universidade estadual de santa cruz programa...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
Diversidade Genética, Resistência à Antracnose e
Mapeamento de Genético da Mangueira
ELAINI OLIVEIRA DOS SANTOS ALVES
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Fevereiro de 2015
ii
ELAINI OLIVEIRA DOS SANTOS ALVES
Diversidade Genética, Resistência à Antracnose e
Mapeamento de Genético da Mangueira
Tese apresentada à Universidade Estadual de
Santa Cruz como parte das exigências para
obtenção do título de Doutora em Genética e
Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e Biologia
Molecular
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Fevereiro de 2015
A474 Alves, Elaini Oliveira dos Santos.
Diversidade genética, resistência à antracnose e mapeamento de genético da mangueira / Elaini Oliveira dos Santos Alves. – Ilhéus, BA: UESC, 2015.
xiii, 68 f. : il. Orientador: Ronan Xavier Corrêa. Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Gené- tica e Biologia Molecular. Inclui referências.
1. Genética vegetal. 2. Manga. 3. Diversidade gené-
tica. 4. Antracnose. 5. Mapeamento genético. I. Título.
CDD 581.35
iii
ELAINI OLIVEIRA DOS SANTOS ALVES
Diversidade Genética, Resistência à Antracnose e
Mapeamento de Genético da Mangueira
Tese apresentada à Universidade Estadual de
Santa Cruz como parte das exigências para
obtenção do título de Doutora em Genética e
Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e Biologia
Molecular
APROVADA: 25 de fevereiro de 2015
Dra. Edna Dora Martins Newman Luz
(CEPLAC/CEPEC)
Prof. Dr. Antonio Carlos Oliveira
(UESB)
Prof.ª Dra. Simone Gualberto Santos
(UNIME)
Dr. Daniel Oliveira Jordão de Amaral
(UESC)
Prof. Dr. Ronan Xavier Corrêa
(UESC – Orientador)
iv
DEDICATÓRIA
À minha mãe, Joana Oliveira dos Santos Alves e
ao meu pai, Belarmino Ferreira Alves (in memoriam).
v
AGRADECIMENTOS
À minha mãe, Joana, pelo apoio incondicional.
Ao meu orientador Dr. Ronan Xavier Corrêa, pela valiosa orientação.
Ao meu noivo, Clay Cardoso, por todo o incentivo e compreensão.
À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), principalmente ao Programa de
Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, por oferecer a oportunidade de
formação neste curso.
À FAPESB, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia, pela bolsa de
doutorado por três anos.
À CAPES, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela
bolsa de doutorado por um ano, inclusive quanto ao período sanduiche.
Ao meu coorientador Dr. Francisco Pinheiro Lima Neto, pela parceria e pelas
madrugadas dedicadas a coletas de folhas no campo, embaladas pelos épicos e
explosivos clássicos de Beethoven e Tchaikovsky.
À minha coorientadora Dra. Ioná dos Santos Araújo, pelo incentivo e mediação no
período sanduiche.
À Embrapa Semiárido, pelo convênio firmado com a UESC, possibilitando a
realização deste trabalho.
À Unicamp, principalmente à professora Dra. Anete Pereira, pela oferta do curso e
disponibilização de reagentes para a obtenção de biblioteca enriquecida de regiões
microssatélites.
À Dra. Maria Angélica Guimarães, colaboradora do projeto na área de Fitopatologia.
vi
Ao Dr. David Kuhn, supervisor de estágio durante o período sanduiche no ARS-
USDA (Agricultural Research Service - United States Department of Agriculture), por
facilitar minha estadia em território estrangeiro.
À Hilçana Ylka, estagiária na Embrapa Semiárido, pelo auxílio e por toda dedicação.
Ao técnico do laboratório do Centro de Biotecnologia e Genética da UESC, Orley, e
à assistente de pesquisa do USDA, Barbara Freeman, pelo auxílio no manuseio dos
equipamentos de genotipagem.
Ao técnico de laboratório Cícero, da Embrapa Semiárido, sempre muito prestativo
aos trabalhos realizados na instituição.
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular
da UESC que me orientaram na obtenção de conhecimentos.
À Rita Mércia Estigarribia Borges, quem orientou meus primeiros passos na área de
pesquisa.
Às amigas Carmem, Mariana, Poliana, Cida e Andréia, pelo suporte e pela fidelidade
na amizade.
A todos os colegas do curso, especialmente aos colegas com quem compartilhei
mais tempo no laboratório de Genética Aplicada, Eulaysa, Isabela, Manuela e Dani
Borges, pelo convívio e pela amizade.
Aos colegas do laboratório de Fitopatologia da Embrapa Semiárido, Marília, Karine,
Nelson, Conrado, Cristiane e Valéria, pela ajuda e troca de experiências.
Às colegas de curso e confidentes de desastres naturais da pós-graduação desde o
mestrado Kátia, Sara e Luciana, por compartilharem experiências e estarem sempre
dispostas a auxiliar.
A todos que de alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho e/ou
incentivaram.
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
AFLP - “Amplified Fragment Length Polymorphism” ou Polimorfismo de Comprimento
de Fragmento Amplificado
cM - centiMorgan
DNA – “Deoxyribonucleic acid” ou Ácido desoxirribonucléico
Embrapa - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EST - “Expressed Sequence Tags” ou Etiquetas de Sequências Expressas
IAC – Instituto Agronômico de Campinas
ITS - “Internal Transcribed Sequences” ou Seqüências Internas Transcritas
PCR - “Polymerase Chain Reaction” ou Reação em Cadeia da Polimerase
QTL - “Quantitative Trait Locus” ou Loco de Característica Quantitativa
RAPD - “Random Amplified Polymorphic DNA” ou Polimorfismo de DNA Amplificado
ao Acaso
RFLP - “Restriction Fragment Length Polymorphism” ou Polimorfismo de
Comprimento de Fragmento de Restrição
SNPs- “Single Nucleotide Polymorphism” ou Polimorfismo de Nucleotídeo Único
SSR - “Simple Sequence Repeat” ou Sequência Simples Repetida
UESC – Universidade Estadual de Santa Cruz
viii
EXTRATO
ALVES, Elaini Oliveira dos Santos, D.S., Universidade Estadual de Santa Cruz,
Ilhéus, fevereiro de 2015. Diversidade Genética, Resistência à Antracnose e
Mapeamento Genético da Mangueira. Orientador: Ronan Xavier Corrêa. Co-
orientadores: Francisco Pinheiro Lima Neto e Ioná dos Santos Araújo.
A Mangifera indica L. (manga) é uma espécie nativa da Índia e Sudeste asiático que
teve seu cultivo disseminado por regiões tropicais e subtropicais do mundo. O Brasil
é um dos maiores produtores e exportadores mundiais de manga e tem seu cultivo
comercial embasado em poucas variedades de origem americana. Dentre estas
poucas variedades, a ‘Tommy Atkins’ predomina nos plantios comerciais. Este fato
causa vulnerabilidade genética e ameaça a sustentabilidade da cultura, devido ao
cultivo monoclonal destas variedades e ao estreitamento genético das mesmas
proveniente do melhoramento genético. Por isso, o conhecimento da variabilidade
genética bem como o estudo da resistência a doenças em mangueira devem estar
entre os principais objetivos nos programas de melhoramento desta espécie. Os
objetivos deste estudo foram: i) descrever a diversidade genética de vinte acessos
do Banco Ativo de Germoplasma de Manga da Embrapa Semiárido, ii) avaliar a
resistência genética à antracnose em uma progênie (‘Haden’ x ‘Tommy Atkins’) e iii)
mapear genes relacionados a esta característica. Foram desenvolvidos 16 novos
marcadores microssatélites, os quais foram utilizados para analisar a variabilidade
genética dos vinte acessos juntamente com outros marcadores microssatélites
obtidos na literatura. Adicionalmente, estes acessos foram analisados quanto à
variabilidade genética com base em descritores morfológicos. A maioria destes
ix
acessos consiste de variedades consideradas brasileiras. Os agrupamentos com
base em dados de descritores morfológicos possibilitaram observar uma relação
com o histórico de melhoramento de alguns acessos, enquanto que o agrupamento
com base em dados moleculares não refletiu esse histórico, já que os marcadores
moleculares acessam regiões aleatórias do DNA, incluindo aquelas que sofrem
pressão de seleção e as que sofrem pouca ou nenhuma pressão. Para avaliar a
resistência de manga à antracnose, um método de inoculação foi otimizado para
inoculação em folhas destacadas, permitindo a avaliação até 10 dias após a
inoculação para a maioria dos genótipos analisados. Com base nas médias do
tamanho de lesões de uma progênie proveniente do cruzamento entre ‘Haden’ e
‘Tommy Atkins’ observou-se que a resistência à antracnose em folhas de manga é
complexa e possui genes de efeito maior. Esta mesma população foi genotipada
com marcadores SSR e SNP visando o mapeamento do genoma da manga. Os
marcadores SSR permitiram a eliminação de amostras de genótipos provenientes de
autofecundação enquanto os marcadores SNP foram bastante eficientes em
identificar híbridos provenientes de contaminações, pelas polinizações, presentes na
população estudada. Um mapa genético preliminar agrupou 18 locos em 8 grupos
de ligação que consistem de dois ou três locos cada grupo. Estes locos cobrem
165,3 cM do genoma da manga. O estudo da diversidade genética de acessos
considerados brasileiros, o conhecimento da herança da resistência de genótipos
mangueira à antracnose e a obtenção de um mapa genético, embora preliminar, são
informações escassas na literatura para a cultura e podem auxiliar programas de
melhoramento genético no desenvolvimento de cultivares superiores.
Palavras-chave: SSR, descritores morfológicos, SNP, Mangifera indica,
Colletotrichum gloeosporioides
x
ABSTRACT
ALVES, Elaini Oliveira dos Santos, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz,
Ilhéus, february of 2015. Genetic Diversity, Resistance to Anthracnose and
Genetic Mapping of Mango. Advisor: Ronan Xavier Corrêa. Advisor Committee
Members: Francisco Pinheiro Lima Neto e Ioná dos Santos Araújo.
Mangifera indica L. (manga) is native to India and Southeast Asia and had its
cultivation spread for tropical and subtropical regions. Brazil is one of the largest
producer and exporter of mango and has its commercial cultivation grounded in a few
varieties of American origin. Among these few varieties, the 'Tommy Atkins'
predominates in commercial plantations. This fact causes genetic vulnerability and
threatens the sustainability of the culture, due to monoclonal cultivation and narrow
genetic basis for breeding. Therefore, the knowledge of genetic variability and the
study of mango diseases resistance should be among the main objectives in
breeding programs. The objectives of this study were: i) to describe the genetic
diversity of twenty mango accessions of the Germplasm Bank of Embrapa Semiárido,
ii) evaluate the genetic resistance to anthracnose in the offspring ('Haden' x 'Tommy
Atkins') and iii) to map genes related to this feature. Sixteen new microsatellite
markers have been developed, which were used to analyze the genetic variability of
the twenty accesses along with other microsatellite markers from the literature. In
addition, these accesses were analyzed for genetic variability based on
morphological descriptors. Most of these accesses is considered as Brazilian
varieties. The grouping based on morphological descriptors allowed to observe a
historical relationship with improvement of some accesses. However the molecular
xi
array based on historical data did not reflect this, since the molecular marker access
random DNA regions, including those suffering selection pressure as well as others
under little or none seletion pressure. To assess the mango for anthracnosis
resistance, an inoculation method was optimized for inoculation of detached leaves,
allowing the evaluation 10 days after inoculation for most of the genotypes were
analyzed. Based on the average lesion sizes of the progeny from a cross between
‘Haden’ and ‘Tommy Atkins’ was observed that mango leaves resistance to
anthracnose is complex and has genes of major effect. This same population was
genotyped with SSR and SNPs markers in order to map the mango genome. The
SSR markers allowed the removal of samples from selfing genotypes while the SNP
markers were very efficient in identifying hybrids obtained by contamination during
the pollination process that generate this population. A preliminary genetic map
grouped 18 loci in eight linkage groups consisting each group of two or three loci.
These loci cover 165.3 cM of the mango genome. The study of the genetic diversity
of the Brazilian mango accesses, the knowledge of the resistance inheritance to
mango anthracnose as well as the preliminary genetic map obtained are scarce
information in the literature for this culture and can help the breeding programs to
develope superior cultivars.
Keywords: SSR, morphological parameters, SNP, Mangifera indica.
xii
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... vii
EXTRATO ................................................................................................................. viii
ABSTRACT ................................................................................................................. x
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 16
Mangifera L. ........................................................................................................... 16
Sistemática e evolução ....................................................................................... 16
Diversidade genética e mapeamento genético ................................................... 17
Antracnose em mangueira ..................................................................................... 20
Resistência genética à antracnose ..................................................................... 21
Mapeamento de genes de resistência de plantas a fitopatógenos ........................ 24
CAPÍTULO 1 ............................................................................................................. 28
Genetic diversity of mango accessions (Mangifera indica) using new microsatellite
markers and morphological descriptors .................... Erro! Indicador não definido.
Introduction ............................................................... Erro! Indicador não definido.
Material and methods ................................................ Erro! Indicador não definido.
Plant Material ......................................................... Erro! Indicador não definido.
Development of new SSR markers ........................ Erro! Indicador não definido.
Morphological Characterization ............................. Erro! Indicador não definido.
Statistical Analyses ................................................ Erro! Indicador não definido.
Results ...................................................................... Erro! Indicador não definido.
Discussion ................................................................. Erro! Indicador não definido.
Acknowledgments ..................................................... Erro! Indicador não definido.
xiii
References ................................................................ Erro! Indicador não definido.
Figure captions ......................................................... Erro! Indicador não definido.
CAPÍTULO 2 ............................................................................................................. 45
Natureza Genética da resistência à Colletotrichum em uma população segregante
de mangueira (Mangifera indica L.)........................................................................ 45
Introdução .............................................................................................................. 46
Material e métodos ................................................................................................. 47
Obtenção dos isolados fúngicos ......................................................................... 47
Teste de patogenicidade e preparo do inóculo ................................................... 47
Material vegetal utilizado .................................................................................... 48
Inoculações ......................................................................................................... 48
Análises estatísticas ........................................................................................... 50
Resultados ............................................................................................................. 50
Teste de patogenicidade ..................................................................................... 50
Avaliação da agressividade dos isolados em mudas .......................................... 51
Avaliação da resistência da população segregante Haden x Tommy Atkins à
antracnose em folhas destacadas ...................................................................... 52
Discussão .............................................................................................................. 55
Conclusão .............................................................................................................. 57
Referências ............................................................................................................ 57
CAPÍTULO 3 ............................................................................................................. 60
Identificação de híbridos de progênie Haden x Tommy Atkins e Mapa de ligação
preliminar para Mangifera indica L. ........................................................................ 60
Introdução .............................................................................................................. 61
Material e métodos ................................................................................................. 62
Resultados ............................................................................................................. 63
Discussão .............................................................................................................. 65
Referências ............................................................................................................ 66
CONCLUSÕES GERAIS ........................................................................................... 68
REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES ..................................................................... 69
14
INTRODUÇÃO
A Mangifera indica L. (mangueira) é uma espécie nativa da Índia e Sudeste
asiático que teve seu cultivo disseminado por regiões tropicais e subtropicais do
mundo. É uma das frutas mais procuradas no mundo, consumida preferencialmente
in natura e industrializada de diversas formas.
O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo e a manga está entre
as dez frutas mais produzidas no país, sendo a segunda mais exportada. O volume
da manga exportada do Brasil nos últimos três anos corresponde a cerca de 18% do
total das exportações de frutas frescas do país. Em 2011 e 2012, a receita obtida
pela exportação das mangas superou a receita obtida pela exportação de melões,
que figuram em primeiro lugar nas exportações de frutas do Brasil. Em 2013, a
receita obtida pela exportação de ambas foi praticamente equiparada (Anuário
Brasileiro de Fruticultura, 2011, 2012, 2013, 2014), o que evidencia a importância da
mangicultura para o país.
A moderna mangicultura brasileira está baseada nas variedades americanas,
sendo que a ‘Tommy Atkins’ é a mais representativa, pois reúne um maior número
de características de interesse aos segmentos da cadeia produtiva (produtores,
distribuidores e consumidores). Recentemente, a variedade Palmer predomina nas
expansões dos pomares da cultura e tende a tomar o espaço da Tommy Atkins
(Anuário Brasileiro de Fruticultura, 2014).
O cultivo monoclonal e o estreitamento genético proveniente do
melhoramento genético causam vulnerabilidade genética e ameaçam a
sustentabilidade comercial da cultura, uma vez que a suscetibilidade a determinadas
doenças pode causar grandes prejuízos, caso venha a ocorrer nos plantios
15
comerciais. Por isso, a resistência a doenças é uma das características mais
importantes na escolha de um cultivar para o plantio.
Dentre as doenças que ocorrem em mangueira, a antracnose (causada por
fungos do gênero Colletotrichum) é considerada a mais importante em pós-colheita,
principalmente em regiões de clima úmido. Na região Nordeste do Brasil, a produção
de manga vem aumentando e dominando principalmente o mercado para
exportação. No entanto, a incidência de doenças fúngicas causadoras de danos pós-
colheita pode acometer a cultura nos períodos chuvosos, causando prejuízos.
O melhoramento genético da manga é um procedimento demorado devido ao
seu longo período juvenil, autoincompatibilidade, baixo pegamento de frutos,
produção de uma única semente por fruto, poliembrionia e poliploidia, entre outros
aspectos. A espécie é predominantemente alógama, considerada alopoliploide, mais
provavelmente anfidiploide, ou seja, um poliploide constituído por dois conjuntos
cromossômicos de duas espécies diferentes (Pinto et al. 2002a).
A caracterização da diversidade genética da manga vem sendo bastante
estudada, principalmente após o advento dos marcadores moleculares, mas o
conhecimento da herdabilidade dos caracteres de importância agronômica,
principalmente caracteres quantitativos, é bastante escasso.
O mapeamento de genes é uma importante ferramenta nos programas de
melhoramento de espécies cultivadas, mas não tem sido relatado para manga
provavelmente devido aos referidos aspectos da natureza da espécie que tornam o
procedimento de cultivo e obtenção de dados demorado.
Atualmente, a Embrapa Semiárido possui um Banco Ativo de Germoplasma
(BAG) de Manga, composto de 162 acessos, e vem cultivando, desde 2002,
populações segregantes visando identificar genótipos superiores. Estas populações
são valiosas fontes para estudos de herdabilidade e mapeamento de características.
Assim, o presente estudo é uma parceria da UESC com a Embrapa utilizando os
acessos catalogados para descrever a diversidade genética, e uma progênie
(‘Haden’ x ‘Tommy Atkins’) para avaliar a resistência genética à antracnose e
mapear genes relacionados a esta característica.
16
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Mangifera L.
Sistemática e evolução
A maioria das espécies do gênero Mangifera L. ocorre na região tropical da
Ásia, considerada seu centro de origem e diversidade. Este gênero pertence à
família Anacardiaceae e possui 69 espécies, as quais foram descritas e classificadas
com base na morfologia floral antes da década de 1990 (Kostermans e Bompard,
1993). A maioria destas espécies está incluída em dois subgêneros (Mangifera e
Limus) com outras onze espécies ocupando posições taxonômicas incertas
(Mukherjee e Litz, 1998). Segundo Hidayat et al. (2011), há muitos problemas
taxonômicos e filogenéticos dentro do gênero Mangifera que são difíceis de
solucionar porque há dificuldades na caracterização dos órgãos reprodutivos das
espécies deste gênero.
Algumas espécies do gênero Mangifera produzem frutos. No entanto, a
espécie M. indica L. foi amplamente disseminada pelos continentes por produzir
frutos consideravelmente superiores, conhecidos como manga. Algumas variedades
da própria espécie M. indica produzem frutos com qualidade inferior que são
referidas como mangas selvagens, bem como os frutos das outras espécies
Mangifera (Kostermans e Bompard, 1993; Manica, 1981).
Estudos filogenéticos com base em marcadores moleculares envolvendo
variadas regiões do DNA podem auxiliar na compreensão da relação e evolução das
17
espécies de Mangifera. Estes estudos têm sido realizados, porém com uma
quantidade parcial de espécies do gênero, o que impossibilita inferências
conclusivas sobre a taxonomia do gênero. No entanto, estes estudos têm
comprovado o potencial destas ferramentas para o esclarecimento da taxonomia do
gênero.
Eiadthong et al. (2000) confirmaram a utilidade de marcadores AFLP na
análise da relação filogenética de 14 espécies Mangifera, dentre elas a Mangifera
indica. Yonemori et al. (2002) usaram sequências ITS de DNA ribossomal nuclear
para investigar as relações filogenéticas entre 14 espécies Mangifera. Nishiyama et
al. (2006) utilizaram hibridização genômica in situ para examinar relações
filogenéticas entre M. indica e oito espécies selvagens do gênero. Hidayat et al.
(2011) também analisaram a relação filogenética comparando sequencias do gene
matK do genoma do cloroplasto de 19 espécies do gênero, incluindo M. indica e
relataram ter encontrado limitação na utilização deste marcador para a taxonomia de
Mangifera. Os estudos mencionados foram regionais e, portanto, não abrangeram as
69 espécies conhecidas do gênero. Não há relato na literatura de uma análise
sistemática molecular completa envolvendo todas as espécies do gênero Mangifera,
no entanto, alguns desses autores sugerem, com base em análises moleculares
realizadas, que as espécies de Mangifera podem ser classificadas usando dados
moleculares.
Do ponto de vista evolutivo, entender as relações filogenéticas
intraespecíficas também é importante, principalmente para nortear a evolução
manejada pelos programas de melhoramento genético. Hidayat et al. (2013)
estudaram o padrão evolutivo de treze cultivares da Malásia, Taiwan e Indonésia
comparando sequencias ITS do DNA ribossomal nuclear.
Diversidade genética e mapeamento genético
Alguns estudos intraespecíficos visam detectar a diversidade genética
levando em consideração o tipo embrionário das variedades de manga. Os
genótipos desta espécie podem ser do tipo monoembriônico, que contêm um único
embrião zigótico e desenvolveu-se principalmente em regiões subtropicais (Índia),
ou do tipo poliembriônico, o qual contém um ou mais embriões e desenvolveu-se em
18
regiões tropicais, mais precisamente no sudeste asiático (Litz, 2009). Este tipo de
divergência é responsável, em parte, pela alta diversidade genética considerada
dentro da espécie. A ocorrência de hibridização dentro dos grupos de mesmo tipo
embriônico ou entre os grupos também atua no processo evolutivo da espécie.
Análises RAPD confirmaram que os tipos mono e poliembriônicos de manga
possuem bases genéticas diferentes e que alguns cultivares poliembriônicos que
ocorrem ao longo da costa oeste da Índia devem ter sido introduzidos do sudeste
asiático (López-Valenzuela et al., 1997; Ravishankar et al., 2004). Viruel et al. (2005)
também relataram uma clara diferenciação entre genótipos monoembriônicos e
poliembriônicos com base em marcadores SSR. Eles analisaram 28 cultivares e
sugeriram que a análise de um número maior de genótipos será necessária para
elucidar o processo de domesticação da mangueira e o deslocamento de material
vegetal entre diferentes países.
Kumar et al. (2001) mostraram que resultados mais expressivos na aplicação
de marcadores RAPD em estudos genéticos de mangueira são obtidos quando a
base genética é larga. Díaz-Matallana et al. (2009) utilizaram marcadores RAPD na
análise de diversidade em seis populações e recomendaram a aplicação de outros
marcadores moleculares para a análise da diversidade genética da cultivar ‘Hilacha’
da Colômbia para complementar as informações obtidas.
Uma larga base genética pode ser encontrada em coleções de germoplasma.
Segundo Bespalhok et al. (2007), germoplasma pode ser definido como o conjunto
de genótipos que podem doar genes para uma determinada espécie, o que torna
uma coleção de germoplasma uma importante fonte de variabilidade genética
disponível para o melhoramento de plantas.
Santos et al. (2008) realizaram o primeiro estudo sobre a similaridade
genética entre um grande número de acessos de mangueira envolvendo genótipos
provenientes de introduções no Brasil e detectaram similaridade entre 30 e 97%
entre os acessos da coleção de germoplasma estudada. Estes autores estimaram a
similaridade genética de 105 acessos de diferentes origens geográficas do Banco de
Germoplasma da Embrapa Semiárido (dos quais 53 são considerados cultivares
brasileiros) com base em marcadores AFLP. Estes marcadores, assim como os
RAPD, são do tipo dominante, ou seja, não permitem distinguir heterozigotos de
homozigotos.
19
Posteriormente, Ribeiro et al. (2012) analisaram a similaridade de 103
acessos do mesmo Banco de germoplasma, dentre os quais a maioria estava entre
os 105 analisados por Santos et al. (2008). Estes autores obtiveram o coeficiente de
similaridade entre 30 e 100% usando marcadores SSR e observaram agrupamentos
diferentes dos relatados por Santos et al. (2008). Marcadores SSR são do tipo
codominantes e podem, portanto, dar uma contribuição ainda maior aos programas
de melhoramento genético porque eles fornecem informação sobre o estado de cada
loco. Outros trabalhos de caracterização molecular de mangueira com base em
marcadores SSR também foram realizados (Viruel et al., 2005, Eiadthong et al.,
1999, Kumar et al., 2013).
Adicionalmente, tem-se constatado variabilidade genética intracultivar
utilizando marcadores moleculares (Begum et al., 2013a, Begum et al., 2013b,
Begum et al., 2013c).
Em suporte aos programas de melhoramento genético, além de estimar a
diversidade genética, os estudos com base em marcadores moleculares podem
identificar alguns marcadores específicos para acessos de M. indica, o que
possibilita a identificação genética de acessos em coleções de germoplasma (Pandit
et al, 2007; Tomar et al., 2011). Também tem sido realizados estudos de inferência
de pedigree (Schnell et al., 2006) e mapeamento genético (Kashkush et al., 2001),
entre outros trabalhos direcionados à genética da espécie.
O primeiro mapa de ligação genética da manga foi baseado em marcadores
AFLP (Amplified fragment length polymorphism) e formou 13 dos 20 grupos de
ligação esperados para a espécie (Kashkush et al., 2001). O referido estudo
analisou 29 progênies do cruzamento entre ‘Tommy Atkins’ e ‘Keitt’ e definiu 34
marcadores AFLP cobrindo 161.5 cM, sendo que a estimativa de tamanho do
genoma da manga em cM varia entre 440 a 590 cM. A partir daí nenhum outro mapa
de ligação genética de manga foi publicado.
Muitos avanços no entendimento da genética da mangueira foram obtidos,
principalmente após o advento do uso dos marcadores moleculares. No entanto,
estes avanços são poucos se comparados com os obtidos em outras fruteiras
perenes como cacau, laranja, pera, entre outras, que possuem um grande número
de marcadores específicos (como SSR e SNPs) desenvolvidos e,
consequentemente, aplicados aos estudos genéticos.
20
Antracnose em mangueira
Embora cultivada em diversas regiões, a mangueira prefere ambientes
tropicais com clima bem definido e inverno seco. A chuva e a alta umidade durante o
florescimento e desenvolvimento dos frutos reduzem o rendimento, propiciando
ainda o surgimento de doenças fúngicas (Cunha et al., 1994a).
Uma das doenças fúngicas mais importantes da mangueira é a antracnose, a
qual ocorre em todas as áreas produtoras do mundo, variando a incidência da
doença de acordo com a umidade do ambiente (Cunha et al., 1994b).
Espécies de Colletotrichum são responsáveis pela ocorrência de antracnose
numa extensa gama de hospedeiros (Menezes et al., 2002). A espécie
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. tem sido referida como agente
causal de antracnose em mangueira (Cunha et al., 1994b) e outras fruteiras
incluindo pinha (López e Pereira, 2010), abacate (Coates et al., 1993), maçã
(Carvalho et al., 2000), goiaba (Singh e Sharma, 1982), caju (Lopez e Lucas, 2010),
mamão (Dickman, 1994; Andrade et al., 2007), maracujá (Junqueira et al., 2003) e
citrus (Feichtenberger et al., 2005). Este fungo é associado à pelo menos 470
hospedeiros de diferentes gêneros (Ferrari et al., 2011).
O fungo C. gloeosporioides é a forma imperfeita ou anamorfa do fungo
Glomerella cingulata (Ston.). Esta espécie pertence ao reino Eumicota, Filo
Ascomicota, Ordem Sordariomycetes, Família Glomerellaceae e Gênero Glomerella
(Colletotrichum) (Index Fungorum, 2015).
Outras espécies do mesmo gênero também foram relatadas como agente
causal de antracnose em mangueira, como Colletotrichum acutatum (Arauz, 2000;
Jayasinghe e Fernando, 2009), Colletotrichum asianum, Colletotrichum fructicola,
Colletotrichum tropicale, Colletotrichum karstii e uma nova espécie denominada
Colletotrichum dianesii (Lima et al., 2013).
Este patógeno afeta ramos, folhas, inflorescências e frutos, podendo
sobreviver na forma saprofítica por longo tempo em ramos mortos, frutos
remanescentes e em hospedeiros alternativos, que podem ser várias espécies de
plantas silvestres e cultivadas, de onde se disseminam pela chuva ou pelo vento
(Cunha et al., 1994b), por insetos e ferramentas (Tavares, 2004). Com o
desenvolvimento da doença, folhas, pecíolos e ramos infectados servem de fonte de
inóculo para outras partes da planta, como flores e frutos (Ferrari et al., 2011).
21
O desenvolvimento da antracnose é favorecida por temperaturas e umidade
relativa elevadas. Os conídios do fungo são liberados e disseminados quando os
acérvulos se encontram úmidos, germinam na presença de água e, após a
germinação, produzem um apressório, iniciando a penetração no tecido do
hospedeiro (Tavares, 2004).
O sintoma típico da doença é caracterizado por manchas grandes e
arredondadas de bordos ligeiramente elevados e com o centro da lesão levemente
deprimido, onde são produzidas massas de conídios alaranjados (Bailey e Jeger,
1992).
Os frutos podem ser afetados em qualquer estádio de seu desenvolvimento.
Quando novos, chegam a cair antes de amadurecerem, mas durante o processo de
amadurecimento o patógeno pode, a princípio, ficar latente e posteriormente
provocar seu apodrecimento (Cunha et al., 1994b).
O mercado externo exige tratamento pós-colheita contra a antracnose para
que os frutos cheguem aos mercados importadores em boas condições de
comercialização (Cunha et al., 1993). A imersão dos frutos em água quente pura ou
combinada com fungicidas é o tratamento mais recomendado e mais econômico
para o controle da antracnose após a colheita. Cultivares que possuem a casca mais
grossa, como a ‘Tommy Atkins’ e a ‘Keitt’, suportam bem o tratamento a 54º ± 1ºC
somente com água quente, porém, aquelas que possuem a casca mais fina, como a
Haden, devem ser tratadas a 52ºC com adição de fungicida (Filgueiras et al., 2000).
A identificação de alguns cultivares suscetíveis e outros resistentes tem sido
relatada (Fisher et al., 2009; Carvalho et al., 2004; Ploetz, 1994). Das variedades
plantadas para o mercado externo a ‘Tommy Atkins’ é considerada a menos
suscetível à antracnose (Prusky et al., 2009). Outras variedades identificadas como
resistentes são IAC 111, Alfa, Beta, Parvin (Galli et al., 2009), Surpresa e Zill
(Fischer et al., 2009). As variedades Haden, Bourbon, Roxa e Rosa, de grande
aceitação comercial, são tidas como bastante suscetíveis (Cunha et al., 1994b; Galli
et al., 2009).
Resistência genética à antracnose
A resistência genética de espécies cultivadas a determinadas doenças tem
sido alvo de estudos desde o advento dos trabalhos de Mendel. A interação entre
22
patógeno e hospedeiro foi descrita geneticamente pela primeira vez por Flor (1955),
o qual definiu o modelo gene-a-gene, presumindo que para cada gene de resistência
no hospedeiro existe um que corresponde a virulência no patógeno. Esta teoria dá
suporte ao entendimento da coevolução do hospedeiro e do patógeno.
O processo evolutivo, por meio da seleção natural, tende a favorecer
indivíduos com genes de resistência e patógenos com genes de virulência,
estabelecendo um processo de coevolução do hospedeiro e do patógeno, o que
permite a sobrevivência de ambos (Borém e Miranda, 2009). Portanto, o
desenvolvimento de cultivares superiores advindos de novas fontes de resistência
genética a diversas doenças é de grande importância, já que o uso de cultivares
resistentes é a estratégia mais eficiente e econômica de controlar as doenças de
plantas (Bueno et al., 2001; Yorinori e Kiihl, 2001), além de conferir grande
vantagem ambiental ao proporcionar a diminuição do uso de agrotóxicos.
Segundo Yorinori e Kiihl (2001) a seleção de cultivares resistentes nem
sempre é simples, pois para a maioria das doenças a resistência estável
(monogênica) é menos frequente.
A investigação do modo de herança de genes de resistência à antracnose em
algumas culturas tem sugerido um padrão mendeliano (Faleiro et al., 2003; Marin et
al. 2003; Mahasuk et al., 2009). No entanto, em algumas culturas bastante
estudadas, como feijão, milho e pimenta, observou-se que a tendência de um
padrão mendeliano da resistência à doença pode ocorrer devido a existência de um
gene de efeito maior associado a genes de efeito menor (Dantas Neto et al., 2005;
Mahasuk et al., 2009; Kim et al., 2008; Faleiro et al., 2003, Campa et al., 2011;
Gonçalves-Vidigal et al., 2012).
Mahasuk et al. (2009) estudaram o modo de herança da resistência à
antracnose em pimenta (Capsicum spp.) e identificaram três diferentes genes
recessivos, cada um atuando na resistência de diferentes partes da planta (mudas,
frutos verdes e frutos vermelhos). Com base na análise de ligação, eles sugeriram
que os genes de resistência em frutos verdes e vermelhos estavam ligados
(frequência de recombinação de 0,25), mas o gene de resistência das mudas não
estava ligado aos genes de resistência dos frutos. Kim et al. (2008) identificaram, na
cultura, um gene de efeito maior associado à resistência a antracnose. A distribuição
da população segregante e os resultados dos testes de qui-quadrado indicaram que
esta resistência é controlada por um único gene recessivo, mas a distribuição
23
contínua da população segregante sugeriu que genes de efeito menor possam
existir e afetem a resistência.
Em feijoeiro, estudos da segregação da resistência a antracnose inicialmente
evidenciaram uma herança monogênica. Vários estudos foram realizados no sentido
de identificar e mapear genes de resistência para diferentes raças de C.
lindemuthianum com base em diferentes cultivares. Foram identificados diferentes
locos para diferentes cultivares analisados, caracterizando a existência de séries
multialélicas e/ou agrupamentos gênicos, bem como foram mapeados genes de
efeito menor e QTL para a resistência da cultura à antracnose (Adam-Blondon et al.,
1994; Alzate-Marin et al., 1999; Geffroy et al., 2000; Faleiro et al., 2003, Campa et
al., 2011; Gonçalves-Vidigal et al., 2012). Esta observação pode ser resultante do
avanço no entendimento dos mecanismos moleculares sobre a resistência e das
especificidades da evolução da interação planta-patógeno em cada patossistema.
Kelly e Vallejo (2004) revisaram os estudos direcionados a resistência a
antracnose em feijoeiro e sugeriram que a localização da maioria dos genes de
efeito maior que conferem resistência à doença possibilita a piramidação dos genes
para desenvolver resistência mais durável e que se faz necessário elucidar os
mecanismos moleculares por trás da resistência para confirmar o modelo gene-a-
gene e caracterizar as interações planta-patógeno a nível molecular.
Modelos contrastantes de herança foram encontrados para a resistência a
antracnose em milho, tais como dominância, aditividade e suas interações e indícios
de resistência de herança complexa, provavelmente condicionada por genes de
pequeno efeito (Matiello et al., 2012).
Em manga, assim como em outras fruteiras que são acometidas por
antracnose, os estudos da genética da resistência ainda são iniciais e têm sido
realizados visando, basicamente, a identificação de fontes de resistência. Estudos
no sentido de entender o modo de herança dos genes de resistência, bem como o
mapeamento destes genes são essencialmente importantes para acelerar os
avanços no melhoramento da cultura.
24
Mapeamento de genes de resistência de plantas a fitopatógenos
O mapeamento genético surgiu com as pesquisas de Thomas Hunt Morgan
sobre ligação e recombinação genética. Em 1913, Sturtevant, um dos seus
estudantes, sugeriu a utilização da frequência de recombinantes como uma medida
da distância entre dois genes, o que permitiu a construção de mapas genéticos
(Griffiths et al., 2008). Assim, inicialmente, os mapas genéticos representavam a
posição relativa dos genes com base nos marcadores fenotípicos de um
determinado organismo.
Os métodos clássicos de mapeamento são relativamente adequados para
características de herança simples. No entanto, a maioria das características
vegetais e animais de importância econômica são quantitativas. Segundo Young
(1996), a genética quantitativa clássica não tem sido suficientemente adequada para
dissecar caracteres de herança complexa, cuja expressão fenotípica apresenta uma
variação contínua, atribuída à segregação simultânea de muitos genes distribuídos
pelo genoma. Estes caracteres são denominados QTL (“Quantitative Trait Loci”).
Com o uso dos marcadores moleculares e o desenvolvimento de ferramentas
estatísticas computacionais tornou-se possível mapear QTLs, incrementando a
construção de mapas genéticos para o melhoramento genético de uma espécie.
O mapeamento de genes baseia-se na verificação de desequilíbrio de ligação
entre dois locos diferentes em uma população segregante. Se dois alelos são
encontrados juntos em uma população com maior frequência do que a esperada
para os locos de segregação independente, os alelos estão em desequilíbrio de
ligação. A escolha dos genitores com fenótipos contrastantes para a característica
que se deseja mapear é extremamente importante na construção de mapas
genéticos, de forma a maximizar o desequilíbrio de ligação entre um loco e a região
genômica associada à característica de interesse (Ferreira e Grattapaglia, 1998).
Além da obtenção de dados fenotípicos em uma progênie, também é princípio
básico do mapeamento genético a identificação de regiões no genoma associadas
aos fenótipos dos indivíduos em uma progênie (Broman e Sen, 2009), trabalho que
ficou mais preciso e eficiente com o uso de marcadores moleculares. Assim, uma
grande variedade e quantidade de marcadores moleculares são essenciais para
acessar diversas variações no DNA e identificar genes associados a uma
característica de interesse.
25
Existem, basicamente, três tipos de variação alélica com grande importância
para estudos com base em marcadores de DNA: variações no número de repetições
de sequência (Microssatélites), deleções ou inserções (InDels) e polimorfismo de um
único par de nucleotídeo (Single Nucleotide Polymorphism – SNP). Métodos como
RFLP, AFLP, RAPD, dentre outros, constituem estratégias indiretas para acessar
estas variações alélicas (Mammadov et al., 2012).
Presentes em genomas eucariotos, os microssatélites (Simple Sequence
Repeat – SSR) são caracterizados por uma sequência de 1 a 6 nucleotídeos, que se
repete dezenas, ou mais raramente, centenas de vezes. O polimorfismo alélico de
um loco SSR ocorre devido a mudanças no número de repetições que surgem
provavelmente de “escorregões” na replicação do DNA, recombinação desigual ou
alinhamento incorreto das fitas de DNA. A análise SSR é realizada pelo uso de
primers específicos que flanqueiam as repetições microssatélites (Salles et al., 2003;
Tóth et al., 2000).
Marcadores SSR são codominantes e considerados altamente polimórficos e
informativos. Eles têm ampla distribuição genômica, natureza multialélica e locos
frequentemente conservados entre espécies relacionadas. Uma das grandes
vantagens que apresentam em relação aos marcadores desenvolvidos
anteriormente é a necessidade de pequena quantidade de DNA, já que são
baseados em PCR. Exibem boa reprodutibilidade, não requerem radioatividade e
estão bem dispersos no genoma, em regiões codificadoras e não codificadoras
(Salles et al., 2003). Segundo Schlotterer (2004), estes marcadores provavelmente
tiveram um grande impacto sobre a construção de mapas genéticos em uma grande
variedade de espécies.
Marcadores SSR foram desenvolvidos para manga por Duval et al. (2005),
Honsho et al. (2005), Schnell et al. (2005), Viruel et al. (2005), Ravishankar et al.
(2011), Chiang et al. (2012).
Na última década, os SSRs obtiveram crescente preferência em estudos
genéticos até o recente advento dos SNPs. Os SNPs são o tipo mais comum nas
diferenças de sequência entre alelos e são passíveis de utilização direta como
marcadores genéticos devido aos recentes avanços no sequenciamento genômico.
Estes marcadores possuem uma distribuição genômica mais ampla que os SSRs e
reprodutibilidade superior, apesar de não serem tão polimórfico quanto os SSRs
(Schlotterer, 2004).
26
Um marcador SNP pode ser definido como uma variação de nucleotídeos
numa localização específica do genoma que se apresenta numa frequência de pelo
menos 1% em uma determinada população. Normalmente apresenta polimorfismo
do tipo bialélico (Brookes, 1999; Liao e Lee, 2010), portanto, com baixo conteúdo
polimórfico por loco. No entanto, estes marcadores possuem baixa taxa de mutação
e facilidade de automoção, além de grande abundância no genoma, podendo ser
utilizados em estudos de distribuição alélica e de desequilíbrio de ligação de
características genéticas complexas (Schlotterer, 2004). Seu potencial tem sido
exaustivamente explorado na genética humana, porém, somente recentemente, vem
crescendo sua aplicação em estudos de ecologia, evolução e conservação (Morin et
al., 2004; Seeb et al., 2011; Helyar et al., 2011), assim como no melhoramento de
plantas cultivadas (Jin et al., 2003; Ganal et al., 2009; Byers et al., 2012, Mammadov
et al., 2012).
Os marcadores microssatélites ainda são muito utilizados em estudos de
genética molecular vegetal devido ao seu potencial polimórfico. No entanto, o custo,
rendimento e reprodutibilidade da técnica limitam sua aplicação em larga escala.
Apesar de possuírem um potencial polimórfico mais baixo que os microssatélites, os
SNPs se destacam na aplicação devido a recentes tecnologias desenvolvidas para
genotipagem deste tipo de marcadores, envolvendo o processamento de um grande
número de marcadores e amostras simultaneamente (Mammadov et al., 2012), o
que agrega menor custo, maior rendimento e nível de reprodutibilidade superior em
relação às técnicas anteriores de acesso a polimorfismo de DNA.
Um suposto número infinito de SNPs pode ser identificado em um genoma
totalmente sequenciado, o que aumenta o potencial do uso desses marcadores para
diversas abordagens em estudos genéticos e, consequentemente, exige a utilização
de técnicas capazes de analisar um grande número de marcadores SNPs
simultaneamente.
Bom rendimento, baixo custo relativo e alta reprodutibilidade são requisitos
decisivos para que uma técnica seja capaz de oferecer excelente suporte em
estudos genéticos. Novas técnicas vêm sendo desenvolvidas com base em
nanotecnologia para possibilitar alto rendimento na genotipagem, com e sem
amplificação alvo-específica e utilização de biochips. Estas tecnologias estão sendo
comparadas e aplicadas com sucesso nas rotinas de genotipagem com marcadores
SNPs (Chan et al., 2011; Bhat et al., 2012, Matthew et al., 2013).
27
A abundância dos marcadores SNPs aliada à tecnologia de genotipagem de
alto rendimento apresentam grande potencial para gerar mapas genéticos muito
densos e associar marcadores a características de interesse no melhoramento
genético (Rafalsky, 2002; Byers et al., 2012), já que o mapeamento genético exige a
análise de um grande número de amostras de DNA individualmente processadas
com um grande número de marcadores, a fim de aumentar a probabilidade de
encontrar um marcador o quanto mais próximo possível do gene de interesse.
Informações sobre a herança de características em mangueira são poucas.
Sharma e Majunder (1988) observaram que o tamanho anão e a regularidade do
porte são caracteres controlados por genes recessivos que podem estar ligados, o
tamanho dos frutos parece ser governado por genes aditivos, a cor da casca
vermelha parece ser dominante. Além disso, evidências de herança citoplasmática
foram obtidas em relação à incidência de cancro bacteriano, enquanto a
‘malformação’ parece ser um carater dominante. No entanto, ainda não há relatos de
associação de marcas moleculares a genes de interesse agronômico no genoma
desta espécie.
28
CAPÍTULO 1
Genetic diversity of mango accessions (Mangifera indica) using new microsatellite markers and
morphological descriptors
Elaini Oliveira dos Santos Alves1, Francisco Pinheiro Lima Neto
2, Carlos Antônio Fernandes Santos
2, Ierla Carla
Nunes dos Santos Ribeiro2, Cláusio Antônio Ferreira de Melo
1, Ioná Santos Araújo Holanda
3, Anete Pereira de
Souza4, 5
, Ronan Xavier Corrêa1*
1UESC, Universidade Estadual de Santa Cruz, Departamento de Ciências Biológicas, Rodovia Jorge Amado, km
16, CEP 45662-900 – Ilhéus, BA, Brazil.
2Embrapa Semiárido, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. BR 428 KM 152. Zona Rural 56300970 -
Petrolina, PE - Brazil - Caixa-postal: 23.
3UFERSA, Universidade Federal Rural do Semiárido, Av. Francisco Mota, Bairro Costa e Silva, CEP 59.625-
900 -Mossoró, RN Brazil.
4UNICAMP, Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Vegetal CEP
13083-862, Campinas, São Paulo, Brazil.
5UNICAMP, Universidade Estadual de Campinas, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, CEP
13083-875, Campinas, SP, Brazil.
*Corresponding author:
E-mail: [email protected]; Telephone: +557336805003 Fax: +557336891126
Abstract: Genetic diversity estimates based on morphological and molecular data can provide different
information on the relationship between cultivars of a species. This study aimed to develop new microsatellite
29
markers as additional tools in genetic studies on mangoes (Mangifera indica), and to analyze the genetic
variability of 20 mango accessions based on morphological descriptors and microsatellite markers. We aimed to
better understand these cultivars’ enhanced breeding histories and to support crossbreeding planning. Forty-eight
positive clones were selected from a library enriched with microsatellite regions for sequencing and primer
design. Four plants of each of the 20 accessions were used for morphological observations, based on 48
morphological descriptors. Twenty accessions were analyzed using 27 microsatellite markers, of which 16 were
developed during this study. The clusters, based on the morphological descriptors by Ward-MLM strategy and
the microsatellite markers, suggested that Brazilian mango cultivars have extensive genetic diversity and are
related to cultivars with different provenances, demonstrating their different enhanced breeding histories.
Keywords: breeding; germplasm; Mangifera indica; molecular marker; Ward-MLM.
30
Introduction
The mango (Mangifera indica) is the most widespread of the 69 species of the genus Mangifera, from
the Anacardiaceae family (Kostermans and Bompard 1993). The fruit’s suitability for cultivation is well
documented and over the centuries, its commercialization has grown extensively.
The Portuguese first introduced the mango tree to Brazil, bringing polyembryonic cultivars to the
Brazilian state of Bahia from Southeast Asia in the 16th
century; these resulted in fibrous fruits that were also
called the ‘Filipino breed’. These polyembryonic types were subsequently grown in Brazil, which resulted in
many different regional mango trees, which came from the planting of seeds, such as the ‘Espada’ and the
‘Rosa’. Monoembryonic cultivars were introduced from the middle of the 20th
century, provided by enhanced
genetic breeding in North America, such as ‘Tommy Atkins’, ‘Keitt’, ‘Palmer’, ‘Haden’ and ‘Van Dyke’ (Pinto
et al. 2002; Soares 2000). The introduction of these cultivars, coupled with the adoption of irrigation in
Northeastern Brazil, caused a substantial change in the cultivation of this fruit tree, characterized by much
improved yields.
The search for promising new cultivars requires knowledge and understanding of their genetic diversity,
because genetic enhancement can lead to the genetic base becoming less rich. Thus, knowledge of genetic
diversity could be used to identify hybrid combinations with a greater heterotic effect, thereby increasing the
possibility of finding superior genotypes in the segregant generations (Cruz et al. 2004) and decreasing
inbreeding depression, which is a serious problem for M. indica.
To identify cultivars and studying genetic diversity, the characteristics of the fruit, leaves, panicle and
others parts have been used successfully as conventional genetic markers in M. indica. However, their
morphological characteristics have low levels of polymorphism and are sensitive to environmental change. Thus,
many genetic diversity studies based on morphological characterization have not reflected the individuals’ actual
genetic diversity.
Using molecular markers, all DNA information can be targeted in the evaluation, depending on the
nature of the marker used. Molecular markers are considered neutral, i.e. they are not influenced by
environmental conditions. In addition, if they are not linked to a gene of agronomic interest, they will be under
little or no selective pressure in the culture’s enhanced breeding process. Molecular markers have therefore been
used regularly for diversity studies in mangoes (Díaz-Matallana et al. 2009; Ravishankar et al. 2004; Kumar et
al. 2001; Santos et al. 2008).
31
However, many morphological characteristics are influenced by selection through many generations
and represent the culture’s enhanced breeding history. Therefore, morphological characterization is essential,
especially in enhanced breeding programs. Thus, genetic diversity estimates that are based on morphological and
molecular data provide different relational information among cultivars, which are important for choosing
genitors for hybridizations and obtaining information regarding the diversity of a germplasm bank.
The aim of this study was to develop and characterize new microsatellite markers as an additional tool
for genetic studies in mangoes. Additionally, the genetic variability of 20 mango accessions, mostly Brazilian
cultivars, were analyzed using the Ward-modified location model (Ward-MLM) strategy to evaluate
morphological descriptors and microsatellite markers for other clustering methodology. The genetic diversities
of certain Brazilian cultivars and their relationships with foreign cultivars were analyzed using this approach,
with the aim of better understanding these cultivars’ enhanced breeding histories and supporting crossbreeding
planning to produce superior cultivars.
Material and methods
Plant Material
The Banco Ativo de Germoplasma de Mangueira da Embrapa Semiárido (a mango Active Germplasm
Bank—AGB—in northeast Brazil) provided 20 accessions, most of which were Brazilian cultivars. The city
where the AGB is located (Juazeiro, coordinates 09°24’S, 40° 26’W) has a semi-arid climate, with 541.6 mm
mean annual rainfall and 58.8% relative humidity. The city’s average annual temperature is 26.8°C and it has a
Vertisol type soil. This AGB maintains 162 accessions, 103 of which were characterized by Ribeiro et al. (2013).
Each accession from this AGB comprised four plants planted with a 10-m × 10-m spacing. The 20 accessions
used in this study were: ‘Ametista’, ‘Comprida Roxa’, ‘Edward’, ‘Espada Itaparica’, ‘Foice’, ‘Haden’, ‘Ipuçaba’,
‘Juazeiro II’, ‘Juazeiro III’, ‘Juazeiro VI’, ‘Keitt’, ‘Kensington’, ‘Manzanillo’, ‘Palmer’, ‘Pêssego DPV’, ‘Pingo
de Ouro DPV’, ‘Princesa’, ‘Recife’, ‘Rosari’ and ‘Surpresa’.
Development of new SSR markers
A library enriched with microsatellite regions was developed according to Billote et al. (1999). The
plant genomic DNA from the cultivar ‘Tommy Atkins’ was isolated from foliar sample tissues using the Cetyl
trimethylammonium bromide (CTAB) method (Doyle and Doyle 1990). The DNA was digested with restriction
32
enzyme AfaI and its fragments were linked to adapters Rsa 21 (5 CTCTTGCTTACGCGTGGACTA 3) and
Rsa 25 (5 TAGTCCACGCGTAAGCAAGAGCACA 3) and then preamplified using complementary primers to
the adapters. The amplification products were incubated with (CT)8 and (GT)8 biotinylated microsatellite probes
for a period of 10 minutes to achieve hybridization. Subsequently, the enriched DNA fragments were captured
using magnetic spheres that were coated with streptavidin (Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA). These
selected fragments were amplified using PCR, cloned into vector pGEM®-T and transformed into Escherichia
coli XL1-BLUE. Forty-eight positive clones were selected for sequencing. The sequences were edited using
BioEdit software - version 7.2.3 (Hall, 1999) to assemble contigs. The Chromas software (version 2.4.1) was
used to eliminate the adapter sequences. An SSRLocator program was used to identify the microsatellite regions
and the Primer3 software (Rozen and Skaletsky, 2000) was used to design the primers. PCR was performed to
amplify DNA from the 20 mango accessions using the new primers. The reactions (total volume of 10 µL)
included 20 ng of DNA, 0.8 µM of each primer, 1 µL of 10 × PCR buffer, 4 mM of dNTP mix and 2 mM of
MgCl2. The following PCR program was used for all loci: 94°C for 2 min; 35 cycles at 94°C for 30 s, 54°C for
45 s, 72°C for 1 min; and a final extension of 6 min at 72°C. The amplification products were subjected to
vertical electrophoresis in polyacrylamide denaturing gels (6%), which were stained with silver nitrate (Creste et
al. 2001). The alleles’ sizes were estimated by comparing them a 10-kpb DNA ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA).
Morphological Characterization
Four plants from each accession were used for morphological observation, based on 48 descriptors,
comprising 10 quantitative descriptors and 38 qualitative descriptors (Ribeiro et al. 2013).
Statistical Analyses
The number of alleles per locus, the observed heterozygosity, the expected heterozygosity and the
polymorphic information content (PIC) were calculated for the new microsatellite loci. Cervus software was
used to characterize the new microsatellite loci and TFPGA software was used to cluster the accessions. We used
the results of genotyping with the new microsatellite markers in conjunction with previous results of genotyping
with 11 loci (Ribeiro et al. 2012) to calculate the genetic distances among cultivars, using Nei’s genetic distances
(1972), and to perform the clustering analysis using the unweighted pair group method with arithmetic mean
(UPGMA) method.
33
Data averages obtained using morphological characterization were used for multivariate analysis, which
was performed using the UPGMA method based on the mean Euclidean distance for the quantitative data and
Nei’s standard genetic distance for the qualitative data. Mantel’s test for cophenetic correlations was used to
evaluate the clustering method’s efficiency.
Qualitative and quantitative morphological variables were jointly analyzed through the Ward-MLM
procedure (Franco et al. 1998), using pseudo-T2 and pseudo-F statistics to define the optimal number of clusters.
The Ward grouping method was used, while considering the joint matrix obtained from the Gower algorithm
(Gower 1971).
Multivariate statistical analyses were performed using the NTSYS software for the UPGMA method,
while SAS software was used for the Ward-MLM procedure.
Results
Microsatellite loci were obtained from the 48 positive clones, allowing us to design 32 primer pairs
based on the flanking sequences of the microsatellite loci. Among these, 16 primer pairs amplified PCR products
typical of microsatellite markers (Table 1). We show the complete sequences of genomic clones containing
microsatellites (GenBank KR998053-KR998068) and the sizes of the alleles amplified by PCR in each
microsatellite locus and each mango cultivar (Supplementary Table 1). The mean number of alleles per locus
was four (ranging from two to six). The mean values of observed (Ho) and expected (He) heterozygosity were
0.438 (0 to 1) and 0.625 (0.405 to 0.794), respectively. The average PIC value was 0.551, suggesting that the
analyzed microsatellite loci were moderately informative (Hildebrand et al. 1992).
The data from the microsatellite markers developed in this study were used, in conjunction with data
obtained by Ribeiro et al. (2012) (27 microsatellites in total), to cluster the 20 mango accessions for this analysis.
The dendrogram showed five clusters (Figure 1), which consisted of two large clusters comprising eight
accessions each, two clusters comprising one accession in each and the last group containing two accessions.
The smallest similarity coefficient among the accessions was found between the accessions ‘Princesa’ and
‘Manzanillo’ (0.493), while the largest similarity coefficient was observed between ‘Keitt’ and ‘Recife’ (0.839).
Most of the accessions used in this study were Brazilian. In this cluster, Brazilian cultivars ‘Recife’,
‘Rosari’, ‘Princesa’, ‘Espada Itaparica’, ‘Comprida Roxa’, ‘Juazeiro VI’ and ‘Ametista’ were related to the
American cultivar ‘Keitt’. Other Brazilian cultivars (‘Ipuçaba’, ‘Foice’, ‘Juazeiro III’ and ‘Surpresa’) were
34
clustered with the Australian cultivar ‘Kensington’, as well as with American cultivars ‘Edward’ and ‘Haden’.
Brazilian cultivars ‘Pingo de Ouro DPV’ and ‘Pêssego DPV’ were clustered in isolation from the other groups,
while the American cultivar ‘Palmer’ was clustered with the Mexican cultivar ‘Manzanillo’.
The calculated similarity coefficients among the 20 mango accessions, based on qualitative
morphological data, ranged from 0.235 (between cultivars; ‘Espada Itaparica’ and ‘Manzanillo’) to 0.686
(between cultivars; ‘Juazeiro III’ and ‘Keitt’, and between ‘Haden’ and ‘Edward’).
In the dendrogram generated by the UPGMA method and based on qualitative data, the 20 studied
accessions were separated into four clusters (Figure 2A). The cultivar ‘Surpresa’ formed a cluster separate from
the other accessions, but was more related to the accessions of the cluster comprising ‘Edward’, ‘Haden’,
‘Palmer’, ‘Juazeiro III’, ‘Keitt’ and ‘Foice’. This second cluster contained all the American cultivars used in this
study. The other two clusters were segregated from the two groups already mentioned. Brazilian cultivars
‘Juazeiro II’, ‘Rosari’, ‘Recife’, ‘Comprida Roxa’, ‘Pêssego DPV’ and ‘Ametista’ were more related to the
Australian cultivar ‘Kensington’ and to the Mexican cultivar ‘Manzanillo’, while the fourth cluster only
comprised Brazilian cultivars. However, this last group is more closely related to the cluster of the Australian
and Mexican cultivars than to the American ones.
The calculated genetic distances, based on quantitative data, ranged from 0.121 (between ‘Keitt’ and
‘Haden’) to 3.012 (between ‘Princesa’ and ‘Juazeiro III’).
The dendrogram, based on genetic distances, showed four clusters (Figure 2B). One of them could be
subdivided: one subcluster comprised the four American cultivars (‘Palmer’, ‘Edward’, ‘Keitt’ and ‘Haden’) and
the Brazilian cultivar ‘Surpresa’, and other subgroup comprised some Brazilian cultivars (‘Foice’, ‘Rosari’,
‘Recife’ and ‘Espada Itaparica’), the Australian ‘Kensington’ and the Mexican ‘Manzanillo’. A second large
cluster could also be divided into two, each containing only Brazilian cultivars. One cluster contained the
cultivar ‘Comprida Roxa’, which may be more related to the cluster of Brazilian cultivars. The cultivar
‘Princesa’ comprised the fourth cluster, which was the most isolated from the others.
The Ward-MLM procedure determined that the optimal number of clusters was nine (Figure 3A). The
cluster were: 1-‘Edward’, ‘Haden’ and ‘Palmer’; 2-‘Kensington’,‘Juazeiro II’, ‘Juazeiro VI’ and ‘Pingo de Ouro
DPV’; 3-‘Recife’, ‘Manzanillo’, ‘Pêssego DPV’, ‘Ametista’ and ‘Comprida Roxa’; 4-‘Keitt’ and ‘Princesa’, 5-
‘Ipuçaba’; 6- ‘Rosary’ and ‘Foice’; 7-‘Surpresa’; 8-‘Juazeiro III’; and 9-‘Espada Itaparica’.
The cultivars in cluster 1 were the American cultivars; cluster 2 comprised Brazilian cultivars and one
Australian; cluster 3 was mostly Brazilian and one Mexican; cluster 4 comprised one Canadian and one
35
American, and the remaining clusters comprised Brazilian cultivars. This large number of clusters suggested
significant diversity among the analyzed accessions.
The first two canonical variables explained 92.27% of the variability among the nine clusters (Figure
3B), indicating that the graphic representation of the first two canonical variables (‘latex quality’ and ‘skin
weight’) was suitable for visualizing the genetic relationship among the clusters, as well as among the accessions
within the same group. “Latex Quality” accounted for most of the variation with the first canonical variable,
followed by “Fruit Length” and “Skin Weight”, with values of 0.679, 0.569 and 0.423, respectively. “Fruit
Length” and “Skin Weight” are targeted more frequently in the selection of superior genotypes (Table 2). The
majority of American cultivars used in this study clustered together. The criterion used for cluster separation,
while considering the canonical variables, was associated with the enhanced breeding history of the accessions.
Discussion
Analysis using molecular markers has generated useful information regarding the genetic diversity in
agricultural species. According to Dillon et al. (2014), high quality genetic analysis of species such as M. indica
requires a large number of informative polymorphic markers, which have been lacking in M. indica to date.
The 16 new, specific, microsatellite markers for M. indica developed during this study were moderately
informative. Adopting the considerations of Hildebrand et al. (1992), loci MiL07, MiL27, MiL29 and MiL37
could be classified as highly informative, because they reached PIC values greater than 0.7; however, loci
MiL02, MiL09 and MiL15 could be considered as having low informational value. The remaining nine loci are
moderately informative. Schnell et al. (2005), Ravishankar et al. (2004) and Chiang et al. (2012), who developed
microsatellite markers for M. indica, also obtained mean PIC values that were considered moderately
informative. According to Hildebrand et al. (1992), the more repetitions a locus has and the less the sequence is
repeated, the greater the tendency for the locus to be highly informative. The results found in this study
corroborated this conclusion for the majority of the loci. Among the 16 SSR markers, eight have microsatellites
composed of dinucleotides, of which three were highly informative and the other five were moderately
informative. These markers increased the number of available markers for the genetic analysis of mango tree
cultures.
The accessions that were used in the characterization of these loci were previously analyzed using
eleven microsatellite markers (Ribeiro et al. 2012). Most of these accessions are considered Brazilian cultivars
and little is known regarding the history of their origin. One cluster analysis was jointly performed, using the
36
data previously obtained by Ribeiro et al. (2012), together with the 16 loci analyzed in this study. This analysis
showed that the Brazilian cultivar ‘Recife’ has a very close genetic relationship with the American cultivar
‘Keitt’. The Brazilian cultivars ‘Rosary’ and ‘Princesa’ also have a close relationship with ‘Keitt’. The Brazilian
cultivars ‘Juazeiro III’ and ‘Surpresa’ proved to be genetically close to the American cultivar ‘Edward’, while
‘Juazeiro II’ is related to the Australian cultivar ‘Kensington’. The American cultivar ‘Palmer’ clustered with the
Mexican cultivar ‘Manzanillo’.
While studying the similarity of accessions belonging to the same germplasm bank that were used in
this study, and based on amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers, Santos et al. (2008)
suggested that the accession identified as ‘Palmer’ might not be a clone of the American ‘Palmer’ or that it had
been erroneously identified, because they observed that ‘Palmer’ clustered with polyembryonic cultivars. In the
present study, this cultivar clustered with one that is considered predominantly monoembryonic. It is worth
highlighting that this ‘embryony’ feature probably comes from a monogenic heritage (Arnon et al. 1998), which
makes it difficult to identify a strong association of this character with the formation of clusters in genetic
diversity studies, when based on molecular markers such as microsatellites, which access random DNA regions.
Nevertheless, this feature may be related to other characteristics, which would justify an embryonic type
association as a criterion of weight during clustering. Ravishankar et al. (2004), while analyzing mango cultivars
with random amplified polymorphic DNA (RAPD) and restriction fragment length polymorphism (RFLP)
markers, which also access random DNA regions, observed segregation of two clusters associated with the
embryonic type of the cultivars and inferred that the embryonic types of mango cultivars have a different genetic
basis. In this study, no association of embryonic type with the clusters’ formation was verified.
In the cluster based on morphological descriptors, both based on qualitative and quantitative data
separately, as well as jointly, the cultivar ‘Palmer’ was clustered with other American cultivars, which are also
monoembryonic, reflecting both an association with the genetic base associated with embryony, as well as with
the enhanced breeding of American cultivars.
The largest similarity coefficient observed (between ‘Edward’ and ‘Haden’) could, in part, be explained
by the fact that they are American cultivars, produced by enhanced genetic breeding. Cultivars; ‘Juazeiro III’ and
‘Keitt’ also showed a similarly high coefficient, suggesting that there is a relationship between them, which may
explain the origin of the Brazilian cultivar.
The clustering based on the morphological descriptors corroborated some observations based on the
molecular data. The Brazilian cultivar ‘Juazeiro II’ has a strong genetic relationship with the Australian cultivar
37
‘Kensington’. This relationship was not observed during clustering that only considered quantitative data, where
the cultivar ‘Juazeiro II’ was clustered closer to other Brazilian cultivars. Note that most of the quantitative
features used in this study had been used in the enhanced breeding process, in addition to the greater influence of
the environmental conditions, because these features are believed to be controlled by many genes. Despite the
quantitative characteristics being a source of great variation, those that are most frequently targeted for selection
tended to have a tapered genetic variability as a result of the enhanced breeding process. Therefore, when these
characteristics are used in genetic diversity studies, they demonstrate a greater similarity among enhanced
cultivars, even with different genetic bases.
Despite being a polyembryonic cultivar, the Brazilian cultivar ‘Surpresa’ was clustered with the
American monoembryonic cultivars in three clusters (based on molecular and morphological data). However, in
the cluster based on the quantitative data (Figure 2B), its relationship with one American cultivar was closer than
in the other cases, suggesting that this relationship may be more related to the enhanced breeding history than to
the genetic base. During the joint analysis, this cultivar was separated by itself in an isolated group.
The Brazilian cultivar ‘Rosary’ was clustered to the Australian cultivar ‘Kensington’ in the clusters
based on separately performed morphological data, but showed no significant relationship in the clusters based
on molecular data or when a joint cluster analysis of the morphological data was made.
In addition, the Brazilian cultivar ‘Recife’ was related to the Mexican ‘Manzanillo’ in clusters based on
morphological data, both when used separately and combined; however, they were not related in the clusters
based on molecular markers.
In the dendrogram generated from genetic distances based on quantitative morphological descriptors,
most Brazilian cultivars were allocated in separate clusters from the foreign cultivars. This was also observed
when the clustering was performed based on qualitative and quantitative characteristics jointly.
Estimating genetic variability is useful for plant enhancement, both for choosing genitors for cross
breeding among divergent genotypes looking to exploit heterosis and to avoid genetic depression caused by
inbreeding. The microsatellite markers that were developed in this study could be used for characterizing
molecular genetic diversity in a larger number of mango germplasm accessions, while seeking greater
understanding regarding the genetic basis of non-Brazilian plant varieties, such as from other provenances.
According to morphological descriptors and molecular markers, it is possible to infer that the Brazilian
mango cultivars are significantly genetically diverse when related to cultivars from different provenances. This
relationship makes improved crossbreeding planning possible with a view to developing superior cultivars.
38
Clustering based on data from morphological descriptors made it possible to observe a relationship with
the enhanced breeding history of some accessions. By contrast clustering based on molecular data did not reflect
that history because the molecular markers access random regions of the DNA, including those that have
undergone selection pressure and those that have not.
Acknowledgments
Brazilian foundations that supported this research are “Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo”
(FAPESP, 2008/52197-4), “Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior” (CAPES,
PROCAD-NF2008, CAPES granted a scholarship to the first author), and “Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico” (CNPq granted the research fellowships to APS and RXC).
Data Archiving Statement
The mango DNA sequences and SSR markers were submitted to GenBank under the accession numbers
KR998053-KR998068. Size of the alleles of each locus microsatellite amplified from DNA samples from 20
different mango cultivars is showed in Supplementary Table1.
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40
Figure captions 1
Fig. 1 Clustering of 20 mango cultivars, generated by the UPGMA clustering method, using a 2
similarity matrix generated by Nei’s standard genetic distance based on data from 27 3
microsatellite markers 4
5
Fig. 2 Clustering of 20 mango cultivars. The clustering was generated by the UPGMA 6
method from two different data sets: A) a similarity matrix generated using Nei’s Standard 7
Genetic Distance based on qualitative data (r=0.62); B) a dissimilarity matrix generated using 8
the mean Euclidean distance based on quantitative data (r=0.78) 9
Fig. 3 Joint multivariate analysis of quantitative and qualitative data by the Ward-MLM 10
strategy. (A) Logarithmic probability function (Log-Likelihood) with the formation of eight 11
clusters. (B) The first two canonical variables for the eight clusters explaining 96.64% of the 12
variation 13
41
Table 1. Characteristics of 16 microsatellite loci isolated from mango DNA samples 14 SSR Locus Primer sequences (5′-3′) Allele size (bp) Repeat motif NA Ho He PIC
MiL01 F: TCGCTTATGGCTCCAAGTTT 181-211 (TG)6 4 0.100 0.544 0.489
R: GGCAATGGTCCTGATGAAGT
MiL02
F: GAAGTGGCAGCTGTATGTGC 330-340 (TTA)3 2 1.000 0.513 0.375
R: CCTTTTCTGGGTCATGGAGA
MiL04
F: TGAGCCCAAATTGAGATTGTC 204-210 (TG)10 4 0.750 0.673 0.598
R: CTTGCTGTTCTTGCCATCAA
MiL07
F: TCCCACTTGGATAGCATTGA 290-318 (TG)12 5 0.400 0.765 0.704
R: ATTTGGGTGCTATTCTTGCC
MiL08
F: TCGGTTTCGATTCATAACCTC 308-330 (ATT)3 4 0.050 0.747 0.679
R: AAAGCATCGGTAGTCGGTTG
MiL09
F: CGAACGTACCCCATCAAAAG 122-126 (ATGAG)2 3 0.000 0.456 0.381
R: TGTTGACAGGTCTGTCTGGTG
MiL13
F: GGTCACACACAGAAGGGGTT 172-178 (TAT)3 3 0.500 0.549 0.436
R: GCCAATTCTCGCATACACCT
MiL14
F: TGGTTTACTGTGCACATGCC 238-242 (AC)15 3 0.200 0.621 0.527
R: CTAGCCCCGAACATGAAGAG
MiL15
F: TATCAGCCAATTTTGCCCTT 312-320 (TTTGT)2 3 0.400 0.405 0.347
R: GAGGTGGACCATAGGGGTTT
MiL16
F: ATGAGCCGATTGGGCTATTA 243-253 (TG)6C(GT)6 5 0.600 0.673 0.605
R: TGATCAAATGTGGCTTGCTC
MiL20
F: GGATTGACAAGGAGGGGAAT 208-216 (GA)4…(AT)6(GT)9 4 0.450 0.609 0.541
R: ATTTGGCGTTTTGAAACCTG
MiL21
F: AACCGGAGATGCTGAAATTG 186-210 (TAT)4 5 0.600 0.583 0.516
R: ATTGCAGGAACCATCCTTCA
MiL23
F: CCTCCCAATCTCCTTCTTCC 294-300 (ATATC)3 3 0.000 0.518 0.442
R: AGCCATCTTTTTCCTCCGTT
MiL27
F: AAGACATCATGGCCACTTGAC 333-337 (TG)9 5 0.400 0.794 0.736
R: CGAAGACCATGGTGGATTA
MiL29
F: AATGACAATGGGGGTGAAAA 153-159 (ATTCCC)2 5 0.850 0.786 0.729
R: GTTCGGAGAAAAGTGTGGGA
MiL37
F: TTGGGTATCCTTTGGAGTGC 331-345 (CA)11…(AT)3…(GAA)2 6 0.700 0.763 0.703
R: CAGCCTGAAAATGCAAGAGA
Note: Ho= observed heterozygosity; He=expected heterozygosity; Na=number of alleles; PIC= polymorphism information content 15
42
Table 2. Averages of 10 quantitative variables for each of the clusters formed by the Ward-MLM
method and the first two canonical (CAN) variables.
Groups CAN
Variables 1 (3) 2 (4) 3 (5) 4 (2) 5 (1) 6 (2) 7(1) 8 (1) 9 (1) CAN1 CAN2
D46 58.57 30.13 42.52 54.00 36.50 40.10 23.90 23.80 41.20 0.419 -0.569
D32 207.63 102.25 102.84 101.95 79.50 86.70 94.10 183.90 72.50 0.320 -0.061
D34 1.07 0.88 2.00 0.95 0.90 0.85 0.40 0.60 0.80 -0.211 -0.169
D35 104.00 32.38 55.82 77.75 26.50 58.95 44.80 21.90 45.30 0.423 -0.515
D29 0.73 0.43 0.22 0.60 1.20 1.15 0.50 1.00 0.60 0.679 0.505
D3 3.03 3.30 3.44 2.90 3.00 3.75 3.00 4.70 4.70 -0.275 0.737
D11 28.79 23.38 27.08 33.45 28.00 28.20 29.80 26.10 35.60 0.386 -0.183
D12 18.30 18.00 21.90 21.20 12.60 19.65 16.10 17.80 23.50 -0.264 -0.153
D14 13.13 7.38 9.38 11.80 8.40 11.60 10.70 8.40 9.60 0.569 -0.311
D15 8.70 7.63 8.70 9.00 7.60 9.70 7.80 7.00 6.50 0.130 -0.286
(D46) Seed Weight; (D32) Lenticel Density; (D34) Skin Thickness; (D35) Skin Weight; (D29)
Latex Quantity; (D3) Petiole Length; (D11) Inflorescence Length; (D12) Inflorescence Width;
(D14) Fruit Length; (D15) Fruit
43
Supplementary Table1. Size of the alleles of each locus microsatellite amplified from DNA samples from 20 different mango cultivars
SSR locus
Cultivar MiL02 MiL02 MiL04 MiL04 MiL07 MiL07 MiL08 MiL08 MiL09 MiL09 MiL13 MiL13 MiL14 MiL14 MiL15 MiL15
1 Surpresa 330 340 180 180 290 310 314 314 122 122 172 178 238 238 - -
2 Kensington 330 340 180 180 290 310 308 308 122 122 172 178 238 242 312 312
3 Rosary 330 340 200 180 290 318 - - 122 122 172 172 242 242 312 312
4 Edward 330 340 200 180 300 318 328 328 122 122 172 178 238 238 312 320
5 Ipuçaba 330 340 200 180 290 310 - - 122 122 172 178 238 242 312 320
6 Juazeiro_II 330 340 200 180 - - 308 308 - - 172 178 238 238 312 320
7 Juazeiro_III 330 340 200 180 290 300 328 328 - - 172 178 238 238 312 312
8 Keitt 330 340 190 180 300 318 328 328 122 122 172 172 - - 312 312
9 Foice 330 340 200 180 290 318 - - 122 122 172 178 - - 312 320
10 Juazeiro_VI 330 340 200 180 - - 308 308 122 122 172 178 238 238 312 320
11 Recife 330 340 - - 300 318 328 328 122 122 172 172 238 242 312 312
12 Espada_Itaparica 330 340 200 180 - - 314 328 122 122 178 178 238 238 312 312
13 Manzanillo 330 340 - - - - 314 314 122 122 178 178 238 238 312 312
14 Pêssego_DPV 330 340 200 180 - - 314 314 126 126 172 178 238 238 312 312
15 Haden 330 340 200 180 318 318 314 314 122 122 172 172 242 242 312 312
16 Princesa 330 340 - - - - - - - - 172 172 238 242 312 320
17 Ametista 330 340 200 180 - - 328 328 - - 172 172 242 242 312 320
18 Pingo_de_Ouro_DPV 330 340 190 180 290 290 - - 122 122 - - 242 242 312 320
19 Comprida-Roxa 330 340 200 180 318 318 - - 122 122 172 178 242 242 312 312
20 Palmer 330 340 190 180 290 290 - - - - 178 178 242 242 312 312
44
Supplementary Table1. Size of the alleles of each locus microsatellite amplified from DNA samples from 20 different mango cultivars
SSR locus
Cultivar MiL16 MiL16 Mil_20 Mil_20 MiL21 MiL21 MiL23 MiL23 MiL27 MiL27 MiL29 MiL29 MiL37 MiL37
1 Surpresa 243 243 216 216 212 212 294 294 - - 159 155 334 334
2 Kensington 253 243 216 216 212 212 294 294 335 335 159 155 344 344
3 Rosary 253 243 212 216 212 190 302 302 337 333 157 153 344 334
4 Edward 243 243 216 216 212 190 294 294 335 327 157 153 344 338
5 Ipuçaba 243 243 216 216 212 200 - - 333 333 159 155 334 334
6 Juazeiro_II 253 243 - - 212 186 294 294 335 335 159 155 344 338
7 Juazeiro_III 255 243 212 216 212 212 294 294 333 327 159 155 344 334
8 Keitt 243 243 212 216 196 212 294 294 - - 157 153 332 332
9 Foice 253 243 212 216 200 212 - - - - 159 155 334 334
10 Juazeiro_VI 253 245 212 216 196 212 294 294 - - 159 155 344 338
11 Recife 253 243 - - 196 196 - - 337 327 157 153 344 332
12 Espada_Itaparica 243 243 216 216 196 212 - - 337 335 159 155 344 338
13 Manzanillo - - 212 216 196 212 294 294 335 335 157 153 344 338
14 Pêssego_DPV 255 243 208 208 212 212 302 302 337 333 159 155 338 334
15 Haden 253 243 216 216 196 200 294 294 337 335 - - 344 334
16 Princesa 253 243 212 216 212 212 294 294 337 337 - - 344 338
17 Ametista 255 253 212 216 212 212 294 294 333 333 159 155 - -
18 Pingo_de_Ouro_DPV 255 243 212 216 196 212 302 302 333 333 159 155 344 334
19 Comprida-Roxa 255 255 212 216 196 212 294 294 337 333 159 155 344 332
20 Palmer 255 255 216 216 186 196 294 294 333 333 157 153 344 338
- missing data.
45
CAPÍTULO 2
Natureza Genética da resistência à Colletotrichum em uma população segregante de mangueira (Mangifera indica L.)
Elaini Oliveira dos Santos Alves1, Francisco Pinheiro Lima Neto2, Maria Angélica
Guimarães Barbosa2, Hilçana Ylka Gonçalves de Albuquerque2, Ronan Xavier Corrêa1*
1UESC, Universidade Estadual de Santa Cruz, Departamento de Ciências Biológicas,
Rodovia Jorge Amado, km 16, CEP 45662-900 – Ilhéus, BA, Brazil.
2Embrapa Semiárido, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. BR 428 KM 152.
Zona Rural 56300970 - Petrolina, PE - Brazil - Caixa-postal: 23.
*Corresponding author:
E-mail: [email protected]; Fax/telephone: +557336805003
Resumo: A resistência a doenças constitui um dos principais objetivos dos programas de
melhoramento da maioria das espécies agronômicas. Uma das doenças fúngicas mais
importantes da mangueira é a antracnose, a qual ocorre em todas as áreas produtoras de
manga do mundo, variando a severidade de acordo com os níveis de umidade do
ambiente. O uso de cultivares resistentes é a estratégia mais eficiente e econômica de
controlar as doenças de plantas, além de diminuir o impacto ambiental reduzindo o uso de
agrotóxicos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a resistência à antracnose em
manga utilizando inoculações em folhas e inferir sobre a natureza genética da resistência
em uma população segregante. O método de inoculação foi otimizado para folhas
destacadas, fazendo com que se mantivessem viáveis para avaliação até 10 dias após a
inoculação para a maioria dos genótipos analisados. Com base nas médias do tamanho
46
de lesões de uma progênie proveniente do cruzamento entre ‘Haden’ e ‘Tommy Atkins’
observou-se que a resistência à antracnose em folhas de mangueira é complexa e possui
genes de efeito maior. Estes resultados devem auxiliar na seleção de genótipos
superiores na população segregante analisada, bem como no planejamento de
estratégias para o melhoramento genético da espécie.
Palavras-chave: melhoramento genético, genes de efeito maior, Colletotrichum,
mangueira
Introdução
A antracnose ocorre em todas as áreas produtoras de manga do mundo, variando
de severidade de acordo com os níveis de umidade do ambiente. No Brasil, essa doença
se encontra amplamente disseminada em todas as regiões produtoras de manga (Cunha
et al., 1994), no entanto, na região semiárida do nordeste brasileiro, sua importância é
restrita às épocas em que a floração e desenvolvimento dos frutos coincidem com a
ocorrência de chuvas (Batista, 2010).
O mais relatado agente causal desta doença em mangueira é o fungo
Colletotrichum gloeosporioides Penz (Cunha et al., 1993; Donadio et al., 1996; Junqueira
et al., 2002; Silva et al., 2006; Galli et al., 2009, Xavier et al., 2009, Fisher et al., 2009),
embora a ocorrência de outras espécies causando antracnose na cultura venha sendo
relatada (Arauz, 2000; Jayasinghe e Fernando, 2009; Lima et al., 2013).
A identificação de cultivares resistentes é a estratégia mais econômica e
ambientalmente vantajosa para diminuir os danos causados por doenças em plantas
cultivadas. Alguns estudos identificaram fontes de resistência à antracnose em
mangueira, como os cultivares IAC 111, Alfa, Beta, Parvin, Surpresa e Zill (Fisher et al.,
2009; Galli et al., 2009). Dos cultivares com grande aceitação comercial ‘Tommy Atkins’,
‘Keitt’ e ‘Van Dyke’ são consideradas as menos suscetíveis à antracnose, enquanto
‘Haden’, ‘Kent’, ‘Bourbon’ e ‘Palmer’ são tidas como bastante suscetíveis (Junqueira et
al.,2002; Prusky et al., 2009).
Dados de mensuração de resistência de plantas a doenças podem ser obtidos a
partir de inoculações em frutos ou folhas para diversos patossistemas. A resistência à
antracnose (Colletotrichum capsici) em folhas e em frutos foi analisada em pimenta
(Mahasuk et al., 2009), identificando-se diferentes genes envolvidos na resistência de
diferentes partes da planta. Vale salientar que, apesar de os maiores danos econômicos
47
serem decorrentes da infecção em frutos, a suscetibilidade nas partes vegetativas da
planta proporciona a manutenção do patógeno nas áreas de plantio até que ocorram as
frutificações. Assim, a resistência em folhas e frutos deve ser observada para um maior
controle da doença.
Estudos da resistência de genótipos de mangueira à antracnose com base em
inoculações nas folhas não foram relatados. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi
otimizar um método de inoculação de Colletotrichum em folhas de mangueira para avaliar
a resistência à antracnose na cultura e inferir sobre a natureza genética da resistência em
uma população segregante.
Material e métodos
Obtenção dos isolados fúngicos
Seis isolados de Colletotrichum (BA-13, BA-35, BA-38, B-58, P-21 e P-29) da
Coleção de Culturas de Fungos Fitopatogênicos “Prof. Maria Menezes” (CMM) da
Universidade Federal Rural de Pernambuco (Recife, Pernambuco, Brasil) foram doados
para a realização deste trabalho.
Teste de patogenicidade e preparo do inóculo
Os seis isolados foram inoculados em frutos de manga (cultivar ‘Haden’), como
descrito por Lima et al. (2013), para testar a patogenicidade dos mesmos. Após o
desenvolvimento dos sintomas foi realizado o reisolamento. Fragmentos da casca do fruto
doente foram transferidos para placas de Petri contendo meio BDA e mantidas a 25±2oC
sob luz constante. Sete dias após o reisolamento, cada isolado foi repicado em 15 placas
de Petri contendo meio BDA e as placas mantidas a 25±2oC sob luz constante para a
realização dos ensaios de inoculação.
O inóculo foi preparado adicionando-se 20 mL de água destilada esterilizada à
placa do fungo cultivado em meio de cultura BDA durante 15 dias, removendo-se as
estruturas do patógeno com uma alça de vidro. Em seguida, a suspensão foi filtrada em
camada dupla de gaze. Após a adição de 50uL de Tween 20 para cada 50mL de solução,
a concentração foi ajustada em 105 esporos/mL, com o auxílio da câmara de Neubauer.
48
Material vegetal utilizado
Mudas clonais e folhas destacadas de mangueira foram utilizadas nos ensaios de
inoculação. Numa fase inicial, mudas clonais dos cultivares ‘Tommy Atkins’ e ‘Haden’,
bem como dois genótipos empregados como controles, ‘Van Dyke’ (resistente) e
‘Bourbon’ (suscetível). As mudas foram mantidas em casa de vegetação e inoculadas
para a escolha dos isolados adequados para avaliar a resistência à antracnose na
população segregante (Tommy Atkins x Haden) composta por 123 progênies, ou seja,
isolados com agressividade contrastante entre os cultivares genitores. Após a seleção de
dois isolados realizaram-se inoculações em folhas destacadas das 123 referidas
progênies. Folhas das plantas que compõem a referida população, bem como dos
cultivares genitores (Tommy Atkins e Haden) e controle (Van Dyke e Bourbon), foram
destacadas (em fase intermediária de desenvolvimento) das plantas que se encontram no
Campo Experimental de Mandacaru, pertencente à Embrapa Semiárido, e levadas ao
Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Semiárido para a realização das inoculações.
Quatro folhas sadias de cada planta foram desinfestadas com hipoclorito de sódio
(1,5%) antes da inoculação. Foram demarcados quatro pontos de inoculação na face
adaxial das folhas, sendo dois de cada lado da nervura central, utilizando-se caneta de
marca permanente. As folhas foram coletadas no mesmo dia das inoculações e
permaneceram com o ápice foliar e o pecíolo em recipiente (Becker ou tubos de ensaio)
contendo água destilada, a fim de se manter a característica fisiológica foliar uma vez que
as avaliações se estenderam por vários dias.
Inoculações
Visando padronizar o método de avaliação da resistência em folhas de mangueira,
as inoculações foram realizadas em duas etapas: inicialmente mudas dos cultivares
genitores e dos cultivares empregados como controles foram inoculadas com os
diferentes isolados de Colletotrichum e posteriormente folhas destacadas das plantas da
população segregante foram inoculadas com dois diferentes isolados selecionados nas
inoculações anteriores.
Avaliação da agressividade dos isolados em mudas
Quatro isolados foram inoculados nas mudas dos cultivares genitores e controle.
Quatro folhas de cada muda foram marcadas para receber o inóculo (uma folha para cada
inóculo/muda). Para cada cultivar foram mantidas sete repetições (mudas de cada
49
cultivar) inoculadas com inóculo contendo conídio e uma muda inoculada com água para
testemunha. Cada folha a ser inoculada recebeu ferimentos em dois locais com uma
almofada contendo cinco alfinetes entomológicos (ferimento de 1 mm). Ensaios
preliminares mostraram a necessidade de ferimento para inoculações experimentais.
Sobre os ferimentos depositou-se o inóculo, disco de papel filtro (4 mm de
diâmetro) embebido com 5 uL de suspensão de esporos (5x105 conídio/mL). Uma muda
de cada variedade foi inoculada com discos de papel filtro embebidos com água destilada
sobre o ferimento (testemunhas). Os discos foram presos ao ferimento com fita adesiva,
para garantir a adesão do inóculo num período de 48 horas e impedir a secagem rápida
dos mesmos. Adicionalmente, cada muda foi envolvida com sacos plásticos umedecidos
permanecendo, assim, por 48 horas. As avaliações foram realizadas diariamente por um
período de 15 dias medindo-se, em dois sentidos perpendiculares, o diâmetro da lesão
(DL), expresso em mm, com auxílio de um paquímetro digital.
Avaliação da resistência da população segregante Haden x Tommy Atkins à antracnose em folhas destacadas
Dois isolados foram inoculados em folhas destacadas dos cultivares genitores e
controle, além dos genótipos da população segregante. As folhas foram destacadas das
plantas no campo às 5 horas da manhã e imediatamente colocadas em copos
descartáveis contendo água para mantê-las túrgidas. Foram coletadas quatro folhas de
cada planta a ser avaliada (três delas para inoculação fúngica e uma para testemunha).
Discos de papel de filtro contendo os inóculos foram depositados sobre ferimentos
feitos com uma almofada contendo cinco alfinetes entomológicos (ferimento de 1 mm) e
presos ao ponto de inoculação com fita adesiva. Cada folha foi inoculada em quatro
pontos: dois do lado esquerdo da folha para um dos isolados e dois do lado direito da
folha para o segundo isolado. Na quarta folha de cada planta foram depositados discos de
papel filtro umedecidos com 10 mL de água destilada (testemunhas).
Cada folha foi colocada num tubo de ensaio contendo água destilada e mantida
dentro de caixa plástica, forrada com folhas de papel filtro embebidas com água destilada,
proporcionando a formação de uma câmara úmida (Figura 2). Após 48 horas, os discos
foram removidos e as avaliações seguiram nos períodos de 2, 4, 6, 8 e 10 dias após a
inoculação medindo-se, em dois sentidos perpendiculares, o diâmetro da lesão (DL),
expresso em mm.
O desenho experimental de inoculação da população segregante foi inteiramente
casualizado, com três tratamentos (2 inóculos + testemunha) e seis repetições (pontos de
50
inoculação/inóculo/planta). As inoculações foram feitas em cinco etapas consecutivas
avaliando-se cerca de 30 híbridos em cada teste. Os controles de resistência (‘Van Dyke’)
e suscetibilidade (‘Bourbon’) e os genitores (‘Haden’ e ‘Tommy Atkins’) foram inoculados
em cada teste, nas mesmas condições das progênies e utilizados como controle geral dos
cinco experimentos realizados consecutivamente.
Análises estatísticas
As médias obtidas para cada genótipo e os respectivos tratamentos foram obtidas
e submetidas a uma análise de variância e ao teste F. A comparação entre as médias,
quando o valor de F foi significativo, foi feita pelo teste de Scott e Knott (1974), a 5% de
probabilidade.
Resultados
Teste de patogenicidade
A patogenicidade dos seis isolados de Colletotrichum foi confirmada em frutos do
cultivar Haden (Figura 1). Após reisolamento e cultivo em meio BDA, quatro dos seis
isolados apresentaram concentrações adequadas de conídios para obtenção da
suspensão (105 esporos/mL) e foram utilizados nas inoculações em mudas para seleção
dos isolados destinados à avaliação da população segregante.
Figura 1: Sintomas de antracnose sete dias após a inoculação em frutos de Mangifera indica (vr. Haden) inoculados com Colletotrichum.
51
Avaliação da agressividade dos isolados em mudas
A análise de variância realizada com base nos dados obtidos nas inoculações em
mudas revelou diferenças de comportamento entre os cultivares inoculados bem como
diferenças entre os isolados, em função do tempo (Tabela 1). Houve diferença
significativa entre os cultivares até 14 dias após a inoculação e entre os isolados no
intervalo de cinco a sete dias após a inoculação. As diferenças significativas entre os
cultivares e não significativas entre os isolados ocorrem de dez a treze dias após a
inoculação. Nesse intervalo, as médias de tamanho de lesão dobram de magnitude,
incremento correspondendo a uma taxa de crescimento de lesão semelhante ao que
ocorre nos primeiros seis dias após a inoculação; essa taxa de crescimento aumenta
quatro vezes nos próximos três dias de avaliação.
Com base no experimento realizado em mudas, observa-se que entre cinco e sete
dias após a inoculação os isolados BA-13 e BA-35 não diferiram estatisticamente entre si,
mas diferiram dos isolados BA-38 e B-58, que também não diferiram entre si (Tabela 1).
Assim, um, de cada dois isolados que não diferiram estatisticamente, foi selecionado com
base na observação das curvas de progresso da doença, sendo que optou-se pelo BA-13,
com o qual Tommy Atkins se mostrou suscetível e Haden resistente, e pelo B-58, com o
qual Tommy Atkins se mostrou resistente e Haden suscetível (Figura 3).
Tabela 1: Resumo da ANOVA para tamanho de lesão foliar medido em diferentes dias após a inoculação (DAI) de mudas de quatro cultivares de manga com quatro isolados de Colletotrichum, com sete inoculações repetidas por planta, indicando-se os valores de p para fonte de variação (FV) e o teste de média para cultivares e isolados. DAI FV Teste* para cultivar Teste* para isolado Média CV(%)
Cultivar Isolado BO HA TA VD BA13 BA35 BA38 B58
3 0,0005 0,3507 b a b b a a a a 13,73 56,10
4 0,0098 0,2656 b a a a a a a a 22,31 98,04
5 0,0014 0,0000 b a b b a a b b 28,41 47,44
6 0,0475 0,0001 a a a a a a b b 34,91 50,34
7 0,0493 0,0057 b a a b a a b b 41,07 57,09
10 0,0139 0,1356 a a b a a a a a 61,53 84,08
11 0,0073 0,1203 a a b a a a a a 69,21 87,53
12 0,0119 0,0894 a a b b a a a a 82,95 89,78
13 0,0232 0,4953 b a b b a a a a 85,94 102,34
14 0,0689 0,4210 b a a b a a a a 84,10 108,35
17 0,3627 0,3900 a a a a a a a a 322,18 759,18
*As colunas seguidas de mesma letra não diferem entre si entre cultivares ou entre isolados, pelo teste Scott knott a 5% de probabilidade.
52
A B Figura 2: Folhas destacadas de híbridos de mangueira e inoculadas com Colletotrichum em Laboratório. A- Disposição das folhas nos tubos de ensaio mantidas em caixa plástica; B- Folhas assintomáticas (Tommy Atkins) e folhas com sintomas (Haden).
Avaliação da resistência da população segregante Haden x Tommy Atkins à antracnose em folhas destacadas
As inoculações em folhas destacadas desenvolveram os sintomas típicos da
antracnose em manga, permitindo a avaliação da maioria dos genótipos até 10 dias após
as inoculações. Algumas folhas secaram ou apresentaram outro tipo de infecção, sendo
eliminadas dos experimentos.
Os cultivares Tommy Atkins e Van Dyke, indicados na literatura como resistentes,
mostraram-se realmente resistentes no presente trabalho ao isolado B-58. No entanto, o
‘Tommy Atkins’ foi consideravelmente suscetível ao isolado BA-13 quando os sintomas
foram avaliados por um maior número de dias. Os cultivares indicados na literatura como
suscetíveis (Bourbon e Haden) mostraram-se mais suscetíveis ao isolado B-58.
Entretanto ‘Bourbon’ foi resistente e ‘Haden’ mediamente resistente aos demais isolados,
indicando haver especificidade da resistência de diferentes cultivares de mangueira aos
diferentes isolados de Colletotrichum (Figura 3).
Para comparar as inoculações nas plantas da população segregante feitas
separadamente em cinco etapas (cinco experimentos consecutivos) foi realizada uma
análise de variância (Tabela 2), a qual confirmou a existência de variação significativa
entre os genótipos, entre os isolados e entre blocos.
Pela análise de variância verificou-se que as médias de tamanho de lesão de todos
os genótipos (genitores e híbridos) causada pelos isolados BA-13 (17,01 mm2) e B-58
(39,83 mm2) diferem significativamente entre si (Scott-Knott, 5%; p=0,0000) (Tabela 2).
Adicionalmente, verificou-se que a média de tamanho de lesão na progênie híbrida foi de
53
28,43 mm2 e que há genótipos com médias significativamente distintas na referida
progênie (Scott-Knott, 5%; p=0,0207).
Cada bloco considerado constitui uma parte do experimento montada
separadamente. A comparação das médias dos blocos demonstrou que a média do bloco
quatro diferiu significativamente dos demais. Adicionalmente, os cultivares suscetíveis
(Haden e Bourbon) diferiram dos resistentes (Tommy Atkins e Van Dyke), bem como os
isolados diferiram entre si (Tabela 3).
Tabela 2. Análise de variância de tamanho de lesão aos oito dias após inoculação, em folhas destacadas dos genitores (Haden e Tommy Atkins) e dos genótipos empregados como controles (Bourbon e Van Dyke). FV F P
Genótipos 6,493 0,0003
Blocos 16,595 0,0000
Isolados 22,672 0,0000
Genótipos x Blocos 4,576 0,0000
Tabela 3. Comparação de médias entre cultivares e isolados para tamanho de lesão aos oito dias após inoculação, em folhas destacadas dos genitores (Haden e Tommy Atkins) e dos genótipos empregados como controles (Bourbon e Van Dyke).
Cultivares* Blocos* Isolados* Média CV(%)
BO HA TA VD 1 2 3 4 5 BA-13 B-58
30,8 23,2 11,8 14,2 12,2 15,0 10,3 47,6 14,8 11,92 28,16 20,04 131,84
b b a a a a a b a a b
*Para cada fonte de variação (cultivar, bloco e isolado), as médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Scott Knott a 5% de probabilidade.
A curva de progresso da doença para os cultivares avaliados no decorrer dos cinco
experimentos foi construída com base nas médias dos dados dos cincos experimentos e
permitiu a distinção entre os cultivares resistentes (Tommy Atkins e Van Dyke) e os
suscetíveis (Haden e Bourbon) nas inoculações com o isolado B-58 (Figua 3 E e F).
Considerando-se que a média do tamanho de lesão do referido isolado foi duas vezes
maior que a média do BA-13, conclui-se que ele apresenta uma maior agressividade. Os
resultados obtidos evidenciam que severidade da doença torna-se distinta entre plantas
resistentes e suscetíveis aos oito dias após a inoculação. Desta forma, a análise conjunta
dos híbridos e dos genitores foi realizada com base nas médias de tamanho de lesão
obtidas para cada genótipo aos oito dias após inoculação.
54
Figura 3. Progresso da colonização de genótipos de mangueira ao longo do tempo (dai - dias após inoculação), com base na área (A, mm2) de lesão foliar causada por diferentes isolados de Colletotrichum (B-58, BA-13, BA-35 e BA-38). BO, ‘Bourbon’; HA, ‘Haden’; TA, ‘Tommy Atkins’; VD, ‘Van Dyke’. A - D são os controles utilizados para padronizar as condições de inoculação em folhas (inoculações realizadas em mudas). E e F são os controles das avaliações da progênie (inoculações realizadas em folhas destacadas).
55
Um gráfico de distribuição dos genótipos em função do tamanho da lesão confirma
que os cultivares Tommy Atkins e Van Dyke contrastaram com os cultivares Bourbon e
Haden na resistência ao isolado B-58, enquanto que, para o isolado BA-13, demonstra
que os quatro cultivares analisados apresentaram o mesmo padrão (Figura 4). A
distribuição dos genótipos híbridos evidenciou um maior número de genótipos num
intervalo de área de lesão de 10 a 19,9 mm2.
Figura 4: Distribuição dos genótipos da população segregante de mangueira (‘Haden’ x ‘Tommy Atkins’) em relação aos tamanhos das lesões de antracnose provocadas por dois diferentes isolados (B58 e BA13). As linhas verticais indicam o posicionamento dos genitores da população e dos genótipos empregados como controles de resistência (VD, ‘Van Dyke’) e suscetibilidade (BO, ‘Bourbon’).
Discussão
A avaliação da resistência à antracnose nas folhas de mangueira é um importante
estudo, já que é nas partes vegetativas que o patógeno se mantém no campo até que
ocorram as frutificações. No âmbito da pesquisa, estudos de resistência com base na
inoculação em folhas possibilitam a realização de testes em qualquer época do ano, bem
como a avaliação precoce de plantas de ciclo de vida longo.
O método de inoculação em folhas destacadas utilizado neste estudo foi otimizado
visando a realização de estudos adicionais sobre a antracnose em mangueira, já que a
inoculação em frutos é bem mais frequente do que a inoculação em folhas. Informações
56
sobre a resistência à antracnose em folhas e frutos de mangueira são valiosas para o
melhoramento genético da cultura.
Neste estudo, a inoculação em folhas destacadas, diferentemente daquela
realizada em mudas, não permitiu o prosseguimento das avaliações a partir de dez dias
após inoculação devido ao aparecimento de outros fungos ou secamento de algumas
folhas. Mesmo assim, as folhas destacadas foram eficientes para distinguir variabilidade
para resistência à doença nas situações em que o isolado do patógeno apresenta um
rápido progresso na planta. No entanto, para aqueles isolados que apresentam um
desenvolvimento mais lento é mais eficiente realizar inoculações em mudas, uma vez que
a vida útil da folha destacada não superou os dez dias para a maioria dos genótipos
analisados (Figura 2). Serra et al. (2011) inocularam folhas jovens de mangueira (cultivar
Espada) para testar a patogenicidade de isolados e realizaram a avaliação sete dias após
a inoculação. Mas diante da variabilidade do patógeno já relatada na literatura (Cunha et
al., 1993, Donadio et al., 1996; Junqueira et al., 2001) e dos dados obtidos neste estudo,
constata-se que os diversos comportamentos intraespecíficos do patógeno podem exigir
períodos de avaliações mais longos.
O cultivar ‘Tommy Atkins’ apresentou-se suscetível ao ser inoculado em folhas com
o isolado BA-13 (Figura 3), o que comprova que o contraste entre resistência e
suscetibilidade observado principalmente com o cultivar Tommy Atkins neste estudo
corrobora a especificidade planta-patógeno descrita por Flor (1955). Vale ressaltar que, os
isolados utilizados neste estudo foram obtidos em plantios comerciais, nos quais
predomina a utilização do cultivar Tommy Atkins. Assim, alguns isolados podem ser
resultantes de processo de co-evolução planta-patógeno.
As descrições na literatura sobre resistência e suscetibilidade de cultivares de
mangueira à antracnose foram feitas com base em observações em frutos. Segundo
Prusky e Ken (1993), a concentração de resolcinóis em níveis fungitóxicos na casca de
frutos imaturos de manga atua na resistência natural contra fungos patogênicos. A
concentração dos compostos antifúngicos diminui com mais intensidade durante a
maturação em cultivares suscetíveis à doença do que em cultivares resistentes. A polpa
dos frutos não possui concentrações fungitóxicas destes compostos. Portanto, compostos
antifúngicos agem na primeira linha de defesa de frutos de manga contra fungos
patogênicos.
Não há relatos na literatura sobre estudo de mecanismos de resistência das folhas
de mangueira a doenças fúngicas. O conhecimento da existência ou não de relação entre
a resistência foliar e a resistência dos frutos é uma importante informação para avanços
57
no melhoramento genético da cultura. Vale ressaltar que as folhas hospedam os fungos
por muito tempo no campo.
O isolado B-58 proporcionou a discriminação clara do padrão de resistência dos
cultivares controle (Figura 4), provavelmente por conta de sua maior agressividade em
relação ao isolado BA-13, o que sugere que isolados mais agressivos podem proporcionar
resultados mais robustos no estudo da natureza genética da resistência a doenças.
A distribuição dos genótipos, incluindo os híbridos, em função do tamanho da
lesão, sugere que a resistência aos isolados analisados é complexa (Figura 4). A curva
levemente deslocada para a esquerda (lesões inferiores a 30 mm2) indica que alguns
genes de efeito maior devem estar atuando na resistência. A ocorrência de genes de
efeito maior na resistência à antracnose tem sido observada em outras culturas como
pimenta e feijão (Kim et al., 2008; Campa et al., 2011; Gonçalves-Vidigal et al., 2012).
Adicionalmente, a distribuição dos genótipos demonstra que há variabilidade
genética expressa entre os híbridos, o que proporciona a possibilidade de seleção no
processo de melhoramento genético. Portanto, estes resultados devem contribuir na
seleção de genótipos superiores na população segregante analisada, além de auxiliar na
busca de marcas moleculares associadas ao fenótipo de resistência.
Conclusão
- Um método para inoculação de Colletotrichum em folhas de manga foi otimizado,
podendo ser aplicado em qualquer época de desenvolvimento da planta.
- O cultivar Tommy Atkins apresentou suscetibilidade a um dos isolados neste estudo.
- A resistência de folhas de mangueira à antracnose é complexa, provavelmente
relacionada a alguns genes de efeito maior. O estudo da natureza da resistência de frutos
de mangueira à antracnose ainda se faz necessário, já que pode atuar com mecanismos
diferentes aos observados em folhas.
Referências
ARAUZ, L. F. Mango anthracnose: economic impact and current options from integrated management. Plant Disease, v.84, p.600–611, 2000.
BATISTA, D. C. Cultivo da Mangueira: Doenças. Embrapa Semiárido, Sistema de Produção, 2 – 2ª Ed. Versão eletrônica, 2010.
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60
CAPÍTULO 3
Trabalho integrante de parceria com a Embrapa Semiárido (Petrolina-PE,BR)e ARS-
USDA (Miami-FL,EUA)
Identificação de híbridos de progênie Haden x Tommy Atkins e Mapa de ligação preliminar para Mangifera indica L.
Resumo: A identificação de uma progênie proveniente de um cruzamento específico é
especialmente importante em estudos visando à construção de mapas genéticos. Os
objetivos do presente trabalho foram confirmar a natureza híbrida da população de estudo
da resistência da mangueira à antracnose e construir um mapa de ligação genética,
visando mapear genes de resistência à doença. Amostras de DNA foram obtidas de
tecido foliar de uma progênie composta por 271 genótipos bem como dos seus supostos
genitores ‘Haden’ e ‘Tommy Atkins’. Tendo este cruzamento sido realizado de forma livre
fez-se necessário a confirmação da progênie Haden x Tommy Atkins. Foram empregados
50 marcadores SSR e 142 marcadores SNPs neste estudo. Dos 50 marcadores SSR,
dezesseis foram selecionados para analisar a população segregante e treze auxiliaram na
identificação dos híbridos, levando à eliminação de 55 genótipos (dentre os 271 utilizados
inicialmente) que provavelmente são provenientes de autofecundação. A genotipagem
com 142 marcadores SNPs também permitiu a confirmação de genótipos que não
pertenciam à população segregante desejada. Trinta e oito genótipos apresentaram, em
pelo menos seis locos, alelos ausentes nos genitores. Assim, foram confirmados 175
híbridos provenientes do cruzamento entre os cultivares Haden e Tommy Atkins. Setenta
e quatro locos segregaram como esperado pela proporção mendeliana, dos quais 18
mostraram-se ligados em grupos de dois ou três marcadores. Adicionalmente, mais 528
marcadores SNPs estão sendo aplicados para analisar esta população de mapeamento
61
visando obter um mapa completo e a associação de uma marca molecular a genes de
resistência à antracnose em mangueira.
Palavras-chave: marcadores SNPs, mapeamento genético, mangueira, antacnose
Introdução
O cultivo comercial de mangueira no Brasil é embasado em variedades de origem
estadunidense como ‘Tommy Atkins’, ‘Haden’, ‘Keitt’, ‘Kent’ e ‘Palmer’. Dentre estas
variedades, a ‘Tommy Atkins’ é a mais utilizada para plantios comerciais, fato que ameaça
a sustentabilidade da cultura e causa vulnerabilidade genética, devido ao estreitamento
genético proveniente do processo de melhoramento.
O melhoramento genético da mangueira encontra algumas dificuldades como longo
período juvenil, autoincompatibilidade e natureza heterozigótica. Esta espécie é
predominantemente alógama, sendo seu modo de reprodução caracterizado por
fecundação cruzada (Litz, 2009).
Marcadores moleculares podem ser utilizados para estimar a proporção relativa de
alogamia e autofecundação de uma espécie (Borém; Miranda, 2009), como já foi feito em
mangueira, revelando um percentual de aproximadamente 80% de híbridos em uma
progênie proveniente de polinização livre (Degani et al., 1997; Rodrigues et al., 2007).
A identificação de uma progênie proveniente de um cruzamento específico é
especialmente importante em estudos visando à construção de mapas genéticos. Além de
auxiliar na confirmação de híbridos resultantes de determinados cruzamentos em
populações sujeitas às autofecundações, como ocorre em mangueira, os marcadores
moleculares podem auxiliar na identificação de eventuais cruzamentos envolvendo outros
genitores masculinos.
O mapeamento de genes baseia-se na verificação de desequilíbrio de ligação entre
dois locos diferentes em uma população segregante. Se dois alelos são encontrados
juntos em uma população com mais frequência do que seria esperado para os locos de
segregação independente, os alelos estão em desequilíbrio de ligação (Ferreira e
Grattapaglia, 1998).
Os objetivos do presente trabalho foram confirmar a natureza híbrida da população
de estudo da resistência da mangueira à antracnose e construir um mapa de ligação
genética, visando mapear genes de resistência à doença.
62
Material e métodos
Amostras de DNA obtidas de tecido foliar dos genitores ‘Haden’ e ‘Tommy Atkins’,
bem como de 271 genótipos da progênie empregada neste estudo, foram extraídas com
base no protocolo de extração de Doyle e Doyle (1990). A quantificação de DNA foi feita
em gel de agarose (0,8%) submetido à eletroforese através da comparação visual da
intensidade das bandas do DNA extraído com bandas do DNA do fago Lambda, cujas
concentrações são conhecidas (25 a 150ng).
Um total de 50 marcadores SSR foi utilizado para genotipagem inicial dos genitores
(a fim de selecionar locos polimórficos) visando à identificação dos híbridos e
consequentemente, à eliminação de indivíduos resultantes de autofecundação.
As reações PCR foram realizadas num total de 13 µL, com 7,5 ng de DNA
genômico, 1,3 µL de tampão de reação 10x (pH 8,5), 20 mM de MgCl2, 3,25 mM de cada
dNTP, 1 unidade de Taq-DNA polimerase (Fermantas), 3,9 mM de primers marcados com
calda M13 (CACGACGTTGTAAAACGA) e 1,43 mM de primer complementar à calda
marcada com fluorescência 6-FAM. As amplificações foram realizadas em termociclador
(Applied Biosystems) programado para desnaturação inicial do DNA a 94oC por cinco
minutos, seguindo-se 30 ciclos com a temperatura de desnaturação a 94oC por 45
segundos, temperatura de anelamento de acordo com cada primer por um minuto e de
extensão a 72oC por um minuto, oito ciclos com a temperatura de 72°C por um minuto,
53ºC por um minuto e 72 ºC por um minuto. Seguiu-se extensão final à temperatura de
72°C por oito minutos.
A amplificação foi verificada em gel de agarose (0,8%) submetido a eletroforese.
Posteriormente, os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese por
capilaridade num sequenciador ABI 3500 (Applied Biosystems) e analisados com o
software Genemarker (versão 1.95) para definir o tamanho dos alelos amplificados.
A genotipagem da população segregante foi realizada com dezesseis marcadores
SSR selecionados como polimórficos entre os genitores e mais 142 marcadores SNPs.
A genotipagem com SNPs foi realizada usando a plataforma Fluidigm SNPtype
(http://www.fluidigm.com/snptype-assays.h tml). Cento e quarenta e duas sequências de
primers SNP foram desenhadas e fabricadas para dois painéis de genotipagem
SNPtypeTM (um painel de 96 e outro de 48). Os ensaios foram baseados na reação em
cadeia da polimerase alelo-específica competitiva permitindo a marcação bi-alélica de
SNPs em loci específicos. O Kit ReagenteTM de genotipagem Fluidigm SNPtype foi
utilizado de acordo com as instruções do fabricante combinado a 35ng/uL de cada
63
amostra de DNA. Ambas as misturas de amostras de DNA e SNPs foram então
carregadas em matriz de genotipagem dinâmica Fluidigm 96.96, que possibilita a
combinação de 96 loci com 96 amostras em 9216 câmaras de reação (Figura 3A), e
submetidas à amplificação alvo-específica a fim de enriquecer as sequências SNP de
interesse. A PCR foi realizada em Termociclador Fluidigm (Figura 3B) e a detecção de
fluorescência executada no sistema EP1TM imager (Fluidigm Corp.) (Figura 3C). Os dados
foram analisados com Fluidigm Genotipagem Analysis Software (Fluidigm, 2011).
A B C Figura 3: Material e equipamentos para genotipagem em plataforma Fluidigm. A-Matriz dinâmica 96.96; B- Load e Termociclador; C- Scan.
Testes de X2 foram aplicados para confirmar os padrões de segregação dos
marcadores moleculares. O cálculo da frequência de recombinação e das distâncias
genéticas entre os marcadores moleculares foi feito utilizando a função de mapeamento
de Kosambi com o auxílio do programa MAPMAKER (Lander et al., 1987; Lincoln et al.,
1992).
Resultados
Dos 50 marcadores SSR utilizados para analisar as amostras de DNA dos
genitores, dezesseis foram selecionados para analisar as amostras de DNA dos genótipos
que compõem a população segregante em virtude do polimorfismo expresso entre os
genitores ou da apresentação de locos igualmente heterozigotos para ambos. Dentre os
dezesseis marcadores selecionados, treze auxiliaram na identificação dos híbridos,
levando à eliminação de 55 genótipos (dentre os 271 utilizados inicialmente) que
provavelmente são provenientes de autofecundação.
A genotipagem com 142 marcadores SNPs permitiu a confirmação de genótipos
que não pertenciam à população segregante desejada, já que a população em estudo é
proveniente de polinização livre. Trinta e oito genótipos apresentaram, em pelo menos
seis locos, alelos ausentes nos genitores.
64
Assim, eliminaram-se os dados de genotipagem de 93 genótipos resultantes de
prováveis eventos como autofecundação ou polinização proveniente de outras
variedades, bem como três amostras que apresentaram problemas de amplificação,
resultando em 175 híbridos genotipados (Tabela 1).
Tabela 1. Levantamento da identificação de autofecundações e polinizações contaminantes em uma população segregante (‘Haden’ x ‘Tommy Atkins’) com auxílio de marcadores moleculares.
Progênie Número de amostras
Número de locos SSR utilizados
Número de locos SNP utilizados
Inicial
271 50 142
Autofecundações (Haden)
55 13 -
Híbridos de Haden x genitor desconhecido
38 - 42
Híbridos Haden x Tommy Atkins 175 15 54
Pela análise do teste X2, verificou-se que 74 locos segregaram como esperado pela
proporção mendeliana. A progênie apresentou 42 locos segregando na proporção de 1:1
que foram codificados para a análise de ligação genética com os códigos A e H, nos
casos em que o homozigoto apresentou mesmo genótipo de Haden, e B e H, nos casos
em que o homozigoto apresentou o mesmo genótipo de ‘Tommy Atkins’. A progênie
também apresentou 32 locos segregando na proporção de 1:2:1 que foram codificados
como A (alelos provenientes da ´Haden’), B (alelos provenientes da ‘Tommy Atkins’) e H,
para o heterozigoto. Apenas em dois locos houve detecção de alelos nulos e a
codificação para a análise de ligação foi realizada considerando como marcador
dominante.
Dos 74 locos utilizados na análise de ligação genética, 18 mostraram-se ligados em
grupos de dois ou três marcadores. Dentre os 42 que segregaram na proporção de 1:1,
12 mostraram-se ligados em grupos de dois ou três marcadores, enquanto, dentre os 32
que segregaram na proporção de 1:2:1, seis mostraram-se ligados aos pares (Tabela 2).
Como o número de marcadores utilizados até o momento não cobriu o genoma de
forma ampla, optou-se por uma análise de associação entre o fenótipo e cada um dos
marcadores isoladamente utilizados para a genotipagem (etapa em andamento).
65
Tabela 2. Grupos de ligação formados com base em locos SSR e SNPs para Mangifera indica L.
Padrão GL Locos Distância (cM) Lod score
1:1 1 M02, M15 e LMMA12 20,7 e 6,8 18,30 e 34,02
2 M05 e M51 19,3 19,26
3 M06 e M13 47,5 5,86
4 M23, M25 e M18 0,1 e 8,0 53,28 e 32,57
5 M44 e M45 12,6 24,22
1:2:1 1 LMMA1i e LMMA1ii 49,1 4,03
2 M08i e M19i 1,2 70,87
3 M37i e M38ii 0,0 75,86
Total 8 18 165,3 -
Discussão
A identificação de genótipos provenientes de autofecundação em progênie de
mangueira é essencial numa análise de mapeamento, pois neste tipo de estudo é
fundamental que toda a progênie segregue os alelos de dois genitores contrastantes.
Sabe-se que a mangueira é uma espécie predominantemente alógama, sendo a taxa de
polinização cruzada estimada em aproximadamente 80% (Degani et al., 1997; Rodrigues
et al., 2007). No presente estudo, a porcentagem de autofecundações identificadas na
progênie estudada foi de 20,29%, corroborando, portanto, o que é esperado para uma
população proveniente de polinização livre na cultura.
Com a polinização livre, também é possível que ocorra contaminação na progênie
considerada por pólen de outra variedade genitora. A aplicação de marcadores
moleculares na identificação deste evento também é fundamental em estudos de
mapeamento genético. Autofecundações e contaminações nas progênies nem sempre
precisam ser descartadas num programa de melhoramento genético, porém devem ser
descartadas da composição de uma população para mapeamento que deve ser analisada
com procedimentos estatísticos apropriados. As autofecundações na cultura podem,
portanto, ser aproveitadas no processo de seleção de variedades superiores porque
proporcionam novas combinações gênicas, uma vez que os genótipos gerados através
das polinizações livres devem apresentar níveis consideráveis de heterozigosidade.
Dependendo do tipo de ação gênica predominante na manifestação de um caráter, pode-
se encontrar um genótipo superior através da autofecundação.
66
Os 18 locos mapeados no presente trabalho formaram oito grupos de ligação
abrangendo 165,3 cM, o que equivale a cerca de 30% da estimativa do tamanho do
genoma da mangueira em cM (440 cM a 590 cM). Kashkush et al. (2001) construíram um
mapa de ligação genética da mangueira definido por 34 marcadores AFLP que formou 13
grupos de ligação e cobriu 161,5 cM. Ambos os mapas cobrem um pequeno percentual
do genoma, já que são esperados 20 grupos de ligação para a mangueira. Um número
maior de marcadores moleculares deve ser aplicado ao mapeamento genético desta
espécie a fim de obter o número de grupos estimado e, assim, aumentar a probabilidade
de identificação de marcas moleculares associadas a características de interesse.
Este capítulo é parte de um trabalho em parceria com o ARS-USDA (Agricultural
Research Service - United States Department of Agriculture) que visa o mapeamento
integrado do genoma da mangueira. Adicionalmente, mais 528 marcadores SNPs estão
sendo aplicados para analisar esta população de mapeamento visando obter um mapa
completo. O mapa integrado deve reunir os dados desta população segregante do Brasil e
os dados de populações segregantes de grupos parceiros da Austrália para compor a
análise final que resultará na publicação. Os dados das avaliações relatadas no capítulo 2
serão utilizados na busca de associação de marcadores moleculares a genes de
resistência à antracnose na cultura, assim como dados de avaliações de resistência da
cultura a outras doenças que estão sendo realizadas pela Embrapa Semiárido integrarão
este trabalho com o ARS-USDA.
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68
CONCLUSÕES GERAIS
Com base em descritores morfológicos e marcadores microssatélites (dentre os
quais 16 desenvolvidos neste estudo) foi possível inferir que variedades brasileiras de
manga possuem ampla diversidade genética, o que confere grande potencial para
utilização em estratégias de desenvolvimento de cultivares superiores.
A avaliação da resistência à antracnose em folhas destacadas de manga evidencia
que a herança é complexa e possui genes de efeito maior.
Na construção do mapa preliminar de ligação genética, a maioria dos locos
genotipados na população segregou de acordo com as proporções mendelianas
esperadas. Um número maior de marcadores moleculares é necessário para a formação
dos vinte grupos de ligação que contem o genoma da manga.
69
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