliminares do extrato da casca do fruto
do cacau revelaram a presença de compostos secundários, pertencentes ao grupo dos
fenólicos, terpenos e alcalóides. Os resultados de genotoxidade mostraram que o extrato
da casca do fruto do cacau não foi capaz de induzir genotoxicidade nas linhagens de S.
cerevisiae, nas cepas de S. typhimurium e em células de mamíferos em nenhuma das
ii
doses testadas. Portanto, o extrato da casca do fruto de T. cacao obtido trabalho consiste,
em uma fonte potencial de identificação de metabólitos com potencial antimicrobianos,
como biofertilizante na produção de mudas de cacaueiro e com indicativo de segurança
na sua manipulação por humanos, além de possibilidades de agregar valor às lavouras do
cacau.
Palavras - chave: Salmonella/microssoma, ensaio Cometa, mutações reversas e recombinação em S. cerevisiae, antimicrobiano.
iii
ABSTRACT
SANTOS, Regineide Xavier, DS, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, November,
2013. Potential biotechnological applications of bark extract cocoa: mechanism of
action, antimicrobial activity and not genotoxic. Advisor: Dra. Cristina Pungartnik. Co-
advisor: Dra. Grace Gosmann. Collaborators: Dr. Martin Brendel.
The cocoa tree ( Theobroma cacao L.), a plant native to South America and Central
taking its cultivation spread throughout the world. In the southern state of Bahia cultivate
more than 400.000 hectares of T. cacao producing large quantities of cocoa fruit peels
after processing the fruit, which are deposited in the same location of the plantations. The
aim of this study was to identify possible biotechnological applications for the bark extract
of the fruit of fermented cocoa and certify the security of use to humans and the
environment. The bark extract of the fruit of cocoa has been obtained by fermentation with
some very important steps. The shells during the process was constantly ripped to
promote aeration, kept with humidity around 50-60%. The temperature observed during
the fermentation process was between 60 to 70oC and about ninety days the bark extract
of the fruit of the cocoa was collected and placed in an oven to dry. Chemical analyzes of
the bark extract of the fruit of the cocoa, showed levels of important macro and
micronutrients to meet the need of elements required for the growth of seedlings of cocoa,
which in some soils are very low in intervals. In extract of the fruit of the cocoa tests were
performed for the identification of potential antimicrobial and genotoxic tests using the
Salmonella / microsome, reverse mutation test and recombination in Saccharomyces
cerevisiae and Comet assay, and phytochemical analysis to identify its composition.
During tests with the CHE was found antibacterial activity with varying degrees in microbial
strains Gram - negative (Pseudomonas aeruginosa and Salmonella choleraesuis)
moreover in yeast S. cerevisiae (mutants defective for the transport of metals) and
basidiomycete Moniliophtora perniciosa causing major damage crops cocoa. In preliminary
phytochemical analysis of the stratum extract of the fruit of the cocoa revealed the
presence of secondary compounds belonging to the group of phenolics, terpenes and
alkaloids. By analysis of genotoxicity can be seen that the extract of the fruit of the cocoa
was not able to induce genotoxicity in strains of S. cerevisiae, the strains of S. typhimurium
and in mammalian cells at all doses tested. Therefore, the bark extract of the fruit of T.
cacao obtained work consists in identifying a potential source of antimicrobial metabolites
iv
with potential as biofertilizer production of cocoa seedlings and indicative of safety in
handling by humans, as well as possibilities to add value to cocoa plantations.
Keywords: Salmonella / microsome, Comet assay, reverse mutation and recombination in
S. cerevisiae, antimicrobial.
v
vi
1. INTRODUÇÃO
O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma planta originaria da América do
Sul e Central tendo seu cultivo espalhado por todo mundo. Suas sementes ou
amêndoas constituem a matéria-prima para fabricação de chocolate e seus
derivados, os quais são consumidos sob diferentes formas e em grandes
quantidades em todos os países.
Na indústria farmacêutica e cosmética, a manteiga de cacau é muito
utilizada, na indústria chocolateira se usa a torta e o pó de cacau para fabricação
de doces e confeitos. Já a polpa do cacau, rica em carboidratos, é utilizada na
fabricação de vinho, licor, vinagre, suco, geléia e outros.
A cacauicultura, produz grande quantidade de resíduos orgânicos (cerca de
7 t de casca fresca), para produção de uma tonelada de amêndoas. Na maioria
das propriedades as cascas são separadas após a quebra dos frutos
permanecendo no mesmo local das plantações.
O aproveitamento desses resíduos orgânicos vem sendo realizados
através do uso na alimentação animal, na extração de pectinas, na produção de
gomas e obtenção de fertilizantes orgânicos por meio da compostagem. Mas,
observa-se que pouco tem sido feito na transformação e ou aproveitamento
destes resíduos, seja por parte dos próprios produtores e/ou pelas autoridades
públicas, constituindo-se, em alguns locais, em um problema ambiental e de
saúde pública.
No entanto, o aproveitamento desses resíduos pode contribuir para
inativação do inóculo de agentes patogênicos, como a Phytophthora spp que
causa a podridão parda, uma doença associada à cultura do cacaueiro. No
entanto, o não aproveitamento destes resíduos representa um desperdício de
matéria-prima, visto que eles contêm uma gama de componentes biologicamente
ativos que em grande parte são descartados.
Os resíduos do cacaueiro parecem ser fonte promissora de futuros
compostos bioativos. Esta idéia está fundamentada pela diversidade de estruturas
produzidas pelas plantas que podem ser utilizados por microrganismos em
1
processos de biotransformação para produzir uma variedade de novos produtos,
tendo um substrato abundante e de baixo custo.
Assim, frente à elevada proporção de resíduos provenientes da lavoura do
T. cacao torna-se relevante investigar o seu potencial bioativo na perspectiva de
obter alguma substância ou composto biotecnológico. O aproveitamento da casca
do fruto do cacaueiro pode ser visto como um recurso natural de importância na
agricultura sustentável, de forma a reduzir os custos de produção e minimizar o
impacto ambiental.
Entretanto, agentes químicos de fontes naturais, podem ocasionar danos
aos organismos vivos, sendo necessário investigar sua genotoxidade com a
finalidade de atestar a seguridade destes produtos que serão expostos aos
animais e ao espaço ambiental.
Desta forma, este trabalho buscou identificar possíveis aplicações
biotecnológicas do extrato da casca do T. cacao fermentado e atestar a
seguridade de uso para humanos e o meio ambiente.
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Theobroma cacao L
No início da civilização, a ação antropológica exercia pequena influência
sobre o ambiente. Com o aumento das densidades populacionais humanas e sua
organização em comunidades cada vez mais aparelhadas, os recursos naturais
presentes não mais supriam as necessidades básicas de uma população cada
vez maior. Assim, o homem passou a dedicar-se ao cultivo do solo, dando origem
ao surgimento da agricultura (PATERNIANI, 2001). Tal sistema se expandiu
amplamente, tornando-se muito importante para o desenvolvimento da economia
mundial, como o exemplo da atividade agrícola do cacau.
A cultura cacaueira, representa hoje uma commodity agrícola de
exportação, onde, a produção mundial média está estimada em 3,3 milhões de
toneladas, produzidas por mais de 20 países, nas regiões tropicais da África,
Américas do Sul e Central e Ásia (EFRAIM, 2004; CRUZ et al., 2012). A produção
mundial de cacau, de acordo com o “International Cocoa Organization” (ICCO)
tem sido ascendente, onde os maiores produtores mundiais de cacau são: a
Costa do Marfim com 1.242 mil toneladas, em seguida, se encontra o países de
Gana (632 mil toneladas), Indonésia (550 mil toneladas), Nigéria (240 mil
toneladas), Camarões (205 mil toneladas), Brasil (161 mil toneladas), Equador
(160 mil toneladas) e Papua Nova Guiné, com produção de 50 mil toneladas
(ICCO, 2011).
Entretanto, o cacaueiro pode ser acometido por várias doenças que como
consequência interferem na produção. A podridão-parda ou podridão-de-
phytophthora, causada por Phytophthora spp. é, em termos mundiais, uma das
principais, encontrada em todos os países produtores de cacau. Outras doenças
como a vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa,
3
amonilíase ou podridão-de-moniliophthora, causada por Moniliophthora roreri, e a
murcha-vascular-estriada causada por Oncobasidium theobromae, causam
perdas em várias regiões do mundo (DANTAS NETO et al., 2005)
Até o final dos anos 80, o sul da Bahia era responsável por 84,5% da
produção nacional de cacau, equivalente na época à 15% da produção mundial
(PEREIRA et al., 1989). A queda na produção nacional pode ser, em parte,
explicada pelo aparecimento nas plantações de cacau do fungo M. perniciosa,
causador da doença conhecida como vassoura-de-bruxa (DIAS, 2001). Esta
doença se inicia quando o esporo do fungo penetra e modifica os tecidos em
crescimento da planta, gerando anormalidades e provocando diferentes tipos de
sintomas que podem variar dependendo do órgão infectado e do ciclo de vida do
fungo (Fig. 1) (SILVA & HANSEN, 2002).
Figura 1. Ciclo de vida do M. perniciosa (MEINHARDT, 2008).
O cacau (Theobroma cacao L.) pertence à família das Esterculiaceas,
sendo reclassificado e inserido na família Malvaceae (SOUNIGO et al., 2003), é
considerado uma árvore pré-histórica das florestas tropicais (WHITKUS et al.,
1998). É uma planta perene, desenvolve-se em solos com características
variadas, tais como, mata de dossel, capoeira, sistemas consorciados com outros
cultivos ou até pastagem (SUFRAMA, 2003). É uma planta que se adapta melhor
em áreas com sombreamento, pois a sombra ameniza o efeito direto do sol e
reduz o movimento do ar sob o cacaueiro (SILVA & HANSEN, 2002).
É uma árvore de pequeno porte, geralmente 4-10m de altura (Fig. 2),
raramente alcança tamanhos maiores, a exceção, apenas quando crescida em
4
zonas de vegetação densa, onde em função do sombreamento, pode atingir até
20 metros (DUKE, 1983; OLIVEIRA et al., 2006). Possui flores pequenas,
amarela-avermelhada, que brotam sob a forma de almofadas unidas ao tronco ou
até mesmo nos ramos lenhosos, mais de 100.00 (cem mil) almofadas são
emersas no período do seu florescimento, dessas, apenas cerca de 0,1%
originam os frutos (SUFRAMA, 2003).
Figura 2. A planta do T. cacao com frutos verdes (Fotos de G. A. Sodré).
Os frutos são sustentados por pedúnculos lenhosos, quando maduros (Fig.
3) adquirem tonalidade variada: esverdeado (fruto jovem) passando a amarelado
(fruto maduro), ou arroxeada a cor alaranjada durante a maturação, dependendo
da variedade cultivada (FERREIRA et al., 2013).
5
Figura 3. Frutos do T. cacao L (RODRIGUES, 2009).
Cada fruto contém entre 20 a 40 sementes com formato, elipsóide ou
ovóide com 2 a 3cm de comprimento envoltas numa polpa mucilaginosa e
esbranquiçada (Fig. 4), levemente doce e ácida. O fruto do T. cacao em geral tem
peso médio de 500 g, deste 70 a 75% compõe a casca, e 20% representam as
sementes - o grão seco (10%), a amêndoa (8%), a testa (1,5%) e outros
constituintes (0,5%) do total do fruto (ZHENG et al., 2004; LACHENAUD et al.,
2007).
Figura 4. Sementes envoltas em polpa mucilaginosa (BENASSI, 2012)
A maior importância econômica de T. cacao está relacionada
principalmente na utilização das sementes de seus frutos, para a produção do
chocolate e confeitos sob as mais diversas formas, em todos os países. Também
pode-se incluir a manteiga de cacau como uma boa matéria prima para fabricação
de produtos farmacêuticos e cosméticos, além da sua polpa ser também muito
apreciada e consumida em várias regiões (MENEZES & CARMO-NETO, 1993). 6
São diversos os empregos do cacau ou de seus derivados nas indústrias tendo,
sua composição oriunda tanto do metabolismo primário e/ou secundário. Dos
metabólicos presentes no cacau podem ser encontrados mais de 300 compostos
e substâncias, que incluem as fibras, os aminoácidos, as proteínas, os lipídeos,
os carboidratos, ácido ascórbico, fósforo, cálcio, ferro e outros (GARZARO et al.,
1998) e classes de alcalóides e fenóis (NOJOSA et al., 2003; SCARPARI et al.,
2005).
O grupo dos alcalóides encontrado na fruta do cacau tem como seus
principais representantes as metilxantinas, a teobromina (3,7-dimetilxantina),
cafeína (1,3,7-trimetilxantina) e traços de teofilina (COSTA, 1994; KOYAMA et al.,
2003). Suas metilxantinas são derivados dos nucleotídeos de purina, o qual
parece ser o mais amplo entre o grupo dos alcalóides (ASHIHARA & CROZIER,
2001). Geralmente as metilxantinas tem local de estocagem diferente daquele
onde ocorre sua síntese, onde frequentemente, são produzidos no retículo
endoplasmático, e armazenados nos vacúolos dos tecidos com crescimento ativo,
nas células epidérmicas e hipodérmicas, nas bainhas vasculares e nos vasos
lactíferos, conjuntamente aos compostos fenólicos (ASHIHARA, 1993;
KOSHIISHI, 2001). As metilxantinas no cacau estão distribuídas também em
diferentes partes, são geralmente mais encontradas em tecidos jovens como as
gemas e folhas (BUCHELI et al., 2001, AL-JANABI, 2011). Mas, seu principal local
de síntese e acumulação é verificada nas sementes (cotilédones e eixo
embrionário), também é observada sua presença nas cascas (HAMMERSTONE
JR et al., 1994; SIMÕES et al., 1999). No pericarpo jovem, a teobromina é a
metilxantina mais abundante, enquanto no pericarpo maduro a cafeína é o
principal alcalóide (BUCHELI et al., 2001; KOYAMA et al., 2003). No cacau e no
chocolate, a metilxantina predominantemente encontrada é a teobromina, em
teores próximos a 1,89%, seguida da cafeína, em quantidades menores (0,23%)
(ROZIN et al., 1991).
Os compostos fenólicos encontrados estão nos cotilédones das sementes,
cascas dos frutos e folhas de cacau, onde cerca de 60% dos polifenóis
encontram-se na forma de procianidinas, havendo também flavonóides, 7
especialmente as catequinas, e a quercetina (FIGUEIRA et al., 1993; ARLÓRIO et
al., 2005; ANDRES-LACUEVA et al., 2008). Segundo LEE et al. (2003), o cacau
possui maior quantidade de compostos fenólicos quando comparado ao chá preto
ou verde e também ao vinho. Os fenólicos, têm sido amplamente estudados em
razão dos efeitos que beneficiam à saúde, como uma potente atividade
antioxidante para prevenir reações oxidativas e formação de radicais livres, além
de gerar proteção contra danos ao DNA das células (WOLLGAST & ANKLAN,
2000b). Os efeitos bioquímicos e farmacológicos dos polifenóis são muito vastos
e dentre estes destacam-se os anti-carcinogênico, anti-trombótico, vasodilatador,
anti-microbianos, analgésico bem como antioxidante (KUO, 1996; FOTSIS et al.,
1997; MAYDATA, 2002; KRIS-ETHERTON & KENN, 2002; GOTTI et al., 2006).
A quantidade dos metabólicos secundários podem variar no conteúdo, os
quais dependem de uma série de fatores como os aspectos genéticos, os
métodos e condições de cultivo, da idade da planta, época de colheita, tipo de
processamento, entre outros (DA CROCE, 2002; ESMELINDRO et al., 2002;
GNOATTO et al., 2007; RAMIREZ-SANCHEZ et al., 2010). Por exemplo, a maior
concentração dos alcalóides estão nas sementes in natura do cacau, sendo
maiores as concentrações de teobromina (cerca 1-2%) que cafeína (0,1%),
entretanto, estes valores são acrescidos após o processo fermentativo das
sementes do cacau (DUKE, 1983; WOLLGAST & ANKLAM, 2000). Já o teor de
epicatequina é diminuída cerca de 70%, e os flavanóis são diminuidos cerca de
90% após processamento das sementes do cacaueiro (WOLLGAST & ANKLAM,
2000; LUNA et al., 2002; EFRAIM et al., 2010).
Durante a etapa de fermentação torra e moagem das sementes ocorrem
alterações no conteúdo total de fenólicos do cacau. Uma das razões para a
diminuição, são as transformações bioquímicas de natureza enzimática. Durante
a fermentação ocorre a morte das células vegetais que perfazem a semente, com
isso, os compostos fenólicos entram em contato com enzimas, como a
polifenoloxidase e glicosidases, sofrendo reações de oxidação e complexação
com proteinas (WOLLGAST & ANKLAM, 2000; LUNA et al., 2002).
8
2.2 AS CASCAS DO T. cacao
Com o crescente desenvolvimento da sociedade e da economia, passou-se
a existir uma tendência de crescimento cada vez maior no consumo da fruta do
cacau in natura, bem como de seus produtos, tanto no mercado interno como na
exportação (LEAL, 2004). Nos últimos anos, as importações de amêndoa
cresceram 22,74%, Manteiga 14,54%, Pasta (líquor) 98,8% e produtos sólidos
12,7% (CEPLAC, 2011). No entanto a cada tonelada de semente seca obtida,
cerca de 7 a 10 toneladas de casca de cacau (peso fresco) é produzida, gerando
grande quantidade de casca do fruto que são separadas das sementes
(FIGUEIRA et al., 1993; KALVATCHEV et al., 1998; SODRÉ et al., 2012).
As cascas produzidas quase sempre permanecem no solo das plantações
em forma de “casqueiros” e são deixadas para apodrecimento no solo. Estas
muitas vezes produzem odores desagradáveis, impactos sobre a paisagem local,
poluição do curso de águas e favorece a proliferação de microrganismos,
podendo causar doenças nas plantas do próprio cacaueiro (MORORÓ, 2007;
CRUZ et al., 2012). Além de criar potenciais problemas ambientais, as cascas do
cacau descartadas como resíduos, representam um desperdício de matéria-prima
e energia (PELIZER et al., 2007). Embora, estes resíduos sejam de matéria
orgânica e materiais totalmente biodegradáveis, sua produção se dá em grandes
quantidades e de forma intensiva sendo, portanto, necessário um longo período
para que esses resíduos venham a ser reciclados de forma natural.
No Brasil, como em outros países, o aproveitamento das cascas do fruto do
cacaueiro vem crescendo, e experimentações têm sido realizadas com relativo
sucesso para o desenvolvimento e diversas aplicações em diferentes áreas:
• Como fonte de matéria prima de produtos industriais: Por apresentar
uma rica fonte de material lignocelulósico, as cascas tem sido testadas para a
produção do bioetanol e outros produtos biológicos como enzimas, através da
conversão microbiana (REDDY & YANG, 2005).
9
• Como fonte alimentar: esta aplicação tem gerado considerável interesse
em países economicamente avançados. Várias patentes existentes citam sua
utilização como um complemento para alimentos de seres humanos (KLEINERT,
1982; MANEZ & BARFUSS, 1998). Estas especulações são baseadas na
grande quantidade de fibras alimentares presentes nas cascas (ARLORIO et al.,
2005). Devido a isto, os produtos alimentícios enriquecidos com a casca do
cacau contribuem para a oferta de produtos comestíveis de alta flexibilidade,
como, por exemplo, os de característica nutracêutica (AZIZAH et al., 1999). A
pectina, uma fibra solúvel muito utilizada como geleificante, surfactante e
emulsionantes nas indústrias alimentares, foram obtidas das cascas de cacau
(VRIESMANN et al., 2011).
• Como fonte de alimentação dos animais: pode ser produzido pelo
primeiro corte das cascas frescas em pequenos flocos, que são parcialmente
submetidos a secagem, seguido de trituração e posterior granulação. Relatórios
indicam que pode incluir 20% destes flocos em ração para aves, para suínos de
30-50%, e para ovinos, caprinos e bovinos de leite até 50% (WOOD & LASS,
1985). No entanto, o uso de cascas, tem sido frequentemente limitado pelo
conteúdo de cafeína e a teobromina (em proporções que variam de 0,3 a 0,8%)
o qual pode gerar intoxicações em alguns animais (KALVATCHEV et al., 1998).
Nos animais monogástricos, é limitado pelo seu elevado teor de lignina,
polissacarídeos não-amidico - celulose, hemicelulose e pectina (AGYENTE-
BADU & ODDOYE, 2005).
• Como fertilizantes orgânicos: Análises químicas das cascas recém
colhidas e secas revelaram teores elevados de elementos que correspondem a
1,20 dag kg-1 de N; 1,10 dag kg-1 de P; 3,88 dag kg-1 de K; 0,52 dag kg-1 de Ca e
0,36 dag kg-1 de Mg (SANTANA & CABALA-ROSAND, 1982). Esses resultados
justificam o uso dos casqueiros do cacau nas práticas de adubação vegetal
(SANTANA & CABALA-ROSAND, 1982; OLADOKUN 1986; CHEPOTE, 1990;
ABIOLA, 1991). O potássio, um dos nutrientes essenciais para as plantas
superiores, é absorvido em quantidades maiores do que qualquer outro mineral
com exceção do nitrogênio (TISDALE & NELSON, 1975). Praticamente todo o
10
potássio encontrado nos fertilizantes comerciais são derivados a partir de
reservatórios de minerais. A compostagem de casqueiros de cacau foi utilizado
como uma fonte alternativa de fertilizantes e contribuiu concomitantemente para
inativação do inóculo do agente causal da podridão parda, o Phytophthora spp
(CHEPOTE et al., 1990).
• Como precursor na produção de carvão ativado: As cascas do T.
cacao tem sido sugeridas como fonte de biomassa capaz de evitar uma crise
energética em vários países, como a Indonésia, Gana e até no Brasil
(SYAMSIRO et al., 2012). São apontados como boa fonte energética para
substituir os combustíveis fósseis, para aquecimento e na geração de energia
elétrica ou como uma alternativa para reduzir o problema das emissões globais
de CO2 (AGYENTE-BADU & ODDOYE 2005; OLADAYO, 2010). O uso da
biomassa vegetal tem sido utilizado como fonte de energia, especialmente em
áreas rurais, sendo uma das mais antigas fontes de energia significativas, como
os resíduos de madeira, casca de arroz, bagaço de cana e outros (SYAMSIRO
et al., 2012).
• Como fonte de matéria prima caseira: em algumas localidades em
Gana e Nigéria, as cascas do fruto do cacaueiro são secas, queimadas e
utilizados como uma fonte de cloreto de potássio para a fabricação de sabão
local (TAIWO et al., 2001).
Assim, as cascas frescas ou secas do cacau podem ser usadas de maneira
que poderá reduzir custos e agregar valor ao manejo e manter o interesse dos
agricultores nessa atividade agrícola (SODRÉ et al., 2012). O aproveitamento das
cascas do T. cacao pode ser de grande utilidade nas diversas aplicações
biotecnológicas, além de ser uma alternativa ecologicamente recomendável em
razão da alta carga de matéria orgânica retirada do ambiente.
Entretanto, o aproveitamento dos resíduos produzidos pela agricultura do
cacau, ainda é considerado pequeno e não têm acompanhado o ritmo dos
inúmeros resíduos produzidos (ZENI & PENDRAK, 2006). Sendo interessante,
11
estudos que abordem mais metodologias de aproveitamento do T. cacao. A
biotransformação de resíduos lignocelulósicos vem abrindo caminhos para vários
setores, por exemplo, da produção de alimentos, energia e produção de enzimas,
buscando a utilização total dos recursos naturais existentes no mundo (VILLAS
BÔAS, 2001).
2.3 BIOTRANSFORMAÇÃO
A biotecnologia faz uso de sistemas celulares para o desenvolvimento de
processos e produtos úteis para a humanidade, sendo a biotransformação uma
importante ferramenta usada na conversões químicas catalisadas por enzimas de
células de origem animal, vegetal, microbiana, e/ou por enzimas purificadas (GIRI
et al., 2001). Na biotransformação, compostos orgânicos podem ser modificados
para um produto recuperável. Sendo esta, uma ferramenta eficaz para produzir
uma variedade de novos produtos ou para síntese de produtos já conhecidos,
mas de forma mais eficiente e de baixo custo (GIRI et al., 2001).
A biotransformação por microrganismos destaca-se por ser realizada por
organismos primitivos (mas de natureza bastante diferentes entre si),
estruturalmente simples, com curto período de geração e por apresentarem
grande diversidade de processos metabólicos (CONTI, 2001; FARNET &
ZAZOPOULOS, 2005). Ademais, possuem a capacidade de transformarem uma
gama de substratos em pouco tempo e com a versatilidade de produzirem
substâncias e compostos largamente utilizados na indústria. Entretanto, um
grande desafio no campo da biotransformação é encontrar a linhagem de
microorganismo apropriada.
Uma variedade de microrganismos, incluindo fungos e bactérias são
utilizados como organismos biotransformadores de produtos de valor econômico.
No entanto, os fungos filamentosos e as leveduras recebem destaque, devido a
capacidade de crescimento em ambientes variados, por exemplo, com baixo teor
de umidade. Mas, são os fungos filamentosos os mais descritos como potenciais
12
produtores de substâncias ou compostos bioativos (AGUILAR et al., 2007;
NIGAM, 2009).
Sob condições especiais, principalmente dependendo do suprimento de
nutrientes, os microrganismos podem produzir uma ampla variedade de
compostos complexos ou substâncias orgânicas (proteínas, antibióticos, álcoois,
enzimas, ácidos orgânicos, vitaminas, drogas, pigmentos e gorduras), durante a
fase de crescimento exponencial, em que as novas células são produzidas
(MEINHARDT & ESSER, 1993). Estes compostos ou substâncias orgânicas são
formados geralmente do metabolismo primário como o etanol, ou do metabolismo
secundário. Os compostos ou substâncias do metabolismo secundário podem ser
produzidos pela simples conversão de um metabólico primário ou também pode
ser originado de outros compostos, mas para isso é necessário uma quantidade
suficiente de metabólitos primários acumulados (NAJAFPOUR, 2007).
O processo de biotransformação depende da composição química do
substrato, o qual deve possuir elementos imprescindíveis (carbono, nitrogênio,
minerais, água) à síntese de material celular e para formação de produto, além de
serem economicamente viáveis. O uso de uma matéria orgânica de baixo custo,
que reuna todos os componentes essenciais (açúcares fermentáveis e
componentes complementares como nitrogênio e sais minerais) e que dispense a
adição de nutrientes suplementares para as reações metabólicas seria um
substrato ideal (DHILLON et al., 2012). A composição do substrato é muito
importante, pois influencia no tipo, custo, qualidade e quantidade de substâncias e
compostos produzidos (ELIBOL & MOREIRA, 2005; MUFFLER et al., 2011). A
utilização de resíduos agrícolas como substrato para processos de
biotransformação pode representar uma boa alternativa e de valor adicional para
proporcionar maior rentabilidade aos produtores rurais.
O valor nutricional das cascas do fruto do cacau varia com uma série de
fatores (cultivar do cacau, conservação das cascas e condição de maturação),
que apresenta 35% de celulose, 11% hemicelulose, 6% pectina, de proteínas
cerca de 9%, baixo teor de gordura (1%), 7,2% de resíduos minerais (cinzas), Ca
13
(0,3%) e P (0,15%), proporções menores de Fe, Mn e Zn, Cu e Se e 1,32% a
4,6% dos metabólitos principais os compostos fenólicos e metilxantinas
( AREGHEORE, 2002; CHUNG et al., 2003; ZHENG et al., 2004; LECUMBERRI
et al., 2007; VRIESMANN et al., 2011; SODRÉ et al., 2012). Quanto ao teor de
aminoácidos estão caracterizados os ácido glutâmico, aspártico e a metionina
(16,0%, 11,5%, 1,1% respectivamente do total de ácidos aminados) (CHUNG et
al., 2003). Além do mais, contém um alto teor de vitamina D2 (29.000 U.I./kg),
sendo esta superior ao de qualquer outro alimento de origem vegetal (COSTA,
2005).
A utilização destes resíduos nos processos de biotransformação, além de
fornecer uma boa matriz (substrato) para reduzir os custos de produção e
minimizar os impactos ambientais, está de acordo com a consciência crescente
de conservação de energia (SOCCOL & VANDENBERGHE, 2003; SOUZA et al.,
2004; DAROIT et al., 2007). Constituindo uma solução econômica e ambiental
interessante para os países com abundância destes materiais.
Várias pesquisas comprovam a viabilidade do uso de resíduos como
substrato em processo de biotransformação para a produção de diversos
compostos e substâncias, por exemplo:
Os ácidos orgânicos de diferentes classes, produzidos sob condições
otimizadas por uma estirpe de Lactobacillus delbrueckii sob substratos de casca
de mandioca, o qual produziu cerca de 249,1 mg de ácido láctico, com uma
eficiência de conversão de mais de 99% do açúcar total disponível (JOHN et al.,
2006). No entanto, a produção deste ácido na indústria química, tem como um
dos principais obstáculos o alto custo da matéria-prima (JOHN et al., 2006).
Sendo o uso de resíduos em bioprocessos uma alternativa para substituir os
materiais refinados e caros (ANURADHA et al., 1999). Cascas de romã ricas em
compostos fenólicos foram utilizadas como fontes de nutrientes para a produção
de ácido elágico por Aspergillus niger (ROBLEDO et al., 2008).
As enzimas para várias aplicações, como a exemplo da tanase muito
utilizada pela indústria de alimentos para eliminar os efeitos indesejáveis dos 14
taninos, são sintetizadas por fungos e bactérias (SABU et al., 2005; MAMMA et
al., 2008).
As substâncias com atividade antimicrobiana como o 6-pentil-α-pirona é um
potente bioativo contra diversos microrganismos foi produzida por Trichoderma
harzianum, utilizando o bagaço da cana como substrato em processos de
biotransformação (ADINARAYANA et al., 2003). Esta lactona tem grande
importância na indústria alimentícia por exalar um aroma característico de coco
( ELLAIAH et al., 2004).
Portanto, a biotransformação microbiana, é um dos procedimentos mais
usuais na obtenção de novos compostos bioativos com diferentes atividades
biológicas (CASTILLO et al., 2000).
2.4 ANTIMICROBIANOS
As substâncias de ações farmacológicas são derivadas a partir de fontes
naturais, plantas, animais e microrganismos, ou são desenvolvidos por síntese
química planejada a partir de produtos naturais (STROBEL et al., 2007).
Vários metabólitos secundários de microrganismos e plantas representam
uma fonte importante de substâncias biologicamente ativas (BAKER, et al., 2007;
TULP, 2007).
As substâncias ativas encontradas nas plantas são acumuladas em uma ou
várias partes dos seus tecidos, folhas, flores, bulbos, rizomas, cascas e outras
partes da planta (BENKEBLIA, 2004; LEE & LEE, 2010; YIM et al., 2010).
Estes compostos produzidos, geralmente são de baixo peso molecular e
com grande diversidade em termos de estrutura e de propriedades físico-químicas
e biológicas (WAKSMUNDZKA-HAJNOS et al., 2008). Das cascas de Taxus
brevifolia (Taxaceae), uma gimnosperma nativa do Hemisfério Norte, obteve-se, o
diterpeno taxol. O óleo volátil da casca do fruto e das folhas de Citrus limon é rico
em limoneno, b-pineno, g-terpineno, terpinoleno, neral e geranial (BISSET &
15
WICHTL, 2001). Dados farmacológicos indicaram que óleo volátil causou inibição
no crescimento de Candida albicans (EZZAT, 2001).
Os diferentes metabólitos produzidos pelos microrganismos costumam ser
produtos característicos de um grupo particular de organismo, são produtos,
muitos dos quais estão em uso clínico ou constituem em modelos para a síntese
de medicamentos. As substâncias derivadas do metabolismo microbiano,
sintetizados em condições bem definidas, com múltiplas etapas e muitas vezes a
partir de intermediários do metabolismo primário, vem sendo exploradas ao longo
dos anos (STROBEL et al., 2004). Como, por exemplo, a penicilina isolada do
fungo Penicillium chrysogenun, descoberta acidentalmente por Fleming em 1928,
que deu início aos estudo investigativos dos microrganismos, como uma das
fontes prolíficas de produtos naturais (STROBEL et al., 2004; TULP & BOHLIN,
2004; RAVAT et al., 2010). Atualmente, diversos antimicrobianos comercializados,
são produzidos em sua maior parte por fungos e bactérias.
Os antibacterianos mais utilizados são a cicloheximida, a eritromicina, a
neomicina, a estreptomicina, tetraciclina (gênero Streptomyces) e as gramicidinas
S, tirocidinas e bacitracinas, e lipopeptídeos como as iturinas, bacilomicinas,
fengicinas (do gênero Bacillus) (LISBOA, 2006). Enquanto, os antifúngicos
isolados, são as penicilinas G e V (Penicillium chrysogenum), cefalosporina C
(Acremonium chrysogenum), ácido fusídico (Acremonium fusidioides) aflatoxinas
(Aspergillus flavus) (KELLER et al., 2008).
Uma vez que os microrganismos produzem uma variedade de substâncias
com propriedades antimicrobianas, é esperado que novas metodologias possam
identificar substancias candidatas para o desenvolvimento de fármacos (GUO et
al., 2010). Embora existam, nos dias atuais, muitas metodologias disponíveis para
síntese de novos fármacos, os produtos metabólicos representam uma alternativa
de sucesso, historicamente privilegiada (BAKER et al., 2007). Os produtos ativos
microbianos são geralmente sintetizados durante processos de biotransformação,
ou então, derivam de síntese química a partir de substancias microbiana (SILVA et
al., 2004).
16
Entretanto, associada a descoberta de novas substâncias bioativas, é
imprescindível o conhecimento da toxicidade dessas substâncias para seres
humanos, com a finalidade de fornecer informações relativas aos efeitos tóxicos e
principalmente, para avaliar riscos que possam ser extrapolados ao homem.
2.5 GENOTOXICIDADE
A genotoxicidade ou toxicologia genética é uma especialidade que se ocupa
da identificação e estudo da ação de qualquer agente físico, químico ou biológico
que produz efeitos tóxicos e genotóxicos, sobre o material genético.
O uso de produtos naturais mostrou, ao longo dos anos, que determinadas
substâncias podem apresentar efeitos tóxicos e reações adversas. Pesquisas tem
mostrado que várias substâncias usadas para fins medicinais, para tratamento,
cura e prevenção de doenças podem ser potencialmente agressivas e, por esta
razão, devem ser utilizadas com cuidado, respeitando seus riscos toxicológicos
(CLARKE, 2007).
Os organismos vivos quando expostos a vários agentes (químicos, físicos
ou biológicos) podem sofrer modificações químicas tanto ao nível celular como
molecular (VILLELA et al., 2013). Qualquer modificação na estrutura química do
DNA pode alterar o metabolismo, tais como replicação, transcrição e
recombinação, além de afetar outros processos vitais muito importantes, como
regulação do ciclo celular e/ou divisão celular (FRIEDBERG et al., 1995).
Os efeitos dos genotóxicos podem ser avaliados por vários tipos de
ensaios genéticos, não somente para estimar os danos celulares, mas também
rastrear e analisar o modo de ação de diferentes agentes químicos tóxicos,
natural ou sintético, capazes de interagir com o material genético dos seres vivos,
inclusive o homem (BIANCHI, 2008).
Entre os testes mais usados estão os ensaios com mutantes de
Salmonella typhimurium (incapazes de crescerem na ausência de histidina),
teste muito utilizado nos métodos para detecção de mutações gênicas. No
entanto, a Salmonella é um organismo simples, e os resultados obtidos de
17
experimentos nem sempre se aplicará para as células eucarióticas. Por esta
razão, é necessário ensaios também com leveduras (Saccharomyces
cerevisiae), para se verificar uma amplitude maior de danos, incluindo as
mutações gênicas até danos cromossômicos e aneuploidias em eucariotos. Mas,
para analisar danos no DNA (quebras simples e duplas, e sítios alcalilábeis), um
ensaio com boa aceitação, empregando células de mamíferos é o ensaio
Cometa (WU & JONES, 2012). Estes testes têm um sistema de validação
internacional para avaliar, detectar, caracterizar e compreender os eventos
genéticos alterados por agentes genotóxicos (CHRISTOFOLETTI, 2008). Os
quais apresentam sensibilidade variada, gerando assim, resultados satisfatórios
para os diversos tipos de agentes testados, extratos, frações, produtos isolados
entre outros (SILVA et al., 2003).
>>Teste Salmonella/microssoma – ensaio de mutação gênica reversa
em Salmonella typhimurium
O ensaio Salmonella/microssoma, também conhecido como teste de Ames
é um bioensaio realizado in vitro com células procarióticas, utilizadas nas últimas
décadas, para avaliar a mutagenicidade de substâncias químicas puras ou
misturas complexas (HENRIQUES et al., 1987). Os testes são também realizados
acrescentando uma fonte exógena de metabolização visando imitar parcialmente
as condições metabólicas dos mamíferos (AMES, 1979).
Para realização dos testes se usa as linhagens de Salmonella typhimurium
que apresentam diferentes mutações em loci específico responsável pela
biossíntese do aminoácido histidina. Estas bactérias não possuem a capacidade
de crescer em meio de cultura sem histidina, portanto, não sintetizam esse
aminoácido, logo, se desenvolvem somente em meio acrescido do mesmo.
Entretanto, esses mutantes, após a exposição a um agente mutagênico, seu
fenótipo (his-) pode ser modificado, revertido (his+). A reversão é um indicativo
que existe alterações nos códons permitindo à célula bacteriana sintetizar o
aminoácido e multiplicar-se. A frequência de mutação reversa é facilmente
quantificada pela contagem do número de colônias (células revertentes) que
18
crescem em meio mínimo após aos bioensaios de uma população de células a
um agente mutagênico (MORTELMANS & ZEIGER, 2000).
Essas linhagens bacterianas foram desenvolvidas para detectar mutações
do tipo deslocamento do quadro de leitura (frameshift) ou para verificar a
substituição de pares de bases no DNA (base pair substitution) (MARON & AMES,
1983; MORTELMANS & ZEIGER, 2000). As linhagens TA98 e TA100 são as mais
utilizadas para estudos de triagem, pois ensaios com estas linhagens têm se
verificado resultados eficientes na detecção de vários tipos de mutágenos
(FERRAZ, 2011).
A linhagem TA100 é usada para detecção de agentes que possam induzir
metilação e causar substituição de pares de bases do DNA, através de uma
mutação no gene hisG46 que codifica a primeira enzima da biossíntese da
histidina. Sua construção é baseada em uma mutação de ponto, a partir de
alteração de base A-T por G-C, que codifica numa trinca específica prolina para
uma leucina, restaurando a produção da primeira enzima da biossíntese de
histidina que, consequentemente, leva a reversão ao caráter prototrófico (MARON
& AMES, 1983).
A linhagem TA98 detecta agentes mutagênicos que induzem alteração no
quadro de leitura do DNA, apresentando como ponto preferencial de lesão oito
resíduos repetitivos GC no operon do gene hisd3052 que codifica para a enzima
histidinol desidrogenase (catalizadora da reação final na biossíntese de histidina)
(MORTELMANS & ZEIGER, 2000). Os agentes mutagênicos geralmente atuam
nestas unidades repetitivas do DNA ocasionando uma restauração do quadro
correto da leitura envolvida na síntese da histidina. Nesta cepa, a reversão (his+)
ocorre pela deleção de um ou dois pares de bases desta sequência ou, pela
adição de um par (MARON & AMES, 1983).
Essas linhagens bacterianas foram desenvolvidas também com
características genéticas que lhes conferem maior sensibilidade e versatilidade na
detecção de diversos tipos de mutágenos. Tais como: mutação rfa que causa
perda parcial de polissacarídeos da parede bacteriana, aumentando a 19
permeabilidade da membrana e facilitando a entrada da substância teste pela
célula bacteriana; deleção uvrB responsável pelo sistema de reparação por
excisão de nucleotídeo (NER) evitando que a célula repare o dano induzido pelo
agente teste) e a presença do plasmídio pKM101 (marcadores de resistência a
antibióticos de forma seletiva evitando contaminação por outras bactérias)
(MARON & AMES, 1983).
Com a finalidade de tornar os testes com procariotos mais consistentes e
aplicáveis a mamíferos, os ensaios com bactérias tornaram-se dependentes de
um passo fundamental que é a mimetização do metabolismo de mamíferos, por
um sistema enzimático de indução microssomal (CLAXTON & WOODALL, 2007).
Nas células eucarióticas está presente o sistema enzimático citocromo P-450, o
qual catalisa a ativação de pró-mutágenos (substâncias que não têm ação direta
sobre o DNA), atua na defesa dos organismos, degrada substâncias químicas
inerentes ao metabolismo celular, mas nas bactérias este sistema está ausente.
Os pró-mutágenos após serem metabolizados no organismo, são
convertidos em compostos eletrofílicos (MORTELMANS & ZEIGER, 2000). Esta
transformação é um processo que inclui reação de oxi-redução e hidrólise, que
podem ativar algumas substâncias às moléculas eletrofílicas reativas capazes de
interagir com os sítios nucleofílicos do DNA provocando lesões, formando aductos
e outros (RABELLO-GAY et al., 1991). Para tal, requerem uma conversão
metabólica por ativação enzimática para tornarem-se geneticamente ativos. Como
estas enzimas encontram-se ausentes nas bactérias, torna-se necessária a
adição de uma mistura exógena para a ativação metabólica.
Esta conversão metabólica dos pró-mutágenos, pode ser detectável
adicionando-se a fração S9 mix - sistema de metabolização exógena, a qual induz
um conjunto de enzimas do sistema microssomal hepático (MARON & AMES,
1983). Este sistema é utilizado pela maioria dos laboratórios, podendo ser
adquirido comercialmente, preparado a partir fígados de ratos, pré tratado com
um indutor enzimático.
20
Assim, teste de Ames pode ser realizado com linhagens bacterianas
sensíveis a diferentes agentes, em presença e ausência de ativação metabólica,
com objetivo de identificar substâncias com ação direta ou indireta sobre o DNA,
acompanhar a atividade positiva ou negativa dos metabólitos gerados pela
biotransformação (KU et al., 2007).
>>Teste de mutagênese e recombinogênese em Saccharomyces
cerevisae
Os danos genéticos podem ser avaliados utilizando bioensaios com
organismos haplóides e diplóides e em todos os estágios do ciclo celular como
G1, síntese de DNA, mitose e meiose. Para avaliação de toxicidade genética,
experimentos de mutações reversas, recombinação mitótica e conversão gênica
mitótica são os mais comumente utilizados. E o fungo S. cerevisiae têm sido de
grande utilidade na avaliação de danos por mutagênicos ambientais ou
farmacológicos, além de ser importante na complementação dos ensaios
realizados em bactérias para detectar mutagênicos (POLI et al., 1999; MATUO et
al., 2012).
Os ensaios utilizando S. cerevisiae são rápidos, economicamente viáveis e
reprodutíveis. Além disso, as leveduras possuem também uma vantagem sobre
os ensaios bacterianos, que é presença de um sistema endógeno de ativação
metabólica (complexo enzimático citocromo P-450 e detoxificação), capaz de
ativar vários pré-mutagênicos sem necessidade de adição de ativador exógeno
para os experimentos (POLI et al., 1999; TOUSSAINT & CONCONI, 2006;
TOUSSAINT et al., 2006; KNIGHT et al., 2007).
Os ensaios de mutação reversa utilizam os processos de reversão de
auxotrofia (microrganismos mutante que necessitam de fatores de crescimento)
para prototrofia (microrganismos que não precisam de fatores de crescimento),
produzidas por uma substituição, inserção, deleção de pares de bases ou por
uma indução de um supressor do gene original (HENRIQUES et al., 1987;
PUNGARTNIK et al., 1999; GASPARRI, 2005; PINHATTI, 2009).
21
Estes processos ocorrem para uma compensação ou restauração de um
erro gênico envolvido no requerimento nutricional (ZIMMERMANN 1975; BOEIRA
et al., 2002; GASPARRI, 2005). A restauração da mutação pode ser uma reversão
exata do defeito original ou uma compensação causada por dois eventos: (I) por
uma segunda mutação dentro do gene (mutação supressora interna); (II) ou uma
mutação externa, nos alelos sem sentido (nonsense - resultante da troca de um
códon, que codifica um determinado aminoácido, para um outro códon de
terminação da síntese proteica) (ATKIN et al., 1993; GASPARRI, 2005).
Para identificação de mutação reversa, geralmente se utiliza leveduras com
alterações genéticas, para uma ou mais deficiências nutricionais, como, por
exemplo, a linhagem haplóide XV185-14c isolada por Von Borstel (ZIMMERMANN
et al., 1984; HENRIQUES et al., 1997; ROSA et al., 2004). Esta linhagem permite
a detecção por dois tipos de mutações locus específicas: (I) reversões do alelo
ocre lys1-1(alteração para o códon UAA de término de cadeia), ou do alelo
“missense” his1-7(códon alterado codifica um aminoácido diferente) e (II) ou
reversões por deslocamento de quadro de leitura do DNA “frameshift” verificadas
no locus hom3-10 (ZIMMERMANN et al., 1984; HENRIQUES et al., 1997; ROSA
et al., 2004).
A análise das células revertentes, se dá pela contagem das leveduras
semeadas em placas contendo meio seletivo, no qual o fator de crescimento
indispensável para o metabolismo não se encontra presente, ou está em
concentrações muito pequenas, permitindo um “background” de crescimento
(GASPARRI, 2005).
O potencial mutagênico de agentes químicos e físicos podem ser
verificados através da recombinação mitótica, um dos mecanismos usados
pelas células para reparação dos danos no DNA. Ao surgir uma alteração no
DNA, esse pode permanecer irreparável, causando a morte celular, ou pode ser
reparado pelo processo de recombinação. Algumas substâncias carcinogênicas,
podem apresentar resultados negativos em testes que detectam mutagênese,
mas podem induzir a recombinação (SILVA et al., 2003; DEGRANDI, 2009). Esse
22
fenômeno acontece normalmente em células diplóides e caracteriza-se pela troca
de fragmentos do DNA entre cromátides irmãs ou cromossomos homólogos. A
recombinação pode acontecer por uma troca recíproca (crossing over) e não
recíproca (conversão gênica).
O crossing over, ou permuta, é o produto da troca recíproca de segmentos
de DNA entre dois cromossomos homólogos, onde os alelos recessivo e
selvagem estão posicionado em cromossomos diferentes. As células portadoras
dos alelos em homozigose seriam capazes de restaurar o genótipo original
(ZIMMERMANN, 1975; KUPIEC, 2000).
As linhagens diplóides heterozigotas de S. cerevisiae são sempre usadas
neste tipo de bioensaio, devido a mesma possuir um genótipo, com um par de
marcadores recessivos, distantes entre si, mas localizados no mesmo braço
cromossômico em diferentes homólogos e defronte aos alelos dominantes
correspondentes (VIAU, 2006).
A conversão gênica mitótica pode resultar da troca não recíproca de
informações genéticas entre dois cromossomos homólogos podendo ocorrer
também entre cromátides irmãs e uma duplicação intracromátide (PETES et al.,
1991).
Para visualizar a conversão gênica mitótica pode se usar linhagem de
levedura diplóide heterozigota com dois alelos inativos diferentes no mesmo locus
gênico. A efetivação desses alelos levam as células crescerem em meio que
contenha suplementos nutricionais específicos. A não ser que, um fenótipo do tipo
selvagem muito ativo seja produzido a partir de alelos inativos através da
recombinação intragênica (ZIMMERMANN, 1975; PETES et al., 1991; KUPIEC,
2000).
Neste sentido, a XS2316 é uma linhagem heterozigota para o lócus CYH2
(+/cyh) e heteroalélica para LEU1 (leu1-1/leu1-12), as quais são passíveis de
verificar a recombinação (crossing over) e conversão gênica, respectivamente.
23
>>Teste cometa
O ensaio Cometa, também conhecido como eletroforese de célula única
em gel, é amplamente empregado como um indicativo de danos mutagênicos em
células eucarióticas. Podem ser realizado em diversos tipos celulares, incluindo
fungos, vegetais e células animais in vitro e in vivo (ROSA et al., 2007;
CAVALCANTI et al., 2008). Por meio deste teste é feito uma avaliação de danos
como, a quebras simples e duplas na fita de DNA, eventos de reparo por excisão
incompletos, sítios álcali-lábeis, danos oxidativos ao DNA, ligações cruzadas
entre moléculas: DNA/DNA, DNA/proteínas e DNA/droga (TICE et al., 2000;
BOLOGNESI et al., 2004).
O princípio deste ensaio leva em consideração o comportamento do DNA
em células individualizadas, bem como, sua organização no núcleo celular. Para a
realização do ensaio, as células devem ser inseridas em um gel de agarose,
disposta em fina camada sobre uma lâmina histológica (PINHATTI, 2009). Através
de uma solução de lise em pH alcalino, suas membranas são rompidas. Os
componentes citoplasmáticos e proteínas nucleares precipitam com uso de
soluções salinas. Dessa maneira, resta na lâmina apenas o nucleóide (parte de
DNA do núcleo) que permanece íntegro, para realização da eletroforese.
As células presentes na lâmina, ao serem submetidas ao campo elétrico, o
comportamento de migração do DNA do nucleóide pelo gel. Fragmentos
pequenos migram em direção ao ânodo com uma velocidade maior que a matriz
nuclear. Após a migração do DNA danificado, este assume um aspecto
semelhante ao de um cometa (a cabeça representa o arcabouço de DNA intacto e
a cauda, os fragmentos provenientes da quantidade de dano ocorrido (TICE, et
al., 2000; LEE & STEINERT, 2003; COLLINS, 2004; BURLINSON et al., 2007).
A visualização dos cometas pode ser obtida em microscópio óptico quando
as células forem submetidas a nitrato de prata ou em microscópio de
fluorescência, se as células foram coradas com brometo de etídeo, laranja de
acridina ou DAPI (DEGRANDI, 2009).
24
Os resultados podem ser obtidos pela análise dos danos de acordo com o
tamanho da cauda em relação a cabeça (núcleo), permitindo avaliar o potencial
genotóxico das amostras.
25
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Identificar possíveis aplicações biotecnológicas do extrato da casca do fruto
do T. cacao fermentado e atestar a seguridade de uso deste extrato para
humanos e o meio ambiente.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Obter um extrato da casca do fruto do T. cacao fermentado;
2. Realizar o fracionamento químico do extrato da casca fruto do T. cacao
fermentado utilizando solventes em uma escala crescente de polaridade;
3. Avaliar o potencial bactericida das frações do extrato da casca do fruto
do T. cacao2 fermentado em bactérias patogênicas;
4. Avaliar o potencial anti-fúngico das frações e do extrato da casca do
fruto T.cacao fermentado contra o fungo M. perniciosa e S. cerevisiae;
5. Determinar o possível mecanismo de ação do extrato da casca do fruto
do T. cacao fermentado em levedura S. cerevisiae
6. Determinar a seguridade de uso do extrato da casca do fruto do T. cacao
fermentado para humanos e o meio ambiente através da avaliação de ensaios
genotóxicos em bactéria, levedura e células de mamíferos.
26
4. CAPÍTULO I
Patente: PRIVILÉGIO DE INOVAÇÃO - EXTRATO DA CASCA DO FRUTO DO CACAUEIRO: OBTENÇÃO E USO AGRÍCOLA
1. Título da Invenção: Extrato da casca do fruto do cacaueiro: obtenção e uso agrícola
2. Área de Pesquisa: Ciências Agrárias3. Número do registro: BR11201201718104. Data de depósito: 12/07/20125. Instituição financiadora: Universidade Estadual de Santa Cruz6. Pesquisador Responsável: Dr. George Andrade Sodré7. Nome(s) do(s) Inventor (es):
Inventor Unidade Laboratório
Dr. George Andrade Sodré Senup/DCAA Fitotecnia e Solos
Dr. Paulo César Lima Marrocos Senup/DFCH Fitotecnia e Solos
Dr. José Olimpio Souza Junior DCAA Fitotecnia e Solos
Dr. Martin Brendel DCB Biologia de Fungos
Dra. Cristina Pungartnik DCB Biologia de Fungos
Dr. Raul René Valle Sefis Fisiologia Vegetal
Msc Regineide Xavier Santos PPGGBM Biologia de Fungos
8. RESUMO DO INVENTO A SER DEPOSITADO
1. Introdução:
Os resíduos agrícolas são classificados de acordo com os perigos que
podem causar pelo descarte no ambiente e também pela potencialidade de uso
na agricultura. Na cultura de cacaueiro o resíduo gerado em maior quantidade é a
casca do fruto. Atualmente, a casca é separada permanecendo no solo das
plantações logo após a extração das sementes. Dentre as potencialidades de
aproveitamento de casca do fruto do cacaueiro, destacam-se o uso na
28
alimentação animal, pectinas e produção de fertilizantes orgânicos (ABIOLA 1988;
CHEPOTE et al., 1990; BARAZARTE et al., 2008).
Em análise química do extrato da casca de frutos de cacaueiros, Sodré et
al (2007), verificaram que a quantidade de potássio (K) foi superior aos demais
nutrientes e representou 73% do total de nutrientes na fração mineral. A
preocupação com a qualidade biológica do extrato da casca de frutos de
cacaueiros e efeitos sobre animais e plantas, levou a ensaios preliminares para
avaliar a atividade anti-microbiana do extrato, os quais se mostraram
extremamente promissores. Nesse contexto, existem diferentes técnicas como
ensaios mutagênicos e genotóxicos utilizados para elucidar o possível potencial
biotecnológico de compostos extraídos de plantas (WILLIAMS 2004; ROSA 2006).
Considerando-se que a região sul do estado da Bahia configura-se como a
maior fronteira nordestina de mata atlântica conservada e onde se cultivam mais
de 400.000 ha com cacaueiros, e, sabendo-se que os empresários do setor
cacaueiro estão preocupados com as questões econômicas e impactos
ambientais dessa atividade, uma forma de despertar ainda mais o interesse dos
cacauicultores por essa atividade é mostrar o valor econômico dos resíduos
desperdiçados, que podem ser utilizados para a produção de fertilizantes, como
para produtos de natureza bioquímica.
Dessa maneira, o trabalho objetivou determinar as características físico-
químicas do extrato obtido da casca de frutos do cacaueiro, viabilizando o uso do
extrato como biofertilizante, caracterizando a atividade biológica (anti-bacteriana e
anti-fúngica) quanto ao seu possível potencial biotecnológico e avaliando a
toxicidade ou genotoxicidade do biofertilizante, visando obter a recomendação de
dose de extrato como biofertilizante a ser aplicada em substituição a adubos
comerciais na produção de mudas de cacaueiros.
Por fim, objetivou-se avaliar o potencial para a produção de patente do
produto tecnológico e determinar se o biofertilizante é seguro para o uso por seres
humanos. Para isso, buscou-se alcançar as seguintes metas: aplicação de doses
do extrato em experimento com 250 mudas de cacaueiro; avaliação do
crescimento das mudas em resposta às doses de extrato aplicadas; obtenção da
dose que permite o maior crescimento econômico das mudas; determinação dos
itens necessários para incluir em processo de patente do produto tecnológico
29
sobre a atividade anti-fúngica e anti-bacteriana e avaliação do potencial para
produção de patente de processo ou produto tecnológico.
2. Metodologia:
Foram realizadas quatro ações de pesquisa: compostagem, obtenção e
caracterização química do extrato; ensaios de validação de uso do extrato como
biofertilizante; avaliação da atividade biológica e genotóxica do extrato.
Em seguida, realizou-se três experimentos para observar a atividade anti-
bacteriana, três experimentos para a observar a atividade anti-fúngica, três
experimentos (ensaios) com Salmonella/microssomo e três experimentos do
ensaio com Saccharomyces cerevisiae. Após o término dos referidos
experimentos, produziu-se um dossiê reunindo as informações sobre a atividade
anti-fúngica, anti-bacteriana do bioproduto determinado e estudo de
genotoxidade. Esses experimentos foram realizados na Universidade Estadual de
Santa Cruz (Uesc).
2.1Compostagem, obtenção e caracterização química do extrato:
As atividades foram realizadas utilizando-se a infra-estrutura do Centro de
Pesquisa do Cacau (Cepec), pertencente à Comissão Executiva do Plano da
Lavoura Cacaueira (Ceplac), Ilhéus-BA. Inicialmente, preparou-se 2 t (duas
toneladas) de composto da casca do fruto de cacaueiro. Esses frutos foram
colhidos em áreas experimentais, quebrados, separados das sementes e
retirados da área.
Durante a preparação do composto, a casca foi picada em pedaços
retangulares de 1,5 a 2,5 cm de largura e dispostas em pilhas sob lona de
polietileno. As pilhas foram preparadas em camadas de 15 cm de altura e
umedecidas vagarosamente. As dimensões da pilha foram 2,5 m de comprimento,
1,5 m de largura e 1,0 m de altura. O composto foi revolvido a cada 15 dias até o
momento em que não mais se verificou o aquecimento da massa.
Para retirar o extrato da casca do fruto, coletou-se por cada extração 30
litros de composto. Em seguida, colocado sobre uma peneira de 4 mm de malha,
adicionou-se lentamente cinco litros de água destilada. Sob a peneira colocou-se
30
uma calha de coleta. O extrato obtido foi seco em temperatura ambiente durante
setenta e duas horas utilizando bandejas de alumínio e, em seguida, moído e
passado em peneira de 1,5 mm, obtendo-se uma produção de 200 kg (duzentos
quilogramas) de extrato de casca do fruto de cacaueiro.
Em amostras do extrato, determinou-se o teor de carbono total pelo método
da ignição e o teor de nitrogênio, pelo método Kjeldahl, (JAKSON, 1958). Para
análise de fósforo, potássio, cálcio, magnésio, cobre, ferro, manganês e zinco as
amostras sofreram digestão nitroperclórica. O fósforo foi dosado
colorimetricamente, o potássio por fotometria de chama e os demais nutrientes
por espectrofotometria de absorção atômica. A condutividade elétrica foi
determinada em solução do extrato diluído em água destilada.
Os ácidos fenólicos foram extraídos de 5g (cinco gramas) de extrato da
casca do fruto do cacaueiro pelo refluxo das amostras durante duas horas, em 50
mL (mililitros) de metanol contendo HCl (ácido clorídrico) a 0,1%. Após filtração,
as amostras foram secas em um evaporador rotativo a vácuo e o resíduo
suspenso em HCl 1M (um molar), refluxado por uma hora, resfriado e filtrado. O
filtrado hidrolisado foi centrifugado e o sobrenadante submetido à extração com
acetato de etila (3x20mL). O extrato foi misturado com NaHCO3 (bicarbonato de
sódio) a 5% (3x20mL), submetido a acidificação com HCl até atingir o pH 3,5, e
extraído com acetato de etila (2x25mL). A umidade residual foi removida do
extrato de acetato de etila com Na2SO4 (sulfato de sódio). Logo após, o extrato
resultante foi seco à vácuo e obteve-se a fração fenólica. Posteriormente,
adicionou-se ao extrato ácido 5 mL de HCl + CH3OH (metanol), que foi refluxado
por trinta minutos para esterificação. A determinação dos ácidos fenólicos foi feita
por cromatografia líquida gasosa em uma coluna de vidro empacotada com 3% de
SE-30 ou OV-17 sobre Chromosorb W de 100-120 mesh.
Para a extração das procianidinas, taninos comumente encontrados no
cacaueiro, amostras de extrato foram macerados em almofariz de porcelana com
metanol 80% (40 mL/g de tecido). O homogenato foi resfriado a 4 °C e
centrifugado a 3000xg por dez minutos, e o metanol removido a vácuo com 30 °C.
O extrato foi reconstituído com 4mL/g de solução tampão de MES/KOH 10 mM pH
6, e submetido a uma nova centrifugação. O sobrenadante foi filtrado, esterilizado
e armazenado a -20 °C até sua determinação (EVANS & BASTOS, 1979). As
31
análises também foram feitas por CLAE, de acordo com o método descrito por
Escribano-Bailón et al (1992).
A determinação do conteúdo de lignina foi realizada pelo método da
percentagem de fibra em detergente ácido (ADF), mediante hidrólise da celulose
em ácido sulfúrico a 72% (ROWLAND & ROBERTS, 1994). De acordo com a
metodologia, 0,5 a 1,0 g de extrato da casca de fruto de cacaueiro seco ao ar
(W1) sofreu imersão em 100 mL de uma solução de cetil trimetil amônio brometo
(CTBA) contendo algumas gotas de etanol. A mistura contida em um frasco foi
fervida em banho-maria por uma hora. Posteriormente, a solução foi filtrada sobre
sucção suave à quente em almofariz filtrante N° 2, previamente calcinado a 550
°C por duas horas. O resíduo foi lavado por três vezes com alíquotas de 50 mL de
água deionizada fervente e, em seguida, com acetona até a remoção de toda
coloração da amostra.
O almofariz com a fibra resultante foi aquecido a 105 °C por duas horas e,
então, tratado com H2SO4 (ácido sulfúrico) a 72%, previamente resfriado a 15 °C
até formar uma massa uniforme. Uma nova porção de H2SO4 a 72% foi
adicionada e o material filtrado a vácuo, foi lavado com água quente e, em
seguida, com acetona. Após secagem por 2 horas o material foi resfriado em
dessecador e pesado (W2). Finalmente, o almofariz foi calcinado a 550 °C por
duas horas e, posteriormente, resfriado em dessecador e pesado (W3). O
percentual de lignina foi obtido pela seguinte equação:
% Lignina = (W2 − W3) 100 / W1
2.2Ensaio de validação do uso do extrato como biofertilizante:
O experimento foi instalado em casa de vegetação do Centro de Pesquisas
do Cacau (Cepec), em vasos contendo substrato formado da mistura de serragem
e areia na proporção volumétrica 2:1. O substrato escolhido foi testado e
recomendado por Sodré (2007) para mudas de cacaueiro. Para a produção das
mudas foram utilizadas mini estacas de ramos plagiotrópicos, do clone Trinidad
Select Hybrid (TSH 1188). A unidade experimental foi constituída por seis plantas,
dispostas em delineamento de blocos ao acaso, com seis tratamentos (doses) e
32
cinco repetições. Os tratamentos foram constituídos por cinco doses de extrato 2,
4, 6, 8, e 10 g dm-3, misturados ao substrato e um tratamento testemunha
formado pela dose de 2 g dm-3 do fertilizante de liberação lenta (3-5 meses)
Osmocote® (22% N - 4 %P2O5 - 8% K2O) e 1,0 g.dm-3 do fertilizante solúvel PG
Mix 14% N -18% P2O5 - 18% K2O + micronutrientes. As aplicações do extrato e
dos fertilizantes foram realizadas de acordo com Marrocos & Sodré (2004).
As miniestacas foram retiradas da ponta dos ramos das plantas matrizes
com comprimento de seis centímetros. A base da miniestaca foi cortada
transversalmente dois milímetros abaixo de uma gema foliar e, em seguida, a
primeira folha da base para o ápice foi reduzida à metade, e as demais em 20%
do tamanho original de acordo com Sodré (2007). Para o enraizamento foram
utilizados tubetes de 288 cm3, as miniestacas foram inicialmente tratadas na base
com ácido indol-butírico (AIB) misturado em talco 6000 mg.kg-1 e em seguida,
inseridas a 1,5 cm de profundidade e conduzidas a câmara de nebulização. Para
manter a atmosfera saturada a 100% de umidade relativa na superfície da folha,
as miniestacas foram submetidas à nebulização por quinze segundos a cada
cinco minutos, entre às seis e dezoito horas, e quinze segundos a cada hora, das
dezoito às seis horas do dia seguinte.
Quando da verificação da presença de raízes primárias e do início das
primeiras brotações, as miniestacas foram retiradas da câmara de nebulização e
transferidas para crescimento em casa de vegetação, em sacos de polietileno de
840 cm3, preenchidos com o mesmo substrato, onde foram aplicados os
tratamentos. Durante o crescimento, as mudas receberam diariamente irrigações
por micro-aspersão com duração de três minutos a cada três horas.
Após seis meses de permanência das mudas em casa de vegetação,
avaliou-se a altura da planta (AP), diâmetro do caule (DC), massa seca da parte
aérea (MSPA) e das raízes (MSR), número de folhas (NF) e área foliar (AF).
Medições de trocas gasosas foram feitas em folhas maduras do terço superior
das mudas, utilizando um sistema portátil de fotossíntese Li-6400. Os dados
obtidos foram submetidos à análise de variância, usando-se o programa SAS®
(SAS, 1989) e os efeitos de tratamentos avaliados por equações de regressão
ajustadas entre as variáveis avaliadas e as doses de extrato. As equações de
33
regressão foram selecionadas em função da significância dos coeficientes da
regressão e do maior coeficiente de determinação.
2.3. Preparo do extrato de casca do fruto de cacaueiro para os testes
biológicos, genotóxico, fitoquímicos e fracionamento
O extrato bruto foi preparado no Centro de Pesquisa do Cacau (Cepec),
como anteriormente descrito por Sodré (2010). O extrato bruto seco foi triturado
(2,015g) com movimentos espiralados em almofariz de porcelana até reduzir o
extrato a pó. Após trituração foi adicionado 10 ml de água destilada e realizada a
filtração em papel filtro, repetiu o procedimento por 3 vezes. O resíduo
posteriormente, foi sonicado com 10 pulsos de 40 segundos em amplitude de
60%, adicionado 5mL de água destilada e filtrado como descrito anteriormente.
Após filtração, o extrato foi congelado e concentrou-se por liofilização durante 4
dias, a fim de obter o cacao pod extract [CHE] (1,4700g, rendimento: 72,95% w/
w).
2.4. Fracionamento de CHE
O fracionamento de CHE (100 mg) foi realizada por partição por hidrólise e
em coluna aberta. PARTIÇÃO: com clorofórmio (3 x 30 mL) (CHE1), acetato de
etila (3 x 30 mL) (CHE2), n-butanol (3 x 30 mL) (CHE3), e a fração restante com
água destilada (CHE4). Extrações por HIDRÓLISE foi usado 100 mg de extrato
bruto (CHE) dissolvido em ácido sulfúrico 1N (5 mL). A mistura foi submetida a
refluxo durante 30 min, filtrou-se e alcalinizou-se até pH 10 rendendo CHE5. Este
CHE5 foi submetido a partição solvente por extracção com clorofórmio / metanol
(3:1 v / v), obtendo-se CHE6 ou clorofórmio (3 x 30 mL) originando CHE7.
COLUNA ABERTA: 1,5 g de CHE foi cromatografado em coluna aberta de gel de
sílica 60RP-18 (40-63 um Fluka Analytical), na razão de 1:50 (extracto: sílica).
Misturas de metanol e água de 0% a 100% foram utilizados como eluente.
Quarenta e cinco fracções foram obtidos, que foram agrupados de acordo com o
seu perfil cromatográfico em cromatografia em camada fina usando n-butanol:
ácido acético: água - BAW (4:1:1) como eluente e visualizados sob luz UV (254 e
365 nm, portátil lâmpada UV Modelo 9403E, BioAmerica Inc., EUA), resultando
em cinco frações (CHE8, CHE9, CHE10, CHE11 e CHE12). As frações foram
34
secas em um evaporador rotativo e armazenado a -20 °C até que os testes
biológicos.
2.4.1. Análises fitoquímica de CHE
A análise fitoquímica para as classes de componentes bioativos foi
realizada usando 10 mg/ml de CHE solubilizado com água destilada. As classes
dos constituintes de bioativos rastreados foram: Compostos fenolicos (Cloreto
ferrico), alcalóides (Mayer, Wagner), saponinas (utilizando o teste de espuma),
glicosídeos cardíacos (Baljet) esteroides, terpenoides e derivados antracênicos
livres (Börntraeger) realizados de acordo com Harbone (1998). Reagentes
específicos de reconhecimento de glicosídeos cardiotônicos (Salkowski, Kedde,
Baljet, Keller-Killiani e Liebermann Burchard), cumarinas voláteis, flavonóides,
taninos (acetato de chumbo e cloreto de ferro III) saponinas, triterpenos
(Liebermann-Burchard e Salkowski) e derivados antracênicos livres (Börntraeger)
foram testados. Para cromatografia em camada fina (TLC) foram utilizados
sistemas e reveladores segundo descrição metodológica descrita de Harborne
(1984) e Wagner e Bladt (1996) para avaliação das frações. Cada um dos testes
foi qualitativamente expresso como negativo (-) ou positivo (+).
2.5. Avaliação de atividade biológica de CHE
Foram realizados ensaios com testes padrões utilizando-se o extrato da
casca do fruto do cacaueiro para as seguintes análises:
‣Atividade anti-bacteriana – Sete cepas bacterianas foram escolhidas para
o ensaio de bioatividade: a) gram-positivo Staphylococcus aureus, St. epidermidis,
e Bacillus subtilis, b) gram-negativas Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella choleraesuis e Klebsiella pneumoniae;
‣Atividade anti-fúngica - realização de teste de inibição de crescimento
contra M. perniciosa (FILHO et al., 2006) e S. cerevisiae (PUNGARTNIK et al.,
2002; PICADA et al., 2003) através de ensaios microbiológicos e in vitro,
disponíveis no Laboratório de Biologia de Fungos da UESC.
2.6. Avaliação da genotoxicidade de CHE:
‣Ensaio de mutagenicidade Salmonella/microsome
35
Este teste teve por objetivo avaliar a habilidade de um determinado produto
em induzir mutações reversas nas diferentes linhagens da bactéria Salmonella
typhimurium. O Teste de Ames/Salmonella pode ser realizado em cinco linhagens
diferentes de S. typhimurium, onde cada uma serve para detectar um determinado
tipo de mutação provocada pelo produto em teste.
Em ensaio clássico, a metodologia utilizada para determinar a atividade
mutagênica das amostras foi o teste Salmonella/microssoma no procedimento de
pré-incubação (Maron & Ames, 1983). Foram utilizadas pelo menos 2 linhagens
de Salmonella typhimurium geneticamente modificadas, escolhidas na primeira
etapa do trabalho de acordo com a sensibilidade observada. Preferencialmente
foram utilizadas as linhagens TA 98 e TA 100 que detectam mutagênicos que
causam erro no quadro de leitura e substituição de pares de bases,
respectivamente (MARON & AMES, 1983).
Todas as linhagens foram testadas em presença e ausência de fração de
metabolização hepática (S9). Nos ensaios foram adicionados controles negativos
(200µl de meio nutriente líquido e o solvente utilizado no ensaio), positivos, de
acordo com a cepa e tratamento utilizado, e cinco dosagens do extrato a testar.
Quanto a determinação da atividade citotóxica, a amostra e a cultura
bacteriana foram incubadas a 37°C por quarenta e oito horas. De acordo com a
metodologia utilizada, obteve-se o resultado em colônias sobreviventes por placa.
O percentual de sobrevivência foi calculado pela razão entre o número de
colônias sobreviventes, frente à amostra estudada, e o número observado no
controle negativo, multiplicado por 100.
As curvas dose-resposta obtidas nos diferentes ensaios foram analisadas
estatísticamente pelo programa Salanal (Salmonella Assay Analysis) versão 1.0
do Research Triangle Institute, RTP, Carolina do Norte, EUA. Tal programa
permite avaliar o efeito das avaliações, selecionando os modelos linear e
Bernstein.
‣Genotoxicidade em levedura Sacchoromyeces cerevisiae
Este ensaio tem por objetivo detectar a mutação gênica em células
eucarióticas de S.cerevisiae e a conversão gênica e recombinação mitótica, para
36
avaliar a habilidade de um determinado produto induzir mutações reversas,
mutações para frente (forward mutation), defasagem no quadro de leitura
(frameshift mutation) e ambos os tipos de recombinação mitótica (conversão
gênica e crossing-over) em microrganismos eucarióticos.
Utilizou-se a linhagem haplóide XV185-14c, a mais usada
internacionalmente, que detecta mutações dos tipos reversão, mutação para
frente e defasagem no quadro de leitura; e a linhagem diplóide XS2316, que é
empregada para detectar crossing-over e conversão gênica mitótica. A cultura
celular foi obtida de colônias isoladas retiradas da placa máster, colocadas para
crescer em meio líquido YEL, contendo 1% de extrato de levedura, 2% de
bactopeptona e 2% de glicose em frasco Erlenmeyer de 30ml no ‘shaker’, por um
período de aproximadamente quarenta e oito horas a 30 °C.
Foram utilizados os seguintes meios de cultura: Meio sintético (SC)
suplementado (1- SC-histidina, 2- SC-lisina, 3- SC-homoserina), estes últimos
com ausência de aminoácidos específicos. As células foram ressuspendidas e
diluídas em solução salina (NaCl 0,9%), contadas em câmera de Neubauer no
microscópio óptico, e o resultado foi utilizado para calcular a concentração celular
(fase exponencial ou como fase estacionária / também os brotos). Para a
sobrevivência, incubou-se as colônias em meio rico YEPD (1% de extrato de
levedura, 2% de bactopeptona, 2% de glicose e 2% ágar) por 3-5 dias em estufa a
30°C, após contagem do número de colônias/revertentes. Todos estes
experimentos foram feitos em triplicata para cada dose testada.
Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando o Teste
ANOVA--Tukey’s, considerando estatisticamente significativo * P < 0,05 e** P <
0,01, nos diferentes tratamentos e doses.
‣Teste Cometa
Para os testes Cometa (Padrão e Modificado) foram realizados em células
de fibroblastos de pulmão de Chinese Hamster V79 (eucariontes). O Ensaio
Cometa (EC), “Single Cell Gel Electrophoresis”, é uma técnica rápida e eficiente
quando usada para quantificar as lesões e detectar os efeitos do reparo no DNA
em células individualizadas de mamíferos. As células de fibroblastos (V79) tratado
com o extrato foi misturado com agarose de baixo ponto de fusão e
37
imediatamente disperso em lâmina de microscopia recoberta com agarose
comum. A seguir, as lâminas foram incubadas em solução de lise gelada durante
24 horas a 4ºC, ao abrigo da luz. Em sequência, as lâminas foram colocadas em
uma cuba de eletroforese horizontal e cobertas pelo tampão de eletroforese por
20 minutos a 4ºC. A eletroforese foi realizada durante 20 minutos a 4ºC a 25V
(0,9V/cm) e 300mA. Todos os passos foram realizados em luz amarela ou
vermelha, para prevenir danos adicionais ao DNA. A seguir, as lâminas foram
neutralizadas, lavadas e coradas. Após coloração, as lâminas foram analisadas
por contagem no microscópio onde foram avaliados, a quantidade de DNA na
cauda do cometa quantificado.
3. RESULTADOS
3.1Caracterização química e biológica do extrato
Tabela 1 – Características de crescimento das mudas de cacaueiro produzidas sob diferentes doses de extrato da casca do fruto do cacaueiro.
Dose de K MSRP MSRS MSPA AF ALT DH
mg kg-1 ....................g kg....................g kg-1.....................................g kg-1................. cm2 cm2 mm
0 0,33ns 0,15ns 1,491 336,1ns 22,32 3,93
125 0,41 0,17 1,84 339,3 25,8 4,1
250 0,36 0,22 1,80 347,9 24,7 4,2
500 0,38 0,21 1,66 306,3 24,3 4,0
1000 0,35 0,16 1,61 303,8 23,3 3,9
CV % 17 11 14 16 12 6
*Significativo a 5% de probabilidade; ns = não significativo. (1) ŷ = -0,0643x2 + 0,3933x + 1,2134 (R2 =0,70); (2) ŷ = -0,6032x2 + 3,6635x + 19,778 (R2 =0,68); (3) ŷ = -0,0654x2 + 0,3827x + 3,654 (R2 =0,83).MSRP = Massa seca de raiz pivotante; MSRS = Massa seca de raiz secundária; MSPA = Massa seca de parte aérea; AF = Área foliar; ALT = Altura das plantas; DH = Diâmetro da haste.
38
Tabela 2 – Teores de nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio e enxofre nas folhas de cacaueiro submetido à aplicação de diferentes doses de extrato da casca do fruto do cacaueiro.
Dose de K N P K Ca Mg S
mg kg-1 ....................................................g kg-1.......................................................................................................g
.......................................................................................................g
.......................................................................................................g
......................................................................................................
0 18,9ns 2,1ns 21,71 5,1ns 2,5ns 1,22
125 17,7 2,1 24,7 4,3 2,6 1,2
250 17,1 1,9 30,3 4,3 2,5 1,1
500 17,3 2,1 32,4 4,4 2,3 1,2
1000 18,4 1,8 31,6 3,7 2 1
CV % 5,3 7 5,7 8,5 5,9 4,8
ns = não significativo. *Significativo a 5% de probabilidade (1) ŷ = -0,8014x2 + 7,5626x + 14,279 (R2 = 0,96*); (2) ŷ = -0,02x2 + 0,0827x + 1,0873 (R2 = 0,75*).
Tabela 3 - Caracterização físico-química do extrato
Características MédiasMédias
N (g kg-1) 20,0
P (g kg-1) 2,35
K (g kg-1) 135,7
Ca (g kg-1) 12,9
Mg (g kg-1) 14,0
Fe (mg kg -1) 1140,01140,0
Zn (mg kg -1) 134,6
Cu (mg kg -1) 58,6
Mn (mg kg -1) 292,1
S total (mg kg -1) ND
Si total (g 100g-1) ND
Si solúvel (g 100g-1) 0,05
Umidade e voláteis (g 100g-1) 9,6 (0,1)29,6 (0,1)2
Cinzas (g 100g-1) 38,7 (0,1)238,7 (0,1)2
Lipídios totais (g 100g-1) ND < 0,13ND < 0,13
Proteína (N x 5,75) (g 100g-1) 12,1 (0,1)212,1 (0,1)2
Carboidratos totais (g 100g-1) 39,6 4
39
Calorias (kcal 100g-1) 207 5
Fibra (g 100g-1) 1,1 (0,0)21,1 (0,0)2
Frutose (g 100g-1) ND < 0,23ND < 0,23
Glicose (g 100g-1) ND < 0,23ND < 0,23
Sacarose (g 100g-1) ND < 0,23ND < 0,23
Teobromina (g 100g-1) ND < 3,03ND < 3,03
Teofilina (g 100g-1) ND < 3,03ND < 3,03
Fibra detergente ácido (FDA) (g 100g-1) 1,57 (0,03)21,57 (0,03)2
Fibra detergente neutro (FDN) (g 100g-1) 1,79 (0,05)21,79 (0,05)2
Polifenóis totais (g 100g-1) 26,50 626,50
Contagem total de aeróbios pisicrotróficos (UFC g-1)1 4,6 x 1044,6 x 104
Esporos de bactérias termófilas acidófilas (UFC g-1)1 >6,5 x 103>6,5 x 103
Esporos de bactérias termófilas aeróbias totais e "flat sour" (UFC 10g-1)1oros de bactérias termófilas aeróbias totais e "flat sour" (UFC 10g-1)1 8,0 x 1028,0 x 102
Esporos de bactérias termófilas anaeróbicas produtoras de H2S (em 4g)1
S (em presentespresentes
Esporos de bactérias termófilas anaeróbias não produtoras de H2S (em 4g)1
S (em presentespresentes
Esporos de bactérias mesófilas aeróbias (UFC g-1)1 >6,5 x 104>6,5 x 104
Esporos de bactérias mesófilas anaeróbicas (em 4g)1 presentespresentes
Atividade de água em 25°C (média de três repetições)1 0,274
Ácidos fúlvicos (g 100g-1) 35,3
Ácidos húmicos (g 100g-1) 5,4
Resíduo insolúvel (g 100g-1) 59,31 Unidades formadoras de colônias.2 Média e estimativa do desvio padrão3 ND = Não detectado.4 Calculado por diferença: 100 - (g 100g-1 umidade + g 100g-1 cinzas + g 100g-1 proteína + g 100gtotais).
proteína + g 100geína + g 100g-1 lipídios lipídios lipídios
5 O valor calórico da amostra foi calculado pela soma das porcentagens de proteína e carboidratos multiplicados pela fator4 (kcal g-1) somado ao teor de lipídios totais multiplicado pelo fator 9 (kcal g-1).
O valor calórico da amostra foi calculado pela soma das porcentagens de proteína e carboidratos O valor calórico da amostra foi calculado pela soma das porcentagens de proteína e carboidratos O valor calórico da amostra foi calculado pela soma das porcentagens de proteína e carboidratos O valor calórico da amostra foi calculado pela soma das porcentagens de proteína e carboidratos
6 Limite de quantificação = 0,01
40
3.2 Avaliação de atividade biológica de CHE
Table 4. Inibição do crescimento bacteriano.
" "
Linhagens Crescimento Bacteriano (%) Crescimento Bacteriano (%) scimento Bacteriano (%)
" 1.0 mg/mL 5.0 mg/mL 10.0 mg/mL
Gram-positiva
B. subtilis 113.5 (± 6.6) 109.8 (± 3.5) 100.9 (± 1.7)
S. aureus 134.1 (± 3.1) 144.5 ( ± 2.7) 103.2 (± 1.3)
St. epidermidis 100.9 ( ± 2.7) 98.3 (± 0.9) 92.5 (± 1.4)
Gram-negativa
K. pneumonia 34.9 (± 3.6) 27.1(± 4.2) 3.0 (± 0.2)
P. aeruginosa 37.0 (± 3.6) 0.1 (± 2.1) 29.4 (±9.4)
S. choleraesuis 19.7 (± 5.2) 0.1 ( ± 8.8) 0.1( ± 1.1)
" " " " "
Figura 1. Sobrevivência S.cerevisiae
41
Figura 2. Sobrevivência de M.perniciosa
Figura 3. Rendimentos químicos e inibição do crescimento bacteriano das
frações de CHE (MIC mg / mL).
*: Dose maxima aplicada;nt: não testada; Se nenhum número for dada nenhuma atividade foi observada.
42
3.3. Avaliação da genotoxicidade de CHE:
Figura 4. Teste Cometa
43
Tabela 5. Genotoxicidade em levedura Sacchoromyeces cerevisiae (XV185-14)
Agent Treatment (µg/mL)
Survival (%)
His1/107
survivorsaLys1/107 survivorsb
Hom3/107 survivorsb
Stationary phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%
4NQOd 0.5 65.1±2.4 48.2±10.9*** 11.6±3.4 4.2±0.9
NC c 0 100e 9.9±4.0e 4.2±0.8e 3.0±0.9e
CHE 50 92.3±3.7 10.8±3.4 3.9±0.9 2.1±0.5
100 80.0±7.7 11.4±4.0 4.1±0.7 2.3±1.2
200 78.9±8.3 9.8±3.0 2.8±0.7 2.1±0.4
Exponential phase - Cells treated in NaCl 0,9%Exponential phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%
4NQO 0.5 99.1±1.72 52.2±3.8*** 16.6±0.1 6.2±0.7
NC 0 100 14.0±0.2 2.6±0. 4 0.9±0.25
CHE 50 97.6±3.3 18.0±0.6 2.5±0.07 2.2±0.07
100 99.8±0.2 13.0±0.1 2.2±0.02 3.3±0.5
200 99.1±0.2 7.0±0.4 0.8±0.02 1.9±0.9
a Revertentes Locus-especifico; b Revertentes Locus- não especifico (forward mutation); c Controle Negativo (solvente); d Controle Positivo; e Média e desvio padrão de pelo menos três experimentos independentes. * Diferença Significativa em comparação com o controle negativo para P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001/ teste ANOVA-Tukey’s.
44
Tabela 6. Genotoxicidade em levedura Sacchoromyeces cerevisiae (XS2316)
Agent Treatment (µg/mL)
Survival (%)
Crossing-over/105
survivorsaGene conversion/10
5
survivorsb
Stationary phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%
4NQOc 0.5 97.5±3.5 106.8±2.5 44.3±2.9
NC b 0 100e17.7±0.3
e 2.8±1.5
e
CHE 200 99.5±0.6 35.4±4.2 1.7±1.5
400 95.6±6.2 36.4±4.3 3.6±1.4
800 95.0±7.0 40.9±3.8 1.1±0.7
Exponential phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%
4NQOc 0.5 84.3±1.7 153.8±2.5 39.1±6.1
NC b 0 100 12.3±0.9 4.2±2.4
CHE 200 99.5±0.7 18.0±0.5 5.2±3.6
400 79.3±23.3 26.0±0.2 6.1±1.7
800 89.7±3.1 22.2±2.2 2.9±0.5
a Média e desvio padrão de pelo menos três experimentos independentes; b Controle Negativo (solvente); c Controle Positivo. * Diferença Significativa em comparação com o controle negativo para P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001/ teste ANOVA-Tukey’s.
45
Tabela 7. Genotoxicidade em levedura S. typhimurium
S. typhimurium S. typhimurium strainsS. typhimurium strainsstrains
Agent Concentration
(µg/plate)
TA100 TA98
Rev/platea MIb Rev/platea MIb
Without metabolic activation (-S9)Without metabolic activation (-S9)Without metabolic activation (-S9)
NCc - 125.3±4.6 - 22.3±4.5 -
CHE 1000 104.3±6.4 0.83 26.0±2.0 1.17
2000 101.0±14.8 0.81 20.7±3.5 0.93
3000 103.7±11.7 0.83 22.0±4.4 0.99
4000 112.3±3.5 0.90 19.3±1.5 0.87
5000 114.3±13.0 0.91 18.3±9.0 0.82
PCd 0.5 (4NQO)
1 (NaN3)
468.0±46.9*** 3.74 182.3±30.6*** 8.18
With metabolic activation (+S9)With metabolic activation (+S9)With metabolic activation (+S9)
NCc - 156.3±13.2 - 23.7±1.5 -
CHE 1000 157.7±12.7 1.01 22.3±0.6 0.94
2000 161.0±15.4 1.03 27.0±4.4 1.14
3000 160.3±5.3 1.03 22.5±6.4 0.95
4000 157.0±23.1 1.01 21.7±5.9 0.92
5000 152.0±8.0 0.97 27.0±6.6 1.14
PCd 1 (AFB1) 454.0±144.8* 2.90 764.7±130.1*** 32.3aNumber of revertants/plate: mean of three independent experiments ± SD; bMI: mutagenic index (nº. of his+ induced in the sample/nº. of spontaneous his+ in the negative control); cNC: negative control distillated water (10 µl) used as a solvent for the extract; dPC: positive control (-S9) sodium azide to TA100; 4-NQO to TA98; (+S9) aflatoxin B1. *Data significant in relation to negative control p<0.05; *** p<0.001.
46
3.4 Análises fitoquímica da fração bioativa de CHE
Figura 5. Análise fitoquímica de CHE e frações bioativas.
Extract Fractions bioactiveFractions bioactiveFractions bioactive
CHE CHE8 CHE9 CH12
Alkaloids + - + +
Amino acids nt - - -
Anthraquinones - nt nt nt
Cardiac glycosides - nt nt nt
Flavonoids nt + + -
Phenolic compounds + + + +
Saponins - - - -
Steroids and terpenes nt + + +
47
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48
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49
3. CAPÍTULO II
Antimicrobial Activity of Fermented Theobroma cacao Pod Husk
Extract
R.X. Santos 1; D.A. Oliveira 1; G.A. Sodré, 2,3; G. Gosmann, 4; M. Brendel 1; C.
Pungartnik1
Artigo publicado na Genetics and Molecular Research (GMR)
51
Antimicrobial Activity of Fermented Theobroma cacao Pod Husk
Extract
R.X. Santos 1; D.A. Oliveira 1; G.A. Sodré, 2,3; G. Gosmann, 4; M. Brendel 1; C.
Pungartnik1
1Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,
Bahia.2Departamento Ciências Agrárias, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia.3 Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira, Ilhéus, Bahia.4 Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio
Grande do Sul.
Corresponding author: C. Pungartnik E-mail: [email protected]
Phone/Fax: +55 73 36805336
52
ABSTRACT. Theobroma cacao L. contains more than 500 different chemical
compounds some of which have been traditionally used as antioxidant, anti-
carcinogenic, immune modulating, vasodilatory and analgesic effects generating and
anti-microbial drug. Spontaneous aerobic fermentation of cacao husks yields a crude
husk extract [CHE] with antimicrobial activity. CHE was fractioned by solvent partition
with polar solvent extraction or by silica gel chromatography and a total of 12 sub-
fractions were analyzed for chemical composition and bioactivity. CHE was effective
against the yeast Saccharomyces cerevisiae and the basidiomycete Moniliophthora
perniciosa. Antibacterial activity was determined using 6 strains: Staphylococcus
aureus, St. epidermidis and Bacillus subtilis (Gram+) and Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumoniae and Salmonella choleraesuis (Gram-). At doses of up to 10 mg/
mL CHE was not effective against the tested Gram+ but against medically important P.
aeruginosa and S. choleraesius with a MIC of 5.0 mg/mL. Sub-fractions varied widely
in activity and strongest antibacterial activity was seen with CHE8 against S.
choleraesius (MIC 1.0 mg/mL) and CHE9 against S. epidermidis (MIC 2.5 mg/mL). All
bioactive CHE-fractions contained phenols, steroids or terpenes but no saponins.
Fraction CHE9 contained flavonoids, phenolics, steroids and terpenes, amino acids and
alkaloids, while CHE12 had the same compounds but lacked flavonoids.
Key words: Pod Husk Extract, Theobroma cacao, Antibacterial activity
53
INTRODUCTION
Cacao (Theobroma cacao L.) is a neotropical species native to humid tropical plains of
Central and South America (Whitkus et al., 1998). It is classified in the genus
Theobroma, family Malvaceae Esterculiacea and is considered a prehistoric tree already
cultured more than 3,000 years ago by Olmecs and Mayans (Dillinger et al., 2000). The
Mesoamerican people used the seeds of T. cacao as bargaining chips and to produce
beverages to be consumed during rituals or as a medicine to relieve symptoms
associated with sicknesses of cardiovascular, gastrointestinal and nervous character
(Henderson et al., 2007; Prufer and Hurst, 2007; Trognitz et al., 2011). Indigenous
people from Central and South America still use cocoa in folk medicine (Jenny et al.,
2009).
Cocoa has become an important ethno medicinal plant since it has an unique chemical
composition of more than 500 different compounds (Crown and Hurst, 2009). Amongst
their reported contribution for human health, there is the antioxidant (Carl et al., 2005;
Mhd Jalil and Ismail, 2008), anti-inflammatory (Selmi et al., 2008), anti-carcinogenic
(Fotsis et al., 1997; Maskarinec, 2009), immune modulating, vasodilator and analgesic
effects generating (Wollgast and Anklam, 2000) and anti-microbial activity (Osawa et
al., 1990; Percival et al., 2006; Summa et al., 2008; Fapohunda and Afolayan, 2012).
Almonds or cocoa beans constitute the raw material for the production of chocolate and
its derivatives, which are used in different forms worldwide. Processing of cocoa in the
farms begins with the opening of the fruit (pods) in the field under the trees, where the
seeds are separated from the husks. The seeds are then fermented in wooden boxes and
sun-dried, to be later processed by industry (Forsyth and Quesnel, 1957; Kalvatchev et
al., 1998; Camu et al., 2008).
The cultivation of cocoa is of economic importance for several countries such as Ghana,
Ivory Coast, Nigeria, Indonesia, Malaysia and Brazil (Azizah et al., 2007; Hii et al.,
2009). At the same time, commercial cocoa culture may represent a serious problem due
to the generation of huge amounts of pod husks, unused organic material generally left
behind in the fields. For each ton of dry seed about 7 tons of fresh pod husks are
produced (Figueira et al., 1993). These residues, left in the field of most farms, may
serve as reservoir of nutrients for various microorganisms (Vriesmann et al., 2012),
including those responsible for different diseases of cacao, e.g. for the fungus causing
witches’ broom. Thus, by helping propagation of unwanted fungi, uncontrolled deposits
of cacao pod husks may lead to a reduction of cacao production (Kalvatchev et al.,
1998). On the other hand, these cacao husks contain a range of biologically active
compounds (Lecumberri et al., 2007; Rice-Evans, 2001) and, therefore, may represent a
valuable source for the isolation of substances of economic value.
Here we show that controlled spontaneous aerobic fermentation of cacao husks
represents an economic alternative to their uncontrolled waste disposal and that this
process not only decreases the extent of environmental problems but also yields an
54
extract enriched with secondary metabolic compounds (such as phenols, alkaloids,
terpenoids) with antimicrobial activity.
MATERIAL AND METHODS
Plant material
T. cacao plants selected for this study were Scavina-6 clones resistant against the fungus
Moniliophthora perniciosa (formerly Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer) growing in
experimental areas of the Comissão Executiva de Planejamento da Lavoura Cacaueira
(Executive Committee of the Plan of Cocoa Farming, CEPLAC) in Ilhéus, Bahia. The
majority of cacao pods were harvested and processed at CEPLAC while a 200 kg batch
of pod husks was obtained from a farm not using chemical products (organic cultivar),
serving as a control. After seed removal from the opened pods the remaining husks were
collected and transported to the Centro de Pesquisas do Cacau (Cocoa Research
Center–CEPEC) Ilhéus, Bahia.
Preparation of Cacao pod husk extract - CHE
Crude extract was prepared at CEPEC as described. Initially, 2 tons of cacao husks
(from CEPLAC) were transferred to CEPEC (Fig. 1A). To prepare CHE empty pod
husks of T. cacao were chopped into rectangular pieces of about 1.5 to 2.5 cm width,
slightly humidified, and placed on a polyethylene tarp to form piles with 2.5 m length x
1.5 m width x 1.0 m height (Fig. 1B). During a 3 months period, the piles of chopped
husks were stirred every 15 d until there was no more heat dissipation. Each pile was
then transferred into a wooden recipient with a bottom sieve (4 mm mesh), 5 L of
distilled water was poured over the fermented husks and the aqueous crude extract
collected in a bottom tray (Fig. 1C). The obtained crude extract was transferred into
glass Petri dishes (150 mm diameter), dried at room temperature for 72 h, ground in an
electric grinder and passed through a 1.5 mm mesh sieve. Fourteen t of fresh cocoa
husks yielded 20 kg of dry crude extract (Fig. 1D). Pod husks from the organic cultivar
were treated separately (as control) in the same manner.
Two g of this crude extract was reduced to powder using a porcelain mortar, suspended/
dissolved in 10 mL of distilled water and filtered through a paper filter (Whatman, 80g/
m2, porosity 3 µm). The remaining non-dissolved material was re-submitted to the same
procedure twice to yield a total of 30 mL water-dissolved extract. The still remaining
insoluble residue was resuspended 5 mL of distilled water and subjected to sonication
(Ultrasonic processor Gex 130, 130 W), with 10 pulses of 40 s each, 60% output with
10 s intervals, and filtered as described above. A total of 35 mL of this aqueous extract
was frozen at -20 oC, later concentrated by freeze-drying for 4 d in order to obtain cocoa
husk extract [CHE] (yield of 72.95% w/w). 100g of CHE was submitted to standard
microbiological (Downes and Ito, 2001) analysis.
Fractionation of CHE
CHE (100 mg) was fractionated by solvent partition by extraction with chloroform (3 x
30 mL) (CHE1), ethyl acetate (3 x 30 mL) (CHE2), n-butanol (3 x 30 mL) (CHE3), or
the remaining distilled water fraction (CHE4). Other extractions were performed after
55
hydrolysis where 100 mg of CHE was dissolved in 1N sulfuric acid (5 mL). The
mixture, refluxed for 30 min, filtered and alkalized to pH 10 yielded CHE5. This CHE5
was submitted to solvent partition by extraction with chloroform/methanol (3:1 v/v),
yielding CHE6 or chloroform (3 x 30 mL) yielding CHE7.
1.5 g of CHE was chromatographed in an open column of silica gel 60RP-18 (a 40-63
Fluka Analytical), in the ratio 1:50 (extract:silica). Mixtures of methanol and water 0%
to 100% were used as eluent. Forty-five fractions were obtained, which were grouped
according to their chromatographic profile in thin layer chromatography (TLC) using
silica gel 60 GF254 plates, n-butanol:acetic acid:water - BAW (4:1:1, v/v) as eluent and
visualized under UV light (254 and 365 nm, handheld UV Lamp Model 9403E,
BioAmerica Inc., USA) resulting in five fractions (CHE8 to CHE12).
All fractions were dried in a rotary evaporator and stored at -20 oC until used in
biological tests. Yield for CHE and CHE-fractions are described in Table 1.
Antibacterial bioassay
The bacterial cultures were grown in Mueller-Hinton agar at 25 °C for 24 h, thereafter
suspended in 10 mL of saline (NaCl 0.9%) and suspensions adjusted to optical density
for a 0.5 McFarland standard [108 colony forming units (CFU) /mL]. Six bacterial
strains were used: a) Gram-positive Staphylococcus aureus (ATCC25921), St.
epidermidis (ATCC35984), and Bacillus subtilis, b) Gram-negative Pseudomonas
aeruginosa (ATCC27853), Klebsiella pneumoniae and Salmonella choleraesius.
Antibacterial bioassay using CHE or CHE-fractions was performed using micro-
dilution broth with modifications (Basri et al., 2012). In a 96 micro-well polystyrene
plate, to each 80 µL of inoculum (1.5 x 105 CFU/mL) 40 µL of Tryptic Soy Broth (TSB)
was added and 80 µL of either CHE (original concentrations 1.0, 5.0 and 10.0 mg/mL)
or CHE-fractions (CHE1 to CHE12, in concentrations of 0.1 – 10 mg/mL). Negative
control was the inoculum plus TSB and water instead of the CHE or CHE-fractions.
Plates were closed and incubated at 37 oC for 24 h. All tests were performed in
triplicate. CHE and CHE-fractions were dissolved in distilled water. Antibacterial
activity was assessed by optical density readings at 600 nm (Beckman DU-70 UV-vis
spectrophotometer) at 0 and 24 h after inoculation. Minimum inhibitory concentration
(MIC) of CHE was taken as the lowest concentration of the test agent that restricted
growth increase to a level of OD <0.05 of the control after the incubation period. For
the results of the MIC the percentage of inhibition was calculated according to (Zampini
et al., 2005). Results represent data of a minimum of 3 repetitions.
Antifungal bioassay
Two fungal species, Saccharomyces cerevisiae (BY4741, EUROSCARF) and
Moniliophthora perniciosa were used in this study. S. cerevisiae was obtained by
inoculation of an isolated colony into liquid YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2%
glucose, 48 h). Survival of stationary yeast culture exposed to CHE (50-200 mg/mL, 1 h
at 30 °C in saline) was determined by plating appropriately diluted aliquots on solid
YPD (triplicate) and incubating at 30 °C for 2-3 days. M. perniciosa cultures were
prepared by inoculation of aliquots during 7 d in CPD media [2% of peptone, glucose
56
and agar, according to Filho et al. (2006)]. From those, 5 mL culture was incubated at
different concentrations of CHE (50-200 mg/mL, 24 h). One mL of broken hyphae
suspension was applied to three plates of CPD, and counted after 7 d, at 25 °C. All
results (yeast and M. perniciosa) were expressed as the percentage of survival related to
the untreated controls and are the mean of at least three independent experiments; with
error bars representing standard deviation as calculated GraphPad Prism program
(GraphPad Software Inc., San Diego, CA).
Phytochemical screening of CHE and bioactive CHE-fractions
Contents of phytochemicals in CHE extracts was determined using 1 mg/mL of the
respective extract in distilled water. The following classes of constituents were screened
for: alkaloids (using both Wagner’s test and Mayer’s test); anthraquinones (using the
Bornträger’s test); cardiac glycosides (using the Baljet’s test); phenolic compounds
(using FeCl3 as the reagent); and saponins (using the Froth test) for their ability to
produce suds (Harborne, 1998). The preliminary phytochemical analysis was also done
for bioactive CHE-fractions using silica gel 60 GF254 TLC plates and BAW (4:1:1, v/v)
as eluent. The spots were visualized under UV light (254 and 365 nm) first, then by
using specific reagents as vanillin ammonia 1% and ferric chloride 2% (polyphenol
compounds), or flavonoids (Natural Reagent -Polyethylene glycol - NP/PEG), or
anisaldehyde/sulfuric acid then heating (steroids and terpenes) or ninhydrin 0.1%
(amines and aminoacids). All these tests, procedures and reagents are described
elsewhere (Harborne, 1984; Wagner and Bladt, 1996).
RESULTS AND DISCUSSION
As little information is available on the presence of antimicrobial compounds in cacao
pod husk an extract was prepared (CHE) and its activity antimicrobial investigated
(Figure 1). Dried CHE powder was black and after dilution in water showed a dark-red
color, absorbing at λmax = 210 and 265 nm; at concentrations >1 mg/mL it is a viscous
fluid; the extraction process to obtain CHE rendered approximately 72.95% of the initial
crude extract.
The antibacterial activity including growth inhibition and MIC assays by CHE and
bioactive CHE-fractions are given in Table 1 and 2, while antifungal activity of CHE
tested with S. cerevisiae and M. perniciosa is shown in figure 2. In Table 1 we can
observe that for K. pneumonia, there was a dose-dependent activity, i.e., 10x higher
concentration led to 10x less bacterial growth. Strongest inhibitory activity was
obtained against P. aeruginosa and S. choleraesius. Interestingly, the bacterial growth of
P. aeruginosa was only inhibited at 5 mg/mL CHE but not at the higher exposure dose
of 10.0 mg/mL (Table 1). This puzzling result was obtained in each of 3 independent
experiments and only with P. aeruginosa. The observed recovery of growth ability by
this bacterium at higher dose of CHE might be explained by the presence of a
compound in CHE that, at 10 mg/mL, can compensate the original antibacterial activity
witnessed at lower CHE doses, by inducing alteration in the bacteria’s physiology. This
compound could be either the same one responsible for the observed antimicrobial
effect at lower doses (induction only at CHE doses > 5 mg/mL) or another non-toxic
compound of CHE that induces these changes in the bacterial metabolism. Similar
57
observations were already reported by Saito (2012) for the same bacterium, i.e., when
testing antimicrobial activity of a plant extract (Cassia alata) in P. aeruginosa.
At the applied doses of 1 to 10 mg/mL CHE was not effective against any of the tested
gram-positive bacteria, but displayed bactericidal activity of varying degree with gram-
negative bacteria (Table 1). Gram-positive and are commonly distinguished by their cell
wall characteristics, which are related to the surface elements and the permeability
properties. The probable chemical compound or group of compounds responsible for
the specific bactericidal action of CHE on Gram-negative bacteria may have been
extracted by the polar solvent (water). The outer membrane surrounding the cell wall of
Gram-negative bacteria is known to contribute to the diffusion of hydrophilic
compounds through its channel proteins, especially porins with hydrophilic
characteristics (Tortora et al., 2010). This structural composition of cell wall may
contribute to the entry of bioactive compounds of increasing polarity, i.e., CHE, which
may result in the observed increased cell death (Table 1).
While there were varying results within different bacteria, both yeast and M. perniciosa
showed dose-dependent survival when exposed to CHE for 1 hour and 24 hours,
respectively (Fig. 2). The data indicate that CHE has considerable in vitro activity not
only against bacteria but also against the two fungi tested as it inhibited growth of both
fungi in a dose-dependent manner. Broken hyphae of M. perniciosa proved to be
significantly more resistant to CHE than yeast. The CHE-resistance of M. perniciosa
resembles the much higher resistance to UVC when compared to yeast and also
suggests that CHE does not induce oxidative stress damage, as M. perniciosa was much
more sensitive to H2O2 and paraquat as likewise treated yeast cells (Filho et al., 2006).
The production of the antifungal CHE activity during decay of the cacao husks is an
aerobic process as treating the husk fragments in closed 60 L containers under anaerobic
conditions for three months did not produce at any time effluents with antimicrobial
activity (data not shown). Indeed, microbiological analysis of CHE showed the presence
of aerobic psychrotrophic microbes (4.6x104 CFU/g), spores from thermophilic
acidophilus bacteria (> 6.5x103 CFU/g), mesophilic aerobic bacteria (> 6.5x104 CFU/g),
and indicated the presence thermophiles anaerobes producers and non-producers of H2S
and mesophilic aerobic bacteria. Also, no exothermic fermentation was observed as
daily measurements never yielded temperatures above 31 oC, i.e., temperatures only 2 to
3 degrees above those of the environment. Also, bioactive compounds are unlike to be
proteins since boiling of CHE eliminated all antifungal activity (data not shown). CHE
derived from husks from organic cacao culture had likewise antimicrobial activity as the
standard CHE derived from cacao husks from CEPLAC (data not shown), indicating
that biotransformation of applied agrotoxic substances are not the source of the
observed antimicrobial potential.
Various methodologies and solvents were used to obtain 12 CHE fractions and to
identify whether the observed bioactivity depends on a single or on a group of chemical
compounds (Table 2). From those 12 fractions only CHE8, CHE9 and CHE12 were
effective against two bacteria Gram- bacteria (S. choleraesius with a MIC of 1.0 mg/
mL) and Gram+ S. epidermidis (MIC of 2.5 mg/mL), a bacterium causing the majority
of hospitalar infections (Table 2). According to Fabry (1998), chemical compounds/
extracts with MIC values less than 8 mg/mL are potentially useful candidates for
therapeutic application. Therefore, the chemical components of CHE may be considered
58
as good candidate against Gram-negative bacteria of medical importance, such as P.
aeruginosa and S. choleraesius. The other fractions exhibited MIC above 10 mg/mL
(CHE3 and CHE4 to S. choleraesuis) or not detected activity (data not shown).
We observed strongest inhibitory activity of the CHE extract against P. aeruginosa
(Table 1). When separating compounds present in CHE one would expect that some
CHE fraction produced even better inhibition against P. aeruginosa, because of the
higher purity of the inhibitory compound obtained by fractioning (Table 2). However,
our analysis showed that none of the fractions tested were active against P. aeruginosa.
That may be due to the existence of “synergistic interaction” amongst substances
present in CHE, that together could exert antibacterial activity against P. aeruginosa
[synergism is characterized when the interaction of two or more compounds yields
higher efficiency than either single compound (Varel, 2002)] or that the active
compounds were not eluted but retained in the column.
Some information on the nature of possible antimicrobial substances in CHE and its
sub-fractions (Table 2) was obtained. Better yields were obtained for water fractions
independent of methodology used (CHE4, CHE5, CHE8). Apparently, acidic hydrolysis
of CHE rendered the extract without inhibitory power against any of the tested bacteria
(CHE5, CHE6, CHE7). Fractions CHE4, CHE5 and CHE8 had a deep red color with
smooth texture and yielded 59.80%, 61.55% and 43.33%, respectively.
The physical characteristics of fractions CHE1, CHE2, CHE3, CHE6 and CHE7
obtained by different methodologies, showed ivory color, liquid texture and yielded
extracts of less than 1.3% that could not inhibit bacterial growth, demonstrating that the
majority of active compounds are polar ones.
In order to try to correlate the antibacterial activity with a chemical class of compound,
CHE was submitted to different colorimetric assays (Table 3) while the bioactive CHE-
fractions were submitted to TLC for qualitative screening of the secondary metabolites
(Table 2). The presence of phenolic compounds, steroids or terpenes and absence of
saponins was observed in all bioactive CHE-fractions. Fractions CHE8 and CHE9 were
positive for flavonoids. Fractions CHE9 and CHE12 were positive for steroids, terpenes
and alkaloids (Table 3).
The phyto-constituents in CHE and its bioactive CHE-fractions can be associated with
their antimicrobial activity. Thus, the observed antibacterial activity (Table 2) cannot be
attributed to only one class of phytochemicals (Table 3). The antimicrobial activities
shown by the extract will likely be due to one or more of the several phytochemical
constituents present in the extract. The phytochemicals detected during chemical
screening are known as substances of important antimicrobial activity (Kumar et al.,
2009). Some of these compounds, the terpenes, polyphenols and alkaloids are known to
have antibacterial, fungicidal and insecticidal activity (Hernández et al., 2000; Akiyama
et al., 2001; Ahmad et al., 2001).
CONCLUSION
Utilization of the enormous amounts of normally wasted cacao pod husks via
fermentation and bioprocessing of their extract [CHE] may be a positive way to
transform what could be an environmental problem into a biotechnological solution.
59
Our study revealed that after spontaneous aerobic fermentation of cacao pod husks, the
obtained CHE is an important source of metabolites that contains bioactive compounds
against bacteria of medical relevance, especially against Gram-negative P. aeruginosa
and S. choleraesius. CHE also revealed fungicidic activity against the basidiomycete
fungus M. perniciosa and the yeast S. cerevisiae. CHE contains a mixture of secondary
metabolites either from the proper pod husks of T. cacao or from bio-transformed
derivatives formed during their aerobic fermentation or from the combination of both
sources as shown by the identification and presence of mainly phenolics and some
nitrogen-containing compounds. Our results provide evidence that some phytochemicals
extracted from aerobically fermented cocoa pod husks are bioactive and thus a potential
source of natural antibacterial and antifungal agents. These results warrant further
studies regarding analysis of the active CHE constituents and to determine their
potential for therapeutic application.
ACKNOWLEDGEMENTS
We would like to thank to Dr. Liovando Marciano da Costa from Universidade Federal
de Viçosa, Departamento de Solos for chemical analysis of CHE. Research financed by
CNPq. R.X.S. and D.O. held CNPq fellowships. G.G. is grateful to CNPq and CAPES
for financial support. M.B. is visiting professor at UESC.
60
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63
Figure legends
Figure 1. Various steps in the production of cacao husk extract (CHE): A) T. cacao
plant; B) Husks of T. cacao at CEPLAC farm; C-D) piled chopped cacao husks, slightly
humidified; E) chopped cacao husks after 60 days; F) chopped cacao husks in wooden
recipient with a bottom sieve, to collect crude extract (G); H-I) dried crude extract
obtained from husks of T. cacao. Photos from G. A. Sodré.
Figure 1
64
Figure 2. Survival of M. perniciosa and S. cerevisisae after CHE treatment. (●) S.
cerevisiae, 1 hour exposure; (■) M. perniciosa, 24 h exposure.
Table 1. Bacterial growth inhibition by CHE
Microbial strains Bacterial growth (%) Bacterial growth (%) terial growth (%) a
!
Microbial strains1.0 mg/mL 5.0 mg/mL 10.0 mg/mL
Gram-positive
B. subtilis 113.5 (± 6.6) 109.8 (± 3.5) 100.9 (± 1.7)
S. aureus 134.1 (± 3.1) 144.5 (± 2.7) 103.2 (± 1.3)
S. epidermidis 100.9 (± 2.7) 98.3 (± 0.9) 92.5 (± 1.4)
Gram-negative
K. pneumoniae 34.9 (± 3.6) 27.1(± 4.2) 3.0 (± 0.2)
P. aeruginosa 37.0 (± 3.6) 0.1 (± 2.1) 29.4 (± 9.4)
S. choleraesuis 19.7 (± 5.2) 0.1 (± 8.8) 0.1(± 1.1)
a Mean value ± SD
65
Table 2. Chemical yields and inhibition of bacterial growth by CHE-fractions
CHE fractions
Chemicalcharacteristic
Chemicalcharacteristic
Minimum Inibitory Concentration (mg/mL)Minimum Inibitory Concentration (mg/mL)Minimum Inibitory Concentration (mg/mL)CHE
fractions Extraction solvent (v:v)
Yield (%)
P. aeruginosa S. choleraesuis S. epidermidis
CHE1 chloroform 1.24 nt
CHE2 ethylacetate 0.19 nt
CHE3 n-butanol 0.27 > 10
CHE4 water 59.80 > 10
CHE5 water 61.55
CHE6 chloroform:ethanol (1:1) 0.39
CHE7 chloroform 0.21
CHE8 water 43.33 1.0 > 10
CHE9 water:methanol (7:3) 5.34 > 10 2.5
CHE10 water:methanol (5:5) 1.07
CHE11 water:methanol (3:7) 1.74
CHE12 methanol 0.21 1.0 > 10
*: Maximal applied dose was 10 mg/mL; nt: not tested; If no number is given no activity was
observed.
Table 3. Phytochemical screening of CHE and bioactive
CHE-fractions
Extract Fractions bioactiveFractions bioactiveFractions bioactive
CHE CHE8 CHE9 CH12
Alkaloids + - + +
Amino acids nt - - -
Anthraquinones - nt nt nt
Cardiac glycosides - nt nt nt
Flavonoids nt + + -
Phenolic compounds + + + +
Saponins - - - -
Steroids and terpenes nt + + +
(+): presence; (−): absence; nt = not tested.
66
Fermented Theobroma cacao Pod Husk Extract: Genotoxicity in Yeast, Bacteria and Mammalian cells
Santos, R.X.; Oliveira, D.; Sodré, G.A.; Gosmann, G;
Brendel, M.; Henriques, J.A.P ; Pungartnik, C.
Artigo a ser submetido para publicação na Mutation Research - Genetic Toxicology and
Environmental Mutagenesis
68
Fermented Theobroma cacao Pod Husk Extract: Genotoxicity in Yeast, Bacteria and Mammalian cells
Santos, R.X.a; Oliveira, D.a; Sodré, G.A.b,d; Gosmann, Gc;
Brendel, M.a; Henriques, J.A.P e; Pungartnik, C.a,*
aDepartamento de Ciências Biológicas; bDepartamento Ciências Agrárias, Universidade Estadual de Santa Cruz, Rod. Ilhéus Itabuna, Km 16, Ilhéus, BA, Brazil. CEP 45662-900.
c Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Ipiranga, 2752, Porto Alegre, RS, Brazil. CEP 90610-000.
d Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira, Km 22 Rod. Ilhéus/Itabuna, Ilhéus, BA, Brazil. CEP 45653-919.
e Dept. de Biofísica, Centro de Biotecnologia, UFRGS, Av. Bento Gonçalves 9500, 91507-970 Porto Alegre, RS, Brazil
*Corresponding author: [email protected]
Phone/Fax: +55 73 36805336
69
Abstract
Theobroma cacao L. is a plant of economic importance to the southern region of Bahia.
Cocoa culture generates a large amount of organic waste from the fruit’s husk, which is
underused. New technologies were encouraged to economically use these pod husks,
thereby reducing this waste. Therefore it is extremely important to use the pod husks of
the cocoa fruit and ensure the safety of generated products or extracted compounds.
Analysis of cocoa pod husk extract (CHE) revealed that it contains high levels of transition
metals such a zinc (Zn), iron (Fe), manganese (Mn), and copper (Cu). We also evaluated
toxicity and genotoxicity / mutagenicity of CHE in established test systems (comet assay,
tests in Saccharomyces cerevisiae and Salmonella / microsome test). It was observed that
STAT yeast cells harboring fet3∆ and aft1∆ mutant alleles were sensitive to CHE
compared to isogenic WT. Comet assay in V79 CHE-exposed cells showed no DNA
damage. No CHE-induced mutations were found in strains TA98 and TA100 of Salmonella
typhimurium (with or without metabolic activation) or in the haploid yeast strain XV185-14c
at exposure concentrations ranging between 50 to 200 ug / mL. CHE was not-
recombinogenic (gene conversion and crossing over) in the diploid yeast strain XS2316.
Absence of genotoxicity while demonstrating a toxic potential against microbes suggest
that CHE, or some of the substances contained in it, may hold promise for a
biotechnological application.
Key words: Cocoa; comet assay, genotoxicity, transition metals.
70
1. Introduction
Cacao (Theobroma cacao L.), a tropical evergreen tree belonging to the Malvaceae family
(Whitlock et al., 2001) is the most economically important species of the genus Theobroma
for many small crop farmers in developing countries with tropical climate. Cacao seeds
(beans) constitute the raw material for the production of chocolate and confectioneries
worldwide and some of their components are also used in cosmetics and pharmaceuticals
(Kalvatchev et al., 1998).
Cacau is produced in monocultures with up to 1,000 trees per hectare and this creates two
problems: (a) phytopathogens like the basideomycete fungus Moniliophthora perniciosa,
the causal agent of witches’ broom, may cause dramatic losses in crop production and (b)
the processing of the ripe cacao pods on the farm leaves a huge amount of organic waste
in form of the empty pod husks (Figueira et al., 1993; Santos et al., 2013). Some million
tons of cacao pod husks are disposed of every year, often left behind in the fields,
resulting in an undesirable waste of organic material (Vriesmann et al., 2011) that contains
valuable organic compounds. The simplest way to get rid of this pod husks is to macerate
them and distribute them under the trees as organic fertilizer. This, however, may also help
to spread plant pathogens, especially microbes that thrive on the rich organic material
(Donkoh et al., 1991).
Alternative approaches have been to extraxt cacao metabolites of economic value (Nojosa
et al., 2003) from the pod husks (Reddy and Yang, 2005; Vriesmann et al., 2011; Syamsiro
et al., 2012) or to subject the macerated pod husks to aerobic fermentation that curbs the
development of pathogenic microbes and produces a stable compost (bio fertilizer) with
antifungal activity that can be safely spread on the cacao farm (Sodré et al., 2012).
71
This aerobic fermentation of pod husks also produced a liquid water extract with antifungal
activity. We standardized the extraction procedure and verified the extract’s antimicrobial
potential (Santos et al., 2013). Here we wish to report our experiments that evaluated the
biological safety. i.e., cytotoxic and genotoxic activities, of cacao husk extract (CHE).
2. Material and Methods
2.1 Materials, chemicals, reagents and media.
All plastics and media were purchased from Gibco®, Eppendorf® (Hamburg, Germany)
and Becton, Dickinson and Company® (BD, Franklin Lakes, N. J., USA). All chemicals and
reagents were P.A. grade and purchased from either Sigma Aldrich Inc, Chemicals and
Reagents (Sigma-Aldrich Co. LLC, USA) or from Merck Chemicals & Reagents (Merck
KGaA, Darmstadt, Germany).
2.2 Preparation of Cacao pod husk extract - CHE
T. cacao plants selected for this study were Scavina-6 clones resistant against the fungus
Moniliophthora perniciosa (formerly Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer) growing in
experimental areas of the Comissão Executiva de Planejamento da Lavoura Cacaueira
(Executive Committee of the Plan of Cocoa Farming, CEPLAC) in Ilhéus, Bahia. Crude
extract was prepared as described by Santos et al. (2013).
Two grames of this crude extract was reduced to powder using a porcelain mortar,
suspended/dissolved in 10 mL of distilled water and filtered through a paper filter
(Whatman, 80g/m2, porosity 3 µm). The remaining non-dissolved material was re-
submitted to the same procedure twice to yield a total of 30 mL water-dissolved extract.
The still remaining insoluble residue was resuspended in 5 mL of distilled water and
72
subjected to sonication (Ultrasonic processor Gex 130, 130 W), with 10 pulses of 40 s
each, 60% output with 10 s intervals, and filtered as described above. A total of 35 mL of
this aqueous extract was frozen at -20 oC, later concentrated by freeze-drying for 4 d in
order to obtain cocoa husk extract [CHE] (yield of 72.95% w/w). 100 g of CHE was
submitted to biological analysis.
2.2 Analytical methods
Zinc (Zn), copper (Cu), manganese (Mn), iron (Fe) concentrations were determined by
nitropercloric digestion according to the Association of Official Analytical Chemists (AOAC)
guidelines (2005). All analyses were carried out in triplicate, the results were expressed as
mg/1000 g.
2.3 Assays with S. cerevisiae
2.3.1 Strains and media
Relevant genotypes of yeast strains used in this work are given in Table 1. Media and
solutions were prepared according to Burke et al. (2000). Complete liquid medium (YPD)
was used for routine growth of yeast cells. For plates, the medium was solidified with 2%
agar. Minimal medium (MM) was supplemented with the appropriate amino acids and
nitrogen base uracil to yield synthetic complete medium (SC). For mutagenesis in the
strain XV-185-14c, the omission media lacking lysine (SC-lys), histidine (SC-his), or
homoserine (Sc-hom) were used. For evaluation of recombinogenisis, leucine was omitted
from the synthetic complete medium (SC-leu) or supplemented with 0.2 % (w/v)
cycloheximede (SC + cyh).
2.3.2. Yeast growth and treatments
73
Stationary phase (STAT) cultures were obtained by inoculation of an isolated colony in
liquid SC for 48 h. Exponential growth (LOG) were obtained by inoculation of 5x105 cells/
mL of an SC culture in stationary phase into fresh 50 mL SC medium.
For all the experiments the cells in STAT phase or LOG phase, were washed twice with
saline solution (0.9% NaCl, pH 5.0) and suspension of 2 x108 cells/mL was incubated at
30 °C for a time 24 h with various concentrations of CHE in saline. To evaluate sensitivity
to CHE, yeast cultures were exposed to concentrations verging from 5 to 40 mg/mL. To
verify mutagenicity and recombinogenisis, cells were pretreated with non cytotoxic
concentrations of CHE. After CHE exposure cells were washed in saline, plated in
appropriate dilution for phenotypic analysis of determination survival or mutagenesis or
recombinogenisis.
2.3.3. Sensitivity assay in yeast wild and mutant isogenic strains
Post-treatment, the cells were diluted in 1:10 steps in sterile saline and 5 µL of each
dilution (suspensions containing from 107 to 103 cell/mL) was placed on surface of solid
SC solid medium. Cellular growth on SC was determined after 5 d incubation at 30ºC.
Photos were taken using a Canon PowerShot G10 camera. Photos represent one of at
least three independent experiments with similar results.
For survival determination, suitable aliquots were plated in triplicate on solid SC, plates
were incubated at 30°C for 2-3 days before counting the colonies. Presented results are
the mean of at least three independent experiments and error bars represent standard
deviation as calculated by GraphPad Prism® program.
2.3.4 Detection of induced mutation and mitotic recombination
Haploid strain XV185-14c was used for assaying mutagenicity. After CHE exposure, cell
survival was determined on SC (3–5 d, 30 °C), and mutation induction (LYS, HIS or HOM
revertants) on the appropriate omission media (7–10 d, 30 °C). Strain XS2316 (2 x 107
74
cells/mL) was used for analysis of mitotic recombination. After CHE treatment, appropriate
dilutions of cells were plated onto SC plates to determine cell survival, and colonies grown
on SC-leu and SC+cyh were scored for intragenic mitotic recombination (gene conversion)
and intergenic recombination (crossing-over), respectively. Assays were repeated at least
four times, and plating was performed in triplicate for each dose. CHE exposure
concentration in mutagenesis assay was 0.5 - 2.5 mg/mL and 2 - 8 mg/mL for
recombinogenisis. Assays were repeated at least three times, and plating was performed
in triplicate for each dose.
2.4 Salmonella/microsome mutagenicity assay
Salmonella typhimurium strains TA98 and TA100 were kindly provided by B. M. Ames
(University of California, Berkeley, CA, USA). Mutagenicity was assayed by the
preincubation procedure. The S9 metabolic activation mixture (S9 mix) was prepared
according to Maron and Ames (1983). Briefly, 100 µL of test bacterial cultures (1-2 x 109
cells/mL) were incubated at 37 oC with different amounts of CHE in the presence or
absence of S9 mix for 20 min, without shaking. Subsequently, 2 mL of soft agar (0.6%
agar, 0.5% NaCl, 50 µM histidine, 50 µM biotin, pH 7.4, 46oC) were added to the test tube
and poured immediately onto a plate of minimal agar (1.5% agar, Vogel-Bonner E medium,
containing 2% glucose). Aflatoxin B1 (1 µg/plate) was used as positive control for all
strains in the presence of metabolic activation (with S9 mix). In the absence of metabolic
activation, 4-nitroquinoline-oxide (4-NQO, 0.5 µg/plate) was used for strain TA98 and
sodium azide (1 µg/plate) for strain TA100. Plates were incubated in the dark at 37 oC for
48 h before counting the revertant colonies.
2.5 CHE cytotoxicity in eucaryotic cells
75
V79 cells were maintained in tissue-culture flasks at 37◦C in a humidified atmosphere
containing 5% CO2, and were harvested by treatment with 0.15% trypsin and 0.08% of
EDTA PBS. Cells (2 × 105 cells) were seeded into each flask and grown/incubated 1 d
prior to treatment.
The concentrations used for each sample were based on trypan blue exclusion, which was
determined as described by Robichova and Slamenova (2002). Treated and washed, as
well as control V79 cells were trypsinized, stained with trypan blue (0.4%), and the number
of viable (uncolored) and dead (colored) cells was counted. The ratio of number of viable
cells/all cells results in the percentage of viable cells. Dose was considered cytotoxic when
cell survival was <70%.
2.6 Comet assay
The Comet Assay was performed based on the protocol proposed by Singh et al. (1988).
Briefly, a cell suspension of 20 µL of cell culture in 1 mL of RPMI 1640 was exposed to 20
µL of CHE (final concentration of 0, 625 to 5 µg/mL, 1 h, 37 °C), 15 µL of that cell
suspension were mixed with 90 µL of low-melting agarose, in a micro-centrifuge tube. The
cell suspension was transferred to an agarose pre-coated glass slide, covered with a glass
cover slip (22 mm x 66 mm), and immediately placed in a refrigerator (4 °C) for 5 min to
allow complete agarose solidification. Slides were prepared in duplicate and coded.
Cover slips were then removed and the slides immersed in cold (4 °C) lysing
solution (2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris with 1% (v/v) Triton X-100 and
freshly added 10% DMSO pH 10), protected from light for at least 8 h. Cells were exposed
to alkali (300 mM NaOH/1 mM Na2EDTA, pH >13, 30 min, 4°C), to allow DNA unwinding
and expression of alkali-labile sites. For electrophoresis, an electric yield of 78 V/cm was
applied for 25 min at 4 °C. After electrophoresis, the slides were neutralised and silver
stained (Nadin et al., 2001). One hundred cells were scored visually according to the tail
76
length and the amount of DNA present in the tail. Each comet was given an arbitrary value
of 0–4 (0, undamaged; 4, maximally damaged), as described by Collins et al. (1995).
Damage score was thus assigned to each sample and can range from 0 (completely
undamaged: 100 cells x 0) to 400 (with maximum damage: 100 cells x 4). International
guidelines and recommendations for the comet assay consider that visual scoring of
comets is a well-validated evaluation method as it is highly correlated with computer-based
image analysis (Collins et al., 1995; Burlinson et al., 2007).
2.6 Statistical analysis
The results were analyzed by the Salmonella Statistic Assay (Environmental
Monitoring System Laboratory, EPA - Software Version 2.3, April 1988). A test substance
was considered mutagenic when significant dose-response and ANOVA variance were
observed, and the increase in the mean number of revertants on test plates was at least
twice higher than that observed in the negative control plates.
3. Results and Discussion
In order to know the interaction of CHE with S. cerevisiae, we performed sensitivity
experiments. The range of lethal CHE concentrations on yeast was determined in a drop
test using different haploid strains. The mutant strain fet3∆ showed high sensitivity to 10
mg/mL CHE exposure as compared to the WT control, whereas mutant alleles fre1∆ and
ntg2∆) did not confer sensitivity to the same CH exposure (Fig. 1).
In order to quantify the drop test results for CHE-sensitive strains, we determined survival
kinetics of haploid yeast strains. We observed that STAT yeast cells harboring fet3∆ and
aft1∆ mutant alleles were sensitive to 10 mg/mL CHE as compared to the isogenic WT
that showed some 85% survival, while fet4∆ and zap1∆ mutants had WT-like survival (Fig.
2). Several transition metals, such as zinc (Zn), iron (Fe), manganese (Mn), or copper
(Cu) are essential micronutrients for all organisms, used in redox processes, regulation of
77
osmotic pressure, and also are essential components of enzymes. However, transition
metals in high concentration can damage the structure of DNA, cell membranes and may
change enzymes specificity (Rutherford and Bird, 2004). We found that CHE contains a
high amount of Fe, followed by Mn and Zn, with intermediate proportions of Cu (Table 2).
In theory, the most simple and effective cellular strategy to avoid toxic intracellular
concentrations of metals is to eliminate the channels or transporters responsible for their
uptake by the membrane (Eide and Guerinot, 1997). Metals may enter into the cytoplasm
through multiple transporters; however the absence of even only one of these transport
routes may already disturb the normal metal metabolism of the cells (Pócsi, 2011).
Since it was unknown if CHE interacted with DNA we chose the unicellular eukaryotic
organism S. cerevisiae to determine whether CHE produce DNA damage and whether this
induces mutagenesis and recombination.
The haploid yeast strain XV185-14c was used for assaying mutagenicity, as it permits the
detection of two types of locus-specific (reversion of the lys1-1 ochre or his1-7 missense
alleles) and frameshift mutations (hom3-10) (Von Borstel et al., 1971). Our experiments
clearly show that CHE was not able to induce mutations (in concentrations of 50 to 200 µg/
mL), neither in alleles allowing locus-specific mutation nor to frameshift sensitive allele
hom3-10 it also did not significantly reduce cell viability as compared to the negative
control (Table 3).The percentage of survival among the different treatments ranged
between 78.9 and 99.8% compared to the negative control. Only the positive control
treatment with 4NQO (0.5 µg/mL) was significantly different, with 65.5% survival.
Possible recombinogenic effects of CHE were investigated by using the diploid yeast strain
XS2316, which allows the detection of two-forms of mitotic recombination (crossing-over
and gene conversion). The recombinogenic effect of CHE was assayed using diploid LOG
cells held under either growth or non-growth (saline) conditions (Table 4). CHE-exposed
78
cells were grown on SC medium, yielding results of cell survival. Colonies grown on SC-
leu and SC+cyh were scored for intragenic recombination (gene conversion) and
intergenic recombination (crossing-over), respectively. CHE did not induce any
recombinogenic events in diploid LOG cells. However, we observed an increase in mitotic
crossing-over for almost all doses of CHE-exposure in STAT cells in relation to negative
control. In order to eliminate possible revertants to cycloheximide-resistance resulting from
mutation at the CYH2 locus, resistant colonies were replica-plated on a series of plates
with SC–Lys, SC–Met and SC–Ade media for screening the recombination of cyh2
homozygocity.
Possible mutagenicity in prokaryotes exposed to CHE was determined in the Ames test
using S. typhimurium strain TA98 that detects frameshift mutations based on the reversion
of this strain from His− to His+ (Table 5). The CHE dose range was determined in a range
finder experiment with strain TA100 with and without metabolization, and cytotoxicity was
not observed at concentrations up to 5,000 µg/plate (data not shown). In mutagenicity
assays CHE doses ranging between 1,000-5,000 µg/plate were used. The extract was not
mutagenic in strain TA98 (detects frameshift mutation in the DNA target –C–G–C–G–C–
G–C–G) in the absence or presence of metabolic activation. Also, no mutagenicity was
seen in strain TA100 detecting base pair substitutions (Leucine [GAG] by Proline [GGG]) in
the absence or presence of metabolic activation. Results, therefore, indicated that CHE in
exposure doses up to 5 mg/mL was not mutagenic in the Salmonella/microsome assay.
The ability of CHE to damage DNA in mammalian cells was estimated by the Single Gel
Electrophoresis Test (Comet assay) in which the tail length (the comet) indicates the extent
of migration of the genetic material in the direction of the anode is giving an estimate of
DNA damage, particularly of the extent of DNA strand breaks. CHE exposure
concentrations of up to 10 µg/mL did not reveal significant DNA breakage (genotoxicity)
79
(Fig. 3A and 3B) as comets were not significantly altered when compared to the controls.
Our results indicate that CHE-exposure does not induce genotoxic or comutagenic effects
in V79 cells.
4. Conclusion
In summary, our results show that CHE in the applied exposure concentrations, was not
genotoxic in our pro- and eukaryotic microbial and mammalian test systems.
Acknowledgements
Research financed by CNPq. R.X.S. and D.O. held CNPq fellowships. G.G. is grateful to
CNPq and CAPES for financial support. M.B. is visiting professor at UESC.
80
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83
Figure caption
Table 1. Yeast strains used and their relevant genotypes
Strains Genotype Protein lacking Source
DY1457 Mata: ade6 can1∆100oc his3 leu2 trp1 ura3 none David J Eide
DEY1394 Like DY1457 except fet3Δ::His3 Class of integral membrane multicopper oxidases
David J Eide
DDY33 Like DY1457 except fet4Δ::Leu2 Low-affinity Fe(II) transporter of the plasma membrane
David J Eide
DEY1524 Like DY1457 except aft1Δ::Trp1 Transcription factor involved in iron utilization and homeostasis
David J Eide
ZHY6 Like DY1457 except zap1Δ::Trp1 Zinc-regulated transcription factor
David J Eide
BY4741 Matα his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura 3∆0 none Euroscaf
Ntg2 Like SJR753 except ntg2Δ::hisG DNA N-glycosylase and apurinic/apyrimidinic (AP) lyase; involved
in base excision repair
Swanson et al., 1999
∆Fre1 Like BY4741 except fre1∆::His3 Ferric reductase and cupric reductase
Dennis J Thiele
ctt1∆ Like SOD+ except ctt1∆::TRP1 cytosolic catalase T Gralla, Los Angeles
XV185-14c MATα: ade2∆2 his1-798 lys1∆1 trp5-48 hom3-10 arg4-17 none Von Borstel et al., 1971
XS2316 MATα + leu1-1 trp5-48 + + + his1-208 none Machida & Nakai (1980)
MATα ade6 leu1-12 + cyh2 met13 lys5-1 his1-208
84
Table 2. Chemical composition of CHE.
Minerals (mg/dm- (mg/dm- (mg/dm-3)
Fe 1155.0 ± 19.1
Zn 134.0 ± 2.5
Cu 58.6 ± 1.1
Mn 292.1 ± 1.3
Results are the mean of triplicate measurements ± SD.
85
Figure 1. Sensitivity of haploid yeast strains to CHE
Yeast strains: A: control, B: CHE exposure (condicionn 24 h, 30 oC). 1. BY4741; 2. ctt1∆; 3. fre1∆; 4. ntg2∆; 5. fet3∆.
86
A B
Figure 2. Sensitivity to CHE of haploid STAT yeast cells.
Cells were diluted in saline. (⧫) WT; (♢)zap1∆ (◯)fet3∆; (☐)fet4∆ (∆)aft1∆
87
Table 3. Indution of point mutation (his1-7), 0chre allele (lys1-1) and frameshift (hom3-10)
mutations in haploid XV185-14 strain of S.cerevisiae after CHE treatments.
Agent Treatment (µg/mL)
Survival (%)His1/107
survivorsa
Lys1/107 survivorsb
Hom3/107 survivorsb
Stationary phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%
4NQOd 0. 5 65.1±2.4 48.2±10.9*** 11.6±3.4 4.2±0.9
NC c 0 100e 9.9±4.0e 4.2±0.8e 3.0±0.9e
CHE 50 92.3±3.7 10.8±3.4 3.9±0.9 2.1±0.5
100 80.0±7.7 11.4±4.0 4.1±0.7 2.3±1.2
200 78.9±8.3 9.8±3.0 2.8±0.7 2.1±0.4
Exponential phase - Cells treated in NaCl 0.9%phase - Cells treated in NaCl 0.9%phase - Cells treated in NaCl 0.9%phase - Cells treated in NaCl 0.9%
4NQO 0. 5 99.1±1.72 52.2±3.8*** 16.6±0.1 6.2±0.7
NC 0 100 14.0±0.2 2.6±0. 4 0.9±0.25
CHE 50 97.6±3.3 18.0±0.6 2.5±0.07 2.2±0.07
100 99.8±0.2 13.0±0.1 2.2±0.02 3.3±0.5
200 99.1±0.2 7.0±0.4 0.8±0.02 1.9±0.9
a Locus-specific revertants; b Locus-nonspecific revertant (forward mutation); c Negative control (solvent); d Positive control; e Mean and standard deviation per three independent experiments. * Significantly different from the negative control at P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001/ one-way ANOVA-Tukey’s multiple comparison test.
88
Table 4. Effects of CHE in diploid XS2316. Induction of crossing-over (+/cyh2) and gene
conversion (leu-1/leu1-12)
Agent Treatment (µg/mL)
Survival (%) Crossing-over/105
survivorsa
Gene conversion/105
survivorsb
Stationary phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%phase - Cells treated in NaCl 0,9%
4NQOc 0.5 97.5±3.5 106.8±2.5 44.3±2.9
NC b 0 100e17.7±0.3
e 2.8±1.5
e
CHE 200 99.5±0.6 35.4±4.2 1.7±1.5
400 95.6±6.2 36.4±4.3 3.6±1.4
800 95.0±7.0 40.9±3.8 1.1±0.7
Exponential phase - Cells treated in NaCl 0.9%phase - Cells treated in NaCl 0.9%phase - Cells treated in NaCl 0.9%phase - Cells treated in NaCl 0.9%
4NQO 0.5 84.3±1.7 153.8±2.5 39.1±6.1
NC 0 100 12.3±0.9 4.2±2.4
CHE 200 99.5±0.7 18.0±0.5 5.2±3.6
400 79.3±23.3 26.0±0.2 6.1±1.7
800 89.7±3.1 22.2±2.2 2.9±0.5
a Mean and standard deviation per three independent experiments; b Negative control
(solvent); cPositive control.
89
Table 5. Induction of his+ revertants in S. typhimurium strains by CHE with and without metabolic activation (S9 mix)
S. typhimurium strainsS. typhimurium strainsstrains
Agent Concentration
(µg/plate)
TA100 TA98
Rev/platea MIb Rev/platea MIb
Without metabolic activation (-S9)Without metabolic activation (-S9)Without metabolic activation (-S9)
NCc - 125.3±4.6 - 22.3±4.5 -
CHE 1000 104.3±6.4 0.83 26.0±2.0 1.17
2000 101.0±14.8 0.81 20.7±3.5 0.93
3000 103.7±11.7 0.83 22.0±4.4 0.99
4000 112.3±3.5 0.90 19.3±1.5 0.87
5000 114.3±13.0 0.91 18.3±9.0 0.82
PCd 0.5 (4NQO)
1 (NaN3)
468.0±46.9*** 3.74 182.3±30.6*** 8.18
With metabolic activation (+S9)With metabolic activation (+S9)With metabolic activation (+S9)
NCc - 156.3±13.2 - 23.7±1.5 -
CHE 1000 157.7±12.7 1.01 22.3±0.6 0.94
2000 161.0±15.4 1.03 27.0±4.4 1.14
3000 160.3±5.3 1.03 22.5±6.4 0.95
4000 157.0±23.1 1.01 21.7±5.9 0.92
5000 152.0±8.0 0.97 27.0±6.6 1.14
PCd 1 (AFB1) 454.0±144.8* 2.90 764.7±130.1*** 32.3
aNumber of revertants/plate: mean of three independent experiments ± SD; bMI: mutagenic index (nº. of his+ induced in the sample/nº. of spontaneous his+ in the negative control); cNC: negative control distillated water (10 µl) used as a solvent for the extract; dPC: positive control (-S9) sodium azide to TA100; 4-NQO to TA98; (+S9) aflatoxin B1. *Data significant in relation to negative control p<0.05; *** p<0.001.
90
Figure 3. DNA damage measured in CHE exposure. A) Results are expressed by the index of the damage (tail size) in comets formed and B) The results were expressed as olive tail moment. Data are expressed as mean ± SD (n=6)
A
B
91
4. CAPÍTULO III
5. DISCUSSÃO GERAL
A geração de resíduo está ligado ao setor produtivo de uma cultura
agrícola. O processo agro industrial tem como finalidade transformar a matéria-
prima em produto, no entanto, como resultado dessas atividades surgem os
subprodutos residuais, cuja recuperação é na maioria das vezes, indesejável, pois
acarreta ônus a empresa (LIMA, 1975).
O aproveitamento de resíduo agro industrial é uma forma de evitar danos
ao manejo da cultura, riscos à saúde pública, agregar valor a produção, minimizar
os impactos ambientais adversos e seria ainda uma maneira de aproveitar a
matéria-prima orgânica. De acordo com Pelizer et al. (2007), os resíduos de
plantas podem conter muitas substâncias de alto valor nutricional e se
manipulados com uma metodologia adequada, esses materiais podem ser
transformados em produtos comerciais ou matérias-primas para processos
diversos.
Os compostos orgânicos dos resíduos são potenciais para se obter
substâncias bioativas (GLÓRIA, 1992). Mas, para tanto os compostos orgânicos,
na sua grande maioria, necessitam sofrer transformações para que adquiram
condições compatíveis com aquilo que se deseja produzir.
O processo de fermentação em materiais orgânicos vegetais, sob
determinadas condições de umidade e temperatura, pode produzir substâncias
com atributos físicos, químicos e biológicos superiores àqueles encontrados nos
materiais utilizados inicialmente no processo (ZENI & PENDRAK, 2006).
A fermentação, processo pelo qual foi obtido o extrato da casca do fruto do
cacau, é um meio de transformação de materiais grosseiros em extratos ricos em
carbono orgânico, de macro e micronutrientes essenciais para o desenvolvimento
das plantas como o nitrogênio (N), fósforo (P), cálcio (Ca), magnésio (Mg) entre
outros.
Por esta razão, um montante de casqueiro, quando tratados corretamente,
não representam um lixo orgânico, mas é uma maneira estratégica de fornecer
condições adequadas aos microrganismos para desencadear o processo de
91
fermentação e realizar transformações microbianas ou bioconversões de
substâncias com valor biotecnológico.
Para a produção de um extrato por fermentação, o processo deve
apresentar algumas etapas muito importante, como as que foram realizadas para
a obtenção do extrato da casca do fruto do cacau. As cascas do cacau foram
separadas de materiais resíduais do ambiente e acondicionadas em um local
higienizado (lona de plástico) para ser feito o extrato. Em seguida foram cortadas
em pedaços retangulares de 1,5 a 2,5 cm de largura disposto em camadas com
cerca de 15 cm, a fim de promover a aeração, fator importante para que ocorra
uma fermentação de maneira satisfatória do material orgânico. Quanto maiores
forem as partículas da fermentação, mais demorado será o processo. As
camadas de cascas de cacau foram umedecidas vagarosamente, mantendo a
umidade em torno de 50 a 60%, pois as bactérias e fungos necessitam de água
para o metabolismo microbiano (COSTA, 1994). A cada 15 dias as camadas eram
revolvidas, para evitar fermentações indesejáveis, pois estas acentuam a perda
de nitrogênio além de desprender odores desagradáveis que são atrativos para
insetos, e para impedir a formação de temperaturas altas. Como resultado da
ação dos microrganismos na decomposição da matéria orgânica, ocorre a
liberação de calor elevando a temperatura do meio. Um valor de temperatura ideal
segundo Gomes e Pacheco (1988), é de 60 a 70oC o que, que inclusive, promove
a destruição de organismos não fermentadores. E assim, por volta dos noventa
dias o extrato da casca do fruto do cacau foi produzido.
As análises químicas evidenciaram teores importantes de macro e
micronutrientes no extrato da casca do fruto do cacau (Tabela 3 - CAPÍTULO I).
Os valores encontrados demonstram que este extrato apresenta nutrientes de
grande validade para suprir a necessidade de elementos requerida pelas plantas,
os quais em alguns solos encontram-se em teores muito baixos. Sendo que entre
os elementos conhecidos como essenciais para o crescimento vegetal, o
nitrogênio, o fósforo e o potássio são geralmente os mais deficientes nos solos
agrícolas (COSTA, 1994). Além disto, na maioria dos tipos de solos é observado
alguma deficiência nutricional, principalmente de micronutrientes como, por
92
exemplo, o zinco (Zn). Por tanto, a produção de um extrato rico como o extrato da
casca do fruto do cacau, pode proporcionar adições de nutrientes particularmente
N, P e K de modo onde os nutrientes possam ser disponibilizados para as culturas
agrícolas, como observado na tabela 2 (CAPÍTULO I).
O extrato da casca do fruto do cacau, aplicado no solo como fonte de K
resultou em aumento significativo no teor de K e nível crítico foliar de 32,1 g kg-1.
para atingir 90% da produção de massa seca da parte aérea. Prado et al. (2004),
obteve respostas quadráticas à aplicação de potássio em mudas de
maracujazeiro com nível crítico foliar de 38,5 g kg-1. O modelo quadrático
apresentado na Tabela 2 (CAPÍTULO I) indica alta preditividade de um modelo
ajustado. As variáveis massa seca da parte aérea (MSPA), altura da planta (AP) e
diâmetro do caule (DC) mostraram respostas quadráticas e significativas às doses
de K (Tabela 1 - CAPÍTULO I). O desenvolvimento das mudas de cacau tratadas
com extrato da casca do fruto do cacau concordam com os resultados de Nunes
& Leal (2001) que também verificaram maior desenvolvimento vegetativo de
mudas de tomateiro pulverizadas com extrato obtido da fermentação
metanogênica da matéria orgânica e água.
Por outro lado, não foi verificada respostas significativas de crescimento
para as raízes, mas se observou a redução de massa seca para as pivotantes e
secundárias na dose 1000 mg em comparação com as doses 125 e 250 mg
respectivamente (Tabela 1 - CAPÍTULO I). No entanto, considerando que o K
presente no extrato pode elevar a salinidade do solo, era de se esperar que as
altas concentrações de K no solo, levassem as raízes a crescer menos e
apresentar deformações como resposta das plantas aos ajustes no ambiente. Nos
ambientes salinos, o crescimento, a absorção de água e nutrientes das raízes
ficam comprometidas, porque diminui o potencial osmótico próximo à rizosfera,
dificultando o transporte dos íons até as raízes (MARSCHNER, 1995; KOYRO &
EISA, 2008).
Embora exista pouco estudo sobre a composição deste tipo de extrato,
sabe-se que os mesmos possuem todos os elementos necessários para a
nutrição vegetal, podendo variar na composição e concentração de seus
93
nutrientes (SODRÉ, 2012). Sendo que a composição deste tipo de extrato, está
diretamente associada com a matéria-prima a ser fermentada, com o período e o
tipo de fermentação (aeróbica e/ou anaeróbica), bem como com as características
dos microorganismos fermentadores.
O extrato CHE além de uma fonte suplementar de macro e micronutrientes
para as plantas, apresentou também efeitos antimicrobianos (Tabela 4; Figura 1, 2
e 3 - CAPÍTULO I; Figura 2, Tabela 1 e 2 - CAPÍTULO II). Pulverizações com
extrato de produto de fermentação foi realizada em mudas de Passiflora edulis,
na qual induziu maior altura, diâmetro, número de ramos, número de flores, de
frutos, contribuiu também para uma cultura de maracujazeiro, livre de doenças
fúngicas e bacterianas (COLLARD et al., 2000). Pinheiro & Barreto (1996), Nunes
& Leal (2001), sugere que ação direta deste tipo de extrato, sobre os fitoparasitas
é devido à presença de substâncias tóxicas no extrato. A ação tóxica do extrato
provavelmente é resultado da presença de metabólitos antimicrobianos
produzidos ou transformados durante o metabolismo microbiano (TRATCH &
BETTIOL, 1997; DELEITO, 2002).
Os agentes antimicrobianos podem agir sobre organismos patogênicos
susceptíveis, atuando de várias maneiras e de intensidade diversas, sobre a
parede celular e/ou membrana celular, sobre a atividade enzimática ou estruturas
do protoplasma, bloqueando certas reações enzimáticas ou sínteses de enzimas
na célula microbiana, interrompendo seu crescimento e reprodução (efeito
bacteriostático) e/ou induzir a morte do organismo (efeito bactericida e fungicida)
(CHOPRA et al., 2002; MCDERMOTT et al., 2003). Estes efeitos podem surgir da
interferência direta ou indireta sobre as vias metabólicas dos microrganismos
podendo alterar desde a permeabilidade (membrana externa) até os processos de
síntese (parede celular, ácido fólico, DNA, RNA e proteínas) (CHOPRA et al.,
2002; FLUHR et al., 2010).
Como observado na Tabela 4 (CAPÍTULO I) e na tabela 1 (CAPÍTULO II) a
ação do CHE foi mais efetivo nas cepas bacteriana Gram-negativas. Nestas
cepas microbianas (Gram-negativas) existem duas membranas, uma na face
externa da parede celular e outra na face interna. Sendo que, na membrana que
94
antecede a parede bacteriana existem proteínas denominadas porinas de
característica hidrofílica, que facilitam a entrada de substâncias polares para o
espaço periplasmático (EUMKEB et al., 2010). Assim, a composição estrutural
membranar destas bactérias, podem ter contribuído para entrada de compostos
polares de CHE de ação antibacteriana. A permeabilidade das substancias e/ou
dos compostos bioativos, influenciam diretamente na ação do antibacteriano.
Brown (2004) e Buynak, (2004), durante experimentos verificaram que alguns
antibacterianos (meticiclina e a oxacilina) foram inativos contras as bactérias
Gram-negativas, por não conseguirem ultrapassar a membrana externa destas
bactérias, impedindo a difusão das substancias bioativas ao seu alvo no interior
celular. Hennebele et al., (2008) sugere que geralmente os extratos com efeitos
antimicrobianos de caráter polar ou de média polaridade apresentam ação
bioativa antibacteriana em bactérias Gram negativas.
Afim de purificar a/as substancia(s) bioativa (s) para detectar melhor
inibição antibacteriana, principalmente contra P. aeruginosa e S. choleraesuis,
realizou-se o fracionamento de CHE e posteriormente, seguiu-se
experimentações das frações obtidas com as linhagens bacterianas (Figura 5 -
CAPÍTULO I e Tabela 3 - CAPÍTULO II). Nos resultados obtidos encontrou-se
duas frações ativas (CHE8 e 12: Figura 3-CAPÍTULO I e Tabela 2-CAPÍTULO II )
contra S. choleraesuis, no entanto, as análises mostraram que, todas as frações
testadas foram inativas contra P. aeruginosa, visto que esta linhagem foi sensível
ao extrato bruto (tabela1). Acredita-se que o efeito de CHE sobre P. aeruginosa,
tenha sua ação de modo sinérgico, ou seja, sua atividade é dependente da
interação de dois ou mais compostos, em vez de cada componente separado
(VAREL, 2002).
Em contra partida a atividade antibacteriana in vitro contra S. epidermidis
não foi observado para o extrato CHE nas doses testadas, mas antibacteriana
moderada para uma fração (CHE 9: Figura 3-CAPÍTULO I e Tabela 2-CAPÍTULO
II). Sugere-se então que as substâncias ativas estavam presentes no extrato
bruto, mas em concentrações em que a bioatividade não era detectável ou estava
suprimida por outras substâncias. Visto que nas matrizes complexas podem
95
conter uma mistura de substancias tóxicas e protetoras que podem atuar
simultaneamente.
O CHE mostrou-se bioativo não somente contra bactérias, mas também
aos fungos, S. cerevisiae e o fungo basidiomiceto M. perniciosa que causa
grandes prejuízos às lavouras cacaueira (Figura 1 e 2: CAPÍTULO I; Figura 2:
CAPÍTULO II). A ação de CHE em M. perniciosa, acredita-se que possa estáar
relacionada os compostos fenólicos. Altas concentrações de fenóis foi verificada
em folhas maduras em SCA um clone resistente a M. perniciosa por Nojosa
(2002) é importante salientar que a infecção do cacaueiro por M. perniciosa
ocorre geralmente em tecidos jovens (tecido pelo qual a incidência de fenóis são
menores no cacaueiro) (NOJOSA, 2002). Comparando-se os dados referentes à
atividade antifúngica de extrato CHE e o teor de fenólicos encontrado em clones
resistentes do T. cacao por Nojosa (2002), é possível inferir que os fenólicos
estejam relacionados ao potencial antifúngico do extrato CHE (Figura 2:
CAPÍTULO I e CAPÍTULO II).
Em análises fitoquímicas preliminares do CHE detectou-se a presença de
compostos fenólicos (Figura 5: CAPÍTULO I; Tabela 3: CAPÍTULO II). Estes
compostos fenólicos têm se destacado como importante antimicrobiano para
várias culturas, devido seus efeitos tóxicos e/ou atuação sobre enzimas, por
exemplo, as catequina, galocatequina e isoquercitina presentes nas plantas de
Gossypium hirsutum, o algodão (NICHOLSON, 1992; SCHWAN-ESTRADA et al.,
2008).
Nas análises fitoquímicas preliminares do CHE e frações (Figura 5:
CAPÍTULO I; Tabela 3: CAPÍTULO II) revelaram a presença de compostos
secundários, pertencentes principalmente ao grupo dos fenólicos e alcalóides.
Estes compostos tem sido descritos na literatura como substâncias de importante
atividade antimicrobiana (GURIB-FAKIM, 2008) onde seus mecanismos de ação
envolvem inibição da síntese de ácidos nucléicos, inibição das funções da
membrana citoplasmática e inibição do metabolismo energético (CUSHNIE &
LAMB, 2005). Substâncias destes grupos podem apresentar ação de acordo com
96
a sua concentração e/ou as espécies de bactérias estudadas (MATASYOH et al.,
2009). Dessa forma, é possível supor que estes grupos contribuíram para a
atividade antimicrobiana decorrente do composto das cascas do cacau, CHE
extrato e CHE frações, principalmente os compostos fenólicos.
A fração de maior atividade teve seu perfil demonstrado pela técnica de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e métodos espectroscópicos como,
Infra-Vermelho (IV), espectrometria de massas (LC-MS) e Ressonância Magnética
(anexo). No entanto, pela inconsistência dos dados não foi possível determinar
estruturalmente a (s) substância (s) bioativa (s) de ação antimicrobiana.
No capitulo III (Figura 1 e 2) foi verificado a sensibilidade dos mutantes
defectivos em sistemas de transporte dos metais Fe, Zn e Cu. Os mais sensíveis
quando comparados com a linhagem selvagem foram os mutantes fet3 e aft1
que apresentaram resultados mais acentuados.
Os metais são essenciais e fundamentais para processos metabólicos dos
microrganismos, esses micronutrientes estão presentes como cofatores para
inúmeras enzimas e exercem papel estrutural em um grande número de
proteínas. No entanto, estes metais podem ser tóxicos, se os níveis de captação e
distribuição não forem regulados, uma vez que o excesso pode comprometer as
funções celulares (EIDE et al., 2003). Os elevados níveis, desses metais
essenciais encontrado no extrato das cascas do fruto do cacaueiro (Tabela1:
CAPITULO III), pode ocasionar danos às membranas celulares, modificar a
especificidade de enzimas, interferir nas funções das células e provocar danos à
estrutura do DNA (BEYERSMANN & HARTWIG, 2008).
Usualmente, os microrganismos podem utilizar vários mecanismos de
resistência a metais, de modo a lhes permitirem a sobrevivência em ambientes
com elevada concentração de metais ou contaminados com metais pesados
(WALDRON & ROBINSON, 2009). Os mecanismos mais descritos para
resistência da célula são: (I) exclusão do metal através de uma barreira de
permeabilidade; (II) ativação de bombas de efluxo; (III) “sequestro” do metal
intracelular; e (IV) redução enzimática e redução da sensibilidade dos alvos
97
celulares em relação aos íons metálicos. Entretanto, as linhagens utilizadas neste
estudo (Tabela 1: e Figura 2: CAPITULO III), apresentavam deficiência para
realização destes mecanismos, visto que eram mutantes defectivos em sistemas
de transporte dos metais Fe, Zn e Cu e seus respectivos fatores de transcrição.
Portanto, para a sobrevivência dos organismos naturais, os mesmos
devem manter as concentrações citoplasmáticas de cobre, ferro e zinco em níveis
não tóxicos, para que esses metais sejam apenas suficientes para o crescimento
celular e participação em processos metabólicos vitais.
No capitulo III (Figura 4, Tabela 5 e 6: CAPITULO I; Tabela 3, 4 e 5; Figura
3 A e B: CAPITULO III) pode-se observar que o CHE não foi capaz de induzir
genotoxicidade nas linhagens de S. cerevisiae, nas cepas de S. typhimurium e
nem em células de mamíferos em nenhuma das doses testadas. Sendo que na
Tabela 5 para a linhagem de S. typhimurium TA100 o ensaio com CHE mostrou o
número de revertentes em alguns lócus menor que no controle (dose zero de
extrato), mostrando que o extrato deve ter substâncias capazes de diminuir a
própria mutagênese espontânea da linhagem.
Quando as células de mamíferos foram expostas às concentrações do
CHE (Figura 3 A e B), a maioria das células não apresentaram danos no DNA
quando comparado com o controle.
Os resultados aqui descritos não descartam a possibilidade de ação
genotóxica relacionada à CHE, nas condições dos testes avaliados neste
trabalho. Segundo Maron & Ames (1983), um resultado negativo no “spot test”
não é indicação suficiente da não genotoxidade de um composto, assim como o
resultado positivo também não é suficiente para indicar a genotoxidade, sem que
estes resultados estejam em concordância com vários outros testes de análise.
No entanto, o fato de CHE não indicar atividade genotóxica torna-o bastante
interessante na identificação de substâncias biologicamente ativas no extrato de
cascas de cacau.
98
6. CONCLUSÕES GERAL
Os resultados obtidos no desenvolvimento do trabalho permitiram concluir que:
É possível usar o composto proveniente da casca do fruto de T. cacao como fonte
de potássio 391,6 mg de K dm-3 de solo. Em função de sua composição, facilidade de
produzir e aplicar o composto, possibilita usá-lo como biofertilizante na produção de
mudas de cacaueiro, além de agregar valor ao resíduo gerado nas lavouras do cacau.
O extrato da casca do fruto de T. cacao tem potencial antifúngico contra os fungos
M.perniciosa e induz sensibilidade em mutantes específicos de S.cerevisiae envolvidos
com o transporte de metais bem como é eficaz contra as bactérias patogênicas Gram
negativas P. aeruginosa S. choleraesuis. Frações do composto também apresentaram
atividade antibacteriana em linhagens de S. choleraesuis (CHE8 e CHE12 - CIM de 1 mg/
mL), S. epidermidis (CHE9 - CIM 2,5 mg/mL). O extrato obtido neste trabalho consiste,
portanto, em uma fonte potencial de identificação de metabólitos antimicrobianos com
aplicação na indústria farmacêutica.
Os alcalóides, terpenos e principalmente os fenólicos parecem ser os constituintes
de maior atividade antimicrobiana, detectados no composto da casca do fruto de T. cacao.
Sugerindo que o composto ou os metabólicos isoladamente sejam os responsáveis pela
atividade antimicrobiana observadas neste estudo.
O composto da casca do fruto de T. cacao não apresentou genotoxicidade perante
os ensaios de Salmonella/microssomo (mutação), S. cerevisiae (mutação, recombinação,
perda de cromossomo) e Teste Cometa (danos ao DNA, quebra de cromossomo), sendo
demonstrado sua possível seguridade de uso para humanos e no meio ambiente.
99
7. PERSPECTIVAS
Seria de extrema importância complementar os dados mostrados nesse trabalho
para uma melhor compreensão dos mecanismos farmacológicos e toxicológicos dos
extratos da casca do fruto de T. cacao:
‣ Identificar as moléculas bioativas, presentes nos extratos de T. cacao,
responsáveis pelo efeito, antifúngico e antibacteriano;
‣ Monitorar via qPCR ou PCR tempo real à expressão de alguns genes
envolvidos no mecanismo de defesa do fungo (transportadores de membrana),
submetidos a diferentes condições de crescimento (com e sem extrato de
cacau);
‣ Caracterizar alterações morfológicas causadas pelos extratos de T. cacao em
linhagens de levedura e M. perniciosa utilizando a microscopia eletrônica de
transmissão e varredura;
‣ Avaliar a sensibilidade de M. perniciosa a frações e extrato do T. cacao em
basidiósporos e hifas monocarióticas;
‣ Verificar o efeito das frações do extrato de T. cacao nas mesmas linhagens de S.
cerevisiae utilizadas neste estudo utilizando outras condições de tratamento:
variando a fase de crescimento e fontes de carbono.
100
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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