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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
SISTEMA REPRODUTIVO DE Lecythis pisonis Cambess
(LECYTHIDACEAE) EM AGROFLORESTAS –CACAU-
CABRUCA– NO SUL DA BAHIA
ACÁCIA BRASIL RODRIGUES
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Março de 2015
i
ACÁCIA BRASIL RODRIGUES
SISTEMA REPRODUTIVO DE Lecythis pisonis Cambess
(LECYTHIDACEAE) EM AGROFLORESTAS –CACAU-
CABRUCA– NO SUL DA BAHIA
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, como parte das
exigências para a obtenção do Título de
Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e Biologia
Molecular.
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Março de 2015
ii
ACÁCIA BRASIL RODRIGUES
SISTEMA REPRODUTIVO DE Lecythis pisonis Cambess
(LECYTHIDACEAE) EM AGROFLORESTAS –CACAU-
CABRUCA– NO SUL DA BAHIA
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, como parte das
exigências para a obtenção do Título de
Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e Biologia
Molecular.
APROVADA: 06 de Março de 2015
______________________________ _____________________________
Drª Daniela Talora Dr. Ronan Xavier Corrêa
(UESC) (UESC)
_______________________________________ ____________________________
Drª Maria Aldete Justiniano da Fonseca Ferreira Dr. Eduardo Mariano Neto
(Embrapa/Cenargen) (UFBA – Co-orientador)
iii
“A mente que se abre à novas ideias nunca mais
volta a seu tamanho original.”
- Albert Einstein -
iv
AGRADECIMENTOS
À Deus pela vida, por tudo que sou e por tudo que posso ser.
À Universidade Estadual de Santa Cruz por oferecer a Pós-graduação tão sonhada e pela
estrutura.
À minha orientadora, Drª Fernanda Amato Gaiotto pela oportunidade que me foi dada,
pela atenção, incentivo, compreensão, pelo exemplo de ser humano e profissional, pela
ajuda com o programa MLTR, além de todos os ensinamentos e orientações científicas.
Ao meu co-orientador Drº Eduardo Mariano Neto por todo apoio ao longo da pesquisa e
principalmente quando foi verificado que não seria possível conseguir um número
amostral adequado de sapucaia nos fragmentos de Mata Atlântica, dando-me
prontamente uma segunda opção de pesquisa para o mestrado.
À Ciro Tavares Neto, meu imenso agradecimento pelo estímulo conjunto a Drª
Fernanda e o Dr. Mariano que possibilitaram o desenvolvimento dessa pesquisa.
Agradeço ainda pelos esforços na coleta dos frutos e posteriormente na germinação das
sementes e pelo compartilhamento de artigos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
incentivo através da bolsa concedida.
Aos professores do PPG-GBM da UESC pela facilitação na compreensão dos mais
variados conteúdos acadêmicos. Meus agradecimentos especiais aos professores Carlos
Priminho Pirovani e Leandro Lopes Loguercio pelas carinhosas palavras de motivação
quando eu mais precisava escutá-las.
Às secretárias do PPG-GBM, Mara, Fabrícia e Kátia por toda compreensão, auxilio e
carinho.
Ao Drº Roberto Tarazi que muito me auxiliou na compreensão dos programas
computacionais utilizados nesse estudo através da disciplina “Práticas computacionais
na análise da estrutura genética de espécies vegetais”. Por todos os ensinamentos
acadêmicos durante a minha iniciação científica, pelo exemplo de pesquisador e de ser
humano e pelo auxilio na construção do resumo do projeto e incentivo antes e durante a
seleção do mestrado.
Ao Leonardo Neves por ter permitido que as sementes de sapucaia germinassem na
RPPN de Nova Angélica e por todo o apoio durante a germinação das mesmas, e à Drª
Camila Righetto Cassano pela atenção e por ter passado o contato do Leonardo.
À RPPN de Nova Angélica pela a estrutura que possibilitou a germinação das sementes.
À Daniela Borges por toda a ajuda com o programa Cervus. Pelas conversas, pelo
exemplo de determinação.
v
À Alesandro Souza Santos por todo o auxílio quando eu o procurava, por ter me
ajudado a compreender o programa Cervus, pelas conversas sobre o mestrado, sobre o
futuro, e pela amizade sincera.
À Flora Bittencourt pela solicitude e ensinamentos iniciais relativos à leitura de picos,
genotipagem e demais procedimentos indispensáveis à consecução dessa pesquisa,
Florinha, muitas vezes você me fez olhar os acontecimentos por um ângulo diferente,
obrigada por isso.
À Júnior por todos os horários nos termocicladores e também no ABI 3500 e por dividir
comigo, sempre me incentivando, a fase em que as genotipagens não ficavam boas.
Ao técnico Horlei Ribeiro pela ajuda fundamental com o analisador genético ABI 3500,
pela dedicação e pronto atendimento nos momentos solicitados durante os
procedimentos da pesquisa e pela sua humildade e tranquilidade em tratar as pessoas
que o cercam.
À toda equipe que compõe o laboratório Marcadores Moleculares pelas conversas
científicas e descontraídas na bancada que me tiraram muitas risadas, e muitas vezes
também me fizeram refletir. Agradeço de coração a Florinha, Rodrigo, Júnior,
Sheilinha, Caio, Ellen, Livinha, Dani França, Dani Borges, Ale, Cláuzio, Andressa e
Elaine.
À minha mãe Jocelma pelo amor, pela preocupação quando os estudos atingiam a
madrugada, por sofrer comigo durante os momentos de dificuldade superados, pelo
cuidado carinhoso. Eu Te amo mãe!
Ao meu pai José pelo amor, por acreditar em mim e pela preocupação atenciosa. Amo o
senhor!
Ao meu noivo Tiago pela cumplicidade e compreensão, principalmente na reta final do
mestrado, pelo olhar carinhoso, pelo amor cuidadoso, por completar e fazer minha vida
ainda mais feliz e plena. Obrigada por estar sempre ao meu lado. Amo você.
À minha irmã e melhor amiga Dayana pela amizade eterna. Nãna, não existem palavras
para descrever o amor que sinto por você e nunca conseguirei te agradecer por tudo que
você fez e faz por mim todos os dias! Obrigada nãna por existir... Você é maravilhosa!
À minha sobrinha Letícia por me motivar a ser uma pessoa melhor, por me ensinar
diariamente a ser forte, por me alegrar com seu sorriso inocente em qualquer momento e
por ser a florzinha linda do meu viver!
À minha madrinha Gildete pelo carinho, compreensão, pela paz que transmite e pelos
valores que muito me inspiram e me fazem admirá-la cada vez mais. Obrigada por ser
um dos meus anjos da guarda.
Aos meus familiares, principalmente meus avós Iracy e José Ancelmo, meus tios e tias,
primos e primas por torcerem pelo meu sucesso.
vi
Ao meu amigo Marcos por todo o auxílio que sempre me deu, seja através de palavras
ou na ação. Meu amigo posso dizer que você é um grande exemplo de disciplina, e foi
através da sua conduta que eu abri os olhos. Obrigada por me ouvir quando eu
precisava, por estar sempre pronto a me ajudar no que for necessário. Você é um
daqueles amigos verdadeiros que fala o que tem que ser dito, mas que sabe como e
quando falar. Obrigada por tudo!
À amiga Alana pela cooperação durante o seminário de tema livre. Sua ajuda foi de
fundamental importância e por sempre se colocar a disposição para me ajudar. Obrigada
por todo o apoio.
A minha amiga e irmã de coração Amanda por me apoiar e acreditar no meu potencial,
pelas conversas, risadas, conselhos e compreensão quando cancelava as visitas por
causa da correria no mestrado. Obrigada mandinha por ser essa amiga irmã sempre
presente e leal.
À minha amiga Greyci por todo companheirismo, preocupação e carinho. Pelas
conversas descontraídas e sérias que tanto me auxiliaram na tomada de decisão.
À Maria Rafaela pela amizade, exemplo de força e honestidade. Você é uma guerreira
linda e inteligente. Obrigada pela companhia. Mesmo distante estarei sempre ao seu
lado.
À Dayse Lara, Thayse, Juliano, Maria Rafaela, Marcos, Ákyla e Ranner pelo
companheirismo. Essa turma (2013.1) só me trouxe bons amigos. Obrigada pelo
carinho, conversas, incentivos, exemplos. Não esquecerei vocês!
À todos que direta ou indiretamente me ajudaram a alcançar esse momento importante e
sonhado.
Muito Obrigada!!
vii
ÍNDICE
EXTRATO ..................................................................................................................... ix
ABSTRACT ................................................................................................................... xi
1. INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 4
2.1. A biodiversidade de espécies arbóreas presentes na Mata Atlântica do sul da
Bahia ............................................................................................................................. 4
2.2. O sistema agroflorestal cacau-cabruca no sul da Bahia ......................................... 5
2.3. Sistema reprodutivo em plantas ............................................................................. 7
2.4. Lecythis pisonis Cambess (Lecythidaceae) .......................................................... 10
2.5. Marcadores microssatélites .................................................................................. 13
3. CAPÍTULO I: FIRST MICROSATELLITE MARKERS FOR Lecythis pisonis
(LECYTHIDACEAE), AN IMPORTANT RESOURCE FOR BRAZILIAN
FAUNA .......................................................................................................................... 16
4. CAPÍTULO II: SISTEMA REPRODUTIVO DE Lecythis pisonis Cambess
(LECYTHIDACEAE) EM AGROFLORESTAS –CACAU-CABRUCA– NO SUL
DA BAHIA .................................................................................................................... 20
RESUMO ....................................................................................................................... 21
INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 22
METODOLOGIA ........................................................................................................... 24
Área de estudo e delineamento amostral .................................................................... 24
Extração e quantificação de DNA............................................................................... 25
Amplificação dos locos SSR e genotipagem .............................................................. 25
Análise do sistema reprodutivo ................................................................................... 26
Análise de paternidade ................................................................................................ 27
Análise da distância do fluxo de pólen ....................................................................... 28
RESULTADOS .............................................................................................................. 29
Sistema reprodutivo .................................................................................................... 29
Análise de paternidade ................................................................................................ 30
Distância do fluxo de pólen ........................................................................................ 31
DISCUSSÃO .................................................................................................................. 33
Sistema de reprodução, paternidade e distância do fluxo de pólen ............................ 33
Implicações para a conservação .................................................................................. 36
AGRADECIMENTOS ................................................................................................... 38
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 38
viii
5. CONCLUSÕES GERAIS ........................................................................................ 43
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS COMPLEMENTARES .......................... 44
ix
EXTRATO
RODRIGUES, Acácia Brasil. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Fevereiro
2015. Sistema Reprodutivo de Lecythis pisonis Cambess (Lecythidaceae) em
agroflorestas –cacau-cabruca– no sul da Bahia. Orientadora: Fernanda Amato
Gaiotto. Co-orientador: Eduardo Mariano Neto.
A variabilidade genética é fator fundamental para a existência das espécies nos
seus habitats ao longo do tempo, por ser a base para que a evolução ocorra. Nessa
perspectiva, não é difícil observar que a maneira como as espécies se reproduzem,
influencia diretamente nessa diversidade, uma vez que, pode alterar a dinâmica das
populações. A região sul da Bahia apresenta uma das maiores riquezas de espécies
arbóreas por área do mundo. Sua paisagem é dita variegada por ser composta por
fragmentos de Mata Atlântica imersos em diversos cultivos, entre eles o de cacau
através do sistema agroflorestal denominado: cabruca. Assim, considerando que esse
sistema é bastante disseminado nessa região, e que alguns autores, defendem sua
contribuição para a conservação dessa riqueza, é relevante compreender de que forma se
reproduzem as espécies arbóreas que constituem a cabruca. A espécie Lecythis pisonis
(sapucaia) é uma arbórea ornamental com importância econômica e ecológica, sendo
encontrada com frequência na região cacaueira do Brasil. Nesse contexto, o objetivo
desse trabalho foi analisar o padrão de reprodução em famílias de Lecythis pisonis
localizadas em cabrucas do sul da Bahia. Entretanto, para compreender o sistema de
reprodução do modelo biológico escolhido, foi necessário desenvolver uma ferramenta
genética apropriada. Os marcadores microssatélites (SSR – simple sequence repeat) por
apresentarem elevado grau de polimorfismo e herança codominante são ideais para
estudos de genética de populações. Essa pesquisa foi dividida em dois capítulos. O
primeiro capítulo trata do desenvolvimento da ferramenta molecular (marcadores SSR)
e o segundo, do sistema de reprodução da sapucaia. Inicialmente houve coleta de
material foliar de 40 indivíduos selecionados aleatoriamente na cabruca de fazendas na
zona rural dos municípios de Ilhéus e Uruçuca, no Estado da Bahia. A coleta desses 40
indivíduos fez parte de um mapeamento inicial das cabrucas. Em seguida, o DNA
genômico total de um único indivíduo foi extraído, e enviado para a Ecogenics GmbH,
na Suíça, onde as etapas de desenvolvimento dos marcadores microssatélites ocorreram
através de sequenciamento de próxima geração [Next Generation Sequencing (NGS)]
x
utilizando um sequenciador com tecnologia 454. Após o recebimento de 30 primers
sintetizados, 16 apresentaram amplificação positiva (temperaturas de anelamento
otimizadas) e foram caracterizados. Os 16 pares de primers mostraram um alto grau de
polimorfismo e por isso são considerados ótimos, especialmente para testes de
paternidade ou análises de identidade. Para estimar o sistema de reprodução, foi
coletado sementes em 12 famílias de sapucaia na cabruca, ao longo de um gradiente
continuo de floresta (quantidade de floresta presente em um raio de 1 km) no entorno da
árvore. Após 60 dias, o material foliar de 24 mudas germinadas foi coletado de cada
uma das 12 famílias. Em seguida, o DNA foi extraído para amplificação via PCR. Os
287 indivíduos foram genotipados utilizando 10 dos 16 locos desenvolvidos. Os valores
encontrados nos parâmetros: taxa de cruzamento multilocus (tm) e taxa de cruzamento
unilocus (ts) foram respectivamente iguais a 1,000 e 0,960. Tais resultados foram
numericamente iguais a 1, e revelaram que a sapucaia se reproduz somente através de
cruzamentos, e por isso, é uma alógama obrigatória. O resultado da correlação de
paternidade rpm (0,306) indicou que parte dos descendentes compartilham o mesmo pai.
Este resultado pode ser explicado pela proximidade maior por algumas árvores paternas
de algumas árvores maternas. Entre os 287 descendentes, 9 (3 %) tiveram a paternidade
atribuída. A média da distância de dispersão de pólen foi de aproximadamente 6 km, e é
condizente com o raio de vôo de forrageamento diário do principal polinizador da
sapucaia, a abelha Xylocopa frontalis. Estes, bem como, os demais resultados obtidos
através dessa pesquisa são bastante informativos sobre como funciona o sistema
reprodutivo de uma espécie nativa da Mata Atlântica, no contexto da cabruca e também
oferece uma noção sobre a diversidade genética presente nessa paisagem. A partir dessa
pesquisa e da ferramenta molecular desenvolvida, os marcadores microssatélites, muitos
outros estudos a respeito da espécie como sua ecologia molecular e variabilidade
genética, poderão ser realizados, fomentando maiores conhecimentos acerca da flora
brasileira, da cabruca, e assim, subsidiando estratégias para a conservação da
biodiversidade do sul da Bahia.
Palavras-chave: Sistema reprodutivo; Sistema Agroflorestal; Marcadores
Microssatélites; Conservação; Lecythis pisonis.
xi
ABSTRACT
RODRIGUES, Acácia Brasil. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Fevereiro
2015. Mating system of Lecythis pisonis Cambess (Lecythidaceae) in agroforestry
system -cacau-cabruca- in southern Bahia. Advisor: Drª Fernanda Amato Gaiotto.
Co-advisor: Dr. Eduardo Mariano Neto.
Genetic variability is fundamental to the existence of species in their habitats
over time, as it is the basis for evolution. From this perspective, it is not difficult to see
that the way how the species reproduce, directly influences in that kind of diversity, as it
can change the dynamics of populations. The southern Bahia region has the highest tree
species richness by area of the world. The landscape in this region is variegated, due to
is composed by fragments of Atlantic Forest immersed in crop fields including cocoa
cultivation by agroforestry system popularly called cabruca. Considering that this
system is quite disseminated in this region, and that some authors defend their
contribution to the conservation, it is important understand how do reproduce tree
species from cabruca agroforestry. Lecythis pisonis is an ornamental tree with economic
and ecological importance, found often in areas with agroforestry cultivation. In this
context, the objective of the present study was to understand the pattern of reproduction
in Lecythis pisonis located in cabrucas from southern Bahia. However, to achieve our
aim it was necessary to develop an appropriate molecular genetic tool. Microsatellite
markers (Simple Sequence Repeat - SSR) have high degree of polymorphisms and
codominant inheritance. They are considered ideal for population genetic studies. The
first chapter deals with the development of SSR markers for L. pisonis and the second
chapter is about the mating system. We sampled leaf material of 40 individuals chosen
randomly, which were included on mapping areas of cabrucas farms from Ilhéus and
Uruçuca - Bahia-Brazil. The genomic DNA of a single individual was isolated and sent
to Ecogenics GmbH, Switzerland where the development of microsatellite markers were
done by next generation sequencing [Next Generation Sequencing (NGS)] using a 454
DNA sequencer. From 30 primers obtained, 16 showed positive amplification and were
characterized. They demonstrated a high degree of polymorphism and should be
considered an excellent tool, especially for paternity or identification analysis. To
estimate the mating system, we collected seed from 12 sapucaia families in cabruca,
xii
along a continuous forest gradient (quantity of forest present in a distance of 1km far
from tree). 24 seedlings germinated from each of 12 families were sampled to proceed
with laboratory analysis. DNA was extracted and submitted to amplification through
polymerase chain reaction (PCR). The 287 individuals were genotyped using 10 of the
16 loci developed. We found in the followed parameters: multilocus outcrossing rate (tm
=1.000) and single crossing rate (ts = 0.960). These results were not significantly
different from 1, which revealed that sapucaia reproduces only by outcrossing, and
should be considered alogamous. The result of correlation paternity multilocus (rpm)
indicated that part of seedlings share the same father (0.306). This result can be
explained due to the proximity to some trees in relation to maternal ones. From 287
descendants, 9 (3%) had the male parents attributed. The average distance of pollen
dispersal was 6 km, which is consistent with the daily foraging flight of the main
pollinator of sapucaia, the Xylocopa frontalis bee. Our results should be very
informative about how the mating system of a native species of the Atlantic Forest
occurs, in the context of agroforestry systems and also can gives us such idea about the
genetic diversity in this kind of landscape. The molecular tool developed will also be
helpful for many other studies on this species, for instance its molecular ecology and
genetic variability. In addition, our study increases the knowledge of Southern Bahia
flora, helping on development of strategies for conservation of biodiversity.
Key-words: Mating system; Agroforestry; Microsatellite markers; Conservation;
Lecythis pisonis.
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
A Mata Atlântica é considerada uma região biodiversa, constituída por diversas
formações vegetais e que possui grande extensão florestal (SAMBUICHI, 2009).
Contudo, o uso da terra e o desmatamento histórico desse bioma, que inclui desde os
ciclos de exploração do pau-brasil até a captura ilegal de animais e plantas (GALINDO-
LEAL e CÂMARA, 2005), promoveram grande redução da área original da floresta
Atlântica. Na atualidade este bioma está restrito a 11,7% da vegetação original
(RIBEIRO et al., 2009).
O desmatamento promove a fragmentação da floresta, que por sua vez, altera
seriamente os ecossistemas que a constituem, podendo levar à extinção local de muitas
espécies (PINTO e BRITO, 2005). Essa fragmentação reduz o tamanho das populações
e consequentemente promove diminuição no número de alelos (genes), e aumenta o
grau de isolamento entre as populações remanescentes (JAQUIERY et al., 2011).
Populações pequenas podem acentuar a deriva genética, que por sua vez pode promover
à fixação de alelos e, consequentemente, à perda de diversidade genética (REED, 2005).
É sabido que a diversidade genética permite a adaptação, a evolução e a
sobrevivência das espécies e indivíduos, principalmente em relação a mudanças
ambientais e doenças. Por isso, é possível afirmar que a diversidade genética é
fundamental para a estabilidade do ecossistema e para a sustentabilidade de populações
naturais.
Existem evidências que os efeitos causados pela fragmentação do habitat afetam
o sistema de reprodução de populações remanescentes, bem como, o padrão de
dispersão de pólen (YONG et al., 1996). Através do estudo do sistema de reprodução de
uma espécie, é possível estimar a taxa de cruzamento entre indivíduos e determinar o
modo de transmissão dos genes de uma de geração para outra (BROWN, 1990). A
polinização, por sua vez, é fundamental entre as complexas interações ecológicas que
promovem padrões de reprodução, pois determina oportunidades de acasalamento, uma
vez que, estabelece a dispersão de grãos de pólen entre flores (BARRETT e HARDER,
1996). Da mesma forma, a variação no comportamento dos polinizadores, além de
outros fatores, pode modificar os parâmetros referentes ao sistema de reprodução
(FRANCESCHINELLI e BAWA, 2000) e alterar o fluxo de pólen. Dessa forma, é
2
possível afirmar que o sistema de reprodução influencia de forma direta na variabilidade
genética nas populações de plantas.
Por isso, baseado na importância da polinização é relevante conhecer a distância
do fluxo de pólen em espécies arbóreas consideradas como interessantes para a
conservação da Mata Atlântica.
Nesse contexto, apesar de ser uma área com intensa exploração desde o
descobrimento do Brasil, o sul da Bahia, é uma das regiões da floresta Atlântica em que
se encontra um número elevado de espécies endêmicas e/ou nativas.
Dessa forma, é relevante ressaltar que o litoral sul, o qual é conhecido como
região cacaueira, foi onde ocorreu a expansão da plantação de cacau sob florestas
nativas criando um sistema que hoje é denominado sistema agroflorestal (SAF) cacau-
cabruca. Os SAFs são sistemas de uso da terra em que espécies perenes lenhosas como
árvores, arbustos, palmeiras e bambus são propositalmente utilizadas e manejadas em
consórcio com cultivos agrícolas e/ou animais (BRASIL, 2008). Assim, em geral, a
cabruca é cercada por vegetação natural, o que minimiza os impactos entre as relações
com o meio físico (LOBÃO et al., 2004; SAMBUICHI, 2009).
A cacauicultura está muito presente na região sul da Bahia até os dias atuais,
sendo esse o sistema predominante em quase 82% da cobertura da terra (FARIA, 2006).
Por isso, as cabrucas não podem ser consideradas somente como mais um sistema
agrícola, pois a sua importância para a conservação ambiental é muito grande na região
sul da Bahia (SAMBUICHI, 2002).
Existem algumas espécies de arbóreas que ocorrem de forma abrangente em
cabrucas. Entre essas espécies está Lecythis pisonis Cambess da família Lecythidaceae,
conhecida popularmente como sapucaia. É uma espécie ornamental e apresenta
importância econômica, sendo utilizada na construção civil para construção de peças
torneadas, entre outras. Além disso, Lecythis pisonis é indicada para restaurações
florestais (relevância ecológica), pois, devido ao sabor, suas sementes são apreciadas
pela fauna, o que a torna uma arbórea atrativa (LORENZI, 2002; SAMBUICHI et al.,
2009).
Assim, considerando a grande ocorrência da cabruca na região sul da Bahia e a
influência do sistema de reprodução sobre a diversidade genética das plantas, o objetivo
dessa pesquisa foi analisar o padrão de reprodução em famílias de Lecythis pisonis no
sistema agroflorestal cacau-cabruca no sul da Bahia utilizando marcadores
microssatélites.
3
Para conhecer o sistema reprodutivo do modelo biológico escolhido, é
necessário utilizar uma ferramenta genética apropriada. Os marcadores microssatélites
(SSR) por possuírem expressão codominante, significando que, ambos alelos de um
indivíduo heterozigótico são visualizados e também por apresentarem alto grau de
polimorfismo, são ideais para estudos de genética de populações. Os microssatélites são
sequências simples e pequenas com 1 a 6 nucleotídeos repetidos em tandem. São muito
frequentes e distribuídos ao acaso, o que permite uma completa cobertura de qualquer
genoma eucarioto (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998; OLIVEIRA et al., 2009).
Através de marcadores SSR pode-se analisar grande número de locos polimórficos, com
grande número de alelos. Por isso, com esses marcadores são obtidas estimativas mais
precisas.
Desse modo, para alcançar o objetivo central foram propostos os seguintes
objetivos específicos: i) Desenvolver e caracterizar marcadores SSR específicos para L.
pisonis do sul da Bahia; ii) Estimar a distância do fluxo de pólen nas famílias de L.
pisonis amostradas; iii) Inferir sobre o tipo de sistema de reprodução que predomina nas
famílias estudadas.
A partir desse estudo espera-se contribuir para a ampliação do conhecimento da
flora arbórea que compõe a região, bem como, a dinâmica da espécie no que diz
respeito ao seu sistema de reprodução na cabruca. Além disso, busca-se subsidiar
trabalhos voltados efetivamente para a conservação e o manejo de L. pisonis na cabruca.
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. A biodiversidade de espécies arbóreas presentes na Mata Atlântica do
sul da Bahia
Originalmente a Mata Atlântica estava presente em aproximadamente 1.300.000
km2. Apesar do desmatamento histórico que reduziu e fragmentou a floresta nativa,
estima-se que na Mata Atlântica existam cerca de 20.000 espécies vegetais (cerca de
35% das espécies existentes no Brasil) (MMA, 2015). É classificada como um hotspot
de biodiversidade (MYERS, 2000), e por isso, deve ser alvo de esforços para a sua
conservação.
A conservação da biodiversidade da Mata Atlântica depende, entre outros
fatores, do restabelecimento da conectividade funcional entre os fragmentos
remanescentes (RAMALHO e BATISTA, 2005). A Mata Atlântica da Bahia, por sua
vez, abriga os remanescentes mais significativos da região Nordeste (BRASÍLIA,
2010).
O que certamente particulariza a Mata Atlântica é a diversidade de espécies, e
por isso, a complexidade de interações que ocorrem neste ambiente (RAMALHO e
BATISTA, 2005).
Nesse contexto, o Sul da Bahia é reconhecido pelos ambientalistas como uma
das áreas mais importantes para a conservação da biodiversidade global (ARAÚJO et
al., 1998). Nessa região, a Mata Atlântica tem uma das maiores densidades de espécies
de árvores do mundo, além de um grande número de famílias, e um elevado número de
indivíduos. A ausência de variações sazonais parece ser o factor mais fortemente
associado com a alta densidade de espécies observadas no sul da Bahia (MARTINI,
2007).
Contudo, o corte seletivo de árvores nativas de importância comercial ameaça a
conservação dessa biodiversidade, pois, a derrubada das árvores afeta a dinâmica da
floresta, alterando as suas condições ambientais internas (SAMBUICHI, 2009).
No sul do estado da Bahia, já foram encontradas 458 espécies de árvores em 1
hectare de floresta, demonstrando uma excepcional riqueza de plantas lenhosas, a qual
foi considerada recorde mundial sendo muitas delas nativas, endêmicas e/ou ameaçadas
de extinção (MARTINI, 2007). A família Lecythidaceae, por exemplo, é um
componente abundante na flora arbórea da Mata Atlântica do sul da Bahia (RAMALHO
e BATISTA, 2005).
5
Dessa forma, para que haja uma gestão sustentável das florestas, se faz
necessária uma melhor compreensão das características específicas das árvores nela
contidas e da sua diversidade genética (FAO, 2015). A diversidade genética é a
principal responsável pela perpetuação das espécies considerando as adversidades
ambientais ou alterações estocáticas. Assim, quanto maior a diversidade genética, maior
a chance das espécies sobreviverem ao longo das gerações (CORRÊA e GAIOTTO,
2009).
2.2. O sistema agroflorestal cacau-cabruca no sul da Bahia
O início da ocupação no Sul da Bahia ocorreu através do extrativismo do Pau-
Brasil. Até o final do século XVII, a cana-de-açúcar foi o cultivo mais importante e
responsável pela instalação dos primeiros povoados. Entre o final do século XVIII ao
início do século XIX, foram introduzidas as culturas de algodão, café e cacau, sendo
que os dois últimos destacaram-se na economia regional nesse período. Entretanto,
somente no início do século XX o cacau se torna definitivamente importante para a
economia sul-baiana, sendo Itabuna e Ilhéus responsáveis pela maior produção
(ROCHA, 2008).
O cultivo de cacau no sul da Bahia foi crescendo de tal maneira que se tornou a
principal fonte motriz da economia da região. Com o passar do tempo e o crescente
interesse nacional e internacional no cacau, a região sul da Bahia passou a ser a
principal produtora de cacau do Estado e do país. A expansão desse cultivo e a sua
rentabilidade foram alteradas devido à doença conhecida popularmente como vassoura
de bruxa causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa (SAMBUICHI, 2009).
Apesar dos prejuízos que essa doença gerou para a economia da região, o sul da
Bahia ainda é uma das principais no cultivo e produção de cacau. Nessa região o cultivo
do cacau ocorre através de um sistema agroflorestal. Para ser chamado de agroflorestal,
o sistema de uso da terra deve ter, entre as espécies componentes do consórcio, pelo
menos uma que seja florestal (nativa ou aclimatada), encontrada num estado natural ou
espontâneo em florestas ou capoeiras (BRASÍLIA, 2008).
O tipo de sistema agroflorestal em que o cacau é cultivado no sul da Bahia é o
sistema cacau-cabruca, ou simplesmente cabruca, o qual é baseado na ocupação do sub-
bosque (estrato florestal intermediário) para cultivar o cacau através do sombreamento
das árvores mais altas. A palavra cabruca tem origem no verbo brocar, o qual criou a
6
palavra cabrucar, que significa roçar o mato e retirar algumas árvores para plantar
cacaueiros (LOBÃO et al., 2004).
A intencionalidade de brocar as matas para o plantio do cacau foi sendo
aprimorada ao longo de mais de 250 anos, e paralelamente houve a formação
sociocultural local e a construção de um modelo de produção autêntico, o sistema
cabruca. Esse sistema proporciona benefícios ecológicos e, por possuir adaptação local,
apresenta vantagens agroambientais sustentáveis diferenciadas quando comparadas a
outros sistemas tropicais de produção agrícola (SETENTA e LOBÃO, 2012).
O clima tropical úmido do sul da Bahia, cujas temperaturas médias mensais
anuais ficam acima de 18ºC durante todo o ano, e o fato de não apresentar estação seca
(ROCHA, 2008) são características ideais para o cultivo do cacau.
Apesar da devastação que ocorreu na Mata Atlântica ter criado uma paisagem
variegada, composta por remanescentes de floresta imersos na matriz cabruca, o sul da
Bahia apresenta ainda uma significativa concentração de árvores nativas em relação a
outras regiões da floresta Atlântica devido ao sistema tradicional de plantio do cacau
que é a cabruca (SAMBUICHI, 2006).
Nesse contexto, a cabruca não favoreceu a devastação total dos recursos
florestais, mas sim permitiu a conservação de remanescentes florestais nele inseridos ou
no entorno das áreas cultivadas, bem como a sobrevivência de indivíduos arbóreos da
floresta primária. Dessa forma, propiciou a formação de corredores ecológicos que
aumentem a capacidade de suporte faunístico dos fragmentos florestais remanescentes,
além de auxiliar na manutenção da qualidade dos solos e de conservar os recursos
hídricos quando houver alta densidade arbórea na faixa ciliar (SETENTA e LOBÃO,
2012).
O sistema cabruca apresenta altos níveis de biodiversidade, o que cria uma
capacidade de "autorregulação" e equilíbrio biológico, que explica os baixos níveis de
doenças ou ataques de insetos (BRASÍLIA, 2008). Esse sistema é utilizado por uma
parte significativa da fauna e flora nativa do sul da Bahia. Dessa forma, as cabrucas têm
um papel importante a desempenhar na conservação da biodiversidade, disponibilizando
alternativa ou habitat adicional para muitas espécies florestais, aumentando a
conectividade entre fragmentos florestais, e reduzindo os efeitos de borda nos
fragmentos que estão expostos (CASSANO et al., 2008).
De acordo com Schroth et al. (2013), a cabruca pode contribuir de forma
fundamental, não apenas para a conservação da biodiversidade, mas também como
7
estoque de carbono, sendo ressaltado pelos pesquisadores a importância da lavoura
cacaueira para a manutenção deste serviço ambiental.
Assim, se bem manejados, os sistemas agroflorestais, podem ser uma opção para
a recuperação de áreas degradadas e para a recomposição florestal das áreas já abertas
(PENEIREIRO et al., s/d).
2.3. Sistema reprodutivo em plantas
O sistema de reprodução diz respeito à maneira pela qual uma espécie “deixa”
seus genes, ou seja, constrói sua descendência e consequentemente interfere na sua
distribuição espacial.
Existem duas formas de reprodução: a assexuada e a sexuada. O modo sexuado
envolve a formação de gametas na meiose, e mistura de material genético através da
fusão dos gametas masculino e feminino.
A reprodução assexuada em plantas ocorre quando os descendentes são
produzidos sem incluir a meiose e a singamia. Quando as plantas vasculares se
reproduzem assexuadamente, podem fazê-lo ou por brotamento, ramificação, ou
perfilhamento (reprodução vegetativa) ou através da produção de esporos ou sementes
geneticamente idênticos a planta mãe, ou ao próprio esporófito (agamospermia em
plantas com sementes, apogamia em pteridófitas) (HOLSINGER, 2000).
A reprodução sexuada pode ocorrer por autofecundação e por cruzamentos.
Plantas com reprodução sexuada podem ser classificadas como autógamas, alógamas e
mistas, esta classificação representa os três tipos de sistema de reprodução, os quais são
baseados na taxa de cruzamentos (FRYXEL, 2009). As alógamas se reproduzem através
de cruzamentos (t > 0,95), as autógamas através de autofecundação (t ≤ 0,5) e as mistas
se reproduzem através de cruzamentos e autofecundações alternativamente (0,5 < t ≤
0,95) (BESPALHOK et al., 2012).
Em espécies alógamas a reprodução ocorre preferencialmente via cruzamentos
ao acaso, sendo o pólen transportado pelo vento e/ou por outro agente polinizador como
insetos e morcegos, de maneira em que a descendência é composta por meios-irmãos
(compartilham o apenas o parental materno) e irmãos completos (compartilham tanto o
parental materno quanto o paterno). As espécies autógamas, por sua vez, possuem o
genoma em estado homozigoto (AA ou aa) como consequência das autofecundações
8
sucessivas, que resultam na formação natural de linhagens puras (todos os locos em
homozigose). Dessa forma, a descendência de linhagens puras apresenta constituição
genética muito semelhante ou idêntica à da planta mãe (RITLAND e JAIN, 1990).
Nas plantas alógamas a fertilização ocorre quando o pólen de uma planta
fertiliza o óvulo da flor de outra planta. De acordo com o tipo de flor que possuem, as
espécies são divididas em três grupos: plantas hermafroditas, monóicas e dióicas. Nas
plantas com flores hermafroditas, a flor é completa, possuindo os dois sexos. As plantas
monóicas apresentam flores unissexuais femininas e masculinas na mesma planta. Já
nas plantas dióicas os sexos são separados entre os indivíduos, ou seja, as plantas ou
possuem apenas flores masculinas ou femininas. (BESPALHOK et al., 2012).
Sistemas de reprodução que promovem movimentação de pólen entre os
indivíduos e também alelos, compartilhando-os amplamente entre as populações,
reduzem a diferenciação dentro de cada espécie. Os cruzamentos não só permitem a
troca de genes entre indivíduos dentro de uma população local, mas aparentemente
permitem que quantidades significativas de genes (alelos) transitem entre populações
(LOVELESS e HAMRICK, 1984).
As plantas alógamas desenvolveram mecanismos que podem determinar ou
incentivar a alogamia (reprodução cruzada). Entre os mecanismos que incentivam,
estão a dicogamia que ocorre em espécies com flores hermafroditas e é definida pelo
amadurecimento da parte feminina (gineceu) e da parte masculina (androceu) em
momentos diferentes. A dicogamia é dividida em protandria e protoginia. Na protandria
as anteras têm os grãos de pólen maduros, porém os estigmas não estão receptivos. E na
protoginia os estigmas estão receptivos, mas anteras não completaram o
amadurecimento. Um exemplo de mecanismo que torna a alogamia obrigatória em
espécies hermafroditas ou monóicas é a autoincompatibilidade, na qual ocorre uma
interação genética entre o grão de pólen e o estigma, que impede que o pólen germine
no estigma da mesma planta. As plantas autógamas também desenvolveram alguns
mecanismos que favorecem a autofecundação, e um exemplo é a cleistogamia, em que a
polinização do estigma ocorre antes da abertura do botão floral ou antese
(BESPALHOK et al., 2012).
Um conjunto de mecanismos está envolvido no modo de reprodução sexual.
Estes podem ser agrupados em dois componenetes básicos: o sistema sexual, que diz
respeito à localização dos sexos nas flores ou nos indivíduos (hermafroditismo,
dioicismo, monoicismo) e o sistema de reprodução, que trata sobre como ocorre à
9
polinização e a fertilização efetivamente (autofecundação e cruzamento) (RAMALHO e
BATISTA; GOODWILLIE, 2005).
Em termos de sistemas sexuais e de reprodução, existem evidências
que a maioria das espécies de árvores em florestas tropicais realizam cruzamentos.
Nessa perspectiva, espera-se que as populações de árvores tropicais mostrem uma
grande variedade de estruturas genéticas populacionais, devido à grande diversidade de
mecanismos de polinização, sistemas sexuais e padrões de reprodução. Nesse contexto,
estudos genéticos de representantes de cada grupo de espécies são necessários para
caracterizar os principais padrões reprodutivos (BAWA et al., 1989).
A polinização é um processo ecológico chave nos ecossistemas terrestres porque
determina o sucesso reprodutivo e, portanto, a capacidade de autorregeneração natural
da vegetação (RAMALHO e BATISTA, 2005).
Uma limitada dispersão de genes via pólen e sementes poderia gerar um
pequeno tamanho efetivo nas populações e, consequentemente, promover o cruzamento
entre indivíduos aparentados. A quantidade de fluxo de genes é amplamente
determinada pelas faixas de forrageio de polinizadores e pelos dispersores de sementes.
Contudo, a execussão do forrageamento pelos polinizadores em si, é dependente de
muitos fatores que envolvem a energética e o comportamento social dos animais
envolvidos, bem como, o tipo do recurso (néctar, pólen, sementes e frutos) e a
distribuição no tempo e no espaço (BAWA, 1979).
O fluxo de genes entre populações de plantas pode, de fato, ser uma importante
força que promove a relação entre populações de plantas naturais em todas as espécies
(LOVELESS e HAMRICK, 1984). Espécies que apenas se cruzam mantêm a maior
parte de sua variabilidade genética distribuída dentro de populações, em contrapartida,
nas espécies que se autofecundam predominantemente, a maior parte está entre
populações (HAMRICK 1983), já que, como dito anteriormente, dentro de cada
população os indivíduos são predominantemente idênticos às plantas da geração
anterior.
O sistema de reprodução afeta a estrutura e a dinâmica das populações genéticas,
e tem efeitos significativos sobre a diversidade genética (RITLAND e JAIN, 1981;
GLÉMIN, 2006). Além disso, estimativas adequadas das taxas de cruzamento são
muitas vezes necessárias para a avaliação dos efeitos dos sistemas de reprodução, bem
como para planejamento de programas de melhoramento (RITLAND e JAIN, 1981).
10
Para realizar investigações sobre o sistema de reprodução, as estimativas de
cruzamento multilocus são recomendadas, pois utilizam em maior ou menor grau, a
segregação conjunta de muitos locos para estimativa de cruzamento. De acordo com
Ritland (1983), a relevância dessa estimativa multilocus está no fato de que se um loco
na planta não detectar um cruzamento, certamente então outro loco pode, como por
exemplo, quando uma mãe homozigota tem uma progênie heterozigota em um
determinado loco.
2.4. Lecythis pisonis Cambess (Lecythidaceae)
Lecythidaceae é uma família de árvores com distribuição pantropical encontrada
nos trópicos da América Central e sul, sudeste da Ásia, e África, incluindo Madagascar.
Na América do sul, existem 10 gêneros e 202 espécies conhecidas da subfamília
Lecythidoideae e uma única espécie, Asteranthos brasiliensis, da subfamília da África
central Syctopetaloideae. O maior gênero da subfamília Lecythidoideae é Eschweilera
com 85 espécies, e o terceiro maior gênero em número de espécies é Lecythis com 26
(MORI, 2004).
As espécies da subfamília Lecythidoideae são caracterizadas por cascas fibrosas;
folhas simples, alternas; androceu actinomorfo ou zigomorfo; numerosos estames;
ovários inferiores ou parcialmente inferiores; óvulos bitegumentados; e a presença de
feixes corticais (PRANCE e MORI, 1979). Nessa subfamília, os membros são
frequentemente importantes ecologicamente em florestas neotropicais, onde são
especialmente abundantes em florestas de baixas altitudes, não inundáveis (MORI e
PRANCE, 1981).
No caso específico da espécie Lecythis pisonis Cambess, o androceu é
caracterizado por muitos estames soldados na base, formando um anel zigomorfo
(assimétrico); possuem capuzes planos com apêndices de anteríferos e não apresentam
néctar. As folhas são simples, espalhadas e de tamanho médio; as flores, quase sempre
grandes, vistosas e aromáticas, apresentam o cálice inteiro ou de dois a seis lobos e
simetria bilateral. A corola tem de quatro a oito (podendo chegar a 18) pétalas livres.
Possuem estiletes curtos com uma expansão anelar para o ápice. A abertura da antera
para a exposição dos polens é lateral. Os frutos são deiscentes e se abrem na maturidade
expondo as sementes através de uma “tampa” chamada opérculo. Por serem grandes,
11
lisos, duros, secos e deiscentes, os frutos são do tipo pixídio lenhoso. Tais frutos quando
amadurecidos costumam permanecer presos nos ramos da árvore. As sementes são do
tipo amêndoa e possuem uma polpa nutritiva denominada arilo que se localiza na base.
(MORI e ORCHARD, 1980; MORI, 1988; MORI, 2001).
A sapucaia, nome popular da espécie Lecythis pisonis, é uma árvore de grande
porte com 20 a 35 m, chegando a atingir 55 m de altura (Figura 1) (MORI et al., 1980).
Figura 1. Lecythis pisonis. A – árvore adulta. Foto: Fernanda Gaiotto, 2014. B – tronco lenhoso com
casca marrom e fissuras verticais acentuadas. Foto: Acácia Rodrigues, 2014. C – folha lignificada. Foto:
Acácia Rodrigues, 2014. D – fruto deiscente. Foto: Acácia Rodrigues, 2014.
Por causa da beleza de suas folhas, as quais apresentam cor rósea quando novas,
a sapucaia é classificada como espécie ornamental. Ao final da floração as folhas
lignificam-se e tornam-se verdes. Por ser uma madeira durável e resistente é utilizada na
A B
C D
12
construção civil. A casca exterior do tronco é estratificada. O fruto é utilizado como
recipiente e para artesanato. É uma espécie decídua, que ocorre na floresta ombrófila e
semidecídua, primária e secundária, além de ser classificada como uma espécie de
sucessão tardia (MORI et al., 1980; MORI e PRANCE, 1990; SAMBUICHI et al.,
2009). Nessa espécie, as amêndoas possuem altos teores lipídicos e protéicos. Esse
elevado teor lipídico e a insaturação do óleo, favorece a possível utilização na indústria
de óleos comestíveis (VALLILO et al., 1998).
As flores da sapucaia se abrem (antes das 7 h 30 min.), a cor das pétalas e do
androceu é roxa. Após 24 horas a cor destas estruturas fica mais clara e 48 horas depois,
as pétalas e o androceu caem ao solo, deixando o ovário preso ao eixo da inflorescência.
Dessa forma, provavelmente, as flores só são receptivas ao polinizador durante o
primeiro dia do ciclo. A sapucaia perde folhas de setembro a novembro, ficando
desfolhada por 10 a 15 dias. Em seguida, emite novas folhas e flores simultaneamente,
no período compreendido entre o final do inverno até o início da primavera, na região
cacaueira da Bahia. A floração persiste por 29 a 46 dias. (MORI et al., 1980).
A sapucaia apresenta dois tipos de pólen, o pólen estéril (localizado no capuz) e
o pólen fértil que é encontrado num anel abaixo do capuz (estrutura que cobre
parcialmente a flor).
O principal polinizador da sapucaia é a fêmea de uma abelha conhecida como
mamangaba [Xylocopa frontalis (Oliver)] que visita a flor para coletar o pólen estéril
(recurso). Entretanto, ao entrar na flor a abelha recebe uma chuva de pólen fértil no topo
da cabeça e nas costas. Assim, quando a mamangaba visitar outra flor, em seguida, o
pólen fértil será transferido para o estigma, que é a estrutura feminina de recepção de
pólen, da outra flor (MORI, 1988; MORI, 2001). O pólen estéril retirado pela abelha
não funciona na fecundação, mas tem uma importante função de atrair o polinizador que
provavelmente o utiliza como alimento para suas larvas (MORI et al., 1980).
Os morcegos da espécie Phyllostomus hastatus são os principais dispersores da
supacaia, os quais coletam as sementes no fruto em busca do arilo, comem e depois
descartam as sementes, às vezes, deixando-as caírem acidentalmente durante o vôo para
seus abrigos ou em seus abrigos e desse modo, efetuam a dispersão (GREENHALL,
1965; MORI E PRANCE, 1981).
As sementes são predadas pelos mamíferos Cebus apela (macaco-prego), Agouti
paca, (paca) e Dasyprocta aguti (cutia) (MORI, 2001; LIMA et al., 2011), sendo
13
portanto excelente fonte de alimentos para a fauna local, mesmo que estes animais não
contribuam para sua dispersão.
Essa espécie ocorre nas florestas Amazônica e Atlântica, e nesta última está
distribuída desde Pernambuco a São Paulo, onde é comum, sobretudo no sul da Bahia e
norte do Espírito Santo (MORI e PRANCE, 1990; BRASÍLIA, 2002). A sapucaia
ocorre com frequência superior a outras arbóreas em sistemas agroflorestais do tipo
cacau-cabruca (SAMBUICHI et al., 2009), possivelmente devido à sua beleza é
estimada pelos agricultores locais.
Lecythis pisonis pode ser classificada como espécie bandeira de acordo com
alguns critérios propostos por BOWEN-JONES e ENTWISTLE (2002), como por
exemplo, ser importante localmente para a conservação de outras espécies e típica na
paisagem; tem características que as tornam facilmente reconhecíveis; o fato de ser
carismática, podendo influenciar a opinião pública; possui significância cultural e
ocorrência em paisagem tradicional (cabruca), entre outros. Além disso, apresenta
importância ecológica, uma vez que, é indicada para restaurações florestais, pois,
devido ao sabor, suas sementes são apreciadas pela fauna, o que a torna uma arbórea
atrativa (LORENZI, 2002; SAMBUICHI et al., 2009).
2.5. Marcadores microssatélites
Os microssatélites são repetições em série de 1 a 6 nucleotídeos encontrados em
alta frequência nos genomas nucleares da maioria dos táxons (LITT e LUTY et al.,
1989). São também conhecidos como simple sequence repeats (SSR), variable number
tandem repeats (VNTR) e short tandem repeats (STR) (SELKOE e TOONEN, 2006).
Consistem em sequências simples paralelamente repetidas de nucleotídeos que podem
ser mono, di, tri, tetra ou pentanucleotídeos (POWELL et al., 1996). As repetições
dinucleotídicas são dominantes no genoma, seguidas pelas repetições
mononucleotídicas e tetranucleotídicas, as repetições trinucleótidicas são menos
dominantes. Entre as dinucleotídicas, as repetições (CA)n são mais frequentes, seguidas
por (AT)n, (GA)n e (GC)n, o último tipo de repetição sendo que é rara (ELLEGREN,
2004).
A distribuição da frequência de microssatélites varia não apenas entre as
espécies, mas também dentro de cromossomos do mesmo organismo (SCHLÖTTERER,
14
2000). As sequências microssatélites são amplamente distribuídas em plantas
apresentando uma frequência de 1 a cada 50 mil pares de bases (FERREIRA e
GRATTAPAGLIA, 1998). No genoma de plantas os nucleotídeos que ocorrem com
mais frequência são os dinucleotídeos AT, seguidos por AG e AC. Em humanos, porém,
os dinucleotídeos AC ou TG são os tipos mais comumente encontrados (POWELL et
al., 1996).
Existem diferentes tipos de repetições de microssatélites, que são divididas em:
(a) repetições perfeitas, quando não possuem nenhuma interrupção; (b) repetições
imperfeitas, quando são interrompidas por bases não repetidas; (c) repetições
compostas, quando duas ou mais repetições (classes) de microssatélites estão dispostas
próximas; e (d) repetições simples, quando o microssatélite é formado por somente um
tipo de repetição. As repetições simples e compostas podem ser perfeitas ou imperfeitas
(BORÉM e CAIXETA, 2009).
As sequências de DNA que flanqueiam os microssatélites são geralmente
conservadas entre os indivíduos de uma mesma espécie, permitindo seleção de primers
específicos que amplificam, via PCR, fragmentos contendo o DNA repetitivo em todos
os genótipos (BORÉM e CAIXETA, 2009). O polimorfismo do microssatélite é
observado, portanto, na diferença do número de vezes em que, por exemplo, um
dinucleotídeo (AG)n se repete naquele loco (BUSO et al., 2003). Assim, a variação no
comprimento do segmento repetitivo presente no loco caracteriza o polimorfismo do
marcador microssatélite. Essa variação no número de repetições pode ter sido originada
de crossing-over desigual ou erro da DNA polimerase durante a replicação. Variações
no número das repetições em tandem acumulam-se mais rapidamente na população do
que mutações de ponto e eventos de inserções/deleções, responsáveis pelo polimorfismo
de outros marcadores moleculares, como por exemplo, RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism) (BORÉM e CAIXETA, 2009). Por isso, as regiões
microssatélites apresentam altas taxas de mutação (10-2
- 10-6
evento por loco por
geração) (LI et al., 2002).
Assim, cada microssatélite constitui um loco genético altamente variável,
multialélico, de grande conteúdo informativo. Essa natureza altamente informativa,
combinada com a especificidade e rapidez da tecnologia baseada em PCR, fazem desses
marcadores uma eficiente ferramenta para estudos de eucariotos. Dessa forma, os
marcadores microssatélites (SSR) possuem herança codominante, são dependentes de
pequena quantidade de DNA, geram informações genéticas rapidamente, podem
15
amostrar um grande número locos no genoma, os dados produzidos não sofrem
influência ambiental, podem ser desenvolvidos para qualquer espécie, envolvem
amostragens não destrutivas e permitem testes de hipóteses (FERREIRA e
GRATTAPAGLIA, 1998).
No entanto, todos os tipos de marcadores moleculares têm desvantagens, no caso
específico dos marcadores microssatélites a principal é a grande quantidade de trabalho
necessário para o desenvolvimento prévio dos marcadores. A partir da tecnologia de
Next generation sequencing (NGS), as etapas iniciais que incluem: confecção de
biblioteca genômica enriquecida, hibridação com sondas contendo microssatélites,
seleção de clones positivos, entre outras, tiveram seu tempo drasticamente reduzido.
De acordo Selkoe e Toonen (2006), embora haja a possibilidade atualmente que
um estudo com marcador microssatélite seja finalizado em menos tempo, por menos
dinheiro e com menos conhecimento técnico do que antes, o uso adequado de dados
microssatélites ainda promovem uma formação adequada e uma base sólida nos
princípios da genética de populações e da evolução molecular.
De modo geral, marcadores codominantes e multialélicos como os marcadores
microssatélites, são mais indicados para estudos de identificação e análise de
paternidade. Além disso, dados adicionais sobre a diversidade genética de potenciais
genitores obtidos com base em marcadores moleculares, para programas de
melhoramento genético, podem auxiliar na escolha dos genitores e no planejamento dos
cruzamentos buscando a maximização da heterose e das combinações gênicas
almejadas. (FALEIRO, 2007).
Os marcadores SSR continuam a encontrar sua aplicação em áreas como mapas
de ligação, testes de paternidade, forense e para inferência de processos demográficos
(ELLEGREN, 2004). Devido as suas características, esses marcadores são utilizados
também para estimativas de sistema de reprodução, fluxo de genes, estrutura genética
espacial, diversidade genética, além de outras finalidades (COLLEVATTI et al., 2001;
GAIOTTO et al., 2003; TARAZI et al., 2013; MENEZES et al., 2014).
16
3. CAPÍTULO I
FIRST MICROSATELLITE MARKERS FOR Lecythis pisonis
(LECYTHIDACEAE), AN IMPORTANT RESOURCE FOR BRAZILIAN
FAUNA
____________ 1http://sweetgum.nybg.org/lp/multimedia.php?irn=1676
Phyllostomus hastatus1
MICROSATELLITE LETTERS
First microsatellite markers for Lecythis pisonis (Lecythidaceae),an important resource for Brazilian fauna
Acacia B. Rodrigues • Ciro Tavares Florence •
Eduardo Mariano-Neto • Fernanda A. Gaiotto
Received: 15 October 2014 / Accepted: 23 November 2014
� Springer Science+Business Media Dordrecht 2014
Abstract Next-generation sequencing was used to develop
microsatellite markers for Lecythis pisonis, a tree species with
economic and ecological importance. Commonly known as
sapucaia, L. pisonis is used to shade cocoa plantations in
Brazilian agroforestry systems. The food resources provided
by this species also make it very attractive to wildlife. We used
material collected from 40 adult trees from cocoa plantations
to characterize 16 primers. All characterized primers were
polymorphic, showing an average of 15 alleles per locus.
Observed and expected heterozygosity values averaged 0.687
and 0.856, respectively. The high combined probability of
paternity exclusion ([0.999) and low identity index (\0.001)
indicate that these microsatellites can be exploited in a vast
number of conservation and molecular genetic studies. We
plan to use these tools to investigate the role of agroforestry
systems in the breeding, management, and conservation of
landscapes in the Brazilian Atlantic forest domain.
Keywords Tropical tree � SSR � Next-generation
sequencing � Conservation � Agroforestry
Lecythis pisonis Cambess (Lecythidaceae), popularly
known as sapucaia, is a naturally occurring tree species of
the Amazon and Atlantic forests. It is an example of a
‘‘flagship species’’ (Bowen-Jones and Entwistle 2002).
Besides its importance as timber (Mori 2001), the tree is
valued for its beauty during the flowering season and is
used to provide shade on cacao plantations in agroforestry
systems in Bahia, Brazil. It also provides resources for
wildlife, such as pollen and arils that are consumed by bees
and bats. Various animals eat and disperse its seeds,
thereby breaking the integument; the tree is thus attractive
as a food resource and indicated for forest restoration.
Considering the economic and (especially) the ecological
relevance of L. pisonis, we developed 16 microsatellite
primers by next-generation sequencing (454 pyrosequenc-
ing; Ecogenics, Schlieren, Switzerland) for use in upcom-
ing molecular ecology studies.
We used a single adult L. pisonis individual collected in
cabruca (14�4505300S, 039�1004800W) for construction of an
enriched genomic library. DNA was isolated from fresh
leaves and enrichment with (AC)n and (GA)n probes.
PCR amplifications were carried out in 13-lL final
volumes containing a mixture of 7.5 ng DNA, 1.3 lL of
10 9 buffer, 3.25 mM of each dNTP, 3.25 mg bovine
serum albumin, 20 mM MgCl2, 1 U of Taq DNA poly-
merase (Phoneutria; Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil),
3.0 lM of reverse primer and fluorescence dye-labeled
forward primer with an M13 tail (CACGACGTTGTAA
AACGA), 0.03 lM of M13-tailed primer complementary
dye-labeled with 6-FAM, VIC, or NED (Applied Biosys-
tems, Foster City, CA, USA), and milli-Q water.
PCR conditions consisted of an initial denaturation step
of 94 �C for 1 min, followed by 30 cycles of 94 �C for
1 min, annealing at a specific temperature for each primer
(Table 1) for 45 s, and 72 �C for 1 min, followed by 8
cycles of M13-fluorescence annealing corresponding to
94 �C for 1 min, 53 �C for 1 min, and 72 �C for 1 min, and
Electronic supplementary material The online version of thisarticle (doi:10.1007/s12686-014-0390-6) contains supplementarymaterial, which is available to authorized users.
A. B. Rodrigues � F. A. Gaiotto (&)
Departamento de Ciencias Biologicas - Centro de Biotecnologia
e Genetica, Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC),
Ilheus, Brazil
e-mail: [email protected]
C. T. Florence � E. Mariano-Neto
Departamento de Botanica, Instituto de Biologia, Universidade
Federal da Bahia (UFBA), Salvador, Brazil
123
Conservation Genet Resour
DOI 10.1007/s12686-014-0390-6
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56
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56
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56
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1
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56
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31
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0.9
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Conservation Genet Resour
123
a final extension step of 72 �C for 10 min. The amplifica-
tion products were multiloaded, and subjected to capillary
electrophoresis on an ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems) (Table 1). Genotyping was performed using
Gene Mapper version 4.1 (Applied Biosystems). A total of
3,101 sequences were obtained, of which 1,054 contained
microsatellites and were used to design 315 primers pairs.
We synthesized 30 selected according to the regions with
the greatest number of repeated motifs, and identified 16
polymorphic loci.
To characterize them, we estimated the following
genetic parameters: number of alleles per locus (A),
observed heterozygosity (HO), expected heterozygosity
(HE), combined probability of paternity exclusion (Q), and
identity index (I) using CERVUS 3.0.3 software (Kali-
nowski et al. 2007) (Table 1). The linkage disequilibrium
(LD) for each locus was tested by FSTAT software, version
2.9.3.2 (Goudet 2002) using Bonferroni correction. The
Hardy–Weinberg equilibrium (HWE) test was performed
in GenAlex software, version 6.5 (Peakall and Smouse
2012).
With an average of 15 alleles per locus, the 16 primer
pairs showed a high degree of polymorphism. The loci with
the highest and lowest number of alleles were Lec 280,
with 24 alleles, and Lec 31, with 8. Average HO and HE
indicated high variability. Estimated values for
Q ([0.9999) and I (8.15 9 10-25) suggest that the devel-
oped primers should be useful tools, for paternity and
identity analysis. The P value found for the LD with a
confidence interval of 95 % was 0.000417, and stated that
none loci are in linkage disequilibrium. Half of them
showed HWE (Table 1).
With their high levels of polymorphism, these first SSR
developed for L. pisonis should be useful to address eco-
logical and evolutionary questions. We plan to use these
markers in a future investigation of the mating system of
L. pisonis.
Acknowledgments The authors thank Horlei Ribeiro and Anderson
R. Vieira for technical support, and Daniela B. Borges and Flora
Bittencourt for help with parameter estimations. This work was fun-
ded by Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientıfico e Tec-
nologico (CNPq) (#487030/2012-5) and Fundacao de Amparo a
Pesquisa do Estado da Bahia (Fapesb) (#PPP0008/2011). Coorde-
nacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nıvel Superior (CAPES)
and CNPq provided fellowships to ABR and FAG, respectively.
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Conservation Genet Resour
123
20
4. CAPÍTULO II
SISTEMA REPRODUTIVO DE Lecythis pisonis Cambess
(LECYTHIDACEAE) EM AGROFLORESTAS –CACAU-CABRUCA–
NO SUL DA BAHIA
____________ 2http://sweetgum.nybg.org/lp/PollinationLP30Mar11.pdf
Xylocopa frontalis2
21
SISTEMA REPRODUTIVO DE Lecythis pisonis Cambess (LECYTHIDACEAE)
EM AGROFLORESTAS –CACAU-CABRUCA– NO SUL DA BAHIA
Autores: Acácia Brasil Rodrigues1; Ciro Tavares Florence
2; Eduardo Mariano Neto
2;
Fernanda Amato Gaiotto1
1Laboratório Marcadores Moleculares, Centro de Biotecnologia e Genética,
Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC); 2Departamento de Botânica, Instituto de
Biologia, Universidade Federal da Bahia (UFBA).
RESUMO
A região sul da Bahia apresenta uma das maiores riquezas de espécies arbóreas
por área do mundo e sua paisagem é dominada pelo sistema agroflorestal cacaueiro
(cabruca) que, contribui para a conservação dessa diversidade. Contudo, o modo como
as espécies se reproduzem influencia diretamente na manutenção, distribuição, aumento
ou diminuição dessa variabilidade, a qual interfere na dinâmica da paisagem. Nessa
perspectiva, o objetivo desse trabalho foi avaliar o padrão de reprodução em famílias de
Lecythis pisonis (conhecida como sapucaia), uma espécie arbórea presente na cabruca e
estimar a distância do fluxo de pólen através da análise de paternidade, utilizando
marcadores microssatélites nucleares. Para estimar o sistema reprodutivo dessa espécie,
comum em áreas com cultivos agroflorestais, alguns parâmetros foram estimados,
considerando o modelo de acasalamento misto. Os resultados revelaram que a sapucaia
se reproduz somente por cruzamento, e por isso é uma espécie alógama obrigatória.
Além disso, a maioria dos indivíduos realizam cruzamentos aleatórios e não com os
indivíduos mais próximos, fatores favoráveis para a manutenção da variabilidade
genética. Nove descendentes tiveram a paternidade atribuída, e alguns deles, mostraram
serem irmãos completos. A média da distância do fluxo de pólen foi de
aproximadamente 6 km, o que é condizente com o raio de vôo da abelha polinizadora
(Xylocopa frontalis). Através das informações obtidas a partir dessa pesquisa, espera-se
subsidiar estratégias para conservação da espécie estudada, bem como, do sistema
agroflorestal cabruca que, além de beneficiar a economia da região, vem demonstrando
importante participação na conservação da biodiversidade de espécies arbóreas
presentes no sul da Bahia.
Palavras-chave: Sistema de reprodução; Dispersão de pólen; Lecythis pisonis; Sistema
Agroflorestal, Microssatélites.
22
INTRODUÇÃO
O sul da Bahia é uma região com significativa porcentagem de floresta
Atlântica, conservando elevada diversidade de espécies, sendo constituída ainda por
diferentes tipos de uso da terra, incluindo os sistemas agroflorestais (SAATCHI et al.,
2001).
Nessa região, contudo, o sistema agroflorestal cacau-cabruca representa o
sistema agroflorestal mais diferenciado (por ser composto por árvores nativas) e
abrangente na paisagem (SAMBUICHI et al., 2009). A cabruca é um tipo de sistema de
uso da terra em que é feita a remoção de arbustos e algumas árvores do sub-bosque para
plantar cacau sob a sombra do dossel. (LOBÃO et al., 2004).
Vários pesquisadores defendem as excelentes possibilidades de conservação que
os sistemas agroflorestais promovem, podendo formar corredores de biodiversidade e
favorecer a permeabilidade entre os fragmentos florestais (PARDINI et al., 2005;
TABARELLI et al., 2010; SAMBUICHI et al., 2012). Nesse contexto, a atuação da
cabruca como uma matriz permeável que promove conexão entre os fragmentos de
floresta pode ser relevante e consistente. Fragmentos conectados favorecem o fluxo de
genes e consequentemente a manutenção da diversidade genética. Entretanto, a
qualidade das cabrucas varia de acordo com a proporção e a qualidade dos
remanescentes na paisagem (FARIA et al., 2006), o que provavelmente estar
relacionado com a variabilidade genética presente nesses cultivos.
A variabilidade genética é fundamental para a estabilidade do ecossistema e para
a manutenção de populações naturais. Além disso, a variabilidade genética dentro das
populações naturais está diretamente relacionada ao seu sistema de reprodução, à
síndrome de dispersão de pólen, à propagação de sementes e também ao tamanho
efetivo da população (HAMRICK, 1983).
A taxa de cruzamento da geração parental determina o padrão em que os
gametas se unem em pares para formar os novos genótipos na geração de descendentes.
Dessa forma, informações confiáveis acerca do sistema reprodutivo são essenciais para
compreender como ocorrem as distribuições das frequências genotípicas e como elas
são transformadas em um sentido evolutivo ao longo de gerações (SHAW et al., 1981).
As espécies de árvores neotropicais, em geral, exibem características no sistema
de reprodução que possibilitam a persistência demográfica e a heterozigosidade mesmo
em densidades populacionais baixas. Certamente, a principal força responsável pela
23
evolução destas características em populações de árvores tropicais com densidade
reduzida, foram as pressões de seleção contra a endogamia (WARD et al., 2005).
Nesse contexto, a movimentação do pólen dentro de populações de plantas,
desempenha um papel fundamental na estruturação da diversidade genética (PARDINI e
HAMRICK, 2007).
Existem algumas espécies arbóreas que ocorrem de forma abrangente em
cabrucas (SAMBUICHI et al., 2009). Entre essas espécies está a Lecythis pisonis
Cambess pertencente à família Lecythidaceae. Na sapucaia, como é comumente
conhecida, o principal polinizador é a fêmea da abelha Xylocopa frontalis, e as suas
sementes são dispersas principalmente pelo morcego Phyllostomus hastatus, que come
o arilo e descartam as sementes em pontos distantes da árvore-mãe (MORI e PRANCE,
1981; MORI, 2001). Por causa da beleza de suas folhas, essa árvore é classificada como
espécie ornamental, além de ser um exemplo de espécie bandeira e apresentar
importância econômica (madeira utilizada na construção civil) e ecológica (indicada
para restaurações florestais) (SAMBUICHI et al., 2009; LOBÃO et al., 2004; BOWEN-
JONES e ENTWISTLE, 2002).
Portanto, considerando que o tipo de reprodução é um fator que afeta a estrutura
genética e dinâmica das populações (HOLSINGER, 2000) por estar diretamente
relacionado à variabilidade genética presente nas populações, se faz necessário
investigar o sistema reprodutivo das espécies que compõem a cabruca.
Para conhecer o sistema reprodutivo do modelo biológico escolhido, foram
utilizados os marcadores microssatélites nucleares desenvolvidos e otimizados no
capítulo 1, os quais são específicos para sapucaia.
Nesse sentido, o objetivo dessa pesquisa foi analisar o padrão em que se
reproduzem as famílias de Lecythis pisonis do sistema agroflorestal cacau-cabruca no
sul da Bahia, bem como, a distância de dispersão dos grãos de pólen nesta região.
24
METODOLOGIA
Área de estudo e delineamento amostral
Esta pesquisa foi realizada em fazendas presentes na zona rural dos municípios
de Ilhéus e Uruçuca, no estada da Bahia, Brasil. O levantamento da área de coleta foi
realizado através de um mapeamento prévio da existência de cabrucas na propriedade
para que as mesmas pudessem fazer parte do estudo. Esse mapeamento foi realizado
com ajuda dos funcionários das propriedades, sendo efetuada recompensa monetária por
cada árvore encontrada. A Figura 1 apresenta a imagem de tais famílias
georreferenciadas pela equipe de pesquisa.
Figura 1. Mapa da paisagem estudada com a localização das famílias amostradas no sul
da Bahia, Brasil.
A coleta foi realizada em parceria com o professor Eduardo Mariano Neto da
Universidade Federal da Bahia (UFBA), o qual é co-orientador desta pesquisa. O
25
esforço amostral de localização das sapucaias foi realizado pelo discente de mestrado do
professor citado, Ciro Tavares Florence, o qual também faz parte da equipe de pesquisa.
Após o levantamento inicial, foram coletados frutos em 12 famílias de sapucaia
nas cabrucas, ao longo de um gradiente continuo de floresta (quantidade de floresta
presente em um raio de 1 km) no entorno de cada árvore (família). A partir dos frutos,
algumas sementes foram colocadas para germinar na RPPN (Reserva Particular do
Patrimônio Natural) Nova Angélica, a qual se localiza no entorno da Reserva Biológica
de Una. Após 60 dias, o material foliar de 24 mudas por família foi coletado em cada
uma das 12 famílias.
As 12 famílias amostradas foram identificadas como: F6, F60, F66, F68, F76,
F87, F92, F93, F354, F361, F376, F377. Os 287 descendentes coletados, por sua vez,
foram denominados com o P (prole ou progênie), seguida por um número, por exemplo:
P1, P2, P3... P287.
Extração e quantificação de DNA
As amostras foliares das mudas foram colocadas em sacolas plásticas e
encaminhadas para o laboratório de Marcadores Moleculares, localizado no Centro de
Biotecnologia e Genética (CBG) da UESC (Universidade Estadual de Santa Cruz). As
folhas foram armazenadas em freezer a -20ºC. O DNA genômico das amostras foi
extraído a partir do protocolo CTAB 2% (Doyle & Doyle, 1987). Após a extração, a
quantificação do DNA extraído foi realizada por meio da análise comparativa com um
padrão molecular de concentração conhecida (DNA do fago λ) em gel de agarose 1,0%,
corado com Gel GreenTM
(Nucleic Acid Gel Stain) diluído a 0,2% e verificado em
transluminador com lâmpada de led azul (470 nm). Em seguida, esse DNA foi diluído
em água mili-Q para a concentração de uso (2,5ng/μL).
Amplificação dos locos SSR e genotipagem
Para a realização da genotipagem dos indivíduos coletados, ocorreu à
amplificação via PCR da sequência de DNA de interesse, utilizando os primers
microssatélites desenvolvidos previamente (RODRIGUES et al., 2014). A reação de
amplificação foi realizada em solução contendo: 7,5 ng de DNA genômico; 1,3μl de
tampão 10X, 3,25 mM de cada dNTP, 3,25 mg de soro de albumina bovino (BSA), 20
26
mM de MgCl2, 1U de Taq DNA polimerase (Phoneutria, Belo Horizonte, Minas Gerais,
Brasil), 3,0 μM de primer reverse e forward marcado com uma cauda de fluorescência
M13 (CACGACGTTGTAAAACGA), 0,03 μM de oligonucleotídeo M13,
complementar a cauda do primer forward, marcado com fluorócromos (6-FAM, VIC,
ou NED, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e água Mili-Q, para um volume
final de 13,0 μL.
As condições de termociclagem para cada reação de polimerase em cadeia
consistiu de uma etapa de desnaturação inicial a 94 ºC por 1 minuto; seguido por 30
ciclos compostos por uma etapa de desnaturação a 94 ºC por 1 minuto, uma etapa de
anelamento em temperatura específica para cada par de primer (RODRIGUES et al.,
2014) por 45 segundos, e uma etapa de extensão a 72 ºC por 1 minuto, seguido por 8
ciclos de anelamento de fluorescência M13 correspondente a 94 °C por 1 minuto, 53 °C
por 1 minuto e 72 °C por 1 minuto, além de um passo de extensão final a 72 ° C por 10
minutos.
As reações de amplificação foram observadas em gel de agarose a 1,0%, e em
seguida foram submetidas à eletroforese capilar no analisador automático de DNA ABI
3500 (Applied Biosystems) em sistema multiload para reduzir tempo e gastos com as
análises laboratoriais.
Para a realização da genotipagem foi utilizado o programa Gene Mapper versão
4.1 (Applied Biosystems).
Análise do sistema reprodutivo
Para analisar o sistema de reprodução de L. pisonis, foi utilizado o material foliar
de 287 sementes germinadas de 12 famílias. Os parâmetros estimados foram escolhidos
considerando o modelo de acasalamento misto proposto por Ritland and Jain (1981),
com o auxílio do programa MLTR 3.2 (RITLAND, 2002). Este modelo se baseia em
algumas premissas: (1) cada evento de acasalamento é devido a cruzamento aleatório ou
autofecundação; (2) a probabilidade de cruzamento é independente do genótipo
materno; (3) o conjunto de pólen é homogêneo no total de árvores maternas; (4) não
existe seleção entre fertilização e o tempo de análise para o genótipo da progênie; (5)
alelos em locos diferentes segregam independentemente (RITLAND, 1981).
Os parâmetros estimados foram: índice de fixação das matrizes (árvores
maternas) (fm), taxa de cruzamento multilocos (tm), taxa de cruzamento uniloco (ts), taxa
27
de cruzamento entre indivíduos aparentados (tm - ts), correlação de paternidade (rp) e a
correlação da taxa de cruzamento entre locos (rt).
Foi calculado um intervalo de confiança a 95% utilizando 10.000 reamostragens
pelo método de bootstrap entre as famílias. Para esses cálculos, o algoritmo utilizado foi
o de maximização da expectativa (EM), o qual tem uma melhor convergência para
atender o máximo do parâmetro e o desvio padrão é reduzido em relação ao algoritmo
Newton-Raphson (NR) (RITLAND, 1990).
Análise de paternidade
Para conhecer os indivíduos doadores dos grãos de pólen que geraram as
plântulas germinadas, foi realizada a análise de paternidade e, para isso, foram
utilizadas as 12 matrizes amostradas para a investigação do sistema de reprodução,
juntamente com 31 dos 40 indivíduos adultos usados para a caracterização dos locos
SSR desenvolvidos (RODRIGUES et al., 2014). A análise de paternidade foi realizada
com o auxílio do programa CERVUS 3.0.7 (KALINOWSKI et al. 2007).
Primeiramente foi realizada a análise da frequência dos alelos e, em seguida,
uma simulação de análise de parentesco. Os arquivos de saída dessas análises são
necessários durante as etapas requeridas pelo programa para concluir a análise de
paternidade. O Cervus utiliza a simulação de análise de parentesco para avaliar a
confiança na atribuição de paternidade ao pai candidato mais provável. Nessa etapa é
escolhido o algoritmo (LOD ou Delta), o qual serve de base para determinar ou não à
paternidade. O algoritmo escolhido foi o LOD.
Na análise de parentesco, a pontuação LOD é obtida tomando o logaritmo
natural (log na base 10) da relação global de verossimilhança. Para a pontuação positiva
de LOD foi atribuído parentesco com 95% de confiança, e significa que o pai candidato
é o verdadeiro pai. Uma pontuação de LOD igual zero significa que o pai candidato tem
a mesma probabilidade de ser o verdadeiro pai como o de não ser. Uma pontuação
negativa de LOD indica que um pai candidato não combina com a prole em um ou mais
locos, e que por isso, o pai candidato provavelmente não é o verdadeiro pai
(KALINOWSKI et al. 2007).
28
Análise da distância do fluxo de pólen
Com base na importância da polinização para o sistema de reprodução e para a
variabilidade genética da espécie utilizada, foi calculada a distância da dispersão de
pólen com ajuda do programa GPS TracKMaKer 13.9 (JÚNIOR, 1998). Utilizando esse
programa e a partir das coordenadas geográficas dos indivíduos atribuídos como
paternos, foi possível obter as distâncias percorridas pelos grãos de pólen.
29
RESULTADOS
Sistema reprodutivo
A tabela 2 apresenta uma síntese dos principais resultados obtidos acerca do
sistema reprodutivo de L. pisonis.
O Índice de fixação das matrizes (fm) foi igual a 0,431 e indica que
provavelmente as mesmas são aparentadas.
Tabela 2. Estimativas do sistema de reprodução de Lecythis pisonis a partir de 10 locos
SSR.
Parâmetro Estimativa Desvio padrão
fm 0.431 0,103
tm 1.000 0,000
ts 0.960 0,011
tm - ts 0.040 0,010
rpm 0.306 0,064
rt 0.000 0,003 fm = índice de fixação das matrizes, tm = taxa de cruzamento multiloco, ts = taxa de cruzamento uniloco, tm
- ts = taxa de cruzamento entre indivíduos aparentados, rpm = correlação de paternidade multiloco, rt =
correlação da taxa de cruzamento entre locos
Nota = ( ) intervalo de confiança a 95% utilizando 10.000 reamostragens bootstrap entre famílias.
A taxa de cruzamento multiloco (tm), foi igual a 1.000 e a taxa de cruzamento
uniloco (ts), foi de 0.960. As taxas de cruzamento multiloco e uniloco mostram o quanto
de cruzamentos a espécie pratica considerando vários locos e um único loco,
respectivamente. Esses valores de tm e ts foram iguais a 1, e esse resultado revela que a
sapucaia se reproduz somente por cruzamentos, sendo por isso, uma espécie alógama
obrigatória. A taxa de cruzamento entre indivíduos aparentados (tm - ts) demonstra que
os indivíduos cruzam aleatoriamente e não necessariamente com os indivíduos mais
próximos. A correlação de paternidade multiloco (rpm), que diz respeito à probabilidade
de dois indivíduos escolhidos ao acaso dentro de progênies possuírem o mesmo doador
de pólen, indicou que parte dos descendentes compartilham o mesmo pai. Já a
correlação da taxa de cruzamento entre locos (rt), que mede a proporção da endogamia
gerada pelo cruzamento entre indivíduos aparentados e por autofecundações, revelou a
30
inexistência de cruzamentos entre parentes e de autofecundação nas famílias
amostradas.
Análise de paternidade
Entre os 287 descendentes, 9 (3 %) tiveram a paternidade determinada. Dentre
os 43 indivíduos adultos totais, 29% (9 árvores) foram as doadoras de pólen dos
descendentes que tiveram seus pais amostrados.
Tabela 3. Plântulas que tiveram a paternidade atribuída, com as coordenadas
geográficas das árvores maternas e paternas e os valores estimados de LOD para
paternidade com nível de 95% de confiança.
Progênie Planta Planta Pontuação
mãe pai de LOD
P11 F6 F60 1,86E+14
P20 F6 F60 4,94E+14
P28 F60 F69 7,41E+13
P31 F60 F66 2,18E+14
P101 F76 F376 1,06E+14
P104 F76 F354 1,08E+14
P144 F87 F354 2,46E+14
P147 F92 F48 1,01E+14
P264 F376 F361 5,22E+14
As árvores F60 e F354 foram as doadoras de pólen de 4 das 9 plântulas que
tiveram seus pais conhecidos, cada um desses indivíduos com 2 filhos cada (tabela 3).
Os filhos P11 e P20 possuem estrutura familiar de irmãos completos, uma vez
que apresentaram mesma planta mãe (F6) e mesma planta pai (F60). Já os indivíduos
P28 e P31 apresentaram estrutura familiar de meios-irmãos, visto que, exibiram apenas
a mesma planta mãe (F60) com pais diferentes. A estrutura familiar de meios-irmãos
também foi observada nos descendentes P101 e P 104, que dividiram a mesma árvore
materna (F76), assim como, no descendente P144 que compartilhou a mesma árvore
paterna (F354) com o P104 (Tabela 3).
31
Distância do fluxo de pólen
O grão de pólen da árvore paterna F354, percorreu a menor distância para
realizar a polinização. A maior distância percorrida por grãos de pólen encontrada nesta
pesquisa foi de 15.26 km e deu origem ao filho P264 (tabela 4).
Tabela 4. Distância de polinização em L. pisonis em sistemas agroflorestais no sul da
Bahia.
Árvores paternas Árvores maternas Distância do fluxo
de pólen (km)
F60 F6 1,16
F60 F6 1,16
F69 F60 0,25
F66 F60 0,29
F376 F76 10,81
F354 F76 7,83
F354 F87 0,25
F48 F92 15,12
F361 F376 15,26
A média entre as distâncias percorridas pelos grãos de pólen foi
aproximadamente de 5,792 m.
Através da figura 2, é possível observar a localização geográfica das árvores
maternas e paternas, e assim, verificar a distância espacial entre tais árvores e
consequentemente notar as distâncias que os grãos de pólens percorreram na área
amostrada.
32
Figura 2. Localização e identificação das árvores maternas e paternas dos 9
descendentes no sul da Bahia, Brasil.
361
376
92
06 60
87 354
69
48
76 66
33
DISCUSSÃO
Existem algumas pesquisas que tratam do sistema de reprodução de espécies da
família Lecythidaceae (GAGLIANONE e AGUIAR, 2008; SOUZA et al., 2008;
POTASCHEFF et al., 2013), porém, este é único trabalho a abordar o sistema de
reprodução da espécie Lecythis pisonis Cambess. Além disso, o fato dessa investigação
ocorrer na cabruca, que é uma paisagem bastante abrangente no sul da Bahia, é outro
fator inovador. Assim, buscando ampliar e intercruzar as informações acerca dessa
arbórea, no contexto da cabruca, estimou-se a paternidade e a partir dela a distância
percorrida pelos grãos de pólen.
Sistema de reprodução, paternidade e distância do fluxo de pólen
O resultado encontrado no índice de fixação das matrizes (fm), o qual informa
sobre a endogamia das árvores maternas, mostrou parentesco entre as mesmas. Esse
resultado indica que provavelmente tais árvores foram originadas a partir do grão de
pólen doado pela mesma árvore. Esta movimentação histórica do grão de pólen explica
o fato das matrizes serem aparentadas. Para compreender melhor este resultado deve-se
considerar que para a efetivação da cabruca, a Mata Atlântica é raleada, e com isso um
número considerável de árvores é retirado, diminuindo as opções do polinizador.
Como verificado pela presente pesquisa as árvores matrizes da área amostrada se
reproduzem obrigatoriamente por cruzamentos. Trata-se, portanto, de uma espécie
alógama, uma vez que, a taxa de cruzamentos é superior a 95% (BESPALHOK et al.,
2012). Esse resultado confirma a suposição feita por Mori et al. (1980), acerca da
sapucaia em um estudo que teve a duração de 6 anos. No estudo, os pesquisadores
relatam que a sapucaia tem características de uma espécie alógama, sendo este o único
trabalho científico que investigou aspectos relacionados ao sistema de reprodução da
sapucaia, sendo por isso, de grande relevância para a abordagem dessa investigação e
para o conhecimento acerca da espécie em questão.
Nessa pesquisa, os autores citados estudaram 4 indivíduos de L. pisonis
localizados na Reserva Botânica do Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC), situado na
Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC), sul da Bahia, Brasil.
Além de outras investigações, eles contaram, em 5 flores de uma árvore, o número de
óvulos. Da mesma maneira, contaram ainda o número total de grãos de pólen em 5
34
anteras procedentes de 5 flores. Os autores mencionam também que outra evidência
favorável à alogamia nesta espécie é a alta razão de 3.700 grãos de pólen por óvulo, em
cada flor, o que pode indicar ainda que L. pisonis possui autoincompatibilidade (MORI
et al., 1980).
A autoincompatibilidade é um mecanismo de auto-reconhecimento que resulta
na rejeição de pólen pelos tecidos somáticos do sexo feminino da própria flor (HARING
et al., 1990). De fato a autoincompatibilidade é um dos mecanismos que promovem a
alogamia e segundo Bawa (1979), é encontrado com frequência em espécies tropicais.
Por não ter sido o foco desta pesquisa, não é possível afirmar que Lecythis
pisonis seja autoincompatível. Para investigar se a sapucaia é autoincompatível é
necessário que estudos futuros criem os cruzamentos artificiais necessários para
determinar se existe ou não reconhecimento por parte da planta de gametas que
contenham seu próprio material genético. A partir da constatação da rejeição, faz-se
relevante determinar qual o tipo de incompatibilidade. Em angiospermas hermafroditas,
como a sapucaia, observam-se dois sistemas de incompatibilidade controlados pela série
alélica S, a gametofítica e a esporofítica (RAMALHO et al., 1996).
É relevante salientar que neste tipo de sistema de reprodução, que é o
cruzamento, a presença do polinizador tem influência fundamental no sucesso
reprodutivo. Várias pesquisas mostraram que Lecythis pisonis Cambess é uma espécie
dependente de Xylocopa frontalis para a produção de frutos (MORI et al., 1980; MORI
e ORCHARD, 1980; MORI e PRANCE, 1981; MORI, 1988; MORI, 2001).
O processo evolutivo da espécie, provavelmente buscando o aumento e a
manutenção da variabilidade genética entre os indivíduos, promoveu o desenvolvimento
de um estame cada vez mais complexo. Esse acontecimento gerou a redução no número
de diferentes espécies de polinizadores que podem penetrar a flor (MORI e PRANCE,
1981). De acordo com Mori e Orchard (1980), em geral, quanto mais especializado é o
estame mais especializado é também o polinizador que visita a flor. Nessa perspectiva,
observações realizadas da coroa da sapucaia no sul da Bahia, Brasil, indicaram que
Xylocopa frontalis é a única abelha que entra em sua flor (MORI e ORCHARD, 1980).
Como, em geral, os indivíduos geograficamente mais próximos têm maiores
chances de se intercruzarem e consequentemente serem aparentados, o resultado obtido
no parâmetro "taxa de cruzamento entre indivíduos aparentados" (tm-ts) demonstrou que
os indivíduos, em geral, cruzam aleatoriamente o que é positivo para a manutenção da
35
variabilidade genética dos indivíduos, famílias e populações da espécie em estudo, que
por sua vez, é fundamental para a continuidade da espécie ao longo de gerações.
Entretanto, apesar do resultado obtido ter sido 0,040, ou seja, não significativo
(nível de confiança de 0,05), se considerarmos a amplitude do desvio padrão (0,030 –
0,050) observaremos a possibilidade desse resultado ser significativo, o que explica o
parentesco encontrado na maior parte dos filhos que tiveram os parentais determinados.
Em contrapartida, o resultado obtido é esperado quando apreciamos o número de
descendentes que não apresentam nenhum grau de parentesco, que é a sua maioria.
Uma possível explicação pela qual não ocorre cruzamento entre indivíduos
parentes é o fato da abelha polinizadora possuir um raio de vôo amplo que chega a uma
média diária de 6,7 a 10 quilômetros (ROUBIK, 1992), permitindo que a mesma visite
flores de indivíduos distantes entre si.
O resultado do parâmetro "correlação de paternidade multilocos" (rpm) indicou
que parte dos descendentes compartilham o mesmo pai, e uma possível explicação para
isso é o fato de algumas árvores paternas estarem relativamente próximas das árvores
maternas. Esta justificativa é completamente plausível quando se observa os resultados,
ocorrendo, por exemplo, entre os indivíduos P11 e P20 que compartilham o pai F60, e
os indivíduos P104 e P144 em que para ambos o pai é a árvore F354. Assim, apesar do
polinizador poder voar grandes distâncias, o mesmo pode “optar” por visitar a flor da
árvore mais próxima. Com esse comportamento, a abelha Xylocopa frontalis obtém o
recurso (pólen estéril) e ainda economiza energia.
Contudo, é importante ressaltar que foi observado um pequeno número de
progênies compartilhando o mesmo pai, visto que, para a maior parte não foi possível
determinar a árvore paterna. Por sua vez, o não compartilhamento do mesmo pai por
boa parte dos descendentes é outro fator favorável para a variabilidade genética da
espécie, uma vez que, pode promover o aumento no número de locos em heterose, o que
é interessante tanto para a conservação e manejo, quanto para o melhoramento (LÔBO e
VILELLA, 2005).
O resultado da correlação da taxa de cruzamento entre locos (rt) indica que não
há cruzamentos entre parentes nem autofecundação nas famílias amostradas. Esse
resultado corrobora com o resultado obtido no parâmetro “taxa de cruzamento entre
indivíduos aparentados”, uma vez que, o mesmo demonstra a inexistência de
cruzamentos entre parentes. Além disso, como a sapucaia se reproduz somente através
de cruzamento, era esperado que não houvesse autofecundação. A não ocorrência da
36
autopolinização contribui para a existência de uma maior variabilidade genética nas
famílias estudadas.
A reprodução entre indivíduos geneticamente semelhantes aumenta a
probabilidade de diferentes locos atingirem o estado homozigótico (LÔBO e VILELLA,
2005). Ademais, o menor número de genótipos em populações altamente
autopolinizadas pode reduzir a eficiência com o qual a seleção natural pode atuar,
restringindo a capacidade de suas populações responderem de forma adaptativa a uma
mudança ambiental (HOLSINGER, 2000).
As distâncias do fluxo de pólen, em sua maioria, foram grandes, indicando que o
polinizador está atuando ativamente na área. A média da dispersão de pólen foi de
aproximadamente 6 km, o que é condizente com o raio de vôo de forrageamento da
fêmea da abelha mamangava, a qual é a principal polinizadora da sapucaia (MORI,
2001). Porém, em apenas 3% dos descendentes foi atribuído à paternidade. Este
resultado assinala duas possibilidades, a primeira delas é o fato que devido à distância
da área percorrida, o delineamento amostral não contemplou todos os indivíduos
possíveis. E a segunda, é a possibilidade de ter ocorrido imigração de pólens dos
remanescentes de floresta Atlântica no entorno das famílias coletadas.
A imigração de pólen é determinada principalmente por exclusão genética. Em
síntese, genótipos multilocos dos descendentes (ou gametas) e os prováveis pais são
comparados, e se um genótipo do descendente (ou gameta) não é compatível com
qualquer adulto dentro da população local, é considerado um imigrante (fluxo de genes
aparente) (BURCZYK et al., 2004).
Implicações para a conservação
Este trabalho mostrou como interagem os indivíduos arbóreos adultos de uma
espécie bastante frequente no sistema agroflorestal cabruca, em um dos aspectos
principais da vida que é o sistema reprodutivo. Essa interação influencia tanto na
continuação da espécie na paisagem em que está inserida como na estrutura e qualidade
dessa paisagem.
De acordo com Perfecto e Vandermeer (2008), com o passar do tempo cada vez
mais florestas serão utilizadas para a agricultura, e serão nessas paisagens fragmentadas
que a biodiversidade do mundo estará localizada. Nessa perspectiva, um plano de longo
prazo para a conservação da biodiversidade tem de reconhecer esse fato, não só com
37
foco na preservação das manchas de vegetação nativa que permanecem, mas para o
manejo de uma paisagem que apresente um sistema de migração possível (PERFECTO
e VANDERMEER, 2008). Dessa forma, é urgente a necessidade em fomentar uma
agricultura ecologicamente sustentável (HARVEY et al., 2008).
Considerando a importância e abrangência da cacauicultura no sul da Bahia,
muitos estudos vêm sendo realizados buscando compreender melhor a interação entre a
cabruca e os fragmentos de Mata Atlântica, bem como, a fauna e a flora que as
constituem (DAWSON, 2013; FARIA, 2006, 2007; PARDINI, 2005; SAMBUICHI,
2002, 2003, 2006, 2009; SAMBUICHI et al., 2008, 2012; UEZU, 2008; TABARELLI
et al., 2010).
Nesse sentido, o conhecimento sobre o sistema reprodutivo de uma espécie que
ocorre com abrangência na cabruca é, sobretudo, extremamente aplicável na
compreensão da diversidade genética presente nesse sistema agroflorestal. Essas
informações permitem que estratégias para conservação e manutenção dessa
variabilidade seja criada, e se estabeleça na região. Consequentemente, a cabruca e a
espécie podem se tornar modelos viáveis para conservação.
38
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Horlei Ribeiro pelo suporte técnico, a Alesandro Souza
Daniela Borges, Daniele França, e Flora Bittencourt pela assistência com as estimativas
dos parâmetros estatísticos. Esta pesquisa foi financiada pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (#487030/2012-5) e a Fundação de
Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (Fapesb) (#PPP0008/2011). A Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES) e CNPq forneceram bolsas
para ABR e FAG, respectivamente.
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43
5. CONCLUSÕES GERAIS
a) Os dezesseis primers SSR nucleares desenvolvidos são altamente polimórficos e
informativos e por isso são ferramentas úteis para responder questões biológicas
sobre aspectos evolutivos e ecológicos
b) A espécie Lecythis pisonis Cambess se reproduz através de cruzamentos
aleatórios, é alógama.
c) A distância média (6 km) da dispersão de pólen encontrada corrobora com a
amplitude do raio de vôo do principal polinizador da sapucaia.
44
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS COMPLEMENTARES
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