universidade do estado do amazonas fundaÇÃo de … › data › area › dissertacao › download...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SISTÊMICAS, UTILIZANDO UMA TÉCNICA DE PCR/RFLP
DIEGO RAYAN TEIXEIRA DE SOUSA
MANAUS
2013
i
DIEGO RAYAN TEIXEIRA DE SOUSA
DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SISTÊMICAS, UTILIZANDO UMA TÉCNICA DE PCR/RFLP
Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza
Co-Orientador: Prof. Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos
MANAUS
2013
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
FICHA CATALOGRÁFICA CATALOGAÇÃO: UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA Av. Carvalho Leal, 1777 – Cachoeirinha – Cep.69065-001
fone: (092) 3878-4380 - Manaus-AM
www.uea.edu.br
S719d Sousa, Diego Rayan Teixeira de. Detecção e identificação de fungos causadores de micoses sistêmicas utilizando uma técnica de pcr/rflp. / Diego Rayan Teixeira de Sousa. – Manaus : UEA, 2013. 49 f. : il. ; 30 cm
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas como requisito para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza.
Inclui Referências. 1. Micoses Sistêmicas. 2. PCR/ RFLP. 3. Diagnóstico. 4. Fungos. 4. Micologia. 5. Biologia Molecular. I. Título. CDU 582.28
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SISTÊMICAS, UTILIZANDO UMA TÉCNICA DE PCR/RFLP
DIEGO RAYAN TEIXEIRA DE SOUSA
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
______________________________________
Prof. João Vicente Braga de Souza, Dr.
Presidente
______________________________________
Prof. Aya Sadahiro, Dr.
Membro
______________________________________
Prof. Maria das Graças Vale Barbosa, Dr.
Membro
iii
Agradecimentos
A Deus, que se mostrou criador, que foi criativo. Seu fôlego de vida em mim me foi sustento e me deu coragem para questionar realidades e propor sempre um novo mundo de possibilidades.
À minha família, por sua capacidade de acreditar em mim e investir em mim. Mãe, seu cuidado e dedicação foi que deram, em alguns momentos, a esperança para seguir. Pai, sua presença significou segurança e certeza de que não estou sozinho nessa caminhada.
Aos meus amigos, pelas alegrias, tristezas e dores compartilhas. Com vocês, as pausas entre um parágrafo e outro de produção, melhora tudo o que tenho produzido na vida.
A todos aqueles que de alguma forma estiveram e estão próximos de mim, fazendo esta vida valer cada vez mais a pena.
A todas as pessoas e instituições que de maneira relevante contribuíram para a realização do trabalho. Em especial as Instituições: UEA, FMT-HVD, SUFRAMA, CAPES, FMURAKI.
iv
RESUMO
A incidência das micoses sistêmicas está aumentando. Um diagnóstico rápido e adequado é importante, no entanto, os ensaios laboratoriais mais comumente utilizados (cultura e microscopia) são lentos, trabalhosos e onerosos. De uma forma geral, os métodos moleculares tem se apresentado como ferramentas úteis em diagnóstico, atendendo aos requisitos de sensibilidade, especificidade e rapidez. O objetivo do presente estudo foi avaliar a possibilidade de detectar e identificar fungos patogênicos causadores de micose profunda, utilizando a técnica de PCR/RFLP, na rotina laboratorial de uma unidade terciária de saúde no norte do Brasil. Para tanto, foi realizada a PCR-RFLP (ITS5-NL4, digestão DdeI) de cepas padrão pertencentes ao laboratório de micologia do INPA, em seguida essa PCR-RFLP foi avaliada na identificação de 90 culturas de fungos causadores de micoses sistêmicas (em comparação com a identificação convencional) e por fim foi investigada a acurácia da PCR/RFLP em comparação com a identificação convencional na detecção e identificação de agentes causadores de micoses sistêmicas em 120 amostras biológicas de pacientes com suspeita clínica de micoses sistêmicas. As características epidemiológicas dos pacientes acometidos por fungemia também foram investigadas. Quanto aos resultados, os perfis de RFLP obtidos na PCR/RFLP com o DNA das cepas padrão (Candida.albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida kruzei, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum e Aspergillus niger) foram similares aos perfis teoricamente descritos pelo GeneBank. Todos as 90 culturas de fungos causadores de micoses sistêmicas foram identificadas de forma similar pelos métodos convencionais e pela PCR-RFLP. Quanto ao diagnóstico das 120 amostras biológicas a PCR apresentou uma co-positividade de 100% e uma co-negatividade de 89,4% em relação ao diagnóstico convencional e também nessa situação a RFLP identificou corretamente os microrganismos que foram identificados de forma convencional. Nessa amostragem, 7 pacientes estavam sendo acometido por fungemias e suas características epidemiológicas eram em sua maioria: sexo masculino (4/7), com idade entre 18 e 58 anos residentes da Zona Leste de Manaus (5/7), apresentavam sorologia positiva para HIV (5/7), Carga viral de HVI de <50 a 170.660 cópias/ml e apresentavam CD4 entre 5 e 491 cel/ml.
Palavras chave: Micoses Sistêmicas, PCR/ RFLP, Diagnóstico.
v
ABSTRACT
The incidence of systemic mycoses is increasing. A rapid diagnosis and appropriate is important, however, the most commonly used laboratory tests (culture and microscopy) are slow, cumbersome and costly. In general, molecular methods have been presented as useful tools in diagnosis, meeting the requirements of sensitivity, specificity and speed. The aim of this study was to evaluate the ability to detect and identify pathogenic fungi causing deep mycosis, using PCR / RFLP in routine laboratory of a tertiary healthcare center in northern Brazil. Therefore, we performed PCR-RFLP (ITS5-NL4, DdeI digestion) of standard strains belonging to the mycology laboratory INPA then this PCR-RFLP was evaluated in the identification of 90 crops of fungi that cause systemic mycoses (compared with conventional identification) and finally we investigated the accuracy of PCR / RFLP compared with conventional identification in the detection and identification of causative agents of systemic mycoses in 120 biological samples from patients with clinical suspicion of systemic mycoses. The epidemiological characteristics of patients with fungemia were also investigated. As for the results, the RFLP profiles obtained by PCR / RFLP with DNA from standard strains (Candida.albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida kruzei, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum and Aspergillus niger) were similar the profiles described theoretically by the GeneBank. All the 90 cultures of fungi causing systemic mycosis were similarly identified by conventional methods and PCR-RFLP. As for the diagnosis of 120 biological samples showed a PCR co-positivity of 100% and a co-negativity of 89.4% over the conventional radiography, and also in that situation the RFLP correctly identified the microorganisms that have been identified in conventional manner. In this sample, 7 patients were being affected by fungemia and its epidemiological characteristics were mostly male gender (4/7), aged between 18 and 58 years resident of East Zone of Manaus (5/7), presented positive serology for HIV (5/7) of HVI viral load of <50 to 170,660 copies / ml and showed CD4 between 5 and 491 cells / ml.
Keywords: Systemic Mycoses, PCR / RFLP, Diagnostics.
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Tamanho dos produtos de PCR da região ITS e dos fragmentos de restrição
baseados na sequência de nucleotidios obtidos no GenBank...................................... 19
Tabela 2. Tamanho dos produtos de PCR da região ITS e dos fragmentos de restrição
baseados na sequência de nucleotidios obtidos no GenBank
(ARTIGO)....................................................................................................................... 27
Tabela 3. Co-positividade e Co-negatividade entre a PCR (ITS5-NL4) e o métodos
convencionais na detecção dos fungos nas amostras biológicas................................. 29
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fluxograma das atividades desenvolvidas no projeto....................................17
Figura 2. Produtos de PCR (A) e de Restrição (B) obtidos a partir dos isolados de
referência....................................................................................................................... 28
Figura 3. Perfis de RFLP (Primers ITS5-NL4, enzima de restrição DdeI) obtidos a partir
de DNA extraído de culturas de fungos isolados de micoses
sistêmicas...................................................................................................................... 29
viii
LISTA DE ABREVEATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
ABNT- Associação Brasileira de Normas Técnicas
CAPES- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNPq- Centro Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
DNA- Ácido Desoxorribonucléico
FAPEAM- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas
FMTHVD- Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado
HCl- Ácido Clorídrico
HIV- Vírus da Imunodificiência Humana
HUSM-Hospital Universitário de Santa Maria
HPD-Histoplasmose Progressiva e Disseminada
IL-Interleucina
INPA- Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
KCl- Cloreto de Potássio
KOH- Hidróxido de Potássio
MgCl2- Cloreto de Magnésio
mM- Unidade de medida: milimolar
PCR- Reação em Cadeia de Polimerase
PPSUS- Programa de Pesquisa para o Sistema Único de Saúde
ix
RFLP- Análise de Polmorfismo de Fragmentos de Restrição
RNA- Ácido Ribonucléico
SUS- Sistema Único de Saúde
TNF- Fator de Necrose Tumoral
U-Unidade de medida: unidades
oC-Unidade de medida: graus celsius
µL- Unidade de medida: microlitro
x
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................01
1.1 Micoses Sistêmicas em Pacientes com Aids..........................................................04
1.1.1 Criptococose........................................................................................................04
1.1.2 Histoplasmose.....................................................................................................05
1.1.3 Candidose............................................................................................................06
1.2 Diagnóstico das Micoses Sistêmicas........................................................................08
1.2.1 Metodologias Convencionais...............................................................................08
1.2.2 Métodos Moleculares...........................................................................................09
2 OBJETIVOS................................................................................................................12
3 MATERIAL E MÉTODO.............................................................................................12 3.1 Modelo do estudo......................................................................................................12
3.2 Universo do estudo...................................................................................................13
3.2.1 Local do estudo.....................................................................................................13
3.2.2 Microrganismos de referência e isolados clínicos.................................................13
3.2.3 População do Estudo…………………………………………………………………...14
3.2.4 Amostragem………………………………………………………………………..……14
3.3 Critério de Inclusão dos Pacientes………………................................................…..14
3.4 Critério de Exclusão dos Pacientes……….......................................................…….14
3.5 Fluxo das Atividades……………………………………………………………………..15
3.6 Aspectos Éticos…………………...............................................................…………..17
3.7 Procedimentos……………………………………………………………………...……..17
xi
3.7.1 Diagnóstico convencional…………………………………………………………..….17
3.7.2 Diagnóstico pela PCR e RFLP……………………………………............................17
3.8 Análise dos Resultados…………………………………………………………………..18
4 RESULTADOS...........................................................................................................19
5 CONCLUSÃO.............................................................................................................35
6 REFERÊNCIAS..........................................................................................................35
7 ANEXOS.....................................................................................................................42
1
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, a incidência de micoses sitêmicas tem aumentado,
tornando-se uma importante causa de morbidade e mortalidade. Os pacientes,
mais acometidos, são os imunocomprometidos, dentre eles, os com a Síndrome
da Imunodeficiência Adquirida (Aids), transplantados, que fazem uso de
corticóides/quimioterápicos e os presentes em unidades de terapia intensiva1,2,3,4.
As micoses oportunistas mais comuns em pacientes com Aids são: criptococose,
histoplasmose e candidose5.
A criptococose é causada pelas espécies Cryptococcus neoformans e
Cryptococcus gattii. Essa raramente acomete indivíduos sadios, no entanto,
chega acometer 1 a cada 10 pacientes com AIDS. O sítio inicial da infecção é
geralmente o pulmão. Em indivíduos hígidos a infecção pode permanecer de
forma latente ou oligossintomática por um longo período e em 10% dos casos
evolui através da disseminação hematogênica, com predileção especial pelo
sistema nervoso central em particular as meninges. Os pacientes com Aids
acometidos por Criptococose, em sua maioria, fazem essa forma disseminada6,7.
A histoplasmose é causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum. A
forma clínica mais grave dessa doença e a disseminada progressiva (PDH), que
é mais freqüente nos pacientes com Aids. O acometimento em pacientes hígidos
ocorre especialmente nos Estados Unidos e América Latina. No Panamá, a PDH
ocorreu em 8% dos pacientes hospitalizados entre 1997 e 2003, apresentando
uma mortalidade de 12%8,9.
As candidoses são causadas por leveduras do gênero Candida, essas
colonizam e infectam o hospedeiro humano com imunocomprometimento. Este
gênero corresponde a 80% das infecções fúngicas documentadas e estudos
2
demonstram que chegam ser o quarto agente mais comum em septicemias,
correspondendo por cerca de 8% dos casos1,10.
O diagnóstico precoce e o tratamento dessas micoses profundas e
oportunistas são importantes, devido à morbi-mortalidade dessas infecções e a
possibilidade de dispersão hematológica para órgãos mais profundos. Ensaios
laboratoriais para detecção dessas infecções necessitam ser eficazes para
determinação do número dessas infecções em nosso meio, para melhoria do
tratamento e prognóstico dos pacientes11.
Os métodos convencionais de identificação de agentes de micoses
profundas e oportunistas são: exame direto (microscopia) e cultura de material
biológico. Os exames diretos, de uma forma geral, são pouco discriminatórios e
possuem um limite de detecção inadequado. As culturas, conjuntamente com as
provas bioquímicas são, de forma geral, lentas e apresentam problemas de
sensibilidade e especificidade5,12.
A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) está sendo cada vez
mais aplicada em rotina para detecção de genes humanos e de microrganismos
patogênicos. De uma forma geral, os métodos moleculares são úteis no
diagnóstico, atendendo aos requisitos de sensibilidade, especificidade e
rapidez13,14.
Um estudo realizado por Souza et al.(2008) demonstrou a importância das
doenças fúngicas disseminadas como causa morte de pacientes com AIDS. Esse
teve como objetivo verificar a causa de morte de 129 pacientes com AIDS,
necropsiados na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas no período de
1996 a 2003 e entre os resultados observou-se que as doenças mais freqüentes
foram tuberculose 28%, pneumonia bacteriana 17%, histoplasmose 13%,
3
toxoplasmose 10%, pneumocistose 8% e criptococose 5%. Outra situação que
deve ser ressaltada é que, as particularidades geográficas e ambientais, da
Amazônia, podem promover resultados quanto à freqüência dos agentes fúngicos
diferentes do resto do Brasil. Portanto, estudos que visem determinar a
freqüência de agentes causadores de micoses profundas e oportunistas são
fundamentais e necessários em nossa região, as informações geradas por esses
trabalhos possuem importância clínica, epidemiológica e para as políticas
públicas15.
Recentemente, na Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado,
Santos et.al., (2010) demonstraram a detecção e identificação de vários fungos
causadores de fungemia utilizando uma única técnica de PCR/RFLP. Esses
avaliaram várias relações entre primers e enzimas de restrição e concluíram que
os primers NL4 e ITS5 e a enzima de restrição Ddell permite a
detecção/identificação de amostras contendo Candida albicans, C. tropicalis, C.
glabrata, C. parapsilosis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii e
Histoplasma capsulatum. Esse estudo necessitou ser ampliado, especificamente,
utilizando essa metodologia na rotina de uma instituição que tenha pacientes
acometidos por micoses profundas e oportunistas5.
O custo das tecnologias moleculares foi durante algum tempo a justificativa
principal para a não utilização dessas metodologias de forma usual.
Recentemente, indícios vêm demonstrando que as atividades de diagnóstico
convencional possuem custo similar ao custo das metodologias moleculares,
sendo que, as metodologias moleculares apresentam vantagens quanto à
velocidade e sensibilidade,16,17
A seguir será apresentada uma revisão da literatura que tem como objetivo
aprofundar a discussão apresentada.
4
1.1 Micoses Sistêmicas em Pacientes com Aids.
A seguir será apresentado uma revisão da literatura sobre algumas das
mais importantes micoses sistêmicas (criptococose, histoplasmose e candidose)5.
1.1.1 Criptococose
Criptococcose é uma micose sistêmica causada principalmente por fungos
pertencentes ao complexo Cryptococcus neoformans, cujos membros são C.
neoformans e Cryptococcus gattii18. C . neoformans ocorre com mais freqüência
em indivíduos imunocomprometidos e a doença resultante pode ser grave e
potencialmente fatal, mesmo quando tratados. A espécie C. gattii por outro lado,
tem sido descrita principalmente em indivíduos imunocompetentes19.
A infecção por Cryptococcus spp inicia nos pulmões logo após a
inspiração de propágulos infecciosos (blastosporos) presentes no ambiente,
especificamente em excretas de aves e de material vegetal em decomposição7.
Quanto às manifestações clínicas, a infecção pulmonar tem uma tendência
à resolução espontânea e é freqüentemente assintomática, mas, quando
presentes, as alterações incluem intensa inflamação granulomatosa.
Principalmente em imunocomprometidos, as manifestações geralmente são
relacionadas à disseminação hematogênica e infecção do sistema nervoso
central, com quadro de meningoencefalite subaguda ou crônica. A disseminação
hematogênica silenciosa para o cérebro produz aglomerados de Criptococccus
nas áreas perivasculares da substancia cinzenta cortical, nos núcleos da base e,
em menor extensão, em outras áreas do SNC. A resposta inflamatória em torno
desses focos é habitualmente escassa. Nos casos mais crônicos, aracnoidite
basilar densa é típica7,20.
Monteiro et. al., estudaram a frequência da criptococose em um Hospital
Universitário de Santa Maria (HUSM) localizado no Brasil, no estado do Rio
Grande do Sul, no ano de 2006. Seus resultados de hemoculturas demonstraram
5
uma frequência de 29,8% de isolamento dos agentes causadores de
criptococose, sendo que, a maioria dos pacientes acometidos possuíam algum
imunocomprometimento21.
A investigação laboratorial de criptococcose é baseada no exame direto,
isolamento de fungos, testes bioquímicos e imunodiagnóstico. No entanto, estes
procedimentos possuem limitações que podem dificultar o diagnóstico final12,16.
Atualmente, embora não seja aplicada no diagnóstico de rotina, existem métodos
moleculares para detecção de determinadas seqüências de genes do complexo
de C. neoformans a partir de espécies clínicas e culturas22.
1.1.2 Histoplasmose
A histoplasmose é uma infecção causada pelo fungo dimórfico Histoplasma
capsulatum9.
O homem adquire a infecção através da inalação dos conídeos presentes
no solo e material contaminado por dejetos de morcegos ou aves. Os esporos
vão para o ar, quando o solo contaminado é inalado pode causar infecção. A
histoplasmose não é transmitida de pessoa para pessoa. O Histoplasma
capusulatum multiplica-se no interior das células de defesa do sistema
macrofágico-linfóide e a partir dos pulmões ganham os linfonodos para-hilares e
mediastinais e depois a circulação sistêmica9,23
A maioria das infecções por Histoplasma são subclínicas, sendo
frequentemente limitadas pela resposta imune do hospedeiro. No entanto, se o
sistema imunológico não consegue controlar a infecção, o fungo pode levar à
infecção pulmonar aguda ou crônica ou disseminada24.
Na última década, a incidência da histoplasmose mais que duplicou entre os
pacientes com Aids. Um estudo retrospectivo realizado no Panamá, entre 1997 a
2003, revelou que em 2379 internamentos por AIDS 184 tinham histoplasmose
disseminada23.
6
O diagnóstico de histoplasmose baseia-se na cultura, histopatologia,
detecção de antígenos e anticorpos. Em cultura, H. capsulatum tem crescimento
lento e sua identificação dura entre 3 a 6 semanas. Sua manipulação laboratorial
é perigosa, devendo ser realizada em ambiente com nível III de biossegurança. A
sensibilidade da cultura varia dependendo do tipo de amostra analisada. Em
medula óssea a sensibilidade é de 70 a 90% enquanto que em espécimes
respiratórios é entre 50 a 90 %23.
O exame por microscopia direta ou após coloração específica de
histopatologia é somente positivo em aproximadamente 50% dos casos. Os
métodos usando anticorpos são mais rápidos do que a cultura, entretanto a
sensibilidade depende da imunidade do paciente, do estágio da doença e da
forma clínica. A detecção do antígeno em amostras biológicas é uma metodologia
sensível e específica (sensibilidade de 95% em amostra de urina), no entanto, é
cara e atualmente não disponível na maior parte dos laboratórios. Portanto, o
diagnóstico laboratorial da histoplasmose necessita ser melhorado24, 25.
1.1.3 Candidose
Candidíase ou candidoses são infecções provocadas por leveduras do
gênero Candida. Embora a lista de microorganismos envolvidos em fungemias
esteja em expansão, às espécies do gênero Candida permanecem como os
agentes mais comumente associados a estas infecções. Estima-se que
aproximadamente 5-15% das infecções de corrente sanguínea e mais de 80%
dos casos de fungemias sejam causados por Candida spp1,26,27 .
Candidíase disseminada tem sido dividida em quatro grupos: candidíase
relacionada a cateter, candidíase disseminada aguda, candidíase disseminada
crônica e candidíase de órgãos profundos. Quanto a idade, a incidência de
candidíase invasiva tem uma distribuição bimodal, sendo aproximadamente
75:100.000 em crianças menores de 1 ano e 26:100.000 em adultos maiores de
65 anos28.
7
Em relação às espécies, Candida albicans é a principal espécie encontrada
nas candidoses sendo responsável por mais de 50% dos casos, seguida por C.
glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. krusei e C. guilliermondii, sendo essa
última espécie um agente etiológico pouco comum na candidíase, com alguns
registros de casos de candidíase disseminada (1 a 2% dos casos). A mortalidade
geral de Candidíase é da ordem de 40 a 60%, representando um grande desafio
aos clínicos de diferentes especialidades devido às dificuldades diagnósticas e
terapêuticas das infecções causadas por tais agentes1,29.
A população de fungos no organismo humano é controlada pela microbiota
bacteriana e pelo sistema imunológico. Porém, às vezes ocorre crescimento de
fungos e surge infecção. Existem várias situações em que Candida spp. podem
desenvolver-se demais ou se multiplicar: a) Uso prolongado de antibióticos
podem destruir as bactérias que inibem os fungo; b) Desordens e mudanças de
causas hormonais, tais como menopausa, gravidez; c) Ingestão de pílulas
contraceptivas; d) infecção pelo HIV e e) Uso de drogas que suprimem o sistema
imunológico do organismo1,30,31 .
Quanto à imunidade, o T-helper subconjunto Th17 é uma importante defesa
do hospedeiro contra Candida e desempenha um papel importante no controle da
colonização desse fungo, ao passo que a resposta Th1 e monócitos dependentes
de citocinas tais como IL-1 e TNF são predominantemente responsáveis pela
ativação de neutrófilos e macrófagos durante candidíase disseminada29. O
diagnóstico de candidoses continua a ser uma problemática laboratorial. As
culturas positivas de urina ou de mucosas, não indicam necessariamente que a
doença é invasiva, embora possam ocorrer durante a infecção sistêmica. Além
disso, diferenças na virulência entre as espécies de Candida, bem como na sua
susceptibilidade a drogas antifúngias, torna a identificação um importante dado
para a clínica32.
O diagnóstico de candidose invasiva é realizado por meio de culturas.
Avanços têm sido desenvolvidos, melhorando a sensibilidade e/ou reduzindo o
8
tempo necessário para obter uma cultura positiva. Métodos automatizados que
utilizam frascos de cultura de sangue como o Bact/ALERT 3D e o BACTEC 9240
foram desenvolvidos e reduziram o tempo de diagnóstico. No entanto, mesmo
com esses avanços, o diagnóstico final ainda demora mais de 72 horas o que
resulta especificamente em candidemia, em um risco elevado de mortalidade
para o paciente2,33.
Frente ao apresentado, nota-se que as micoses profundas e oportunistas,
por serem indicativos de migração fúngica para outros órgãos, especialmente em
pacientes comprometidos imunologicamente, exigem diagnóstico rápido,
específico e específico.
1.2 Diagnóstico das Micoses Sistêmicas
Esse presente item apresenta um resumo das ferramentas de diagnóstico
convencionais e moleculares que são utilizadas e que possuem potencial para
serem utilizadas para o diagnóstico das micoses profundas.
1.2.1 Metodologias Convencionais
Os métodos convencionais são os mais usados na rotina por serem de
fácil acesso e de baixo custo. Estes métodos se dividem em: exame direto
(microscopia), cultura de fungos e exames imunológicos34,35
As técnicas de exame microscópico direto em material biológico são
amplamente utilizadas para detecção rápida de fungos, fornecendo a avaliação e
informações imediatas sobre os microrganismos. No entanto, essas técnicas
apresentam problemas devido aos baixos limites de detecção (necessidade de
um número superior a 1x104 células/ml), dificuldade de interpretação,
sensibilidade baixa e o valor diagnóstico variável34,35,36.
O exame micológico envolvendo o cultivo é um recurso de amplificação
biológica. Isola-se o agente biológico e obtêm-se culturas puras, as quais são
9
caracterizadas, identificando-se o agente, o que confere certeza ao diagnóstico.
As hemoculturas têm notoriamente pouca sensibilidade no fornecimento de
evidências de infecção disseminada (73% de positividade nos sistemas mais
eficientes). Quando chegam a ser evidentes em hemoculturas, os resultados são
igualmente indicativos de alta morbidade e mortalidade para os pacientes. São,
na verdade, achados que muitas vezes antecedem, quase que imediatamente, a
morte do paciente. Tornando o tratamento empírico ainda muito importante nos
casos de fungemias2,37.
Quanto aos métodos imunológicos, os principais problemas são a baixa
sensibilidade e a especificidade de muitos deles. A detecção de anticorpos anti
Candida albicans, por exemplo, não é muito eficaz, tendo em vista a baixa
sensibilidade e especificidade, talvez por ser Candida um membro da microbiota
normal. Os antígenos desse microrganismo não se mostram especialmente
imunogênicos. Além disso, a produção de anticorpos nos pacientes
imunossuprimidos, aqueles mais susceptíveis a tais infecções, está
comprometida, o que diminui a possibilidade de detecção de aumento de título de
anticorpos específicos. Quanto às metodologias baseadas na busca de
antígenos, essas possuem sensibilidade, especificidade e velocidade adequadas
para os casos de micoses profundas e oportunistas, no entanto, ainda não são
difundidas e são muito caras2,37,38.
Pelo apresentado, entende-se que os métodos convencionais possuem
problemas e necessitam ser melhorados, especificamente quanto à sensibilidade
e velocidade. As metodologias moleculares são uma opção para a detecção e
identificação de agentes de agentes de micoses profundas e oportunistas,
reduzindo espaço de tempo entre a internação do paciente e inicio do tratamento
não empírico.
1.2.2 Métodos Moleculares
Apartir dos anos 50, com a descoberta da estrutura do DNA (ácido
desoxirribonucléico), surgiu uma nova ciência a Biologia Molecular, a qual se
10
revelou uma ferramenta útil no diagnóstico das doenças infecciosas através da
identificação de uma sequência gênica específica de um agente causador da
doença em material biológico obtido do paciente39.
Os métodos moleculares complementam com qualidade os métodos
convencionais através da análise genética de amplificação de determinados
seguimentos da estrutura do genoma do microrganismo envolvido e diversas
publicações tem reiterado sua aplicação na prática clínica40.
Os anos 60 assistiram à descoberta do código genético, dos mecanismos
de transcrição do DNA em RNA mensageiro, e a sua tradução em proteínas. Nos
anos setenta, emergiram a tecnologia do DNA recombinante e as técnicas para
seqüenciamento rápido do DNA37.
Entre 1970 E 1990, o número de revistas médicas, contendo a palavra
“molecular” no título, cresceu de 31 para 90, assinalando que a compreensão dos
fenômenos biológicos acontecia nesse nível. As técnicas moleculares podem ser
empregadas para monitorar a presença e o estabelecimento de genótipos,
mesmo das cepas mais virulentas, em uma dada população, uma vez que
permitem o estudo da diversidade de espécies do meio ambiente. Assim, a
acumulação de dados gerados por métodos moleculares, vem causando um
impacto positivo sobre o acompanhamento de cepas resistentes e tratamento de
doenças19.
O primeiro ensaio de PCR para o diagnóstico de micoses foi publicado, em
1990, por Buchman et. al. Esses autores concluíram que, a detecção de DNA
fúngico pela PCR foi precoce comparativamente aos achados de cultura.
Seguiram-se outros trabalhos como, por exemplo, o de Hopfer et. al. (1993)34,
que realizaram a amplificação do DNA de fungos patogênicos e com o uso de
enzimas de restrição (PCR-RFLP) puderam identificar fungos patogênicos
(Candida, Cryptococcus, Trichosporon, bolores e hifas septadas, bolores e hifas
asseptadas e fungos dimórficos)37.
11
Modernas técnicas de PCR, tais como, PCR-multiplex e PCR-multiplex em
tempo real, têm sido usadas para a detecção e identificação de fungos
patogênicos. Entretanto, estes métodos possuem algumas deficiências, tais
como: a) A técnica de PCR-multiplex é limitada para a identificação de poucas
espécies fúngicas por reação e apresenta problemas de especificidade para
detecção fúngica em amostras biológicas e b) O PCR-multiplex em tempo real
não é um método bem disseminado porque necessita de equipamentos
específicos e ainda de alto custo5.
As análises por RFLP (Análise de polimorfismo de fragmento de restrição)
detectam variações de seqüencias do genoma, usando endonucleases de
restrição para amostrar pequenos trechos de DNA, representados por sítios de
reconhecimento para cada enzima. As endonucleases de restrição conhecem
seqüencias específicas, usualmente quatro a seis nucleotídeos, e cortam o DNA
dentro ou na proximidade do sítio de reconhecimento. Essa técnica tem um
grande potencial para a detecção rápida, identificação de espécies de fungos
patogênicos e, portanto, como ferramenta de diagnóstico e a PCR/RFLP é um
ensaio simples, exige apenas equipamentos padrões e fornece resultados
adequados para o estudo de diversas espécies simultaneamente5,41.
Uma série de procedimentos que utilizam a técnica de amplificação de
PCR/RFLP tem sido sugeridos para a identificação de espécies de fungos.
Entretanto, poucos estudos incluem em um mesmo procedimento a identificação
de agentes causadores de fungemias5. Neste sentido, foi realizado na FMTHVD,
no período de 2006-2009, um projeto financiado pelo Programa de Pesquisa para
o SUS (gestão compartilhada-PPSUS), denominado “Aspectos referentes à
implantação na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-HVD) um
diagnóstico molecular (PCR/RFLP) para identificação de agentes causadores de
fungemias em pacientes com Aids”.Entre os principais resultados deste projeto
cita-se que, utilizando a região de amplificação ITS1/NL4 e enzima de restrição
Ddel, foi obtido um perfil de RFLP para os principais agentes de fungemia:
Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida tropicalis,
Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii e Histoplasma capsulatum. Este
12
resultado foi validado indentificando-se 60 outras culturas de uma coleção de
fungos. No entanto, para utilização em rotina de pesquisa para fungos, necessita-
se validar esta metodologia em estudos que utilizem amostras biológicas5.
2. OBJETIVOS
O objetivo deste estudo foi avaliar a detecção e identificação de fungos
causadores de micoses profundas e oportunistas, utilizando a técnica de
PCR/RFLP. Especificamente pretendeu-se:
a) Determinar os perfis de RFLP obtidos com a realização da técnica PCR-
RFLP com as cepas padrão.
b) Definir assertividade da PCR-RFLP na identificação de culturas de agentes
causadores de micoses sistêmicas.
c) Relatar a co-positividade e co-negatividade da PCR e a cultura para
fungos na detecção e identificação de fungos em amostras biológicas de
pacientes com suspeita de micose sistêmica.
d) Expor as características epidemiológicas dos pacientes da casuística
acometidos por micoses sistêmicas.
3. MATERIAL E MÉTODO
3.1 Modelo de Estudo
Estudo transversal e descritivo, de validação de ferramenta de diagnóstico,
com o objetivo avaliar a detecção e identificação de fungos causadores de
micoses sistêmicas, utilizando a técnica de PCR/RFLP.
13
Foi realizada a PCR-RFLP (ITS5-NL4, digestão DdeI) das cepas padrão
pertencente ao laboratório de micologia do INPA, em seguida essa PCR-RFLP foi
avaliada na identificação de 90 culturas de fungos causadores de micoses
sistêmicas (em comparação com a identificação convencional) e por fim foi
investigada a acurácia da PCR/RFLP em comparação com a identificação
convencional na deteção e identificação de agentes causadores de micoses
sistêmicas em 120 amostras biológicas de pacientes com suspeita clínica de
micoses sistêmicas. As características epidemiológicas dos pacientes acometidos
por fungemia também foram investigadas.
3.2 Universo do Estudo
3.2.1 Local de Estudo: Este estudo foi realizado na Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado e no Laboratório de Micobacteriologia do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.
3.2.2 Microrganismos de referência e isolados clínicos
Culturas de cepas de referência: Foram incluidas cepas pertencentes a
coleção de fungos da FMT-HVD: Candida albicans FMT170, Candida parapsilosis
FMT72, Candida tropicalis FMT44, Candida glabrata FMT66, Candida krusei
ATCC6258, Candida guilliermondii ATCC6260, Cryptococcus neoformans
FMT1420, Cryptococcus gattii FMT1170, Histoplasma capsulatum FMT1400 e
Aspergillus niger ATCC1015. Estes microorganismos foram identificado pelos
métodos convencionais e confirmados pelo seqüenciamento da região ITS1 do
DNA ribossomal.
Culturas de isolados clínicos: Foram utilizadas noventa culturas de agentes
causadores de infecção sistêmica em pacientes com HIV/AIDS isoladas de
pacientes atendidos na FMT-HVD no período entre Dezembro de 2005 e Janeiro
de 2008 e entre março a agosto de 2012.
14
3.2.3 População do Estudo: Foi constituída de pacientes atendidos na
internação da FMTAM-HVD no período de Setembro a Dezembro de 2012.
3.2.4 Amostragem: Foram investigadas 120 amostras biológicas (sangue total
(7), hemocultura (33), líquor cefalorraquidiano (70) e aspirado de medula óssea
(10). Essas amostras biológicas correspondem a todas as amostras biológicas
pertencentes a pacientes com suspeita de micose sistêmica encaminhadas ao
Laboratório de Micologia da FMT-HVD para pesquisa de micoses invasivas no
período de Setembro a Dezembro/2012.
3.3 Critério de Inclusão dos Pacientes:
Os pacientes inclusos no estudo foram:
a) Os que tiveram solicitação para realização de exames para micoses
sistêmicas (amostras: Sangue, Aspirado Medular e Líquor) submetidas à
gerência de Bacteriologia e Micologia da FMT-HVD,
b) Pacientes que aceitaram participar do estudo assinando o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido.(Anexo D)
c) Pacientes que apresentaram amostras com volume suficiente para
a realização de todos os procedimentos de rotina e do ensaio molecular
experimental;
3.4 Critério de Exclusão dos Pacientes:
15
Os pacientes excluídos do estudo foram:
a) Pacientes com amostras que no decorrer do exame realizado na
Gerência de Bacteriologia e Micologia da FMT-HVD apresentaram crescimento
de outro agente infeccioso que não seja fungos;
b) Pacientes com amostras identificadas inadequadamente para o
estudo ou amostra de outra tipografia que não seja sangue, hemocultura,
aspirado medular ou líquor. Exemplo: soro, plasma, etc.
3.5 Fluxo das Atividades: A Bacteriologia ou a Micologia da FMT-HVD informou
aos proponentes desse projeto quando houve solicitação de exames para
micoses sistêmicas. O proponente do projeto solicitou, por meio do TCLE, o
consentimento do paciente para obtenção da(s) amostras biológicas. Quando
autorizado, os técnicos do laboratório realizavam a coleta da(s) amostra(s) do
paciente para o frasco apropriado, quando a amostra era sangue total, a amostra
era enviada imediatamente ao Laboratório do de Micologia do INPA, para as
demais amostras foi transferido 1 mL da amostra para um microtubo estéril. O
volume do microtudo foi conduzido para os ensaios moleculares previstos no
presente trabalho. A amostras foram investigada pelos métodos moleculares nas
seguintes situações: a) quando, no caso de hemocultura, o sistema automatizado
de cultura indicou crescimento fúngico, ou quando não houve desenvolvimento
microbiano após 30 dias,. O Laboratório de Micologia da FMT-HVD possui um
papel fundamental nesse projeto, esse realizou a identificação fenotípica dos
fungos presentes nas amostras positivas. Por fim, uma análise comparativa entre
os dados dos ensaios convencionais e moleculares foi realizada. A Figura 1 é o
Fluxograma das atividades desenvolvidas no projeto.
16
Figura 1: Fluxograma das atividades desenvolvidas no projeto.
17
3.6 Aspectos Éticos: Para poder realizar a pesquisa e em consonância com a
Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (CNS), que trata sobre as
recomendações Éticas e Legais com pesquisas envolvendo seres humanos, o
plano de pesquisa foi aprovado Comitê de Ética e Pesquisa com Seres Humanos
da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD). Parecer:
CEP 45151.
3.7 Procedimentos
3.7.1 Diagnóstico convencional
A detecção e identificação das espécies patogênicas foi realizada utilizando
a identificação clássica (bioquímica e micromorfológica) como descrito por Lacaz
et. al., 2002. Foi realizado o exame direto do material por microscopia (coloração
em Nakin, azul de lactofenol e KOH 10%) e tentativa de isolamento de fungos da
amostra biológica utilizando Agar Sabouraud e crescimento em meios que
permitem a identificação como CHROMagar, Agar Niger e Mycosel e ensaios
micrormorfológicos incluindo produção de tubo germinativo, microcultivo em meio
aguar-Tween 80, incubação em 42ºC, testes de assimilação de carboidrato e
nitrogênio e fermentação de carboidrato.
3.7.2 Diagnóstico pela PCR e RFLP
Foi realizado como descrito por Santos et al., 2010. Extração do DNA:
Inicialmente foi realizada a extração das amostras utilizando-se o kit de extração
baseado na utilização de membranas ( QIAamp Tissue and Blood, Qiagen,
Hilden, Germany). Reação de PCR: A reação teve um volume final de 25 µL
consistindo de Tampão de PCR ( 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl), 1,5 mM
MgCl2, 200 nM primers ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3) e NL4 (5’-
GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’) descritos por Irobi et al. [7], 50 uM dNTPs,
1U ampli-tag DNA polimerase e 20 ng do DNA fúngico. As amostras foram
levadas a termociclador onde após desnaturação inicial de 94 oC por 5 min, foram
18
realizados 40 ciclos que consistiram de desnaturação do DNA 94oC por 30s,
anelamento a 50oC por 30s e o extensão a 72 oC por 1 min, por fim foi realizada
uma extensão final a 72 oC por 10 min. Eletroforese: Os produtos de PCR foram
analisados por eletroforese em gel de agarose 2% e corados por SYBR® Green.
Será utilizado como marcador de DNA Gene Ruler DNA ladder Mix (SM0331,
MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany). RFLP: Os produtos de PCR foram
digeridos individualmente com 10 U da enzima de restrição Ddel, por 3 horas a
37 oC e submetidos a eletroforese como descrito anteriormente. Perfis de RFLP:
Os tamanhos dos produtos de PCR e os fragmentos de restrição gerados a partir
dos isolados foram comparados com a as sequências de nucleótidos previstas da
região ITS e que está disponível a partir da base de dados GenBank (Tabela 1).
Tabela 1: Tamanho dos produtos de PCR da região ITS e dos fragmentos de
restrição baseados na sequencia de nucleotidios obtidos no GenBank .
3.8 Análise dos Resultados
Os ensaios moleculares foram considerados positivos quando os produtos de
amplificação tiveram o tamanho estimado.
Espécies Tamanho dos produto de PCR
(genbank)
GenBank Tamaho dos Podutos de PCR
Tamanho dos fragmentos digeridos
pela Ddel
C. albicans 1153 bp 440, 360, 241 e 211 bp
1325bp 450, 400, 275 e 200 bp
C. tropicalis 1142 bp 435, 289, 212, 138 e 68 bp
1250bp 425, 350, 275 e 200 bp
C. parapsilosis 1137 bp 567, 284, 212, 68 e 6 bp
1125bp 550, 350 e 275 bp
C. glabrata 1507 bp 806, 370, 211, 76 e 44bp.
900bp 425, 375 e 100 bp
C. krusei 1120 bp 556, 338, 200 e 26
1075bp 550, 375 e 150 bp
C. guilliermondii 1224 bp 419, 359, 235 e 211 bp.
1285bp 535, 450, 200 e 100 bp
C. neoformans 1201 bp 602, 398, 104 e 48 bp
1050bp 550, 400 e 100 bp
C. gattii 1202 bp 603, 266, 48, 48 e 32bp.
1125bp 400, 400 e 325 bp
H. capsulatum 1239 bp 511, 414, 253 e 60 bp
1300bp 475, 425, 300 e 100 bp
A. niger 985 615, 200 e 170bp
950bp 600, 200 e 150 bp
19
Os perfis de PCR-RFLP das culturas de cepas padrão, das culturas de
origem clínica e das amostras biológicas foram analisados quanto ao número e o
peso molecular das bandas de eletroforese obtidas e comparadas com os dados
descritos na Tabela 1.
Os dados dos ensaios convencionais e moleculares foram analisados quanto
à concordância com a finalidade de estabelecer a sensibilidade e especificidade de
cada metodologia. Para tanto foram utilizados quadros 2x2 e foi determinado o
número Kappa de correlação.
4 Resultados
Manuscrito
1. Título: DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS CAUSADORES DE
MICOSES SISTÊMICAS, UTILIZANDO UMA TÉCNICA DE PCR/RFLP.
2. Autores: SOUSA DRT1, SANTOS CSS2, SILVA RM1, CRUZ KS2, MONTE
RL2, SANTOS MC1, SOUZA JVB1,3.
3. Instituições de Origem: 1-Universidade do Estado do Amazonas, 2-
Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, 3-Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia.
4. Título Curto: DIAGNÓSTICO DE MICOSES SISTÊMICAS POR
PCR/RFLP
5. Palavras Chave: Micoses Sistêmicas, PCR/ RFLP, Diagnóstico.
6. João Vicente Braga de Souza
20
Biotecnólogo/Tecnologista Pleno III
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Coordenação de Sociedade, Ambiente e Saúde
Laboratório de Micologia
3643-3055 ou 3643-3056
Av. André Araújo, 2936, Aleixo, CEP 69060-001, Manaus - AM
RESUMO A incidência das micoses sistêmicas está aumentando. Um diagnóstico rápido e adequado é importante, no entanto, os ensaios laboratoriais mais comumente utilizados (cultura e microscopia) são lentos, trabalhosos e onerosos. De uma forma geral, os métodos moleculares tem se apresentado como ferramentas úteis em diagnóstico, atendendo aos requisitos de sensibilidade, especificidade e rapidez. O objetivo do presente estudo foi avaliar a possibilidade de detectar e identificar fungos patogênicos causadores de micose profunda, utilizando a técnica de PCR/RFLP, na rotina laboratorial de uma unidade terciária de saúde no norte do Brasil. Para tanto, foi realizada a PCR-RFLP (ITS5-NL4, digestão DdeI) de cepas padrão pertencentes ao laboratório de micologia do INPA, em seguida essa PCR-RFLP foi avaliada na identificação de 90 culturas de fungos causadores de micoses sistêmicas (em comparação com a identificação convencional) e por fim foi investigada a acurácia da PCR/RFLP em comparação com a identificação convencional na detecção e identificação de agentes causadores de micoses sistêmicas em 120 amostras biológicas de pacientes com suspeita clínica de micoses sistêmicas. As características epidemiológicas dos pacientes acometidos por fungemia também foram investigadas. Quanto aos resultados, os perfis de RFLP obtidos na PCR/RFLP com o DNA das cepas padrão (Candida.albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida kruzei, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum e Aspergillus niger) foram similares aos perfis teoricamente descritos pelo GeneBank. Todos as 90 culturas de fungos causadores de micoses sistêmicas foram identificadas de forma similar pelos métodos convencionais e pela PCR-RFLP. Quanto ao diagnóstico das 120 amostras biológicas a PCR apresentou uma co-positividade de 100% e uma co-negatividade de 89,4% em relação ao diagnóstico convencional e também nessa situação a RFLP identificou corretamente os microrganismos que foram identificados de forma convencional. Nessa amostragem, 7 pacientes estavam sendo acometido por fungemias e suas características epidemiológicas eram em sua maioria: sexo masculino (4/7), com idade entre 18 e 58 anos residentes da Zona Leste de Manaus (5/7), apresentavam sorologia positiva para HIV (5/7), Carga viral de HVI de <50 a 170.660 cópias/ml e apresentavam CD4 entre 5 e 491 cel/ml. Palavras chave: Micoses Sistêmicas, PCR/ RFLP, Diagnóstico
21
Introdução
Nos últimos anos, a incidência de infecções causadas por fungos invasivos
tem aumentado, tornando-se uma importante causa de morbidade e mortalidade.
Os pacientes, mais acometidos, são os imunocomprometidos, dentre eles, os
com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Aids), transplantados, que fazem
uso de corticóides/quimioterápicos e os presentes em unidades de terapia
intensiva [1,2,3,4]. Entre as micoses sistêmicas mais comuns destacam-se:
candidose, aspergilose, criptococose e histoplasmose [5].
O diagnóstico precoce e o tratamento dessas micoses sistêmicas são
importantes, devido à morbi-mortalidade dessas infecções e a possibilidade de
dispersão hematológica para órgãos mais profundos. Ensaios laboratoriais para
detecção dessas infecções necessitam ser eficazes para determinação do
número dessas infecções em nosso meio, para melhoria do tratamento e
prognóstico dos pacientes [8].
As técnicas de exame microscópico direto em material biológico são
amplamente utilizadas para detecção rápida de fungos, fornecendo a avaliação e
informações imediatas sobre os microrganismos. No entanto, essas técnicas
apresentam problemas devido aos baixos limites de detecção (necessidade de
um número superior a 1x104 células/ml), dificuldade de interpretação,
sensibilidade baixa e o valor diagnóstico variável [9,10,11]. O exame micológico
envolvendo o cultivo é um recurso de amplificação biológica ainda muito utilizada
nas rotinas laboratoriais, no entanto, são na verdade, achados que muitas vezes
antecedem quase que imediatamente a morte do paciente, tornando o tratamento
empírico ainda muito importante nos casos de micoses sistêmicas. Os métodos
convencionais que usualmente utilizados em rotina são os exames de
microscopia direta, cultura e imunológicos [2,12].
22
A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) está sendo cada vez
mais aplicada em rotina para detecção de genes humanos e de microrganismos
patogênicos. De uma forma geral, os métodos moleculares são úteis no
diagnóstico, atendendo aos requisitos de sensibilidade, especificidade e rapidez
[13,14].
Modernas técnicas de PCR, tais como, PCR-multiplex e PCR-multiplex em
tempo real, têm sido investigadas e até mesmo comercializadas para a detecção
e identificação de fungos patogênicos. Entretanto, estes métodos possuem
algumas deficiências, tais como: a) A técnica de PCR-multiplex é limitada para a
identificação de poucas espécies fúngicas por reação e apresenta problemas de
especificidade para detecção fúngica em amostras biológicas e b) O PCR-
multiplex em tempo real não é um método bem disseminado porque necessita do
termociclador de tempo real, um aparelho menos difundido que o termociclador
convencional [5,15,16].
Em um estudo na Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado,
Santos et.al. [5] demonstraram a detecção e identificação de vários fungos
causadores de micose sistêmica utilizando uma única técnica de PCR/RFLP.
Esses concluíram que os primers NL4 e ITS5 e a enzima de restrição DdeI
tiveram melhor desempenho na identificação de fungos causadores de
fungemias. No entanto, esse estudo necessitava ser ampliado, especificamente,
utilizando essa metodologia na rotina de uma instituição que tenha pacientes
acometidos por micoses sistêmicas.
A Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado é
considerada centro de referência nacional e mundial para o tratamento de
enfermidades tropicais. Suas enfermarias, em maioria ocupadas por pacientes
com HIV/Aids refletem a importância de investimentos na área de diagnóstico
para doenças oportunistas.
O objetivo do presente estudo foi avaliar a possibilidade de detectar e
identificar fungos patogênicos causadores de micose sistêmica, utilizando a
23
técnica de PCR/RFLP. Especificamente pretendeu-se investigar: a) Quais os
perfis de RFLP obtidos com a realização da técnica PCR-RFLP com as cepas
padrão?; b) Qual a assertividade da PCR-RFLP na identificação de culturas de
agentes causadores de micoses sistêmicas?; c) Qual a co-positividade e co-
negatividade da PCR e a cultura para fungos na detecção e identificação de
fungos em amostras biológicas de pacientes com suspeita de micose sistêmica?;
d) Quais as características epidemiológicas dos pacientes da casuística
acometidos por micoses sistêmicas?
Material e Métodos
Fluxo das atividades
Foi realizada a PCR-RFLP (ITS5-NL4, digestão DdeI) das cepas padrão
pertencente ao laboratório de micologia do INPA, em seguida essa PCR-RFLP foi
avaliada na identificação de 90 culturas de fungos causadores de micoses
sistêmicas (em comparação com a identificação convencional) e por fim foi
investigada a acurácia da PCR/RFLP em comparação com a identificação
convencional na deteção e identificação de agentes causadores de micoses
sistêmicas em 120 amostras biológicas de pacientes com suspeita clínica de
micoses sistêmicas. As características epidemiológicas dos pacientes acometidos
por fungemia também foram investigadas.
Microrganismos de referência e isolados clínicos
Culturas de cepas de referência: Foram incluidas cepas pertencentes a
coleção de fungos da FMT-HVD: Candida albicans FMT170, Candida parapsilosis
FMT72, Candida tropicalis FMT44, Candida glabrata FMT66, Candida krusei
ATCC6258, Candida guilliermondii ATCC6260, Cryptococcus neoformans
FMT1420, Cryptococcus gattii FMT1170, Histoplasma capsulatum FMT1400 e
Aspergillus niger ATCC1015. Estes microorganismos foram identificado pelos
métodos convencionais e confirmados pelo seqüenciamento da região ITS1 do
DNA ribossomal.
24
Culturas de isolados clínicos: Foram utilizadas noventa culturas de agentes
causadores de infecção sistêmica em pacientes com HIV/AIDS isoladas de
pacientes atendidos na FMT-HVD no período entre Dezembro de 2005 e Janeiro
de 2008 e entre março a agosto de 2012.
Amostras biológicas e informações dos sujeitos da pesquisa
Amostras biológicas: Foram investigadas 120 amostras biológicas (sangue
total (7), hemocultura (33), líquor (70) e aspirado de medula óssea (10). Essas
amostras biológicas correspondem a todas as amostras biológicas pertencentes
a pacientes com suspeita de micose sistêmica encaminhadas ao Laboratório de
Micologia da FMT-HVD para pesquisa de micoses invasivas no período de
Setembro a Dezembro/2012.
Informações dos sujeitos da pesquisa: sexo , idade, local de moradia,
espécime clínico investigado, sorologia para HIV, valor de carga viral do HIV e
CD4 celulas/mm3 foram informações obtidas das solicitações de exame e do
sistema de informatização hospitalar IDoctor, utilizado na FMT-HVD.
Diagnóstico convencional
A detecção e identificação das espécies patogênicas foi realizada utilizando
a identificação clássica (bioquímica e micromorfológica) como descrito por Lacaz
et. al., 2002. Foi realizado o exame direto do material por microscopia (coloração
em Nakin, azul de lactofenol e KOH 10%) e tentativa de isolamento de fungos da
amostra biológica utilizando Agar Sabouraud e crescimento em meios que
permitem a identificação como CHROMagar, Agar Niger e Mycosel e ensaios
micrormorfológicos incluindo produção de tubo germinativo, microcultivo em meio
aguar-Tween 80, incubação em 42ºC, testes de assimilação de carboidrato e
nitrogênio e fermentação de carboidrato.
Diagnóstico pela PCR e RFLP
25
Foi realizado como descrito por Santos et al., 2010. Extração do DNA:
Inicialmente foi realizada a extração das amostras utilizando-se o kit de extração
baseado na utilização de membranas ( QIAamp Tissue and Blood, Qiagen,
Hilden, Germany). Reação de PCR: A reação teve um volume final de 25 µL
consistindo de Tampão de PCR ( 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl), 1,5 mM
MgCl2, 200 nM primers ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3) e NL4 (5’-
GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’) descritos por Irobi et al. [7], 50 uM dNTPs,
1U ampli-tag DNA polimerase e 20 ng do DNA fúngico. As amostras foram
levadas a termociclador onde após desnaturação inicial de 94 oC por 5 min, foram
realizados 40 ciclos que consistiram de desnaturação do DNA 94oC por 30s,
anelamento a 50oC por 30s e o extensão a 72 oC por 1 min, por fim foi realizada
uma extensão final a 72 oC por 10 min. Eletroforese: Os produtos de PCR foram
analisados por eletroforese em gel de agarose 2% e corados por SYBR® Green.
Será utilizado como marcador de DNA Gene Ruler DNA ladder Mix (SM0331,
MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany). RFLP: Os produtos de PCR foram
digeridos individualmente com 10 U da enzima de restrição Ddel, por 3 horas a
37 oC e submetidos a eletroforese como descrito anteriormente. Perfis de RFLP:
Os tamanhos dos produtos de PCR e os fragmentos de restrição gerados a partir
dos isolados foram comparados com a as sequências de nucleótidos previstas da
região ITS e que está disponível a partir da base de dados GenBank (Tabela 2).
26
Tabela 2: Tamanho dos produtos de PCR da região ITS e dos fragmentos de
restrição baseados na sequencia de nucleotidios obtidos no GenBank .
Análise dos resultados
Os perfis de PCR-RFLP das culturas de cepas padrão, das culturas de
origem clínica e das amostras biológicas foram analisados quanto ao número e o
peso molecular das bandas de eletroforese obtidas e comparadas com os dados
descritos na Tabela 2.
Os dados de diagnóstico da cultura e da PCR foram analisados quanto à
concordância com a finalidade de estabelecer a sensibilidade e especificidade de
cada metodologia. Para tanto foram utilizadas tabelas 2x2 e foi determinado o
número Kappa de correlação.
Resultados
A Figura 2(A) apresenta os produtos de PCR, obtidos utilizando o DNA
extraído das culturas das cepas padrão. Produtos de PCR de aproximadamente
1100 pb foram obtidos para maioria das linhagens investigadas. A reação
Espécies Tamanho dos produto de PCR
(genbank)
GenBank Tamaho dos Podutos de PCR
Tamanho dos fragmentos digeridos
pela Ddel
C. albicans 1153 bp 440, 360, 241 e 211 bp
1325bp 450, 400, 275 e 200 bp
C. tropicalis 1142 bp 435, 289, 212, 138 e 68 bp
1250bp 425, 350, 275 e 200 bp
C. parapsilosis 1137 bp 567, 284, 212, 68 e 6 bp
1125bp 550, 350 e 275 bp
C. glabrata 1507 bp 806, 370, 211, 76 e 44bp.
900bp 425, 375 e 100 bp
C. krusei 1120 bp 556, 338, 200 e 26
1075bp 550, 375 e 150 bp
C. guilliermondii 1224 bp 419, 359, 235 e 211 bp.
1285bp 535, 450, 200 e 100 bp
C. neoformans 1201 bp 602, 398, 104 e 48 bp
1050bp 550, 400 e 100 bp
C. gattii 1202 bp 603, 266, 48, 48 e 32bp.
1125bp 400, 400 e 325 bp
H. capsulatum 1239 bp 511, 414, 253 e 60 bp
1300bp 475, 425, 300 e 100 bp
B. niger 985 615, 200 e 170bp
950bp 600, 200 e 150 bp
27
resultou em produtos de 900 e 950 pb para C. glabrata e A. niger,
respectivamente.
Os produtos de PCR foram tratados com a restrição da enzima Ddel para
investigação dos perfis de RFLP. A Figura 2(B) mostra a eletroforese dos
padrões obtidos após a digestão dos produtos de PCR. Os perfis de RFLP
obtidos foram similares aos previstos teoricamente (Tabela 1).
A)
B)
Figura 2-Produtos de PCR (A) e de Restrição (B) obtidos a partir dos isolados de
referência. Sendo C. albicans (CA), C. parapsilosis (CP), C. tropicalis (CT), C.
glabrata (CG), C. krusei (CK), C. guilliermondii (CGu) C. gattii (CGa), C.
neoformans (CN), H. capsulatum (HC) e A. niger (An).
A Figura 3 apresenta os perfis de RFLP (Primers ITS5-NL4, enzima de
restrição DdeI) obtidos a partir de DNA extraído de 30 culturas de fungos isolados
de micoses sistêmicas.. Perfil 1, 2, 4, 5, 6 e 7 eram de culturas de C. albicans
isoladas de hemoculturas, perfil de 13 a 23 eram de culturas de C. neoformans
isoladas de Líquor cefaloraquidiano, perfil 3 e 8 eram de culturas de C. glabrata
perfil 9 e 10 eram culturas de C. krusei, perfil 11 e 12 eram culturas de C.
tropicalis, perfil de 24 a 26 eram de C. gattii e perfil de 27 a 30 eram de culturas
de H. capsulatum. Além dessas 30 culturas, outras 60 foram avaliadas e
28
observou-se que a PCR-RFLP e os métodos convencionais identificaram as
culturas de forma idêntica. As identificações convencionais levaram entre 5 a 30
dias com média de 7 dias enquanto que a PCR-RFLP demorou apenas 2 dias.
Figura 3- Perfis de RFLP (Primers ITS5-NL4, enzima de restrição DdeI) obtidos a
partir de DNA extraído de culturas de fungos isolados de micoses sistêmicas.
Quando investigada a acurácia da PCR (ITS5-NL4) (frente aos métodos
convencionais) em diagnosticar 120 amostras biológicas de pacientes com
suspeita de estarem sendo acometidos por micoses sistêmicas, foi observado
que a PCR apresentou uma co-positividade de 100% e uma co-negatividade de
89,4% (Tabela 3).
Tabela 3- Co-positividade e Co-negatividade entre a PCR (ITS5-NL4) e o
métodos convencionais na detecção dos fungos nas amostras biológicas.
Cultura
Positiva Negativa TOTAL
PCR
Positivo 7 12 17
Negativo 0 101 103
TOTAL 7 113 120
29
Quando os produtos da PCR (ITS-NL5) foram digeridos pela enzima de
restrição DdeI foi possível identificar os microrganismos detectados. As 7
amostras que foram consideradas positivas pelos métodos convencionais e pela
PCR eram: C. neoformans (n=3) em amostras de líquor, C. gattii (n=1) em
amostra de líquor, H. capsulatum (n=1) em amostra de aspirado medular e C.
albicans (n= 2) em Hemocultura. Da mesma forma que com as culturas, os
ensaios convencionais e a RFLP/PCR apresentaram identificações similares.
Nas 12 amostras biológicas em que a PCR foi positiva e os métodos
convencionais foram negativos, a digestão dos produtos de amplificação permitiu
a identificação de C. neoformans em todas amostras, sendo que essas últimas
todas eram líquor cefaloraquidiano.
Quanto às características epidemiológicas dos pacientes que participaram
do estudo, a maioria era do sexo masculino a (72%), faixa etária entre 29 e 39
anos (32% e mediana de 32 anos) e residiam na Zona Leste da cidade de
Manaus (35%), possuíam sorologia positiva para HIV (78,4%), tinham Carga Viral
< 50 cel/ml (27,6%) e CD4 < 100 cel/ml (25%).
Quanto aos pacientes que obtiveram positividade na cultura e na PCR, em
sua maioria, eram do sexo masculino (4/7), com idades entre 18 e 58 anos
residentes da Zona Leste de Manaus (5/7), apresentava sorologia positiva para
HIV (5/7), Carga viral de HVI de <50 a 170.660 cópias/ml e apresentavam CD4
entre 5 e 491 cel/ml.
Quanto aos pacientes que obtiveram negatividade na cultura e positividade
na PCR, em sua maioria eram do sexo masculino (7/12) com idade entre 38 e 63
anos, residentes da Zona Leste de Manaus (10/12), apresentavam sorologia
positiva para HIV (12/12), com Carga viral de HVI de <50 a 43.601 cópias/ml e
CD4 entre 15 e 384 cel/ml e todos estavam fazendo culturas de controle de
tratamento de Criptococose.
30
Discussão
O presente trabalho investigou a possibilidade de detectar e identificar
fungos patogênicos causadores de micoses sistêmicas utilizando a técnica de
PCR/RFLP. Esse trabalho: a) é um dos primeiros que a demonstrar a detecção e
identificação de fungos em amostras biológicas por PCR/RFLP, a maioria dos
trabalhos previamente publicados limitaram-se a identificação de cepas padrão e
de culturas de isolados clínicos; b) demonstrou o potencial do produto de PCR
avaliado em permitir a discriminação por RFLP dos mais importantes fungos
causadores de micose sistêmica e c) demonstrou que mesmo sendo fragmento
de DNA grande (aproximadamente 1100pb) a PCR investigada apresentou uma
sensibilidade adequada para a detecção de fungos nas amostras biológicas
[5,17].
A PCR/RFLP da região estudada no presente trabalho permitiu a
identificação da maioria dos agentes fúngicos patogênicos, permitiu o
desenvolvimento de uma coleção de perfis de RFLP, apresenta utilidade para
laboratórios que não possuem termocicladores de tempo real e pode ser utilizada
como metodologia comprobatória nas validações da PCR em tempo real, isso
porque a PCR/RFLP é um ensaio simples, exige apenas equipamentos padrões
de biologia molecular e fornece resultados adequados para o estudo de diversas
espécies simultaneamente [5,18].
Quanto aos perfis de RFLP obtidos com as cepas padrão investigadas
nesse trabalho (Figura 1), estes foram compatíveis com os resultados previstos
teoricamente e encontrados na prática por Santos et. al. [5] e por Irobi et. al. [17].
Mirhendi [19] e Mirhendi [20] Deve-se ressaltar que o presente trabalho foi o
primeiro a incluir a espécie A. niger na lista de microrganismos identificados por
essa reação de PCR/RFLP (ITS5-NL4, digestão por DdeI).
Discutindo sobre a identificação convencional dos fungos causadores de
micoses invasivas deve-se citar que a identificação de Candida spp. utiliza testes
enzimáticos, de assimilação e fermentação, ela é onerosa quando realizada com
31
kit comerciais e lenta quando realizada sem esses. A identificação de
Criptococcus spp. utiliza um meio de cultura denominado CGB, no entanto, os
resultados desse ensaio demoram em média 3 dias e podem apresentar-se
incorretos. A identificação de H. capsulatum é sem dúvida a mais demorada, sua
cultura demora em média 25 dias para desenvolver-se e a sua identificação é
micromorfológica, sendo que, o ensaio confirmatório de identificação (ensaio de
pleomorfismo) pode demorar mais 25 dias [2,12]. Portanto, uma das
possibilidades de utilização em rotina da PCR-RFLP apresentada no presente
trabalho é a sua utilização identificação das colônias obtidas de amostras
clínicas. Nesse sentido, a PCR-RFLP é mais versátil que a PCR em tempo real
devido à possibilidade da criação de uma ampla biblioteca de perfis de RFLP e
apresenta-se mais acessível que os ensaios de sequenciamento. A identificação,
no presente trabalho, de 90 culturas de fungos isolados de amostras clínicas
apresentando resultados similares aos resultados dos métodos convencionais
demonstra essa afirmação.
Quanto à utilização da PCR (ITS5-NL4) para detecção de agentes
causadores de micoses invasivas. Os dados apresentados no presente trabalho
permitem afirmar que esse ensaio possui uma sensibilidade adequada e que
pode ser utilizada com materiais biológicos de diferentes origens (sangue,
hemocultura, liquor e aspirado medular).
Ainda discutindo sobre os resultados da PCR para detecção de fungos em
amostras biológicas, os “falsos positivos” obtidos com a PCR, esses podem ser
explicados devido à presença de células inviáveis, ou em número muito pequeno
ou apenas de DNA no líquor cefaloraquidiano, sendo essa situação atribuída ao
tratamento da criptococose. Mais estudos devem ser realizados para entender
essa situação, sendo que os dados da PCR devem ser interpretados com
atenção com esse tipo de amostra.
Quanto às informações epidemiológicas dos pacientes, o seu número foi
pequeno e, portanto um estudo analítico não pode ser realizado. De uma forma
32
geral, pode-se afirmar que, esses possuem características semelhantes a
casuística de outros estudos realizados com a mesma população.
Agradecimentos
Agradecemos ao CNPq, CAPES e FAPEAM pelo financiamento desta pesquisa.
Conflito de Interesse
Os autores não têm conflito de interesse a declarar.
Referências
1. Colombo AL, Nucci M, Park BJ et al. Epidemiology of candidemia in Brazil:
a nationwide sentinel surveillance of candidemia in eleven medical centers.
J Clin Microbiol 2006; 44:2816-23.
2. Kobayashi GS; Murray PR; Pfaller MA; Rosenthal KS. Microbiologia
Médica. Guanabara Koogan. 4ª Ed. 2004: 626-634p.
3. Puebla LEJ. Fungal Infections in Immunosuppressed Patients. Intech. 1ª
Ed. 2012: 6p.
4. Ramos-e-Silva M; Cíntia Maria Oliveira Lima CMO; Regina Casz
Schechtman RC; Trope BM; Carneiro S. Systemic mycoses in
immunodepressed patients (AIDS). Clinics in Dermatology. 2012. 30: 616–
627p.
5. Santos MS; Souza ES; Junior RMS; Talhari S; Souza JVB. Identification of
fungemia agents using the polymerase chain reaction and restriction
fragment length polymorphism analysis. Braz J Med Bio Res, 2010. Vol
43(8): 712-716.
33
6. Ostrosky-Zeichner L. Invasive Mycoses: Diagnostic Challenges. The
American Journal of Medicine. 2012, Vol.125; S14–S24p
7. Ruhnke M, Böhme A, Buchheidt D, Cornely O, Donhuijsen K, Einsele H,
Enzensberger R, Hebart H, Heussel CP, Horger M, Hof H, Karthaus M,
Krüger W, Maschmeyer G, Penack O, Ritter J, Schwartz S. Diagnosis of
invasive fungal infections in hematology and oncology—guidelines from the
Infectious Diseases Working Party in Haematology and Oncology of the
German Society for Haematology and Oncology (AGIHO). Ann Oncol,
2012. Vol 23 (4): 823-833p.
8. França JC; Ribeiro CEL; Queiroz-Telles F. Candidemia in a Brazilian
tertiary care hospital: incidence, frequency of different species, risk
factors and antifungal susceptibility. Rev Soc Bras Med Trop 2008; 41:23-
28.
9. Lease ED; Alexander BD. Fungal Diagnostics in Pneumonia. Semin Respir
Crit Care Med. 2011; 32(6): 663-672p.
10. Dornbusch HJ; Groll A; Walsh TJ. Diagnosis of invasive fungal infections
in immunocompromised children. Clinical Microbiology and Infection. 2010.
Vol 16, 1328–1334.
11. Bharathi MJ; Ramakrishnan R; Meenakshi R; Mittal S; Shivakumar C;
Srinivasan M. Microbiological diagnosis of infective keratitis: comparative
evaluation of direct microscopy and culture results. Br J Ophthalmol, 2006.
Vol 90: 1271–1276.
12. Lacaz CS, Porto EM, Costa JE, Heins-Vaccari EM, Melo NT. Tratado de
Micologia Médica. 9ª ed. São Paulo: Sarvier; 2002.
34
13. Shin JH; Ranken R; Sefers SE; Lovari R; Quinn CD; Meng S; Carolan HE;
Toleno D; Li H; Lee JN; Stratton CW; Massire C; Tang YW. Detection,
Identification, and Distribution of Fungi in Bronchoalveolar Lavage
Specimens by Use of Multilocus PCR Coupled with Electrospray
Ionization/Mass Spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2013. vol. 51; no. 1 136-
14.
14. Johnson G; Nolan T; Bustin SA. Real-Time Quantitative PCR, Pathogen
Detection and MIQE. Methods in Molecular Biology. Vol 943, 2013, 1-16p.
15. Kasai M, Francesconi A, Petraitiene R, Petraitis V, Kelaher AM, Kim HS.
Use of quantitative real-time PCR to study the kinetics of extracellular DNA
released from Candida albicans, with implications for diagnosis of invasive
Candidiasis. J Clin Microbiol 2006; Vol 44: 143-150p.
16. Sampaio P, Gusmao L, Correia A, Alves C, Rodrigues AG, Pina-Vaz C.
New microsatellite multiplex PCR for Candida albicans strain typing
reveals microevolutionary changes. J Clin Microbiol 2005; Vol 43: 3869-
3876p.
17. Irobi J, Schoofs A, Goossens H. Genetic identification of Candida species
in HIV-positive patients using the polymerase chain reaction and restriction
fragment length polymorphism analysis of its DNA. Mol Cell Probes 1999;
Vol. 13: 401-406.
18. Ming L, But PP, Shaw P. Molecular Identification of Traditional Medicinal
Materials. Molecular Pharmacognosy. 2013, 45-66p.
19. Mirhendi SH, Kordbacheh P, Kazemi B, Samiei S, Pezeshki M,
Khorramizadeh MR. A PCR-RFLP Method to Identification of the Important
Opportunistic Fungi: Candida Species, Cryptococcus neoformans,
Aspergillus famigatus and Fusarium solani. Iranian J. Publ. Health, 2001.
Vol. 30, Nos. 3-4: 103-106.
35
20. Mirhendi SH, Makimura K, Mohamadreza K, Hideyo Y. A One-Enzima
PCR-RFLP Assay for indentification of six Medically important clinical
Candida species. Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 47, 225-229, 2006.
5 Conclusão
Os perfis de RFLP obtidos foram compatíveis com os resultados previstos
teoricamente e encontrados na prática outros autores.
A identificação, no presente trabalho, de 90 culturas de fungos isolados de
amostras clínicas apresentando resultados similares aos resultados dos
métodos convencionais demonstra a assertividade da técnica de PCR-RFLP
na identificação de culturas de agentes causadores de micoses sistêmicas.
Os dados apresentados no presente trabalho permitem afirmar que esse
ensaio possui um sensibilidade adequada e que pode ser utilizada com
materiais biológicos de diferentes origens (sangue, hemocultura, liquor e
aspirado medular).
Quanto às informações epidemiológicas dos pacientes, o seu número foi
pequeno e, portanto um estudo analítico não pode ser realizado. De uma forma
geral, pode-se afirmar que, esses possuem características semelhantes a
casuística de outros estudos realizados com a mesma população.
6 REFERÊNCIAS
1. Colombo AL, Nucci M, Park BJ et al. Epidemiology of candidemia in
Brazil: a nationwide sentinel surveillance of candidemia in eleven
medical centers. J Clin Microbiol 2006; 44:2816-23.
2. Kobayashi GS; Murray PR; Pfaller MA; Rosenthal KS. Microbiologia
Médica. Guanabara Koogan. 4ª Ed. 2004: 626-634p.
36
3. Puebla LEJ. Fungal Infections in Immunosuppressed Patients. Intech.
1ª Ed. 2012: 6p.
4. Ramos-e-Silva M; Cíntia Maria Oliveira Lima CMO; Regina Casz
Schechtman RC; Trope BM; Carneiro S. Systemic mycoses in
immunodepressed patients (AIDS). Clinics in Dermatology. 2012. 30:
616– 627p.
5. Santos MS; Souza ES; Junior RMS; Talhari S; Souza JVB. Identification
of fungemia agents using the polymerase chain reaction and
restriction fragment length polymorphism analysis. Braz J Med Bio
Res, 2010. Vol 43(8): 712-716.
6. Teresa R; O'Meara; J. Alspaugh JA. The Cryptococcus neoformans
Capsule: a Sword and a Shield. Clin. Microbiol. Rev. 2012, 25(3):387.
7. Negroni R. Criptococcosis. Clinics in Dermatology. 2012, 30, 599– 609.
8. Gutierrez ME; Canton A; Sosa N; Puga E; Talavera L. Disseminated
histoplasmosis in patients with AIDS in Panama: a review of 104
cases. Clin Infect Dis, 2005. Vol 40: 1199-1202.
9. Bitterman R; Oren I; Geffen Y; Sprecher H; Schwartz E; Ami Neuberger A.
Prolonged Fever and Splinter Hemorrhages in an Immunocompetent
Traveler With Disseminated Histoplasmosis. Journal of Travel Medicine
2013; Volume 20 (Issue 1): 57 – 59.
10. Sardi JCO; Scorzoni L; Bernardi T; Fusco-Almeida AM; Mendes MJS.
Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm
formation, natural antifungal products and new therapeutic options.
Journal of Medical Microbiology. 2013, 62, 10–24.
37
11. França JC; Ribeiro CEL; Queiroz-Telles F. Candidemia in a Brazilian
tertiary care hospital: incidence, frequency of different species,
risk factors and antifungal susceptibility. Rev Soc Bras Med Trop
2008; 41:23-28.
12. Springer J; Einsele H; Loeffler J. Molecular techniques em the
diagnosis of deep and systemic mycosis. Clinics in Dermatology. 2012,
30, 651-656.
13. Shin JH; Ranken R; Sefers SE; Lovari R; Quinn CD; Meng S; Carolan HE;
Toleno D; Li H; Lee JN; Stratton CW; Massire C; Tang YW. Detection,
Identification, and Distribution of Fungi in Bronchoalveolar Lavage
Specimens by Use of Multilocus PCR Coupled with Electrospray
Ionization/Mass Spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2013. vol. 51; no. 1
136-14.
14. Johnson G; Nolan T; Bustin SA. Real-Time Quantitative PCR, Pathogen
Detection and MIQE. Methods in Molecular Biology. Vol 943, 2013, 1-16p.
15. Souza LS; Feitoza PVS; Araújo JR; Andrade RV; Ferreira LCL. Causes of
death among patients with acquired immunodeficiency syndrome
autopsied at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas. Rev.
Soc. Bras. Med.Trop, 2008. Vol. 41(3):247-251.
16. Scherer LC, Rosa DS, Ruffino-Netto A, Rossetti MRL, Vater C, Klatser P,
Kritski AL. Cost-effectiveness analysis of PCR for the rapid diagnosis
of pulmonary tuberculosis. BCM Infectious diseases, 2009. Vol 9:216.
17. Cleeff M; Kivihya-Ndugga L; Githui W; Ng'ang'a L; Kibuga D; Odhiambo J;
Klatser P. Cost-effectiveness of polymerase chain reaction versus
38
Ziehl-Neelsen smear microscopy for diagnosis of tuberculosis in
Kenya. Int J Tuberc Lung Dis, 2005. Vol 9(8): 877-83.)
18. Bovers M; Hagen F; Boekhout T. Diversity of the Cryptocuccus
neoformans and Cryptococcus gattii species complex. Rev. Iberoam.
Micol, 2008. Vol 25(1): S4-S12.
19. Sidrim JJC; Costa AKF; Cordeiro RA; Brilhante RSN; Moura FEA; Castelo-
Branco DSCM; Araujo MP; Rocha MFG. Molecular methods for the
diagnosis and characterization of Cryptococcus: a review. Can. J.
Microbiol, 2010. Vol 56: 445-458.
20. Pedroso RS; Candido RC. Diagnóstico Laboratorial da Criptococose.
Newslab, 2006. Edição 77.
21. Monteiro DU; Brum TF; Noal CB; Righi RA; Santos ER; Oliveira LTO; Rui
MLL. Prevalência de Candida e Cryptococcus em hemoculturas
oriundas de pacientes do Hospital Universitário de Santa Maria, RS
(HUSM) no ano de 2006. Saúde (Santa Maria), Ahead of Print, 2011. Vol:
37(2):81-88
22. Paschoal RC; Hirata MH; Hirata RC; Melhem MS; Dias ALT Paula CR.
Neurocryptococcosis: diagnosis by PCR method. Ver. Inst. Med. Trp.
São Paulo, 2004. Vol 46(4): 203-207.
23. Ferreira MS; Borges AS. Histoplasmose. Rev. Socied. Bras. Med. Trop,
2009. Vol 42(2): 192-198.
39
24. Threlkeld ZD; Broughton R; Khan GQ; Berger JR. Isolated Histoplasma
capsulatum Meningoencephalitis in an Immunocompetent Child. J
Child Neurol. 2012 vol. 27 no. 4 532-535.
25. Logrena SM; Kirschb EJ; Maroc VP; Morrisseya AB; Msuyac LJ; Kinaboc
GD; Sagandae W; Diefenthalc HC; Ramadhanic HO; Wheatb LJ; Crump
JA. Histoplasmosis among hospitalized febrile patients in northern
Tanzania. Elsevier. Volume 106, 2012, 504–507 p.
26. Sardi JCO; Scorzoni L; Bernardi T; Fusco-Almeida AM; Giannini MLSM.
Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm
formation, natural antifungal products and new therapeutic options.
Journal of Medical Microbiology. 2013, Vol 62, 10–24p.
27. François LM; Duncan W; Bernhard H. Candida albicans pathogenicity
mechanisms. Landes Bioscience. 2013, Vol 4:2, 1–10p.
28. Fidel PL Jr; Vazquez JÁ; Sobel JD. Candida glabrata: review of
epidemiology, pathogenesis, and clinical disease with comparison to
C. albicans. Clin Microbiol Rev. 1999 Jan;12(1):80-96.
29. Girmenia C, Pizzarelli G, Cristini F, Barchiesi F, Spreghini E, Scalise G,
Martino P. Candida guilliermondii fungemia in patients with
hematologic malignancies. J Clin Microbiol. 2006 Jul;44(7):2458-64.
30. Colombo AL; Guimarães T. Epidemiologia das infeções hematogênicas
por Candida spp. Ver. Soc. Bras. Med. Trop, 2003. Vol 36(5): 599-607.
31. Pfaller MA; Diekema DJ. Epidemiology of Invasive Candidiasis. Clin
Microbiol Reviews 2007; 20:133-163.
40
32. Silva S; Negri M; Henriques M; Oliveira R; Williams DW; Azeredo J.
Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis:
biology, epidemiology, pathogeni city and antifungal resistance.
Microbiol Ver, 2012. Vol. 36: 288–305.
33. Van de Veerdonk FL, Kullberg BJ, Netea MG. Pathogenesis of invasive
candidiasis. Curr Opin Crit Care. 2010 Oct;16(5):453-9.
34. Lease ED; Alexander BD. Fungal Diagnostics in Pneumonia. Semin
Respir Crit Care Med. 2011; 32(6): 663-672p.
35. Dornbusch HJ; Groll A; Walsh TJ. Diagnosis of invasive fungal
infections in immunocompromised children. Clinical Microbiology and
Infection. 2010. Vol 16, 1328–1334.
36. Bharathi MJ; Ramakrishnan R; Meenakshi R; Mittal S; Shivakumar C;
Srinivasan M. Microbiological diagnosis of infective keratitis:
comparative evaluation of direct microscopy and culture results. Br J
Ophthalmol, 2006. Vol 90: 1271–1276.
37. Lacaz CS, Porto EM, Costa JE, Heins-Vaccari EM, Melo NT. Tratado de
Micologia Médica. 9ª ed. São Paulo: Sarvier; 2002.
38. Hopfer RL. Use os molecular biological techiniques in the diagnostic
laboratory for detecting and differentiating fungi. Arch. Med. Res,
1995. Vol 26 (3): 287-92.
39. Watson JD; Crick F. Molecular structure of Nucleic Acids: A Structure
for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature, 1953. Vol 171, 737-738p.
40. Mielle A Filho; Remualdo V. Biologia molecular aplicada ao diagnóstico
de doenças infecciosas. Prát. Hosp. (infect), 2007. Ano IX. Nº 53: 33-35.
41
41. Luo G; Mitchell TG. Rapid identification of pathogenic fungi directly
from cultures by using multiplex PCR. J. Clin. Microbiol, 2002. Vol
40(8): 2860-2865.
42
7. ANEXOS
43
Anexo A
Equipe Científica de Apoio ao Desenvolvimento do Plano de Dissertação
Nome Titulação Função
Diego Rayan Teixeira de
Sousa
Farmacêutico. Analista Clínico.
Mestrando em Medicina Tropical
Executor
Dr. João Vicente Braga
de Souza
Micologista.
Doutor em Biotecnologia Industrial
Coordenação
Dr. Marcelo Cordeiro dos
Santos
Infectologista.
Doutor em Medicina Tropical
Coordenação
Kátia Santana Cruz Micologista
Mestre
Coordenação
Rossicléia Lins Monte
Microbiologista.
Mestre em Medicina Tropical
Coordenação
Marcel Barros dos Santos Acadêmico de Medicina (UFAM) Colaborador
Roberto Moreira da Silva Doutorando em Medicina Tropical Colaborador
44
Anexo B
TERMO DE CONSENTIMENTO PARA PARTICIPAÇÃO EM PESQUISA (TCLE)
TÍTULO DO ESTUDO: DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS
CAUSADORES DE MICOSES PROFUNDAS E OPORTUNISTAS, UTILIZANDO
A TÉCNICA DE PCR/RFLP EM UMA UNIDADE DE SAÚDE NO NORTE DO
BRASIL
Nome do Voluntário:
________________________________________________________
Introdução:
Você está sendo convidado a participar de um projeto de pesquisa. Os
pesquisadores responsáveis por este estudo são João Vicente Braga de Souza,
Marcelo Cordeiro dos Santos e Diego Rayan Teixeira de Sousa. Este termo de
consentimento irá informá-lo sobre este estudo e ajudá-lo a decidir se gostaria de
participar do mesmo. A SUA PARTICIPAÇÃO NESTE ESTUDO É
VOLUNTÁRIA. Você tem o direito de recusar ou se retirar do estudo a qualquer
momento sem que isto implique em riscos para seu tratamento médico. Se você
concordar em participar do estudo, você deverá assinar este documento e
receber uma cópia do mesmo.
PORQUE ESTE ESTUDO ESTÁ SENDO REALIZADO?
Este estudo está sendo realizado para avaliar um novo tipo de exame para
detecção de fungo. (micoses profundas e oportunistas).
COMO SERÁ SUA PARTICIPAÇÃO NO ESTUDO?
Se você concordar em participar deste estudo, quando o médico solicitar a
pesquisa de fungos no sangue, será feito a rotina tradicional do hospital, o
técnico do laboratório irá colher de 05 – 10 ml do sangue do paciente para
pesquisar fungo no sangue, na hora da coleta será separado 1ml do sangue em
um tubo para a realização do estudo. Você não precisará ser furado duas vezes
para a realização do estudo.
O QUE SERÁ FEITO COM AS AMOSTRAS DE SANGUE?
A sua amostra de sangue será encaminhada para Laboratório da Gerência de
Bacteriologia e será examinada através do método convencional (Hemocultura).
45
O tubo com 1ml de sangue será encaminhado pelo próprio pesquisador para o
laboratório do INPA, onde será processado.
SE MEU TESTE FOR POSITIVO O MEU MÉDICO RECEBERÁ O EXAME ?
Como ainda não temos certeza que este novo método é melhor que o método
tradicional (hemocultura), iremos considerar para diagnóstico da sua doença
somente os resultados do método tradicional. Mas, mesmo assim o resultado
será entregue ao médico para possíveis análises.
QUEM PODERÁ PARTICIPAR E QUEM NÃO PODERÁ PARTICIPAR DESTE
ESTUDO?
Poderão participar deste estudo pessoas de todas as faixas etárias com suspeita
de fungos no sangue.Pacientes menores de 18 anos que aceitarem participar do
estudo, só serão incluídos se os responsáveis concordarem em assinar o TCLE.
Não poderão participar deste estudo, pacientes que não assinarem este
documento (TCLE).
EXISTEM RISCOS AO PARTICIPAR DESTE ESTUDO?
Há risco mínimo na sua participação no estudo. Pode haver leves incômodos
provocados pela coleta de sangue.
QUAIS SÃO OS BENEFÍCIOS?
É possível que você não tenha nenhum benefício direto ao participar deste
estudo, no entanto, se este novo teste for melhor que o convencional ele poderá
substituir o teste antigo e desta forma melhorar o diagnóstico da doença. Neste
caso, este novo método poderá permitir que mais pessoas possam ser
diagnosticadas e tratadas mais rapidamente. No entanto, informaremos o seu
médico do resultado dessa nova metodologia.
HAVERÁ ALGUMA DESPESA PARA PARTICIPAR DESTE ESTUDO?
Você não terá despesas para participar do estudo. O diagnóstico e tratamento de
suas doenças serão gratuitos e subsidiados pelos hospitais.
HAVERÁ ALGUM TIPO DE PAGAMENTO?
A sua participação neste estudo é voluntária, você não receberá nenhum tipo de
pagamento pela sua participação no mesmo.
QUAIS SÃO SUAS ALTERNATIVAS CASO NÃO QUEIRA PARTICIPAR DO
ESTUDO?
46
Caso não queira participar do estudo não haverá nenhum prejuízo, inclusive da
assistência à sua saúde todos seus exames requisitados pelo médico serão
realizados.
HAVERÁ CONFIDENCIALIDADE DE SUAS INFORMAÇÕES?
Todas as suas informações serão mantidas confidenciais. Você terá um
número de registro e seu nome não será usado. Se as descobertas desse estudo
forem publicadas seu nome ou sua identificação não serão divulgados. Sua
identidade permanecerá confidencial. Ao participar deste estudo, serão coletadas
informações pessoais, mas você tem o direito de se recursar-se a responder
às perguntas. Estes dados serão registrados pelos pesquisadores e médicos
que irão arquivá-los. As informações serão guardadas após o término do estudo
por 6 anos como recomenda a legislação do país.
QUAIS SÃO OS SEUS DIREITOS?
A sua participação neste estudo é voluntária. Você tem o direito de recusar ou de
se retirar do estudo a qualquer momento sem prejuízo a assistência à sua saúde
nesta instituição.
AFIRMAÇÕES DO PACIENTE
Fui esclarecido sobre os objetivos da pesquisa, os procedimentos, riscos e
benefíciosSIM....... NÃO .......
Fui esclarecido sobre a liberdade de desistir de participar a qualquer momento,
sem que isso traga prejuízos ao meu atendimento e tratamento. SIM.......NÃO
.......
Fui esclarecido de que não haverá remuneração financeira. SIM.......NÃO ...
QUEM VOCÊ PODERÁ CONTACTAR CASO TENHA DÚVIDA?
Se você tiver alguma dúvida sobre seu direito como voluntário na pesquisa, você
poderá entrar em contato com:
Coordenador do Projeto:Dr. João Vicente Braga de Souza / Tel: (92) 9114-
7815 / e-mail: joã[email protected] / Endereço:
Executor dos testes: Diego Rayan Teixeira de Sousa / Tel: (92) 81192971 /e-
mail: [email protected] / Endereço:Av. Constantino Nery, Parque dos
Ingleses, nº 2525, bloco 10ª aptº 302
47
Coordenador do Comitê deÉtica e Pesquisa da FMT-HVD:Dr. Francisco
Nailson Santos Pinto/ Tel:8121-0591 / e-mail:[email protected]
Comitê de Ética e Pesquisa da FMT-HVD:Endereço :AV. Pedro Teixeira, 25 –
Bairro D. Pedro I /Tel: (92) 2127-3572
TERMO DE CONSENTIMENTO:
Eu recebi uma cópia deste termo de consentimento e sei que uma cópia ficará
guardada no meu arquivo do estudo. Eu entendo que posso deixar o estudo a
qualquer momento que quiser ou que o médico do estudo pode me pedir para
deixar o estudo se ele entender que esta decisão é melhor para os meus
interesses.
Eu entendo que se eu colocar minha impressão digital no espaço abaixo, eu
estou concordando em participar do estudo e a realizar todos os procedimentos
dos mesmos estabelecidos neste documento.
Eu expliquei os objetivos deste estudo para o voluntário. Tenho plena convicção
que ele/ela entendeu os objetivos, riscos e benefícios da sua participação no
estudo.
Local:________________________Data:____________/___________/_____
Impressão dactiloscópica Assinatura do Voluntário Nome do Voluntário -impresso
Assinatura do responsável legal Nome do responsável legal
Assinatura da testemunha
Impressão dactiloscópica
Nome da testemunha
Assinatura do investigador Nome do investigador
48
Anexo C
EXTRAÇÃO DE DNA
1. Adicionar 100mg de vidro em tubi de 2ml;
2. Adicionar 180ul de tampão ATL;
3. Adicionar 100mg de biomassa;
4. Masserar com bastão de vidro estéril de 2-5 minutos com
movimentos contínuos e de giro.
5. Adicionar a proteinase K e incubar overnight a 56°C;
6. Adicionar 200ul de tampão AL e 200ul de etanol P.A.;
7. Pipetar a mistura da 6ª etapa na coluna de extração;
8. Centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto;
9. Colocar a coluna em um novo tubo, adicionar 500ul de tampão
AW1;
10. Centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto;
11. Colocar a coluna em um novo tubo, adicionar 500ul de tampão
AW2;
12. Centrifugar durante 3 minutos a 14000 rpm para secar a membrana
( se o sedimento continuar com etanol, centrifugar por mais 1
minuto a 14000 rpm);
13. Colocar a coluna em um microtubo de microcentrífuga;
14. Adicionar 200ul de tampão AE diretamente na membrana;
15. Incubar em T.A. por 1 minuto e centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm
para eluir. ( Para melhor eluir, adicionar 100ul, centrifugar, adicionar
mais 100ul e centrifugar, para obter uma concentração maior de
DNA);
16. Armazenar a 4°C.
49
Anexo D
Artigo Publicado durante o curso.
50
Anexo E
Resumos Publicados em Congressos
1. SOUSA, D. R. T. ; Souza, J. V. B. ; Freire, A. C. L ; Santos, M. C. .
Identificação de agentes de fungemia através da região ITS, utilizando a técnica
de PCR-RFLP. In: XXI CONGRESSO LATINOAMERICANO DE
MICROBIOLOGIA, 2012, Santos-SP. XXI Congresso Latinoamericano de
Microbiologia, 2012.
2. SOUSA, D. R. T. ; Sousa, D. R. T ; Monte,R,L ; SANTOS, C. S. ; Souza, J. V.
B. Determinação da Freqüência de Hemoculturas Positivas para Fungo na Rotina
da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.. In: XXI Congresso
Latinoamericano de Microbiologia, 2012, Santos-SP. XXI Congresso
Latinoamericano de Microbiologia, 2012.
3. SOUSA, D. R. T. ; Santos, M. C. ; Souza, J. V. B. . Optimization of M13-
fingerprint reaction for the characterization of Candida tropicalis isolates: a useful
tool for monitoring fungemias in neonatal.. In: XLVIII Congresso da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, 2012, Rio de Janeiro-RJ. XLVIII Congresso da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 2012.
4. SOUSA, D. R. T. ; Santos, M. C. ; Souza, J. V. B. . Utilization of PCR-RFLP for
the identification of fungemia agents. In: XLVIII Congresso da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, 2012, Rio de Janeiro-RJ. XLVIII Congresso da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 2012.
5. SOUSA, D. R. T. ; Santos, M. C. ; Souza, J. V. B. . Utilization of PCR-RFLP for
the identification of fungemia agents. In: XLVIII Congresso da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, 2012, Rio de Janeiro-RJ. XLVIII Congresso da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 2012.
6. Monte,R,L; SOUSA, D. R. T. Avaliação da Implantação da Metodologia
Ogawa-kudoh no Diagnóstico de Tuberculose na Fundação de Medicina Tropical
Dr Heitor Vieira Dourado-FMTAMVD. In: XLVII Congresso da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, 2011, Rio de Janeiro-RJ. XLVII Congresso da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 2011.
51
ANEXO F
INSTRUCTION TO AUTORS
GENERAL
Mycoses is dedicated to the publication of manuscripts on topics concerning
medical or veterinary mycology. Studies on plant pathology or mycological papers
on fungi not related to human or veterinary medicine do not lie within the scope of
Mycoses and will not be accepted. Manuscripts may be published as original
communication of normal or short length (Short communication). The submission
of review articles both of the mini-review and the full-length type is particularly
encouraged. Only papers submitted in English will be accepted (this does not
exclude the Latin text required for the description of new species or genera).
The editors reserve the right not to accept papers unless adherence to the
principles given in the Declaration of Helsinki and the Guiding Principles in the
Care and Use of Animals (DHEW Publication NIH) is clear.
No charge is made for publication but authors will be required to pay for extensive
alterations to agreed papers at proof stage.
EARLY VIEW
Mycoses is covered by Wiley-Blackwell's Early View articles for articles that are
complete and final. They have been fully reviewed, revised and edited for
publication, and the authors' final corrections have been incorporated. Because
they are in final form, no changes can be made after online publication. The
nature of Early View articles means that they do not yet have volume, issue or
page numbers, so Early View articles cannot be cited in the traditional way. They
are therefore given a Digital Object Identifier (DOI), which allows the article to be
cited and tracked before it is allocated to an issue. After print publication, the DOI
remains valid and can continue to be used to cite and access the article.
MANUSCRIPT SUBMISSION
Manuscripts are submitted to Mycoses online, i.e. electronically, from the
corresponding author's Mycoses ScholarOne Manuscript (formerly known as
Manuscript Central) account. You will need your files in an electronic format, an
Internet connection, and a user ID and password for the site. To begin a new
submission, go to http://mc.manuscriptcentral.com/myc and log in or create an
account to get your auser ID and password. Full instructions are provided on the
site.
If assistance is needed, the Editorial Office can be contacted and will readily
provide any help users need to upload their manuscripts.
Ann O'Mahony
52
Mycoses Editorial Office
ELECTRONIC SUBMISSION
Manuscripts should be uploaded as Word (.doc) or Rich Text Format (.rft) files
plus separate figure files. JPEG, TIFF or EPS files are acceptable for submission,
but only high-resolution JPEG, TIFF or EPS files are suitable for printing. The files
will be automatically converted to a PDF document on upload and will be used for
the review process. The text file must contain the entire manuscript including title
page, abstract, text, references, tables, and figure legends, but no embedded
figures. Figure tags should be included in the file.
Manuscripts should be formatted as described in Mycoses’ Author Guidelines
(below). When preparing your file, please use only standard fonts such as Times,
Times New Roman or Arial for text, and Symbol font for Greek letter, to avoid
inadvertent character substitutions. In particular, please do not use Japanese or
other Asian fonts. Do not use automated or manual hyphenation.
For more information on preparing manuscripts for online submission, please read
the detailed instructions at http://mc.manuscriptcentral.com/myc. Additional help is
available by emailing [email protected]/.
Authors are encouraged to provide names of potential reviewers for their
manuscript. All acceptable material submitted for publication is forwarded to the
Deputy Editor in charge of the particular field who together with two further
referees makes a judgement on the paper. The votes of the independent referees
as well a preliminary suggestion of acceptance or rejection is forwarded by the
Deputy Editor to the Editors who make the final decision on their individual
specialty. Authors must inform the Editors of any possible conflict of interest
capable of influenceing their judgement and if necessary, a disclaimer will be
included.
Revised manuscripts must be uploaded within 2 months of authors being notified
of conditional acceptance pending satisfactory revision. Authors resubmitting
manuscripts should follow the same procedures as for submission of new
manuscripts. If accepted, papers become the copyright of the journal.
After acceptance please make sure that the final manuscript and the figure files
are uploaded. The figures must be high-resolution scans (JPEG, TIFF or EPS
files). Detailed information on our digital illustration standards is available at
http://authorservices.wiley.com/bauthor/illustration.asp
ORIGINAL ARTICLES AND REVIEWS
Text
Authors should aim for a concise readable style. Spelling should follow
theConcise Oxford Dictionary, and The Oxford Dictionary for Writers and Editors.
53
The Editors reserve the right to make corrections, both literary and technical, to
the papers.
All pages must be numbered consecutively in the upper right-hand corner of each
page. Starting with the title page as p.1, the pages should be numbered in the
following order: title page, summary and key words, text, acknowledgements,
references, tables, figure legends.
The following items should each start on a separate page.
Title Page
This should bear (1) the title, (2) the names of all authors, (3) the institutions of
origin with brief addresses, (4) a short title of not more than 50 characters
(including spaces) to be used as a running head, (5) a list of up to eight key words
for indexing purposes, and (6) the name and full postal address (with phone and
fax numbers and e-mail address) of the author who will be responsible for reading
the proofs (the corresponding author). The corresponding author must keep the
Mycoses office informed of any change in details until the paper is published.
Authors should keep a copy of their manuscript.
Summary
Normally in less than 210 words, this should indicate clearly the scope and main
conclusions of the paper. Original articles should have a structured abstract,
comprising the five headings: Background, Objectives, Patients/Methods, Results
and Conclusions.
Main Text
Papers should be divided into sections headed (1) introduction, (2) materials and
methods (or patients and methods/subjects and methods if human
patients/subjects were used), (3) results, (4) discussion (5) acknowledgements,
and (6) Conflict of Interest. Avoid an excess of sub-headings - two further
divisions, if necessary, should be adequate.
The introduction should explain why the work was done and briefly introduce the
scope and contents of the paper. Essential details should be included in materials
and methods, including experimental design and statistical analysis. Results
should be recorded in the past tense. The discussion should present the author's
results in the broader context of other work on the subject. Acknowledgements
should be as brief as possible.
References
Please verify your references before submission and send them as a plain,
unstructured list. We recommend the use of a tool such as Reference Managerfor
reference management and formatting. All references must be cited in numerical
order in the text following the Vancouver system. The numbers of references
should appear in the text in brackets e.g. [1, 21] or [1-4]. If giving the names of
authors in the text the following form should be used: Brown & Smith [1] or Brown
et al. [2] if there are more than two authors. Unpublished observations and
personal communications may be included in the text only.
54
The reference list should show the references in numerical order as they appear
in the text. References should include the following: (1) authors (surname followed
by initials), (2) year, (3) title of (a) article or (b) chapter, (4) editors (if a book), (5)
title of (a) journal or (b) book, (6) volume number, (7) place of publication and
name of publisher (if a book), and (8) first and last page numbers of (a) article or
(b) chapter. Journal titles should be abbreviated according to the system adopted
in Index Medicus.
The following format should be used:
JOURNAL ARTICLES
(List all authors if six or fewer, list the first three then add et al. if there are seven
or more).
Sharma A, Saple DG, Surjushe A, Rao GRR, Kura M, Ghosh S, Bolmall C et
al.Efficacy and tolerability of sertaconazole nitrate 2% cream vs. miconazole in
patients with cutaneous dermatophytosis. Mycoses 2011;54: 217-222.
BOOKS
Kwon-Chung KJ, Boekhout T, Wickes BL, Fell JW. Systematics of the genus
Cryptococcus and its type species C. neoformans. In: Heitman, J, Kozel, T, Kwon-
Chung, KJ, Perfect, J. & Casadevall, A. (eds) Cryptococcus:from Human
Pathogen to Model Yeast. ASM Press, Washington DC, USA, 2011:3-15.
Work that has been submitted but not accepted for publication should not appear
in the reference list but may appear in the text as unpublished observations. Work
that has been accepted but not published should be included in the reference list
stating the journal in which it is to appear followed by '(in press)' plus DOI. Further
details should be supplied as soon as possible.
TABLES
These must be numbered consecutively with Arabic numerals and typed on
separate sheets carrying an appropriate legend and presented in a way that
makes the table self-explanatory.
Numerical results should be expressed as means with the relevant standard
errors and/or statistically significant differences, quoting probability levels (P-
values). Three significant figures are usually sufficient for mean values and
standard errors should be quoted two or three more decimals than the mean.
The only lines appearing in the table should be horizontal and all decimals should
be aligned in columns. The placement of all tables should be indicated in the text,
being referred to as Table 1 or Tables 2 and 3.
FIGURES
Figures should be numbered in sequence in Arabic numerals as they appear in
the text. Labels, lettering and symbols etc. must be professionally prepared and
should be uniform. Lines should be of sufficient thickness to stand reduction (no
55
less than 4 mm wide for a 50% reduction), and letters should be a minimum of 14
pt Times New Roman or an equivalent size. Acceptable symbols for experimental
points are ¡, r, o, ˜, p, ¢. The symbols + and × will not be accepted.
Legends should be typed on a separate sheet and consist of a short title together
with a brief explanatory paragraph. The legend must make the meaning of each
figure understandable without further reference to the text. Photomicrographs
should state the original magnification.
The position of all figures should be indicated in the text and should be referred to
as Fig. 1 or Figs 1 and 3. Figure 1 should be written out in full if at the beginning
of a sentence.
ELECTRONIC ARTWORK
Vector graphics (e.g. line artwork) should be saved in Encapsulated Postscript
Format (EPS), and bitmap files (e.g. photographs) in Tagged Image File Format
(TIFF). Please do not use any pixel-oriented programs. Scanned figures (only in
TIFF format) should have a resolution of 300 dpi (halftone) or 600 to 1200 dpi (line
drawings) in relation to the reproduction size. Colour graphics should be created
using the CMYK colour palette (print colours), not RGB (monitor colours). There is
a charge for alterations to figures when carried out by the publisher.
Full details of submission of figures in electronic format are available at:
http://authorservices.wiley.com/bauthor/illustration.asp
If figures have more than one part, each part should be labelled(preferably) in the
top left-hand corner with lower-case letters in parentheses e.g. a figure with two
parts would be labelled (a) and (b). In the text this should be referred to as Fig. 1a
or Figs 2a, b.
Figures should be planned to fit the printed column, i.e. 7.9 cm wide for single
column and 16.5 cm wide for double column.
Photographs can be up to twice the reproduction size and must be unmounted
glossy prints showing good detail and moderate contrast.
UNITS, SYMBOLS and ABBREVIATIONS
SI (Système International) units should be used and should conform with the lists
printed Units, Symbols and Abbreviations - A Guide for Biological and Medical
Editors and Authors 4th edn as published by the Royal Society of Medicine.
Nomenclature of disease should follow the International Classification of Disease,
published by the World Health Organization, as far as possible.
When first mentioned, cumbersome medical names should be abbreviated for
later reference in the text. Latin bi-nominals should abbreviate the genera to the
initial letter after the first mention unless it begins a sentence.
56
Doses of drugs should be given as unit weight per body weight, e.g. mmol kg-1.
Rates should be expressed with negative indices. Concentrations should be given
in terms of molarity, e.g. mmol l-1, not mM.
Numerals are to be used from 10 upwards; and the 24-hour clock, e.g. 21.00
hours, should be used.
MATERIALS
The source of all materials used should be given stating company, city and
country.
Verification of the identity of living specimens used must take place through
sequencing, or by consultation of taxonomists working at a reference centre.
Specimens analyzed must remain accessible for later reference. Strains should
be deposited in one of the major culture collections, and sequences in a public
data bank. Collection and sequence numbers must be cited in the text. It is
recommended that new taxa are deposited in MycoBank. Descriptions of new
taxa must comply with the rules of the International Code of Botanical
Nomenclature.
CASE REPORTS
Case Reports may be submitted but only those which are RARE or of
EXCEPTIONAL INTEREST will be considered. Please upload Case Reports in
the same format as Original Articles.
In addition each Case Report should be accompanied by a review of the topic the
case report deals with. Case reports uploaded without a review will not be
considered.
LETTERS TO THE EDITOR
There are no keywords required. The references must be integrated ino the text
(Author AA et al, Journal 2008, 1:242) or (Book Author AA, Book Title, 2nd
Edition, Publisher, Place 2010
Letters to the Editor are considered for publication (subject to editing and
abridgment) if they do not contain material that has been submitted or published
elsewhere.
Letters in reference to a Journal article must not exceed 200 words (excluding
references) and must relate to articles published in Mycoses within the past three
years.
A letter can have no more than 5 references and one figure or table (References
should be incorporated into the body of the text)
A letter can be signed by no more than three authors
You will be asked to include your full address and email.
57
COPYRIGHT ASSIGNMENT
Authors are no longer required to assign copyright in their paper. Instead authors
are required to assign the exclusive licence to publish ther paper to Wiley-
Blackwell and Mycoses. Assignment of the exclusive lincence is a condition of
publication and papers will not be passed to the publisher for production unless
licence has been assigned. (Papers subject to government or Crown copyright are
exempt from this requirement). Please download the Copyright Transfer
Agreement form and send it to the Production Editor via email: [email protected] or
fax: +65 66438599
PROOFS
The corresponding author will receive an email alert containing a link to a web
site. A working e-mail address must therefore be provided for the corresponding
author. The proof can be downloaded as a PDF (portable document format) file
from this site. Acrobat Reader will be required in order to read this file. This
software can be downloaded (free of charge) from the following web site:
http://www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html.
This will enable the file to be opened, read on screen and printed out in order for
any corrections to be added. Further instructions will be sent with the proof. Hard
copy proofs will be posted if no e-mail address is available. Excessive changes
made by the author in the proofs, excluding typesetting errors, will be charged
separately.
ONLINEOPEN
OnlineOpen is available to authors of primary research articles who wish to make
their article freely available to non-subscribers on publication, or whose funding
agency requires grantees to archive the final version of their article. With
OnlineOpen, the author, the author's funding agency, or the author's institution
pays a fee to ensure that the article is made available to non-subscribers upon
publication via Wiley Online Library, as well as deposited in the funding agency's
preferred archive. Please visit http://olabout.wiley.com/WileyCDA/Section/id-
406241.html for further information about OnlineOpen. Prior to acceptance there
is no requirement to inform an Editorial Office that you intend to publish your
paper OnlineOpen if you do not wish to. All OnlineOpen articles are treated in the
same way as any other article. They go through the journal's standard peer-
review process and will be accepted or rejected based on their own merit.
OFFPRINTS
58
A PDF offprint of the online published article will be provided free of charge to the
corresponding author, and may be distributed subject to the Publisher's terms and
conditions. Paper offprints of the printed published article may be purchased if
ordered via the method stipulated on the instructions that will accompany the
proofs. Printed offprints are posted to the correspondence address given for the
paper unless a different address is specified when ordered. Note that it is not
uncommon for printed offprints to take up to eight weeks to arrive after publication
of the journal.
AUTHOR MATERIAL ARCHIVES POLICY
Please note that unless specifically requested, Wiley-Blackwell will dispose of all
hardcopy or electronic material submitted two months after publication. wIf you
require the return of any material submitted, please inform the editorial office or
Production Editor as soon as possible if you have not yet done so.
AUTHOR SERVICES
NEW: Online production tracking is now available for your article through Wiley-
Blackwell's Author Services: Author Services enables authors to track their article
- once it has been accepted - through the production process to publication online
and in print. Authors can check the status of their articles online and choose to
receive automated e-mails at key stages of production. The author will receive
an e-mail with a unique link that enables them to register and have their article
automatically added to the system. Please ensure that a complete e-mail address
is provided when submitting the manuscript.