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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA

MOLECULAR

ESTUDO MORFOLÓGICO E ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO GENE FLOWERING

LOCUS T EM UM HÍBRIDO DE CITROS COM FLORESCIMENTO PRECOCE

LUCIANA SILVA ALMEIDA

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Outubro de 2016



LOCUS T EM UM HÍBRIDO DE CITROS COM FLORESCIMENTO PRECOCE

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de

Santa Cruz como parte das exigências para

obtenção do título de Mestre em Genética e

Biologia Molecular.

Área de concentração: Genética e

Biologia Molecular

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Outubro de 2016



LOCUS T EM UM HÍBRIDO DE CITROS COM FLORESCIMENTO PRECOCE.

Dissertação apresentada à Universidade

Estadual de Santa Cruz como parte das

exigências para obtenção do título de

Mestre em Genética e Biologia

Molecular.

Área de concentração:

Genética e Biologia Molecular

APROVADA:

Profa. Dra. Fabienne Florence Lucienne Micheli Profa. Dra. Fatima Cerqueira Alvim

(UESC/CIRAD) (UESC)

Profa. Dra. Dayse Drielly Souza Santana Vieira Dr. Abelmon da Silva Gesteira

(UNINASSAU) (EMBRAPA/UESC - Orientador)

Aos meus pais, pelo amor e cuidado,

DEDICO.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por iluminar e guiar meus passos durante esta caminhada e me presentear com

pessoas maravilhosas.

À Universidade Estadual de Santa Cruz pela realização desse curso.

Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular pela oportunidade de

realização desse trabalho e pelo compromisso com a formação dos discentes.

À EMBRAPA Mandioca e Fruticultura Tropical, ao Laboratório de Biologia Molecular e ao

Laboratório de Ecofisiologia, pelo espaço físico para o desenvolvimento dessa pesquisa.

Ao meu orientador Dr. Abelmon da Silva Gesteira, pela orientação, pelo apoio durante o

desenvolvimento da pesquisa e acima de tudo pela confiança.

À Dr.ª Tahise Magalhães e o Dr. Alex-Alan Furtado, pela co-orientação.

Ao Dr. Walter Soares e Dr. Maurício Coelho, pela atenção e ensinamentos.

À todos os Professores e as secretárias do PPGGBM, pelo suporte.

Ao Sr. Santana e todo a equipe do campo, pela amizade e ajuda na realização da pesquisa.

Aos membros da banca examinadora Dra. Fabienne Florence Lucienne Micheli, Dra. Fatima

Cerqueira Alvim e Dra. Dayse Drielly Souza Santana Vieira por terem aceitado participar da

avaliação deste trabalho.

À Eliana, pela amizade sincera, apoio, ensinamento e parceria no desenvolvimento desse

trabalho. Muito obrigada por tudo!

À Diana e Paulinho, pela amizade, ajuda, incentivo, explicações e orientação na técnica de

PCR em tempo real.

Aos amigos do grupo de pesquisa de citros, Shirley, Eliana, Lucas, Diana, Dayse, Nayara,

Moni, Andressa, Maria, Lais e Edlan, pela ajuda durante todo o trabalho, pelo bom convívio

diário e acima de tudo pela amizade que levarei para o resto da vida.

Aos amigos do LBM pela amizade, companheirismo, auxílio na realização desse trabalho e,

claro, pelos momentos de descontração que me proporcionaram tornando cada vez melhor

minha rotina diária no laboratório.

Aos colegas do curso de mestrado, que fizeram parte desse momento.

Aos meus amigos especiais, Vera, Shiw, Ane, Elvis, Paula, Mila e Dali pela amizade e torcida

de sempre.

A toda minha família, pela cooperação e palavras de estimulo, em especial, tia Neusa e Tate.

A meus pais, Américo e Valdete, que me ensinaram o verdadeiro valor da vida e respeito ao

próximo, e pelo incentivo constante a novas conquistas. Ao meu irmão e amigo Adriano, por

seu amor especial e pela torcida sincera. E ao meu namorado Robson, por estar ao meu lado

sempre, me dando conselhos, força, coragem e incentivo, e tornando cada dia da minha vida

mais especial. AMO VOCÊS!

Enfim, a todos que passaram pela minha vida e que direta ou indiretamente contribuíram para

o meu crescimento pessoal e profissional. Os meus sinceros agradecimentos!

ÍNDICE

EXTRATO .............................................................................................................................................. I

ABSTRACT ......................................................................................................................................... III

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 1

2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................................... 3

2.1 Citros – Aspectos gerais .................................................................................................................. 3

2.2 Fases de desenvolvimento das plantas perenes - Período juvenil ................................................ 5

2.3 Melhoramento Genético e período juvenil .................................................................................... 6

2.4 Florescimento (em citros) ............................................................................................................... 7

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 11

4. CAPÍTULO I: Caracterização morfológica de um híbrido de citros com florescimento

precoce .................................................................................................................................................. 15

RESUMO ............................................................................................................................................. 16

ABSTRACT ......................................................................................................................................... 17

4.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 18

4.2 MATERIAL E MÉTODO ............................................................................................................ 19

4.2.1 Coleta de dados ........................................................................................................................... 19

4.2.2 Árvore .......................................................................................................................................... 20

4.2.3 Folhas .......................................................................................................................................... 20

4.3.4 Flores ........................................................................................................................................... 20

4.2.5 Frutos e Sementes ....................................................................................................................... 20

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 21

4.3.1 Árvore .......................................................................................................................................... 21

4.3.2 Folhas .......................................................................................................................................... 22

4.3.3 Flores ........................................................................................................................................... 23

4.3.4 Frutos e Sementes ....................................................................................................................... 25

4.4 CONCLUSÕES ............................................................................................................................. 28

4.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 28

5. CAPÍTULO II: Estudo molecular do gene FLOWERING LOCUS T (FT) em planta de

origem híbrida de citros com florescimento precoce ....................................................................... 30

RESUMO ............................................................................................................................................. 31

ABSTRACT ......................................................................................................................................... 32

5.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 34

5.2 MATERIAL E MÉTODO ............................................................................................................ 35

5.2.1 Obtenção do material vegetal .................................................................................................... 35

5.2.2 Extração do DNA ....................................................................................................................... 35

5.2.3 Marcadores microssatélite para a confirmação dos clones nucelares ................................... 36

5.2.4 Desenho e otimização de primers para sequenciamento dos genes AP1, AP2, BAM, ELF4,

LFY, FLC, FT, SOC1 , TFL e WUS .................................................................................................... 37

5.2.5 Extração de RNA ........................................................................................................................ 38

5.2.6 Síntese de cDNA ......................................................................................................................... 39

5.2.7 Desenho e otimização dos primers para o estudo da expressão gênica .................................. 39

5.2.8 Eficiência dos primers e amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR) ..... 40

5.3 RESULTADO E DISCUSSÃO .................................................................................................... 41

5.3.1 Confirmação dos clones nucelares ............................................................................................ 41

5.3.2 Desenho e otimização dos primers para o sequenciamento ..................................................... 43

5.3.3 Desenho dos primers para o RT-qPCR ..................................................................................... 43

5.3.4 Análise de cDNAs e especificidade dos primers via PCR convencional ................................. 44

5.3.5 Otimização dos genes por RT-qPCR ........................................................................................ 44

5.3.6 Expressão gênica do gene FT .................................................................................................... 44

5.4 CONCLUSÕES ............................................................................................................................. 49

5.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 49

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................................... 53

I

EXTRATO

ALMEIDA, Luciana Silva Almeida, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,

outubro de 2016. Estudo morfológico e análise da expressão do gene FLOWERING

LOCUS T em um híbrido de citros com florescimento precoce. Orientador: Prof. Dr.

Abelmon da Silva Gesteira. Co-orientadores: Prof. Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida e Dra.

Tahise Magalhães de Oliveira

Os citros são considerados umas das principais fruteiras do mundo, sendo o setor citrícola

brasileiro um dos mais representativos. Os principais estados produtores no Brasil são São

Paulo e Bahia. As plantas de citros apresentam um período juvenil longo o que tem

dificultado o progresso do melhoramento genético dessas plantas. Nesse sentido, faz-se

necessário estudos com a finalidade de reduzir o longo período juvenil. Este trabalho tem

como objetivo caracterizar a planta de citros de origem híbrida [(LCR x CTYM – 005) x MCP

– 011] quanto à sua morfologia, e estudar a expressão do gene FLOWERING LOCUS T (FT)

relacionado à floração nesse híbrido no inverno e verão. Estudos morfológicos do híbrido

[(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011] que apresenta período juvenil curto foram realizados,

utilizando o manual Descriptors for Citrus. Medições da altura e diâmetro da copa das

árvores, além de observações de folhas, frutos, flores e sementes e a contagem dos embriões

foram realizadas. Verificou-se que o híbrido apresenta aproximadamente 50% de

poliembrionia, bem como um florescimento precoce e frutificação contínua, características

que o tornam um candidato promissor para utilização no melhoramento genético de citros. Em

adição, estudos de expressão do gene FT foram realizados no híbrido [(LCR x CTYM – 005)

II

x MCP – 011], em seu período de floração. Observou-se que houve influência do período do

inverno na expressão do gene FT entre caule e folha. No caule, a diferença não foi

significativa entre inverno e verão. Os dados apresentados são os primeiros a abordar genes

relacionados à redução do período juvenil e indução floral no híbrido [(LCR x CTYM – 005)

x MCP – 011].

Palavras-chave: Redução do período juvenil, genes do florescimento e melhoramento genético

de citros.

III

ABSTRACT

ALMEIDA, Luciana Silva Almeida, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,

October 2016. Morphological study and analysis of the expression of FLOWERING

LOCUS T gene in a citrus hybrid with early flowering. Advisor: Prof. Dr. Abelmon da

Silva Gesteita. Committee Members: Prof. Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida and Dr. Tahise

Magalhães de Oliveira

The citrus are considered one of the main fruit trees of the world, being the Brazilian citrus

sector one of the most representative. The main producing states in Brazil are São Paulo and

Bahia. Citrus plants have a long juvenile period which has hampered the progress of genetic

improvement of these plants. In this sense, studies are necessary in order to reduce the long

juvenile period. This work aims to characterize the citrus plant of hybrid origin [(LCR x

CTYM - 005) x MCP - 011] regarding its morphology, and to study the FLOWERING

LOCUS T (FT) gene expression related to flowering in this hybrid in winter and summer.

Morphological studies of the hybrid [(LCR x CTYM - 005) x MCP - 011] showing short

juvenile period were performed using the Descriptors for Citrus manual. Measurements of the

height and diameter of the crown of the trees, besides observations of leaves, fruits, flowers

and seeds and counting of the embryos were performed. The hybrid has been shown to have

approximately 50% polyembryony as well as early blossoming and continuous fruiting,

characteristics that make it a promising candidate for use in citrus breeding. In addition, FT

gene expression studies were performed on the hybrid [(LCR x CTYM - 005) x MCP - 011],

IV

during its flowering period. It was observed that there was influence of the winter period on

the expression of the FT gene between stem and leaf. In the stem, the difference was not

significant between winter and summer. The data presented are the first to address genes

related to juvenile period reduction and floral induction in the hybrid [(CCR x CTYM - 005) x

MCP - 011].

Keywords: Reduction of juvenile period, flowering genes and genetic improvement of citrus.

1

1. INTRODUÇÃO

As plantas de citros fazem parte da família Rutaceae, e o gênero Citrus destaca-se

como um dos mais importantes do ponto de vista comercial. As espécies do gênero Citrus são

alógamas, sexualmente compatíveis, altamente heterozigotas e a maioria é diploide, com 18

cromossomos nas células somáticas. As plantas de citros podem se reproduzir sexualmente,

assexuadamente e ainda por enxertia (CAMERON; FROST, 1968).

Os citros são nativos da Ásia oriental, no entanto, essas plantas se propagaram para

diversos países tropicais e subtropicais, como Brasil, sendo considerada a principal fruteira no

mundo. O setor citrícola brasileiro é um dos mais representativos do mundo, com cultivo em

ampla escala nos estados de São Paulo e Bahia. Nessas regiões, milhares de pessoas

trabalham com os citros, desde a sua produção ao beneficiamento e comercialização de seus

produtos, o que tem contribuído de forma significativa para o desenvolvimento do país

(NEVES et al., 2010).

Os citros, assim como todas as plantas perenes, passam por diferentes fases de

desenvolvimento durante seus ciclos de vida: fase vegetativa juvenil, fase vegetativa adulta e

fase adulta reprodutiva. A passagem da fase juvenil para a fase adulta é marcada

principalmente pelo ganho da capacidade de formação das estruturas reprodutivas, ou seja,

quando acontece a floração. Essa transição envolve fatores exógenos e endógenos que

controlam uma rede genética complexa e depende da duração do período juvenil (SONG et

al., 2013; TAN; SWAIN, 2006; HA, 2014).

A fase juvenil possibilita o maior crescimento vegetativo da planta (THOMAS;

VINCE-PRUE, 1997), no entanto, em plantas perenes esse período é muito longo, o que tem

2

dificultado o progresso do melhoramento genético dessas plantas (TONG et al., 2009). Nos

citros, o período juvenil pode durar de dois à 12 anos em plantas provenientes de sementes

(ENDO et al., 2005; MATSOUKAS et al., 2012; MACHADO et al., 2005), o que dificulta os

cruzamentos e pode levar à descontinuidade nos programas de melhoramento estabelecidos

(FROST; SOOST, 1968).

Com o objetivo de encurtar o longo período juvenil comumente observado em citros, a

EMBRAPA Mandioca e Fruticultura apresenta um extenso Programa de Melhoramento

Genético de Citros (PMG - Citros), onde uma das linhas de pesquisa é a seleção de híbridos

de citros com período juvenil curto. Essas plantas selecionadas com ciclo juvenil curto,

podem ser utilizadas em técnicas moleculares e fisiológicas nos programas de melhoramento

otimizando tempo, custos e manutenção de plantas.

Nesse contexto, o PMG - Citros da EMBRAPA Mandioca e Fruticultura dispõe de um

híbrido oriundo de um cruzamento triplo, [(Limoeiro ‘Cravo” (LCR) x Citrangeiro

‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus papuana (MCP) – 011] que apresenta período juvenil

muito curto de aproximadamente um ano. Contudo, tornar esse híbrido como potencial objeto

de estudo exige ações de pesquisa intensas e de médio prazo. Nesse sentido, o presente estudo

teve como objetivos caracterizar a planta de citros de origem híbrida [(LCR x CTYM – 005) x

MCP – 011] quanto à sua morfologia, e estudar a expressão do gene FLOWERING LOCUS T

(FT) relacionado à floração nesse híbrido no inverno e verão.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Citros – Aspectos gerais

Os citros apresentam ampla diversidade de gêneros e espécies e de seus processos de

geração, o que torna sua taxonomia bastante complexa e controvertida. Os estudos

taxonômicos mais relevantes são os de Swingle (1967), que classifica o gênero Citrus em 16

espécies e um amplo número de híbridos, e os de Tanaka (1961) que considera 162 espécies.

A classsificação de Swingle é a mais aceita e difundida, no entanto, com o uso de marcadores

moleculares e do sequenciamento de genoma, os estudos estão mais avançados e a taxonomia

dos citros está sendo esclarecida. A análise da diversidade, estrutura genética e origem de

limas e limões, desenvolvida por Curk e colaboradores (2016) demonstrou alto grau de

polimorfismo para os dois grupos, com variedades diploides, triploides e tetraploides. Além

disso, a contribuição do genoma nuclear das quatro taxas básicas de Citrus (C. medica, C.

maxima, C. micrantha e C. reticulata) foi confirmada para os acessos de limas e limões.

As plantas de citros e gêneros relacionados pertencem à ordem Geraniales, subordem

Geranineae, família Rutaceae, e subfamília Aurantioideae. Dentro da subfamília

Aurantioideae, existem seis gêneros: Fortunella (Swingle), Eremocitrus, Poncirus, Clymenia

(Swingle), Microcitrus e Citrus. Dentre esses gêneros, os que exibem maior interesse

comercial são Fortunella, Poncirus e, principalmente, Citrus (AGUSTÍ et al., 2014). As

espécies do gênero Citrus são alógamas, sexualmente compatíveis e altamente heterozigotas.

A grande maioria dessas espécies é diploides, com número de cromossomos nas células

4

somáticas 2n = 18 (CAMERON; FROST, 1968), no entanto, algumas variações podem

ocorrer a exemplo de triploides e tetraploides (SPIEGEL-ROY; GOLDSCHMIDT, 2008). As

plantas de citros podem se reproduzir sexualmente, por fecundação cruzada e por

autopolinização, assexuadamente por apomixia nucelar e agronomicamente por meio de

enxertia (CAMERON; FROST, 1968).

Os citros são nativos da Ásia oriental, no entanto, essas plantas se propagaram para

diversos países tropicais e subtropicais, como Brasil, China, Índia, EUA, México e Espanha,

sendo considerada a principal fruteira no mundo. No Brasil, os citros foram introduzidos

durante a colonização portuguesa, por volta da metade do século XVI. As primeiras sementes

foram plantadas na Bahia, posteriormente propagadas nos estados de São Paulo e Rio de

Janeiro (SPIEGEL-ROY; GOLDSCHMIDT, 2008; LIMA, 2014). Atualmente, os maiores

estados produtores de laranja no Brasil são respectivamente, São Paulo, Bahia, Paraná, Minas

Gerais e Sergipe. Os estados do sudeste detêm a maior produção, com cerca de 80%,

enquanto Bahia e Sergipe, juntamente, representam em torno de 9% da produção nacional

(IBGE, 2013).

A citricultura é considerada um dos segmentos mais importantes do agronegócio

brasileiro, e tem contribuído de forma significativa para o desenvolvimento do país desde

1962, quando começaram as primeiras exportações e o setor gerou US$ 60 bilhões (NEVES et

al., 2010). Desde então, a citricultura nacional evoluiu bastante, e a safra brasileira de laranja

2015/2016 tem previsão de atingir 410 milhões de caixas de 40,8kg cada, o que representa um

aumento de 10 milhões de caixas, relativa à safra anterior (2014/2015) (CANAL RURAL,

2016; REVISTA GLOBO RURAL, 2016).

O setor citrícola brasileiro é um dos mais representativos do mundo, se destacando

como o segundo maior produtor, ficando atrás apenas da China (FRANCK CURK, 2014). A

produção brasileira de laranja representa cerca de 30% da safra mundial da fruta (MAPA-

Citros, 2016), no entanto, 98% da laranja produzida no Brasil é comercializada para a

industrialização da fruta, principalmente para a produção do suco concentrado e congelado, e

é exportado para países como EUA, União Europeia, Japão e China (LOHBAUER, 2011).

Essa produção corresponde a cerca de 60% da produção mundial de suco (MAPA-Citros,

2016).

5

2.2 Fases de desenvolvimento das plantas perenes - Período juvenil

As plantas perenes passam por diferentes fases de desenvolvimento durante seu ciclo

de vida: fase vegetativa juvenil, fase vegetativa adulta e fase reprodutiva. As transições

começam da germinação para a fase vegetativa juvenil, na qual as plantas aumentam

rapidamente sua capacidade fotossintética, seu tamanho e massa, porém não são capazes de

responder aos estímulos ambientais para emissão de flores (HUIJSER; SCHMID, 2011; HA,

2014).

O período juvenil é seguido por uma fase vegetativa adulta, onde as plantas adquirem

competência reprodutiva em resposta a sinais indutores florais. A transição para a fase

reprodutiva é marcada pela floração, ou seja, o meristema vegetativo do caule é convertido

em um meristema floral (BÄURLE; DEAN, 2006; HUIJSER; SCHMID, 2011; HA, 2014).

Essa transição é raramente reversível e ideal para a polinização e desenvolvimento de

sementes, que é um fator importante no sucesso reprodutivo da planta (BOSS et al., 2004).

A transição da fase vegetativa juvenil para a fase vegetativa adulta é marcada por

alterações de algumas características da planta, tais como o tamanho e a morfologia da folha,

comprimento dos entrenós, filotaxia, distribuição de tricomas, tamanho de celulas e

capacidade de enraizamento; e pelo ganho da competência reprodutiva, que depende da

duração do período juvenil (YU et al., 2013). Essa fase juvenil varia entre as espécies. Em

plantas anuais, como Arabidopsis thaliana, esta fase leva algumas semanas ou meses.

Enquanto em espécies de plantas perenes essa fase pode durar vários anos, como pode ser

visto em citros, que dependendo da espécie, pode durar em média de dois à 12 anos (ENDO

et al., 2005; MATSOUKAS et al., 2012; MACHADO et al., 2005).

Do ponto de vista fisiológico, a fase juvenil possibilita o maior crescimento vegetativo

da planta e a produção de grande superfície foliar, e ainda evitam os baixos rendimentos de

sementes que ocorreriam se fossem florescer precocemente (THOMAS; VINCE-PRUE,

1997). No entanto, o longo período juvenil das plantas perenes tem ocasionado impacto no

progresso do melhoramento genético (TONG et al., 2009), visto que, o longo tempo para

obtenção de frutos torna o melhoramento dessas plantas laborioso e oneroso, o que tem levado

os pesquisadores a explorarem métodos moleculares e fisiológicos para reduzir o período

juvenil e acelerar o tempo para o florescimento (MATSOUKAS et al., 2012).

6

2.3 Melhoramento genético e período juvenil

Os estudos com melhoramento genético de citros na EMBRAPA Mandioca e

Fruticultura Tropical, localizada no Recôncavo Baiano, em Cruz das Almas - BA iniciaram a

partir dos anos 1980 com base nos acessos presentes no Banco Ativo de Germoplasma (BAG)

de Citros dessa Unidade, com o intuito de incentivar os trabalhos de hibridação visando a

criação de novas cultivares copa e porta-enxertos adaptados às condições regionais (PASSOS

et al., 2007). Atualmente o BAG apresenta aproximadamente 600 acessos, como laranjas,

tangerinas, limões, limas, cidras, pomelos, toranjas e híbridos, conservados sob condições de

campo e em telado (SOARES FILHO et al., 2013). Desde o estabelecimento desse banco, a

diversidade genética nele contida vem servindo como base para o desenvolvimento da

citricultura brasileira.

A caracterização de cultivares é uma etapa essencial no manejo de coleções de

germoplasma, e consiste no levantamento de informações necessárias à descrição,

identificação e diferenciação de acessos dentro de uma mesma espécie. A caracterização

morfológica consiste na adoção de descritores botânicos herdáveis, facilmente visíveis e

mensuráveis, que, a princípio, são expressos em todos os ambientes (IBPGR, 1999). Os

estudos de caracterização morfológica devem permitir a discriminação relativamente fácil

entre fenótipos e fornecer as primeiras estimativas de variabilidade dentro da coleção de

germoplasma. No caso dos citros, o manual de Descriptors for Citrus, elaborado pelo então

International Board for Plant Genetic Resources (IBPGR, 1999) é o mais utilizado

atualmente e representa uma ferramenta de padronização internacional para todas as espécies

cítricas.

O melhoramento genético via cruzamentos controlados entre plantas compatíveis é

uma das principais formas de se obter e manipular a variabilidade. No entanto, nos citros, o

longo período juvenil de plantas provenientes de sementes dificulta os cruzamentos e podem

levar à descontinuidade nos programas estabelecidos (FROST; SOOST, 1968). Visto que, o

período de tempo desde a semeadura até o início da fase reprodutiva das plantas de citros

propagadas via sementes dura em média de dois a 12 anos (ENDO et al., 2005;

MATSOUKAS et al., 2012; MACHADO et al., 2005). Dessa forma, os citros levam um

tempo muito longo para a conclusão de um ciclo de recombinação e seleção, e

consequentemente há uma demora de muitos anos para o lançamento cultivares (CARLOS;

STUCHI; DONADIO, 1997). O longo período juvenil implica ainda na presença de plantas

7

com grande quantidade de espinhos, crescimento vigoroso, folhagem abundantes resultando

em plantas com porte excessivo, dificultando a avaliação das progênies híbridas (GROSSER;

GMITTER JÚNIOR, 1990). Durante esse período as plantas não produzem flores e nem

frutos, e dessa forma, é necessário um longo período para alcançar produções satisfatórias

(CAMERON; FROST, 1968).

Com o objetivo de encurtar o longo período pré-reprodutivo comumente observado em

citros, podem ser desenvolvidas algumas técnicas nos programas de melhoramento de citros

com a utilização de plantas que apresentem ciclo juvenil curto, por possibilitar a redução de

tempo, de trabalho e de custo de manutenção das plantas. Nesse sentido, a EMBRAPA

Mandioca e Fruticultura apresenta um extenso Programa de Melhoramento Genético de Citros

(PMG - Citros), onde uma das linhas de pesquisa é a seleção de híbridos de citros com

período juvenil curto. O PMG - Citros dispõe do híbrido [(Limoeiro ‘Cravo”(LCR) x

Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus papuana (MCP) – 011] que apresenta

período juvenil muito curto, de aproximadamente um ano.

Plantas de citros que apresentem período juvenil curto tornam um excelente material

para desenvolver técnicas do melhoramento, como a hibridação sexual e somática. Além

disso, plantas com essa característica facilitam os estudos de genômica funcional relacionado

ao florescimento e a frutificação (TAN et al., 2009; TONG et al., 2009; PINHEIRO et al.,

2014). Outra maneira interessante de utilizar e estudar plantas de citros com curto período

juvenil é empregá-la como porta-enxerto na combinação copa/porta-enxerto. O porta-enxerto

pode imprimir nas copas enxertadas mudanças fisiológicas e moleculares que proporcionem

um menor período vegetativo.

2.4 Florescimento em citros

A floração é um acontecimento crucial no ciclo de vida da planta, pois garante o

desenvolvimento e evolução da espécie. Esse evento é marcado pela conversão do meristema

caulinar vegetativo em estruturas reprodutivas, através da verificação dos sinais ambientais e

endógenos que controlam uma rede genética complexa e apresenta as vias de floração

(HUIJSER; SCHMID, 2011).

A partir de estudos moleculares com mutantes de Arabidopsis thaliana, muitos genes

envolvidos nas múltiplas rotas que controlam o florescimento foram identificados e

caracterizados, e com isso, o desenvolvimento floral passou a ser abordado como um evento

8

que abrange várias etapas, incluindo a indução floral, diferenciação e antese, além dos tipos e

distribuição das flores e a produção e qualidade dos frutos (ZIK; IRISH, 2003; SIMPSON;

DEAN, 2002; WELLMER; RIECHMANN, 2010; AMASINO, 2010). Essas etapas são

resultantes de interações complexas entre genoma, níveis hormonais, promotores e inibidores,

os quais dependendo da idade e fase de desenvolvimento da planta são afetados pelas

condições ambientais (WELLMER; RIECHMANN, 2010).

A temperatura é um dos fatores ambientais que tem grande influência na floração de

citros, pois afeta a duração e a taxa de desenvolvimento floral (MOSS, 1969; SOUTHWICK;

DAVENPORT, 1986; VALIENTE; ALBRIGO, 2004). No entanto, a faixa ideal e o efeito da

temperatura sobre a floração variam entre as espécies (HA; JOHNSTON, 2013). A exposição

prolongada à baixas temperaturas, evento chamado de vernalização, também desempenha um

papel importante na indução da floração em citros (GARCIA-LUIS et al., 1992;

SOUTHWICK; DAVENPORT, 1986). O déficit hídrico também tem sido citado como

responsável pelo aumento do número de ramos produtores de flores em citros

(SOUTHWICK; DAVENPORT, 1986).

Em Arabidopsis, a regulação floral integra estímulos ambientais e endógenos e

envolve quatro rotas metabólicas: rota do fotoperíodo, rota autônoma, rota de vernalização e

rota das giberelinas, onde são propostas regulações positivas e negativas (YU et al., 2013;

HUIJSER; SCHMID, 2011; HA, 2014; MATSOUKAS et al., 2012; BOSS et al., 2004).

Todas as rotas convergem para um ponto de integração, onde acontece a expressão de um

conjunto de genes, chamados integradores florais. Estes agem sobre a expressão dos genes de

identidade do meristema floral, os quais desencadeiam e controlam a morfogênese floral,

através da regulação da expressão dos genes de identidade de órgãos florais (SONG et al.,

2013; WELLMER; RIECHMANN, 2010; OMAOILEIDIGH et al., 2014).

Dentre os genes conhecidos como integradores da floração, podemos citar

SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1 ) e FLOWERING LOCUS

T (FT). Em A. thaliana, SOC1 é um importante integrador floral nas múltiplas rotas. Os genes

SOC1, AP3 e WUSCHEL (WUS) foram isolaram e caracterizaram em citros, e superexpressão

de SOC1 de citros resultou no florescimento precoce em A. thaliana. Enquanto, o aumento da

expressão de CsWUS em A. thaliana garantiu um papel importante na integridade da

identidade e da estrutura dos meristemas florais. Essas observações indicam que os genes

SOC1 e WUS apresentam em citros funções equivalentes às observadas em A. thaliana (TAN;

SWAIN, 2007).

9

FT é um importante indutor da floração, e têm sido investigado para reduzir a

juvenilidade em algumas culturas, como em A. thaliana (NAKATSUKA et al., 2009) e

árvores de álamo (HSU et al., 2006). Em citros, observou-se o aumento na expressão de um

gene ortólogo de FT, em plantas adultas de tangerina “Satsuma” no período de indução floral,

quando exportas ao tratamento com baixa temperatura (15ºC). Entretanto, condições de baixa

temperatura não alteraram a expressão desse gene em plantas juvenis. (NISHIKAWA, et al.,

2007, 2009). A expressão constitutiva de FT de citros pode reduzir o período juvenil,

induzindo floração e frutificação, além de causar alterações nas características morfológicas

em P. trifoliata, evidenciando o papel do gene FT como importante regulador da indução

floral em citros. (ENDO et al., 2005).

Em A. thaliana, dois genes foram mostrados como reguladores positivos cruciais de

desenvolvimento do meristema floral: LEAFY (LFY) e APETALA1 (AP1). Ambos, AP1 e LFY

promovem a expressão de outros genes de identidade do meristema floral, enquanto

concomitantemente reprimem a expressão de reguladores negativos da floração, como

TERMINAL FLOWER1 (TFL1) (KAUFMANN et al., 2010).

A superexpressão de FLY e AP1 promove floração precoce em espécies perenes,

incluindo citros. Peña e colaboradores (2001) transformaram plantas juvenis de citranges (C.

sinensis x P. trifoliata) com os genes LFY e AP1 de A. thaliana, e observaram uma redução

em dois anos no período juvenil dessas plantas. Em 2004, Pillitteri e colaboradores isolaram e

caracterizaram os genes LFY e AP1 de citros e demonstraram que plantas transgênicas de A.

thaliana expressando constitutivamente os genes LFY ou AP1 de citros apresentaram

florescimento bastante precoce, semelhante ao descrito para superexpressão desses genes em

A. thaliana (PILLITTERI et al., 2004b).

Dentre os genes que provocam prolongamento da fase vegetativa em citros, retardando

o tempo de florescimento, destaca-se o gene TERMINAL FLOWER1 (TFL1). Plantas

transgênicas de A. thaliana expressando o gene CsTFL1, isolado de laranja doce “Washington

navel”, apresentaram um fenótipo de florescimento tardio semelhante à superexpressão de

TFL1 em A. thaliana (PILLITTERI et al., 2004a). Conforme estudos em A. thaliana e

algumas culturas perenes, como citros, a característica de período juvenil longo está associada

a altos níveis do gene TFL, (HA, 2014).

SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) é outro importante gene que retarda a transição

da fase juvenil para a fase adulta pela repressão da função dos genes do florescimento. Em

citros, SVP foi isolado de um mutante de florescimento precoce de P. trifoliata e observou-se

10

que SVP foi expresso em tecidos dormentes e meristemas vegetativos antes da transição floral

e sua expressão foi reprimida em botões florais, durante a transição floral. Além disso, foi

constatado que a expressão de SVP em citros foi maior nos primórdios florais (células

diferenciadas) do que nos meristemas (células indiferenciadas). Dessa forma, o padrão de

expressão de SVP em citros, durante a determinação do meristema apical, sugere que este

gene não interrompe a iniciação floral, no entanto, influencia o desenvolvimento vegetativo e

a identidade do meristema floral, regulando o tempo de floração (LI et al., 2010).

11

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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15

CAPÍTULO I: Caracterização morfológica de um híbrido de citros com

florescimento precoce

16

RESUMO

Os citros são um dos principais cultivos frutífero do Brasil. Essa cultura representa um

importante segmento econômico no país. No entanto, as plantas de citros apresentam um longo período

juvenil, fator que limita a eficiência dos programas de melhoramento de citros. Nesse contexto, a

EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, Cruz das Almas –BA selecionou o híbrido (LCR x CTYM - 005)

x MCP - 011 que apresenta período juvenil muito curto, em comparação com os demais. Este trabalho

tem como objetivo estudar esta planta de origem híbrida por meio da caracterização morfológica. Para

tal, foi utilizado o manual Descriptors for Citrus. Foram caracterizados três exemplares da planta em

estudo. Medições da altura e do diâmetro da copa das árvores foram realizadas, bem como a

caracterização morfológica de folhas, frutos, flores e sementes e a contagem dos embriões. O híbrido

(LCR x CTYM - 005) x MCP – 011 é uma planta de altura média de 250 cm aos 4 anos, com

aproximadamente 200 cm de diâmetro da copa. Suas folhas apresentam coloração verde escura. O

limbo único e contínuo apresenta forma lanciolada e margem dentada, sem a presença de pelos em

ambas as faces. As flores hermafroditas e os botões florais são de cor branca e perfumadas. As anteras

são amarelas e o seu comprimento é mais curto em relação ao estigma. Em relação à floração, foram

observadas algumas mudas florescendo a partir do segundo mês de cultivo e plantas adultas podendo

florescer, com o aparecimento simultâneo e contínuo de flores e frutos durante todo o ano. O fruto

apresenta formato esferóide. Quando maduro, apresenta coloração verde amarelado e superfície suave.

São bastante atrativos, principalmente por apresentarem uma fragrância perfumada e serem produzidos

em grande quantidade durante todo o ano. Já as sementes, apresentam forma esferóide, com superfície

suave e muita mucilagem. Com base nas observações e contagem dos embriões, as sementes

apresentam de um a cinco embriões e 50% de poliembrionia. Os resultados obtidos indicam que a

planta em estudo apresenta características diferenciadas, principalmente relacionadas com

florescimento precoce e frutificação contínua, o que a caracteriza como um candidato promissor para

utilização no melhoramento genético de citros.

Palvras-chave: Período juvenil, floração e descritores de citros.

17

ABSTRACT

Citrus is one of the main fruit crops in Brazil. This culture represents an important economic segment

in the country. However, citrus plants have a long juvenile period, a factor that limits the efficiency of

citrus breeding programs. In this context, EMBRAPA Cassava and Fruticulture, Cruz das Almas - BA

selected the hybrid (LCR x CTYM - 005) x MCP - 011, which presents a very short juvenile period in

comparison with the others. This work aims to study this plant of hybrid origin through the

morphological characterization. For this, the manual Descriptors for Citrus was used. Three specimens

of the plant under study were characterized. Measurements of tree crown height and diameter were

performed, as well as the morphological characterization of leaves, fruits, flowers and seeds and the

counting of the embryos. The hybrid (LCR x CTYM - 005) x MCP - 011 is a medium height plant of

250 cm at 4 years, with approximately 200 cm of crown diameter. Its leaves are dark green in color.

The single and continuous limbus presents lanciolate form and dentate margin, without the presence of

hairs in both faces. The hermaphrodite flowers and floral buds are white and perfumed. The anthers are

yellow and their length is shorter in relation to the stigma. In relation to the flowering, some seedlings

were observed to bloom from the second month of cultivation and adult plants could flourish, with the

simultaneous and continuous appearance of flowers and fruits throughout the year. The fruit has a

spheroid shape. When ripe, it has a yellowish-green coloration and a soft surface. They are quite

attractive, mainly because they present a perfumed fragrance and to be produced in large quantity

throughout the year. The seeds are spheroid in shape, with a smooth surface and a lot of mucilage.

Based on observations and counts of the embryos, the seeds have one to five embryos and 50% of

polyembryony. The results indicate that the plant under study presents differentiated characteristics,

mainly related to early flowering and continuous fruiting, which characterizes it as a promising

candidate for use in the genetic improvement of citrus.

Keywords: juvenile period, flowering and citrus descriptors.

18

4.1 INTRODUÇÃO

A citricultura é o principal cultivo frutífero do Brasil, com 800 mil ha de área plantada. Os

citros foram introduzidos no Brasil logo no início da colonização, e encontrou no país melhores

condições para vegetar e produzir do que nas próprias regiões de origem, expandindo-se por todos os

estados brasileiros. No Brasil, a produção de citros representa importante segmento econômico,

estando entre as culturas frutíferas de maior destaque, não só por seu expressivo valor de produção,

como por sua importância na geração de empregos diretos e indiretos (NEVES et al., 2010).

O gênero Citrus pertence à família Rutaceae, apresenta alta diversidade de espécies e é

considerado o gênero mais importante economicamente (CAMERON; FROST, 1968). Em geral, as

espécies do gênero Citrus são alógamas, sexualmente compatíveis, altamente heterozigotas e diploides,

com número de cromossomos nas células somáticas 2n = 18 (CAMERON; FROST, 1968). Essas

plantas podem se reproduzir sexualmente, podendo, também, haver reprodução assexual e por meio de

enxertia (CAMERON; FROST, 1968).

As plantas de citros apresentam um longo período juvenil que varia de dois a 12 e varia em

função da espécie de citros, das condições ambientais e do sistema de cultivo adotado (MACHADO et

al., 2005). Longos períodos juvenis retardam o melhoramento genético dos citros, pois não há

produção de frutos e, quando estes são produzidos, apresentam, nas safras iniciais, características

distintas das plantas com completo amadurecimento fisiológico (SPIEGEL-ROY; GOLDSCHMIDT,

2008).

Reduzir o período juvenil é uma das principais estratégias para aumentar a eficiência dos

programas de melhoramento de citros, devido ao longo tempo de geração da espécie. Nesse sentido, o

Programa de Melhoramento Genético dos Citros da EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, Cruz das

Almas –BA selecionou o híbrido [(Limoeiro ‘Cravo”(LCR) x Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) – 005) x

Microcitrus papuana (MCP) – 011] que apresenta período juvenil muito curto, de aproximadamente

um ano. Esse híbrido pode ser utilizado com o objetivo de acelerar o melhoramento de citros, no

entanto, é de grande importância o desenvolvimento de estudos relativos à caracterização morfológica.

A caracterização morfológica dos acessos conservados no BAG é uma etapa essencial para

identificar o potencial existente na coleção, e consiste na adoção de descritores botânicos herdáveis,

facilmente visíveis e mensuráveis, que, a princípio, são expressos em todos os ambientes (IBPGR,

1999). No caso dos citros, o manual Descriptors for Citrus elaborado pelo então International Board

19

for Plant Genetic Resources (IBPGR, 1999) é o mais utilizado atualmente e representa uma ferramenta

de padronização internacional para todas as espécies cítricas.

Desta forma, este trabalho teve como objetivo estudar o híbrido (LCR x CTYM - 005) x MCP –

011 localizado no Banco de Germoplasma (BAG) de Citros da EMBRAPA Mandioca e Fruticultura

por meio da caracterização morfológica, com a finalidade de gerar subsídios para ações de

melhoramento genético voltado para a redução do período juvenil em citros.

4.2 MATERIAL E MÉTODO

Este estudo foi desenvolvido no BAG de Citros, localizado na EMBRAPA Mandioca e

Fruticultura, a 12º 40' 19" de latitude sul e 39º 06' 22" de longitude oeste, localizado no município de

Cruz das Almas, Recôncavo da Bahia, Brasil.

O clima do município de Cruz das Almas, segundo classificação de Köppen, é uma transição

entre as zonas Am e Aw (clima de monção e clima tropical de inverno seco, respectivamente), com

precipitação pluviométrica com média anual de 1143 mm, temperatura média de 24,28 ºC e umidade

relativa de 60,47% (SOUZA et al., 2009). O solo da área experimental é um Latossolo Amarelo

distrófico típico, A moderado, textura franco-argiloarenosa, caulinítico, hipoférrico, fase transição

floresta tropical subperenifólia/subcaducifólia com declive de 0 a 3% (SOUZA; SOUZA, 2001).

A planta de origem híbrida [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011] selecionada pelo Programa

de Melhoramento Genético dos Citros da Embrapa Mandioca e Fruticultura – PMG Citros foi avaliada

morfologicamente por meio de descritores morfológicos adaptados a partir da lista Descriptors for

Citrus (IPGRI, 1999).

4.2.1 Coleta de dados

Foram observadas três árvores da planta [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011], todas com

aproximadamente quatro anos de cultivo, localizadas no BAG de Citros da EMBRAPA Mandioca e

Fruticultura. Essas plantas são clones nucelares comprovadas por meio de marcadores microssatélites

da planta matriz, que apresenta 6 anos de cultivo. Foram coletadas 30 folhas maduras, 10 frutos

maduros e 10 flores totalmente abertas por árvore. Esse material foi coletado na parte externa da

planta, ao redor de toda a copa, a uma altura de 1 a 2 m do solo, e avaliado de acordo com o manual

Descriptors for Citrus (IBPGR, 1999).

20

4.2.2 Árvore

Foram tomadas as medidas de altura das árvores e de diâmetro das copas (no sentido longitudinal à

linha de plantio), utilizando-se um banner com régua graduada. Também foram avaliados o formato

das copas e a presença de espinhos.

4.2.3 Folhas

As folhas coletadas foram aquelas de tamanho mediano, que visualmente compunham cerca de

80% das folhas da planta. As medições de comprimento, largura e espessura da lâmina foliar foram

feitas com o auxílio de um paquímetro digital. Outras variáveis também foram avaliadas: tipo da folha

(simples ou composta), formato da lâmina foliar, tipo de pecíolo (menor ou maior que a lâmina foliar,

ou ausente), tipo de margem, coloração da folha. A coloração das folhas foi avaliada visualmente e

definida segundo o manual Descriptors for Citrus (IBPGR, 1999). A presença ou a ausência de

fragrância também foi anotada.

4.3.4 Flores

As medidas de diâmetro do cálice, comprimento de pedicelo, comprimento e largura de pétalas

foram feitas com o auxílio de um paquímetro digital. Além disso, avaliou-se o comprimento das

anteras em relação ao estigma, o número de pétalas, a coloração das pétalas e das anteras, o tipo de

flor, e o arranjo das flores na planta (se florescem isoladamente ou em inflorescências). A coloração

das pétalas foi definida segundo Descriptors for Citrus (IBPGR, 1999). A presença ou a ausência de

fragrância também foram observadas.

4.2.5 Frutos e sementes

Os frutos foram coletados quando apresentaram, visualmente, coloração verde amarelado, pois

permanecem nessa coloração mesmo quando maduros. As medidas de altura e diâmetro dos frutos

foram feitas com o auxílio de um paquímetro, considerando-se a região equatorial do fruto para a

definição do diâmetro. Uma balança foi utilizada para a medição da massa dos frutos. Outras variáveis

ainda foram avaliadas, a saber: forma do fruto, formato da base, formato do ápice, textura da casca,

localização dos frutos na copa, a presença ou a ausência de fragrância na base do IBPGR.

21

Foi realizada a abertura transversal do fruto com um bisturi, fez-se a extração individual de

todas as sementes, contadas e classificadas em cheias ou murchas. Foram observadas também as

seguintes características: forma, superfície e cor das sementes. Algumas características da polpa, como

textura e cor também foram anotadas.

A determinação do número médio de embriões por semente foi efetuada através do exame de

100 sementes cheias. Pelo método direto, com o auxílio de pinça e bisturi e sob lupa, a casca e o

tegmento das sementes foram retirados e procedeu-se a separação e a contagem dos embriões.

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.3.1 Árvore

O híbrido (LCR x CTYM - 005) x MCP – 011 é uma planta de altura média de 250 cm aos 4

anos, com aproximadamente 200 cm de diâmetro de copa (Figura 1). Seu parental feminino (LCR X

CTYM- 005) apresenta em média 280 cm de altura. Já o parental masculino, M. papuana, segundo

Santos (2015) apresenta porte baixo, com aproximadamente 140 cm de altura. A copa é

consideravelmente densa e apresenta forma elipsoide, com presença de espinhos vigorosos, semelhante

ao parental masculino.

Segundo Santos (2015), o híbrido (LCR x CTYM - 005) x MCP – 011 foi caracterizado como

resistente ao vírus-da-tristeza-dos-citros, uma vez que o teste de ELISA foi negativo e as plantas não

apresentaram caneluras. A resistência ao vírus-da-tristeza-dos-citros é uma das importantes

características observadas pelos programas de melhoramento genético para seleção de potenciais porta-

enxertos (SCHAFER et al., 2001).

22

Figura 1 - Planta de origem híbrida [(Limoeiro ‘Cravo’

(LCR) x Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus

papuana (MCP) – 011] localizada no BAG de Citros da

EMBRAPA Mandioca e Fruticultura em Cruz das Almas-

BA, com aproximadamente quatro anos.

4.3.2 Folhas

Esse híbrido apresenta ciclo de vida vegetativa perene. Suas folhas (Figura 2) apresentam

coloração verde escura sem diversidade de cores. A forma da lâmina da folha é lanciolada e margem

dentada, com ápice agudo e base aguda e atenuada. Além disso, a folha é desprovida de pelos em

ambas as faces, a divisão da folha é simples, apresentado o limbo único e contínuo, não dividido em

lâminas menores, como as de seu parental masculino. O parental feminino LCR x CTYM - 005

apresenta a maioria das folhas simples, e algumas trifolioladas, todas de coloração verde escuro sem

diversidade de cores.

As médias do comprimento, da largura da lâmina e da espessura da folha do híbrido [(LCR x

CTYM – 005) x MCP – 011] são mostradas na Tabela 1.

23

Figura 2 – Folha da planta de origem híbrida [(Limoeiro ‘Cravo’

(LCR) x Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus


EMBRAPA Mandioca e Fruticultura em Cruz das Almas-BA.

Tabela 1 – Medidas da folha do híbrido [(Limoeiro ‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro

‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus papuana (MCP) – 011] em milímetros

Medidas Média em milímetros (mm)*

Comprimento da folha 31,5 ± 2,63

Largura da lâmina da folha 12,7 ± 1,70

Espessura da folha 0,31 ± 0,02

*Média ± desvio-padrão.

4.3.3 Flores

As flores e os botões florais do híbrido (Figura 3) em estudo são de cor branca e perfumadas,

assim como as de seus parentais. As anteras são amarelas e o seu comprimento é mais curto em relação

ao estigma. A média do número de pétalas por flor é de cinco. E a média do número de estames foi de

25. A flor é hermafrodita e ovário súbero. As médias do comprimento do pedicelo, do diâmetro do

cálice, do comprimento e largura da pétala são mostradas na Tabela 2.

Figura 3 – Botões florais em três diferentes estágios de

desenvolvimento e flor da planta de origem híbrida [(Limoeiro

‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus


EMBRAPA Mandioca e Fruticultura em Cruz das Almas-BA.

24

Tabela 2 – Medidas das partes da flor do híbrido [(Limoeiro ‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro

‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus papuana (MCP) – 011] em milímetros


Comprimento do pedicelo 1,3 ± 0,41

Diâmetro do cálice 5 ± 0,33

Comprimento da pétala 11 ± 0,73

Largura da pétala 4,4 ± 0,49


O híbrido em estudo apresenta período juvenil muito curto de aproximadamente um ano. Tem-

se observado plântulas desse genótipo florescendo a partir do segundo mês de cultivo (Figura 4) e

plantas adultas podendo florescer em várias épocas num mesmo ano, independentemente de estímulos

ambientais, sempre em novos ramos desenvolvidos. Além disso, esse híbrido apresenta ao mesmo

tempo flores e frutos durante todo o ano (Figura 5).

Figura 4 – Plantas de origem híbrida [(Limoeiro ‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) –

005) x Microcitrus papuana (MCP) – 011] proveniente de sementes em diferentes estágios de

desenvolvimento, com florescimento precoce. A= Planta em tubete com substrato de sementeira

com aproximadamente dois meses de cultivo. B= Planta em saco de 2 kg com substrato de

pinhos com aproximadamente quatro meses de cultivo. C= Planta em tubete com substrato de

sementeira com aproximadamente quatro meses de cultivo. D= Planta em saco de 2 kg com

substrato de pinhos com aproximadamente quatro meses de cultivo. E= Planta em vaso de 30 kg

com substrato de pinhos e casca de coco com aproximadamente seis meses de cultivo.

A B C D E

25

Figura 5 - Planta de origem híbrida [(Limoeiro

‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) –

005) x Microcitrus papuana (MCP) – 011]

localizada no BAG da EMBRAPA Mandioca e

Fruticultura em Cruz das Almas-BA, com flor e

fruto ao mesmo tempo

Essas características não são compartilhadas com seus parentais e são encontradas em poucas

variedades de citros, como é o caso do cultivar “x11”, um mutante espontâneo de laranjeira 'Tobias'

que é cultivado no Banco de Germoplasma do 'Centro de Citricultura Sylvio Moreira' Citrus,

Cordeirópolis, São Paulo, Brasil. Mudas de 'x11' apresentam floração precoce de aproximadamente

dois anos e floresce várias vezes em todas as estações, sem a necessidade de estímulos ambientais,

com exceção de poda, que estimula a produção de novos brotos (PINHEIRO et al., 2014).

Outras culturas apresentam cultivares com características semelhantes, o Longan, 'sijimi'

proveniente da China e do Vietnã, que tem uma fase juvenil mais curto em comparação com outras

cultivares e apresenta florescimento contínuo. Esta cultivar produz flores e frutos durante todo o ano,

tanto em condições tropicais e subtropicais, com nenhuma exigência de controle ambiental (JIA et al.,

2014).

4.3.4 Frutos e sementes

O fruto (Figura 6) apresenta formato esferóide, com a forma do ápice convexo e da base

truncar, que lembra os de seu parental feminino. Já o parental masculino (M. papuana) apresenta

minifrutos alongados e com textura rugosa (SANTOS, 2015). Quando maduro, o fruto do híbrido

apresenta coloração verde amarelado e superfície suave. São bastante atrativos, principalmente por

apresentarem uma fragrância perfumada e serem produzidos em grande quantidade durante todo o ano.

26

Essas características podem ser exploradas para a produção de óleos essenciais, bem como para

interesse ornamental.

Figura 5 – Fruto da planta de origem híbrida

[(Limoeiro ‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro

‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus papuana

(MCP) – 011] localizada no BAG de Citros da

EMBRAPA Mandioca e Fruticultura em Cruz das

Almas-BA.

Em relação ao potencial ornamental, Santos (2015) observou que a existência de espinhos

associada ao adensamento da copa torna essa planta potencial para o uso como cerca-viva. As

características de flores bonitas e perfumadas, frutos bastante atrativos e principalmente por serem

produzidos em grande quantidade durante todo o ano, conferem a essa planta atributos que a

qualificam para uso em vaso e em paisagismo. O florescimento precoce é outra característica de

extrema importância, pois a produção de flores e frutos torna uma planta ornamental mais atrativa.

O uso dos citros [Citrus (L.) e gêneros afins] em paisagismo é antigo, porém restrito no Brasil e

se resume à indicação de poucos profissionais. Nos Estados Unidos, Japão e Itália, entre outros países

europeus, a utilização dos citros em projetos paisagísticos é comum e vem ganhando cada vez mais

popularidade, por serem plantas atrativas do ponto de vista ornamental e alimentício (MAZZINI,

2010).

A média do peso do fruto do híbrido (LCR x CTYM - 005) x MCP – 011 é 15,39 g e o seu

parental feminino apresenta fruto com média de peso de 65,5 g. As médias do diâmetro e do

comprimento do fruto do híbrido em estudo e de seus parentais são mostradas na Tabela 3.

27

Tabela 3 – Medidas do fruto do híbrido [(Limoeiro ‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus

papuana (MCP) – 011] e de seus parentais em milímetros


HÍDRIDO PARENTAL FEMININO PARENTAL MASCULINO

Diâmetro do fruto 28,9 ± 2,71 38 ± 0,10 19 ± 0,08

Comprimento do fruto 32 ± 3,62 41± 0,25 54,5 ± 0,38


A polpa do fruto é firme e seca, apresenta coloração verde claro uniforme e fragrância

perfumada. Os frutos apresentam em média 10 sementes viáveis. As sementes apresentam forma

esferóide e tamanho médio de 6,74 mm. A superfície é suave, com muita mucilagem. A cor da

semente é branco amarelado e o cotilédone é branco.

Com base nas observações e contagem dos embriões, as sementes apresentam de um a cinco

embriões e 50% de poliembrionia. Esse resultado corrobora com as observações visuais no plantio e

análise molecular realizada por meio de marcadores microssatélite (SSRs), onde de 300 indivíduos

analisados, 132 foram caracterizados como indivíduos nucelares e 168 como indivíduos zigóticos.

Dessa forma, pode-se afirmar que esse híbrido apresenta aproximadamente 50% de poliembrionia

nessas condições de cultivo, visto que, a poliembrionia pode se alterada em função das condições de

cultivo, principalmente pela temperatura (PASSOS et al., 2006).

A presença de vários embriões na mesma semente pode dificultar a sobrevivência dos embriões

zigóticos, devido à competição entre embrião sexual e nucelares por nutrientes, contribuindo assim

para manter a uniformidades das plantas e permitindo a obtenção de plantas semelhantes à planta-

matriz (RAMOS et al., 2006).

De acordo com Passos et al. (2006), quanto mais elevada a taxa de poliembrionia nas sementes,

maiores são as chances de o porta-enxerto, quando propagado, resultar em plântulas de origem nucelar,

semelhantes à cultivar-mãe, garantindo assim a mesma constituição genética e favorecendo a

homogeneidade dos pomares. Plantas que possuem grande potencial como plantas doadoras de

sementes para porta-enxertos, são aquelas que tem boa produção de sementes/fruto, grande número de

embriões por semente e alta taxa de poliembrionia, sendo recomendados para a diversificação dos

pomares de citros caso sejam considerados bons porta-enxertos.

28

4.4 CONCLUSÕES

A avaliação das características morfológicas indica que o híbrido [(LCR x CTYM – 005) x

MCP – 011] apresenta características diferenciadas, principalmente relacionadas à floração. Algumas

mudas floresceram a partir do segundo mês de cultivo, e plantas adultas apresentam flores e frutos de

forma simultânea durante todo o ano. Com base nas observações e contagem dos embriões, foi

possível observar que o híbrido apresenta 50% de poliembrionia.

Dessa forma, o híbrido [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011] caracteriza-se como um

candidato promissor para utilização no melhoramento genético de citros, como objeto de estudo para o

desenvolvimento de vários trabalhos relacionados à redução período juvenil, florescimento e

escalonamento de produção.

4.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS



1968. p.325-370.

CHUTIA, M. et al. Antifungal activity and chemical composition of Citrus reticulata Blanco essential

oil against phytopathogens from North East India. LWT-Food Science and Techonology, Zurich,

2009. p. 777-780.

IBPGR - International Board for Plant Genetic Resources Institute. Descriptors for Citrus. Rome:

IBPGR, 1999. 66p.

JIA, T. et al. Identification of Regulatory Genes Implicated in Continuous Flowering of Longan

(Dimocarpus longan L.). Plos one, 2014.

KIRBASLAR, F. G. et al. Antimicrobial activity of Turkish Citrus peel oils. Pakistan Journal of

Botany, Karachi, 2009. p. 3207-3212.

MACHADO, M.A. et al. Genética, melhoramento e biotecnologia de citros. In: MATTOS JUNIOR,

D. de et al. (Ed.). Citros. Campinas: IAC: FUNDAG, 2005. p. 221-277.

MAZZINI, R. B.; PIO, R. M. Caracterização morfológica de seis variedades cítricas com potencial

ornamental. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, 2010. p. 463-470.

NEVES, M.F. et al. (Org.). O Retrato da Citricultura Brasileira. Ribeirão Preto: CitrusBR, 2010.

p.137.

29

PASSOS, O. S. et al. Caracterização de híbridos de Poncirus trifoliata e de outros porta-enxertos de

citros no Estado da Bahia. Revista Brasileira de Fruticultura, 2006. p.410-413.

PINHEIRO, T. T. et al. Early-flowering sweet orange mutant ‘x11’ as a model for functional genomic

studies of Citrus. BMC Research Notes, 2014. 511p.

RAMOS, J.D. et al. Poliembrionia e caracterização de frutos de citrumelo ‘Swingle’ e de Poncirus

trifoliata. Ciência e Agrotecnologia, 2006. p. 88-91.

REHMAN, S-U. et al. Inhibitory effect of Citrus peel essential oils on the microbial growth of bread.

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SANTOS, A. R. A. et al. Genetic variation of Citrus and related genera with ornamental potential.

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SOUZA, L. D.; LINS, O. B. S. M. O.; ACCIOLY, A. M. A. Diagnóstico rápido participativo do

meio ambiente do Centro Nacional de Pesquisa de Mandioca e Fruticultura Tropical. Cruz das

Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, 2009, 40p. (Documentos 177).

SOUZA, L. S.; SOUZA, L. D. Caracterização físico-hídrica de solos da área do Centro Nacional

de Pesquisa de Mandioca e Fruticultura Tropical. Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e

Fruticultura Tropical, 2001, 56p. (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 20).

SPIEGEL-ROY, P.; GOLDSCHMIDT, E.E. Biology of citrus. 2.ed. Cambridge: University, 2008.

230p.

30

CAPÍTULO II: Estudo molecular do gene FLOWERING LOCUS T (FT) em planta de origem

híbrida de citros com florescimento precoce

31

RESUMO

As plantas de citros são amplamente cultivadas no Brasil e economicamente importante no

mercado nacional e internacional. Assim, como todas as plantas perenes, os citros apresentam um

longo período juvenil. Durante esse período, a planta é incapaz de iniciar a floração. Portanto, o

encurtamento da fase juvenil e a regulação do tempo de floração em citros são importantes para

acelerar os esforços do melhoramento genéticos dessas plantas. Este trabalho tem como objetivo

estudar a expressão do gene FLOWERING LOCUS T (FT) relacionado à floração no híbrido [(LCR x

CTYM – 005) x MCP – 011], selecionado pela EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, Cruz das Almas

– Bahia, que apresenta período juvenil curto. Clones nucelares do híbrido [(LCR x CTYM – 005) x

MCP – 011] foram selecionados por meio de marcadores moleculares. Os resultados demonstram que

o híbrido apresenta aproximadamente 50% de poliembrionia. Dentre as 170 plantas selecionadas

visualmente, 13 apresentaram florescimento precoce, a partir do segundo mês de cultivo. Destas, seis

foram comprovados como clones nucelares da planta matriz. Após essa análise, 18 plantas foram

selecionadas para estudo de expressão gênica de genes relacionados à floração em citros. Por meio de

análises de sequências, foram selecionados os seguintes genes candidatos: BAM, FT, TFL e WUS. A

metodologia utilizada para alcançar o objetivo foi primeiramente realizar a semeadura das plantas do

híbrido. Após a emergência e crescimento inicial, os clones nucelares mais vigorosos foram

selecionados visualmente e por meio de Marcadores Microssatélite. Foram selecionadas 18 plantas

para o estudo da expressão gênica. Logo, ocorreu a seleção dos genes candidatos para o estudo, que

foram AP1, AP2, BAM, ELF4, LFY, FLC, FT, SOC1 , TFL e WUS. A partir de analises de sequências

de citros disponíveis em bancos de dados foi realizado o desenho de primers. Posteriormente foi

realizada a amplificação por meio da técnica de PCR e o sequenciamento dos genes BAM, FT, TFL e

WUS. A partir das sequências obtidas foram desenhados os primers para o qPCR. Os resultados

sugerem que o híbrido [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011] apresenta aproximadamente 50% de

poliembrionia. Dentre as 170 plantas selecionadas visualmente, 13 apresentaram florescimento

precoce, a partir do segundo mês de cultivo. Destas, seis foram comprovados como clones nucelares da

planta matriz. A análise da expressão gênica demonstrou que houve influência do período do inverno

na expressão do gene FT entre as duas partes analisadas da planta, caule e folha. É possível ainda

inferir por meio da análise que houve diferença significativa na expressão de FT entre os dois períodos

avaliados para folha. Em relação à expressão do gene FT no caule, foi possível observar que não houve

diferença significativa nos dois períodos avaliados. A expressão de FT na gema no verão foi

significativa, demonstrando uma menor expressão quando comparada com folha e o caule. A partir

32

desse trabalho, surge possibilidade de novas pesquisas em relação ao estudo da via gênica de floração

em citros e o desenvolvimento de técnicas para reduzir o período juvenil com a utilização dessa planta.

Palavras-chave: Expressão gênica, PCR em tempo real e floração.

33

ABSTRACT

Citrus plants are widely cultivated in Brazil and economically important in the national and

international markets. Thus, like all perennial plants, citrus have a long juvenile period. During this

period, the plant is unable to start flowering. Therefore, shortening the juvenile phase and regulating

flowering time in citrus are important to accelerate the breeding efforts of these plants. The objective

of this work was to study the expression of the FLOWERING LOCUS T (FT) gene related to

flowering in the hybrid [(LCR x CTYM - 005) x MCP - 011], selected by EMBRAPA Cassava and

Fruticulture, Cruz das Almas - Bahia, Short juvenile period. Clones of the hybrid [(LCR x CTYM -

005) x MCP - 011] were selected by means of molecular markers. The results demonstrate that the

hybrid shows approximately 50% polyembryony. Among the 170 plants selected visually, 13 showed

early flowering, from the second month of cultivation. Of these, six were proven as nucellar clones of

the parent plant. After this analysis, 18 plants were selected to study the gene expression of genes

related to flowering in citrus. By means of sequence analyzes, the following candidate genes were

selected: BAM, FT, TFL and WUS. The methodology used to reach the objective was to first sow the

plants of the hybrid. After emergence and initial growth, the most vigorous nucellar clones were

selected visually and by means of SSR. Eighteen plants were selected for the study of gene expression.

Therefore, the selection of the candidate genes for the study were AP1, AP2, BAM, ELF4, LFY, FLC,

FT, SOC1, TFL and WUS. From the analyzes of citrus sequences available in databases, the design of

primers was carried out. Afterwards, the amplification was performed by means of the PCR technique

and the sequencing of BAM, FT, TFL and WUS genes. From the sequences obtained the primers were

designed for qPCR. The results suggest that the hybrid [(LCR x CTYM - 005) x MCP - 011] shows

approximately 50% polyembryony. Among the 170 plants selected visually, 13 showed early

flowering, from the second month of cultivation. Of these, six were proven as nucellar clones of the

parent plant. Analysis of the gene expression showed that there was influence of the winter period on

the expression of the FT gene between the analyzed parts of the plant, stem and leaf. It is possible to

infer from the analysis that there was a significant difference in FT expression between the two periods

evaluated for leaf. Regarding the expression of the FT gene in the stem, it was possible to observe that

there was no significant difference in the two evaluated periods. FT expression in the yolk in summer

was significant, demonstrating a lower expression when compared to leaf and stem. From this work,

there is a possibility of new research in relation to the study of the gene flow pathway in citrus and the

development of techniques to reduce the juvenile period with the use of this plant.

Keywords: gene expression, real-time PCR and flowering.

34

5.1 INTRODUÇÃO

As plantas perenes passam por diferentes fases de desenvolvimento: a fase juvenil, a fase adulta

vegetativa e a fase adulta reprodutiva. O período juvenil é definido como o momento que antecede a

capacidade de formação das estruturas reprodutivas. Nesse período, a planta é incapaz de iniciar a

floração independentemente de receber estímulos que induzem a flor em plantas maduras (HA, 2014).

A duração do período juvenil em plantas perenes é longo, como pode ser vista em citros, que pode

durar em média de dois a 12 anos (ENDO et al., 2005; MATSOUKAS et al., 2012; MACHADO et al.,

2005).

As plantas de citros são amplamente cultivadas no Brasil e economicamente importante no

mercado nacional e internacional. Portanto, o encurtamento da fase juvenil e a regulação do tempo de

floração em citros são importantes para acelerar os esforços do melhoramento genéticos dessas plantas.

Nesse sentido, a Embrapa Mandioca e Fruticultura selecionou o híbrido [(Limoeiro ‘Cravo’ (LCR) x

Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus papuana (MCP) – 011] que apresenta período

juvenil muito curto de aproximadamente um ano, que pode ser utilizado em pesquisas relacionadas ao

florescimento e redução de período juvenil em citros.

Muitos estudos têm demonstrado que o processo de floração em plantas é controlado não só

pela regulação de múltiplos genes, por fatores endógenos, mas também por vários sinais ambientais

(TAN; SWAIN, 2006). Ambos os fatores controlam uma rede genética complexa, que integra esses

sinais diferentes e converge para ativar a expressão de um conjunto de genes que desencadeiam e

controlam a morfogênese floral (SONG et al., 2013; TAN; SWAIN, 2006).

Estudos moleculares com Arabidopsis têm identificado e caracterizado muitos genes

envolvidos na rede que controla o florescimento, e os fatores que interferem essa rede genética

(SIMPSON; DEAN, 2002; ZIK; IRISH, 2003; WELLMER; RIECHMANN, 2010; AMASINO, 2010).

Em citros, ortólogos para os genes relacionados à floração têm sido isolados e caracterizados com

sucesso, incluindo o LEAFY (LFY) e APETALA1 (AP1) (PILLITTERI et al., 2004b), FLOWERING

LOCUS T (FT) (NISHIKAWA, et al., 2007, 2009, ENDO, et al., 2005), FLOWERING LOCUS C

(FLC), BARELY ANY MERITED (BAM); (ZHANG et al., 2009a,b); TERMINAL FLOWER1 (TFL1)

(PILLITTERI; LOVATT; WALLING, 2004), SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) (LI et al., 2010);

SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1 (SOC1 ) e WUSCHEL (WUS) (TAN; SWAIN, 2007).

Nos últimos anos, o gene FLOWERING LOCUS T (FT) tem sido o mais estudado e eficaz na

promoção da floração precoce em plantas (MOURADOV et al., 2002; KOMED, 2004;

35

LEMMETYINEN et al., 2004). Estudos indicam que o gene FT pode reduzir a juvenilidade em

algumas culturas, como a Arabidopsis, álamo, citros, arroz e tomate (NAKATSUKA et al., 2009; HSU

et al., 2006; KOJIMA et al., 2002; ENDO et al., 2005; LIFSCHITZ et al., 2006; BOHLENINUS et al.,

2006).

Nesse sentido, o objetivo deste trabalho é estudar a expressão do gene FT relacionado a

redução do período juvenil no híbrido [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011], que apresenta período

juvenil curto.

5.2 MATERIAL E MÉTODO

5.2.1 Obtenção do material vegetal

O estudo foi realizado em condições de casa de vegetação na EMBRAPA Mandioca e

Fruticultura em Cruz das Almas - Bahia. O híbrido [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011] selecionado

pelo Programa de Melhoramento Genético dos Citros da EMBRAPA foi utilizado para realização dos

experimentos.

A semeadura das plantas do híbrido foi efetuada em tubetes plásticos de 75 ml, contendo

substrato a base de casca de pinos decomposta, a uma profundidade de 1,5 cm. Os tubetes foram

suspensos em bancada de tela metálica com 1,2 m de altura. Uma semente foi usada por tubete. Após a

emergência e crescimento inicial, cerca de 60 dias após a semeadura, os clones nucelares mais

vigorosos foram selecionados visualmente, realizando o descarte das demais plantas.

Com cerca de 20 cm da altura, ou seja, com aproximadamente quatro meses de cultivo, as

plantas do híbrido foram transplantados para sacos plásticos (1,5 kg), dispostos sobre tijolos a 10 cm

do solo. O substrato utilizado foi casca de pinos decomposta. A adubação foi realizada pela aplicação

do fertilizante Osmocote® e ureia, em cobertura logo após a transplantação. A irrigação foi realizada

manual de três a cinco vezes na semana, conforme monitoramento das condições meteorológicas e de

umidade do substrato.

5.2.2 Extração do DNA

O DNA genômico foi extraído de folhas dos indivíduos de origem híbrida [(LCR x CTYM –

005) x MCP – 011] de acordo com a metodologia descrita por Murray e Thompson (1980).

36

O DNA obtido foi dissolvido em tampão TE (10mM Tris HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA), e

conservado a -20°C. A quantificação do DNA foi realizada por meio do uso do DNA ʎ em três

diferentes concentrações de 100, 200 e 300 ng/μL. As amostras de DNAs foram submetidas a

eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio 1 μg/mL em tampão TAE, a 100V

durante 25 minutos.

5.2.3 Marcadores microssatélite para a confirmação dos clones nucelares

As amostras de DNAs foram diluídas para a concentração de 5 ng/ µL. Marcadores

microssatélites foram amplificados a partir dos seguintes pares de primers: miCrCIR01E02,

Ci06A05b, CMS14, TAA4S, CMS26 (FROELICHER et al., 2008; CRISTOFANI-YALY et al., 2011;

YONG et al., 2006) (Tabela 1). As reações de amplificação foram preparadas para volume final de 25

µL contendo 5,0 ng/µL de DNA, 1,0 U de Taq DNA polimerase, tampão 10X (500 mMKCl, 100 mM

Tris-HCl, pH 8 Invitrogen), MgCl2 1,0 mM, dNTP (0,2 mM) e 0,2 µM de cada primer. As reações de

amplificação aconteceram em termocicladores “Veriti® Thermal Cycler” de acordo com a seguinte

programação 35 ciclos de 94°C por 30s, 52°C por 30s e 72°C por 45s. A temperatura de anelamento

foi de 65°C, decrescendo até 0,3°C a cada ciclo seguido por três ciclos de anelamento a 56°C. Os

produtos da PCR foram visualizados em gel de agarose 3% corado com brometo de etidio (0,5 ng/ml).

O registro fotográfico foi realizado em fotodocumentador.

Tabela 1 – Primers microssatélites utilizados para identificar plantas nucelares e zigóticas

PRIMERS SEQUÊNCIAS

CrCIR01E02 F: TGAATGGTACGGGAAATGC

R: CAGGGTCGGTGGAGAGGAT

Ci06A05b F: TCTCTGGTTGGTTTTTGTGA

R: ATGATGAAAAGCAAGGGG

CMS14 F: GGCTTCTCTTCTACTAGAACGG

R: ACGCCACGTAAGCAATAACC

TAA45 F: GCACCTTTTATACCTGACTCGG

R: TTCAGCATTTGAGTTGGTTACG

CMS26 F: TGATGTCTTGATCCACACTTCC

R: ACTCAAAGCTCCGCTACAGTG

37

5.2.4 Desenho e otimização de primers para sequenciamento dos genes AP1, AP2, BAM, ELF4,

LFY, FLC, FT, SOC1 , TFL e WUS

A partir das análises das sequências de Citrus sinensis e Citrus clementina disponíveis em

bancos de dados disponíveis na internet (National Center for Biotechnology Information - NCBI e

Phytozome v.9.1), foi realizado o desenho dos primers para o sequenciamento dos fragmentos dos

genes APETALA1 (AP1), APETALA2 (AP2), BARELY ANY MERISTEM (BAM), EARLY

FLOWERING 4 (ELF4), LEAFY (LFY), FLOWERING LOCUS C (FLC), FLOWERING LOCUS T

(FT), SUPPRESSOR OF CONSTANS1 (SOC1 1), FLOWER TERMINAL (TFL) e WUSCHEL (WUS).

Posteriormente, foi realizado o alinhamento das sequências referentes a cada gene por meio do

programa ClustalW2. As ORFs das sequências dos genes foram obtidas com o uso do programa ORF

Finder (Open Reading Frame Finder), e as sequências iniciadoras forward e reverse dos primers foram

desenhados em regiões anteriores e posteriores as ORFs, respectivamente. O conteúdo de GC e a

temperatura de melting das sequencias iniciadoras foram analisados no programa Integrated DNA

Technologies.

Os primers (Tabela 2) foram otimizados por meio da PCR convencional. Foi utilizado o DNA

genômico dos indivíduos do híbrido ([(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011]). As condições de

termociclagem foram: 94°C por 2 min, seguido de 15 ciclos de 94°C por 2 min, 65°C por 30 s, 72°C

por 1 min, 35 ciclos de 94°C por 30 s, 48°C por 30 s, 72°C por 1 min e uma extensão final de 72°C por

10 min. As reações foram preparadas em um volume total de 25 μL contendo 5,0 ng/µL de DNA, 1,0

U de Taq DNA polimerase, tampão 10X (500 mMKCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8 Invitrogen), MgCl2

5,0 mM, dNTP (0,2 mM) e 0,5 µM de cada primer. Posteriormente, os produtos da PCR dos genes

BAM, FT, TFL e WUS foram submetidos ao sequenciamento pelo método de Sanger, 1977.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

38

Tabela 2. Sequências dos primers forward e reverse dos genes APETALA1 (AP1), APETALA2 (AP2), BARELY ANY MERITED

(BAM), EARLY FLOWERING 4 (ELF4), LEAFY (LFY), FLOWERING LOCUS C (FLC), FLOWERING LOCUS T (FT),

SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1 (SOC1), TERMINAL FLOWER (TFL), WUSCHEL (WUS).

Gene

Sequência forward

Sequência reverse

AP1 5’CAATGGGAAGAGGTAGGGTTC 3’ 5’CATCCAGCAAAGCATCCAAG 3’

AP2 5’ATGGAAGAAGATGCATCAAGC 3’ 5’TCAATTAATCTGTACACCA3’

BAM

BAM SQ3 - 5’AGCGGCAGGCACTTTACG 3’ BAM SQ3 -5’AGTGGGTGATGCCCATCTCG 3’

BAM SQ2 -5' GAGGCCTGACACAAGATTAACC 3' BAM SQ2 5´CCATCGATTGCTGCCATCTCC -3'

BAM SQ1 - 5’ CAGAGAGAGAGGCCTGCTATG 3’ BAM SQ1 5’ CAGCTTCTCTCATCTCCCG 3’

ELF4 V2 F - 5’ CGACATGTATGGGTCTGAG 3´ V2 - 5’ ATGGTCTTGGTTACATGGC 3’

V3 F - 5’ TAAGAAAGCATGTGCCG 3’ V3 5’ CACTTCACCACATAGCTACC 3’

LFY 5’ ATGGACCCGGAAGCT TTC 3´ 5’ CAGTATGGCTTCAAAATGACG 3’

FLC 5´ CAGCACCAGAACCTGCG 3´ 5´ CTTCCTACAATGCCGACAG 3´

FT 5´ GGCTGCTTCAGTTGATCC 3´ 5´ CGAGACAGTACACTTGCGG 3´

SOC1 5´GTCTGAATTAAGATGGTGAGAGGC 3´ 5´ GCT TGCGCAAGTGTAATTTG 3´

TFL 5’ATGTTAGAACCTCTCGCTGTTGG3’ 5’CAGCGTCTTCTGGCAGCAG3’

WUS 5´TGGAACCTCAACAACAGC 3´ 5´TGG TAACAGGTCCATATC C 3´

5.2.5 Extração de RNA

O RNA total foi extraído de amostras de folhas, gemas e caules, de dois grupos de plantas: (i)

nucelares confirmadas pelo microssatélite apresentando floração precoce e (ii) com nove meses de

cultivo e que não floresceram. As amostras foram coletadas em dois tempos: inverno (14/agosto/2015)

e verão (02/fevereiro/2016), imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em

ultrafreezer -80 ºC.

A extração do RNA total das amostras foi realizado a partir de 75 mg de material vegetal,

macerado com nitrogênio líquido, usando o RNAqueous® Kit (Applied Biosystems, Ambion) seguindo

as recomendações do fabricante. A qualidade do RNA foi verificada em eletroforese com gel de

agarose 1% (p/v) em tampão TAE 1x (Tris Base 0,04 M, ácido acético glacial 1M, EDTA 50 mM) a 3

Vcm-1.

O RNA total foi tratado com DNAse, TURBO DNA-freeTM DNase Tratment- Ambion®,

utilizando 15 μl do RNA total de cada amostra. Para verificar a pureza e quantificação do RNA, 3 μl

de RNA tratado de cada amostra foram aplicados em gel de agarose a 0,8% (p/v), em tampão TAE

corado com brometo de etídio e a quantificação conduzida no espectrofotômetro Nanodrop ND-2000

(Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA).

39

5.2.6 Síntese de cDNA

A síntese de cDNA foi realizada com 9 μl (20 ng/μl) do RNA tratado, utilizando-se o kit (High

Capacity RNA-to-cDNA (Applied biosystems), seguindo as especificações do fabricante. Os cDNAs

foram quantificados em espectrofotômetro Nanodrop ND-2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA,

EUA) e armazenados em -80 ºC.

5.2.7 Desenho e otimização dos primers para o estudo da expressão gênica

As sequências obtidas dos genes BAM, FT, TFL e WUS do sequenciamento de Sanger, foram

utilizadas para desenhar primers específicos (Tabela 3) que foram utilizados na avaliação por qPCR do

perfil de expressão do híbrido [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011]. Programas como ClustalW2,

ORF Finder e Integrated DNA Technologies foram utilizados na analise das sequências e construção

dos primers, respectivamente. Os parâmetros analisados foram: tamanho do primers, temperatura de

melting e porcentagem de bases GC.

Tabela 3. Primers forward e reverse específicos que foram utilizados na avaliação por qPCR.

Genes Sequência (5'-3')

TFL Forward: 5’-CTAATGCCGATTCAACCCAATG-3’

Reverse: 5’-ATCAGGTGTCACGGATACAAG-3’

FT Forward: 5’-ACCCATGAGAATTATCCCACC-3’

Reverse: 5’-CAGAGAATCCACGGAGTGTTC-3’

BAMSQ3 Forward: 5’-CCGCAATGGACCCTAAATG-3’

Reverse: 5’-CCCCTGCGTTTATCCTATGG-3’

BAMSQ2 Forward: 5’-AGAAAACTCGAGACTGGAACG-3’

Reverse: 5’-TCTTCATCCTTGCATTCACCG-3’

WUS Forward: 5’-AATCGTAAGCTAGTGGCGG-3’

Reverse: 5’-GAATTTGTTCGGCAGTTGGG-3’

GAPC2* Forward: 5’-TCTTGCCTGCTTTGAATGGA-3’

Reverse: 5’-TGTGAGGTCAACCACTGCGACAT-3’

25S* Forward: 5’-ACATTGTCAGGTGGGGAGTT-3’

Reverse: 5’-CCTTTTGTTCCACACGAGATT-3’

*Genes de referência

Para validação dos cDNAs e otimização dos primers foi realizado uma PCR convencional para

todas as amostras de cDNA, confeccionou-se um mix para reação final de 20 μl, contendo 7,2 μl de

H2O Mili-Q autoclavada; 2 μl de tampão 10x; 0,2 μl de Taq DNA Polimerase 5 U/μl; 2 μl de cada

primer (forward e reverse) (2 μM); 1,6 de MgCl2 (25 mM); 2 μl de dNTPs (2,5 mM) e 1 μl de cDNA

40

(10 ng/μl). As condições de termociclagem foram: 94°C por 5 minutos, seguido de 35 ciclos de

desnaturação a 94°C por 30 s, 58ºC por 30 s, 72ºC por 45 s e uma extensão final de 72°C por 5 min.

Para controle negativo, 1 μl de água ultrapura autoclavada ao invés do cDNA. Em relação ao

controle positivo, foi utilizado 1 μl de DNA (10 ng/μl) oriundo do híbrido [(LCR x CTYM – 005) x

MCP – 011]. O produto das amplificações foram verificados em gel de agarose 1% em tampão TAE

1x corado com brometo de etídio.

5.2.8 Eficiência dos primers e amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR)

As análises de RT-qPCR foram realizadas no equipamento ABI 7500 Fast Real-Time PCR

System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A amplificação do gene alvo foi realizada a

partir do cDNA total, utilizando a metodologia SYBR Green, o qual tem a capacidade de intercalar

fitas duplas de DNA, emitindo fluorescência durante a ligação. Como genes de referência, foram

utilizados, o gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase C2 (GAPC2) (MAFRA et al., 2012) e o 25 S

(PODIVIM et al, 2012).

A eficiência de amplificação dos primers foi verificada por meio da obtenção da curva padrão

com diluições seriadas na proporção 1/5. Cada diluição para o ponto da curva padrão foi realizado em

triplicata. Os primers que apresentaram eficiência entre 80 e 100% e apenas um produto de

amplificação, foi selecionado para os ensaios com os cDNAs.

As reações de amplificação foram realizadas no volume final de 10 mL, contendo 6,0 μL do

Power SYBR® Green Master Mix; 0,6 μL de cada primer (10 μM); 2,0 μL de amostra do cDNA

estoque (100 ng/μL) e 0,8 μL de H2O livre de nucleases. Reações como controle negativo foram

realizadas utilizando H2O livre de nucleases como amostra. As amplificações foram conduzidas em

incubações de 95 ºC por 2 min, seguidas de 40 ciclos de 94 ºC por 45 s, 60 ºC por 45 s e 72 ºC por 1

min, com detecção do sinal da fluorescência ao final de cada etapa de extensão. Por fim a curva de

dissociação foi realizada para todas as amostras.

A quantificação relativa foi utilizada para determinar a expressão dos genes alvo, por meio do

método 2-ΔΔCT (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).

A análise estatística da expressão dos genes em diferentes tempos foi realizada por meio da

comparação das médias usando o teste de Tukey no SISVAR. Em todos os casos a significância foi

avaliada a P< 0.05.

41

5.3 RESULTADO E DISCUSSÃO

5.3.1 Confirmação dos clones nucelares

Foram obtidas 300 plantas por meio da semeadura, que foram avaliadas em relação a sua

origem nucelar. Em Citrus observa-se a apomixia facultativa, quando em uma mesma semente podem

ser encontrados vários embriões, com coexistência de zigóticos e nucelares. As linhagens nucelares

são importantes por serem geneticamente idênticas à planta matriz; de modo contrário, as plantas de

origem zigótica não podem ser utilizadas nos experimentos, pois não são clones da planta que a

originou (CAMERON; FROST, 1968).

Dessa forma, a fim de selecionar as plantas nucelares, foi realizada a seleção visual,

observando características morfológicas como: quantidade de espinhos, tamanho uniforme, forma e

disposição das folhas. Dentre as 300 plantas avaliadas, foram selecionadas 170 plantas como clones

nucelares vigorosos. A seleção visual baseada em características morfológicas é realizada inicialmente

com o objetivo de otimizar a seleção de nucelares, e dessa forma, reduzir custo e tempo em relação ao

uso exclusivo de marcadores moleculares (OLIVEIRA et al., 2002).

Após a análise fenotípica, foi realizada a análise do genótipo para confirmar os clones

nucelares usando marcadores microssatélites, e dessa forma garantir maior confiabilidade nos

resultados. A análise dos primers utilizados, através das observações das bandas nos géis de agarose,

identificou 38 indivíduos zigóticos. Os primers utilizados miCrCIR01E02, Ci06A05b (Figura 1),

CMS14, TAA4S, CMS26 indicaram respectivamente, 5, 20, 25, 16 e 8 indivíduos zigóticos. Vale

salientar que alguns indivíduos foram identificados em todos os primers, já outros em apenas um

primer.

De modo geral, após a seleção visual e molecular, das 300 plantas germinadas, 56% dos

indivíduos foram considerados zigóticos e 44% foram considerados nucelares. A partir dessas

observações e da contagem direta do número de embriões nas sementes da planta em estudo, podemos

afirmar que o híbrido [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011] apresenta aproximadamente 50% de

poliembrionia, como acontece em limoeiro Cravo (PASSOS et al., 2006).

Dentro da parcela de 170 plantas que foram selecionadas visualmente, 13 plantas apresentaram

florescimento precoce, a partir do segundo mês de cultivo. Essas foram separadas e também

caracterizadas como nucelares ou zigóticas, utilizando os mesmos primers de SSRs citados

anteriormente. Foram identificadas 6 plantas como nucelares e 7 como zigóticas (Figura 2). Levando

em consideração que alguns indivíduos que apresentaram florescimento precoce são de origem

42

zigótica, podemos indicar que a planta matriz do híbrido [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011]

também passa essa característica aos seus descendentes.

Figura 1 – Perfil de amplificação de indivíduos [(Limoeiro ‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro

‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus papuana (MCP) – 011]. Os produtos da PCR foram amplificados

com o Primer SSR – Ci06A05b e revelados com gel de agarose 3%. As setas amarelas indicam as

bandas amplificadas do DNA da planta matriz do híbrido [(Limoeiro ‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro

‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus papuana (MCP) – 011], e as setas vermelhas indicam os

indivíduos que apresentam perfil de amplificação diferente quando comparados com o da planta matriz.,

ou seja, os indivíduos zigóticos para esse primer específico.

Figura 2 – Perfil de amplificação de indivíduos [(Limoeiro

‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) – 005) x

Microcitrus papuana (MCP) – 011], que apresentaram

florescimento precoce. Os produtos da PCR foram

amplificados com o Primer SSR – Ci06A05b e revelados com

gel de agarose 3%. A seta amarela indica as bandas

amplificadas do DNA da planta matriz do híbrido e as setas

vermelhas indicam os indivíduos que apresentam perfil de

amplificação diferente quando comparados com o da planta

matriz, ou seja, os indivíduos zigóticos para esse primer

específico.

43

5.3.2 Desenho e otimização dos primers para o sequenciamento

Para o estudo da expressão gênica, ocorreu a seleção dos genes candidatos para o estudo, que

foram AP1, AP2, BAM, WUS, TFL, ELF4, FT, SOC1 e TFL. Os genes selecionados são relacionados

com floração em citros, dentre eles estão genes de identidade do meristema floral, genes repressores e

genes integradores florais (SONG et al., 2013; WELLMER; RIECHMANN, 2010; OMAOILEIDIGH

et al., 2014).

A partir das análises das sequências de Citrus sinensis e Citrus clementina disponíveis em bancos

de dados, foi realizado o desenho dos primers para o sequenciamento dos fragmentos dos genes.

Posteriormente foi realizada a amplificação dos genes por meio da técnica de PCR convencional com o

DNA do híbrido [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011], e apenas cinco genes foram amplificados: FT,

TFL, WUS, BAMSQ2 e BAMSQ3 (Figura 3).

Figura 3 - Eletroforese de gel de agarose

1% corado com brometo de etídio.

Produtos da amplificação por PCR

convencional com DNA do hibrido

[(Limoeiro ‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro

‘Yuma’(CTYM) – 005) x Microcitrus

papuana (MCP) – 011].

5.3.3 Desenho dos primers para o RT-qPCR

Com as sequências obtidas por meio do sequenciamento, foi realizado o alinhamento dessas com

as sequências utilizadas para desenhar os primers. Foi possível observar que as duas sequências são

muito diferentes, apresentando pouca identidade, principalmente nas regiões que foram utilizadas para

44

desenhar os primers. Esse resultado é uma possível explicação em relação aos demais genes que não

foram amplificados.

Com as sequências do híbrido [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011] obtidas por meio do

sequenciamento, foi realizado o desenho dos primers para o qPCR para os genes FT, TFL, WUS,

BAMSQ2 e BAMSQ3. Os genes utilizados como endógenos foram GAPC2 e 25S.

5.3.4 Análise de cDNAs e especificidade dos primers via PCR convencional

A partir dos cDNAs obtidos, todos os 7 genes foram testados para viabilidade para o estudo de

RT-qPCR via PCR convencional. O resultado mostrou que dois genes alvos (FT e WUS) apresentaram

especificidade. Com relação aos primers selecionados para genes candidatos a genes de referência,

ambos apresentaram especificidade.

5.3.5 Otimização dos genes por RT-qPCR

O primer desenhado para o gene WUS, apesar de ter sido otimizado em PCR convencional, não

apresentou eficiência em qPCR, o que impossibilitou o estudo da expressão para esse gene. No

entanto, o gene FT apresentou apenas um produto de amplificação podendo ser estudado.

A partir da obtenção da curva padrão gerada para o iniciador, foi possível calcular a eficiência de

amplificação (E). A curva padrão gerada para cada um dos genes é representada pelo o valor Ct

correspondente versus o log da quantidade de cDNA utilizada na reação. A partir do slope desta curva,

foi possível calcular a eficiência de amplificação (E) dos primers, que variou entre 87.7 a 99.1%.

5.3.6 Expressão gênica do gene FT

A planta de origem híbrida [(LCR x CTYM – 005) x MCP – 011] disponível no BAG de Citros

da unidade da EMBRAPA Mandioca e Fruticultura em Cruz das Almas-BA apresenta uma

característica singular e diferenciada em relação aos demais genótipos de citros existentes, visto que,

essa planta apresenta um florescimento precoce, o que indica que seu período juvenil é muito curto.

Atualmente, a planta matriz apresenta aproximadamente seis anos de cultivo, e foi observado

florescimento a partir de um ano da inserção no campo com produção de flores e frutos

concomitantemente e de forma interrupta em todas as estações do ano.

Ao longo do desenvolvimento da pesquisa foi possível observar que 13 indivíduos de um total

de 170 demonstraram um florescimento precoce a partir de dois meses de vida, como pode ser A

B

C

45

observado na figura 4. Destas, seis foram comprovadas como de origem nucelar. Ainda foi observado

que a floração de alguns desses indivíduos aconteceu novamente ao longo de meses posteriores. Esses

indivíduos que apresentaram o florescimento precoce foram os utilizados como calibradores na técnica

de qPCR para avaliar a expressão gênica de FT nos demais indivíduos do híbrido [(LCR x CTYM –

005) x MCP – 011].

Figura 4 – Plantas de origem híbrida [(Limoeiro ‘Cravo’ (LCR) x Citrangeiro ‘Yuma’(CTYM) –

005) x Microcitrus papuana (MCP) – 011] proveniente de sementes em diferentes estágios de

desenvolvimento, com florescimento precoce. A= Planta em tubete com substrato de sementeira

com aproximadamente dois meses de cultivo. B= Planta em saco de 2 kg com substrato de pinhos

com aproximadamente quatro meses de cultivo. C= Planta em tubete com substrato de sementeira

com aproximadamente quatro meses de cultivo. D= Planta em saco de 2 kg com substrato de

pinhos com aproximadamente quatro meses de cultivo. E= Planta em vaso de 30 kg com substrato

de pinhos e casca de coco com aproximadamente seis meses de cultivo.

A análise da expressão gênica demonstrou que houve influência do período inverno na

expressão do gene FT entre as duas partes analisadas da planta, caule e folha, como pode ser observado

no gráfico 1. De modo contrário, o período de verão não influenciou na expressão de FT na folha e no

caule, ou seja, no verão a expressão de FT na folha e no caule não diferenciou significativamente.

A B C D E

46

Gráfico 1 - Análise da expressão do gene FT em folhas e caule do híbrido [(LCR x CTYM –

005) x MCP – 011] no inverno e verão. Os perfis de expressão foram determinados por

qPCR. Os níveis de expressão foram normalizados ao valor correspondente da expressão do

gene GAPC2. Os dados representam a média ± EP (erro padrão) de três réplicas

experimentais. Médias com letras minúsculas representam a comparação da expressão do

gene FT nas partes da planta, folha e caule, nos diferentes períodos de amostragem, inverno e

verão. Médias com letras maiúsculas representam a influencia dos períodos, inverno e verão,

na expressão do gene FT nas partes da planta, folha e caule.

É possível ainda inferir por meio da análise do gráfico 1 que houve diferença significativa na

expressão de FT entre os dois períodos avaliados para folha. No período do inverno a expressão de FT

foi significativamente maior, quando comparado com o verão, mesmo a planta apresentando no

inverno idade de cultivo menor, nove meses. A temperatura média na casa de vegetação no mês de

coleta de inverno foi de 22ºC, e no dia da coleta (14/08/2015) a temperatura apresentada foi a menor

do mês, como pode ser constatado no gráfico 2.

10

15

20

25

30

35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

C

Dia do mês

Temperatura - Ago/2015

Temp. Min.

Temp. Média

Temp. Máx.

Gráfico 2 – Temperaturas mínimas, médias e máximas do mês de agosto de 2015.

47

A exposição prolongada a baixas temperaturas é um dos estímulos ambientais mais importantes

para a indução floral em citros. O trabalho clássico de Moss (1969) comprovou que laranjeiras

‘Washington Navel’ submetidas a baixas temperaturas, aumentaram significativamente o número de

flores, quando comparadas com plantas cultivadas em condições de temperaturas mais elevadas.

Nishikawa e colaboradores (2007) relataram que temperatura de 15ºC são eficazes para a indução

floral em Satsuma mandarina, levando ao aumento da expressão do gene FT. Em Poncirus trifoliata,

foi possível observar, o desenvolvimento do botão de flor durante o inverno, quando o nível do gene

FT estava alto (NISHIKAWA et al., 2009).

Apesar da maioria dos trabalhos relacionados com a influência de temperatura na floração de

citros indicarem que as temperaturas capazes de induzir flor são abaixo de 20ºC, podemos inferir que

as temperaturas médias observadas no inverno influenciaram a expressão de FT na planta avaliada,

visto que o padrão de temperatura depende das condições climáticas da região onde as plantas são

cultivadas (DAVIES; ALBRIGO, 1994) e varia de acordo com a espécie (HA; JOHNSTON, 2013).

Em mutantes de Arabidopsis, baixa temperatura induz o processo de indução floral por redução

do nível de gene FLC, que controla a expressão de FT (BASTOW et al., 2004; MICHAELS;

AMASINO, 2001). Além disso, as proteínas provenientes do gene FT são acumuladas em árvores de

citros submetidas a condições de baixa temperatura que auxiliam no processo de indução floral, como

observado em Satsuma e Poncirus trifoliata, que a indução floral foi desencadeada por baixas

temperaturas durante o inverno (NISHIKAWA et al., 2007, 2009).

Em relação à expressão do gene FT no caule, foi possível observar que não houve diferença

significativa nos dois períodos avaliados (Gráfico 1). O gene FT também foi expresso em caule e

folhas em plantas de arroz (AKI et al., 2008), bem como nos tecidos de caule e folhas de Satsuma,

sendo que em folha a expressão de FT foi maior (NISHIKAWA et al., 2007).

O efeito estimulante das baixas temperaturas no florescimento é percebido tanto pelas folhas

como pelo caule (HALL et al., 1977), no entanto a maior expressão do gene FT em folha quando

comparadas com caule de citros no inverno, pode ser explicado por meio da capacidade da folha

responder primeiramente aos estímulos ambientais, como a temperatura.

48

15

20

25

30

35

40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

C

Dia do mês

Temperatura - Fev/2016

Temp. Min.

Temp. Média

Temp. Máx.

Gráfico 3 – Temperaturas mínimas, médias e máximas do mês de fevereiro de 2016.

No período de verão, além de analisar caule e folha foi também inferido a expressão de FT em

gemas. Nesse período a temperatura média na casa de vegetação no mês de coleta de inverno foi de

28ºC, como pode ser constatado no gráfico 3.

A expressão de FT na gema no verão foi significativa, demonstrando uma menor expressão

quando comparada com folha e o caule, como pode ser observado no gráfico 4. Em diversas plantas

transformadas foi possível observar a expressão de FT nas gemas apicais em plantas adultas, como em

citros (KOBAYASHI et al., 1999) e maça (KOTODA et al., 2010). No entanto, esses trabalhos

afirmam que a maior expressão de FT é encontrada em folhas e caule, o que reforça o resultado

demonstrado.

Gráfico 4 - Análise da expressão do gene FT em folhas, caule e gema do híbrido [(LCR x CTYM –

005) x MCP – 011] no verão. Os perfis de expressão foram determinados por qPCR. Os níveis de

expressão foram normalizados ao valor correspondente da expressão do gene GAPC2. Os dados

representam a média ± EP (erro padrão) de três réplicas experimentais. Médias com letras

minúsculas representam a comparação da expressão do gene FT nas partes da planta, folha, caule e

gema no verão.

49

As plantas utilizadas no estudo da expressão de FT floresceram alguns meses depois do período

do verão, o que sugere dizer que o período juvenil foi quebrado e que o gene FT induziu a floração

nessas plantas. Esse resultado corrobora com estudo desenvolvido por Endo e colaboradores (2005),

onde foi observado que a expressão constitutiva de FT em P. trifoliata foi capaz de reduzir

significativamente o tempo de florescimento das plantas transgênicas, evidenciando o papel do gene

FT como importante regulador da indução floral em citros.

Experiências de enxertia com mutantes de Arabidopsis provaram que a proteína FT poderia ser

transportada a longas distâncias e promover a floração (XU et al., 2012). Corbesier e colaboradores

(2007) relataram também que a proteína FT se move das folhas para o meristema apical onde a

diferenciação floral ocorre. Nesse sentido, Nocker e Gardiner (2014) surgerem que uma linha

transgênica estável que expressa constitutivamente FT poderia ser utilizado como porta-enxerto para

conduzir a floração em um enxerto transplantado. No entanto, a planta estudada no presente trabalho

apresenta tais características de forma natural, o que é muito mais importante para o melhoramento

genético de citros.

5.4 CONCLUSÕES

A expressão do gene FT encontrada nas partes da planta de origem híbrida [(LCR x CTYM –

005) x MCP – 011] confirma que esse genótipo tem um período juvenil precoce. As plantas utilizadas

no estudo da expressão de FT floresceram alguns meses depois do período do verão, o que implica

dizer que o período juvenil foi quebrado e que o gene FT induziu a floração em citros.

A partir desse trabalho, surge possibilidade de novas pesquisas em relação ao estudo da via

gênica de floração em citros e o desenvolvimento de técnicas para reduzir o período juvenil com a

utilização do híbrido em estudo, o que promoverá avanços em estudos de melhoramento genético de

citros.

5.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

As análises morfológicas e moleculares indicam que o híbrido em estudo apresenta

características diferenciadas, principalmente relacionadas com florescimento precoce. Nesse sentido,

essa planta pode ser usada no melhoramento genético de citros, como objeto de estudo de trabalhos

relacionados à redução do período juvenil, florescimento precoce e escalonamento de produção. Além

de proporcionar o desenvolvimento de novas pesquisas em relação ao estudo da via gênica de floração

em citros.

universidade estadual de santa cruz programa de...

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