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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
APLICAÇÃO DE FITOCISTATINAS DE Theobroma cacao NA
DETECÇÃO DE CISTEÍNO PROTEASES DE Trypanosoma
cruzi E ANÁLISE DE SUA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA EM
LEVEDURAS DE Saccharomyces cerevisiae
VIVIANIA JOANA BITENCOURT
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Maio de 2014
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VIVIANIA JOANA BITENCOURT
APLICAÇÃO DE FITOCISTATINAS DE Theobroma cacao NA
DETECÇÃO DE CISTEÍNO PROTEASES DE Trypanosoma
cruzi E ANÁLISE DE SUA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA EM
LEVEDURAS DE Saccharomyces cerevisiae
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Maio de 2014
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de
Santa Cruz, como parte das
exigências para a obtenção
do título de Mestre em
Genética e Biologia
Molecular.
Área de concentração:
Genômica e Proteômica.
B624 Bitencourt, Viviania Joana. Aplicação de fitocistatinas de Theobroma cacao na detecção de cisteíno proteases de Trypanosoma cruzi e análise de sua atividade antifúngica em leve- duras de Sacharomyces cerevisiae / Viviania Joana Bitencourt. – Ilhéus, BA: UESC, 2014. xvi, 66f. : Il. Orientadora: Fátima Cerqueira Alvim. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular. Inclui bibliografia.
1. Leveduras (Fungos). 2. Enzimas proteolíticas. 3. Proteínas. 4. Cacaueiro. 5. Saccharomyces cere- visiae. 6. Tripanossoma cruzi. I. Título. CDD 579.5
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VIVIANIA JOANA BITENCOURT
APLICAÇÃO DE FITOCISTATINAS DE Theobroma cacao NA
DETECÇÃO DE CISTEÍNO PROTEASES DE Trypanosoma
cruzi E ANÁLISE DE SUA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA EM
LEVEDURAS DE Saccharomyces cerevisiae
Aprovada: 22 de maio de 2014.
Prof. (a) Dra. Acássia Benjamin Leal Pires Prof. (a) Dra. Cristina Pungartnik
(UNEB) (UESC)
Prof. Dr. Abelmon da Silva Gesteira Prof. (a) Dra. Fátima Cerqueira Alvim
(UESC/EMBRAPA) Orientadora (UESC)
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa
Cruz, como parte das exigências
para a obtenção do título de
Mestre em Genética e Biologia
Molecular.
Área de concentração:
Genômica e Proteômica.
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À minha querida amiga, Kátia Andrade Gomes, pelo incentivo e apoio na
realização deste sonho.
DEDICO
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, força, determinação, coragem e persistência dada em todos os
momentos.
A UESC, pela estrutura e apoio financeiro.
Ao CNPq e CAPES, pelo apoio financeiro ao projeto e concessão da bolsa de
mestrado.
Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, pela
oportunidade de ampliar os meus conhecimentos.
À orientadora Dra. Fátima Cerqueira Alvim, pela orientação, amizade e paciência.
Ao meu co-orientador Dr. Carlos Priminho Pirovani, pelo apoio e sábios conselhos.
À Dra. Cristina Pungartnik, pelos conselhos, observações e direcionamento.
À Fabricia, Mara e Kátia, três anjos na secretaria do PPGGBM.
À Louise Barreto e Diêgo, pela ajuda nos experimentos realizados no Laboratório de
Biologia de Fungos.
Ao Professor Dr. Paulo Melo e Daniele por toda ajuda dispensada na realização
deste projeto.
À Ana Camila Freitas, pela grande ajuda na realização dos experimentos em
proteômica e conselhos.
Ao amigo Horlei, pela ajuda nos géis SDS-PAGE e reagentes.
À Lívia Andrade, Cristina Martins e Juliano Santana pelos momentos de
descontração e amizade.
A todos os integrantes do Centro de Biotecnologia e Genética (CBG).
À minha mãe, Rita, pela força, preces e palavras de carinho.
Ao meu pai, Clarindo, in memorian.
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―É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida
passar; é melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-
se fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva
caminhar, que em dias tristes em casa me esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade
viver...‖.
Martin Luther King
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Índice
Extrato IX
Abstratc XI
Lista de Figuras XIII
Lista de Tabelas XVI
1- Introdução 17
2 - Revisão Bibliográfica
2.1 – Cistatinas 19
2.2 – Fitocistatinas 20
2.2.1 – Função das Fitocistatinas 23
2.2.2 – Fitocistatinas de Theobroma cacao 25
2.3 – Cisteíno proteases – Trypanosoma cruzi 25
3 – Objetivos 29
4 – Material e Métodos
4.1 – Expressão e purificação das cistatinas recombinantes de Theobroma
cacao 30
4.2 – Obtenção das proteases da cultura de Trypanosoma cruzi 31
4.3 – Dosagem proteica colorimétrica da atividade de cisteíno proteases em
extrato de T.cruzi 31
4.4 – Armadilha para capturar cisteíno proteases de T. cruzi 32
4.5 – Gel Semi-nativo de atividade de proteases com Anfólito 34
4.6 – Digestão em Solução – Amostra Complexa 34
4.7 – Análise da Citotoxicidade de TcCYS3 e TcCYS4 com leveduras
mutantes de Saccharomyces cerevisiae
4.7.1 – Ensaio semi-quantitativo n° 1 35
4.7.2 – Ensaio semi-quantitativo n° 2 37
4.7.3 – Curva de Sobrevivência 37
4.8 – Análise Estatística 40
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5 – Resultados
5.1 - Análise das cistatinas de T. cacao purificadas 41
5.2 - Perfil proteico do extrato total de Trypanosoma cruzi 42
5.3 - Inibição da atividade de proteases de Trypanosoma. cruzi por cistatinas
de Theobroma cacao 43
5.4 - Captura de proteases de Trypanosoma cruzi utilizando armadilha
TcCYS4:Sepharose 44
5.5 - Análise no Espectrômetro de Massas 45
5.6 - Análise da Citotoxicidade das cistatinas de Theobroma cacao em
Saccharomyces cerevisiae 46
6- Discussão 52
7- Conclusão 56
8- Perspectivas 57
9- Referências Bibliográficas 58
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EXTRATO
BITENCOURT, Viviania Joana, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus –
Bahia, maio de 2014. APLICAÇÃO DE FITOCISTATINAS DE Theobroma
cacao NA DETECÇÃO DE CISTEÍNO PROTEASES DE Trypanosoma
cruzi E ANÁLISE DE SUA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA EM
LEVEDURAS DE Saccharomyces cerevisiae. Orientador (a): Dra. Fátima
Cerqueira Alvim. Co-orientador: Dr. Carlos Priminho Pirovani.
Fitocistatinas são proteínas inibitórias de cisteíno proteases clã C1A, família
papaína-like, e possuem ação antiviral, antimicrobiana e antifúngica, além de
participação em processos como morte celular programada, estocagem de
proteínas, defesa da planta contra proteases excretadas por insetos e nematóides,
além de ter envolvimento na resistência da planta a estresse biótico e abiótico.
Recentemente, o grupo de pesquisa da UESC, isolou e expressou in vitro quatro
fitocistatinas de Theobroma cacao (TcCYS1, TcCYS2, TcCYS3 e TcCYS4). O
presente trabalho teve como objetivo primordial analisar a aplicação de duas dessas
fitocistatinas (TcCYS3 e TcCYS4) na detecção de cisteíno proteases de
Trypanosoma cruzi e sua atividade antifúngica em leveduras de Saccharomyces
cerevisiae. Essas fitocistatinas foram selecionadas por apresentarem características
contrastantes: TcCYS3 não possui a região carboxi-terminal estendida e TcCYS4
não apresenta peptídeo sinal. Em Trypanosoma cruzi as cisteíno proteases estão
relacionadas com a invasão na célula hospedeira, em mamíferos, e desenvolvimento
do patógeno durante o seu ciclo de vida, constituindo-se assim em um potencial alvo
no combate a Doença de Chagas, doença endêmica que mata milhares de pessoas
todos os anos. O mecanismo antifúngico das fitocistatinas ainda é desconhecido, e
neste trabalho TcCYS3 e TcCYS4 foram testadas com diferentes linhagens
mutantes de Saccharomyces cerevisiae que foi o organismo modelo eleito para os
experimentos. Os resultados indicaram que as cistatinas de T. cacao são capazes
de inibir as cisteíno proteases de T. cruzi sendo que TcCYS4 inibiu (53,77%) e
TcCYS3 (20,20%). Com base nesse resultado foi feita uma armadilha para capturar
cisteíno proteases de T. cruzi. A armadilha foi composta por TcCYS4 ligada a uma
resina de sepharose-CNBr. A esta armadilha foi submetida o extrato proteico total de
T. cruzi. Em zimograma foi possível verificar a atividade de proteases nas eluições
coletadas após o uso da armadilha. Esse resultado indicou uma eficiência da
armadilha. As eluições sofreram digestão triptíca e analisadas via espectrometria de
massas. Vinte e um peptídeos foram identificados, contudo não apresentaram
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similaridade com proteases de T. cruzi. Neste trabalho foram, também, realizados
ensaios visando avaliar o potencial citotóxico das TcCYS3 e TcCYS4 em linhagens
mutantes de S. cerevisiae com deficiência em vias de reparo de DNA linhagens
(xrs2Δ, rad52Δ, rad53Δ, rev1Δ e rev3Δ), transporte de membrana (yor1Δ) e para
detoxificação de estresse oxidativo (sod1Δ, sod2Δ, ctt1Δ e cta1Δ). Observou-se uma
sensibilidade maior das linhagens mutantes com deficiência em reparo de DNA
quando expostas as fitocistatinas de T. cacao.
.Palavras – chave: fitocistatinas, cisteíno proteases, Chagas, citotoxicidade.
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ABSTRATC
BITENCOURT, Viviania Joana, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus –
Bahia, may of 2014. APPLICATION OF Theobroma cacao phytocystatins THE DETECTION OF Trypanosoma cruzi cysteine proteases AND ANALYSIS OF ITS ACTIVITY IN YEAST OF ANTIFUNGAL Saccharomyces cerevisiae. Advisor: Dra. Fátima Cerqueira
Alvim. Advisor Commitee Member: Dr. Carlos Priminho Pirovani.
Phytocystatins are inhibitory proteins clan C1A cysteine proteases, papain-like
family, and have antiviral, antimicrobial and antifungal action, and participation in
processes such as programmed cell death, storage proteins, plant defense against
proteases secreted by insects and nematodes, besides having involvement in plant
resistance to biotic and abiotic stress. Recently, the research group of UESC,
isolated and in vitro four phytocystatins of Theobroma cacao (TcCYS1, TcCYS2,
TcCYS3 and TcCYS4) expressed. This study had as its primary objective to analyze
the application of two of these phytocystatins (TcCYS3 and TcCYS4) in the detection
of cysteine proteases of Trypanosoma cruzi and their antifungal activity in yeast
Saccharomyces cerevisiae. These phytocystatins were selected because they have
contrasting characteristics: TcCYS3 lacks the carboxy-terminal region and extended
TcCYS4 shows no signal peptide. Trypanosoma cruzi in the cysteine proteases are
related to invasion of the host cell in mammals, and development of the pathogen
during its life cycle, thus constituting a potential target to combat Chagas disease,
endemic disease that kills thousands people every year. The antifungal
phytocystatins mechanism is still unknown, and this work TcCYS3 and TcCYS4 were
tested on different mutants strains of Saccharomyces cerevisiae organism was
chosen for the experiment model. The results indicate that the T. cacao cystatins are
able to inhibit cysteine proteases of T. cruzi, and TcCYS4 inhibited (53.77%) and
TcCYS3 (20.20%).The trap consisted of TcCYS4 linked to CNBr sepharose resin. To
this trap we subjected the total protein extract of Trypanosoma cruzi. Zymogram
analyses revealed that the trap elution presented proteases activity. This result
indicated that the trap was efficient in separe proteases from protein crude samples.
Simultaneously, the trap elution were submitted to a tryptic digestion and further
analyzed via mass spectrometry. Twenty-one peptides were identified. However
none of those showed similarity to Trypanosoma cruzi proteases. This work was also
carried out tests to evaluate the cytotoxic potential of TcCYS3 and TcCYS4 proteins
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in mutant strains of S. cerevisiae deficient in repair pathways of DNA lineages
(xrs2Δ, rad52Δ, rad53Δ, rev1Δ e rev3Δ), membrane transport (yor1Δ) and
detoxification of oxidative stress (sod1Δ, sod2Δ, ctt1Δ and cta1Δ). We observed an
increased sensitivity of mutant strains deficient in DNA repair when exposed to
phytocystatins of T. cacao.
Keywords: phytocystatins, cysteine proteases, Chagas, cytotoxicity
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Modelo estrutural de orizacistatina I. Apresentação dos elementos
principais na atividade de inibição das cisteíno proteases. Modificado de
KIGGUNDU et al. (2006). 21
Figura 2: O ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. Apresenta quatro estágios: A)
Amastigota (replicação intracelular); B) Tripomastigota fase não replicativa na
circulação sanguínea no homem; C) Epimastigota,apresenta um estágio
replicativo, no vetor (inseto); D) Tripomastigota metacíclica, estágio não replicativo,
mas infectivo . Modificado de Alvarez et al. (2012). 26
Figura 3: Representação Ensaio semi-quantitativo. A) Demonstra a diluição
seriada (1:10) das amostras sendo que no primeiro tubo está a levedura em
Tampão Bicarbonato, no segundo tubo a levedura é exposta a cistatina de
Theobroma cacao, em Tampão de Bicarbonato de Sódio 100 mmol L-1, e alíquotas
de 100µL são transferidos, sucessivamente, sendo que os tubos 3-6 contêm
Tampão Bicarbonato de Sódio 100 mmol L-1. B) Esquema de aplicação da
diluição seriada na placa de Petri com meio YPD sólido. 36
Figura 4: Representação esquemática da Curva de sobrevivência. Demonstra
a diluição seriada (1:10) das amostras sendo que no primeiro tubo está a levedura
não diluída, em meio YEL, e alíquotas de 100µL são transferidos, sucessivamente,
sendo que nos tubos 2-6 , a levedura é diluída e exposta a cistatina de
Theobroma cacao, em Tampão de Bicarbonato de Sódio 100 mmol.L-1 contêm
Tampão Bicarbonato de Sódio 100 mmol.L-1. Da última diluição (103) aplica-se 0,1
mL na placa de Petri com meio YPD sólido. 38
Figura 5: Análise em SDS-PAGE a 12,5% das cistatinas recombinantes
TcCYS3 e TcCYS4 - Onde M é o marcador de peso molecular LWM (GE Health
Care) aplicou-se 20µg de TcCYS3 e TcCYS4 nos géis, respectivamente. TcCYS3
e TcCYS4 foram purificadas da fração solúvel do extrato bacteriano. 41
Figura 6: Perfil proteico de proteínas totais deT. Cruzi – 25 microgramas de
proteínas totais de T. cruzi foram separadas em gel SDS-PAGE a 12,5%. As
proteínas foram visualizadas após coloração com Azul de Comassie Coloidal. M-
Marcador de Peso Molecular em KDa (GE Health Care). 42
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Figura 7: Inibição da atividade de proteases de T. cruzi por cistatinas de T cacao – Perfil
inibitório de TcCYS3 e TcCYS4 em Trypanosoma cruzi. A proteína TcCYS4 apresentou
melhor poder de inibição do que a TcCYS3. As barras verticais pretas correspondem aos
desvios padrões das médias (n=3). 43
Figura 8: Atividade de proteases de T. cruzi capturadas com armadilha TcCYS4:
sepharose CNBr. As proteínas capturadas com a armadilha de CYS-Sepharose
foram separadas em gel de acrilamida semi nativo contendo anfólitos de 3-10. Foto do
gel de gelatina de sobreposição após coloração com Azul de Comassie Coloidal.
Setas indicam isoformas de proteases de T. cruzi capturadas com a armadilha no gel
semi-nativo, pode-se visualizar o halo formado pela degradação das proteases de T.
cruzi na gelatina. 44
Figura 9: Ensaio semi-quantitativo. As linhas correspondem a diluição seriada após
o tratamento de Y10000 (5 µL de cada diluição (1:10) foi inoculado) com TcCYS3 e
TcCYS4 nas concentrações de 6 µg/µL e 12 µg/µL no intervalo de 0, 1, 3, 6,10, 24 e
48 horas. 46
Figura 10: Teste de sensibilidade com diferentes leveduras mutantes em contato
com TcCYS3 na concentração de 12 µg/µL por 3 horas. As colônias à esquerda
são o controle negativo, ou seja, não foram expostas à fitocistatina. Na foto é possível
observar a diminuição do crescimento nas leveduras mutantes em reparo de DNA
(xrs2Δ, rad1Δ, rev1Δ). 48
Figura 11: Teste de sensibilidade com diferentes leveduras mutantes em contato
com TcCYS4 na concentração de 12 µg/µL por 3 horas. As colônias à esquerda
são o controle negativo, ou seja, não foram expostas a cistatina. Na foto é possível
observar a diminuição do crescimento nas leveduras mutantes em reparo de DNA
(xrs2Δ, rad1Δ, rev1Δ). 49
Figura 12: Curva de sensibilidade das leveduras mutantes e Y10000 em
exposição à 6 µg/µL cistatina de Theobroma cacao (TcCYS3), no intervalo de
tempo de 0, 6, 12 e 24h. No gráfico observa-se a redução do crescimento celular em
xrs2 Δ e rad53Δ quando expostas a TcCYS3, em comparação com Y10000. 50
XIV
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Figura 13: Curva de sensibilidade dos mutantes e Y10000 em exposição a 6
µg/µL cistatina de Theobroma cacao (TcCYS4), no intervalo de tempo de 0, 6,
12 e 24h. Nota-se, no gráfico, uma diminuição da viabilidade celular de rev1Δ e
rev3Δ quando comparados com a levedura isogênica da selvagem Y10000 (controle
negativo), em contato com TcCYS4. 51
XV
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: As estirpes de leveduras utilizadas. 39
Tabela 2: Peptídeos identificados por Espectrometria de Massas após digestão
tríptica. A análise da espectrometria de massas das amostras foi realizada pelo
programa Mascot. 45
XVI
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1. INTRODUÇÃO
As cistatinas são consideradas proteínas ubíquas, ou seja, estão presentes
em mamíferos, pássaros, peixes, insetos, plantas, fungos e protozoários (WALLIN et
al., 2010), sendo a sua principal característica a inibição de cisteíno proteases
(BENCHABANE et al., 2010). Nas plantas, estão envolvidas em diversos processos
moleculares e fisiológicos como: senescência, estoque de nutrientes na semente,
morte celular programada e defesa da planta contra proteases exógenas secretas
por insetos (RIVARDI et al., 2007; TIAN et al., 2009). Fitocistatinas podem
apresentar atividade antifúngica (GUO et al., 2013; LIMA et al., 2014; PIROVANI et
al., 2010; POPOVIC et al., 2013), atividade antimicrobiana e antiviral (CARRILLO et
al., 2011; GHOLIZADEH et al., 2005). Recentemente, quatro cistatinas de
Theobroma cacao (TcCYS1, TcCYS2, TcCYS3 e TcCYS4) foram identificadas,
expressas e purificadas em laboratório por (PIROVANI et al., 2010), e demonstraram
que esses inibidores de cisteíno proteases são capazes de inibir o crescimento do
fungo Moniliophthora perniciosa, além de terem sido eficientes na captura de
cisteíno proteases em diferentes amostras proteicas complexas. O mecanismo de
atividade antifúngica das fitocistatinas ainda é desconhecido, porém alguns estudos
relatam que as fitocistatinas afetam o desenvolvimento da parede celular do fungo
(LIMA et al., 2014; POPOVIC et al., 2013), outros que o mecanismo de inibição
antifúngico não seria o mesmo da inibição de cisteíno proteases (VALDES-
RODRIGUES et al., 2010).
As cisteíno proteases, assim como as cistatinas, também são encontradas em
bactérias, protozoários, plantas e animais (STOKA et al., 1995). Oliveira et al. (2003)
relata a participação de cisteíno proteases como proteínas de sistemas de
degradação (lisossomais) e atuantes em desordem metabólica, em vertebrados; em
nematóides e patógenos atuam como enzimas digestivas. Em Trypanosoma cruzi,
as cisteíno proteases estão presentes em todas as fases do ciclo de vida do
parasita, são responsáveis pela imunoevasão, diferenciação (LEE al., 2012) e,
constituindo-se assim em um potente alvo para o desenvolvimento de fármacos e
terapias de combate ao patógeno que mata milhares de pessoas todos os anos
(ALVAREZ et al., 2012; ZAMBRANO et al. 2013).
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Este projeto teve por objetivos a análise de fitocistatinas de Theobroma cacao
(TcCYS3 e TcCYS4) na detecção de cisteíno proteases em protozoários, tendo o
Trypanosoma cruzi como organismo modelo adotado, uma vez que a Doença de
Chagas é uma doença endêmica e ainda não possui uma terapia eficiente; e,
identificar a sua via metabólica de atuação antifúngica em leveduras mutantes de
Saccharomyces cerevisiae (organismo modelo).
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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Cistatinas
O primeiro inibidor de cisteíno proteases foi isolado e caracterizado a partir da
clara de ovo (BOBEK et al., 1992). O termo cistatina foi empregado por (BARRETE,
1981) e foi comprovada a sua inibição contra papaína, catepsinas e caspases
(CAMBRA et al., 2012; CHU et al., 2011; GOLE et al., 2012). São proteínas
presentes em diversos organismos tanto em eucariotos quanto em procariotos
(BENCHABANE et al., 2010).
Mesmo presentes em diversos organismos houve uma conservação dos
domínios referentes à estrutura, função bioquímica e não ocorreram mudanças na
especificidade de inibição (WALLIN et al., 2010). No entanto, variações foram
observadas (alterações nos resíduos de aminoácidos e suas conformações). A
atividade das cistatinas é afetada pelos elementos reguladores (por exemplo, os
promotores) dos genes, o que pode determinar quando e onde serão expressas
(DUTT et al., 2012).
Desde a sua descoberta, a família cistatina aumentou e é agora uma
superfamília que pode ser classificada em quatro grandes famílias: Estefinas,
Cistatinas, Kininogênios e Fitocistatinas.
Estefinas A e B, também conhecidas como cistatinas A e B são proteínas
constituídas de uma única cadeia polipeptídica de baixo peso molecular (~ 11 kDa),
domínio único e não apresentam corpos dissulfídricos. Possuem peptídeo sinal e
são expressas intracelularmente (OCHIENG et al., 2010). Estão envolvidas na
resposta imune contra bactérias em crustáceos e anelídeos (PREMACHANDRA et
al., 2012)
Os inibidores da família das Cistatinas também são proteínas de baixo peso
molecular, porém apresentam pontes de enxofre em sua cadeia polipeptídica para
estabilizar a estrutura da proteína. Possuem peso molecular (~13-14 kDa), peptídeo
sinal e alguns dos membros dessa família são glicosilados (ARAI et al., 2002;
OCHIENG et al., 2010). Envolvimento na regulação de tumorigênese, câncer e
doenças neurodegenerativas (OCHIENG et al., 2010).
20
Os Kininogênios mostram uma organização estrutural mais complexa, pois
são compostos de três cadeias polipeptídicas, glicosilados e apresentam corpos
dissulfídricos, possuem domínios repetidos das estefinas provenientes de eventos
de duplicação gênica (BENCHABANE et al., 2010; DUTT et al., 2010). Os
Kininogênios foram principalmente estudados para se determinar suas propriedades
como precursores de hormônios vasoativos, as kininas e em seguida, a sua
capacidade para regular a atividade proteolítica das proteases de cisteína
(LALMANACH et al., 2010).
As Fitocistatinas estão presentes apenas em plantas, não apresentam pontes
dissulfeto e mostram uma estrutura diferenciada (BENCHABANE et al., 2010;
MARGIS-PINHEIRO et al., 2008). Possuem função na defesa e desenvolvimento da
planta (LINDE et al., 2012), antimicrobiana, antiviral (CARRILLO et al., 2010;
GHOLIZADEH et al., 2005) e antifúngica (GUO et al., 2013; LIMA et al., 2014;
PIROVANI et al., 2010; POPOVIC et al., 2013).
A ação inibitória das cistatinas contra as cisteíno proteases ocorre em três
pontos de interação: (i) Um ou dois resíduos de Gly perto da região amino-terminal;
(ii) Região central conservada, caracterizadora do sítio ativo Gly-X-Val-X-Gly
(QXVXG); (iii) Um resíduo de triptofano na segunda alça perto da região carboxi-
terminal (BENCHABANE et al., 2010; CHU et al., 2011; DUTT et al., 2010).
2.2 Fitocistatinas
Uma análise comparativa do genoma de cistatinas revelou que este grupo
apresenta particularidades estruturais, organização genômica e diversidade
intrínseca que levaram a criação de uma família dentro da superfamília de cistatina
para incluir todas as cistatinas de planta (fitocistatinas) (MARGIS-PINHEIRO et al.,
2008). Esta subdivisão está baseada na sequência homóloga e peso molecular,
assim como na presença e ausência de corpos dissulfídricos (DUTT et al., 2010).
Cistatinas de planta ou fitocistatinas têm sido objeto de estudo nas últimas
décadas, várias já foram isoladas de sementes, folhas, frutos e raiz de plantas
monocotiledôneas e dicotiledôneas. Estudos apontam como sua função-alvo a
inibição de cisteíno proteases, subfamília papaína, clã C1A (MARTINEZ; DIAZ,
21
2008; POPOVIC et al., 2012). Essa inibição ocorre de forma forte e reversível na
forma de pseudo-substratos que se conectam ao sítio ativo das enzimas alvo
bloqueando o acesso dos substratos proteicos (BENCHABANE et al., 2010;
KINGGUDU et al., 2006).
O seu mecanismo de inibição exige uma parcial flexibilidade da região N-
terminal, para que a mesma adote a conformação necessária para interagir com a
proteína alvo (BJORK et al., 1995). Essa particularidade da região N-terminal deve-
se a presença de um resíduo de glicina que apresenta a função de conferir uma forte
especificidade das cistatinas por cisteíno proteases e de manter a conformação do
sítio ativo da enzima (BJORK et al., 1995; CAVINI et al., 2012; MARTINEZ et al.,
2009). Além disso, a região apresenta, também, dois hairpin loops que carregam um
forte domínio conservado QxVxG e um resíduo de triptofano, assim como, uma
região conservada LARFAV, presente somente em fitocistatinas (BATEMAN et al.,
2011). A região Carboxi-terminal apresenta três funções: (i) dotar a região N-terminal
com mais especificidade para inibição de cisteíno proteases; (ii) evitar que o domínio
N-terminal seja atacado por peptidases endógenas e exógenas; e (iii) aumentar o
seu tamanho molecular, tornando-se uma proteína de armazenamento (WANG et
al., 2008). Além disso, foi identificado um novo motivo conservado na extremidade
C-terminal de fitocistatinas, cuja sequência de aminoácidos, YEAKxWxKxF,
demonstra influenciar tanto no processo de ligação quanto na estabilidade do
Figura 1: Modelo estrutural de orizacistatina I. Apresentação dos elementos principais na
atividade de inibição das cisteíno proteases. Modificado de KIGGUNDU et al. (2006).
22
complexo resultante da ligação entre inibidor –protease alvo (CHAUHAN et al.,
2014).
Irene et al. (2012) analisaram a estrutura e função da fitocistatina de abacaxi
(Ananas comosus) e identificaram que a estrutura globular compacta da proteína era
estabilizada por agrupamentos hidrofóbicos sobre a interface entre a α-hélice e a β-
folha; sendo que a estabilidade da fitocistatina se deve aos resíduos da α-hélice
presentes no motivo LARFAVxExN.
Zhao et al. 2014 propõem que a regulação da atividade das proteases alvo
das fitocistatinas pode ocorrer de três maneiras: (i) regulação da transcrição dos
genes da família cistatina em diferentes tecidos; (ii) compartimentalização
intracelular das cistatinas; (iii) e através dos motivos específicos responsáveis pela
sua forte e reversível inibição. As fitocistatinas, presentes exclusivamente em
plantas, apresentam o sítio conservado LARFAV como uma característica marcante
(BOBEK; LEVINE, 1992; MARGIS et al., 1998). Nissen et al. (2009) descreve três
tipos de fitocistatinas: (1) pequenas proteínas com peso entre 10 – 16 kDa,
apresentando corpos dissulfidrícos e sequência homóloga com a família 2 de
cistatina animal; (2) moléculas com aproximadamente 23 kDa contendo uma
extensão Carboxi-terminal (inibidor de legumaínas) e; (3) multi-cistatinas que
apresentam peso molecular entre 60 – 80 kDa. São reconhecidas como proteínas de
secreção, uma vez que contêm peptídeo sinal que as enviam para o Retículo
Endoplasmático e, finalmente, para diferentes destinos com o objetivo de se ligarem
as sequências alvo de proteases e inibição de suas atividades em um local
intracelular específico (ZHAO et al., 2014).
O seu segundo alvo de inibição seriam as legumaínas, segunda maior
família de cisteíno proteases (MARTINEZ et al., 2007). A inibição das legumaínas se
deve a região Carboxi-terminal das cistatinas com a presença do domínio SNSL
(MARTINEZ et al., 2007; MUNTZ; SHUTOV, 2002). A principal função das
legumaínas está relacionada com o processamento de outras proteínas na sua
forma madura para atividade, mobilidade ou estocagem de proteínas (CHRISTOFF
et al., 2014). Legumaínas estão associadas a eventos como senescência e morte
celular programada (PIERRE et al., 2014). Cisteíno proteases como papaína,
legumaína e seus inibidores (fitocistatinas) são importantes para o desenvolvimento
e homeostase da planta.
23
2.2.1 – Função das Fitocistatinas
As fitocistatinas regulam cisteíno proteases em processos fisiológicos e
celulares importantes para a planta, tais como: organogênese, regulação endógena
da quantidade de proteínas durante o desenvolvimento da semente e germinação,
morte celular programada, tolerância a estresse abiótico e defesa contra enzimas
proteolíticas secretadas por insetos, nematóides e fungos (NEUTEBOOM et al.,
2009; KIGGUNDU et al., 2006; MARTINEZ et al., 2005).
Possuem composições de sequência similar como das estefinas e cistatinas,
mas não contêm resíduos livres de cisteína (SUN et al., 2014). Zhao et al. (2014)
detectaram fitocistatinas em gametas masculinos e femininos, a regulação da
expressão dessas proteínas pode estar relacionada a eventos de desenvolvimento
durante a embriogênese e formação de sementes.
Dutt et al. (2010) observaram que quando superexpressa em plantas, as
fitocistatinas promovem um acúmulo maior de proteínas na semente, o que mostra a
sua importância na prevenção da degradação das proteínas endógenas durante o
seu desenvolvimento, além disso, confere uma maior resistência da planta contra
proteases secretadas por insetos, fungos e nematóides (LIMA et al., 2014; WANG et
al., 2008). Algumas fitocistatinas respondem a vários estresses abióticos como calor,
frio, salinidade e anaerobiose conferindo estabilidade da membrana celular e
mantendo funções nucleares, protegendo assim atividades vitais, tais como a
fotossíntese e a respiração. (VALDES-RODRIGUES et al., 2007; WANG et al., 2012)
participando da degradação de proteínas danificadas pelo estresse e na síntese de
novas enzimas adaptadas ao estresse (SUN et al., 2014).
Fitocistatinas recombinantes quando expressas induzem uma variedade de
alterações fenotípicas na planta, incluindo um retardo no desenvolvimento de órgãos
florais (PEREIRA et al., 2011), modificação no comportamento fisiológico sob baixas
temperaturas ou escassez de luz (HWANG et al., 2010; VALDÉS-RODRÍGUES et
al.,2007), alteração na concentração de proteínas em folhas (WANG et al., 2012).
Sua participação é relatada, também, em eventos como senescência (BREEZE et
al., 2011) e morte celular programada onde as fitocistatinas modulam a atividade de
cisteíno proteases e a regulação do dobramento de proteínas (IRENE et al., 2012;
SOLOMON et al., 1999). A superexpressão de fitocistatinas protege a planta, do
ataque de nematóides, secretando proteases nas raízes o que acaba interferindo na
24
quimiorecepção de acetilcolinesterase e receptores nicotínicos de acetilcolina do
nematóide afetando o seu ciclo de vida (ATKINSON et al., 2011; REYNOLDS et al.,
2011).
Wang et al. (2008) analisaram diferentes segmentos de peptídeos das regiões
N-terminal, Carboxi-terminal e comprimento total de fitocistatinas de inhame
(Colocasia esculenta) em ensaios de sensibilidade antifúngica e observaram que a
atividade antifúngica de fitocistatinas está relacionada com os peptídeos da região
N-terminal. Popovic et al. (2013) estudaram a atividade antifúngica de fitocistatina de
kiwi (Actinidia deliciosa) em fungos patogênicos (Alternaria radicina e Botrytis
cinérea), contudo não identificaram a rota metabólica de inibição da cistatina. Em
outro estudo, Pirovani et al. (2010) observaram uma forte inibição do crescimento
micelial de Moniliophthora perniciosa, assim como, um subsequente encurtamento
da hifa e um número reduzido de unidades de micélio (pseudo-colônias) quando em
contato com fitocistatinas recombinantes TcCYS3 e TcCYS4 de Theobroma cacao,
porém, o mecanismo de atividade antifúngica não foi elucidado.
Pesquisas são necessárias para compreender a resposta antifúngica das
fitocistatinas, ensaios de citotoxicidade em leveduras podem ajudar a elucidar o
problema. A levedura Saccharomyces cerevisae é um organismo modelo unicelular
eucariótico promissor em pesquisas por apresentar características celulares,
semelhança genética, bioquímica e funcional com as células de mamíferos, que ao
contrário da maioria dos microrganismos, pode ser haplóide, diplóide ou poliplóide.
Além de permitir a realização de experimentos bastante controlados com um grande
número amostral, outras propriedades tornam as leveduras excelentes candidatos
para estudos biológicos: rápido crescimento celular, facilidade no isolamento de
mutantes, além de possuir um sistema de transformação de DNA muito versátil
(GIAEVER; NISLOW, 2014; SHERMAN. 2002). S. cerevisae mutantes que
apresentam um gene nulo, em comparação com o tipo isogênico da selvagem
oferecem a oportunidade de avaliar uma determinada via metabólica específica em
falta de resposta ao tratamento com o produto químico estudado; caracterizar um
produto como antifúngico ou mutagênico e verificar se a inibição ou os danos ao
DNA são reversíveis ou não (SAITO et al., 2012; SUN et al., 2014).
25
2.2.2 – Fitocistatinas de Theobroma cacao
O Centro de Biotecnologia e Genética da Universidade Estadual de Santa
Cruz possui uma biblioteca de cDNA da interação Theobroma cacao –
Moniliophthora perniciosa onde estão depositadas quatro sequências de
fitocistatinas envolvidas no processo de inibição de cisteíno proteases.
Pirovani et al. (2010) identificaram que as proteínas TcCYS1 e TcCYS3
possuem peptídeo sinal e uma identidade de 96% entre elas. TcCYS1 apresenta
209 aminoácidos, enquanto que TcCYS3 contém 124 aminoácidos. A cistatina
TcCYS3 é resultado de um processamento alternativo do gene que codifica para a
proteínas TcCYS1, além disso, não apresenta a cauda C-terminal estendida. As
proteínas TcCYS2 e TcCYS4 possuem 88% de identidade e não apresentam
peptídeo sinal. TcCYS4 é caracterizada com uma região C-terminal estendida e uma
sequência primária com 205 aminoácidos. TcCYS2 possui 127 aminoácidos e é
truncada em relação à TcCYS4. Ainda nesse estudo, comprovaram a inibição do
crescimento do micélio do fungo Moniliophthora perniciosa, in vitro, pelas quatro
cistatinas de cacau.
DOS SANTOS (2012) observou que a superexpressão de TcCYS4 em
plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) reduzia a atividade de MpNEP, que induz a
morte celular em folhas (GARCIA et al., 2007). FREITAS (2012) analisou a
oligomerização da atividade inibitória de cistatinas de cacau expressas durante a
interação com Moniliophthora perniciosa e observou que: (i) TcCYS1 é sensível a
tratamento térmico; (ii) TcCYS2 é termoestável, mas precipita com o aumento da
temperatura e ocorre diminuição do seu poder inibitório; (iii) TcCYS3 é termoestável
e sua estrutura sofre poucas alterações com o aumento de temperatura; e (iv)
TcCYS4 é termoestável, forma dímeros (quando tratada termicamente em
temperaturas de 60 - 70°C). Embora, quando na forma dimérica não seja capaz de
inibir a papaína (cisteíno-protease).
2.3 – Cisteíno proteases – Trypanosoma cruzi
26
O agente etiológico da Doença de Chagas é o protozoário Trypanosoma
cruzi, que afeta mais de 14 milhões de pessoas na America Latina (ANTUNES et al.,
2013; DUSCHAK; COUTO, 2007). O ciclo de vida do T. cruzi consiste de quatro
estágios: epimastigota, tripomastigota metacíclica, tripomastigota e amastigota
(Figura 2).
A forma natural de transmissão da Doença de Chagas se dá por insetos
hematófagos (sub-família Triatominae) (OLIVEIRA et al., 2003). No vetor
intermediário (inseto), o desenvolvimento do T. cruzi se inicia quando o inseto se
alimenta do sangue de um hospedeiro mamífero infectado. Quando a maior parte do
sangue ingerido com o parasita na forma tripomastigota atinge o seu estômago,
inicia-se a diferenciação de tripomastigota para epimastigota. Após a passagem para
o intestino delgado e reto, do vetor, o parasita na forma epimastigota divide-se,
repetidamente, por divisão binária e adere nas paredes do intestino delgado
posterior, que é uma região com elevada atividade digestiva e onde há uma maior
concentração de metabólitos, mas que não suporta uma elevada densidade
B)
C)
A)
D)
HOMEM
INSETO
Figura 2: O ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. Apresenta quatro estágios: A)
Amastigota (replicação intracelular); B) Tripomastigota fase não replicativa na circulação
sanguínea no homem; C) Epimastigota,apresenta um estágio replicativo, no vetor
(inseto); D) Tripomastigota metacíclica, estágio não replicativo, mas infectivo . Modificado
de Alvarez et al. (2012).
27
populacional do parasita (GARCIA et al., 2010; GODOY et al., 2012). Então, quando
a população de parasitas migra para o reto, as formas epimastigotas se diferenciam
na forma não-replicativa, mas infecciosa tripomastigota metacíclica. O vetor pode,
eventualmente, eliminar nas fezes e urina as formas epimastigota e tripomastigota,
entretanto, apenas os tripomastigotas são capazes de infectar o hospedeiro
mamífero (ANTUNES et al., 2013; GARCIA et al., 2007).
Após alimentar-se, o inseto hematófago (sub-família Triatominae),
popularmente conhecido como barbeiro,(OLIVEIRA et al., 2003) deposita as suas
fezes contendo as formas epimastigota e tripomastigota metacíclica do protozoário
próximo do orifício usado para a sua alimentação. Contudo, o momento da dejeção
depende da quantidade de sangue ingerido, pois os barbeiros que tomam uma
quantidade maior de sangue tendem a defecar muito mais rapidamente do que
aqueles que efetuam um repasto sanguíneo menor (GUARNERI et al., 2000;
SOARES et al., 2014). Após a invasão celular, no hospedeiro mamífero, as formas
tripomastigotas são englobadas por um vacúolo parasitóforo onde se diferenciam à
forma amastigota que é a responsável pela proliferação intracelular do parasito e,
após alguns ciclos de replicação, estas se diferenciam novamente nas formas
tripomastigotas, que são liberadas, podendo atingir a corrente sanguínea após a
ruptura celular. O ciclo se encerra quando o inseto não-infectado triatomíneo fizer o
seu repasto sanguíneo (PITA; PASCUTTI, 2011).
No parasita, as cisteíno proteases são responsáveis por sua invasão,
imunoevasão, digestão de imunoglobulinas e desenvolvimento intracelular em
macrófagos, fibroblastos e células musculares estriadas e lisas no hospedeiro e
mecanismo de defesa contra o sistema imune do hospedeiro (LEE et al., 2012;
SILVA et al., 2007). As cisteíno proteases são divididas em dois grandes grupos: clã
CA ou papaína-like e clã CD ou legumaínas-like, e são designadas para clans e
famílias a depender de características, tais como: sequência de similaridade e
especificidade bioquímica para pequenos peptídeos substratos (DUSCHAK;
COUTO, 2007; SAJID; McKERROW, 2002). Garcia et al. (1997) identificaram que as
cisteíno proteases podem ser encontradas tanto no citoplasma quanto nos
lisossomos e que possuem resíduos de cisteína e histidina envolvidos na hidrólise
do substrato. Em T. cruzi, elas são importantes nos processos de diferenciação
morfológica e desenvolvimento do parasita e, consequentemente, por sua invasão e
desenvolvimento intracelular em macrófagos, fibroblastos e células musculares
28
estriadas e lisas no hospedeiro (mamífero) e mecanismo de defesa contra o sistema
imune (SILVA et al., 2007; SUNDARARAJ et al., 2014; YADAV et al., 2011).
A cruzipaína é um membro da superfamília de cisteíno proteases e é mais
sequencial e estruturalmente homóloga para a catepsina L (KIKUCHI et al., 2010;
LEE et al., 2012) e se constitui em um excelente alvo terapêutico no combate a
Doença de Chagas, devido ao fato de ser diferencialmente expressa nos quatros
estágios do ciclo de vida do parasita, está presente em organelas relacionadas com
o lisossoma; a concentração mais elevada dessa proteína no ciclo de vida do T.
cruzi é na fase epimastigota (triatomíneo) (UEHARA et al., 2012) e, é codificada por
um grande número de genes dispostos em tandem, localizado em 2-4 cromossomos
diferentes, em diferentes espécies de trypanosoma e clones (ALVAREZ et al., 2012;
DUSCHAK; COUTO, 2009; NDAO et al., 2014). A maioria dos genes
tripanosomatídeos não contêm introns, codificam um peptídeo sinal, um pró-
peptídeo e uma enzima madura; os resíduos de cisteína formam um bloco de
construção básico de todos os tióis antioxidantes, atuando como um anti-oxidante
direto e também como um precursor para a biossíntese da glutationa, tripanotiona, e
ovotiol . Além disso, a cisteína é também essencial para a síntese de biomoléculas,
incluindo coenzima A, hipotaurina, taurina e os grupos (Ferro-Enxofre), que estão
envolvidos na transferência de elétrons, a regulação redox, fixação de nitrogênio, e
regulação do processo sensorial do parasita (ROMERO et al., 2014). A cruzipaína é
responsável pela viabilidade, infectividade e virulência do patógeno (ALVAREZ et al.,
2012; ROMERO et al., 2014; SAJID et al., 2011). Choy et al. (2013) sugerem que a
diversificação estrutural-funcional transmitida por polimorfismo genético pelos genes
da cruzipaína pode ter contribuído para a adaptação do T. cruzi em hospedeiros
vertebrados. ATWOOD III et al. (2005) identificaram a presença de 30 cisteíno
proteases no proteoma de T.cruzi. Contudo, muitas delas são sintetizadas como
precursoras, ou seja, com um pro-domínio cujas funções incluem atuar como uma
chaperona molecular no dobramento da proteína ou como um inibidor endógeno na
regulação da atividade de proteases.
29
3. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivos analisar a aplicação de fitocistatinas de
Theobroma cacao na detecção de cisteíno proteases em organismo modelo
(Trypanosoma cruzi) e compreender o seu mecanismo de atividade antifúngica em
leveduras de Saccharomyces cerevisiae.
Para atingir tais objetivos, foram instituídas as seguintes metas:
1- Analisar a interação das cistatinas TcCYS3 e TcCYS4 com cisteíno
proteases de Trypanosoma cruzi, na fase epimastigosta, por intermédio de ensaios
de dosagem proteica colorimétrica e zimograma;
2- Investigar a citotoxicidade das cistatinas em TcCYS3 e TcCYS4 em
leveduras de Saccharomyces cerevisiae.
30
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Expressão e purificação das cistatinas recombinantes de Theobroma
cacao
Escherichia coli Rosetta (DE3) contendo os plasmídeos recombinantes (pET
28A com as sequências codantes de cistatinas) foram inoculados em 10 mL de meio
de cultura ―Circle Grow‖ acrescido dos antibióticos cloranfenicol 34 µg mL -1 e
canamicina 50 µg mL -1. A cultura permaneceu sob incubação a 37°C/ 200rpm por
16 horas. Os pré-inóculos foram centrifugados a 5.000 rpm por 10 minutos em
centrifuga eppendorf 5804 R e os precipitados foram ressuspendidos em 2 mL de
meio ―Circle Grow‖ sem antibióticos e inoculados em 200mL de meio de cultura
―Circle Grow‖ com os respectivos antibióticos já citados e mantidos a 37°C sob
agitação de 200rpm. Quando as culturas atingiram a OD600 entre 0,5 – 0,7 a
produção das proteínas foi induzida por 0,8 mmol.L-1 de IPTG (isopropil-β-D-
tiogalactósido) (Fermentas). Após quatro horas de indução a 37° C, sob agitação de
200 rpm, as culturas bacterianas foram centrifugadas a 5000 rpm por 10 min, o
sobrenadante foi descartado, e os precipitados foram estocados a -20° C.
Para a purificação das proteínas recombinantes, os precipitados foram
degelados com 20 mL de tampão de ligação (500 mmol L -1 de NaCl, 20 mmol.L -1 de
Tris-HCl, pH 7,9 e 5 mmol.L -1 de imidazol) acrescido de 100 µL de lisozima 50 mg
mL-1 e incubadas por 30 min a 25° C. Em seguida, a amostra foi sonicada em gelo,
utilizando o processador ultrassônico GEX 130 com sonda de 6 mm de diâmetro, por
10 min em ciclos de 10 s e intervalos de 25 s, à amplitude de 70%. O lisado foi
centrifugado em centrifuga Eppendorf® 5804 R a 5000 rpm por 20 min a 4° C. As
proteínas foram purificadas do extrato bacteriano por cromatografia de afinidade por
metal imobilizado (IMAC) utilizando-se a coluna HisTrap FF crude (GE Healthcare)
ativada com íons Ni2+. Neste processo, as proteínas recombinantes ligaram-se a
resina- Ni2+. As proteínas recombinantes foram eluídas com gradiente de
concentração de imidazol usando-se tampão de eluição (500 mmol.L -1 de NaCl, 20
mmol.L -1 de Tris-HCl, pH 7,9 e 500 mmol.L -1 de imidazol). As cistatinas purificadas
foram então analisadas em SDS-PAGE a 12,5 % e visualizadas após coloração com
Azul de Comassie Coloidal G250 a 0,1% (NEUHOFF et al., 1988).
31
Na etapa seguinte, com a revelação do gel, as amostras proteicas mais
concentradas foram dessalinizadas por diálise, utilizando membrana MWCO 6-8000
(SpectrumLabs), substituindo o tampão de eluição empregado na cromatografia por
tampão Bicarbonato de Sódio 100 mmol.L -1 pH 8,3. As proteínas quantificadas pelo
método de Bradford (1976) e analisadas a 595 nm de absorbância em
espectrômetro de microplacas VersaMax (Molecular Devices), utilizando BSA 0,1
mg/mL (albumina soro bovina) como padrão.
4.2 - Obtenção das proteases da cultura de Trypanosoma cruzi
Formas epimastigotas da cepa Y de T. cruzi foram obtidas através do cultivo
em meio LIT (Liver Infusion Tryptose) (CAMARGO, 1964) a 28°C em estufa
bacteriológica. As cepas foram mantidas através de repiques semanais em meio
suplementado com 15% de soro bovino fetal (SBF). Alíquotas de 10 mL da cultura
de T. cruzi foram transferidas para tubos de polietileno e centrifugadas 5000 rpm por
3 min (centrifuga eppendorf 5804 R). O sobrenadante foi descartado e o precipitado
ressuspendido em 1mL de Tampão Fosfato 100 mmol.L-1, pH 6.0. As amostras
foram sonicadas em gelo, no processador ultrassônico GEX 130 com sonda de 6
mm de diâmetro, por 2 min em ciclos de 5 s e intervalos de 20 s, à amplitude de
50%. O lisado resultante foi centrifugado em minicentrifuga spin (eppendorf) a 14500
rpm por 90 segundos.O sobrenadante foi transferido para novo microtubo. As
proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford (1976).
Vinte e cinco µg de proteínas totais de T. cruzi foram resolvidas em gel SDS-
PAGE a 12,5 % e visualizadas após coloração com Azul de Comassie Coloidal G250
a 0,1% (NEUHOFF et al., 1988).
4.3 – Dosagem proteica colorimétrica da atividade de cisteíno proteases em
extrato de T. cruzi
Alíquotas de 25 microgramas das proteínas totais de T cruzi foram
distribuídas em microtubos de 1,5 mL e então foram adicionadas volumes fixos de
TcCYS3, TcCYS4 com diferentes concentrações molares (5,6; 2,8 e 1,4 mM). A essa
reação adicionou-se o tampão de extração de proteases (Fosfato de Sódio 500
32
mmol.L-1, EDTA 10mmol.L-1 e 2-β-mercaptoetanol 50 mmol.L-1) e o tampão de
reação de cisteino-proteases (Fosfato de Sódio 500 mmol.L-1, EDTA 10mmol.L-1 e 2-
β-mercaptoetanol 50 mmol.L-1) acrescido de 1,2 mmol.L-1 do substrato cromogênico
BApNA (Nα-benzoil-DL-arginina-ρ-nitroanilida) (Fluka). O controle padrão consistiu
de 25 microgramas de proteínas totais de T. cruzi, na presença de tampão de
reação de cisteíno proteases e tampão de extração de proteases. O controle
negativo foi constituído por 25 microgramas de proteínas totais de T. cruzi, na
presença de tampão de extração de proteases. As reações, conduzidas em
quadruplicatas, foram incubadas no escuro, por 30 minutos a 37° C. Após este
período mediu-se o incremento de absorbância a 410 nm. A absorbância das
reações foi monitorada por 3 horas, em intervalos de 15 min, utilizando
espectrômetro de microplacas VersaMax (Molecular Devices), com
acompanhamento pelo software SoftMax Pro 6.3 (Molecular Devices).
O percentual de inibição foi calculado de acordo com a seguinte fórmula:
Pinibitório =
Onde Pinibitório corresponde ao percentual inibitório, Abs final corresponde os
valores de absorbância final. Abs inicial corresponde aos valores da absorbância
inicial e X Abs padrão é a média da absorbância do padrão.
4.4 – Armadilha para capturar cisteíno proteases de T. cruzi
A captura de cisteíno proteases de T. cruzi foi feita utilizando a resina
sefarose CNBr ativada (GE Health Care) conjugada a TcCYS4. A metodologia
constitui-se de cinco etapas, a saber:
A) Preparo da resina sefarose CNBr ativada (GE Health Care)
Pesou-se 0,03g da resina em um microtubo de 1,5 mL e adicionou-se 200 µL
de ácido clorídrico (HCl) 1 mmol.L-1. O material foi centrifugado (minicentrifuga spin a
14500 rpm / 1minuto e o sobrenadante descartado). Essa etapa foi repetida cinco
vezes. Adicionou-se 200 µL de tampão de acoplamento (Tampão Bicarbonato de
Abs final – Abs inicial X 100 _ X Abs padrão
33
Sódio 100 mmol.L-1, pH 8.3), o material foi centrifugado (minicentrifuga spin a 14500
rpm / 1minuto e o sobrenadante descartado).
B) Acoplamento da proteína recombinante (cistatina) na resina
Incubou-se 2 mg de cistatina com 0,03g da resina de sefarose CNBr
hidratada, por 16 horas sob suave agitação. Após esse período, lavou-se o excesso
de ligante com 500 µL de tampão de acoplamento, o material foi centrifugado
(minicentrifuga spin a 14500 rpm por 1minuto) e o sobrenadante descartado. Essa
etapa foi repetida 5 vezes.
Os grupos que não eram de cisteíno protease foram bloqueados com 1 mL
Tris-HCl 0,1 M, pH 8.0, por 2 horas, sob suave agitação. Após esse período foram
feitas lavagens alternadas com 300 µL de tampão acetato (acetato de sódio) 0,1 M
pH 4.0 e 300 µL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8.0. Em cada lavagem, o material era
centrifugado (minicentrifuga spin a 14500 rpm por 1minuto) e o sobrenadante
descartado. As lavagens foram repetidas alternando-se os tampões por cinco vezes.
C) Preparo do Extrato Proteico Total (cultura de T. cruzi)
Já descrito no item 3.2.
D) Captura de Proteases
A resina foi equilibrada com tampão de atividade de proteases (Tampão
Fosfato 500 mmol.L-1 , pH 6.0, EDTA 10 mmol.L-1 e 2-β-mercaptoetanol 50 mmol.L-1)
e incubada por 1hora com o extrato proteico total (cultura de T. cruzi), sob suave
agitação, em temperatura ambiente. Após esse tempo, o material foi centrifugado
(minicentrifuga spin a 14500 rpm por 1minuto) e o sobrenadante descartado. Lavou-
se a resina, três vezes, com 200 µL de tampão de atividade de proteases, depois o
material foi centrifugado (minicentrifuga spin a 14500 rpm por 1minuto) e o
sobrenadante descartado.
E) Eluição
Procedeu-se três eluições de 50 µL com Tampão de Glicina 50 mmol.L-1 pH
2.9, em cada eluição o material era centrifugado (minicentrifuga spin a 14500 rpm
por 1minuto) e o sobrenadante transferido para novo microtubo de 1,5 mL.
Procedeu-se três eluições de 50 µL com Tris-HCl 10 mmol.L-1 , pH 10.7, em cada
34
eluição o material era centrifugado (minicentrifuga spin a 14500 rpm por 1minuto) e o
sobrenadante transferido para novo microtubo de 1,5 mL.
4.5 – Gel Semi-Nativo de Atividade de Proteases com Anfólito
Para este procedimento foi necessário o preparo prévio dos tampões para a
corrida. Tampão Cátodo, 0,009% de hidróxido de sódio (NaOH), desaerado em
banho ultrassônico por 30 minutos. O Tampão Ânodo, 0,7% de ácido fosfórico
(H3PO4). Ambos os tampões foram acondicionados a 4°C até o momento do uso.
O gel semi-nativo, (Água destilada (68,36%); Anfólito 3 – 10 (4,58%);
Acrilamida 30% (24,94%); Persulfato de Amônio 10% (1,17%) e Temed (0,95%).
Uma pré-corrida foi conduzida a 200 V por 15 minutos seguidos de 300 V por 15
min, para distribuir os anfólitos no gel semi-nativo. A amostra aplicada no gel foi a
solução de 25 µL da eluição obtida da captura de proteases, com 0,5 µL de anfólito 3
– 10 2%, mais 1,5 µL de Azul de Bromofenol 0,2% e 3 µL de glicerol 99%) a corrida
foi conduzida a 150 V por 120 minutos (SUTTNAR; DYR, 1989) .
Preparou-se gel de gelatina a 7,5%, contendo 20,12% de Tampão de
Atividade de Protease (Fosfato de Sódio 500 mmol.L-1, EDTA 10mmol.L-1 e 2-β-
mercaptoetanol 50 mmol.L-1); água destilada (q.s.p); Acrilamida 30% (25,15%);
Persulfato de Amônia 10% (0,62%) e Temed (0,094%). Depois de polimerizado, foi
sobreposto no gel semi-nativo e submergidos em Tampão de Atividade de Protease
(Fosfato de Sódio 500 mmol.L-1, EDTA 10mmol.L-1 e 2-β-mercaptoetanol 50 mmol.L-
1) à 37° C por 16 horas sob suave agitação. Após esse tempo, descartou-se o
tampão de atividade, separaram-se os géis e executou-se a coloração do gel de
gelatina com Azul de Comassie Coloidal G250 a 0,1% por 16 horas (NEUHOFF et
al., 1988). Depois desse tempo, foi efetuada a descoloração do gel com água
destilada autoclavada e visualização do halo (Figura 8).
4.6 – Digestão em Solução – Amostra Complexa
As eluições provenientes da Captura de Proteases foram unidas e liofilizadas
no Liofilizador LS3000 Terroni. Adicionou-se 200 µL de Bicarbonato de Amônio
(NH4)2CO3, 50 mmol.L-1 e 200 µL da solução de Uréia (NH2)2CO, a 8M. Procedeu-
35
se, então a redução adicionando-se uma solução de Ditiotreitol (DTT) a 5 mmol.L-1
seguida de incubação por 25 minutos à 56° C. A etapa seguinte foi a alquilação com
a adição da solução de Iodoacetamida (IAA) 14 mmol.L-1, seguida de incubação
durante 30 minutos, em temperatura ambiente e protegido da luz. Após esse tempo,
adicionou-se DTT a 5 mmol.L-1, seguida de incubação por 15 minutos, em
temperatura ambiente e protegido da luz. A amostra foi diluída (1:5) com 1600 µL de
solução de Bicarbonato de Amônio 50 mmol.L-1 e para reduzir a concentração da
Uréia para 1,6 molar. Na mesma amostra, adicionou-se uma solução de Cloreto de
Cálcio (CaCl2) 1mmol.L-1 e 20 µL de tripsina 2,5%, seguida de incubação por 16
horas à 37° C.
No dia seguinte, acrescentou-se Ácido Trifluoracético (CF3COOH) na
concentração final de 0,4% e aferiu-se o pH 6.0, sendo que o pH desejado para o
experimento seria 2.0. Então se adicionou a reação Ácido Fórmico (CH2O2) (0,4%)
para corrigir o pH. A reação foi centrifugada (centrifuga Eppendorf® 5804 R) a 2500
G por 10 minutos, o sobrenadante foi transferido para outro microtubo. Os peptídeos
foram concentrados no concentrador a vácuo (eppendor concentrator 5301), até que
o volume final fosse de 50 µL. Depois a amostra foi centrifugada no Minispin
eppendorf durante 10 minutos a 14500 rpm e 20 µL foram injetados no
Espectrômetro de Massas MS/MS Q-TOF.
4.7 – Análise da Citotoxicidade de TcCYS3 e TcCYS4 em ensaios com
leveduras mutantes de Saccharamyces cerevisiae
4.7.1 – Ensaio semi-quantitativo n° 1
Para este ensaio testou-se a linhagem isogênica da selvagem Y10000 S.
cerevisiae, em fase logarítmica (LOG).
A linhagem Y10000 foi inoculada em erlenmeyer de 250 mL contendo 15 mL
de meio YEL liquido (1% de Extrato de Levedura, 2% de D-Glucose, 2% de Peptona
de Carne e água destilada q.s.p) mantida na temperatura de 30° C, sob agitação de
100 rpm por 14 horas. Após esse período, a cultura foi transferida para tubo de
polietileno, centrifugada 5000 rpm por 2 minutos e o sobrenadante descartado.
Adicionou-se 4 mL de Solução Salina 0,9% (NaCl), seguida de vortéx e
centrifugação 5000 rpm por 2 minutos, esta etapa foi executada 2 vezes. Por fim,
36
foram adicionados 4 mL de Tampão Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) 100 mmol.L-1,
pH 8.3, seguido de vortéx e centrifugação 5000 rpm por 2 minutos e o sobrenadante
descartado. O precipitado foi resuspendido com 4 mL de Tampão Bicarbonato de
Sódio 100 mmol.L-1, pH 8.3. Foi efetuada a leitura de densidade óptica OD660 nm no
espectrômetro V-1600 Spectrophotometer - Pró-Análise, para averiguar a densidade
de células haplóides da levedura, que deveria estar entre 1,0 – 2,0 x 107. Em
seguida, a cultura foi diluída (diluições seriadas 1:10), plaqueada em meio sólido
YPD (1% de Extrato de Levedura, 2% de D-Glucose, 2% de Peptona de Carne, 2%
de Agar Agar e água destilada q.s.p) e incubadas à 30° C por 72h (RUHLAND et al.,
1981) . Nesse primeiro teste em gota, as cistatinas foram testadas em diferentes
concentrações: 3 µg, 6 µg e 12 µg, nos pontos de 0, 1, 3, 6 e 10 horas de contato
com a levedura (Y10000), a cada tempo, novas diluições eram feitas a partir do
segundo tubo. Experimento foi executado em triplicata.
100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µLA)
B)
2 3 4 5 6
1
Figura 3: Representação esquemática do Ensaio semi-quantitativo. A)
Demonstra a diluição seriada (1:10) das amostras sendo que no primeiro tubo está a
levedura não diluída, em meio YPD, e alíquotas de 100 µL são transferidos,
sucessivamente, sendo que nos tubos 2-6 , a levedura é diluída e exposta a
cistatina de Theobroma cacao, em Tampão de Bicarbonato de Sódio 100 mmol.L-1
contêm Tampão Bicarbonato de Sódio 100 mmol.L-1. B) Esquema de aplicação da
diluição seriada na placa de Petri com meio YPD sólido.
37
4.7.2 – Ensaio semi-quantitativo n° 2
A metodologia foi a mesma descrita no item 3.7.1. Entretanto, este teste foi
executado com as seguintes linhagens de S. cerevisiae Y10000 (linhagem selvagem
isogênica utilizada como controle), yor1Δ (linhagem mutante com deficiência em
transporte de membrana), xrs2Δ, rad1Δ, rev1Δ (linhagens mutantes com deficiência
nos mecanismos de reparo de DNA), WTS (Selvagem isogênica), sod1Δ, sod2Δ,
ctt1Δ e cta1Δ (linhagens deficientes em detoxificação de estresse oxidativo). Os
testes foram realizados com as cistatinas TcCYS3 e TcCYS4 na concentração de 12
µg/µL. O ponto de aplicação na placa foi o de três horas de contato entre levedura e
inibidor.
4.7.3 – Curva de Sobrevivência
As linhagens usadas neste trabalho foram leveduras isogênicas da selvagem
(Y10000) (como controle negativo) de S. cerevisiae BY10000 (EUROSCARF) e seus
respectivos mutantes em reparo de DNA: xrs2Δ, rad52Δ, rad53Δ, rev1Δ, rev3Δ.
As leveduras foram inoculadas em erlenmeyers de 250 mL contendo
15 mL de meio YEL liquido (1% de Extrato de Levedura, 2% de D-Glucose, 2% de
Peptona de Carne e água destilada q.s.p) mantidas na temperatura de 30° C, sob
agitação de 100 rpm por 14 horas. Após esse período, as culturas foram transferidas
para tubo de polietileno, centrifugadas 5000 rpm por 2 minutos e o sobrenadante
descartado. Adicionou-se 4 mL de Solução Salina 0,9% (NaCl), seguida de vortéx e
centrifugação 5000 rpm por 2 minutos, esta etapa foi executada duas vezes. Por fim,
foram adicionados 4 mL de Tampão Bicarbonato de Sódio 100 mmol.L-1, pH 8.3,
seguido de vortéx e centrifugação 5000 rpm por 2 minutos e o sobrenadante
descartado. O precipitado foi resuspendido com 4 mL de Tampão Bicarbonato de
Sódio 100 mmol.L-1, pH 8.3. Efetuou-se a leitura de densidade óptica OD660 nm no
espectrômetro V-1600 Spectrophotometer - Pró-Análise, para averiguar a densidade
de células haplóides das leveduras, que deveriam estar entre 1,0 – 2,0 x 107 cels/
mL. Em seguida, as culturas foram diluídas em microtubos, sendo que o primeiro
microtubo continha Tampão Bicarbonato de Sódio 100 mmol.L-1, pH 8.3 e cistatina
de T. cacao na concentração de 6µg /µL e os demais microtubos continham somente
38
Tampão Bicarbonato de Sódio 100 mmol.L-1, pH 8.3 (diluições seriadas 1:10) da
última diluição retirou-se uma alíquota de 100 µL e aplicou-se na placa de Petri com
meio YPD sólido (1% de Extrato de Levedura, 2% de D-Glucose, 2% de Peptona de
Carne, 2% de Agar Agar e água destilada q.s.p) e com a ajuda de esferas de vidro
fez-se o espalhamento das células. O experimento foi executado em triplicata (três
placas), as placas foram incubas à 30° C, por 72 horas. Depois desse tempo
procedeu-se a contagem das colônias (a partir das células viáveis), calculada a
fração de sobrevivência de cada linhagem em relação à dose zero e expressa sob a
forma de percentagem (N/ N0 x 100).
0,1 mL
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL
0,1 mL
10⁷ 10⁶ 10⁵ 10⁴ 103
Figura 4: Representação esquemática da Curva de sobrevivência. Demonstra a
diluição seriada (1:10) das amostras sendo que no primeiro tubo está a levedura não
diluída, em meio YEL, e alíquotas de 100µL são transferidos, sucessivamente, sendo
que nos tubos 2-6 , a levedura é diluída e exposta a cistatina de Theobroma cacao,
em Tampão de Bicarbonato de Sódio 100 mmol.L-1 contêm Tampão Bicarbonato de
Sódio 100 mmol.L-1. Da última diluição (103) aplica-se 0,1 mL na placa de Petri com
meio YPD sólido.
39
Tabela 1: As estirpes de leveduras utilizadas.
Estirpe Genótipo Proteína ausente Fonte
BY4741 Matα; his3Δ 1; leu2Δ 0; met15Δ 0; ura3Δ0
Nenhuma. EUROSCARF
rad1Δ Como BY4741, exceto rad1Δ:: KanMx4 Endonuclease de DNA de cadeia simples (com Rad 10p).
EUROSCARF
xrs2Δ Como BY4741, exceto xrs2Δ:: KanMx4 Proteína envolvida em reparo de DNA; Componente do complexo Mre 11.
EUROSCARF
rad52Δ Como BY4741, exceto rad52Δ:: KanMx4
Proteína que estimula a permuta das fitas, facilitando a ligação de Rad51p ao DNA de fita simples.
EUROSCARF
rad53Δ Como BY4741, exceto rad53Δ:: KanMx4
Proteína quinase, requerida para deter o ciclo celular em resposta a algum dano no DNA.
EUROSCARF
rev1Δ Como BY4741, exceto rev1Δ:: KanMx4 Deoxicitidina transferase; envolvida no reparo de sítios abásicos e aduzidos por guaninas no DNA danificado pela síntese translesão.
EUROSCARF
rev3Δ Como BY4741, exceto rev3Δ:: KanMx4 Sub-unidade catalítica do DNA polimerase zeta, envolvida na síntese de translesão durante o reparo de pós-replicação; necessária para a mutagênese induzida por dano ao DNA.
EUROSCARF
yor1Δ Como BY4741, exceto yor1Δ:: KanMx4 Transportadora via proteína plasmática de ligação ao ATP; transportadora de múltiplas drogas; medeia a exportação de muitos ânions orgânicos diferentes.
EUROSCARF
sod1Δ Como SOD+, exceto sod1Δ: TRP1 S superoxido dismutase. E.B.Gralla, Los Angeles
sod2Δ Como SOD+, exceto sod2Δ: TRP1 Mn superoxido dismutase. E.B.Gralla, Los Angeles
ctt1Δ Como SOD+, exceto ctt1Δ: TRP1 Catalase T citosólica. E.B.Gralla, Los Angeles
cta1Δ Como SOD+, exceto cta1Δ: TRP1 Catalase A presente na matriz peroxissomal. E.B.Gralla, Los Angeles
40
4.8- Análise estatística
Realizou-se análise estatística de variância (ANOVA) e fez-se teste de médias
(Turkey, p< 0,1 e p< 0,05) para os ensaios de cinética inibitória das cistatinas
TcCYS3 e TcCYS4 com n=3.
41
5. RESULTADOS
5.1 – Análise das cistatinas de T. cacao purificadas
As proteínas purificadas por cromatografia de afinidade foram analisadas por
SDS-PAGE a 12,5%. Comparadas ao padrão de massa molecular, as proteínas
purificadas TcCYS3 e TcCYS4 apresentaram com a cauda de histidina,
aproximadamente, 14 kDa e 24 kDa, respectivamente. A quantificação proteica de
TcCYS3 foi de 0,734 mg/ mL e TcCYS4 foi de 5,017 mg/ mL, pelo método de
Bradford (1976).
97
66
45
30
20.1
14.4
kDa M TcCYS3 TcCYS4
Figura 5: Análise em SDS-PAGE a 12,5% das cistatinas recombinantes
TcCYS3 e TcCYS4 - Onde M é o marcador de peso molecular LWM (GE Health
Care). TcCYS3 e TcCYS4 foram purificadas da fração solúvel do extrato bacteriano
de E. coli.
42
5.2 – Perfil proteico do extrato total de Trypanosoma cruzi
A análise do perfil proteico das proteínas totais de T. cruzi foi conduzida em
gel de poliacrilamida a 12,5% sendo que as proteínas foram visualizadas após
coloração com Azul de Comassie Coloidal. As amostras proteicas foram extraídas de
culturas de T. cruzi, linhagem Y, na fase epimastigota, pois nesta fase o parasita
está na sua forma não infectante. A análise do perfil proteico demonstrou que as
amostras de proteínas totais isoladas de T. cruzi, são compostas por proteínas
distribuídas entre 97 e 14 kDa. Foi observada uma maior concentração de proteínas
na faixa dos 66 kDa (Figura 6). A quantificação proteica do extrato total de T. cruzi,
pelo método de Bradford (1976), foi de 1mg/ mL.
Figura 6: Perfil proteico de proteínas totais deT. Cruzi – 25 microgramas de proteínas
totais de T. cruzi foram separadas em gel SDS-PAGE a 12,5%. As proteínas foram
visualizadas após coloração com Azul de Comassie Coloidal. M- Marcador de Peso
Molecular em KDa (GE Health Care).
43
5.3- Inibição da atividade de proteases de T. cruzi por cistatinas de T. cacao
A capacidade de cistatinas de cacau de inibir a atividade de cisteíno
proteases de T cruzi foi primeiramente avaliada via ensaios colorimétricos utilizando
o BapNa como substrato. Nestes experimentos, quantidades semelhantes de
proteínas de T cruzi foram homogeneizadas individualmente com duas cistatinas de
T. cacao. As amostras foram lidas em intervalos de 15 minutos por um período de 3
horas. O resultado demonstrou que ambas cistatinas conseguem inibir a atividade
de cisteíno proteases do parasita. A maior inibição foi de 53,77% da cistatina
TcCYS4 na concentração de 5,6 mM.
A proteína TcCYS3 apresentou comportamento diferenciado durante o ensaio
colorimétrico de cinética. Nota-se uma inibição de 20,20% até o tempo de 45
minutos nas concentrações de 5,6 e 1,4 mM.
0
10
20
30
40
50
60
70
30 45
Ati
vid
ad
e I
nib
itó
ria
(%
)
Tempo (minutos)
Padrão
TcCYS3 5,6mM
TcCYS4 5,6mM
TcCYS3 1,4mM
TcCYS4 1,4mM
Figura 7: Inibição da atividade de proteases de T. cruzi por cistatinas de T. cacao – Perfil
inibitório de TcCYS3 e TcCYS4 em Trypanosoma cruzi. A proteína TcCYS4 apresentou melhor
poder de inibição do que a TcCYS3. As barras verticais pretas correspondem aos desvios
padrões das médias (n=3).
44
5.4 – Captura de proteases de T cruzi utilizando armadilha TcCYS4:Sepharose
Figura 8: Atividade de proteases de T. cruzi capturadas com armadilha
TcCYS4:sepharose CNBr. As proteínas capturadas com a armadilha de CYS-Sepharose
foram separadas em gel de acrilamida semi-nativo contendo anfólitos de 3-10. Foto do gel
de gelatina de sobreposição após coloração com Azul de Comassie Coloidal. Setas indicam
isoformas de proteases de T. cruzi capturadas com a armadilha no gel semi-nativo, pode-se
visualizar o halo formado pela degradação das proteases de T. cruzi na gelatina.
Uma armadilha de sepharose CNBr ligada a TcCYS4 foi utilizada com o
objetivo de capturar cisteíno proteases de extrato total de T. cruzi. Duas eluições da
captura foram separadas em gel semi-nativo de acrilamida a 24,9% contendo
anfólitos de 3 a 10. Com essa metodologia foi possível visualizar o aparecimento de
2 halos de atividade no gel de gelatina utilizado na sobreposição, como produto da
pI 3
10
45
degradação da gelatina por proteases. Essas proteases apresentam ponto
isoelétrico entre 7 – 10.
5.5 – Análise no Espectrômetro de Massas
A amostra concentrada obtida da digestão triplica em solução (Amostra
Complexa) foi analisada no Espectrômetro de Massas MS/MS Q-TOF e o resultado
se prevaleceu na identificação de 21 peptídeos. Não foi possível encontrar
sequências homologas de cisteíno proteases aos peptídeos no programa Mascot
(Matrix Science).
TABELA 2: Peptídeos identificados por Espectrometria de Massas após
digestão triplica. A análise da espectrometria de massas das amostras foi realizada
pelo programa Mascot.
Sequência dos peptídeos Peso (kea) pI (ponto isoelétrico)
(R)DTHKSEIAHR(F) 69,248 5,7574
(R)FKDLGEEHFK(G)
(K)TCVADESHAGCEK(S)
(K)SLHTLFGDELCK(V)
(K)IETMREK(V)
(R)ALKAWSVAR(L)
(K)AEFVEVTKLVTDLTK(V)
(K)YICDNQDTISSK(L)
(K)LKECCDKPLLEK(S)
(K)DAFLGSFLYEYSR(R)
(R)RHPEYAVSVLLR(L)
(K)HLVDEPQNLIK(Q)
(K)LGEYGFQNALIVR(Y)
(R)KVPQVSTPTLVEVSR(S)
(R)MPCTEDYLSLILNR(L)
(K)TPVSEKVTK(C)
(K)CCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPK(A)
(R)RPCFSALTPDETYVPK(A)
(K)AFDEKLFTFHADICTLPDTEK(Q)
(K)KQTALVELLK(H)
(K)QTALVELLK(H)
46
5.6 - Análise da Citotoxicidade das cistatinas de Theobroma cacao em
Saccharomyces cerevisiae
Foi avaliado o efeito das fitocistatinas TcCYS3 e TcCYS4 de T. cacao usando
leveduras mutantes S. cerevisiae com deficiência na síntese de antioxidantes
endógenos, enzimas de reparo de DNA e constituintes de membrana, como células
modelo para encontrar possíveis alvos que poderiam indicar o mecanismo de ação
antifúngica das fitocistatinas. Foi empregado um conjunto de 13 leveduras mutantes,
sendo que 06 estão relacionadas em mecanismo de reparo de DNA, 01 está
envolvida em mecanismo de transporte, 04 com estresse oxidativo e 02 são
isogênicas da selvagem.
5.6.1 – Ensaios de Sensibilidade de leveduras Saccharomyces cerevisiae com
TcCYS3 e TcCYS4
Figura 9: Ensaio semi-quantitativo. As linhas correspondem a diluição seriada após o
tratamento de Y10000 (5 µL de cada diluição (1:10) foi inoculado) com TcCYS3 e TcCYS4
nas concentrações de 6 µg/µL e 12 µg/µL no intervalo de 0, 1, 3, 6,10, 24 e 48 horas.
Y10000
47
Esse teste foi feito para identificar qual concentração de TcCYS3 e TcCYS4
demonstrariam maior toxicidade ou seriam letais para a linhagem selvagem. Os teste
de viabilidade foram realizados em condições controle e de estresse (diferentes
concentrações de TcCYS3 e TcCYS4 em contato com a levedura em diferentes
intervalos) usando a linhagem Y10000 e foi analisada pela capacidade de formação
de colônias nas diferentes diluições.
O resultado indica que após 72 h à 30° C, o controle (sem estresse, 0% de
TcCYS3 e 0% de TcCYS4) apresentou crescimento em todas as diluições. Na
concentração de 6 µg/µL, a partir do tempo de 6 horas de exposição à TcCYS3,
nota-se uma diminuição na quantidade de colônias, com 10 horas a sensibilidade da
linhagem aumenta, e com 24 e 48 horas de exposição não se observa formação de
colônias nas diluições de 105, 104 e 103. Ao dobrar a concentração de TcCYS3 e
TcCYS4 (12 µg/µL) foi possível notar a diminuição da formação de colônias com 3
horas de contato entre o inibidor e a linhagem, no tempo de 24 e 48 horas de
contato não se detectou formação de colônias nas diluições de 106, 105, 104 e 103.
A partir desses resultados foi possível testar a sensibilidade de diferentes
leveduras mutantes em contato com TcCYS3 e TcCYS4 na concentração de 12 µg/
µL no tempo de 3h para avaliar uma possível interação das fitocistatinas com as
diferentes vias metabólicas nas leveduras de S. cerevisiae.
48
5.6.2- Teste de sensibilidade de leveduras com diferentes leveduras mutantes
com TcCYS3 e TcCYS4 na concentração de 12 µg/µL.
Tratamento com TcCYS3 12µg/ 3h
Selvagem
Isogênica
Transporte de
Membrana
Controle
106 105 104 103 106 105 104 103Linhagens
Y 10000
yor1Δ
xrs2 Δ
rad1Δ
rev1Δ
WTS
sod1Δ
sod2 Δ
ctt1 Δ
cta1 Δ
Reparo
de D
NA
Selvagem
Isogênica
A fitocistatina de T. cacao TcCYS3 na concentração de 12 µg/µL foi testada
com diferentes linhagens de leveduras mutantes para determinar por qual via
metabólica ocorreria a atividade biológica de inibição das ficistatinas quando em
contato com as leveduras por 3 horas. Uma vez que estudos anteriores apontaram
que as cistatinas atuariam via Reticulo Endoplasmático e Complexo de Golgi na
inibição fúngica (LIMA et al., 2014; NISSEN et al., 2009). Na figura, é possível
visualizar o controle negativo das mutantes (sem TcCYS3) e a direita observou-se
um aumento da sensibilidade nas linhagens mutantes com deficiência em reparo de
DNA (xrs2Δ, rad1Δ e rev1Δ), nas diluições de 104 e 103 quando comparadas ao
Figura 10: Teste de sensibilidade com diferentes leveduras mutantes em contato com
TcCYS3 na concentração de 12 µg/µL por 3 horas. As colônias à esquerda são o
controle negativo, ou seja, não foram expostas à fitocistatina. Na foto é possível observar a
diminuição do crescimento nas leveduras mutantes em reparo de DNA (xrs2Δ, rad1Δ,
rev1Δ).
Estresse Oxidativo
49
controle negativo. O mesmo teste foi aplicado com TcCYS4, na mesma dosagem de
concentração e tempo (Figura 11).
B)
Linhagens
Y 10000
yor1Δ
xrs 2 Δ
rad 1Δ
rev 1 Δ
WTS
sod 1Δ
sod 2 Δ
ctt 1 Δ
cta 1 Δ
Re
pa
ro
de
DN
A
Estr
esse
Oxid
ativo
Transporte de Membrana
Selvagem
Selvagem
106 105 104 103 106 105 104 103
Controle Tratamento com TcCYS4 12µg/ 3h
A fitocistatina de T. cacao TcCYS4 foi testada na concentração de 12 µg/µL
com diferentes linhagens de leveduras mutantes para determinar por qual via
metabólica ocorreria a atividade biológica de inibição. A esquerda da figura está o
controle negativo (sem TcCYS4), e a direita estão as mesmas leveduras que foram
exposta a proteína TcCYS4 por 3 horas e aplicadas na placa por diluição seriada.
Após 72h à 30° C, verificou-se que TcCYS4 demonstrou poder de inibição, também,
nas leveduras mutantes com deficiência em reparo de DNA, principalmente, em
rev1Δ.
Figura 11: Teste de sensibilidade com diferentes leveduras mutantes em contato com
TcCYS4 na concentração de 12 µg/µL por 3 horas. As colônias à esquerda são o controle
negativo, ou seja, não foram expostas a fitocistatina. Na foto é possível observar a
sensibilidade das leveduras mutantes em reparo de DNA (xrs2Δ, rad1Δ, rev1Δ) na presença
de TcCYS4.
50
Com os dados obtidos, o próximo experimento foi determinar a curva de
sensibilidade dos mutantes para exposição à 6µg/µL de TcCYS3 e, também, de
TcCYS4 na mesma concentração.
5.6.3- Curva de Sobrevivência
10
100
0 6 12 24
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
TcCYS3 [6 µg/µL] (hora)
Y10000
xrs2Δ
rad52Δ
rad53Δ
Por intermédio dos testes de crescimento foi possível estabelecer e
determinar a taxa e o perfil de crescimentos em condições laboratoriais. Foram
efetuadas curvas de sensibilidade das leveduras mutantes Y10000, xrs2Δ, rad52Δ e
rad53Δ. Foi analisado e comparado o perfil de sobrevivência dos mutantes em
contato com TcCYS3. A linhagem mutante rad52Δ apresenta a mesma sensibilidade
quando comparada à linhagem selvagem, sendo rad52Δ um pouco mais sensível e
xrs2Δ a linhagem mais sensível.
Figura 12: Curva de sensibilidade das leveduras mutantes em exposição à 6 µg/µL
TcCYS3, no intervalo de tempo de 0, 6, 12 e 24 horas. No gráfico observa-se a
redução do crescimento celular em xrs2Δ e rad53Δ quando expostas a TcCYS3.
51
10
100
0 6 12 24
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
TcCYS4 [6 µg/µL] (hora)
Y10000
rev1Δ
rev3Δ
Foram efetuadas curvas de sensibilidade das leveduras mutantes Y10000,
rev1Δ e rev3Δ. Foi analisado e comparado o perfil de sobrevivência dos mutantes
em contato com TcCYS4. Quando expostas à TcCYS4, as linhagens mutantes
rev1Δ e rev3Δ demonstraram sensibilidade semelhante à selvagem após 24 horas
de exposição, sendo a linhagem rev1Δ ligeiramente mais sensível em exposição
aguda (até 12 horas).
Figura 13: Curva de sensibilidade dos mutantes e Y10000 em exposição à 6 µg/µL
cistatina de Theobroma cacao (TcCYS4), no intervalo de tempo de 0, 6, 12 e 24
horas. Nota-se, no gráfico, uma diminuição da viabilidade celular de rev1Δ e rev3Δ
quando expostas à TcCYS4.
52
6. DISCUSSÃO
Nesse trabalho foi efetuada a análise do poder inibitório de duas cistatinas de
Theobroma cacao em cisteíno proteases de Trypanosoma cruzi, na fase
epimastigota, e investigação de possíveis vias metabólicas de atuação das proteínas
utilizando ensaios com linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae.
Pirovani et al. (2010) produziram os clones de expressão das fitocistatinas
recombinantes de T. cacao (TcCYS1, TcCYS2,TcCYS3 e TcCYS4) em Escherichia
coli. As sequências codantes dessas proteínas foram isoladas, a partir de bibliotecas
de cDNA da interação Theobroma cacao – Moniliophthora perniciosa produzidas por
Gesteira et al.(2007). No corrente projeto foram testadas a atividade de inibição de
cisteíno proteases de T. cruzi de duas fitocistatinas de cacau TcCYS3 e TcCYS4, as
mesmas foram selecionadas por apresentarem diferenças estruturais. TcCYS3
apresenta elevada similaridade com TcCYS1 (96%) e TcCYS4 com TcCYS2 (88%).
Sendo assim, TcCYS3 e TcCYS4 são, dentre as quatro cistatinas de cacau isoladas,
as duas mais divergentes. Dentre as diferenças observadas cabe ressaltar a
ausência de peptídeo sinal em TcCYS4 e a falta da região carboxi-terminal
estendida em TcCYS3 (PIROVANI et al., 2010).
As fitocistatinas, como as de T. cacao, são proteínas inibidoras de cisteíno
proteases, e, em plantas, já foi demonstrada que a mesma tem atividade antifúngica
(Pirovani et al., 2010). Neste trabalho, testamos o poder de cistinas de cacau inibir a
atividade de proteases de outro patógeno que não o M. perniciosa, in vitro. O
organismo eleito para os experimentos foi o T. cruzi, agente etiológico da doença de
Chagas. Todo o trabalho foi feito com o protozoário na fase epimastigota, em que o
parasita está em sua forma não infectante (NDAO et al., 2014; PEREZ-MORALES et
al., 2012). Já foi demonstrado, que nesta fase do ciclo de vida do T. cruzi, existe um
perfil proteico complexo com a presença de grande quantidade de cisteino-proteases
(YAVAD et al., 2011; DUSCHAK; COUTO, 2007). Corroborando com esses estudos
a análise do perfil proteico do Trypanosoma cruzi revelou proteínas distribuídas na
faixa entre 97 – 14 kDa. PARODI – TALICE et al. (2004) analisaram o proteoma do
T. cruzi e observaram uma distribuição de proteínas do patógeno, em gel 2D, entre
97 – 14 kDa.
53
Importantes enzimas do T. cruzi têm sido identificadas, purificadas e
caracterizadas. Dentre elas cisteíno proteases, metalo proteases e serino proteases
(BOYSEN et al., 2013; LEE et al., 2012). Nesses protozoários, particularmente, as
proteases são responsáveis pela imunoevasão, ativação enzimática, invasão
tecidual e celular, incubação e desenvolvimento (CAFFREY; STEVERDING, 2009;
RODRIGUES et al., 2010). Sendo assim, estudá-las passa a ser importante não
apenas para a compreensão das bases moleculares do ciclo de vida do patógeno
como também para propor novos alvos terapêuticos para o seu controle. De fato, foi
observada uma elevada atividade de cisteíno proteases no extrato total de T. cruzi
(Figura 7). A observação que ambas cistatinas de cacau testadas conseguiram
diminuir em aproximadamente 29% a atividade dessas proteases, em ensaios
conduzidos in vitro, corroborou com ensaios realizados com outras fitocistatinas
(POPOVIC et al., 2013; HAQ et al.,2004).
O ensaio de dosagem proteica colorimétrica utilizando BapNa por substrato
revelou que a cistatina TcCYS4 (5,6 mM) inibiu a atividade das proteases
tripanosomíticas melhor do que TcCYS3 (5,6 mM). Essa observação pode decorrer
do fato de TcCYS4 não apresentar peptídeo sinal e TcCYS3 não apresentar a região
C-terminal estendida (PIROVANI et al., 2010). TcCYS3 é proveniente de um
processamento alternativo de TcCYS1 (PIROVANI et al., 2010). Em outras cistatinas
esse processamento foi relacionado a presença de uma mutação no resíduo de
glicina no motivo principal da fitocistatina, ocasionando uma fraca inibição das
cisteíno proteases (KOIWA et al., 2001; MARTINEZ et al., 2009; YADAV et al.,
2011).
Com base no resultado do ensaio colorimétrico, onde TcCYS4 apresentou um
potencial inibitório maior do que TcCYS3, selecionou-se TcCYS4 para ser ligada a
uma resina de Sepharose-CNBr visando capturar cisteíno proteases de T. cruzi.
Esta técnica já havia sido descrita por Pirovani et al. (2010) em estudos realizados
com M. perniciosa. Um zimograma feito com as eluições do ensaio comprovou que
a armadilha foi eficiente em capturar proteases de T. cruzi (Figura 8).
Os halos observados no gel indicam que as proteases de T. cruzi que
interagem com TcCYS4 se encontram na faixa de pI 7 – 10, ou seja, apresentam pH
básico. Parodi-Talice et al. (2004) realizaram uma análise proteômica de T. cruzi por
gel 2D e espectrômetro de massas, onde detectaram a presença de cisteíno
54
proteases precursoras de pI 7.6. YADAV et al. (2011) analisaram as cisteíno
proteases de Trypanosoma evansi usando zimograma, onde detectaram proteínas
que atuam em pH 3.0 - 5.5 e em pH tão alto quanto pH 8.0, assim como catepsinas
B e H que podem exibir considerável atividade até o pH 8.0.
As eluições obtidas com a armadilha para captura de proteases passaram por
digestão triplica e analisadas em espectrômetro de massas. O resultado foi a
detecção de 21 peptídeos. Contudo, nenhum desses apresentou homologia com
sequências de cisteíno protease depositada no Mascot 2.3 (Matéria Ciência). Uma
possível explicação para este fato é que a sequência do genoma do T. cruzi não
está disponível em bancos de dados públicos (ncbi, swissprot, entre outros). O halo
visto no gel pode ser referente a uma protease ainda não identificada no genoma do
Trypanosoma cruzi, esse resultado sugere, também, que a protease identificada no
gel de gelatina não se reporta a cruzipaína que é sabidamente a mais abundante
cisteíno protease do parasita (ALVAREZ et al., 2012; DOYLE et al., 2011; LEE et al.,
2012;). Além disso, (IRENE et al., 2012) observaram que embora as cistatinas
possam inibir fortemente as cisteíno proteases, os três circuitos inibitórios da
chagasin mostram baixa homologia de sequência com outras cistatinas.
Avaliou-se, também, a atividade antifúngica das fitocistatinas de T. cacao em
leveduras de S. cerevisiae. TcCYS3 e TcCYS4 foram testadas, inicialmente, em
diferentes concentrações (6 µg/µL e 12 µg/µL) com a linhagem isogênica da
selvagem Y10000, no intervalo de 0,1,3,6,10,24 e 48h de contato entre a levedura e
o inibidor para avaliar qual a concentração e tempo de contato entre fitocistatina e
levedura era necessário para induzir sensibilidade. O resultado revelou que na
concentração de 12 µg/µL por três horas ocorria uma inibição do crescimento da
levedura mutante. A partir desse resultado testaram-se os inibidores com diferentes
leveduras mutantes envolvidas em diversas funções celulares (Tabela 1), para
identificar uma possível via metabólica de atuação dos inibidores. O resultado
mostrou que as fitocistatinas apresentaram citotoxicidade diferenciada nas leveduras
mutantes em reparo de DNA (xrs2Δ, rad52Δ, rad53Δ, rev1Δ, rev3 Δ), sendo que
xrs2Δ demonstrou sensibilidade maior à TcCYS3, e rev1Δ para TcCYS4 . Devido a
esse grau de sensibilidade, esses resultados sugerem que TcCYS3 e TcCYS4
contêm uma ou mais substâncias que interagem com o DNA individualmente ou
simultaneamente por rotas distintas, considerando que a via de reparo não seja
específica (SAITO et al., 2012). É sabido que cistatinas apresentam
55
fitopatogenicidade contra fungos e bactérias e regulam o mecanismo de morte
celular programada (LIMA et al., 2014; MARGIS-PINHEIRO et al., 2008; POPOVIC
et al., 2013; SOLOMON et al., 1999).
Popovic et al. (2012) analisaram in vitro e in vivo as propriedades antifúngicas
de fitocistatinas em kiwi (Actinidia deliciosa). O grupo sugeriu algumas possibilidades
para a atividade antifúngica das cistatinas: presença de peptídeo sinal e região
carboxi; e o fato de prevenir o desenvolvimento da parede celular do fungo afetando
a síntese de quitina (polissacarídeo componente da parede celular de fungos e do
exoesqueleto de artrópodes). VALDES-RODRIGUES et al. (2010) observaram que a
atividade antifúngica das fitocistatinas não está relacionada com o mecanismo
inibitório entre cistatinas e cisteíno proteases. Contudo, o mecanismo de interação
das fitocistatinas em leveduras requer mais estudos, uma vez que foi observado um
envolvimento com diferentes vias de reparo de DNA decorrente de danos
específicos provocados no DNA pelas diferentes fitocistatinas.
56
7. CONCLUSÃO
O presente projeto analisou o poder de inibição e atividade citotóxica de duas
fitocistatinas de T. cacao com características especiais, TcCYS3 (sem região C-
terminal estendida) e TcCYS4 (sem peptídeo sinal), ambas apresentaram potencial
de inibição contra as cisteíno proteases de T.cruzi, sendo que nas condições
testadas, TcCYS4 apresentou maior poder inibitório. Pode-se concluir, também, que
é possível capturar proteases de T. cruzi com a armadilha de resina de sepharose
CNBr ligada a TcCYS4.
Verificou-se, com os testes de citotoxicidade que as fitocistatinas de T. cacao
apresentaram uma inibição contra as leveduras mutantes de S. cerevisiae com
função em reparo de DNA. O que sugere ser esta uma possível rota de atuação das
cistatinas na inibição fúngica.
57
8. PERSPECTIVAS
Como perspectivas, análises da inibição das fitocistatinas no desenvolvimento
do parasita, na fase epimastigota, in vitro, bem como estudos a cerca da sua
atividade biológica em leveduras S. cerevisiae, para salientar as cistatinas de T.
cacao como uma promissora ferramenta biotecnológica.
58
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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