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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

Estudo da atividade citotóxica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona

Juliana Bagatini Klein

Itajaí, 2012

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

Juliana Bagatini Klein


Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Profa Dra Nara Lins M. Quintão Co-orientador: Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas

Itajaí, julho de 2012

FICHA CATALOGRÁFICA

K672e

Klein, Juliana Bagatini, 1984-

Estudo da atividade citotóxica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-

ona [Manuscrito] / Juliana Bagatini Klein. – 2012.

111 f. : il. Color.

Cópia de computador (Printout(s)).

Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Programa de Mestrado

em Ciências Farmacêuticas Área de Concentração em Produtos naturais e Substâncias

Sintéticas Bioativas 2012.

“Orientadora: Profª. Drª Nara Lins M. Quintão ;

Co-orientador: Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas ”.

Bibliografia: f. 96-108.

1. Produtos naturais. 2. Câncer - tratamento. 3. Farmacologia -

plantas medicinais. I. Quintão, Nara M. II. Freitas, Rilton Alves

de. III. Título.

CDU: 615.03

Claudia Bittencourt Berlim CRB 14-964


Juliana Bagatini Klein 07/2012

Orientador: Nara Lins M. Quintão, Dra. Co-orientador: Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas, Dr. Número de Páginas: 118 Os cânceres de pele são os mais frequentes no Brasil e correspondem, em média, a 25% de todos os tumores malignos registrados. Destes, o melanoma representa não menos que 5% e é caracterizado por seu alto poder metastático. O desenvolvimento de fármacos antineoplásicos a partir de produtos naturais é considerado fundamental para a farmacologia. O interesse pelo desenvolvimento de agentes quimioterápicos mais eficazes vem crescendo a cada ano. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antineoplásica da substância isolada de Vernonia scorpioides (Lam) Pers o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona. Para avaliar a atividade citotóxica da substância foram utilizados os corantes vitais MTT em células de melanoma murino B16F10, e o corante XTT para as células leucêmicas, tumores sólidos e CMNH (células mononucleares normais humanas). Os padrões de morte celular foram estabelecidos por microscopia de fluorescência, utilizando os corantes brometo de etídeo, diacetato de fluoresceína e alaranjado de acridina. A atividade da enzima caspase 3 foi determinada por ensaio colorimétrico. O efeito antitumoral do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nos modelos in vivo de tumor sólido e metástase pulmonar em camundongos C57BL6, foi avaliado observando-se os seguintes parâmetros: crescimento tumoral, índice de metástase, peso corporal, atividade exploratória através do modelo de campo aberto Open Field e a toxicidade do composto foi avaliada em diferentes órgãos. A atividade antinociceptiva da substância isolada foi avaliada em animais submetidos ao modelo de metástase pulmonar. Os resultados apresentados mostraram que a substância poliacetileno apresentou níveis significativos de citotoxicidade sobre células de melanoma murino B16F10 com CI50 de 17,39 ± 3,26µM; células leucêmicas NB4, RAMOS, JURKAT e NALM6 e de tumores sólidos PC3, H1299, MG63 e NCI, não apresentando citotoxicidade significativa frente as CMNH. O poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona apresentou a apoptose como principal mecanismo de morte celular, pela indução de caspase 3. Também foi observado inibição de 80 ± 15,95% no desenvolvimento do tumor sólido induzido com B16F10 em camundongos bem como o aumento no número de cruzamentos no modelo Open Field de 57,50 ± 5,90 na menor dose comparado com o grupo controle com tumor de 34,5 ± 5,23. Pode-se observar a redução de nódulos metastáticos em 62% na menor dose, bem como no número de cruzamentos. Nenhum efeito toxicológico significativo foi observado, bem como alteração no peso corporal de animais sadios. Na avaliação da sensibilidade mecânica com a substância, observou-se redução significativa na sensibilidade dos grupos tratados. Estes resultados, em conjunto, demonstram que o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona apresentou importante atividade antineoplásica, podendo tornar-se uma importante ferramenta no tratamento do câncer sem existência de efeitos indesejáveis. Considerando os promissores resultados obtidos com o poliacetileno, é

necessário continuar os estudos farmacológicos e moleculares, para elucidar o mecanismo de ação desta substância que pode ser uma nova e atrativa molécula para o tratamento do câncer. PALAVRAS CHAVES: VERNONIA SCORPIOIDES (LAM)PERS.POLIACETILENO.CITOTOXICIDADE. APOPTOSE.

Abstract

Study of the cytotoxic activity of polyacetylene 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2 (5H)-one

Juliana Klein Bagatini 07/2012

Supervisor: Nara Lins M. Quintao,Ph.D Co-supervisor: Rilton Alves de Freitas,Ph.D Number of Pages: 118 Skin cancers are the most common types of cancer in Brazil, and correspond to around 25% of all malignant tumors recorded. Of these, melanoma represents at least 5% and is characterized by its high metastatic power. The development of anticancer agents from natural products is considered critical to pharmacology, and interest in the development of more effective chemotherapeutic agents is increasing each year. This study evaluates the antineoplastic activity of the substance isolated from Vernoniascorpioides (Lam) Perspolyacetylene 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2 (5H)-one. To assess the cytotoxic activity of the substance, vital MTT dyes were used in vital cells of murine melanoma B16F10, and the dye XTT for the leukemia cells, solid tumors and NHMC (normal human mononuclear cells). The patterns of cell death were determined by fluorescence microscopy using the dyesethidium bromide, fluorescein diacetate and acridine orange. The enzyme activity of caspase 3 was determined by colorimetric assay. The antitumor effect of polyacetylene 5-octa-2 ,4,6-triinil-furan-2 (5H)-one in in vivo models of solid tumors and lung metastasis in C57BL6 mice, was evaluated using the following parameters: tumor growth, rate of metastasis, body weight, and exploratory activity through the Open Field model. The toxicity of the compound was evaluated in different organs. The antinociceptive activity of the isolated substance was evaluated in animals submitted to the lung metastasis model. The results showed that the substance polyacetylene has significant levels of cytotoxicity on B16F10 cells, with IC50 of 17.39 ± 3.26 µM, while the NB4 leukemic cells, RAMOS, JURKAT and NALM6 solid tumors and PC3, H1299, and NCI MG63 and did not show significant cytotoxicity against CMNH. The polyacetylene 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2 (5H)-one showed apoptosis as the main mechanism of cell death,viathe induction of caspase 3. Inhibition of 80 ± 15.95% was also observed in the development of solid tumors in mice, induced by B16F10, and an increase in the number of crossings in the Open Field model of 57.50 ± 5.90 at the lowest dose, compared with the control group tumor (34.5 ± 5.23). A 62% reduction in metastatic nodules was seen at the lowest dose, as well as a reduction in the number of crossings. No significant toxicological effect or changes in body weight of the healthy animals were observed. In the evaluation of sensitivity to mechanical substances, there was a significant reduction in sensitivity of the treated groups. Taken together, these results demonstrate that the polyacetylene 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2 (5H)-one showed significant anticancer activity, and may become an important tool for the treatment of cancer, without the existence of undesirable side effects. Based on the promising results obtained with polyacetylene, further pharmacological and molecular studies are needed, to elucidate the mechanism of

action of this substance with potential as a new and attractive molecule for cancer treatment. Keywords: Vernoniascorpioides (Lam) Pers. polyacetylene. cytotoxicity.apoptosis.

Dedico esta dissertação, aquele que me faz sorrir toda manhã, que faz o dia ficar mais leve, aquele que esta sempre do meu lado, que me faz acreditar que sou capaz, agradeço a Deus por ser a pessoa mais feliz

do mundo, pois tenho VOCÊ ao meu lado meu amor.

Agradecimentos Especiais

Agradeço a Deus, que está sempre comigo, iluminando meus passos e guiando meu

caminho. Tudo o que tenho e sou agradeço a ele.

Nada na vida acontece por um acaso, e se aconteceu DEUS quis assim. O que

me resta é so correr atras de meus objetivos, ainda mesmo que pessoas conspirem ao contrário DEUS estará comigo.

Eça de Queiroz

Agradeço aos meus pais, que me educaram, me deram amor, carinho, limites, possibilidades e sabedoria. Para que eu pudesse trilhar meu caminho sozinha

reconhecendo princípios, valores e agisse de forma honesta e digna. Obrigado por tudo!

Mãe sei que muitas vezes deixou de seguir seu caminho para que pudéssemos viver

de forma que julgava ser melhor, assim realizando nossos sonhos e ideais, saiba que você faz parte de todos os sonhos que estão se realizando!

Carol, sem palavras para descrever o quanto te amo, o quanto me sinto melhor

quando esta por perto, e o quanto me orgulho de você. Te amo!

A família do Jésum, que sempre me acolheu, mostrando amor e confiança. Obrigada pelo incentivo, pela alegria e por estarem presentes nas minhas

conquistas.

Jésum Meu companheiro, minha alma gêmea, o que dizer desta pessoa que está sempre

ao meu lado, me amando, elogiando, incentivando? “Amar pode dar certo” é a frase mais simples possível para traduzir a convicção de que nascemos para amar e ser amados, e que nossa felicidade consiste em realizar

essa missão. Esteja sempre comigo,

TE AMO!

O amanhecer traz o louvor dos pássaros que cantam para glorificar a Deus. A natureza inteira louva o Criador e demonstra os atributos de tudo o que

foi criado com perfeição. Os Anjos não se cansam de cantar louvores e de enaltecer as qualidades

divinas que podem encontrar expressão em cada coração humano. O louvor está no peito de cada um que

se devota a amar e a servir, sem medo de ser feliz.

Agradecimentos

Ao professor Rilton, pelo prazer da convivência, pelas inúmeras oportunidades

de aprendizado proporcionadas em diversas áreas do conhecimento, por saber

reconhecer aptidões individuais e estimulá-las, pelo incentivo de ir além.

Obrigada pelo respeito, dedicação e confiança;

A professora Nara, obra do destino, até pode ser! Quero agradecer por me aceitar

como sua orientanda. Posso me considerar privilegiada por ter tido a oportunidade

de ter dois orientadores: o Rilton e você. Foi um enorme prazer conviver este tempo

contigo, agradeço pelos conselhos, ensinamentos, pela ajuda e amizade;

Agradeço minhas amigas que sempre estiveram do meu lado, incentivando e

aplaudindo meus passos, presentes em todos os momentos, Mirela e Juliana;

Agradeço a minha amiga Dani, que mesmo de longe me aconselhou, esteve

presente em meu coração e se hoje estou aqui com certeza ela teve sua

participação. E hoje mais do que nunca estamos ligadas para toda a vida;

Amigas que conquistei fazendo o mestrado e que com certeza ficarão para

sempre, Sheila e Thaís. Obrigada pela amizade, pelos sorrisos, e algumas lágrimas

também, obrigada pelo convívio maravilhoso. Vocês fazem parte deste trabalho;

A amiga Juliana Nunes, obrigada pelas manhãs e tardes de muita conversa e

histórias contadas, obrigada por fazer com que eu fizesse parte de tua história;

A minha mais nova amiga, companheira de manhãs e tardes, querida Gi.

Obrigada, pelos conselhos, pelo carinho, pelos abraços, por me manter calma e

mais paciente;

A profª. Dr. Maique Biavatti, pela substância cedida para o estudo. Pela

atenção e confiança;

Aos professores do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, por

terem compartilhado seus conhecimentos;

As professoras Fátima e Márcia, pela dedicação, sugestões e críticas que

fizeram ao trabalho, colaborando e contribuindo na sua finalização;

Ao Juliano e Elenize, da secretaria do Programa de Mestrado em Ciências

Farmacêuticas, por terem me ajudado sempre que precisei e que, indiretamente me

auxiliaram no desenvolvimento deste trabalho;

As técnicas de laboratório Margie, Lilian e Cláudia pelo apoio sempre

presente, ajuda na realização de experimentos e conversas diversas que alegravam

nossos dias;

A profª. Dr. Tânia Bresolin, por estar sempre disposta a dar conselhos e

questionar. Obrigada por tudo;

Ao Gilberto Franchi, pela disposição e colaboração no trabalho;

As técnicas do laboratório de histologia Bia e Maria, pela ajuda, atenção e

dedicação;

A todos meus colegas de mestrado, pelo incentivo nas horas mais difíceis, e

troca de idéias;

A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, auxiliaram e me

acompanharam durante a realização deste trabalho, proporcionando um ambiente

de luz, de amor e sabedoria. Por me ajudarem a enfrentar os obstáculos, e desviar

de pessoas que não mereciam a minha amizade ou indignação. Que me ajudaram a

vencer cada minuto, cada dia, cada mês, cada ano, cada pensar e agir nesta

dissertação;

Obrigada mais uma vez a Deus por criar os animais, seres de luz em minha

vida. Tenho a honra de compartilhar os meus momentos com meus dois filhos

peludos Tobi e Nicolas, os quais, com amor incondicional, me fazem uma pessoa

melhor;

Obrigada a CAPES pela bolsa concedida durante o período do mestrado,

possibilitando mais uma conquista.

Epígrafe

Que o “Mestre dos Mestres” lhe ensine que nas falhas e lágrimas se esculpe a sabedoria.

Que o “Mestre da Sensibilidade” lhe ensine a contemplar as coisas simples e a navegar nas águas da emoção.

Que o “Mestre da Vida” lhe ensine a não ter medo de viver e a superar os momentos mais difíceis da sua história.

Que o “Mestre do Amor” lhe ensine que a vida é o maior espetáculo no teatro da existência.

Que o “Mestre Inesquecível” lhe ensine que os fracos julgam e desistem, enquanto os fortes compreendem e tem esperança.

Não somos perfeitos. Decepções, frustações e perdas sempre acontecerão.

Mas Deus é o artesão do espírito e da alma humana. Não tenha medo. Depois da longa noite surgirá o mais belo amanhecer. Espere-o.

Augusto Cury

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. APOPTOSE MEDIADA PELA VIA INTRÍNSECA (MITOCONDRIAL) E PELA VIA

EXTRÍNSECA (RECEPTORES DE MORTE). ................................................................... 31 FIGURA 2. ESTRUTURA QUÍMICA DE ALCALÓIDES DERIVADOS DE CATHARANTUS ROSEUS A

VINCRISTINA E VINBLASTINA ................................................................................... 34 FIGURA 3. ESTRUTURA QUÍMICA DO PACLITAXEL (TAXOL®) ............................................ 35 FIGURA 4. ESTRUTURA QUÍMICA DA CAMPTOTECINA, ISOLADA DE CAMPTOTHECA

ACUMINATA(A) TOPOTECANO (B) IRINOTECANO ...................................................... 355 FIGURA 5. ESTRUTURA QUÍMICA DA PODOFILOTOXINA DE PODOPHYLLUM EMODI E P.

PELTATUM E OS DERIVADOS SEMI-SINTÉTICOS TENIPOSÍDEO E ETOPOSÍDEO ................ 36 FIGURA 6. FOTO DAS PARTES AÉREAS DE VERNONIA SCORPIOIDES (LAM) PERS. ............ 38 FIGURA 7. REPRESENTAÇÃO DA ESTRUTURA QUÍMICA DE ÉSTER DEHIDROMATRICARIA ....... 40 FIGURA 8. POLIACETILENO ISOLADO DE V. SCORPIOIDES ................................................. 42 FIGURA 9. ESQUEMA REPRESENTANDO A METABOLIZAÇÃO DO MTT. ................................ 46 FIGURA 10. ESQUEMA REPRESENTANDO A METABOLIZAÇÃO DO XTT. .............................. 48

FIGURA 11. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA DE CÉLULAS B16F10 CORADAS COM

BROMETO DE ETÍDIO E ALARANJADO DE ACRIDINA E CLASSIFICADAS EM PADRÕES PRÉ-ESTABELECIDOS. .................................................................................................... 51

FIGURA 12. INFLUÊNCIA SOBRE O CRESCIMENTO TUMORAL SÓLIDO DE CÉLULAS DE

MELANOMA MURINO B16F10 EM CAMUNDONGOS C57BL/6. ...................................... 53

FIGURA 13. FIGURAS ILUSTRATIVAS DO PROCEDIMENTO DE PERFUSÃO CARDÍACA REALIZADA

NOS ANIMAIS PARA RETIRADA DOS PULMÕES E ÓRGÃOS. ............................................ 55 FIGURA 14. MODELO DO ENSAIO DECAMPO ABERTO (OPEN FIELD) .................................. 56 FIGURA 15. FOTO ILUSTRATIVA DA PLATAFORMA DE ARAME ELEVADA PARA AVALIAÇÃO

MECÂNICA UTILIZANDO O MONOFILAMENTO DE VON FREY .......................................... 57 FIGURA 16. VIABILIDADE DAS CÉLULAS B16F10 EXPOSTAS AO POLIACETILENO 5-OCTA-

2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA.TEMPO DE CONTATO COM O COMPOSTO (A) 24, (B) 48

E (C) 72 HORAS, MANTIDAS A 37ºC/5% CO2. ........................................................... 60

FIGURA 17. EFEITOS DO COMPOSTO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA NA CONCENTRAÇÃO DE 5,43µM, NA MORFOLOGIA DAS CÉLULAS DE MELANOMA

MURINO B16F10.. ................................................................................................. 64

FIGURA 18. EFEITOS DO COMPOSTO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA NA CONCENTRAÇÃO DE 54 µM, NA MORFOLOGIA DAS CÉLULAS DE MELANOMA

MURINO B16F10.. ................................................................................................. 65 FIGURA 19. EFEITOS DO COMPOSTO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-

ONA NA CONCENTRAÇÃO DE 543 µM, NA MORFOLOGIA DAS CÉLULAS DE MELANOMA

MURINO B16F10. .................................................................................................. 65 FIGURA 20. EFEITOS DO FÁRMACO PACLITAXEL UTILIZADO COMO CONTROLE POSITIVO NA

CONCENTRAÇÃO DE 100 µM, NA MORFOLOGIA DAS CÉLULAS DE MELANOMA MURINO

B16F10.. .............................................................................................................. 66 FIGURA 21. IMAGENS DO CONTROLE NEGATIVO MEIO MEM+DMSO 1%, NA MORFOLOGIA

DAS CÉLULAS DE MELANOMA MURINO B16F10.. ........................................................ 66 FIGURA 22. QUANTIFICAÇÃO DA P-NITRO ANILINE (PNA) MMOL/L FORMADA NAS CÉLULAS

TUMORAIS B16F10EM PRESENÇA DO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA. ........................................................................................................... 69

FIGURA 23. EFEITO DO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA NAS

DOSES DE (5,43 E 54,34 µMOL/KG) SOBRE O PESO DA MASSA TUMORAL DOS

CAMUNDONGOS C57BL/6N INDUZIDOS AO CRESCIMENTO DE TUMOR SÓLIDO POR

CÉLULAS DE MELANOMA MURINO B16F10.. .............................................................. 70 FIGURA 24. EFEITO DO POLIACETILENO SOBRE O VOLUME TUMORAL. EFEITO DO

POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA NAS DOSES DE (5,43 E

54,34µMOL/KG) SOBRE O VOLUME TUMORAL. ........................................................... 71 FIGURA 25. IMAGENS REPRESENTATIVAS DA ANÁLISE MACROSCÓPICA DOS PULMÕES

RETIRADOS DOS CAMUNDONGOS TRATADOS COM O POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA.. .................................................................................... 73

FIGURA 26. GRÁFICO DE INIBIÇÃO DE METÁSTASE PULMONAR INDUZIDA POR CÉLULAS

B16F10 INJETADAS VIA RETRO-ORBITAL EM CAMUNDONGOS C57BL/6 ....................... 74

FIGURA 27. ANÁLISE HISTOLÓGICA DE METÁSTASE PULMONAR (A) CONTROLE NEGATIVO (B) CONTROLE POSITIVO (C) DOSE DE 5,43µMOL/KG (D) DOSE DE 54,34µMOL/KG. AUMENTO

DE 400X ................................................................................................................ 75

FIGURA 28. EFEITO DO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA (5,43 E

543 µMOL/KG, I.P.) SOBRE OS PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS “CROSSING” (CRUZAMENTOS) NO MODELO DO OPEN FIELD EM MODELO DE TUMOR SÓLIDO ............. 76


543 µMOL/KG, I.P.) SOBRE OS PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS “CROSSING” (CRUZAMENTOS) NO MODELO DO OPEN FIELD EM MODELO DE METÁSTASE PULMONAR . 76


543 µMOL/KG, I.P.) SOBRE OS PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS “CROSSING” (CRUZAMENTOS) NA AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA. ....................................................... 77

FIGURA 31. FREQUÊNCIA DE RESPOSTA DA PATA DIREITA DOS ANIMAIS DO MODELO DE

METÁSTASE PULMONAR TRATADOS COM O COMPOSTO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA NAS DOSES DE 5,43 E 543 µMOL/KG. ................................ 78

FIGURA 32. FOTOS ILUSTRATIVAS DO ASPECTO FÍSICO DOS ANIMAIS TRATADOS COM O

POLIACETILENO NAS DOSES DE 5,43µMOL/KG (A) E 543µMOL/KG (B, C) DURANTE 12

DIAS, PARA AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DO COMPOSTO. .............................................. 79 FIGURA 33. GRÁFICO DE VARIAÇÃO DO PESO INICIAL E PESO FINAL(G) DOS ANIMAIS

TRATADOS COM O POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA NAS DOSES

DE 5,43 E 543µMOL/KG, I.P, E GRUPO SALINA (C) TRATADOS POR 12 DIAS. .................. 79 FIGURA 34. ANÁLISE HISTOLÓGICA DO FÍGADO DOS ANIMAIS SUBMETIDOS A AVALIAÇÃO

TOXICOLÓGICA (A) GRUPO CONTROLE (B) DOSE DE 5,43µMOL/KG (C) 54,34µMOL/KG. AUMENTO DE 400X. ............................................................................................... 80

FIGURA 35. ANÁLISE HISTOLÓGICA DO BAÇO DOS ANIMAIS SUBMETIDOS A AVALIAÇÃO


FIGURA 36. ANÁLISE HISTOLÓGICA DO RIM DOS ANIMAIS SUBMETIDOS A AVALIAÇÃO


LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Concentração inibitória da viabilidade celular em cinquenta porcento das células (CI50) das células PC3, LNCAP, H1299, OVCAR, NCI, MCF7, U138MG, VW473, HELA, T84, HOS E MG63 expostas por 24 horas ao poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona........................................................................................61 Tabela 2. Concentração inibitória da viabilidade celular em cinquenta porcento das células (CI50) das células leucêmicas K562, KG1, HL60, NB4, RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT, MOLT4, NALM6, B15 e U937 e células normais CMNH, expostas por 48 horas ao poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona.........................................62 Tabela 3. Porcentagem de apoptose apresentada pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona no processo de morte celular através da marcação de morte celular com Alaranjado de Acridina e Brometo de Etídeo na linhagem celular B16F10.......................................................................................................................67 Tabela 4. Porcentagem de necrose apresentada pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona no processo de morte celular através da marcação de morte celular com Alaranjado de Acridina e Brometo de Etídeo na linhagem celular B16F10.......................................................................................................................68 Tabela 5. Porcentagem do Peso dos animais no 7º. e último dia de experimento em relação ao peso inicial e porcentagem dos órgãos em relação ao peso final de camundongos C57BL/6N, após administração do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona..........................................................................................................72

LISTA DE ABREVIATURA AA- Alaranjado de acridina AChe- Acetilcolinesterase B16F10- Célula de melanoma murino B15- Linhagem celular de leucemia linfoblástica aguda BE- Brometo de etídeo BCRJ- Banco de células do Rio de Janeiro Bid- Proteína pro-apoptótica CADS (DNases)- Enzimas nucleases ativadas por caspase Cdc27- Proteína reguladora do ciclo celular CFA- Adjuvante completo de Freund CMNH- Células mononucleares humanas DNA-P- DNA polimerase DR- Death receptors (receptores de morte)

DISC- Complexo sinalizador de morte DMSO- Dimetilsulfóxido EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético FADD- Proteína derivada da morte associada a FaS FAS/CD95- Receptor de morte FAsL- Receptor de morte HE- Hematoxilina eosina HELA- Adenocarcinoma de colo de útero humano HEPES- Hidroxietil piperazinoltanossulfonico HIV- Vírus da imunodeficiência humana HOS- Linhagem celular de osteosarcoma humano H1299- Linhagem celular de carcinoma de pulmão humano HL-60- Linhagem celular de leucemia promielocítica humana ICAD- Inibidor de ativação de caspase INCA- Instituto Nacional do Câncer JURKAT- Linhagem celular de leucemia/linfoma de células T K562- Linhagem celular leucemia mielóide/eritroleucemia Ph+ humana KG1- Linhagem celular de leucemia mielóide humana LNCAP- Linhagem delular de câncer de próstata humano MCF-7- Linhagem celular adenocarcinoma de mama humano MEM- Meio essencial mínimo MG63- Linhagem celular de osteosarcoma humano MOLT4- Linhagem celular de leucemia linfoblástica aguda MMP- Potencial de membrana mitocôndrial MTT- 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio brometo NALM6- Leucemia linfóide aguda B humana NB4- Leucemia promielocítica aguda humana NCI- Linhagem celular de câncer de pulmão humano NALM6- Leucemia linfóide aguda B humana NK562- Linhagem celular de leucêmia natural killer sensível OMS- Organização Mundial de Saúde OVCAR- Linhagem celular de adenocarcinoma de ovário humano PARP- Proteína polimerase requerida no reparo do DNA PBS- (Phosphate buffered saline) Salina tamponada com fosfato PC3- Linhagem celular de Câncer de próstata humano PKB/AKt- Proteína reguladora da sinalização apoptótica

RAMOS- Linhagem celular de linfoma humano de Burkitt’s RAJI- Linhagem celular de linfoma humano de Burkitt’s Rb- Proteína reguladora do ciclo celular RIP quinase- Proteína mediadora da sinalização apoptótica RPMI- Meio de cultura Instituto Roswell Park Memorial RS4- Linhagem celular de leucemia aguda SFB- Soro fetal bovino TNF- Fator de necrose tumoral TRAIL- Receptor de morte T84- Linhagem celular de adenocarcinoma de cólon humano U138MG- Linhagem celular de adenocarcinoma cervical humano U937- Linhagem celular de linfoma monocítico VEGF- Fator de crescimento endotelial vascular VW473- Linhagem celular de meduloblastoma humano XTT- 2,3-bis (2- metil-4-nitro-5-sulfofenil) – 5-[(fenilamino) carbonil] – 2H- hidróxido de tetrazólio

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 12

2 OBJETIVOS........................................................................................................ 15

2.1 Objetivo geral.................................................................................................. 15

2.2 Objetivos específicos.................................................................................... 15

3 REVISÃO DA LITERATURA.............................................................................. 17

3.1 Câncer............................................................................................................. 17

3.2 A carcinogênese............................................................................................. 18

3.2.1 Metástases.................................................................................................... 20

3.2.2 Tumor sólido e resistência a fármacos antitumorais.............................. 21

3.3 Câncer da pele................................................................................................ 22

3.3.1 Tratamento melanoma................................................................................ 24

3.3.2 Dor no câncer e melanoma........................................................................ 26

3.4 Câncer e o processo de morte celular.......................................................... 27

3.5 Importância das plantas medicinais na terapia antitumoral....................... 33

3.6 Gênero Vernonia: ocorrência e aspectos biológicos ................................ 37

3.6.1 Poliacetileno: atividades biológicas........................................................ 39

4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 43

4.1 Material vegetal e composto isolado............................................................ 43

4. 2 Ensaios in vitro............................................................................................. 43

4.2.1 Linhagens celulares.................................................................................... 43

4.2.1.1 Obtenção de células mononucleares humanas .................................. 44

4.2.1.2 Cultura de células..................................................................................... 44

4.2.1.3 Determinação da viabilidade celular...................................................... 45

4.2.1.2.1 Ensaio de citotoxicidade (MTT).......................................................... 46

4.2.1.2.2 Ensaio de citotoxicidade (XTT)............................................................ 47

4.2.2 Avaliação do processo de morte celular por microscopia de

fluorescência.........................................................................................................

48

4.2.2.1 Brometo de etídeo e diacetato de

fluoresceína.........................................................................................................

48

4.2.2.2 Brometo de etídeo e alaranjado de

acridina................................................................................................................

49

4.2.2.3 Critérios para classificação das células em apoptóticas, necróticas

ou viáveis utilizando dupla-coloração...............................................................

51

4.2.3 Determinação da atividade da caspase-3 por ensaio

colorimétrico............................

52

4.3 Avaliação da atividade antineoplásica do poliacetileno............................ 52

4.3.1 Animais........................................................................................................ 52

4.3.2 Influência sobre o crescimento tumoral................................................... 53

4.3.3 Avaliação do efeito do tumor melanoma B16F10 sobre o peso

corporal dos animais......................................................................................

54

4.3.4 Avaliação do efeito antimetastático do poliacetileno............................. 54

4.3.5 Avaliação da atividade locomotora utilizando o modelo de campo aberto (Open Field)..............................................................................................

55

4.3.6 Modelo de avaliação de hipernocicepção mecânica através do

monofilamento de Von Frey................................................................................

56

4.3.7 Avaliação histológica ................................................................................ 57

4.3.8 Avaliação da Toxicidade aguda in vivo.................................................... 57

4.4 Análise estatística......................................................................................... 58

5 RESULTADOS............................................................................................... 59

5.1 Avaliação da viabilidade celular.............................................................. 59

5.1.2 Avaliação da morte celular por microscopia de fluorescência.......... 63

5.1.2.1 Brometo de etídeo e diacetato de fluoresceína................................ 63

5.1.2.2 Brometo de etídeo e alaranjado de acridina..................................... 63

5.2 Determinação da atividade de caspase-3 por ensaio colorimétrico..........................

69

5.3 Avaliação da atividade antineoplásica do poliacetileno in vivo........... 70

5.3.1 Influência sobre o crescimento tumoral.............................................. 70

5.3.2 Avaliação do efeito do tumor sobre o peso corporal dos animais.... 71

5.3.3 Avaliação do efeito antimetastático do poliacetileno......................... 73

5.3.4 Avaliação da atividade locomotora (Open Field)................................ 75

5.3.5 Avaliação de hipernocicepção mecânica através do

monofilamento de Von Frey...........................................................................

77

5.3.6 Avaliação da atividade toxicológica aguda......................................... 78

6 DISCUSSÃO.................................................................................................. 81

7 CONCLUSÃO................................................................................................ 94

REFERÊNCIAS................................................................................................ 96

12

1. INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, o câncer ganhou uma dimensão maior, convertendo-se em

um evidente problema de saúde pública, segundo o Instituto Nacional do Câncer

(INCA 2012). Diante disso, fica evidente a necessidade de investimentos no

desenvolvimento de ações abrangentes para o controle do câncer nos diferentes

níveis de atuação, sobretudo na pesquisa (INCA 2010). Desta forma, a busca por

novos fármacos com ação antitumoral tem sido muito importante, visto que ainda

existem muitos tipos de tumores que não possuem tratamento ou são resistentes

aos fármacos atualmente existentes no mercado (NEVIN; VIJAYAMMAL, 2003).

A natureza é uma fonte atraente de novos compostos candidatos terapêuticos

com uma enorme diversidade química encontrada em milhões de espécies de

plantas, animais, organismos marinhos e microorganismos O papel dos produtos

naturais como fonte de medicamentos tem sido reconhecido desde os tempos

antigos. Apesar de grande progresso científico e tecnológico os fármacos derivados

de produtos naturais ainda contribuem para a descoberta de novos medicamentos.

(CRAGG; NEWMAN., 1997).

Várias moléculas derivadas de produtos naturais, seus derivados semi-sintéticos

ou seus modelos moleculares sintetizados são empregados atualmente com

sucesso no tratamento do câncer. Dentre eles os alcalóides vincristina e vimblastina

isolados de Catharantus roseus, destacam-se como dois dos mais importantes

agentes quimioterapêuticos (VIEIRA; BRAZ-FILHO, 2005) seguidos pelos produtos

semissintéticos etoposídeo e teniposídeo, obtidos de epipodofilotoxina derivados das

lignanas isolada de espécies Podophyllum peltatum e P. emodi, respectivamente, o

irinotecano etopotecano de Camptotheca acuminata os terpenóides taxol, paclitaxel

e docetaxel de Taxus brevifolia (CHOI et al., 2008).

Considerando estes aspectos, a busca de novos agentes farmacologicamente

ativos através de triagem de moléculas de fontes naturais, levou a descoberta e ao

desenvolvimento de muitos fármacos utilizados clinicamente e que desempenham

um importante papel no tratamento de várias doenças, especialmente a terapia de

doenças infecciosas e do câncer, estima-se que mais de 75 e 60% respectivamente

dos fármacos utilizados atualmente são derivados de fontes naturais (GRAGG;

NEWMAN, 2005).

13

Produtos naturais e seus derivados têm sido importantes historicamente como

fonte de agentes terapêuticos. No entanto, na última década as pesquisas com

produtos naturais na indústria farmacêutica têm diminuído. Com isto, novas

estratégias estão sendo utilizadas, despertando novamente o interesse pela

pesquisa em produtos naturais para a descoberta de novos medicamentos (KOEHN;

CARTER, 2005). Nos últimos anos, no entanto, a importância dos organismos

vegetais como fontes produtivas de substâncias anticancerígenas e outras

atividades biológicas reativaram interesses sociais e econômicos, superando

obstáculos na construção de cenário crescente, estimulando, inclusive, a percepção

das lideranças industriais empenhadas na fabricação de produtos sintéticos (BRAZ-

FILHO, 2010).

Efeitos biológicos como citotoxicidade, ação antinflamatória e antimicrobiana da

planta V. scorpioides têm motivado o estudo de seu potencial para uso terapêutico,

uma vez que sua interação com as células poderia reduzir a proliferação de células

tumorais, e também induzir a resposta imunológica aumentando o número de

neutrófilos na área tumoral, possibilitando, assim um melhor prognóstico, quando

comparado a tratamentos quimioterápicos tradicionais (DALAZEN et al., 2005;

BUSKUHL et al., 2009; HOWARD et al., 2003; PAGNO, 2004; WILLIAMS et al.,

2005).

No gênero V. scorpioides são encontradas lactonas sesquiterpênicas (WARNING

et al., 1987), formando um dos maiores grupos com atividade antitumoral e citotóxica

já obtido de plantas (PICMAN, 1986; LEE et al., 1971). Assim, vem se

desenvolvendo muitos estudos para identificar qual ou quais frações estão

envolvidas nestas ações. A partir da fração diclorometano obtida pelo fracionamento

do extrato hidroalcoólico de flores e folhas de V. scorpioides, foi isolado um

poliacetileno, que apresentou atividade citotóxica e genotóxica frente a linhagens

tumorais, demonstrando considerável morte celular por via apoptótica (BUSKUHL et

al., 2009).

Visando a necessidade de se encontrar novos agentes antineoplásicos, têm-se

procurado identificar compostos isolados de plantas com propriedade citotóxica. Em

paralelo tem-se o desafio de encontrar sobstâncias que induzam morte de células

neoplásicas, sem ocasionar elevada citotoxicidade em células não malignas.

14

Dentro desta perspectiva, é interessante ressaltar o mecanismo de ação dos

fármacos antitumorais que ocorram pelo processo apoptótico, focando nas células

alvo da doença e minimizando os efeitos colaterais devido à indução do processo de

morte celular por necrose ou até mesmo de apoptose em outras células e tecidos

(DUARTE, 2010).

Deste modo, o objetivo deste trabalho foi a ampliação dos estudos

farmacológicos elucidando as atividades biológicas do composto poliacetileno

através de modelos in vitro, avaliando a atividade citotóxica a fim de avaliar o

mecanismo de morte celular, e in vivo, procedendo com estudos iniciais que possam

evidenciar a ação antineoplásica desta molécula, podendo ser um potencial fármaco

utilizado terapeuticamente.

15

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Avaliar a atividade antitumoral do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-

ona isolado das partes aéreas de Vernonia scorpioides, através de ensaios in vitro e

in vivo.

2.2 Objetivos Específicos:

- Analisar a citotoxicidade do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona sobre

células de linhagem de melanoma murino B16F10, células mononucleares humanas

(CMHN), as linhagens tumorais PC3, LNCAP, H1299, OVCAR, NCI, T84, MCF-7,

U138MG, VW473, HELA, HOS e MG63 e leucêmicas K562, KG1, HL60, NB4,

RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT, MOLT4, NALM6, B15 e U937.

- Em células de linhagem de melanoma murino B16F10 observar o padrão de morte

induzido pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona por microscopia de

fluorescência utilizando os corantes brometo de etídeo, diacetato de fluoresceína e

alaranjado de acridina em células de linhagem melanoma murino B16F10.

- Analisar a participação da enzima Caspase 3 no processo de morte celular

induzida pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, através da

quantificação colorimétrica, em células de linhagem de melanoma murino B16F10.

- Avaliar a atividade antitumoral do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona

em camundongos C57BL-6 usando o tumor sólido induzido pela injeção subcutânea

de células B16F10 como modelo.

16

- Observar o efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona sobre a

metástase pulmonar induzida pela injeção intravenosa de células B16F10 em

camundongos.

- Avaliar o efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona sobre a

toxicidade agudaem diferentes órgãos de camundongos C57BL-6, através de

análise histológica.

- Avaliar o efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona sobre a

nocicepção mecânica induzida pelo melanoma metastático em camundongos

C57BL-6.

- Avaliar o efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona sobre a atividade

locomotora dos animais submetidos aos modelos de melanoma sólido e metastático,

induzido pela inoculação de células B16F10.

17

3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Câncer

Conhecido há muitos séculos, o câncer foi amplamente considerado como

uma doença dos países desenvolvidos. Há aproximadamente quatro décadas esta

situação vem mudando. A incidência global do câncer pode ser observada em

países em desenvolvimento, principalmente aqueles com poucos e moderados

recursos. Assim, nas últimas décadas, o câncer ganhou maior dimensão,

convertendo-se em evidente problema de saúde pública mundial (INCA, 2012).

O câncer é uma doença complexa envolvendo anormalidade em muitos

genes, levando a alterações na expressão ou funções de genes da homeostasia

celular. Acarretando em mudanças metabólicas e comportamentais, podendo

converter uma célula normal em uma célula transformada, levando a proliferação

descontrolada e anormal. O padrão de combinação dos vários genes mutados pode

revelar as relações funcionais entre genes e cascatas de sinalização que levam à

tumorigênese, além de identificar possíveis alvos terapêuticos (YEANG et al, 2008).

Estas mudanças surgem devido à alterações genéticas alterando a

proliferação celular, influenciando no relacionamento destas células com as células

vizinhas. Em muitos aspectos, as células cancerosas possuem uma organização

independente de sobrevivência não seguindo as regras de um ciclo celular normal.

Com isto, estas células se adaptam, lutando contra o sistema de defesa do

organismo, adotando então um comportamento agressivo e invasivo, resultando na

formação de uma massa cancerosa (DE VITA; HELLMANN; ROSENBERG, 2005;

WHO, 2008).

A maioria destas alterações pode ocorrer impulsionada por duas classes de

genes, os proto-oncogenes e os genes supressores de tumor. A alteração em um ou

mais destes grupos cooperam na indução da condição neoplásica. Os proto-

oncogenes são importantes para o controle do crescimento, divisão celular e

sobrevivência, já os genes supressores de tumor atuam no atraso do ciclo celular,

inibindo a proliferação celular, e ativando o processo de morte celular (apoptose)

(HARRINGTON, 2011).

Assim, para compreender os mecanismos moleculares da metástase do

câncer, é indispensável identificar os genes que sofrem alterações acumulando-se

18

durante a progressão do câncer, bem como os genes cuja expressão é responsável

pela aquisição do potencial metastático em células neoplásicas (YOKOTA, 2000).

A Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou que, no ano 2030, podem-

se esperar 27 milhões de casos incidentes de câncer, 17 milhões de mortes por

câncer e 75 milhões de pessoas vivas, anualmente, com câncer.

Segundo as estatísticas mundiais, é previsto a ocorrência de 12,4 milhões de

casos novos e 7,6 milhões de óbitos por câncer no mundo. Os cânceres mais

incidentes são o de pulmão, (1,52 milhões de casos novos), o de mama (1,29

milhões) seguido pelo de cólon de reto (1,15 milhões) e pelo câncer de estômago

com 870 mil casos novos (WHO, 2008).

Considerada a segunda maior causa de morte por doença no Brasil, segundo

o Instituto Nacional do Câncer (INCA), é ainda considerado um grande desafio para

a ciência e medicina, pois para muitos tipos de tumores ainda não se tem cura, e os

tratamentos convencionais apresentam consideráveis efeitos colaterais.

No Brasil, as estimativas para o biênio 2012-2013 apontam a ocorrência de

aproximadamente 518.510 casos novos de câncer, incluindo os de pele não

melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. O estudo das

diversas etapas que estão envolvidas na progressão tumoral pode ser feito

utilizando modelos murinos de tumores de pele pois apresentam boa similaridade

com a neoplasia humana (VAN DYKE; JACKS, 2002).

O modelo de linhagem celular tumoral escolhido para ser estudado nesta

dissertação, avaliando a citotoxicidade e/ou atividade antitumoral, foi o de melanoma

murino B16F10, uma linhagem que se desenvolve in vitro e é altamente

tumorigênica in vivo, pois cresce espontaneamente em camundongos C57BL/6 e

com habilidade de formar metástases (ZHAO et al., 2001; NAKAMURA et al., 2002).

3.2 A carcinogênese

Há cerca de 3000 anos a.C, a primeira descrição registrada de câncer é

encontrada em um papiro egípcio. Hipócrates é considerado o criador da palavra

câncer, pois a forma dos tumores trouxe-lhe a lembrança de caranguejos. Assim, ele

usou as palavras carcinos, carcinoma e câncer, que se referem aos caranguejos em

grego, para descrever os tumores (COOPER; HAUSMAN,2007).

19

Eventualmente, algumas células podem sofrer transformações em genes

relacionados com funções biológicas e controles em relação à morfologia,

metabolismo, diferenciação e proliferação. Estes processos dependem de

complexas vias bioquímicas sinalizadoras, resultando em comportamentos anormais

em relação ao tecido em que se encontram como morfologia incompatível,

metabolismo acelerado e proliferação indiscriminada. Além da perda de

funcionalidade, essas células aberrantes acabam por se sobrepor as células normais

na disputa tanto por espaço como nutrientes (ALBERTS et al., 2008).

A formação e o desenvolvimento das neoplasias, denominado de

carcinogênese, é um processo complexo, dividido em três etapas: iniciação,

promoção e progressão. O primeiro estágio, a iniciação, é quando acontece a

desregulação genômica, devido a um agente cancerígeno, provocando modificações

em alguns genes, transformando a célula. O estágio de promoção acontece por uma

série de interações entre citocinas, fatores de crescimento e seus receptores,

consistindo na proliferação, ou expansão das células iniciadas. A etapa de

progressão tumoral é considerada irreversível, onde ocorrem inúmeras modificações

biológicas, ou seja, caracterizada pela alta instabilidade genômica, tornando o

câncer cada vez mais agressivo (KUMMAR,2005).

Depois de anos de rápidos avanços na pesquisa do câncer foi gerado um rico

e complexo campo de conhecimento, revelando o câncer com uma doença envolvida

em dinâmicas mudanças genômicas (HANAHAN;WEINBERG, 2000; HARRINGTON,

2011). Na recente revisão apresentada por Hanahan e Weilberg, delineou-se e

ampliou-se o conhecimento com duas características cruciais a instabilidade

genômica e a inflamação, permitindo assim, a aquisição das oito habilidades

fisiológicas que caracterizam uma célula tumoral. Quando ocorre instabilidade

genômica as células cancerosas perdem o controle da integridade de seu material

genético assim facilitando a acorrência de inúmeras alterações que

progressivamente promovem o surgimento do câncer. A segunda característica, a

inflamação descreve um situação comum em que as lesões pré-malignas e lesões

malignas promovem um estado inflamatório, recrutando e ativando mediadores

químicos que apoiam o crescimento e disseminação do tumor.

Essas habilidades se aplicam à grande maioria, se não, a todos os tipos de

câncer, variando apenas a ordem destes eventos e os mecanismos pelos quais elas

podem se estabelecer. As habilidades das células cancerosas são: a perda da

20

inibição por contato; independência com relação aos fatores de crescimento;

imortalidade, desvio no controle da apoptose, capacidade de promover a

angiogênese, capacidade de invasão tecidual e metástase, reprogramação do

metabolismo energético e a capacidade de fuga da destruição imune.Como

características gerais têm-se que a célula guarda um certo grau de diferenciação

característico do tecido original (HANAHAN; WEINBERG, 2011).

3.2.1 Metástases

A metástase é considerado um processo complexo, responsável por 90% da

mortalidade relacionada ao câncer. Além de fatores ambientais e genéticos, as

interações físicas de células cancerosas com o seu microambiente, bem como sua

modulação por forças mecânicas, são fundamentais na determinação deste

processo (WIRTZ et al., 2011).

Metástase é a propagação de células neoplásicas para áreas não diretamente

adjacentes ao tecido primário. O espalhamento pode ocorrer por invasão de vasos

sanguíneos ou linfáticos, por penetração das células tumorais no interior da

cavidade corpórea ou espaços que circundam órgãos. Quando estas células se

desprendem do tumor primário, elas podem invadir o hospedeiro e penetrar em

vasos sangüíneos e linfáticos. Para tanto, estas células necessitam se infiltrar na

membrana basal que circunda os vasos sangüíneos (Figura 1). Em casos eventuais,

essas células podem deixar as veias, ficando protegidas de ataques tecido-

específico (CRAIG & LOBERG, 2006; RUFFINI et al, 2007).

As células que completam todos os passos de proliferação metastática

invadem outros tecidos. A visão emergente para o papel de processos físicos e

mecânicos na metástase deve contribuir para o desenvolvimento de novas

abordagens para o câncer, diagnóstico e novos alvos terapêuticos (WELCH et al.,

2008;STAFFORD et al, 2008; WIRTZ et al., 2011).

O melanoma metastático é uma doença devastadora, as opções de

tratamento são limitadas. Uma gama de medicamentos citotóxicos têm sido

avaliados e utilizados na clínica terapêutica como agentes únicos no tratamento de

melanoma, apresentando poucas respostas terapêuticas (KIRKWOOD et al., 2005).

21

Em 2011, era esperado que o melanoma cutâneo afeta-se aproximadamente

70.000 pacientes, e cerca de 8.800 pacientes morreriam da doença. Devido à

dificuldade de prever um prognóstico individual para um paciente diagnosticado com

melanoma, porque o prognóstico varia amplamente entre ambose dentro de estádios

da doença. Particularmente para pacientes com melanoma que invadiram linfonodos

(CALLENDER et al., 2012).

Embora ocorra a detecção precoce, cirurgia adequada e, em alguns casos, a

terapia adjuvante, pelo menos, um terço dos pacientes com melanoma em fase

inicial irá desenvolver metástases. Estes pacientes têm uma sobrevida média de

aproximadamente 6 a 8 meses e < 5% geralmente sobrevivem 5 anos ou mais

(BALCH et al., 1997).

3.2.2 Tumor sólido e resistência a fármacos antitumorais

Tumores sólidos são organizados como estruturas que são heterogêneas e

complexas. Eles compreendem as células cancerosas e células do estroma (

fibroblastos e células inflamatórias) que são incorporados em uma matriz

extracelular e alimentados por uma rede vascular Cada um destes componentes

pode variar de um local para outro no mesmo ambiente tumoral (TRÉDAN et al.,

2007).

A maioria dos tumores apresenta vascularização irregular e limitada fazendo

com que existam células muito distantes de qualquer capilar, estando, em privação

de nutrientes e em hipóxia crônica.Tal situação pode levar à necrose das células,

porém, a maioria das células hipóxicas são ainda viáveis. Com a morte das células

localizadas próximas aos vasos, ou seja, aquelas que estão em maior contato com o

quimioterápico, o aporte de nutrientes e oxigênio às células hipóxicas melhoram

consideravelmente, permitindo assim que estas células sobrevivam e contribuam

para a proliferação tumoral (TRÉDAN et al., 2007).

Para a penetração de fármacos anticancerígenos em células distantes é

necessário um sistema vascular para a eficácia da quimioterapia contra tumores

sólidos. Entretanto, muitos tumores sólidos têm um sistema sanguíneo vascular mal

formado com taxas variáveis de fluxo sanguíneo e distâncias muito maiores do que

as que são encontradas em tecidos normais. A exigência de fármacos que

22

possuem a capacidade de penetrar em várias camadas de tecido pode representar

uma barreira para o tratamento eficaz de tumores sólidos (TUNGGAL et al., 1999).

A resistência de tumores sólidos à fármacos anticâncer é frequentemente

atribuída a mutações genéticas, amplificação gênica, ou mudanças epigenéticas que

influenciam na absorção, metabolismo ou exportação de drogas a partir de células

individuais. Outra importante causa de resistência a fármacos anti-cancerígenos é a

capacidade limitada destes em penetrar o tecido do tumor e alcançar todas as

células tumorais em uma concentração potencialmente letal (TRÉDAN et al., 2007).

Alterações no microambiente tumoral vêm sendo apontadas como

importantes causas de resistência às drogas. Considerando a heterogeneidade

dentro do microambiente tumoral que leva a gradientes marcados na taxa de

proliferação celular bem como para regiões de hipoxia e acidez, é importante

relacionar tais fatores influenciando na sensibilidade das células tumorais para o

tratamento químico (TRÉDAN et al., 2007).

Em face da necessidade de se encontrar novos fármacos, tem se procurado

identificar compostos isolados de plantas capazes de reduzir a proliferação celular,

tendo como desafio encontrar compostos que induzam a morte de células malignas

driblando as células do microambiente tumoral, sem contudo, ocasionar elevada

citotoxicidade em células não neoplásicas, representando uma importante direção

para a terapia do câncer.

3.3 Câncer da pele

Há milhares de anos atrás (460 375 a.c) nas escrituras de Hipócrates já havia

manuscrito referente ao melanoma. No entanto, o termo "melanoma" só foi

empregado em 1838 por Robert Carswell, que o descreveu como lesões malignas

pigmentadas da pele (WAINSTEIN; BELFORT, 2004).

Os cânceres de pele são classificados em tumores de pele não melanoma e

melanomas. Dentre os não melanomas, estão o carcinoma basocelular e o

epidermoide. O melanoma cutâneo origina-se nos melanócitos e tem predominância

em adultos brancos. Mesmo representando menos do que 5% dos tipos de câncer

de pele, o melanoma cutâneo é o mais grave, devido a seu alto poder metastático

(PARK et al., 2010; HOON et al., 2012).

23

A sua incidência vem aumentando, significativamente, em todo o mundo, mais

rapidamente do que qualquer outro tipo de neoplasia maligna. A Organização

Mundial de Saúde estima que, anualmente, ocorram em torno de 132 mil casos

novos de melanoma no mundo (LENS et al., 2004).

O melanoma da pele acomete principalmente os caucasianos que moram em

países com alta intensidade de radiação ultravioleta. No entanto, esse tipo de câncer

afeta todos os grupos étnicos em alguma proporção. A prevenção do câncer de pele,

inclusive os melanomas, inclui ações de prevenção primária, por meio de proteção

contra luz solar, que são efetivas e de baixo custo. O auto-exame também contribui

para o diagnóstico precoce. Ao surgimento de manchas/sinais novos ou mudança

em alguns, o indivíduo deve procurar o dermatologista. A educação em saúde, tanto

para profissionais quanto para a população em geral, no sentido de alertar para a

possibilidade de desenvolvimento de câncer de pele e de possibilitar o

reconhecimento de alterações precoces sugestivas de malignidade, é outra

estratégia internacionalmente aceita (MAHON, 2003; INCA 2012).

Sua letalidade é elevada, porém sua incidência é baixa. As maiores taxas

estimadas em homens e mulheres encontram-se na região Sul. Apresenta altos

percentuais de cura se for detectado precocemente, em alguns casos em que há

demora no diagnóstico, esse câncer pode levar a ulcerações e deformidades físicas

graves ou metástases (PARK et al., 2010; INCA, 2012).

Os melanomas são tumores malignos decorrentes da transformação e

proliferação de melanócitos, células produtoras de melanina que normalmente

residem na membrana basal da epiderme. Os melanócitos são células

especializadas em pigmentação, que podem ser vistos em qualquer área da pele

bem como região dos olhos, sistema nervoso central, respiratório, gastrointestinal e

trato genitourinário, originam-se na crista neural progenitora de alta mobilidade e

migram para a pele durante o desenvolvimento embrionário. Na pele, estão

localizados na membrana basal da epiderme e nos folículos capilares, e sua

homeostase é regulada por queratinócitos epidérmicos (DE VITA; HELLMANN;

ROSENBERG, 2005).

Acredita-se que cerca de 30 a 50% dos melanomas possam surgir a partir de

nevo pré-existentes. Quando surge uma lesão denominada de nevo atípico, é

possível a geração de uma malignidade derivada da crista neural, que é o

melanoma, assumindo um crescimento radial ou superficial não invasivo. Pode

24

tornar-se invasivo devido a alterações genética bem como angiogênico e

metastático, iniciando a ocorrência de metástases e invasão de células neoplásicas

em tecidos distantes e possível morte (GOVINDARAJAN et al., 2007).

As células de melanoma são caracterizadas pelo relativo crescimento

autônomo. Um mecanismo autócrino de estimulação de crescimento tem sido

sugerido, envolvendo a secreção de peptídeos endógenos de fatores de crescimento

(REED et al., 1985; HERLYN et al., 1992).

A pele é a principal barreira contra as agressões do ambiente externo, os

melanócitos propiciam fotoprotecção e termorregulação por produzir um pigmento

denomindado melanina. O grau de produção de pigmentos se manifesta como

'fototipo' de pele (cor de pele e facilidade de bronzeamento) é o indicador mais útil

de risco de câncer de pele na população em geral (LIN e FISHER, 2007).

O crescimento ou alteração da forma deste tumor é progressivo. No estágio

inicial do tumor, o melanoma encontra-se confinado na epiderme, fase esta

denominada crescimento radial ou lateral. Na fase seguinte, o melanoma progride,

invadindo a epiderme podendo atingir ou não a derme superior. Na fase de

crescimento vertical, o melanoma é caracterizado pelo seu crescimento acelerado

através da espessura da pele, formando nódulos visíveis e palpáveis capazes de

sofrerem metástase (BANDARCHI et al., 2010).

Os principais fatores de risco são: (1) exposição excessiva aos raios

ultravioleta (UV), (2) o aumento do número de nevo congênito (pinta escura), (3)

xeroderma pigmentoso ou nevo displásico, (4) indivíduos de pele clara, (5) história

prévia de câncer de pele, (6) história familiar de melanoma, (7) irritações crônicas, e

(8) exposição a fatores químicos. A radiação ultravioleta ocasiona mudanças

genéticas na pele, prejudicando a funcão do sistema imune cutâneo, aumentando a

produção dos fatores de crescimento, bem como induzindo a formação de espécies

reativas de oxigênio afetando assim os queratinócitos e melanócitos (MILLER e

MIHM, 2006).

3.3.1 Tratamento do melanoma

Os estudos para o tratamento do melanoma iniciaram há cerca de 150 anos,

sendo um desafio, considerando que sua evolução está intimamente relacionada

com os avanços da biologia e sua história natural (WAINSTEIN; BELFORT, 2004).

25

Quando o melanoma é detectado precocemente o tratamento mais indicado é

a cirurgia com boas taxas de cura. Quando os pacientes não apresentam lesões

ulcerativas confinadas na pele, a cirurgia torna-se eficaz, porém no estágio

disseminado do melanoma o procedimento cirúrgico é ineficaz (KLUGER et al.,

2009).

Terapias adjuvantes têm sucesso limitado no tratamento de estágios

avançados de melanoma. Na quimioimunoterapia ou bioquimioterapia o primeiro

adjuvante utilizado é o IFN-α, mostrando significativa sobrevivência em pacientes de

alto risco (MOCELLIN et al., 2010). A IL-2 é outro adjuvante imunoterápico utilizado,

porém, foi demonstrado que é necessário o uso de altas doses de IL- 2 para induzir

a remissão de 6% dos casos de melanoma metastático (AGARWALA, 2003). A

radioterapia também é limitada em sua eficácia devido a radioresistência do

melanoma quando comparado com outros canceres. A resposta deste tipo de terapia

é dose dependente, portanto, devido às altas doses de radiação necessárias para a

redução do tumor, a radioterapia é menos utilizada em decorrência do alto índice de

efeitos adversos (TESTORI et al., 2009).

Alguns agentes como os anticorpos monoclonais tem sido desenvolvidos

como adjuvantes da quimioterapia. Como o Ipilimumab, aprovado em 2011 para o

tratamento do melanoma em estágio avançado, o mecanismo de ação do ipilimumab

é indireto, pela potenciação da resposta imunitária mediada pelas células T,

resultando na ativação das células T, proliferação e infiltração dos linfócitos nos

tumores. Outro anticorpo monoclonal que apresentou resultados significantes é o

Bevacizumab, que age bloqueando a ação da VEGF( fator de crescimento endotelial

vascular), ou seja, impede a angiogênese (THIRLWELL et al., 2008). Quando há

ocorrência de metástases, o melanoma é incurável na maioria dos casos, portanto, a

estratégia de tratamento para a doença avançada deve ter como objetivo aliviar os

sintomas e melhorar a qualidade de vida do paciente (INCA, 2012).

Quando o melanoma é comparado a outros canceres ele apresenta uma das

piores taxas de resposta a quimioterapia. Poucos agentes demonstraram atividade

antitumoral significativa contra o melanoma metastático. Um grande número de

ensaios clínicos tem testado diferentes fármacos como agentes alquilantes

(Dacarbazina), alcalóides da vinca (Vincristina), taxanos (Paclitaxel), análagos da

platina (Cisplatina), nitrossouréias (Fotemustina), inibidores da topoisomerase e

26

antraciclinas, mas poucos têm mostrado uma taxa de resposta significativa (<20%)

ou um aumento nas taxas de sobrevida (ATKINS, 1997; GOGAS et al., 2007).

A eficácia da quimioterapia sozinha é menor que 10% onde o agente

quimioterápico mais eficaz é a Dacarbazina com aproximadamente 14% a 20% a

taxa de resposta e uma média de duração de quatro a seis meses. A Dacarbazina foi

aprovada em 1975 como o único agente quimioterápico para o tratamento de

melanoma metastático. Ela é mais eficaz em tumores subcutâneos, linfonodos e

metástases pulmonares. (HUNCHAREK et al., 2001; KLUGER et al., 2009).

A Dacarbazina é um pró-fármaco que, para que seu efeito antineoplásico

ocorra, ela precisa ser metabolizada por enzimas hepáticas, formando um

intermediário que decompoem-se imediatamente no derivado ativo, que metila o

DNA das células, impedindo-as de se replicar corretamente, ocasionando a

fragmentação do DNA e a morte celular (COLVIN, 2001).

3.3.2 Dor no câncer e melanoma

A dor é classificada como aguda e crônica e na definição da fisiopatologia, a

dor pode ser denominada de acordo com o tipo da lesão e/ou dos mediadores

envolvidos em “nociceptiva”, “neurogênica” e “psicogênica”, a qual está associada,

respectivamente, com estimulação excessiva dos nociceptores, com lesão ao tecido

neural, com disfunção do nervo ou com fatores psicológicos.

Além disso, podem ocorrer manifestações dolorosas decorrentes de algumas

alterações sensoriais comumente apresentadas em pacientes que a experimentam

como a hiperalgesia (sensibilidade exacerbada a um estímulo doloroso), alodínia

(sensibilidade anormal dos neurônios sensoriais) e hiperestesia (sensibilidade

anormal a um estímulo sensorial) (SERPELL et al., 1998; MILLAN, 1999; LOESER E

TREEDE., 2008). Em humanos pouco se sabe da distinção entre hiperalgesia e

alodínia, pois apesar do interesse clinico poucos estudos revelam as bases

moleculares para esta distinção (VERRI et al., 2005, SANTODOMINGO-GAZON.,

2006).

Expondo a pele ou mesmo qualquer outro órgão a diferentes estímulos, como

químicos, térmicos ou mecânicos, que induzem a uma sensação desagradável,

proporcionam ao indivíduo uma resposta de ativação, repassando assim a

informação sobre um perigo real ou potencial para sua integridade física. Este

27

mecanismo de resposta pode ser diferenciado como dor fisiológica ou dor

patológica; onde a dor fisiológica é aquela que vai induzir um reflexo, caracterizando

a dor conhecida como aguda causada pela ativação intensa, potencial ou efetiva dos

nociceptores (COSTIGAN et al., 2009), e a dor patológica, a qual está relacionada

com respostas adaptativas específicas, geradas por estímulos intensos na superfície

da pele, caracterizando a dor crônica (ALMEIDA et al., 2006).

A dor sentida por um paciente com câncer pode ser proveniente de diversos

fatores sendo que de 5 a 20% esta relacionada ao tratamento antitumoral como no

pós-operatório, pós-quimioterapia e pós-radioterapia. Muitos pacientes com câncer

avançado sofrem de mais de um tipo de dor e o tratamento adequado vai depender

da identificação de sua origem.

Muitos agentes farmacológicos são utilizados para alívio da dor nestes

pacientes como antiálgicos, opióides, antidepressivos entre outros, porém a

preocupação com o uso terapêutico destes é com seus efeitos adversos que são

inúmeros podendo causar dependência, depressão respiratória e até levar a óbito,

frente a tal situação cresce o interesse de descobertas de novas moléculas para fins

terapêuticos com atividade tanto antitumoral como analgésica (BRASIL, 2001).

3.4 Câncer e o processo de morte celular

Há mais de 30 anos atrás, Kerr, Wyllei e Durrie (1972), já diziam que a

apoptose através de suas características morfológicas sugeria ser um fenômeno já

programado. Podendo ser iniciada ou inibida por uma variedade de estímulos

ambientais, fisiológicos e patológicos. Com características morfológicas distintas

como a condensação nuclear e citoplasmática e fracionamento da célula, fragmentos

ultraestruturalmente bem preservados. No segundo momento, os referidos corpos

apoptóticos, onde se submetem a uma série de mudanças são rapidamente

degradados por enzimas lisossomais. O envolvimento da apoptose em tecidos

normais é responsável pela eliminação de células durante o desenvolvimento

embrionário normal. Ocorre espontaneamente em neoplasias malignas não tratadas,

e participa pelo menos em alguns tipos de regressão do tumor terapeuticamente

induzido. Estando envolvida na involução fisiológica e atrofia de vários tecidos e

órgãos.

28

A morte celular programada, ou apoptose, é considerada crítica para a

autodestruição celular, para uma variedade de processos, tais como o

desenvolvimento ou a prevenção da transformação oncogênica. A apoptose deve

ser rigorosamente controlada, pois seu mecanismo desregulado pode levar ao

desenvolvimento de um grande número de diferentes patologias. Porém, as células

desenvolveram um grande número de processos celulares que servem para impedir

o processo de morte celular programado inadequado ou prematuro. Estas

estratégias consideradas de sobrevivência celular, envolvem uma complexa rede

fisiológica, coordenada e sistemática, bem como mudanças genéticas que servem

para impedir a morte celular (GREENWOOD et al., 2011).

No processo apoptótico ocorre uma seqüência de eventos morfológicos e

atuação de um programa interno bioquímico de suicídio. Pode ser considerado um

mecanismo de autodefesa destruindo células infectadas com patógenos ou aquelas

que sofreram mutações. Neste caso, uma cascata de componentes celulares detecta

e destrói estas células ativando a via apoptótica prevenindo o desenvolvimento do

câncer (ROBBINS, COTRAN, 2008; FANELLI, et al., 2012).

Desde 2002 com o prêmio Nobel recebido por Sulston, Brenner e Horvitz

pelos estudos realizados sobre a morte celular programada, ou seja, que alterações

de vias apoptóticas são uma característica comum entre os tumores, permitindo que

as células cancerosas sobrevivam a intervenções quimioterapêuticas, o interesse

pelos mecanismos da apoptose como alvo para a terapia do câncer vem crescendo

(BARBOUR, 2002; RUFINI; MELINO, 2011).

Dividindo a apoptose em três fases, tem-se a fase de iniciação, a efetora e a

de degradação. A fase de iniciação é caracterizada por depender do tipo de estímulo

apoptótico recebido pela célula via intrínseca ou pela via extrínsica. A primeira fase

influencia a eficácia das fases subsequentes (efetora e de degradação). Na fase

efetora, ocorre a ativação da cascata de caspases, constituída da ativação de

proteases, nucleases, e de outros intermediários que participam dessa fase. E na

fase de degradação, a célula adquire as características bioquímicas e morfológicas

características desse processo (GREEN & KROEMER, 1998).

A morfologia de células apoptóticas é reconhecida por alterações no

citoesqueleto que induzem contração celular, agregação da cromatina levando a

aparência de núcleos picnóticos, fragmentação nuclear, formação de vesículas sem

perda de integridade da membrana e sem resposta inflamatória. O evento na

29

apoptose que define seu mecanismo é a ativação de cascatas de enzimas

proteolíticas denominadas caspases, as quais são responsáveis pela iniciação,

execução e regulação do processo apoptótico. Envolvidas num mecanismo de

clivagem específica de proteínas as caspases levam ao colapso da infra-estrutura

celular através da desintegração do citoesqueleto, desarranjo metabólico e

fragmentação genômica. Essas enzimas ativadas, por sua vez, ativam nucleases

como as CADs (DNAases ativadas por caspase) que degradam o DNA e outras

enzimas importantes de morte celular. Seus principais alvos são as proteínas

estruturais e de funções essenciais como proteínas requeridas no reparo do DNA

(DNA-PK, PARP), proteínas reguladoras do ciclo celular (Cdc27, Rb), proteínas

envolvidas em patologias humanas e proteínas diretamente envolvidas na regulação

da apoptose (ICAD, Bid), assim como reguladoras/mediadoras da sinalização

apoptótica (PKB/Akt, RIP quinase (kÖHLER et al., 2002, GHOBRIAL et al., 2005).

Duas vias distintas atuam na ativação das caspases, a via mitocondrial e a via

receptor de morte, denominadas de intrínseca e extrínseca, respectivamente

(CROCE, 2008).

A via extrínseca da apoptose (Figura 1) é iniciada após a ligação extracelular

de receptores localizados na superfície celular, denominados DR “death receptors”

com seus ligantes específicos, como o membro da superfamília do Fator de Necrose

Tumoral (TNF), que se acoplam a um receptor da família dos receptores de morte

correspondente (FAsL, FAS/CD95, TRAIL) induzindo, assim a sua oligomerização

(KUMAR, 2007), que resulta na formação do complexo intracelular de indução de

morte denominado DISC, que é o complexo sinalizador de morte celular, o qual é

formado pela interação entre a parte citoplasmática dos receptores com inúmeras

moléculas adaptadoras como FADD/MORT1 ( Proteína derivada da morte associada

a Fas) por exemplo. Está interação entre os receptores e moléculas adaptadoras

acontece através de domínios de interação proteína-proteína denominados domínios

de morte (DD) presentes em ambas as moléculas (FULDA, 2009).

Posteriormente, as caspases iniciadoras, como as caspases 8 ou 10, são

recrutadas onde interagem com moléculas adaptadoras. A interaçãos com proteínas

adaptadoras leva a oligomerização destas caspasaes, aumentando assim a

concentração local e favorecendo a autoclivagem e autoativação dessas caspases

iniciadoras. Sendo que, uma vez ativada a caspase 8 cliva e ativa a caspase 3,

30

induzindo diretamente a próxima fase do processo apoptótico a execução (FULDA,

2009).

A via mitocondrial ou intrínseca (Figura 1) inicia-se pela ação de diversos

sinais como danos no material genético, defeitos nos pontos de checagem do ciclo

celular, mitose catastrófica, hipóxia, ausência de fatores de crescimento, agentes

quimioterápicos, radiação, drogas citotóxicas e outros tipos severos de estresse

intracelulares. Envolvendo a ativação e extravasamento de proteínas pró-

apoptóticas para o citoplasma e ativação das caspases. Como Bax e Bad, que agem

na mitocôndria, afetando sua permeabilidade seletiva através da formação de poros

por onde extravasam fatores apoptogênicos como citocromo c.

Alguns estudos indicam que durante o processo apoptótico ocorre a formação

de um megaporo contendo proteínas, através deste ocorre a liberação do citocromo

c no citosol, em presença de dATP, induzindo a formação dos apoptossomos. O

apoptossomo consiste num heptâmero de moléculas adaptadoras APAF-1 (fator

ativador de protease apoptótica), que promove a clivagem da pró-caspase 9,

liberando a caspase 9 ativa. Esta caspase atua sequencialmente no processamento

e ativação das caspases efetoras 3 e 7 e iniciando a execução da apoptose

similarmente à caspase 8. O complexo apoptossômico provavelmente serve como

um regulador alostérico da caspase 9 que, em situações onde não haja estímulo

apoptótico, encontra-se livre no citosol na forma de monômeros inativos. A

integração da caspase 9 ao apoptossomo induz sua dimerização e ativação

(CROCE, 2008).

Abaixo desenho esquemático das duas vias (Figura 1).

31

Figura 1. Apoptose mediada pela via intrínseca (mitocondrial) e pela via extrínseca (receptores de

morte).

Fonte: Adaptado de Fulda et al., 2009.

As vias intrínseca e extrínseca podem agir em conjunto nas fases de indução

e execução do processo apoptótico, cooperando na recepção do sinal de morte e na

amplificação da ativação de caspases. Com isso, a ativação de receptores de morte

pode levar à ativação da via mitocondrial através da clivagem da proteína pró-

apoptótica Bid pela caspase 8. A Bid (tBid) transloca-se para a mitocôndria onde

ativa Bak e Bax, induzindo a oligomerização dessas moléculas e a formação de

poros por onde extravasam o citocromo c e demais fatores apoptogênicos

mitocondriais levando à ativação de caspases efetoras (FULDA, 2009).

A maioria dos tecidos sofre um constante processo de renovação celular

graças ao equilíbrio entre a proliferação e morte das células, caracterizada por um

processo ativo de alterações morfológicas e bioquímicas, a apoptose. A

compreensão dos mecanismos e das alterações nos componentes das vias

apoptóticas e sua correlação com a ocorrência do câncer são importantes para o

desenvolvimento de novas terapias e métodos de prevenção do câncer (Grivicich et

al., 2007)

32

A necrose foi descrita em detalhes por Walker et al. (1988) e tem sido

considerada por anos como uma forma acidental e descontrolada de morte celular.

A necrose é morfologicamente identificada por um aumento na volume da célula

(oncose), expansão das organelas e plasma, ruptura da membrana seguido por

perda de conteúdo intracelular. Além disso, ela demonstra comprometimento

bioenergético, degradação aleatória do DNA e desencadeia a liberação de fatores

envolvidos na estimulação da resposta imune ou ativa o sistema de reparo de

feridas e lesões (WALKER et al., 1988; ZONG et al., 2006). Todos estes eventos

resultam em perda de função homeostática. A necrose, diferentemente da apoptose,

impede a reposição celular e a regeneração de tecidos (PORTH, 2004).

A morte celular por necrose não é considerada a via desejada pelos

medicamentos antitumorais, por não ser um processo específico para as células

cancerígenas assim como, pela promoção de processo inflamatório intenso

(BURLACU et al., 2001). É considerada uma resposta passiva à lesão celular,

entretanto estudos recentes sugerem que a necrose também pode ser regulada

geneticamente (ZONG; THOMPSON, 2006).

A definição de apoptose considera que a eliminação da célula apoptótica é

realizada por lesão irreversível e, na sequência fagocitada. No entanto, outro

processo pode estar envolvido, a necrose secundária, a qual é um processo

autolítico de desintegração celular com liberação de componentes celulares que

ocorre quando não existe intervenção de de células fagocitárias e todo o sistema

apoptótico é completado. Necrose secundária tem sido implicada na gênese de

importantes patologias humanas, é uma forma de eliminação de células e deve ser

considerada como o resultado natural de todo o programa de apoptose (SILVA,

2010).

Com isso, é de interesse ressaltar que inúmeros medicamentos que foram

desenvolvidos para o tratamento do câncer e doenças infecciosas são derivados de

plantas, a seguir será mencionado a importância das plantas medicinais na terapia

antitumoral.

33

3.5 Importância das plantas medicinais na terapia antitumoral

A natureza, de maneira pródiga, tem produzido a maioria das substâncias

orgânicas conhecidas. Dentre os diversos reinos da natureza, o reino vegetal é o

que tem contribuído de forma mais significativa para o fornecimento de metabólitos

secundários, muitos destes de extremo valor agregado devido às suas aplicações

como medicamentos, cosméticos, alimentos e agroquímicos (PHILLIPSON et al,

1998).

A medicina tradicional tem sido empregada por milhares de anos em todo o

mundo, tendo um papel essencial no cuidado a saúde. Desde os primórdios dos

tempos as plantas medicinais são fundamentais tanto para a alimentação quanto

para a cura de doenças. Para a população, o uso de plantas medicinais, muitas

vezes, é a opção disponível e a mais aceita (CECHINEL FILHO et al, 2003). A

Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 80% dos habitantes mundiais se

beneficiam desta medicina (CECHINEL FILHO et al., 2007).

O Brasil possui grande diversidade vegetal e em muitos países a pesquisa

com plantas vem aumentando significativamente o interesse por fontes alternativas

de medicamentos. Dos 250 medicamentos considerados como básicos e essenciais

pela Organização Mundial da Saúde (OMS), 11% são obtidos de plantas medicinais.

Considerando que o Brasil possui uma flora invejável para o resto do mundo, em

termos de matéria prima para a produção de fitofármacos, e que apenas cerca de

8% foram estudadas, é de grande importância a busca e estudos dessas plantas,

impulsionando as pesquisas para a obtenção de novos fármacos mais eficazes e

específicos (BRAZ-FILHO, 2010; CECHINEL FILHO et al., 2003).

A necessidade do desenvolvimento de novos fármacos eficazes de ação

antitumoral e dotados de menores efeitos adversos comparada à quimioterapia e

radioterapia tradicionais tem impulsionado a comunidade científica a novas e

incessantes pesquisas nesta área. Além da diversidade de tumores que ainda não

possuem tratamento satisfatório, os quimioterápicos atuais provocam leucopenia,

deixando o paciente susceptível a infecções. Então, um possível tratamento que

condicione o estímulo do sistema imunológico auxiliaria na recuperação do paciente,

proporcionando um possível prognóstico mais favorável para a cura (HENTY et al.,

2001; NEVIN; VIJAYAMMAL, 2003; PAGNO, 2004).

34

Dentre os fármacos antineoplásicos derivados de plantas usados clinicamente

ressalta-se os alcalóides vimblastina (Velban®) e vincristina (Oncovin®), ambos

extraídos de Catharantus roseus, utilizados para o tratamento de linfomas e na

leucemia infantil (PASA et al., 2001; CRAGG; NEWMAN, 2007) (Figura 2). Entre os

alcalóides da vinca, a existência de pequenas diferenças na estrutura resulta em

notáveis diferenças na toxicidade e nos espectros antitumorais.

Estas moléculas têm a ação de inibir o fuso mitótico, ligando-se as proteínas

microtubulares assim, interrompendo a divisão celular (SUI et al., 2005). A

incapacidade de segregação correta dos cromossomos durante a mitose leva à

morte celular. Tanto as células normais quanto as malignas expostas à vincristina

sofrem alterações características do processo de apoptose (HAIT et al., 2007).

Figura 2. Estrutura química de alcalóides derivados de Catharantus roseus a (A) Vincristina e (B) Vinblastina

N

CH3CO

H3CO

HO

N

OH

CH3

H

COCH3

OCH3

O

C

O

OH

HCHO

N

N

N

C

OH3CO

H3CO

H

N

OH

CH3

HN

COCH3

OCH3

O

C

O

OH

HCH3

N

Fonte: BOLZANI et al., 2002.

O diterpeno taxol ou paclitaxel (Taxol®) é considerada uma das mais

promissoras descobertas para a cura do câncer. Isolado de Taxus brevifolia, é

empregado para o tratamento dos cânceres ovariano, mamário e pulmonar

(GANESAN, 2008). O mecanismo de ação desses medicamentos é único. Os

taxanos impedem a ocorrência da mitose pela interferência no funcionamento normal

dos microtúbulos (Figura 3). Eles agem como agentes estabilizadores da tubulina,

favorecendo a sua polimerização, porém inibindo a despolimerização dos

microtúbulos, levando à morte das células cancerosas (MALONGA et al., 2005).

A B

35

Figura 3. Estrutura química do Paclitaxel (Taxol®)

Fonte: BOLZANI et al., 2002;

Outro importante agente antineoplásico é a Camptotecina alcalóide extraído

da Campotheca acuminata Decne, que age inibindo a enzima topoisomerase I. É

utilizada para o tratamento de câncer ovariano e cervical (BUTLER, 2004). Devido à

sua alta toxicidade, a semisíntese da camptotecina deu origem ao derivado

irinotecano, que apresentou menos efeitos tóxicos. A partir desta última molécula,

obteve-se ainda o topotecano (Figura 4) (CHOI et al., 2008).

Figura 4. Estrutura química da Camptotecina, isolada de Camptotheca acuminata

Fonte: BOLZANI et al., 2002; NEGI et al., 2005.

Outros agentes clinicamente ativos são o etoposídeo (Veperide®) e o

teniposídeo (Figura 5) (Vumon®), derivados semi-sintéticos do produto natural

O

OH

OH

H

O

OO

H

CH3

H3C

O

O

OH

O

O

O

O

NHO

N

H3C

HO

O

N

O

O

36

epipodofilotoxina. Eles podem ser considerados os compostos mais relacionados

com o emprego original da planta no tratamento de câncer. A epipodofilotoxina é um

isômero da podofilotoxina que foi isolada como um agente ativo antitumoral obtido

das raízes de várias espécies do gênero Podophyllum, ambos atuam inibindo a

enzima topoisomerase II (CRAGG; NEWMAN, 2007).

Figura 5. Estrutura química da Podofilotoxina de Podophyllum emodi e P. peltatum e os derivados semi-sintéticos (A) etoposídeo e (B) teniposídeo

Fonte: BOLZANI et al.; 2002.

Além destas moléculas utilizadas na terapia contra o câncer, outros

quimioterápicos são utilizados em combinação com outras terapias ou utilizadas

isoladamente. A descoberta e desenvolvimento de medicamentos contra o câncer foi

revolucionada na última década. Devido a alta toxicidade de muitos fármacos, a

pouca eficácia bem com a resistência adquirida, a terapia antineoplásica passou de

uma quimioterapia citotóxica para uma estratégia de medicina personalizada que

enfoca a descoberta e o desenvolvimento de medicamentos molecularmente

orientados que exploram a genética, vícios, dependências e vulnerabilidades de

células do câncer (HOELDER; WORKMAN, 2012).

Muitas dessas substâncias servem como protótiposs para o desenvolvimento

de medicamentos sintéticos modernos como citado anteriormente. Neste contexto, é

O

HOHOO

O

OCH3

OH

CH3O

O

OO

OOCH3

OH

O

OCH3

OCH3

CH3O

O

OO

A

B

37

através destes conhecimentos adquiridos e descobertos através dos produtos

naturais que podemos entender a busca incessante de algumas indústrias e

pesquisadores por busca de substâncias bioativas novas.

3.6 Gênero Vernonia: Ocorrência e aspectos Biológicos

O gênero Vernonia é pertencente à família Asteraceae (Compositae)

compreende 1100 gêneros e 2500 espécies, sendo a maior família das

angiospermas. Compreende plantas de hábitos bem variados como ervas,

subarbustos, trepadeiras e árvores, a grande maioria de pequeno porte (JOLY,

1998). Segundo Bremer (1994 apud NAKAJIMA, 2001), a família Asteraceae

representa cerca de 10% da flora mundial e vem sendo muito estudada nos últimos

anos.

Estima-se que o Brasil possua 200 espécies de Vernonia, utilizadas na

medicina popular para o tratamento de diversas desordens. A espécie V. cinerea

demonstrou significante atividade analgésica, antiinflamatória e antipirética em

estudo realizado em ratos onde foi analisado o efeito de vários extratos da planta

(IWALEWA, 2003). A V. amygdalina provavelmente é a mais usada como planta

medicinal do gênero Vernonia, apresentando tanto atividade antibacteriana quanto

antifúngica (ERASTO et al., 2006). Também foi relatado atividade antitumoral nas

espécies V. pachyclada, V. amygdalina e V. scorpioides (PAGNO, 2004; WILLIAMS

et al., 2005).

Rao et al.,(2010), demonstraram atividade antidiabética e antihiperglicemiante

das sementes de Vernonia anthelmintica, em diabetes induzida por estreptozocina

em ratos, sem relato de efeitos tóxicos. O nome científico da planta indica que é uma

erva medicinal utilizada na medicina popular como antihelmíntico (HORDEGEN et

al., 2003).

As lactonas sesquiterpênicas têm demonstrado inúmeras atividades

biológicas como citotóxica e imunomoduladora (IZEVBIGIE et al., 2004; BUSKUHL

et al., 2007), antibacteriana (AFOLAYAN et al., 2006), antitumoral e antinflamatória

(PAGNO et al., 2006).

A espécie V. scorpioides (Figura 6) é uma erva comum da vegetação

secundária da encosta atlântica e da floresta latifoliada do alto do Uruguai, no

extremo oeste catarinense. Apresenta também uma extensa distribuição geográfica,

38

sendo encontrada desde o Ceará até o Rio Grande do Sul, como também no centro-

oeste conhecida popularmente como Enxuga, Erva de São Simão e Piracá

(CORREA, 1984; CABRERA, 1980). Exibe características físicas de arbusto, com

ramos numerosos(Figura 6) (CORREA, 1978; REITZ, 1980). Na medicina popular é

utilizada por via tópica no tratamento de várias desordens cutâneas, incluindo

úlceras crônicas, alergias, irritações, prurido, edemas provocados por traumatismos

ou infecção, nevralgia, processos inflamatórios e lesões cutâneas em geral

(CABREIRA,1980).

Figura 6. Foto das partes aéreas de Vernonia scorpioides (LAM) PERS.

Fonte: Cytocymura, 2010

Das inúmeras espécies de Vernonia encontradas no Brasil, a Vernonia

scorpioides é utilizada popularmente como antiinflamatório e cicatrizante, sendo o

efeito cicatrizante comprovado por Almeida e Palhano (2001) e a ação

antiinflamatória confirmada por Dalazen et al. (2005). Estudos são encontrados com

relação à atividade biológica da espécie, em relação a sua ação citotóxica, ação

antiinflamatória e antimicrobiana (TOIGO et al.; 2004; LEITE et al., 2002; BARDON,

2007; IWALEWA,2003; ERASTO et al., 2006; PAGNO, 2004; WILLIAMS et al., 2005)

Considerando que a Vernonia scorpioides é uma planta comumente utilizada

na medicina popular para o tratamento de desordens da pele e tendo informações

sobre suas propriedades farmacológicas, a atividade antinflamatória do extrato

etanólico da mesma foi investigada em modelos murinos de inflamação cutânea

aguda e crônica, apresentando inibição significativa da migração de neutrófilos no

tecido inflamado (CABRINI et al., 2011).

39

Dreux (2005) demonstrou atividade antiinflamatória do extrato hidroalcóolico

administrado por via intraperitonial, em modelos de edema de pata induzido por

carragenina e histamina em camundongos. Com a administração oral deste extrato

em modelo de peritonite induzida por carragenina, pode-se observar uma redução

significativa na migração de neutrófilos e leucócitos mononucleares, confirmando

uma ação antiinflamatória.

O efeito citotóxico da fração diclorometano de V. scorpioides também foi

verificado em estudo com camundongos tratados com este extrato em modelo de

lesões cutâneas (DALAZEN E MOLON, 2003).

Kreuger et al., (2009) verificaram ainda que a fração 2125 de extrato das

folhas da V. scorpioides apresentou atividade antitumoral em camundongos com

tumor de Ehrlich, quando tratados por via intraperitoneal. Similarmente, Pagno

(2006) demonstrou uma alta citotoxicidade contra o tumor de Ehrlich, em

camundongos, com fração diclorometano de V. scorpioides.

A atividade citotóxica de Vernonia sp, assim como da espécie scorpioides, é

atribuída em parte a presença de lactonas sesquiterpênicas em sua fração

diclorometano. Entretanto, Buskuhl et al., (2007) identificaram substâncias ativas na

fração acetato de etila, denominado de poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-

ona, com potencial citotóxico, preliminarmente avaliados em linhagens celulares de

adenocarcinoma (Hela), melanoma (B16F10) e de fibroblasto (L929).

3.6.1 Poliacetileno: Atividades Biológicas

Produtos naturais acetilênicos incluem todos as substâncias com ligação tripla

ou um grupo alquil funcional, embora o termo poliacetileno seja, muitas vezes,

utilizado para descrever esta classe de produtos naturais. Produtos naturais

acetilênicos são amplamente distribuídos, ocorrendo em plantas, musgos e liquens,

fungos, algas marinhas, esponjas, tunicados, insetos, sapos e até em pequenas

quantidades em humanos. Os próprios compostos tendem a ser instáveis perante

oxidação, fotolíticos ou decomposição dependente de pH, desafiando seu

isolamento e caracterização (ARNAUD, 1892,1902 apud MINTO et al, 2008).

O primeiro produto natural alcino foi isolado em 1826, o éster

dehidromatricaria (Figura 7), porém não foi totalmente caracterizado naquela época.

Entre os anos 1960 a 1980 os produtos naturais altamente insaturados começaram

40

a ser sintetizados devido ao crescimento dos químicos orgânicos no âmbito de

conhecimento químico (BOHLMANN et al.,1973). Nos últimos 25 anos com o

crescimento no aspecto de exploração, isolamento e síntese, o aumento do número

de novos poliacetilenos tem se destacado, mais de 2000 poliacetilenos são

conhecidos, sendo mais de 1100 de plantas da família Asteraceae (MINTO;

BLACKLOCK, 2008).

Figura 7. Representação da estrutura química de éster dehidromatricaria

Fonte: MINTO;BLACKLOCK, 2008.

Poliacetilenos com origem de produtos naturais como mencionado

anteriormente são uma classe de compostos frequentemente instáveis contendo

uma ligação tripla carbono-carbono, coM ampla variedade de funções bioquímicas,

ecológicas, com potencial econômico e, de modo surpreendente de biossíntese.

Experimentos realizados entre 1960 e 1990 demonstraram que a maioria destes

compostos são derivados de ácidos graxos e precursores policetídeos.

Durante a última década, a investigação sobre o metabolismo de

poliacetilenos tem avançado, o estado atual do conhecimento da genética

bioquímica e molecular de vias metabólicas secundárias poliacetilênicas tem sido

apresentado em pesquisas com novos poliacetilenos terrestres e marinhos (MINTO

et al., 2008).

Os Poliacetilenos vem sendo identificados em muitos estudos, considerados

uma classe de produtos naturais que tem demonstrado várias atividades biológicas,

incluindo ação antimicrobiana, inibidor da bomba de sódio e potássio ATPase,

inibidor do HIV, envolvidos em atividade imunosupressora, antitumoral e

antinflamatória (FUSETANI et al., 1993; HALLOCK et al., 1995; CHRISTENSEN et

al., 2006).

Em um estudo realizado por Nho et al., (2010), foi isolado o poliacetileno

Gymnasterkoreayne (GKB) da espécie Gymnaster koraiensis, uma planta endêmica

Coreana, o qual demonstrou efeitos quimiopreventivos em ensaios in vitro e in vivo,

41

através de enzimas de desintoxicação, resultando na proteção de células do

estresse oxidativo e hepatotoxicidade.

O interesse por produtos naturais marinhos tem aumentado nos últimos

tempos. Uma espécie de interesse farmacológico é a esponja marinha Petrosia sp.

Segundo Kim et al (2002), o poliacetileno Dideoxypetrosynol A isolado deste

organismo apresentou significativa citotoxicidade sobre diversas células tumorais

humanas. Evidenciou-se que este poliacetileno inibiu a replicação do DNA,

predominantemente no seu estágio inicial de replicação.

O poliacetileno isolado do extrato clorofórmico das folhas de Crithmum

maritimum denominado falcarindiol, amplamente distribuído na família Apiacea,

demonstrou atividade contra Micrococcus luteus e Bacillus cereus. Também

apresentou atividade citotóxica em células IEC-6 (células epitélio intestinal de rato)

após exposição por 48 horas. Estes estudos sugeriram que Crithmum maritimum

pode ser potencialmente utilizado em fábricas de produtos alimentares e

cosmetologia como agentes conservantes e biopesticidas, ou na medicina como

novos antibióticos (DUROS et al., 2010).

Aralia nudicaulis, uma planta medicinal canadense conhecida como

salsaparilha selvagem, é utilizada para muitas doenças como a tuberculose. Gray e

colaboradores (2012) investigaram o extrato aquoso desta planta isolando dois

poliacetilenos, o (3R)-falcarinol e (3R, 9R, 10S)-panaxidol, que apresentaram

significativa atividade contra a Mycobacterium tuberculosis H37Ra.

A Panax ginseng, tem sido fonte de inúmeras substâncias inclusive

poliacetilenos. Suas raízes são usadas popularmente no Japão, China e Korea

devido ao efeito tônico. Dois novos poliacetilenos, o 1-hidroxidihidropanaxacol e o

17-hidroxipanaxacol foram isolados e investigados da Panax ginseng, apresentando

atividade antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,

Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatus (ORIHARA et AL., 2012).

O fracionamento do extrato n-hexano de raízes de Echinacea pallida levou ao

isolamento de dois poliacetilenos, mostrando que o poliacetileno mais hidrofóbico

apresentou atividade moderada frente às células de adenocarcinoma do pâncreas

(PELLATI, 2006).

Buskühl (2009) isolou e caracterizou o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-

2(5H)-ona (Figura 8) a partir da fração diclorometano obtida pelo fracionamento do

extrato hidroalcoólico obtido de flores e folhas da V. scorpioides. Deste foi

42

investigado o potencial antitumoral e genotóxico em várias linhagens celulares,

observando resultados significantes. O mesmo poliacetileno demonstrou uma

diminuição da viabilidade celular frente às células B16F10 após exposição de 24

horas, demonstrando um processo necrótico, juntamente com o apoptótico.

Entretanto ficou evidenciado que o poliacetileno apresentou maiores índices de

apoptose, apesar de não ser exclusivo.

Devido aos dados promissores o interesse pelo estudo do mecanismo de ação

do poliacetileno e seu possível efeito antineoplásico cresceu. Deste modo, neste

trabalho os estudos farmacológicos in vitro e in vivo do composto isolado de

Vernonia scorpioides o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona foi avaliado,

demonstrando sua atividade citotóxica, como indicativo de propriedade antitumoral,

bem como estudos iniciais in vivo, possibilitando evidenciar mecanismos de ação e

seu efeito antitumoral.

Figura 8. Poliacetileno isolado de V. scorpioides

PM: C12H8O2 PM: 184 g/mol

5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona

Fonte: BUSKUHL et al., 2009.

43

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material vegetal: composto isolado

O poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, obtido das partes aéreas

da espécie Vernonia scorpioides, foi gentilemente cedido pela Dra. Maique W.

Biavatti, Universidade Federal de Santa Catarina. Foi preparado na concentração de

1mg/mL em PBS 0,1 M pH 7,4 contendo 1% de DMSO e posteriormente diluído no

mesmo solvente (DMSO) em fluxo laminar.

4.2 Ensaios in vitro

4.2.1 Linhagens celulares

As linhagens celulares utilizadas foram B16F10 (melanoma murino), PC3

(câncer de próstata humano), LNCaP (câncer de próstata humano), H1299

(carcinoma de pulmão humano), OVCAR (adenocarcinoma de ovário humano), NCI

(câncer de pulmão), MCF-7 (adenocarcinoma de mama humano), U138MG

(adenocarcinoma cervical humano), VW473 (meduloblastoma humano), HELA

(adenocarcinoma cervical), T84 (adenocarcinoma cólon humano), HOS

(osteosarcoma humano), MG63 (osteosarcoma humano), NK562 (natural Killer-

leucêmia sensível), KG1 (mielóide humano), HL60 (leucemia promielocítica

humana), NB4 (leucemia promielocítica aguda humana), RAMOS (linfoma humano

de Burkitt’s), RAJI (linfoma humano de Burkitt’s), U937 (Leucemia linfoma

monocitico humano), JURKAT (leucemia/linfoma das células T), MOLT4 (leucemia

linfoblastica aguda humana), NALM6 (leucemia linfoblástica aguda humana), B15

(leucemia linfoblastica aguda humana), RS4 (leucemia aguda humana) e CMNH

linfócitos não tumorais. As células foram cultivadas em meio MEM ou RPMI 1640

(Gibco-BRL) suplementadas com 10% de soro fetal bovino inativado (Gibco),

contendo 1% de uma solução de antibióticos (Gibco) (5mg/mL de penicilina, 5mg/mL

de streptomicina e 10mg/ml de neomicina), 2 mM L-Glutamina (Glutamax-Gibco) and

piruvato de sódio (Gibco). As células foram mantidas em estufa CO2 5% a 37°C.

44

4.2.1.1 Obtenção das células mononucleares humanas normais

As CMHN foram obtidas por separação em gradiente de densidade conforme

método descrito por Boyum (1968) e modificado por Boyum (1976). O sangue

venoso foi coletado assepticamente a vácuo em tubos estéreis contendo heparina

sódica. Os tubos foram centrifugados a 1500 rpm durante 5 minutos à temperatura

ambiente (Fanem, modelo 206-BR Exelsa Baby II, São Paulo, SP, BRASIL). A

interface entre os eritrócitos e o plasma contendo os leucócitos foi colhida e diluída a

1:2 com tampão salina fosfato estéril 0,1M, pH7,4 (PBS). Esta suspensão celular foi

depositada lentamente sobre o gradiente de densidade Ficcoll Paque™ (densidade

de 1,077, Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia). Após centrifugação a 3000 rpm

durante 15 minutos em temperatura ambiente, foi removido o anel de células

mononucleares formado sobre o Ficcoll Paque™ e a segunda centrifugação a 1000

rpm por 5 minutos para retirada das plaquetas. O precipitado celular resultante foi

ressuspenso em 1 mL de meio de cultura RPMI suplementado e quantificado em

câmara de Neubauer, sendo avaliada simultaneamente a viabilidade celular pelo

teste de exclusão com Azul de Tripan a 0,4% em PBS (Sigma). Somente foram

utilizadas suspensões celulares com viabilidade superior a 90%.

4.2.1.2 Cultura de Células

Os testes com a linhagem celular B16F10 obtida a partir de melanoma de

pele de camundongos (Mus musculus C57BL/6J) (BCRJ CR010) e células

mononucleares normais humanas foram realizados no laboratório de Farmacologia

in Vitro (Laboratório de cultivo celular animal) da UNIVALI. Os testes com as

linhagens celulares de tumores sólidos humanos e leucemias humanas foram

realizados no Centro Integrado de Pesquisa Oncológica da Infância (CIPOI),

UNICAMP com a colaboração de Alexandre Nowill e Gilberto Carlos Franchi Junior.

As linhagens celulares foram cultivadas a 37o C 5% CO2 em meio MEM ou RPMI

1640 (Gibco-BRL) suplementado com Soro Fetal Bovino (Gibco) a 10% já estéril,

inativado e filtrado em fluxo laminar, e 1% de mistura de antibióticos (Gibco 15640)

sendo 5mg/mL de penicilina, 5mg/mL de estreptomicina e 10mg/ml de neomicina e

45

antifúngico (Gibco) (250 μg/ml), 2mM de L-glutamina (Ajinomotto) e piruvato de

sódio (Gibco) para as linhagens leucêmicas e de tumores sólidos humano.

As células foram descongeladas rapidamente em banho-maria a 37˚C e

transferidas para garrafas de cultivo celular, em meio de cultura apropriado e

devidamente suplementado como descrito acima, e mantidas a 37º C, com 5% de

CO2.

O meio de cultura MEM foi trocado a cada 2 dias até uma confluência de 80-

90% das células na garrafa, sendo então realizado o procedimento de tripsinização.

As células foram lavadas com PBS 0,1 M pH 7.4. Posteriormente, foi adicionado 1

mL de tripsina (0,25% tripsina,0.038% EDTA) seguido de incubação em estufa a

37ºC/, 5% de CO2, por no máximo 10 minutos.. A atividade da tripsina foi inativada

com meio MEM contendo 10% de soro fetal bovino e íons Mg++ e Ca++, seguido de

transferência das células para um tubo falcon de 15 mL, centrifugação a 1000 xg/10

min a 10oC, descarte do sobrenadante e ressuspensão em meio MEM suplementado

e transferências em um “split” de 1:3 a 1:6.

4.2.1.3 Determinação da viabilidade Celular pela exclusão do corante azul de

tripan

Para a avaliação da viabilidade celular foi utilizado o corante azul de tripan

diluído em PBS (0,4%). Após tripsinização as células foram ressuspendidas em meio

MEM e adicionado azul de tripan a 0,4% com posterior contagem em câmara de

Neubauer através de microscópio óptico em aumento de 400X, avaliando-se o

número de células vivas (não coradas) e mortas (coradas). A viabilidade celular foi

determinada utilizando-se a seguinte equação:

46

4.2.1.2.1 Ensaios de Citotoxicidade (MTT)

Na figura 9 tem-se o esquema de metabolização do MTT em sais de

formazan em células viáveis, que em meio biológico ocorre através da enzima

mitocondrial succinato desidrogenase. A citotoxicidade nas células foi determinada

pelo teste MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio brometo) (Sigma). O MTT

(sal de tetrazólio) é convertido em sal de formazan, em células vivas, principalmente

pela atividade da succinato desidrogenase mitocondrial, formando uma coloração

azulada (sal de formazan) (MOSMANN, 1983).

Figura 9. Esquema representando a metabolização do MTT.

Fonte: Roche, 2008.

Os testes de citotoxicidade das células tumorais PC3, LNCAP, H1299,

OVCAR, NCI, T84, MCF-7, U138MG, VW473, HELA, HOS e MG63 e células

leucêmicas K562, KG1, HL60, NB4, RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT, MOLT4, NALM6,

B15 e U937 foram realizados no Centro Integrado de Pesquisa Oncológica da

Infância (CIPOI), UNICAMP com a colaboração de Alexandre Nowill e Gilberto

Carlos Franchi Junior. Os demais experimentos foram realizados no laboratório de

cultivo celular animal da UNIVALI.

Os ensaios foram realizados em triplicata de experimentos independentes, em

quadruplicata para cada tipo celular por experimento. As células foram plaqueadas,

em placas de 96 poços, a 1.104 células/poço e incubadas com 200 L de meio MEM

suplementado por 24h a 37C em 5% CO2. Posteriormente, o meio foi removido e

substituído por 180 μL de meio MEM ou RPMI suplementado e foram adicionadas 20

μL da substância teste em diferentes concentrações (0,054; 0,54; 5,4; 54 e 543 μM),

dos fármacos paclitaxel (0,01; 0,1; 1; 10 e 100 µM), doxorubicina (0,01; 0,1; 1; 10 e

47

100 µM), daunorubicina (0,01; 0,1; 1; 10 e 100 µM) e do controle negativo (meio de

cultura com SFB contendo 1% de DMSO) e incubadas por 48h ( células leucêmicas)

e 24h (células tumorais) a 37ºC em estufa CO2 5%. Após este tempo foi retirado o

meio e adicionado 180 L de MEM sem SFB e 20 L de MTT (5 mg/mL) e foram

novamente incubadas por 4h a 37ºC em 5% CO2. O meio, juntamente com o MTT,

foi retirado e os cristais de formazan insolúveis foram dissolvidos em 100 L de

DMSO 1%. A determinação da absorbância foi realizada em leitor de microplaca a

570 nm (MOSMANN, 1983). A viabilidade relativa das células relacionadas ao

controle sem as substâncias testes foi calculada conforme equação abaixo.

A utilização dos fármacos antitumorais na avaliação da viabilidade celular foi

realizada para fins comparativos em relação ao composto isolado.

4.2.1.2.2 Ensaio de citotoxicidade (XTT)

A citotoxicidade das CMHN foi avaliada pelo teste XTT (2,3-bis (2- metil-4-

nitro-5-sulfofenil) – 5-[(fenilamino) carbonil] – 2H- hidróxido de tetrazólio) (Figura 11).

Neste teste, o XTT sofre redução pela atividade da desidrogenase

mitocondrial das células vivas e é convertido em sal formazan solúvel em água

permitindo a quantificação da coloração formada em espectrofotômetro

(MARSHALL; GOODWIN; HOLT; 1999). Este ensaio apresenta a vantagem de não

necessitar do processo de solubilização, permitindo leituras de absorbância direta,

uma vez que as CMHN crescem em suspensão. Além disto, há redução do tempo e

risco de erros no procedimento. Quando o XTT é associado ao metassulfato de

fenazina apresenta maior sensibilidade e maior faixa dinâmica do método de

citotoxicidade, devido ao acoplamento de elétrons causados pelas enzimas

oxirredutases de membrana (MARSHALL; GOODWIN; HOLT, 1999).

Após a obtenção das CMHN, foram plaqueados 180 µL da suspensão celular,

mantida em meio RPMI e suplementado com 10% SFB (GIBCO), antibióticos PSN

(Gibco, 5mg/mL de penicilina, 5mg/mL de estreptomicina e 10 mg/ml de neomicina)

e antifúngico (Gibco, anfotericina 250µg/ml), 2mM de L-glutamina estéril (Ajinomoto),

48

em placas de 96 poços a uma densidade celular de 1,5.105 células/poço e

adicionadas 20µL do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona em

diferentes concentrações (0,054; 0,54; 5,4; 54 e 543μM) do controle positivo triton X-

100 a 1% e do paclitaxel ( 0,1;1;10 e 100µM) e do controle negativo (meio RPMI sem

SFB contendo 1% de DMSO), mantidas por 44 horas a 37˚C em 5% de CO2. Após foi

adicionado 20µl de XTT (3mg/mL) com metassulfato de fenazina 1%, previamente

diluída em PBS estéril e incubadas por mais 4h a 37ºC em 5% CO2 para a formação

dos cristais de formazan. A determinação da absorbância foi realizada em leitor de

microplaca a 492nm e referência a 690nm. A viabilidade relativa das células

relacionadas ao controle sem o composto foi calculada utilizando a equação abaixo:

Figura 10. Esquema representando a metabolização do XTT.

Fonte: Roche, 2008

4.2.2 Avaliação do processo de morte celular por microscopia de

fluorescência

4.2.2.1 Análise através dos corantes brometo de etídeo e diacetato de

fluoresceína

Para confirmação dos dados obtidos no ensaio de citotoxicidade as células de

melanoma murino B16F10 foram plaqueadas em placas de 96 poços na

concentração de 1.104 células por poço e incubadas com 200 L de meio MEM

49

suplementado por 24 h a 37ºC em estufa CO2 5%. Após este período o meio foi

removido e substituído por 180 μL de meio MEM suplementado e foram adicionadas

20 μL do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, com concentrações finais

de (0,054; 0,54; 5,4; 54 e 543 μM), do controle positivo Paclitaxel (0,01; 0,1; 1, 10 e

100µM), e do controle negativo (meio MEM com soro fetal bovino e solvente 1%

DMSO) sendo mantidas em estufa a 37ºC a CO2 5% por 24, 48 e 72 h.

Posteriormente o meio de cultura foi removido e as células foram fixadas com 100

µL de metanol gelado por 10 minutos. O corante diacetato de fluoresceína (5mg/ml)

foi diluído em acetona mantido em freezer -20˚C e posteriormente diluído para a

concentração de trabalho (1:100). O brometo de etídeo (0,1mg/mL), para a solução

final foi adicionado 10 µL de diacetato de floresceína e 1mL de brometo de etídeo

conservado em freezer -20˚C e vedado de luz. Após o tempo de incubação o

sobrenadante da placa foi removido e adicionado 100 µL de metanol gelado e

deixado em geladeira por aproximadamente 10 minutos. Retirado o metanol as

células foram hidratadas com 100µL de PBS e posteriormente colocado 100 µL da

solução dos corantes. A solução estoque de diacetato de fluoresceína (5mg/mL) foi

diluída em uma proporção 1:100 em brometo de etídeo (0,3 mg/mL em PSB estéril)

e em seguida incubados por 10 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante

foi removido e lavado com 100 µL de PBS estéril para posterior análise morfológica

celular.

Realizou-se a análise em microscópio de fluorescência (Olympus

CKX41SF2, sistema de fluorescência CKX41-RFA e Sistema Olympus Q-color3 de

aquisição de imagens, da Olympus Optical Co. Ltd., e filtro de 480 e 520 nm)

(NOBRE JUNIOR, 2006).

4.2.2.2 Análise através dos corantes brometo de etídeo e alaranjado de acridina

São inúmeras as técnicas designadas para identificar, quantificar e

caracterizar os mecanismos de morte celular apoptose e necrose. Podendo analisar

as características morfológicas destes mecanismos através da sua coloração, a

segunda metodologia empregada para avaliar estes mecanismos de morte celular foi

realizada com os corantes de alaranjado de acridina e brometo de etídeo.

Este método de coloração pelo BE e AA (MCGAHON et al., 1995) permite

diferenciar células viáveis daquelas em processo de morte por apoptose ou necrose,

50

através da coloração diferencial por fluorescência dos corantes alaranjado de

acridina e brometo de etídeo (0,1 mg/mL). Este método baseia-se na revelação das

células controle e tratadas com a coloração por BE e AA no núcleo. O corante AA

intercala-se ao DNA, sendo capaz de permear membranas intactas, penetrando em

células viáveis e inviáveis emitindo fluorescência verde e fluorescência vermelho-

alaranjado. Após ligação com RNA e devido ao seu acúmulo nos lisossomas. Já o

corante BE emite fluorescência vermelha depois que intercala no DNA de células

com alguma alteração membranar (último estágio de apoptose e necrose). As

células viáveis com membrana intacta apresentam núcleo uniformemente corado de

verde pelo AA. E como o BE não é capaz de atravessar a membrana íntegra, esta

não é marcada ou pouco marcada. As células em apoptose inicial, possuindo a

membrana intacta, apresentam manchas verdes brilhantes no núcleo, devido à

característica morfológica de condensação da cromatina e não são marcadas por

BE; morfologicamente podem-se observar alterações da membrana em decorrência

da formação de corpúsculos apoptóticos ou corpos apoptóticos. As células em

processo de necrose, com lesão de membrana apresentam um padrão de coloração

uniforme, laranja-avermelhada e não ocorre a formação de corpos apoptóticos.

(KOSMIDER et al, 2004).

Para este teste as células de melanoma murino B16F10 foram plaqueadas

em placas de 96 poços na concentração de 1.104 células por poço foram cultivadas

por 24 horas mantidas em estufa a 37ºC e CO2 5%, posteriormente incubadas em

presença do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, com concentrações

finais de (0,054; 0,54; 5,4; 54 e 543 μM), do controle positivo paclitaxel na

concentração final de 100 µM e controle negativo (meio MEM com soro fetal bovino)

e solvente (1% DMSO) por 2, 6, 12 e 24h a 37ºC a 5% de CO2. O meio MEM da

placa foi removido e adicionado 95 µL de meio MEM sem SFB e 5µl de BE e AA

(100mg/L PBS). Mantidas em temperatura ambiente por 15 minutos e analisados os

resultados quanto ao mecanismo de morte celular.

As células foram analisadas usando microscópio de fluorescência (Olympus


aquisição de imagens, da Olympus Optical Co. Ltd., e filtro de 480 e 520 nm)

(NOBRE JUNIOR, 2006).

51

4.2.2.3 Critérios para classificação das células em apoptóticas, necróticas ou

viáveis utilizando dupla-coloração

Através das análises morfológicas das células tratadas com o poliacetileno, 5-

octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, realizadas através da coloração por BE e AA para

microscopia de fluorescência, foi calculado a porcentagem de células viáveis,

apoptóticas e necróticas.

As análises para identificação e quantificação de células em processos de

apoptose e necrose celular foram realizadas por meio dos parâmetros cor e aspecto

morfológico do núcleo, analisando em torno de 50 eventos, além da condensação e

fragmentação da cromatina também avaliada.

Diferentes padrões celulares podem ser observados e classificados:

a) As células vivas possuem seu núcleo verde uniforme (Figura 11a);

b) As células necróticas apresentam núcleo avermelhado uniforme (Figura11b).

c) Apoptose inicial quando as células ainda possuem suas membranas intactas e,

portanto, apresentam núcleo verde, porém não uniformemente corado. Devido a

condensações da cromatina, clivagem do DNA e/ou fragmentação nuclear (Figura

11c);

d) Apoptose tardia (necrose secundária ou apoptose-necrose) o BE penetra na

célula já que ocorre alteração da membrana mantendo o núcleo alaranjado,

apresentam condensação da cromatina e fragmentação (Figura 11b ). As células

apoptóticas podem ainda apresentar corpos apoptóticos (LEITE et al, 1999.;

VERMES et al, 2000.; KOSMIDER et al, 2004).

Figura 11. Microscopia de fluorescência de células B16F10 coradas com brometo de etídio e alaranjado de acridina e classificadas em padrões pré-estabelecidos: a) célula viável, b) células em necrose e c) célula em apoptose.

Fonte: Autor, 2012

52

4.2.3 Determinação da caspase-3 por ensaio colorimétrico

As células B16F10 foram plaqueadas, em placas de 6 poços a 5X106

células/poço e mantidas por 6, 12 e 24h na presença do poliacetileno 5-octa-2,4,6-

triinil-furan-2(5H)-ona, nas concentrações de 5,4, 54 e 543 µM. Para o controle

negativo foi utilizado meio de cultura MEM suplementado e DMSO 1% e para o

controle positivo paclitaxel na concentração de 100 μM (KHALILZADEH et al., 2007).

Nos tempos determinados de 6, 12 e 24h, as células foram ressuspendidas

em 50 μL de tampão de lise e incubadas por 10 minutos em banho de gelo. Após

centrifugar a 10000 x g a 4C, por 5 minutos, o sobrenadante corresponde ao lisado

(extrato citosólico). A concentração de proteína do lisado celular foi determinada pelo

método de Bradford, a fim de estabelecer a mesma concentração de proteínas para

todas as amostras e assim determinar a atividade da enzima caspase-3.

A determinação da enzima caspase-3 foi preparada em placa de 96 poços

conforme as instruções do fabricante, contendo branco, branco com inibidor de

caspase-3, controle negativo, controle positivo e o tratamento com o poliacetileno

(Chemicon´s Caspase-3 Colorimetric Activity Assay Kits).

A presença de caspase 3 no lisado consequentemente produz a p-nitroanilina

(pNa) gera coloração, sendo quantificada em 405 nm no leitor de microplacas. Os

resultados foram expressos em μM pNa, utilizando uma curva de pNa preparada

obtendo a seguinte equação da reta: y= -0,01631+ 0,00325.x, onde y é a

absorbância e x a concentraçãp de pNa (r= 0,998).

4.3 Avaliação da atividade antineoplásica do Poliacetileno

4.3.1. Animais

Foram utilizados camundongos C57BL/6, machos, com idade entre 1,5 e 3

meses, pesando em média 20-30g, obtidos do Biotério Central da Universidade do

Vale do Itajaí. A pesquisa seguiu as normas estabelecidas pela Comitê de Ética no

Uso de animais CEUA da Univali. A pesquisa seguiu as normas estabelecidas pelos

Princípios Internacionais Orientadores para Pesquisa Biomédica envolvendo

Animais, do Conselho de Organização Internacional de Ciências Médicas (GOLDIM,

1997) e foi aprovada pelo CEUA da UNIVALI, protocolo 001/2010

53

Os animais foram distribuídos em grupos contendo 8 camundongos, que

foram alojados em gaiolas plásticas, em temperatura controlada (22± 2°C), com ciclo

claro/escuro de 12 horas, recebendo dieta comercial e água ad libitum.

4.3.2 Influência sobre crescimento tumoral

As células de melanoma da linhagem B16F10 foram inoculadas no dia zero

(1x106 volume = 100µL/animal) por via subcutânea no dorso de camundongos

C57BL/6 machos (n=8 animais/grupo) de seis semanas de idade. Os animais foram

tratados por via i.p com doses diárias do composto Poliacetileno de 5,43 e

54,34µmol/kg, como controle positivo (inoculação de células tumorais e tratamento

com salina) e negativo (inoculação de meio MEM suplementado sem células e

tratamento com salina), durante 12 dias, iniciando o tratamento quando os tumores

se tornaram palpáveis a partir do 14 dia. Ao final do experimento, os animais foram

eutanasiados para retirada do tumor, o diâmetro tumoral foi mensurado com auxílio

de paquímetro e posterior pesagem para o cálculo da massa tumoral (V) (Figura12).

Assim, a atividade antitumoral foi determinada através da redução da massa e

volume tumoral sólido gerado. O volume do tumor (mm3) foi calculado de acordo

com a fórmula V= [ comprimento x (largura)2 ] / 2. (DEVALAPALLY et al., 2007; KIM

et al., 2010).

Figura 12. Influência sobre o crescimento tumoral sólido de células de melanoma murino B16F10 em camundongos C57BL/6N. A) grupo controle negativo sem tumor, B) grupo controle negativo com tumor e C) procedimento de tricotomia D) visualização do tumor E) retirada da massa tumoral F) massa tumoral

Fonte: Autor, 2012

54

4.3.3 Avaliação do efeito do tumor melanoma B16F10 sobre o peso corporal

dos animais

O registro do controle de peso dos animais foi realizado no dia zero, no

momento do crescimento do tumor palpável e ao fim do experimento.

No final do período experimental, os animais foram sacrificados

cuidadosamente por deslocamento cervical. Foi realizada a retirada e pesagem dos

tumores subcutâneos e dos órgãos coração, baço, rins, fígado e o tumor sólido

foram removidos e imediatamente pesados.

Os resultados foram expressos em porcentagem do peso dos animais no 7º e

último dia de experimento em relação ao peso inicial e da porcentagem dos órgãos

em relação ao peso final dos animais.

4.3.4 Avaliação do efeito antimetastático do Poliacetileno sobre o

desenvolvimento de metástases pulmonar

Para o estudo de metástase pulmonar os animais (n=8 animais/grupo) foram

submetidos à inoculação de células de melanoma murino B16F10 na concentração

de 1X106 células num volume de 50µL/animal através da injeção intraocular. Os

animais foram tratados por via i.p com o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-

furan-2(5H)-ona, nas doses de 5,43 e 54,34µmol/kg, controle positivo (inoculação de

células tumorais e tratamento com salina), e controle negativo (inoculação de meio

MEM suplementado sem células e tratamento com salina), com doses diárias com

início no dia 0 (dia da inoculação) até o 12º dia experimental. Depois de 12 dias de

tratamento com o Poliacetileno, os animais foram anestesiados com uma solução de

hidrato de cloral a 7%. A cavidade toráxica foi dissecada e a perfusão cardíaca foi

realizada com solução de PBS e fixador paraformaldeído a 4% (Figura 13). Os

pulmões foram coletados e em seguida cortes deste material foram obtidos e as

lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina conforme item 4.3.7. Os pulmões

foram analisados e os pontos de metástase foram enumerados.

As lâminas foram analisadas e fotografadas usando o microscópio (Olympus


aquisição de imagens, da Olympus Optical Co. Ltd., e filtro de 480 e 520 nm, em

aumento de 400x, para posterior análise no software EARP onde os pontos

metastáticos foram medidos por mm2.

55

Figura 13. Figuras ilustrativas A e B do procedimento de perfusão cardíaca realizada nos animais para retirada dos pulmões e órgãos.

As imagens foram capturadas e a análise foi realizada através do analisador

de imagens software EARP, com o qual as regiões de pontos metastáticos foram

interativamente selecionadas e marcadas para posterior medição em mm2. Através

destes parâmetros estabelecidos por Lentini et al., (2000) a área foi calculada

através da equação área da metástase / área total x 100.

4.3.5 Avaliação da atividade locomotora utilizando o Modelo do campo aberto

(Open Field)

A atividade exploratória pode ser analisada pelo modelo de campo aberto

(Open Field), objetivando avaliar possíveis efeitos colaterais, como alterações na

atividade locomotora, avaliando compostos estimulantes ou depressores do Sistema

nervoso central (HO et al., 2002). Este experimento consiste de um círculo de

acrílico transparente com 60 cm de diâmetro e borda de 50 cm de altura, com um

piso dividido em 12 quadrantes (Figura 14). O número de quadrantes cruzados com

as quatro patas foi quantificado durante o tempo de 6 minutos. Os animas foram

avaliados no sétimo dia de tratamento com o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-

triinil-furan-2(5H)-ona, nas 5,43 e 54,34 µmol/kg nos modelos experimentais de

tumor sólido e metástase induzido pelas células de melanoma murino B16F10.

56

Figura 14. Modelo do campo aberto (Open Field)

Fonte: Autor , 2012

4.3.6 Modelo de avaliação de hipernocicepção mecânica através do

monofilamento de Von Frey

Para avaliar a nocicepção mecânica os animais foram colocados

individualmente em compartimentos de acrílico transparente (9x7x11cm),

organizados em uma plataforma de arame elevada para permitir o acesso à

superfície ventral das patas traseiras (Figura 15). Os animais foram mantidos nos

compartimentos por pelo menos 30 minutos para aclimatação antes da realização

dos testes. A frequência de resposta de retirada foi obtida através de 10 aplicações

de 1 segundo cada, do filamento de Von Frey 0,6g (VFH, Stoelting, Chicago, USA).

Os estímulos foram realizados na superfície plantar da pata direita. Neste modelo

apenas os animais do modelo de metástase pulmonar foram avaliados (QUINTÃO et

al., 2005).

57

Figura 15. Foto ilustrativa da plataforma de arame elevada para avaliação mecânica utilizando o monofilamento de Von Frey

Fonte: Autor, 2012

4.3.7 Avaliação histológica

Foi avaliada a presença ou não de metástases pulmonares a partir da leitura

de cortes histológicos obtidos através da inclusão total do órgão. Foram preparadas

lâminas em número suficiente para que todo o pulmão fosse mostrado, variando de

duas a três em corte seriado. Os cortes foram feitos em micrótomo rotativo

(American Optical 820®) com navalhas descartáveis, com 4 µm de espessura e

corados pela técnica de hematoxilina-eosina (HE). As lâminas foram fotografadas e

avaliadas no programa EARP para posterior cálculo da porcentagem relativa de

nódulo metastáticos em cada pulmão.

Foram avaliadas no ensaio toxicológico as alterações morfológicas dos

órgãos retirados como fígado, pulmão, rim e baço. Foram preparadas lâminas em

número suficiente para que todo o órgão fosse mostrado, variando de duas a três.

Os cortes foram feitos em micrótomo rotativo (American Optical 820®) com navalhas

descartáveis, com 4 µm de espessura e corados pela técnica de hematoxilina-eosina

(HE).

4.3.8 Avaliação da Toxicidade aguda in vivo

Para avaliação da toxicidade do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-

furan-2(5H)-ona, os animais camundongos C57BL6 machos (n=6 animais/grupo) de

seis semanas de idade foram submetidos ao tratamento via i.p do mesmo durante 12

dias, nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg como controle negativo (tratados com

58

salina). Ao final do experimento, os animais foram eutanasiados por deslocamento

cervical e retirados os órgãos, fígado, rins e baço para posterior análise histológica

com o objetivo de identificar alterações morfológicas devido ao tratamento.

4.4 Análise estatística

Os resultados dos experimentos in vitro e in vivo foram expressos por média,

± desvio padrão, analisados de forma independentes. Os ensaios in vitro foram

analisados por ANOVA seguido de Tukey-Kramer. A CI50 foi determinada pelo

método de linearização de PROBITOS das viabilidades celulares em função da

concentração ou aproximada através da regressão sigmoidal utiizando software

Origin 5.0, para os experimentos com células, utilizando-se em função do log das

concentrações aplicadas***p<0, 001ANOVA seguido de TUKEY.

Os dados in vivo foram analisados por ANOVA de uma via seguida pelos

testes de Dunnet e Newman-Keuls. O nível de significância foi de p<0,05. Todas as

análises citadas foram realizadas utilizando o software GraphPad Instat® ou

GraphPad PRISM (VIEIRA, 1991).

59

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Avaliação da viabilidade celular

A avaliação da citotoxicidade foi realizada, em princípio para relacionar a

atividade citotóxica do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, em

linhagens células tumorais e não tumoral. Em testes onde foi observada uma relação

dose-resposta da citotoxicidade, foi determinada a concentração letal ou inibitória em

cinqüenta porcento das células (CI50).

Inicialmente foi realizado um ensaio de citotoxicidade em células B16F10 nos

tempos de 24, 48 e 72 horas, utilizando o composto isolado poliacetileno (Figura 16).

Foi observada uma relação citotóxica dose dependente para o poliacetileno 5-octa-

2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona em todos os tempos de incubação. Após 24 horas de

incubação, o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, foi capaz de reduzir de

maneira dependente da dose a viabilidade celular, com redução de 7,4 a 96,5 %

com CI50 de 17,39 ± 3,26 µM (Figura 16A). Em 48 horas de incubação o composto

também reduziu de forma dose dependente a viabilidade celular, com redução de 11

a 95,5% e CI50 de 18,47 ± 19,02 µM (Figura 16B), já no tempo de 72 horas a redução

da viabilidade celular teve um decréscimo, reduzindo de 55 a 75% a viabilidade

celular a partir da dose de 54 µM e CI50 de 41,30 ± 6,52 µM (Figura 16C). Não houve

diferença significativa dos tempos de 48 e 72 horas, mesmo sendo observado um

aparente decréscimo no efeito citotóxico. Os resultados de citotoxicidade foram

semelhantes aos obtidos com Paclitaxel a 100 µM (98,3% de redução da viabilidade

celular). A seguir imagens das células de melanoma B16F10 após tratamento com o

poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona (Figura 17).

60

Figura 16. Viabilidade das Células B16F10 expostas ao poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona. (A) 24 (B) 48 e (C) 72 horas de incubação, como controle negativo meio MEM +DMSO 1% (O) e como controle positivo (C+) o Paclitaxel a 100µM. Gráfico representado por média ± desvio padrão.**p< 0,01 ***p<0,001 ANOVA, post-test TUKEY.

C0,

545,

43 54 543 c+

0

50

100

150

******

***

Concentração (M)

Via

bil

idad

e C

elu

lar

(%

)

C0,

545,

43 54 543 c+

0

50

100

150

*** ***

***

Concentração (M)

Via

bil

idad

e C

elu

lar

(%)

C0,

54 5,4 54 54

3 c+0

50

100

150

200

**

**

***

Concentração (M)

Via

bil

idad

e C

elu

lar

(%)

A

B

C

61

De acordo com os dados obtidos, foram selecionadas algumas linhagens

celulares para avaliar o potencial citotóxico do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-

2(5H)-ona, assim dando continuidade aos ensaios de citotoxicidade. Nas tabelas 1 e

2 tem-se representada as respostas citotóxicas nos modelos celulares tumorais

(PC3, LNCAP, H1299, OVCAR, NCI, T84, MCF-7, U138MG, VW473, HELA, HOS

e MG63), leucêmicos (K562, KG1, HL60, NB4, RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT,

MOLT4, NALM6, B15 e U937) e (CMNH), comparando os resultados da

concentração inibitória da viabilidade celular em cinqüenta por cento das células

(CI50) do composto isolado poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona.

Tabela 1. Concentração inibitória da viabilidade celular em cinquenta porcento das células (CI50) das células PC3, LNCAP, H1299, OVCAR, NCI, MCF7, U138MG, VW473, HELA, T84, HOS E MG63 expostas por 24 horas ao poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas concentrações de 0,054 a 543µM e a Doxorubicina nas concentrações de 0,01 a 100µM. Tabela representada por média ± desvio padrão. post-test TUKEY.

Linhagens celulares tumorais Composto isolado Poliacetileno

IC50µM Fármaco Doxorubicina

IC50µM

PC3 17,22 ± 2,17 4,22 ± 0,24

LNCAP 20,16 ± 2,5 3,15 ± 0,65

H1299 17,17 ± 0,81 8,87 ± 1,53

OVCAR 41,52 ± 11,14 2,20 ± 1,12

NCI 17,88 ± 0,87 12,84 ± 0,96

MCF7 39,18 ± 2,93 12,60 ± 2,15

U138MG 26,25 ± 1,30 1,82 ± 0,95

VW473 21,46 ± 2,17 4,63 ± 2,36

HELA 38,04 ± 4,61 5,01 ± 0,76

T84 19,29 ± 1,41 18,51 ± 0,62

HOS 20,54 ± 3,09 1,79 ± 0,22

MG63 17,98 ± 2,22 0,79 ± 0,06

As linhagens celulares acima foram expostas por 24 horas ao 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona (0,054-543 µM) e Doxorubicina (0,01-100µM). Sem eguida a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio do MTT. Os valores representam a média ± DP da concentração da substância capaz de manter 50% das células vivas (IC50) obtidos de 3 experimentos independentes, cada um realizados em triplicata.

62

Tabela 2. Concentração inibitória da viabilidade celular em cinquenta porcento das células (CI50) das células leucêmicas K562, KG1, HL60, NB4, RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT, MOLT4, NALM6, B15 e U937 e células normais CMNH, expostas por 48 horas ao poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas concentrações de 0,054 a 543µM e a Daunorubicina nas concentrações de 0,01 a 100µM. Tabela representada por média ± desvio padrão. post-test TUKEY.

Linhagens celulares leucêmicas Composto isolado Poliacetileno

IC50µM

Fármaco Daunorubicina

IC50µM

NK562 25,10 ± 3,31 0,36 ± 0,24

KG1 25,16 ± 1,19 0,57 ± 0,01

HL60 15,43 ± 0,76 0,24 ± 0,01

NB4 13,42 ± 1,73 0,19 ± 0,03

RAMOS 12,77 ± 0,59 0,57 ± 0,05

RAJI 23,91 ± 6,79 0,11 ± 0,03

U937 14,72 ± 4,40 0,32 ± 0,01

JURKAT 12,66 ± 0,59 0,13 ± 0,07

MOLT4 18,96 ± 1,84 0,07 ± 0

NALM6 4,40 ± 0,21 0,03 ± 0,01

B15 17,71 ± 1,30 0,07 ± 0

RS4 15,32 ± 0,76 0,38 ± 0

CMNH (normais) >100 Não avaliado

As linhagens celulares acima foram expostas por 48 horas ao 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona (0,054-543 µM) e Daunorubicina (0,01-100µM). Sem eguida a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio do XTT. Os valores representam a média ± DP da concentração da substância capaz de manter 50% das células vivas (IC50) obtidos de 3 experimentos independentes, cada um realizados em triplicata.

A atividade citotóxica do composto frente às células tumorais PC3, H1299,

MG63, NCI mantidas em contato com o composto por 24 horas, foi considerada

significativa (Tabela 1), sendo que na maior concentração (543µM) o composto

poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, provocou a morte celular,

diminuindo, respectivamente, 87%, 85%, 84% e 86% a viabilidade celular, no

entanto nas demais linhagens a atividade citotóxicica do composto foi menor. Nas

células leucêmicas tratadas com o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-

2(5H)-ona por 48 horas, os resultados também mostraram-se promissores (Tabela 2)

sendo que na linhagem NB4, RAMOS, JURKAT e NALM6, na concentração de

543µM a redução da viabilidade celular foi de respectivamente 91%, 93%, 84% e

81%. Apesar da citotoxicidade apresentada nestas linhagens celulares pelo

poliacetileno, o resultado da viabilidade celular das CMNH, apresentou baixa

atividade citotóxica (Tabela 2).

63

5.1.2 Avaliação da morte celular por microscopia de fluorescência 5.1.2.1 Brometo de etídeo e diacetato de fluoresceína

Os resultados do ensaio de citotoxicidade foram monitorados por microscopia

de fluorescência nas células de melanoma murino B16F10 utilizando os corantes

vitais brometo de etídeo e diacetato de fluoresceína, como controle negativo (meio

MEM sem SFB) e positivo (Paclitaxel 100 µM). As imagens das células foram

fotografadas e estão demonstradas detalhadamente nos apêndices A e B,

confirmando os resultados do ensaio de citotoxicidade celular por MTT.

5.1.2.2 Brometo de etídeo e alaranjado de acridina

O método de microscopia de fluorescência utilizando os corentes BE e AA, foi

utilizado para a melhor caracterização de morte celular por apoptose precoce e tardi

e necrose. A avaliação da atividade citotóxica, visando o possível mecanismo de

morte celular da linhagem B16F10 do composto isolado poliacetileno 5-octa-2,4,6-

triinil-furan-2(5H)-ona, controle negativo e utilizando como controle positivo o

fármaco paclitaxel foi determinada usando a combinação destes dois corantes, o BE

e AA.

O experimento foi realizado nos tempos de exposição de 2, 6, 12 e 24 horas,

com diferentes concentrações da substância testada nas células tumorais B16F10.

As imagens da avaliação do processo de morte celular por microscopia de

fluorescência das células B16F10 marcadas com BE e AA encontram-se nas Figuras

17, 18, 19, 20, 21 e 22.

De acordo com as imagens pode-se sugerir a apoptose como o mecanismo

de morte celular mais expressivo desde as primeiras horas de contato com o

composto, apresentando condensação da cromatina bem como formação de corpos

apoptóticos e fragmentação do DNA. Mesmo em menor proporção também pode-se

observar células em processo necrótico. Nas tabelas 3 e 4 a porcentagem de

eventos apoptóticos e necróticos foi calculada através da análise quantitativa

morfológica de um campo de células, onde 50 células foram contadas e

caracterizadas.

64

No tratamento com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona na

concentração de 5,43µM no tempo de 24 horas (Figura 17d) é clara a alteração

morfológica das células, apresentando fragmentação nuclear, dando indícios de um

processo apoptótico.

Figura 17. Efeitos do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, na concentração de 5,43µM, na morfologia das células de melanoma murino B16F10. Corantes AA(0,01mg/mL) e BE (0,01mg/mL). Período de incubação 2,6,12 e 24 horas. Excitação de BP460-490nm, Filtro BA520nm. Aumento de 400x. (FR) Fragmentação nuclear

Nos tempos de 2 e 6 horas na concentração de 54µM (Figura 18 a,b) é

possível observar o processo de apoptose tardia observando as alterações

morfológicas característicos onde a cromatina se fragmenta e os dois corantes se

intercalam, visivelmente no tempo de 6 horas, onde as células em apoptose tardia

dividem espaço com células em processo de necrose. Nos tempos de 12 e 24 horas

a morfologia característica indica inúmeros eventos apoptóticos, a porcentagem de

células apoptóticas é de respectivamente 87% e 75% (Tabela 3).

Podemos observar o padrão morfológico e de coloração (Figura 18 d)

fluorescência verde e fragmentação nuclear representativo de apoptose precoce. Em

contrapartida, podemos notar os padrões de apoptose tardia onde vemos núcleos

com cromatina fragmentada (Figura 18a) e coloração vermelha fluorescente (BE) e

necrose apresentando núcleo normal e coloração vermelha fluorescente (Figura

18b).

65

Figura 18. Efeitos do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, na concentração de 54 µM, na morfologia das células de melanoma murino B16F10. Corantes AA (0,01mg/mL) e BE (0,01mg/mL). Período de incubação 2, 6,12 e 24 horas. Excitação de BP460-490nm, Filtro BA520nm. Aumento de 400x. (AT) Apoptose tardia (N) Necrose.

De acordo com a Figura 19 onde as células foram expostas a concentração

de 543µM do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, todos os

tempos apresentam a apoptose como o mecanismo de morte celular predominante,

com uma redução significatica na quantidade de células no campo. Sua atividade

pode ser comparada ao Paclitaxel utilizado como controle (Figura 20). É possível

observar que nas primeiras horas de contato com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-

furan-2(5H)-ona, o processo necrótico é visível,bem como apoptose tardia onde os

corantes se intercalam, no entanto após 24 horas o composto apresentou morte

celular predominantemente apoptótica.

Figura 19. Efeitos do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, na concentração de 543 µM, na morfologia das células de melanoma murino B16F10. Corantes AA (0,01mg/mL) e BE (0,01mg/mL).Período de incubação 2,6,12 e 24 horas. Excitação de BP460-490nm, Filtro BA520nm. Aumento de 400x.

66

Figura 20. Efeitos do fármaco Paclitaxel utilizado como controle positivo na concentração de 100 µM, na morfologia das células de melanoma murino B16F10. Corantes AA (0,01mg/mL) e BE (0,01mg/mL). Período de incubação 2,6,12 e 24 horas. Excitação de BP460-490nm, Filtro BA520nm. Aumento de 400x.

Na Figura 21 pode-se evidenciar que as células B16F10 expostas somente

com meio de cultura MEM+DMSO 1% utilizado como controle negativo do

experimento, estão viáveis em todos os tempos analisados.

Figura 21. Imagens do controle negativo meio MEM+DMSO 1%, na morfologia das células de melanoma murino B16F10. Corantes AA (0,01mg/mL) e BE (0,01mg/mL). Período de incubação 2,6,12 e 24 horas. Excitação de BP460-490nm, Filtro BA520nm. Aumento de 400x.

67

Tabela 3: Tabela demonstrativa da porcentagem de apoptose apresentada pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona no processo de morte celular através da marcação de morte celular com Alaranjado de Acridina e Brometo de Etídeo na linhagem celular B16F10.

Poliacetileno OO

(concentrações)

Linhagem Celular

B16F10

2h 6h 12h 24h

543µM

100%

100% 100%

100%

54µM

84%

50% 67%

100%

5,4µM

79%

75% 87%

75%

0,543µM

Controle negativo

65%

69% 80%

70%

0 0 0 0

Paclitaxel 100µM

51% 44% 50% 45%

68

Tabela 4: Tabela demonstrativa da porcentagem de necrose apresentada pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona no processo de morte celular através da marcação de morte celular com Alaranjado de Acridina e Brometo de Etídeo na linhagem celular B16F10.

Poliacetileno OO

(concentrações)

Linhagem Celular

B16F10

2h 6h 12h 24h

543µM

0

0 0

0

54µM

16%

50% 33%

0

5,4µM

21%

25% 13%

25%

0,543µM

Controle negativo

35%

31% 20%

30%

0 0 0 0

Paclitaxel 100µM

49% 56% 50% 55%

69

5.2 Determinação da caspase-3 por ensaio colorimétrico

A quantificação da caspase 3, uma enzima efetora pertencente às duas vias

de ativação apoptótica, foi realizada nas células tumorais B16F10 utilizando o

composto isolado poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona que, devido aos

resultados anteriores demonstrou ser uma substância com indício de morte celular

apoptótica. Podemos observar na Figura 22 que no tempo de 6 horas houve

aumento da pNa quando as células B16F10 foram expostas a 100µM de Paclitaxel

comparado ao controle negativo.

Pode-se observar que na concentração de 543µM do poliacetileno 5-octa-

2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, ocorre um aumento da pNa, ou seja, um aumento da

caspase 3, já nos tempos de 12 e 24 horas não foi possível observar as mesmas

alterações na concentração de pNa.

Figura 22. Quantificação da p-nitro aniline (pNa) mmol/L formada nas células tumorais B16F10em presença do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona. Utilizando meio de cultura MEM para controle negativo e Paclitaxel como controle positivo com tempo de exposição de 6h. As barras são expressas pela média ± desvio padrão. *p<0,05**p<0,01***p<0,001 ANOVA seguido de TUKEY.

0 5,4 54 543 543 c+ c+0

20

40

60

80

- - - - + - +Inibidor Caspase

p<0,001

p<0,001p<0,001

p<0,001

pN

a (

mm

oL

/L)

70

5.3 Avaliação da atividade antineoplásica do poliacetileno in vivo 5.3.1 Influência sobre o crescimento tumoral As células de melanoma murino B16F10 foram injetadas no dorso dos

animais e, em média, 14 dias após pode-se observar os tumores

macroscopicamente. Na figura 25 tem-se o gráfico do peso da massa tumoral dos

camundongos após o tratamento com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-

ona nas doses de 5,43 e 54,34µmol/kg.

Figura 23. Efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg sobre o peso da massa tumoral dos camundongos C57BL/6N induzidos ao crescimento de tumor sólido por células de melanoma murino B16F10. As barras representam a média ± desvio padrão do peso do tumor de 8 animais por grupo. p< 0,001 ANOVA seguido de TUKEY.

0

5

10

15

***

5,43 54,34

Poliacetileno

(mol/kg,i.p)

C

p< 0,001

Massa t

um

ora

l (g

)

Na figura 23 o gráfico representa o peso da massa tumoral dos camundongos

após tratamento com o composto nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg, apresentando

redução ativa (p< 0,001) de 65,6± 18,9% e 80 ± 15,95% do tamanho tumoral

promovido por células B16F10 em ambas as doses quando comparadas com o

controle negativo (C).

Na figura 24 o gráfico mostra o volume tumoral (mm3), onde os tumores foram

medidos com um paquímetro e analisou-se a redução do volume tumoral nos

camundongos tratados com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, nas

71

doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg, apresentando significância de p < 0,05 para a

concentração de 54,34 µmol/kg comparado com o controle (C).

Figura 24. Efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg sobre o volume tumoral dos camundongos C57BL/6N induzidos ao crescimento de tumor sólido por células de melanoma murino B16F10. A barra foi expressa pela média ± desvio padrão de 8 animais por grupo. p<0,05 ANOVA seguido de TUKEY.

C 5,43 54,340

1

2

3

4

5 *

Poliacetileno

(mol/kg,i.p)

Vo

lum

e t

um

or

(mm

3)

5.3.2 Avaliação do efeito do tumor sobre o peso corporal dos animais

O peso corpóreo dos animais foi acompanhado a partir da data de início do

tratamento, quando o tumor já está palpável. Do peso corporal total foi subtraído o

valor da massa tumoral resultando no valor do peso real dos animais (g).

A porcentagem do peso dos animais no 7º dia de tratamento, no último dia de

tratamento em relação ao peso inicial e porcentagem dos órgãos em relação ao

peso final corporal dos camundongos C57BL/6, após tratamento com o composto

isolado poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, nas doses de 5,43 e 54,34

µmol/kg estão descritos na tabela 5 abaixo.

72

Tabela 5. Porcentagem do peso dos animais no 7º. e último dia de experimento em relação ao peso inicial e porcentagem dos órgãos em relação ao peso final de camundongos C57BL/6N, após administração do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg

Análise estatística: Dados representados por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ANOVA seguido de Dunnett’s. a diferenças significativas em relação ao grupo sem tumor no final do experimento.

b diferenças significativas em relação ao grupo com tumor no final do experimento.

Na tabela 5 podemos observar os seguintes resultados, no tratamento com o

composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, utilizando as doses de

5,43 e 54,34 µmol/kg via intraperitoneal nos camundongos, não foi observado

diferença significativa sobre a porcentagem do peso dos animais.

No grupo de animais com crescimento tumoral sólido de melanoma murino,

pode-se observar uma diminuição significativa da porcentagem do peso do coração

em relação ao grupo negativo sem tumor (p<0,05).

Pode-se observar também que, ao baço os grupos apresentaram-se

semelhantes. É possível notar o aumento do baço de todos os grupos comparado

ao controle negativo sem tumor, apresentando significância o grupo que recebeu o

tratamento na dose de 54,34µmol/kg. Em relação ao peso dos fígados não foi

observado diferença significativa entre os grupos.

Analisando o peso dos rins pode-se observar que o grupo que recebeu

tratamento com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona 54,34µmol/kg

apresentou diferença significativa quando comparado ao grupo negativo com tumor,

Grupos %Peso inicial

%Peso 7º dia

%Peso final

Coração (%)

Baço (%)

Rins (%)

Fígado (%)

C negativo sem tumor

100

98,54± 8,07

91,32 ± 15,05

0,67 ±0,13

0,37±0,06

1,43±0,09

6,40±1,15

C negativo com tumor

100

100,92± 16,35

119,58 ± 16,09

0,43±0,00

a*

* 0,50±0,00

0,87±0,08

a*

3,97±0,68

Poliacetileno 5,43µmol/kg

100

95,38 ± 11,26

111,44 ± 8,66

0,56±0,16

0,60±0,19

b* 0,40±0,10

5,36±0,84

Poliacetileno 54,34µmol/kg

100

94,07 ± 11,94

102,37 ± 14,44

0,54±0,08

0,71±0,18

a***

1,34±0,33

b**

5,50±1,33

73

já o grupo controle com tumor apresentou uma dimuinuição da porcentagem do peso

dos rins quando comparados com o grupo controle sem tumor (p< 0,05).

5.3.3 Avaliação do efeito antimetastático do poliacetileno

Após a indução de metástase pulmonar os animais foram tratados por 12

dias, após este período foram anestesiados e submetidos à perfusão cardíaca

seguido de coleta dos pulmões. A figura 25 mostra os pulmões dos animais retirados

após perfusão cardíaca, onde é possível observar macroscopicamente a redução

dos nódulos metastáticos nos tratamentos com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-

furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg comparando com o controle

onde foram inoculadas células tumorais e não houve tratamento.

Também é possível notar significante redução do número de nódulos

metastáticos nos pulmões comparado com o controle, sendo que na dose de 5,43

µmol/kg houve uma redução de 62,08 ± 4,96% e na dose de 54,34µmol/kg 43,58 ±

6,82% valores demonstrados no gráfico da figura 26 (setas indicam os nódulos

metastáticos).

Figura 25. Imagens representativas da análise macroscópica dos pulmões retirados dos camundongos tratados com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona. Doses de 5,43µmol/kg (A), 54,34µmol/kg (B), controle negativo (sem inoculação de células B16F10) (C) e controle positivo (D) com inoculação de células sem tratamento.

74

Figura 26. Gráfico de inibição de metástase pulmonar induzida por células B16F10 injetadas via retro-orbital em camundongos C57BL/6, tratados com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg; i.p durante 12 dias. Barras representam a média ± EPM do número de nódulos observados por grupo, cada um com 8 animais.**p<0,01 ANOVA seguido de Dunnett’s.

T 5,43 54,340

10

20

30

Poliacetileno

(mol/kg, i.p)

**N

ód

ulo

s

Na figura 27, pode-se observar lâminas histológicas dos pulmões dos

animais. Na figura A representando o grupo controle negativo sem presença de

nódulos metastáticos, na figura B o controle positivo, onde é possível observar vários

nódulos metastáticos, e nas figuras C e D os tratamentos com o poliacetileno 5-octa-

2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas respectivas doses de 5,43 e 54,34µmol/kg, podendo

observar uma significativa redução nos nódulos metastáticos, quando comparado

com o controle positivo.

75

Figura 27. Análise histológica de metástase pulmonar (A) controle negativo (B) controle positivo (C) dose de 5,43μmol/kg (D) dose de 54,34μmol/kg. Ampliação de 400x.

5.3.4 Avaliação da atividade locomotora (Open Field)

A atividade locomatora dos animais foi observada através do modelo do

campo aberto (Open Field) a fim de avaliar a ação do poliacetileno 5-octa-2,4,6-

triinil-furan-2(5H)-ona e seus possíveis efeitos. Os resultados apresentados na

Figura 30 demonstram que a indução de tumor sólido pelas células B16F10 reduziu,

de forma significativa o número de cruzamentos (crossing) no modelo apresentado

em relação ao grupo sem tumor. A administração de Poliacetileno na dose de

5,43µmol/kg, i.p do composto conduz ao aumento do número de cruzamentos,

quando comparado ao grupo controle com tumor. Já o composto na dose de

54,34µmol/kg, i.p, não apresenta diferença significativa quando comparado ao grupo

controle com tumor.

76

Figura 28. Efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona (5,43 e 54,34 µmol/kg, i.p.) sobre os parâmetros comportamentais “crossing” (cruzamentos) no modelo do Open Field em modelo de tumor sólido, (M) animais sem tumor e (T) animais com tumor. Cada grupo representa a média de 8 animais. A barra representa *p<0,05. ANOVA seguido de Dunnett’s.

0

30

60

90

120

M T 5,43 54,34

Poliacetileno

(mol/kg, i.p)

*N

úm

ero

de

cru

zam

en

tos

Os resultados apresentados na Figura 29 demonstram que a indução de

metástases pulmonar não alterou de forma significativa o número de cruzamentos

(crossing) nas doses de 5,43 e 54,34µmol/kg, i.p em relação ao grupo controle com

tumor.

Figura 29. Efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona (5,43 e 54,34 µmol/kg, i.p.) sobre os parâmetros comportamentais “crossing” (cruzamentos) no modelo do Open Field em modelo de metástase pulmonar, (M) animais sem tumor e (T) animais com tumor. Cada grupo representa a média de 8 animais. ANOVA seguido de Dunnett’s.

M T 5,43 54,340

50

100

150

Poliacetileno

(mol/kg,i.p)

Nú

mero

de

cru

zam

en

tos

77

Na figura 30 o gráfico expressa os valores referente ao efeito do poliacetileno

5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona no modelo de avaliação toxicológica onde os

animais foram tratados com o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-

ona nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg, i.p. Em nenhuma das doses administradas

foi apresentado aumento ou redução significativa no número de cruzamentos

comparado com o controle salina (0).

Figura 30. Efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona (5,43 e 54,34 µmol/kg, i.p.) sobre os parâmetros comportamentais “crossing” (cruzamentos) na avaliação toxicológica, (0) grupo controle salina. Cada grupo representa a média de 6 animais. ANOVA seguido de Dunnett’s.

0 5,43 54,340

50

100

150

Poliacetileno

(mol/kg, i.p)

Nú

mero

de

cru

zam

en

tos

5.3.5 Avaliação de hipernocicepção mecânica através do monofilamento de Von Frey

Os animais que foram inoculados com células B16F10 por via retro-orbital a

fim de induzir metástase pulmonar foram avaliados no último dia de tratamento

quanto à nocicepção mecânica. Com o intuito de avaliar um possível efeito anti-

nociceptivo do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, os animais

foram submetidos a avaliação mecânica através do monofilamento de Von Frey. A

figura 31 demonstra que os animais submetidos ao modelo de metástase pulmonar

apresentaram aumento significativo da sensibilidade mecânica quando comparado

ao grupo tratado com meio. O tratamento com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-

furan-2(5H)-ona nas concentrações de 5,43 e 54,34µmol/kg, foi capaz de reduzir a

sensibilização mecânica, com inibição de 67,47 e 57,14%.

78

Com base nestes dados ensaios para a avaliação de hipernocicepção

mecânica foram realizados utilizando como agentes flogísticos a carragenina e o

CFA, porém não foi observado efeito anti-hiperalgésico do composto poliacetileno, 5-

octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona tais resultados não estão demonstrados no

trabalho.

Figura 31. Frequência de resposta da pata direita dos animais do modelo de metástase pulmonar tratados com o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg, i.p, controle negativo meio MEM (M) e controle positivo inoculação do tumor (T). O gráfico é expresso por média ± EP de 8 animais por grupo. Diferença significativa do grupo controle *p< 0,05. ≠ difere significativamente em relação ao grupo (M). ANOVA seguido de Dunnett’s.

0

10

20

30

40

50

M T 5,43 54,34

#

* *

Poliacetileno

(mol/Kg. i.p)

Fre

qu

ên

cia

de R

esp

osta

(%

)

5.3.6 Avaliação da atividade toxicológica aguda

A fim de avaliar o possível efeito citotóxico do composto poliacetileno 5-octa-

2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, os animais foram submetidos ao tratamento com o

composto nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg; i.p durante 12 dias. No ínicio e fim do

tratamento os animais foram pesados com o objetivo de avaliar o peso corporal. Na

figura 34 o gráfico demonstra que não houve redução ou ganho de peso corporal

significativo comparando os pesos inicias e finais dos animais. Observou-se um

ganho de peso de 7,01 ± 3,29% no grupo tratado com a concentração de 54,34

µmol/kg e 3,63 ± 0,26% na concentração de 5,43 µmol/kg não apresentando

significância comparado com o controle salina que apresentou ganho de peso

corporal de 9,90 ± 8,03%.

79

Na figura 32 fotos ilustrativas do aspecto físico dos animais são mostradas.

Na visualização macroscópica destes órgãos não foi observada nenhuma alteração

significativa.

Figura 32. Fotos ilustrativas do aspecto físico dos animais tratados com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43µmol/kg (A) e 54,34µmol/kg (B, C) durante 12 dias, para avaliação toxicológica do composto.

Figura 33. Gráfico de variação do peso inicial e peso final (g) dos animais tratados com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34µmol/kg, i.p, e grupo salina (0) tratados por 12 dias.

0 5,43 54,340

10

20

30

40

Peso inicialPeso final

Poliacetileno

(mol/kg, i.p)

Peso

co

rpo

ral

(g)

Após o período de tratamento dos animais, os mesmos foram anestesiados e

foi realizada a perfusão cardíaca para retirada dos órgãos fígado, rim e baço a fim de

avaliar possível efeito tóxico do composto. Para análise histológica dos órgãos as

lâminas histológicas foram fotografadas e analizadas. Na figura 34 estão

representadas as lâminas de cortes histológicos do fígado do grupo negativo e dos

80

respectivos tratamentos com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, nas

doses de 5,43 e 54,34µmol/kg, não apresentando alteração na morfologia celular

quando comparado com o controle.

Na figura 35, os cortes histológicos do baço também não apresentam

diferença morfológica dos grupos tratados com o composto quando comparado com

o controle. O mesmo pode ser observado na figura 36 os cortes histológicos do rim

dos animais tratados com o Poliacetileno também não apresentaram alteração

morfológica quando comparados ao grupo controle.

Figura 34. Análise histologica do fígado dos animais submetidos a avaliação toxicológica. (A) grupo controle (B) dose de 5,43µmol/kg (C) dose de 54,34µmol/kg. Aumento de 400x.

Figura 35. Análise histologica do baço dos animais submetidos a avaliação toxicológica. (A) grupo controle (B) dose de 5,43µmol/kg (C) dose de 54,34µmol/kg. Aumento de 400x.

Figura 36. Análise histologica do rim dos animais submetidos a avaliação toxicológica. (A) grupo controle (B) dose de 5,43µmol/kg (C) dose de 54,34µmol/kg. Aumento de 400x.

81

6. Discussão

Embora o processo do câncer tenha sido estudado por séculos, os

conhecimentos sobre os mecanismos biológicos de transformação e progressão do

tumor eram poucos no início da medicina molecular em meados do século 20. Até o

ano de 1950, a terapia utilizada para o câncer era predominantemente a intervenção

cirúrgica. Em 1960, a radioterapia se tornou uma ferramenta primordial para o

controle da doença, mas, apresentaram os mesmos resultados apresentados pela

cirurgia, não sendo capaz de exterminar com o câncer metastático. Um tratamento

que fosse efetivo para muitos pacientes necessitava ultrapassar os limites do sítio

tumoral, penetrando cada órgão do corpo (CHABNER & ROBERTS, 2005).

Atualmente o foco da medicina é outro. Na tentativa de desenvolver fármacos

para alvos específicos relacionados ao câncer, a pesquisa científica se tornou

multidisciplinar e tem trabalhado em conjunto na busca por medicamentos mais

efetivos para o tratamento de tumores, com redução da resistência do paciente ao

mesmo, diminuição da toxicidade, aumento da especificidade e biodisponibilidade do

fármaco (CHABNER & ROBERTS, 2005).

Nas últimas décadas, intensificou-se a procura de uma explicação genética

sobre a origem, o crescimento e a progressão do melanoma cutâneo. Encontrar uma

ligação direta entre as mutações gênicas e a origem da doença tem sido objetivo

dos pesquisadores dedicados ao estudo dessa neoplasia (FAURI et al., 2010).

Considerado o tumor de pele mais agressivo, o melanoma cutâneo é mantido na

liderança das mortes por câncer de pele nos países industrializados. A sua

incidência vem aumentando significativamente em todo o mundo, mais rapidamente

do que qualquer outro tipo de neoplasia maligna (ALONSO et al., 2004).

Considerando que o Brasil é privilegiado com uma das mais complexas

biodiversidades do planeta, ainda pouco se conhece de seus recursos naturais

(CECHINEL FILHO et al., 2003). A intensa procura, nos últimos anos por alternativas

eficientes para o tratamento do câncer tem feito com que a grande diversidade

brasileira se destaque, levando em consideração o importante papel das plantas e

de seus fitoconstituintes na descoberta de novos agentes anticâncer.

A atividade antitumoral de plantas do gênero Vernonia é relatada na literatura,

onde as substâncias isoladas lactonas sesquiterpênicas glaucolida 2 e hirsutinolida 4

82

demonstraram significativa atividade citotóxica in vitro sobre células HeLa (BIAVATTI

et al., 2010). Ngeh e colaboradores (2012) demonstraram que a fração

diclorometano, extratos e compostos isolados de tubérculos de Vernonia guineensis

Benth apresentaram atividade antitumoral em células de câncer de próstata,

sugerindo seu uso como um importante agente antineoplásico.

Nosso trabalho avaliou inicialmente, a viabilidade de células de diferentes

linhagens após a incubação com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona.

Demonstrando que o tratamento com a substância, nas concentrações de 0,054 a

543 µM, foi capaz de reduzir a viabilidade de B16F10 nos diferentes tempos de

incubação (24, 48 e 72 h). Os resultados de citotoxicidade foram comparados aos

obtidos com o Paclitaxel (100µM), quimioterápico utilizado como controle positivo,

apresentando citotoxicidade semelhante.

Com o objetivo de complementar os dados obtidos com a linhagem celular

B16F10, foram realizados ensaio de viabilidade celular utilizando linhagens de

tumores sólidos PC3, LNCAP, H1299, OVCAR, NCI, T84, MCF-7, U138MG, VW473,

HELA, HOS e MG63 expostas por 24 h com o composto poliacetileno, células

leucêmicas K562, KG1, HL60, NB4, RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT, MOLT4, NALM6,

B15 e U937 expostas por 48h com o composto e células mononucleares humanas

CMNH. Nosso resultados demonstram mais uma vez atividade citotóxica do

poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona em linhagens de tumores sólidos e

leucêmicas.

Durante os últimos 25 anos, mudanças substanciais têm ocorrido na área de

biossíntese de produtos naturais acetilênicos. A expansiva triagem liderada pelo

Instituto Nacional do Câncer revigorou a descoberta de novos compostos. Mais de

2000 poliacetilenos são conhecidos, com mais de 1100 da família Asteraceae

(MINTO et al., 2008). Dados anteriores demonstraram atividade antitumoral e

genotóxica deste poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, caracterizada por

morte celular apoptótica envolvendo um mecanismo dependente de caspase 3

(BUSKUHL et al., 2009).

Pellati et al., (2006), relataram a característica hidrofóbica aos poliacetilenos

isolados de Echinacea pallida, testados em células de adenocarcinoma pancreático

humano (PaCa2). Os resultados demostraram que os poliacetilenos mais

hidrofóbicos tiveram atividade citotóxica moderada comparado aos outros compostos

hidroxilados. Purup et al. (2009), relatam que o falcarinol e falcarindiol, poliacetilenos

83

isolados da cenoura (Daucus carota) apresentaram atividade citotóxica significativa

sobre células de câncer intestinal humano Caco-2. Segundo os autores, a

bioatividade do Falcarinol se deve, provavelmente,a sua característica hidrofóbica

(CHRISTENSEN et al., 2006).

É digno de nota que, apesar da marcante atividade citotóxica apresentada

pelo poliacetileno, quando incubados com diferentes linhagens de células

neoplásicas, o mesmo apresentou baixa citotoxicidade quando adicionado às células

mononucleares humanas (CMNH). O fármaco antineoplásico Paclitaxel, utilizado

como controle positivo nos experimentos in vitro, é um fármaco com propriedade

hidrofóbica com capacidade de auto-agregação e consequente precipitação

dependendo do meio e da concentração utilizados (BALASUBRAMANIAN;

ALDERFER, 1994).

O mecanismo de ação desses medicamentos é único. Os taxanos impedem a

ocorrência da mitose pela interferência no funcionamento normal dos microtúbulos.

Eles agem como agentes estabilizadores da tubulina, favorecendo a sua

polimerização, porém inibindo a despolimerização dos microtúbulos, levando à morte

das células cancerosas (MALONGA et al., 2005). Já foi descrito na literatura

inúmeros efeitos tóxicos do Paclitaxel, dentre eles mielosupressão e neurotoxicidade

periférica dando origem a quadros de dor neuropática (NIETO e VAUGHAN, 2004).

Outra classe importante de medicamentos utilizados no tratamento do câncer

compreende os antibióticos do grupo das antraciclinas, são compostos considerados

importantes no tratamento do câncer, com atividade tanto em tumores sólidos como

em neoplasias hematológicas. A Daunorubicina e a Doxorubicina estão entre os

principais fármacos aprovados para uso pelo FDA (LOFTI; ZACKRISSON et al.,

2002).

A Daunorrubicina (DNR) é um quimioterapêutico que foi desenvolvido como

aplicação clínica no tratamento da leucemia, tornou-se uma das mais eficazes

drogas anti-câncer (JOHNSON et al., 1998; LÖWENBERG et al., 2009). No entanto,

como outros tipos de agentes quimioterápicos, a resistência das células neoplásicas

a terapia continua a ser um importante obstáculo para o sucesso do tratamento de

leucemia, limitando assim seu uso clínico. A resistência às drogas é considerado ser

um fenômeno multifatorial que envolve vários mecanismos importantes, como

reparação de danos aumentado do DNA, apoptose reduzida, alterações no

metabolismo do fármaco, e aumento da energia de efluxo dependente do fármaco,

84

bem como alterações na expressão da glutationa transferase II e topoisomerase

(MCLORNAN et al., 2007; MICHAEL et al., 2008). A Doxorrubicina é considerada o

principal antibiótico antineoplásico deste grupo. Sua atividade citotóxica acontece

através da ligação ao DNA assim inibindo tanto a síntese de DNA, quanto a de RNA,

porém sua principal ação é mediada por um efeito na topoisomerase II, cuja

atividade é muito intensa em células em proliferação (RANG et al., 2007).

Semelhante ao Paclitaxel, os fármacos do grupo das antraciclinas, como a

Daunorrubicina e a Doxorrubicina apresentam manifestações tóxicas preocupantes,

ocasionando obstáculos para seu uso. Dentre as complicações estão a

mielosupressão e a toxicidade cardíaca, hepática, renal e neuronal limitando

consideravelmente a janela terapêutica destes fármacos (DEVITA; HELLMAN et al.,

2005).

Os dados de citotoxicidade foram confirmados através da utilização dos

corantes brometo de etídeo e o diacetato de fluoresceína. Como mencionado

anteriormente, o corante diacetato de fluoresceína é metabolizado por ação de

estearases citoplasmáticas, assim torna-se concentrado no interior das células, na

forma de fluoresceína, emitindo fluorescência esverdeada em células viáveis,

enquanto que as células que apresentam núcleos corados de vermelho-alaranjado

estão mortas por permitirem que o brometo de etídeo se intercale no DNA exposto.

Existem diversos mecanismos que estão envolvidos na evolução de uma

célula normal para uma célula maligna (HANAHAN; WEINBERG, 2000), mas a maior

parte deles interfere na divisão celular. Oncogenes são derivados a partir de versões

mutadas de genes celulares normais, os chamados proto-oncogenes, que

ocasionam a proliferação descontrolada, sobrevivência e disseminação celular. Em

células normais, a expressão de proto-oncogenes está muito bem regulada evitando

o crescimento descontrolado de células (HARRINGTON, 2011). Assim, muitos

fármacos eficazes contra o câncer exercem sua ação sobre as células que se

encontram no ciclo celular, ou seja, aquelas que estão em multiplicação constante,

são denomindos fármacos ciclo celular específicos.

Os produtos naturais ciclo-celular específicos são muito utilizados na terapia

clínica oncológica, dentre eles está o Paclitaxel com o mecanismo de ação

detalhado anteriormente (SALMONM, 1998; OLIVEIRA et al., 2002). Com base nos

dados observados nos testes de viabilidade celular, a substância poliacetileno

apresenta característica semelhante ao Paclitaxel quanto a sua atividade citotóxica,

85

pressupondo que o poliacetileno seja um produto natural ciclo celular específico, já

que em células mononucleares humanas sua ação citotóxica não foi significativa.

A capacidade de agentes antitumorais de inviabilizar células tumorais, com o

mínimo de danos em células não tumorais, é o objetivo da procura por novas

moléculas com propriedades antineoplásicas. Com isto, o conhecimento do

mecanismo de morte celular do poliacetileno fez-se importante, possibilitando

entender melhor a ação deste composto frente a células tumorais, bem como a

etiologia do câncer.

Para avaliar o tipo de morte celular induzida pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6-

triinil-furan-2(5H)-ona, as células B16F10 foram incubadas com brometo de etídeo e

alaranjado de acridina. Esta metodologia, como mencionado anteriormente, permite

diferenciar células viáveis daquelas em processo de morte por apoptose ou necrose,

através da diferença de coloração por fluorescência. O corante alaranjado de

acridina intercala-se ao DNA, dando cor verde ao núcleo da célula, este corante é

capaz de atravessar membranas intactas. Já o brometo de etídeo é incorporado

predominantemente por células não viáveis, que possuem membranas instáveis,

assim o corante intercala-se ao DNA e o cora de laranja, ligando-se fracamente ao

RNA, que se mostrará com uma coloração vermelha. As células que estiverem

viáveis apresentando membrana intacta terão seu núcleo corado de verde pelo

alaranjado de acridina. Como o brometo de etídeo não ultrapassa membranas

celulares íntegras, estas células não são coradas, ou coradas fracamente. Pode-se

também avaliar células em apoptose inicial, a membrana ainda intacta, apresentam

manchas verdes brilhantes no núcleo, devido a condensação da cromatina, não

sendo coradas pelo brometo de etídeo. Já as células em necrose, que apresentam

ruptura de membrana mostram coloração laranja-avermelhada uniforme (VERMES

et al., 2000).

Os resultados obtidos apontam a apoptose como sendo a principal via de

morte celular induzida pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, uma vez

que através da microscopia de fluorescência pode-se identificar as características de

células em processo de morte celular apoptótica, como fragmentação do DNA,

condensação de cromatina e presença de corpos apoptótico. Além da análise

quantitativa que através da porcentagem de células viáveis, em apoptose ou

necrose, mostraram que a substância poliacetileno tem sua ação

predominantemente por via apoptótica. Para fins de comparação utilizou-se o

86

fármaco Paclitaxel como controle positivo, que da mesma forma apresentou maior

índice de morte celular pelo mecanismo de apoptose. A necrose que também foi

evidenciada nas células em contato com o poliacetileno pode ser responsável por

um pequeno processo inflamatório, o que não seria ruim, pois seriam recrutadas

células de reparo como descrito por Dalazen et al., (2005).

Em estudos anteriores realizados por Buskhul et al., (2009) foi demonstrado

que o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona induziu morte celular tanto por

via apoptótica quanto necrótica, quando incubado com células de linhagem B16F10

e Hela, utilizando Anexina V-FITC. Estes resultados corrobam com nossos achados,

sugerindo uma associação de necrose e processo apoptótico. Porém, as células

necróticas totalizavam menos que 25% das células totais indicando um predomínio

de morte celular por apoptose.

Corroborando com nossos resultados, Ryan e Whelan (2004) investigaram os

efeitos do poliacetileno Capillin isolado da Artemisia monosperma, frente a quatro

linhagens humanas tumorais HT29 (carcinoma de cólon), PaCa-2 (carcinoma

pancreático), HEp-2 (carcinoma epidermóide de laringe) e A549 (carcinoma de

pulmão). O mesmo foi capaz de inibir a proliferação celular das linhagens celulares

citadas acima de forma dose e tempo dependente, apresentando morte celular por

via apoptótica e fragmentação nuclear também dose e tempo dependente

confirmada por análise em citômetro de fluxo, acumulando as células nas fases S (

síntese de DNA) e G2/M (mitose e divisão) do ciclo celular.

Outro estudo realizado por Park e colaboradores (2006), com o poliacetileno

dideoxypetrosynol A isolado da esponja marinha Petrosia sp, demonstrou que o

composto foi capaz de manter as células de leucemia monocítica humana em

transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular. Sugeriu-se ainda o envolvimento

das proteínas p16 e pRB na ação deste composto.

Os nossos resultados até então apresentados, em conjunto com dados da

literatura, sugerem que poliacetilenos possivelmente induzem a apoptose em células

tumorais de melanoma. O balanço entre a divisão celular e a morte celular é

importante para o desenvolvimento e manutenção de organismos multicelulares. A

desregulação neste balanço pode levar a condições patológicas, como o câncer

(HOTCHKISS et al., 2009).

A apoptose é um processo específico de morte celular programada através da

ativação de uma via intracelular conservada evolutiva, levando a alterações celulares

87

distintas morfologicamente e bioquimicamente da necrose celular. Sendo essencial

na homeostase de tecidos normais, especialmente as do trato gastrointestinal,

sistema imunológico e da pele. Existem evidências crescentes de que os processos

de transformação neoplásica, progressão e metástase envolvem alterações nas vias

normais de apoptose. Além disso, a maioria dos agentes quimioterapêuticos, bem

como a radiação utilizam a via apoptótica para induzir a morte celular. A resistência

à quimioterapia também parece ser determinada por alterações nas vias apoptóticas

das células cancerosas. Desta forma, compreender os sinais de apoptose o

mecanismo de apoptose pode permitir o desenvolvimento de um melhor agente

terapêutico para o tratamento do câncer (KROEMER et al., 2009; FULDA et al.,

2010).

As vias da apoptose representam os dois processos muito estudados. A via

extrínseca da apoptose é iniciada após a ligação extracelular de receptores

localizados na superfície celular, denominados DR (death receptors) com seus

ligantes específicos, como o membro da superfamília do fator de necrose tumoral

(TNF) que se acopla a um receptor da família dos receptores de morte

correspondente, a ativação destes receptores de morte recrutam e ativam as

caspases iniciadoras como as caspases 8 e 10. Este processo envolve a formação e

ativação do complexo DISC, levando a ativação dos efetores de caspases, como a

caspase 3. (VANDENABEELE et al., 2009; WHELAN et al., 2010).

A via mitocondrial ou intrínseca regulada pela mitocôndria, inicia-se pela ação

de diversos sinais de estresse intracelular, tais como irradiação, agentes

quimioterápicos, vírus, bactérias e ausência de fatores de crescimento celular, os

quais convergem para a mitocôndria com a formação do apoptossoma. O

apoptossoma ativa as caspases iniciadoras, caspase 9 tipicamente, a qual ativa a

caspase 3. As quais são responsáveis pela iniciação, execução e regulação do

processo apoptótico. Envolvidas num mecanismo de clivagem específica de

proteínas as caspases levam ao colapso da infra-estrutura celular através da

desintegração do citoesqueleto, desarranjo metabólico e fragmentação genômica.

Seus principais alvos são as proteínas estruturais e de funções essenciais como

proteínas requeridas no reparo do DNA (DNA-PK, PARP), proteínas reguladoras do

ciclo celular (Cdc27, Rb), proteínas envolvidas em patologias humanas e proteínas

diretamente envolvidas na regulação da apoptose (ICAD, Bid), assim como

88

reguladoras/mediadoras da sinalização apoptótica (PKB/Akt, RIP quinase (kÖHLER

et al., 2002, GHOBRIAL et al., 2005).

Dando continuidade ao estudo, foi realizada a avaliação da atividade

apoptótica pela via da caspase executora 3. As modificações morfológicas que

ocorrem na célula em apoptose são promovidas por uma família de cisteína

proteases denominadas caspases. A família de genes da caspase consiste de 15

membros que são agrupadas em duas grandes sub-famílias, nomeadamente

caspases inflamatórias e caspases apoptóticas.

As caspases formam um sistema de cascata que desempenha o papel central

na indução, transdução e amplificação de sinais intracelulares apoptóticos para

determinação do destino celular, regulação da imunidade, proliferação celular e de

diferenciação (BHAT et al., 2008).

O aumento da caspase 3 nas células tumorais B16F10, após exposição ao

poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona por um período de 6 h, mostra

novamente que a morte celular acontece por via apoptótica e que possivelmente

envolva a via mitocondrial ou intrínseca ( evidenciada pela ativação da enzima

caspase 3). Não foram encontrados dados significativos com períodos de incubação

de 12 e 24 horas. Considerando que nesta via um dos principais alvos das caspases

são as proteínas reguladoras do ciclo celular, como já mencionado anteriormente, o

poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona pode ser um candidato fitofármaco

antineoplásico ciclo celular específico.

Dados da literatura confirmam que muitos fármacos quimioterápicos clássicos,

como a cisplatina, taxol, etoposídeo e doxorubicina ocasionam através da via

intrínseca da morte celular apoptótica, uma forma dependente de p53, por exemplo,

através da ativação de uma resposta aos danos no DNA. A ativação da proteína p53

pode promover a parada do ciclo celular e induzir a célula à apoptose (VOUSDEN;

LANE, 2007).

Nossos resultados são similares aos apresentados por Choi et al. (2006),

onde foram quantificadas as caspases 3 e 9 na presença de um poliacetileno isolado

de Petrosla sp, em células de melanoma humano (SK-MEL-2) nas concentrações

de 5 e 10 µM por um período de 24 horas. O método de quantificação das caspases

foi semelhante ao utilizado neste trabalho, ou seja, quantificação da p-nitroanilina (p-

Na). O poliacetileno na concentração de 5µM obteve pequeno aumento na caspase

3, sendo semelhante aos aqui obtidos com a concentração de 5,4µM,porém em

89

tempo de 6 horas, mas na concentração de 54µM a atividade de caspase 3 se torna

duas vezes mais potente comparada a concentração inferior, sugerindo resposta

dose dependente.

Ativação de caspases iniciadoras geralmente envolve o recrutamento

de várias enzimas homólogas para uma molécula adaptadora, as caspases

iniciadoras são ativadas por dimerização do zimógeno por uma proteína adaptadora,

liberando assim o sítio catalítico da enzima. Em seguida, a cascata proteolítica

propaga o sinal de morte e enzimas efetoras clivam uma série de proteínas (SLEE et

al., 1999). Estas são as responsáveis pelo englobamento das células durante a

apoptose, através da proteólise, posteriormente a externalização de fosfolipídeos, na

condensação e fragmentação nuclear bem como na alteração do citoesqueleto.

A importância das caspases para o mecanismo de morte celular apoptótico

para alguns autores é considerada como a característica mais importante para a

definição de morte celular por apoptose (KROEMER et al., 2005). Todos os agentes

antineoplásicos podem induzir a apoptosee ativar caspases nas células tumorais.Por

exemplo, em células U937 humanas células leucêmicas, a caspase-3 e caspase-6

desempenham um papel central na apoptose desencadeada por inibidores de

topoisomerase. (SORDETet al,1999). A caspase-3 é considerada necessária para

algumas características típicas de apoptose, tais como a fragmentação do DNA,

blebbing de membrana e outras mudanças morfológicas e bioquímicas (SAHARA et

al, 1999).

Para melhor entendimento da ação antitumoral do poliacetileno 5-octa-2,4,6-

triinil-furan-2(5H)-ona, foram realizados ensaios in vivo. Muitos modelos para o

estudo da neoplasia melanoma estão disponíveis. Os modelos murinos são

utilizados para melhor entender o câncer e o seu desenvolvimento, constituindo

importantes ferramentas experimentais, atribuindo uma melhor conpreensão de

novas drogas e novas estratégias fornecendo inúmeras possibilidades para o

tratamento antineoplásico ( NAKAMURA et al., 2002). As células da linhagem

B16F10, após serem inoculadas em camundongos C57BL/6, além de crescerem

espontaneamente possuem a habilidade de formar metástases (NAKAMURA et al.,

2002). Apesar da análise tumoral in vivo ser complexa, algumas diferenças são

visíveis macroscopicamente, como a redução do tumor, a melhora do

comportamento e estado físico do animal, peso corporal entre outros. No entanto, os

90

tumores possuem um microambiente bastante complexo e de grande importância

para o seu desenvolvimento e progressão ou regressão (CONTENTE, 2010).

A ação antineoplásica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona foi

avaliada em modelo de tumor sólido e metástase pulmonar em camundongos

C57BL/6. A atividade antitumoral desta substância nas doses de 5,43 e 54,34

µmol/kg, administrado por via intraperitoneal, apresentou inibição do

desenvolvimento do tumor sólido em camundongos, com redução de 65 a 80% da

massa tumoral, sugerindo uma importante atividade antineoplásica. Os animais

foram acompanhados quanto ao peso corporal, bem como, em relação ao peso de

vários órgãos.

A evolução tumoral nos diferentes grupos foi visivelmente distinta. Não

apenas em relação a massa tumoral e a sobrevida, mas também em relação ao

aspecto físico dos animais. Os animais do grupo controle inoculados com células

B16F10 mostraram-se mais debilitados, e com perda de pelo. No entanto, não foi

observada diferença significativa sobre a porcentagem do peso dos animais, bem

como do fígado em relação ao controle negativo sem tumor e com tumor. Pode-se

observar redução significativa do peso dos corações do grupo controle com tumor

quando comparado com o controle sem tumor e os grupos tratados.

Pode-se observar, em relação ao peso dos baços, aumento significativo no

grupo tratado com a maior dose do poliacetileno, quando comparado ao controle

com tumor. O sistema imune é uma rede de células e órgãos que trabalham juntos

com a principal função de monitorar os tecidos mantendo a homeostase, assim

protegendo contra a invasão de patógenos infecciosos e para eliminar células

danificadas (VISSER et al., 2006). Por exemplo, o baço serve como um reservatório

para o sangue, filtrando e purificando o sangue e a linfa que fluem através dele. O

baço sofrendo qualquer dano, o indivíduo tem mais probabilidades a infeccções (YU

et al., 2007).

Analisando o peso dos rins pode-se observar que o grupo que recebeu

tratamento com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona na maior dose

apresentou diferença significativa quando comparado ao grupo negativo com tumor.

Entretanto, o grupo controle com tumor apresentou uma diminuição da porcentagem

do peso dos rins quando comparados com o grupo controle sem tumor. É possível

sugerir que tais alterações possam ser ocasionadas devido ao tratamento com a

substância, sendo que alteração renal é um dos efeitos adversos da quimioterapia

91

convencional, porém para poder sugerir uma possível causa destas diferenças de

porcentagens nos pesos dos rins, é necessários estudos mais detalhados e

específicos.

No modelo de indução de metástases pulmonares, foi observado redução de

nódulos metastáticos durante a necropsia os grupos tratados com o composto

poliacetileno na menor e maior doses, respectivamente, uma significante redução do

número de nódulos metastáticos nos pulmões comparado com o controle. No

entanto, podemos observar que ocorreu uma redução da atividade antineoplásica do

poliacetileno na maior dose. Estes dados podem ser relacionados com a dificuldade

encontrada na terapia antineoplásica de encontrar uma resposta eficaz para o

tratamento de metástases. Sendo que o melanoma é uma das formas mais

agressivas de câncer, e muito resistente aos tratamentos baseados em drogas que

agem sobre o DNA, microtúbulos e as topoisomerases (CHEN et al., 2006).

Para a maioria dos cânceres metastáticos a única opção baseia-se em

tratamentos sistêmicos com uso de terapia quimioterápica, é muitas vezes a única

opção para retardar o crescimento do tumor ou para aliviar a morbidade associada à

metástase (SETHI e KANG, 2011).

Levando-se em consideração os resultados in vitro e in vivo até então

apresentados, pode-se sugerir que o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona

apresenta importante atividade anticâncer, possivelmente através da indução da

apoptose de células neoplásicas através da indução da enzima caspase-3.

Outros dados somam a este estudo informações importantes. A avaliação da

atividade exploratória avaliada através do modelo de campo aberto (Open Field).

Nosso resultados demonstram que a indução de tumor sólido pelas células B16F10

reduziu de forma significativa o número de cruzamentos no modelo apresentado em

relação ao grupo controle negativo sem tumor. Este resultado evidencia sinais de

prostação, comuns em pacientes com neoplasias em estágios avançados (INCA,

2012).

A administração sistêmica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona,

na dose 5,43 µmol/kg, promoveu um aumento do número de cruzamentos, quando

comparado ao grupo controle com tumor, sugerindo uma melhora na atividade

exploratória dos animais. Já os animais tratados com a dose de 54,34 µmol/kg do

composto não apresentaram diferença significativa quando comparado ao grupo

controle com tumor. A indução de metástases pulmonar não alterou de forma

92

significativa o número de cruzamentos nas doses utilizadas em relação ao grupo

controle com tumor.

Outro parâmetro importante avaliado foi à sensibilidade mecânica dos

animais submetidos ao modelo de metástase pulmonar. A dor é um dos sintomas

mais comuns em pacientes com câncer ocorrendo em 90% dos pacientes durante a

doença. A dor é considerada um fenômeno complexo, que pode ser exacerbada por

inúmeros outros fatores. Considera-se que se a dor for controlada corretamente 80%

dos pacientes conseguem melhorar a qualidade de vida. Portanto, 20% destes

pacientes com dor do câncer tem dificuldade para controlar está dor. O controle da

dor do câncer é alcançado com ótimos resultados através da integração de

analgésicos durante o tratamento ou outro adjuvante que seja necessário (LAIRD et

al., 2008).

As neuropatias periféricas são efeitos colaterais comuns dos medicamentos

quimioterápicos, incluindo taxanos, fármacos baseadas em platina, alcalóides da

vinca, e talidomida. Os sintomas mais comuns são dormência, formigamento e / ou

dor em queimação. Em casos mais grave de neuropatias requer redução da dose,

uma mudança na quimioterapia , ou cessar a quimioterapia. Não há intervenções de

eficácia comprovada para prevenir ou tratar a neuropática induzida por quimioterapia

(AMI et al., 2012). Um terço dos pacientes com câncer metastático sofrem de dor e

60 a 90% dos pacientes com câncer avançado tem dor (LEVY, 1996). O câncer é

associado frequentemente com dor crônica, também é ocasionalmente associado a

episódios prolongados de dor excruciante (dor do câncer emergencial) que requere

uma aplicação rápida de poderosas estratégias analgésicas (HAGEN et al., 1997).

De modo surpreendente, ambas as doses utilizadas (5,43 e 54,34 µmol/kg,

i.p) do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, foram capazes de reduzir

significativamente a sensibilização mecânica, quando comparado com o grupo de

controle negativo inoculado com B16F10. Diante destes resultados pode-se sugerir

dois mecanimos importantes. Primeiramente podemos enfatizar a ação analgésica

do composto frente à dor induzida por metástase. Entretanto, quando avalia-se os

principais efeitos tóxicos das terapias antineoplásicas convencionais, observa-se o

surgimento de neuropatias periférias (LEVY, 1996). O composto em questão, além

de promover redução do tumor e metástase, reduziu a sensibilização induzida pelas

células tumorais. Cabe ressaltar que a ação anti-nociceptiva deste composto foi

avaliada em diferentes modelos de dor inflamatória (dados não apresentados neste

93

estudo), porém nenhuma atividade foi observada, sugerindo que esta ação anti-

nociceptiva citada acima seja decorrente da sua atividade anti-neoplásica.

Por fim, na tentativa de buscarmos outras informações sobre o

comportamento da substância poliacetileno in vivo, foi proposto um estudo de

toxicidade aguda. No entanto, a maioria dos agentes antineoplásicos atua de forma

não-específica, ou seja, lesando tanto as células neoplásicas quanto as normais,

principalmente as células que possuem um crescimento rápido como as

gastrointestinais, capilares e as do sistema imunológico, explicando os efeitos

colaterais da quimioterapia (MURAD et al., 1996).

O fígado é considerado o órgão de detoxificação, e os rins como o órgão

excretor mais importante, assim ambos são vulneráveis perante a fármacos

quimioterápicos, como disfunções hepáticas ocasionadas pela mitramicina e a

toxicidade renal causada pelo fármaco docetaxel (SALMONM, 1998).

Assim os animais receberam tratamento com a substância nas doses de 5,43

e 54,34 µmol/kg; i.p durante 12 dias. Os animais foram avaliados quanto a

alterações no peso corporal, os resultados sugeriram que, não houve redução ou

ganhos de peso corporal significativa comparando os pesos inicias e finais dos

animais. Os órgãos analisados fígado, rim e baço não apresentaram nenhuma

alteração significativa. Nenhuma alteração foi observada quando a atividade

locomotora destes animais foi avaliada.

Os resultados obtidos até o momento são considerados promissores. Foi

possível estabelecer modelos básicos de experimentação e documentar fatos

importantes como estudo de influência tumoral, metástase pulmonar, avaliação de

peso corporal e órgãos e toxicidade aguda do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-

triinil-furan-2(5H)-ona. O estudo mostrou que o tratamento com o poliacetileno é

efetivo no combate as células tumorais, menos tóxico e bem tolerado.

Sendo assim, nossos resultados sugerem que a substância isolado da

planta Vernonia scorpioides o poliacetileno, pode ser considerado uma molécula

promissora com potencial ação antineoplásica, podendo servir de molécula base

para modificações químicas, que podem aumentar seu efeito citotóxico utilizando

como via de morte o processo apoptótico.

94

7. Conclusão

Este trabalho nos permite concluir que o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-

furan-2(5H)-ona isolado de Vernonia scorpioides

Apresenta capacidade antiproliferativa significativa contra células leucêmicas,

de tumor sólido, células de melanoma murino B16F10 utilizando como

análise os ensaios colorimétricos com MTT e XTT;

O composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona é semelhante ao

Paclitaxel quanto a sua atividade citotóxica;

A apoptose pode ser a principal via de morte celular após incubação com

Poliacetileno;

Também pode ser evidenciado que a atividade citotóxica é moderadamente

reduzida na presença do inibidor de caspase;

O poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona mostrou atividade

antineoplásica frente ao modelo de tumor sólido, reduzindo de forma

significativa a massa tumoral e o volume tumoral;

No modelo de metástase pulmonar o composto reduziu significativamente os

nódulos metastáticos;

Conclui-se também que o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-

2(5H)-ona não apresentou efeitos tóxicos significativos quando administrado

por 12 dias de tratamento nos animais. Mantendo o peso corporal, e órgãos

como o fígado, baço e rins sem alterações macroscopicamente visíveis;

Considerando os promissores resultados apresentados neste trabalho pelo

composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, é de interesse a

continuidade dos estudos com a pesquisa, avaliando de forma mais detalhada

mecanismos de morte celular envolvendo outras caspases iniciais, bem como o

envolvimento de outras proteínas no processo apoptótico como a p53, além de

estudo in vivo buscando análises bioquímicas de mediadores inflamatórios utilizando

de forma mais complexa as ferramentas de biologia molecular.

Em conclusão, embora não seja possível apresentar um mecanismo exato da

substância poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, os nossos dados

sugerem que sua ação antineoplásica está associada a indução de morte celular por

95

apoptose. Outros estudos são importantes para detalhar este efeito em nível

molecular.

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REFERÊNCIAS

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Apêndices

109

Apêndice A

Análise morfológica das células

110

Figura 1. Efeitos do composto poliacetileno obtido de V. scorpioides, na morfologia das células de melanoma murino B16F10. As células foram mantidas durante 24 horas a 37ºC/5% de CO2, utilizando como controle negativo meio MEM com solvente (G) e controle positivo Paclitaxel a 100μM (F) e as respectivas concentrações de 0,0543 μM (A); 0,54 μM (B); 5,4 μM (C); 54 μM (D); 543 μM (E). Excitação BP480-550nm, Filtro BA590nm, com aumento de 400X.

111

Apêndice B

Análise morfológica das células

Figura 2. Efeitos do composto Poliacetileno obtido de V. scorpioides, na morfologia das células de melanoma murino B16F10. As células foram mantidas durante 48 horas a 37ºC/5% de CO2, utilizando como controle negativo meio MEM com solvente (G) e controle positivo Paclitaxel a 100 μM (F) e as respectivas concentrações de 0,0543 μM (A); 0,54 μM (B); 5,4 μM (C); 54 μM (D); 543 μM (E). Excitação BP480-550nm, Filtro BA590nm, com aumento de 400X.

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