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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica

Área de Tecnologia de Fermentações

Produção de L-asparaginase pela levedura Leucosporidium muscorum

CRM 1648 isolada de sedimento marinho coletado na Península Antártica

Rominne Karla Barros Freire

Tese para obtenção do Título de DOUTORA

Orientador: Prof. Dr. Adalberto Pessoa Jr.

Coorientador: Prof. Dr. Aldo Tonso

São Paulo, 2019

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica

Área de Tecnologia de Fermentações




Versão Corrigida da Tese conforme resolução CoPGr 6018 de 13/10/2011. Original

encontra-se disponível no Serviço de Pós-Graduação da FCF/USP.

Tese para obtenção do Título de DOUTORA

Orientador: Prof. Dr. Adalberto Pessoa Jr.

Coorientador: Prof. Dr. Aldo Tonso

São Paulo, 2019




Comissão Julgadora

da

Tese para obtenção do título de DOUTORA

__________________________________

Prof. Dr. Orientador/Presidente

__________________________________

1° Examinador

__________________________________

2° Examinador

__________________________________

3° Examinador

__________________________________

4° Examinador

São Paulo, ___ de ___________ de 2019.

Epígrafe

Como ligar 9 pontos utilizando apenas 4 linhas retas?

Quando olhamos a figura e temos um olhar mais rígido, tendenciamos a limitar-nos à

imagem do quadrado formado pelos pontos. Esse olhar fixo, limitado, faz a gente não

alcançar a solução do problema que é, justamente, OLHAR PARA FORA, sair dos

limites, ir além. Para fazer Ciência é preciso “sair da caixa”, para fazer Ciência é preciso

“pensar vivo” e o conhecimento vivo é aquele que nunca se fecha, pois o final

representa sempre o começo de um novo pensar.

Rominne Freire

(trecho do portfólio desenvolvido como parte do curso livre de Pedagogia Waldorf, em

Fevereiro de 2017).

“A coisa mais bela que podemos experimentar é o mistério.

Essa é a fonte de toda a arte e ciências verdadeiras”.

(Albert Einstein).

1

2

3

4

Aos meus pais e irmãos,

que sempre me apoiaram nas minhas escolhas.

Agradecimentos

Aos meus pais, Lana e Wilson, pelo carinho e por terem me apoiado e me incentivado

durante toda a minha trajetória.

Aos meus irmãos (Radha e Endrigo), sobrinhas e sobrinho (Cecília, Clarice e Dante),

cunhado e cunhada (Gilles e Aline), pelo carinho e apoio emocional.

Ao meu orientador Prof. Adalberto por toda a paciência, disponibilidade e por ter

aceitado a orientação desta tese.

Ao meu coorientador Prof. Aldo, sempre muito atencioso e disposto a passar horas com

seus alunos em longas conversas e aprendizados. Gratidão por ter aceitado o convite e

por ter compreendido e apoiado as minhas escolhas, em especial pela orientação nos

ensaios em biorreator.

Ao Prof. Dr. Paul Long, por ter me recebido em seu grupo de pesquisa, no Instituto de

Ciências Farmacêuticas do King’s College, em Londres. Eu ainda não estava

oficialmente matriculada no doutorado, mas foi uma experiência enriquecedora, da

qual sou grata pela indicação do prof. Adalberto.

Ao prof. Dr. Felipe Rebello, profa. Dra. Gisele Monteiro, profa. Dra. Carlota Rangel,

Profa. Dra. Lara Sette e Prof. Dr. João Carlos pela disponibilidade em me auxiliar e

sanar dúvidas com relação a este trabalho. Em especial a Profa. Lara Sette e seu aluno

Fábio Inforsato, por ceder as amostras de leveduras utilizadas neste trabalho e as

informações acerca da coleta, e ao prof. Felipe Rebello pela disponibilidade em me

orientar a respeito das análises estatísticas utilizadas neste trabalho.

Ao prof. Marco Antonio Stephano que participou do meu processo de entrada no

doutorado, pelas sugestões, conversas nos corredores da Faculdade de Ciências

Farmacêutica e pela oportunidade de organizar junto com ele e outros colegas o Curso

de Inverno da FCF/USP nos anos de 2015 e 2017.

Aos amigos de bancada (e da vida) que me apoiaram, em especial a João Santos,

Joãozinho, um irmão querido, que sempre me acolheu e esteve do meu lado ao longo de

todo esse processo, pela orientação nas tentativas de purificação da enzima, pelas

correções dos meus textos e incentivo para que eu não desistisse dessa jornada. Ao

Ignácio Moguel, pela paciência e por ter me ajudado nas muitas tentativas para a

purificação da enzima. Ao Rafael Ferraro, pela oportunidade de ensiná-lo e, assim,

aprender muito mais com ele. Ao Carlos Mendonça pela disponibilidade e atenção na

leitura e correção dos meus textos.

Por todas as conversas de incentivo, em especial a minha mãe, Lana (mãe, amiga,

companheira em todos os momentos), a César Diaz, João Santos e ao prof. Aldo, que

não me deixaram desistir.

A toda equipe (alunos, professores e técnicos) dos laboratórios de Biotecnologia,

Nanobio e Biomol, aos novos e aos que já passaram por aqui, em especial à Larissa

Bentim, Alexsandra Apolinário e Luciana Bueno pela amizade e apoio; à Letícia

Parizotto pelo auxílio nos ensaios em biorreator; ao Tales Costa-Silva e ao Juan

Flores-Santos pela parceria no artigo COSTA-SILVA et al., 2018b.

Ao apoio financeiro da CAPES e FAPESP (que apoia o projeto temático no qual este

trabalho está inserido).

A todos os que estiveram presentes na minha vida nesse período (2014-2019), aos que

ficaram e aos que se foram, aos que me bem quiseram e àqueles que me mal quiseram,

pois, como já disse a Monja Coen em uma de suas palestras, os nossos “inimigos” são

os nossos maiores amigos, pois são eles que apontam nossos erros, nossas falhas e

fraquezas, são o espelho que mostram as nossas sombras e, assim, impulsionam o nosso

crescimento. Por isso, gratidão a todos!

Sumário

Lista de Figuras........................................................................................................ 10

Lista de Tabelas........................................................................................................ 13

Lista de Equações..................................................................................................... 14

Lista de abreviações................................................................................................. 15

RESUMO................................................................................................................. 16

ABSTRACT............................................................................................................. 17

Introdução e Justificativa.......................................................................................... 18

I. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................. 21

1.1.L-ASNase como agente quimioterápico............................................................. 21

1.2. Estrutura e mecanismo de ação........................................................................ 23

1.3.Leucemia Linfoblástica Aguda.......................................................................... 25

1.4. Tratamento de LLA............................................................................................ 26

1.5. Outras aplicações da enzima L-ASNase........................................................... 29

1.6. Em busca de alternativas às L-ASNases convencionais................................... 30

1.7. Produção de L-ASNase em biorreator.............................................................. 33

1.8. Leveduras da região Antártica.......................................................................... 35

1.8.1. Interesse biotecnológico................................................................................. 36

1.8.2. Leucosporidium muscorum............................................................................ 40

II. OBJETIVOS........................................................................................................ 42

2.1. Objetivo Geral................................................................................................... 42

2.2. Objetivos Específicos........................................................................................ 42

III. MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................. 43

3.1. Leveduras isoladas da Antártica....................................................................... 43

3.2. Preservação das linhagens................................................................................ 45

3.3. Meios de cultivo................................................................................................. 45

3.4. Condições de cultivo em frascos agitados (shaker).......................................... 46

3.5. Seleção dos isolados produtores de L-ASNase................................................. 46

3.6. Análise univariada de fontes de carbono.......................................................... 48

3.7. Análise univariada de fontes de nitrogênio....................................................... 48

3.8. Avaliação da interação de fontes nutricionais por delineamento fatorial

completo para melhoramento do crescimento e produção de L-

ASNase...................................................................................................................... 49

3.9. Análise univariada das condições de cultivo: temperatura, pH inicial,

concentração celular inicial (X0) e concentração de água do mar no

meio.......................................................................................................................... 50

3.10. Ensaios em biorreator..................................................................................... 51

3.10.1. Preparo do biorreator.................................................................................... 51

3.10.2. Ensaios em biorreator: condições de cultivo e oxigênio

dissolvido.................................................................................................................. 52

3.11. Metodologias Analíticas.................................................................................. 55

3.11.1.Monitoramento dopH.................................................................................... 55

3.11.2. Monitoramento do crescimento celular........................................................ 56

3.11.3. Dosagem de atividade enzimática................................................................ 57

3.11.4. Dosagem de proteínas totais......................................................................... 59

3.11.5. Dosagem de sacarose.................................................................................... 59

3.11.6. Dosagem de prolina...................................................................................... 60

3.11.7. Cálculo dos parâmetros cinéticos................................................................. 60

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................... 61

4.1. Triagem de leveduras adaptadas ao frio produtoras de L-ASNase (avaliação

qualitativa)............................................................................................................... 61

4.2. Perfil de produção de L-ASNase pelas leveduras selecionadas (avaliação

quantitativa) e seleção do melhor produtor............................................................. 65

4.3. Triagem e seleção dos fatores nutricionais....................................................... 67

4.3.1. Avaliação de fontes de carbono ..................................................................... 68

4.3.2. Avaliação de fontes de nitrogênio.................................................................. 70

4.4. Otimização dos fatores nutricionais por delineamento fatorial

completo................................................................................................................... 73

4.5. Análise univariada das variáveis temperatura (°C), concentração inicial de

células (X0), pH inicial e concentração de água do mar na composição do meio

de cultivo.................................................................................................................. 79

4.6. Cultivos em biorreator e avaliação do oxigênio dissolvido............................. 84

4.6.1. Ensaio 1: sem controle de oxigênio dissolvido (OD < 20%)......................... 84

4.6.2. Ensaio 2: sem controle de oxigênio dissolvido (OD > 20%)......................... 87

4.6.3. Ensaio 3: oxigênio dissolvido controlado em 80%........................................ 90

4.6.4. Ensaio 4: oxigênio dissolvido controlado em 20%........................................ 93

4.6.5. Avaliação comparativa dos ensaios em biorreator......................................... 95

V. CONCLUSÕES................................................................................................... 100

VI. PERSPECTIVAS FUTURAS........................................................................... 102

VII. REFERÊNCIAS.............................................................................................. 103

APÊNDICES.......................................................................................................... 117

apêndice A................................................................................................................ 118

apêndice B................................................................................................................ 122

apêndice C................................................................................................................ 122

apêndice D................................................................................................................ 126

apêndice E................................................................................................................ 127

apêndice F................................................................................................................. 132

apêndice G................................................................................................................ 133

apêndice H................................................................................................................ 136

apêndice I................................................................................................................. 137

Lista de Figuras

Figura 1 – Número de publicações registradas na plataforma PUBMED do

NCBI que faz referência ao termo “asparaginase” desde 1949 até os dias atuais.

Pesquisa realizada em fevereiro de 2019................................................................. 22

Figura 2 – Mecanismo de ação da enzima L-ASNase. Fonte: adaptado de

AVRAMIS, 2012........................................................................................................ 23

Figura 3 –A atividade enzimática em relação a temperatura. A atividade das

enzimas psicrófilas (círculo vazio) α-amilase (gráfico esquerdo) e celulase

(gráfico direito) e seus correspondentes mesófilos (círculo cheio). Fonte:

Adaptado de FELLER, 2013.................................................................................... 38

Figura 4 – Imagem de células em microscópio e morfologia da colônia de

linhagem de L. muscorum. Fonte: http://www.westerdijkinstitute.nl/collections,

acesso em 12/12/18.................................................................................................. 41

Figura 5 – Mapa da Baia do Almirantado, localizada na Ilha do Rei George,

Península Antártica. Os números no mapa da Baia do Almirantado (A) indicam

os lugares onde as amostras foram coletadas. 1. Refúgio 2; 2. EACF (Estação

Antártica Comandante Ferraz, base brasileira de pesquisa); 3. Botany Point.

Fontes: (A) grupo de pesquisa da Profa. Dra. Lara Sette; (B) acesso no Google

Maps; e (C) adaptada de ANDRADE et al., 2015.................................................... 44

Figura 6 – Distribuição de cada cepa e dos brancos (amostras sem

microrganismo) em placas de 96 poços para pré-inóculo e produção..................... 47

Figura 7 – Biorreator BIOSTAT® B-MO em uso para cultivo de L.

muscorumCRM 1648 e produção de L-ASNase..................................................... 51

Figura 8 – Representação do painel de controle do biorreator BIOSTAT®

B-MO

e todos os parâmetros possíveis de controle: agitação, temperatura, pH, OD,

vazão de ar puro de entrada (1) e vazão de O2 puro de entrada (2), este último

controlado por pulsos de abertura (% de tempo de abertura) da válvula de O2 (3).

No início do ensaio 4 a conFiguração foi modificada, conforme representado no

círculo pontilhado................................................................................................... 55

Figura 9 – Valores de densidade óptica em função de valores de massa seca

celular, sendo o R2 = 0,987.......................................................................................

56

Figura 10 – Reações químicas no método do ácido L-aspartil-β-hidroxâmicode

quantificação de L-ASNase. Fonte: adaptada de MAGRI et al., 2018.................... 57

Figura 11 – Sequência de passos para a execução do teste de atividade pelo

método do ácido L-aspartil-β-hidroxâmico.............................................................. 58

Figura 12 – Triagem de produtores de L-ASNase entre 150 isolados da Antártica

pelo método do ácido L-aspartil-β-hidroxâmico. A intensidade da cor vermelha

indica maior ou menor produção da enzima............................................................ 62

Figura 13 – Resultado do cultivo dos isolados produtores de L-ASNase em meio

CDM com azul de bromotimol. Da esquerda para a direita: meio não inoculado,

meio sem fonte de nitrogênio, isolados 2, 26, 1, 16, 86, 94 e 85............................. 63

Figura 14 – Morfologia das colônias dos isolados produtores................................ 64

Figura 15 – Curva de crescimento e produção de L-ASNase por 7 isolados da

Antartica .................................................................................................................. 66

Figura 16 – Crescimento celular (A) e produção de L-ASNase (B) pela linhagem

L. muscorum CRM 1648 em meio Czapek Dox com adição de diferentes fontes

de carbono............................................................................................................... 69

http://www.westerdijkinstitute.nl/collections/BioloMICS.aspx?Table=Yeasts%20species&Name=Leucosporidiella%20muscorum&Fields=All&ExactMatch=T

Figura 17 – Crescimento celular (A) e produção de L-ASNase (B) pela linhagem

L. muscorum CRM 1648 em meio Czapek Dox com diferentes fontes de

nitrogênio.................................................................................................................. 71

Figura 18 – Gráfico da superfície de resposta em 3D de MSC (Y1) e atividade

de L-ASNase (Y2) em função da concentração de sacarose (X1), extrato de

levedura (X2)e prolina (X3). Valores fixados: X1 = 17, X2 = 15 e X3 = 16......... 78

Figura 19 – Efeito do meio Czapek Dox no crescimento de L. muscorum CRM

1648 e produção de L-ASNase após o delineamento experimental. CD: meio

Czapek Dox inicial, com glicose e prolina; CDM: meio Czapek Dox melhorado

neste trabalho, contendo prolina (20 g.L-1

), extrato de levedura (15 g.L-1

) e

sacarose (20 g.L-1

).................................................................................................... 79

Figura 20 – Avaliação do crescimento de L. muscorum CRM 1648 em meio

CDM por análise de DO e massa seca celular, bem como de Ln(msc), quando X0

= 0,5 g.L-1

(A), X0 = 1,0 g.L-1

(B) e X0 = 1,5 g.L-1

(C). msc: massa seca celular....... 80

Figura 21 – Curva comparativa de crescimento de L. muscorum CRM 1648 e

produção de L-ASNase quanto a concentração celular inicial (X0)......................... 81

Figura 22 – Análise dos dados de inclinação das curvas de crescimento de L.

muscorum CRM 1648 (A) e produção de L-ASNase (B) por regressão linear em

cada nível de X0........................................................................................................ 81

Figura 23 – Curva de crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-

ASNase em diferentes temperaturas......................................................................... 82


ASNase em diferentes valores de pH inicial do meio CDM.................................... 83


ASNase em diferentes concentrações de água do mar no meio CDM..................... 84

Figura 26 – Perfis das variáveis pH, temperatura (°C), agitação (rpm) e volumes

adicionados de ácido (HCl 20%) e base (NaOH 20%) registradas pelo biorreator

durante o Ensaio 1.................................................................................................... 84

Figura 27 – Perfis das variáveis aeração e oxigênio dissolvido (OD) no Ensaio 1

em biorreator............................................................................................................ 85

Figura 28 – Perfil das variáveis crescimento (DO e MSC), pH e produção de L-

ASNase no Ensaio 1 em biorreator.......................................................................... 86

Figura 29 – Perfil das variáveis produção de CO2 (CER) e Ln de CER na fase

exponencial (A) e crescimento celular (massa seca celular, [X]) mais ln(X) e

ln(X) na fase exponencial (ln(X)exp) no Ensaio 1................................................... 86

Figura 30 – Perfis das variáveis pH, temperatura (°C) e agitação (rpm)

registradas pelo biorreator durante o Ensaio 2......................................................... 87


em biorreator............................................................................................................ 88

Figura 32 – Perfil de crescimento [X], consumo de sacarose e de prolina [S] e

produção de L-ASNase no Ensaio 2 em biorreator.................................................. 89

Figura 33 – Perfil das variáveis crescimento celular (massa seca celular, [X]),

ln(X) e ln(X) na fase exponencial (ln(X)exp) no Ensaio 2...................................... 89

Figura 34 – Medida de pH do meio CDM e atividade de L-ASNase ao longo do

cultivo de L. muscorum CRM 1648 em biorreator no ensaio 2............................... 90


registradas pelo biorreator durante o ensaio 3......................................................... 91


em biorreator............................................................................................................ 91

Figura 37 – Perfil de crescimento [X], consumo de sacarose e prolina [S] e 92

produção de L-ASNase no Ensaio 3 em biorreator.................................................




registradas pelo biorreator no Ensaio 4.................................................................... 93


em biorreator. O valor médio de OD foi de 25,1 %................................................. 94

Figura 41 –Perfil de crescimento [X], consumo de sacarose e de prolina [S] e

produção de L-ASNase no Ensaio 4 em biorreator.................................................. 95



Figura 43 – Comparação do perfil de OD em cada ensaio...................................... 97

Figura 44 – Comparação do perfil de crescimento (A) e de produção de L-

ASNase (B) nas condições de OD avaliadas em biorreator..................................... 97

Figura 45 – Perfil comparativo da produtividade em células Px (A) e em produto

L-ASNase Pp (B) nos ensaios 1-4 em biorreator..................................................... 98

Figura 46 – Perfil comparativo do consumo dos substratos sacarose (A) e

prolina (B) nos ensaios 2-4 em biorreator................................................................ 99

Lista de Tabelas

Tabela 1 –Propriedades das L-ASNases disponíveis comercialmente. Fontes: de

Abud, 2005 e Narta et al., 2007................................................................................... 27

Tabela 2 – Referências encontradas na literatura relacionadas à produção de L-

ASNase por espécies de leveduras............................................................................... 32

Tabela 3 – Informações sobre a espécie, material de origem e local de coleta dos

isolados identificados neste trabalho como produtores de L-ASNase......................... 43

Tabela 4 – Meios de cultivo utilizados para a preservação, manutenção e

crescimento de leveduras isoladas da Antártica........................................................... 46

Tabela 5 – Fontes de carbono e respectivas concentrações (C) em g.L-1

de cada

fonte avaliada no meio CD para crescimento da levedura alvo e produção de L-

ASNase......................................................................................................................... 48

Tabela 6 – Fontes de nitrogênio e respectivas concentrações (C) em g.L-1

de cada

fonte avaliada no meio CD para crescimento da levedura e produção de L-

ASNase......................................................................................................................... 49

Tabela 7 – Fatores e níveis avaliados em delineamento fatorial completo (I) para

melhoramento do crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-

ASNase......................................................................................................................... 49

Tabela 8 – Fatores e níveis avaliados em delineamento fatorial completo (II) para

melhoramento do crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-

ASNase......................................................................................................................... 50

Tabela 9 – Matriz do planejamento fatorial completo(I) e suas respectivas

respostas para a avaliação do crescimento de L. muscorumCRM 1648 e produção

de L-ASNase................................................................................................................ 74

Tabela 10 –Análise de Variância (ANOVA) por regressão de superfície de

resposta de MSC (Y1) e atividade de L-ASNase (Y2) em função da concentração

de sacarose (X1), extrato de levedura (X2) e prolina (X3) – delineamento

experimental I.............................................................................................................. 75

Tabela 11 – Matriz do planejamento fatorial completo (II)e suas respectivas

respostas para a avaliação do crescimento de L. muscorumCRM 1648 e produção

de L-ASNase................................................................................................................ 76

Tabela 12 –Análise de Variância (ANOVA) por regressão de superfície de

resposta de MSC (Y1) e atividade de L-ASNase (Y2) em função da concentração

de sacarose (X1), extrato de levedura (X2) e prolina (X3) – delineamento

experimental II............................................................................................................. 77

Lista de Equações

Equação 1 – Cálculo do volume de suspensão celular para inoculação do meio de

cultivo........................................................................................................................... 46

Equação 2 – Cálculo de predição da resposta massa seca celular no delineamento

experimental................................................................................................................. 50

Equação 3 – Cálculo de predição da resposta produção de L-ASNase no

delineamento experimental.......................................................................................... 50

Equação 4 – Cálculo da taxa de captação de O2 dissolvido (OUR)............................ 52

Equação 5 – Cálculo da taxa de produção de CO2 (CER).......................................... 52

Equação 6 – Cálculo do coeficiente respiratório (RQ)............................................... 52

Equação 7 – Cálculo do fluxo de ar de saída no biorreator (Φs)................................ 53

Equação 8 – Cálculo de massa seca celular (em gramas por litro)............................. 56

Equação 9 – Cálculo da relação entre DO e MSC...................................................... 56

Equação 10 – Cálculo da velocidade específica de crescimento (µx)......................... 60

Equação 11 – Cálculo da Integral da equação 10....................................................... 60

Equação 12 – Cálculo da produtividade em células................................................... 60

Equação 13 – Cálculo da produtividade em produto (L-ASNase)............................. 60

Lista de abreviações

L-ASNase –L-asparaginase

Asn – asparagina

LLA – leucemia linfoblástica aguda

ASNS – asparagina sintetase

MS – Ministério da Saúde

PI – ponto isolelétrico

FDA – Food and Drug administration

OFAT –one-factor at a time

DoE – Delineamento Experimental

CCD – Central Composite Design

OD – oxigênio dissolvido

DO – densidade óptica

CD – Czapek-Dox

CDM – Czapek-Dox Modificado

EACF – Estação Antártica Comandante Ferraz

CRM – Central de Recursos Microbianos da UNESP

vvm – volume de gás por volume de meio por minuto

LpM – litro de gás por litro de meio por minuto

AHA –-hidroxamato aspártico

GOD/POD– glicose oxidase/peroxidase

Eq – equação

UV – ultravioleta

TCA – ácido tricloroacético

RCN – repressão catabólica pelo nitrogênio

FN – fonte de nitrogênio

FC – fonte de carbono

MSC – massa seca celular

DEC – digestivo enzimático de caseína

RQ – coeficiente respiratório

OUR –taxa de captação de O2 dissolvido

CER –taxa de produção de CO2

RESUMO

FREIRE, R.K.B. Produção de L-asparaginase pela levedura Leucosporidium muscorum

CRM 1648 isolada de sedimento marinho coletado na Península Antártica. 2019. 147f.

Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo,

São Paulo, 2019.

L-asparaginase (L-ASNase) é uma enzima com propriedades interessantes para a

indústria médica, farmacêutica e de alimentos, que tem recebido atenção especial,

inclusive no Brasil, por fazer parte do protocolo de tratamento de distúrbios

linfoproliferativos, como a leucemia linfoblástica aguda (LLA). No mercado desde a

década de 1970, as enzimas de origem bacteriana enfrentam algumas limitações por

provocarem reações adversas graves em quase 80% dos pacientes em tratamento. Nesse

contexto, L-ASNases provenientes de leveduras se destacam como alternativa, por

serem mais próximas às congêneres humanas. A Antártica ainda é um ambiente pouco

explorado, com grande diversidade de microrganismos com potencial para a produção

de moléculas biológicas de interesse industrial. Nesse contexto, 150 leveduras isoladas

de amostras de sedimento marinho coletadas na Península Antártica como parte do

projeto MICROSFERA (PROANTAR/CNPq) foram avaliadas para a produção de L-

ASNase. A triagem resultou em 9 isolados produtores, dos quais 7 pertencem ao gênero

Leucosporidium. A linhagem L. muscorum CRM 1648 foi a que produziu mais enzima

(540 U.L-1

), com maior produtividade (5,6 U.L-1

.h-1

) e, por isso, foi alvo deste estudo. A

análise univariada de fontes de carbono e nitrogênio indicou maior crescimento desse

microrganismo e produção de L-ASNase em meio CD com extrato de levedura, prolina

e sacarose. Ureia, cloreto de amônio e sulfato de amônio resultaram em baixa ou

nenhuma produção da enzima, sugerindo que a metabolização de fontes de nitrogênio

por essa linhagem está sob a influência do fenômeno de repressão catabólica pelo

nitrogênio (RCN). Dois delineamentos experimentais do tipo fatorial completo

resultaram em um aumento de 10 vezes na produção e produtividade da enzima (4582,5

U.L-1

e 63,6 U.L-1

.h-1

, respectivamente). A análise univariada da concentração inicial de

inóculo (X0), pH inicial do meio, temperatura e adição de água do mar mostrou que a

melhor condição para a produção foi: pH = 5,5 ou 6,5, cultivo a 15°C com adição de

água do mar (25-50% m/v). A variável X0 não foi significativa nas concentrações

avaliadas. Cultivos em biorreator (batelada) foram conduzidos em quatro diferentes

níveis de oxigênio dissolvido (OD): (1) OD não controlado e abaixo de 20%, (2) OD

não controlado e acima de 20%, (3) OD controlado em 80% e (4) OD controlado em

20%. Os resultados mostraram que OD é fator limitante para o crescimento de L.

muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase por essa levedura e deve ser mantido

acima de 35% para maior produção da enzima.Neste trabalho, a composição do meio e

condições de cultivo foram estabelecidas para favorecer a produção de uma nova L-

ASNase livre de atividade glutaminásica por levedura adaptada ao frio, abrindo espaço

para novos estudos acerca de seu potencial antileucêmico e possível uso como

alternativa às enzimas já existentes no mercado no tratamento de LLA.

Palavras-chaves: L-asparaginase; Leucosporidium muscorum; leveduraadaptada ao

frio; leucemia linfoblástica aguda; Antártica; biorreator; delineamento experimental;

oxigênio dissolvido.

ABSTRACT

FREIRE, R.K.B. L-asparaginase production by the yeast Leucosporidium muscorum

CRM 1648 isolated from marine sediments collected in Antarctic Peninsula. 2019. 147f.

Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo,

São Paulo, 2019.

L-asparaginase (L-ASNase) is an enzyme with interesting properties for medical,

pharmaceutical and food industry, which has received special consideration, especially

in Brazil, for being part of lymphoproliferative disorders treatment, such as acute

lymphoblastic leukemia (ALL). Bacterial enzymes are on the market since the 1970s

and face some limitations related to theirserious adverse reactions that reach almost

80% of all patients in treatment. In this context, L-ASNases from yeasts are highlighted

as important alternative to bacterial enzymes, due to the closerphylogeny to human

congeners. Antarctic environment has much to be explored, with a vast diversity of

microorganisms with potential to produce biomolecules with industrial interest. A total

of 150 yeasts isolated from Antarctic marine sediments as part of MICROSFERA

project (PROANTAR/CNPq) were evaluated for L-ASNase production. The screening

resulted in 9 producers, 7 species from the genus Leucosporidium. L. muscorum CRM

1648 was the strain that yielded the highest L-ASNase activity (540 U.L-1

) and

volumetric productivity (5.6 U.L-1

.h-1

). Carbon and Nitrogen sources were evaluated by

a method of one-factor at a time (OFAT). From the gather results, sucrose, yeast extract

and proline resulted in a maximal growth and highest enzyme production.The absence

or low production of L-ASNase in medium with urea, ammonium chloride and

ammonium sulfate suggests the presence of nitrogen catabolic repression (NCR).

Carbon and nitrogen concentration were evaluated by full factorial design and yielded

about ten times higher enzyme and volumetric productivity (4582.5 U.L-1

and 63.6 U.L-

1.h

-1, respectively). Initial inoculum concentration (X0), initial pH, temperature and

concentration of seawater in the culture were evaluated by OFAT analysis and the best

condition for L-ASNase production was: pH = 5.5 or 6.5, at 15 °C with addition of

seawater (25-50 wt%). X0 was not considered a significant variable. Bioreactor assays

(in batch regime) were performed in four different dissolved oxygen (DO) levels: (1)

without DO control (DO remained under 20%), (2) without DO control (DO remained

above 20%), (3) DO controlled at 80%, and (4) DO controlled at 20%.The results

showed that DO is a key factor for growth of L. muscorum CRM 1648 and production

of L-ASNase by this yeast and should be maintained above 35% for higher production

of this enzyme.At this work, the medium and culture conditions were established to

support the production of a novel glutaminase-free L-ASNase by a cold adapted yeast,

opening a new path for further studies regarding its antileukemic potential and possible

use as an alternative for ALL treatment.

Keywords: L-asparaginase; Leucosporidium muscorum; cold-adapted yeast; acute

lymphoblastic leukemia; Antarctica; bioreactor; experimental design; dissolved oxygen.

18

INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

Produção de L-asparaginase no Brasil: uma necessidade urgente

Desde a década de 70, quando a enzima L-asparaginase (L-ASNase) de

Escherichia coli foi extraída, purificada e introduzida no protocolo de tratamento de

pacientes com leucemia linfoblástica aguda (LLA), a taxa de sobrevida aumentou

sensivelmente e hoje é em torno de 80-90% (PIETERS et al., 2011; KATO; MANABE,

2018). Combinada com esteróides, vincristina e, às vezes, antraciclina nas etapas

iniciais do tratamento, essa enzima se tornou um produto terapêutico de grande

importância para a erradicação completa das células leucêmicas (KATO; MANABE,

2018), ainda que apresente limitações quanto à estabilidade no soro e possa causar

hipersensibilidade em 3-78% dos pacientes (apud NARTA et al., 2007).

Mais recentemente, outras L-ASNases de origem bacteriana foram lançadas no

mercado, uma forma peguilada proveniente da forma nativa de E. coli e outra nativa,

proveniente da espécie Erwinia chrysanthemi (reclassificada como Dickeya dadantii, de

acordo com GRENIER et al 2006). No Brasil, no entanto, a única formulação liberada

para tratamento de LLA pela ANVISA é a nativa de E. coli. Além disso, o Brasil não é

um país de fabricação de biofármacos, muito pelo contrário, costuma importar esse tipo

de medicamento. Por depender da importação de L-ASNase, em 2013 o país sofreu

problemas no seu abastecimento pela empresa fornecedora Bagó, que descontinuou a

comercialização de Elspar®, fórmula de L-ASNase inicialmente fabricada pela Merck

Sharp & Dohme (MSD) e, posteriormente, pela Lundbeck INC e OSO

Biopharmaceutical (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017).

De acordo com a Recomendação n°10/2013 do Ministério Público Federal, a

ausência de L-ASNase nos protocolos de tratamento no Brasil é um problema de saúde

pública e representaria um retrocesso de pelo menos 20 anos no tratamento de LLA

nesse país, principalmente porque dados da época (2012-2013) do INCA (Instituto

Nacional do Câncer) previam 11.500 novos casos/ano de câncer em crianças, dos quais

25% seriam de LLA e 15% de Linfoma Não Hodgkin (MINISTÉRIO PÚBLICO

FEDERAL, Recomendação n°10/2013). Embora dados atuais do INCA mostrem que no

Brasil, de 2000 a 2005, a sobrevida relativa em cinco anos de leucemia infantil tenha

resultado em 70% (INCA, 2016), na falta de L-ASNase cerca de 5 mil crianças e

adolescentes no Brasil teriam sua chance de cura comprometida (MINISTÉRIO

PÚBLICO FEDERAL, Recomendação n°10/2013).

19

Por ser a L-ASNase tão importante no protocolo de tratamento de LLA,

associada ao fato de que o Brasil ainda não produzir biofármacos e de que a enzima

Elspar® (formulação nativa de E. coli) é, dentre as formulações comerciais, aquela que

mais provoca reações imunológicas, existe uma urgente necessidade da sua produção

nacional, bem como a pesquisa de fontes alternativas dessa enzima. Por isso, desde

2013 há uma demanda do Ministério da Saúde (MS) para que o Brasil comece a

produzir L-ASNase. Recentemente, o MS adquiriu uma alternativa mais barata da

enzima, de nome comercial Leuginase®, cuja eficácia foi contestada por profissionais da

área da saúde, gerando polêmica que foi parar na mídia brasileira e resultou em sua

retirada do mercado (Fantástico, Rede Glogo, 2017). Desde então há risco de

desabastecimento dos hospitais que pode vir a comprometer o tratamento de pacientes

com LLA.

Essas questões motivaram o projeto temático (FAPESP 2013/08617-7)

Produção de L-asparaginase extracelular: da bioprospecção à engenharia de um

biofármaco antileucêmico, que propõe incentivar a pesquisa nessa área, com a

finalidade de buscar diferentes fontes produtoras dessa enzima em sua forma nativa,

bem como utilizar de ferramentas de engenharia genética para melhorar os biofármacos

que já estão no mercado ao reduzir as repostas imunológicas e, portanto, efeitos

colaterais associados ao tratamento com as L-ASNases convencionais.

Em razão de suas condições inóspitas, a Antártica tem se revelado um ambiente

bastante propício para a descoberta de novas biomoléculas com características

interessantes para a indústria. Por isso, esse ambiente foi um dos escolhidos para

rastrear microrganismos produtores de L-ASNase e este é o campo de pesquisa onde se

encaixa este trabalho.

O presente trabalho focou na seleção de uma levedura produtora de L-ASNase,

melhoramento do meio e condições de cultivo em frascos agitados e avaliação da

demanda de oxigênio dissolvido (OD) em biorreator, visto que o entendimento da

fisiologia do microrganismo produtor é essencial e compõe as primeiras etapas em um

processo industrial que visa à produção de produtos biológicos. Optou-se por explorar

apenas leveduras porque todas as L-ASNases disponíveis no mercado são de origem

bacteriana e existe a expectativa de que a enzima de origem fúngica, por sofrer

modificações pós-traducionais, possa resultar em um tratamento com menor resposta

imunológica e, logo, com mais qualidade de vida para os pacientes com LLA.

Conscientemente, espera-se que este trabalho não seja o fim, mas apenas o começo de

20

novas pesquisas tanto sobre a levedura Leucosporidium muscorum e seu potencial

biotecnológico, como acerca da enzima L-ASNase produzida por esse microrganismo.

21

I. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1. L-ASNase como agente quimioterápico

L-asparaginase, L-asparagina amidohidrolase (EC 3.5.1.1), é um importante

agente quimioterápico utilizado para o tratamento de uma infinidade de desordens

linfoproliferativas e linfomas, principalmente de leucemia linfoblástica aguda (LLA) em

crianças e jovens (NARTA et al., 2007). Clementi (1922) foi o primeiro a observar

atividade elevada dessa enzima no soro de porquinhos da índia (Cavia porcellus). Anos

mais tarde, Kidd (1953) reportaria a regressão de linfosarcomas em ratos tratados

também com o soro desse animal. Em 1961, Broome relacionaria o estudo de Kidd com

a observação feita por Clementi, concluindo que a enzima L-ASNase seria o agente

responsável pela regressão de linfosarcomas (apud NARTA et al., 2007).

A extração de L-ASNase, em quantidades suficientes para a produção industrial,

a partir do soro de porquinhos da índia envolve uma operação complicada, de forma que

outras fontes produtoras da enzima foram buscadas. Mashburn e Wriston (1964), bem

como Campbell e Mashburn (1969) reportaram a purificação de L-ASNase de

Escherichia coli e demonstraram que esta tinha potencial tumoricida similar à enzima

produzida por porquinhos da índia, com a vantagem de ser produzida mais facilmente e

por um custo mais baixo (apud NARTA et al., 2007). Dessa forma, a obtenção da

enzima a partir de sistemas mais simples, como bactérias, possibilitou a produção em

larga escala para os primeiros estudos pré-clínicos e clínicos. Desde então, L-ASNases

de diversas fontes têm sido estudadas, desde aquelas produzidas por microrganismos

procariotos como Escherichia coli (CEDAR; SCHWARTZ, 1968), Erwinia carotovora

(ROTH et al., 2013) e Pseudomonas aeruginosa (EL-BESSOUMY et al., 2004), até

organismos eucariotos, como Aspergillus terreus, roedores, primatas e plantas

(KHUMAR; SOBHA, 2012).

Uma pesquisa na plataforma PUBMED do National Center for Biotechnology

Information (NCBI) realizada dia 26 de dezembro de 2018 mostra o registro de

publicações que fazem referência a palavra “asparaginase”. Desde 1949 até os dias

atuais são quase 5.000 publicações, as quais se mostram expressivas nos primeiros anos

da década de 70, época na qual a enzima nativa de E. coli foi lançada no mercado. O

tema tornou-se evidente novamente desde 2012, como mostra a Figura 1, período no

qual o Ministério da Saúde começou a anunciar futuros problemas no abastecimento de

22

L-asparaginase e possível prejuízo no tratamento de crianças com LLA. Assim como o

Brasil, outros países foram afetados, principalmente países do norte da Áfria e Ásia.

Figura 1 – Número de publicações registradas na plataforma PUBMED do NCBI que

faz referência ao termo “asparaginase” desde 1949 até os dias atuais. Pesquisa realizada

em fevereiro de 2019.

Como essa enzima é produzida por uma vasta variedade de animais e plantas,

além de microrganismos diversos (bactérias, fungos filamentosos, leveduras,

microalgas), muitos desses trabalhos estão voltados a explorar novos nichos em busca

de microrganismos produtores de L-ASNase, já que a produção e extração dessa enzima

de plantas e mamíferos é mais demorada e complexa (DORIYA et al, 2016). A

preferência pela enzima proveniente de microrganismos se deve ao fato da produção ser

mais barata, abundante e mais simples para o aumento de escala e purificação, além

dessas enzimas serem mais estáveis e de mais fácil modificação genética quando

compara as congêneres de organismos superiores (VIMAL; KUMAR, 2017a).

L-ASNase é classificada em dois grupos: L-ASNAse tipo bacteriana e L-

ASNase tipo planta, as quais diferem estruturalmente e bioquimicamente. O tipo

bacteriano tem outra subdivisão, tipo 1 e tipo 2. As L-ASNases tipo 1 correspondem a

enzimas citosólicas que exibem baixa afinidade pelo substrato L-asparagina, enquanto

as do tipo 2 são periplasmáticas e possuem alta afinidade pelo substrato. As

formulações de L-ASNase que estão no mercado são do tipo 2, possuem estrutura

23

tetramérica composta por quatro subunidades idênticas, cada qual constituída por 326

resíduos de aminoácidos (DORIYA et al, 2016).

1.2. Estrutura e mecanismo de ação

A enzima L-ASNase age hidrolisando o grupamento amida da cadeia lateral do

aminoácido, não essencial, L-asparagina (Asn), levando à formação de ácido aspártico e

amônia (AVRAMIS, 2012), como mostra a Figura 2.

Figura 2 – Mecanismo de ação da enzima L-ASNase. Fonte: adaptado de AVRAMIS,

2012.

O aspartato resultante dessa reação sofre transaminação com α-cetoglutarato,

gerando glutamato e oxaloacetato que, em células de mamíferos, é convertido em

malato no citosol, sendo transportado para a matriz mitocondrial pelo transportador

malato-α-cetoglutarato. Em bactérias, o oxaloacetato produzido na reação de

transaminação pode ser utilizado diretamente no ciclo do ácido cítrico para a geração de

energia na forma de potencial redutor (NELSON; COX, 2014).

Em células humanas normais, a asparagina é um aminoácido não essencial, já

que pode ser sintetizada a partir de outros aminoácidos (como glutamato, glutamina e

aspartato), através de transaminases e asparagina sintetase (MARINI et al., 2017). O

modo de ação da enzima L-ASNase consiste no fato das células leucêmicas

necessitarem de elevadas quantidades do aminoácido L-asparagina para a sua

proliferação, além de não o sintetizarem em quantidades suficientes em razão de baixa

ou nenhuma capacidade de produção de asparagina sintetase (NARTA et al., 2007;

RAETZ; SALZER, 2010; KUMAR; SOBHA, 2012). Assim, para satisfazer a elevada

demanda desse aminoácido, as células leucêmicas precisariam de asparagina fornecida

24

pela dieta ou proveniente de sua biossíntese, que é limitada (KUMAR; SOBHA, 2012).

Dessa forma, a ação antineoplásica efetiva dessa enzima tem como base a necessidade

nutricional dos linfoblastos leucêmicos, uma vez que deprimem a asparagina presente

no soro, fator essencial para a síntese de proteínas, DNA e RNA, resultando em morte

celular. Uma vantagem desse tratamento é que as células saudáveis não sofrem com os

efeitos diretos das L-ASNases por serem capazes de produzir normalmente o

aminoácido L-asparagina a partir de outros aminoácidos, como já mencionado.

A enzima L-ASNase também é capaz de converter L-glutamina em ácido

glutâmico e amônia, ainda que essa reação ocorra em menor velocidade e mais baixa

afinidade pelo substrato (CHAN et al., 2014). Uma questão ainda pouco abordada e

esclarecida é se a atividade glutaminásica da enzima L-ASNase seria prejudicial ao

tratamento de LLA, já que aparentemente esta estaria associada a alguns efeitos

adversos (neurotoxicidade, principalmente), ou se essa atividade atuaria juntamente com

a atividade asparaginásica no combate a esse tipo de leucemia. Há indícios na literatura

de que glutaminases microbianas também possuem atividade antitumoral e foi reportada

a regressão completa de leucemia em camundongos tratados com L-ASNase em

condições na qual a L-glutamina circulante foi depletada (apud WADE et al., 1971). De

acordo com COVINI et al. (2012), a hidrólise de glutamina pela L-ASNase contribuiria

com os efeitos tóxicos no tratamento de LLA mas, por outro lado, seria necessária para

sustentar a depleção do aminoácido asparagina, contribuindo significativamente para a

atividade antineoplásica da enzima.

CHAN et al. (2014) avaliaram o efeito da ausência de atividade glutaminásica na

L-ASNase de E. coli comercial (Elspar®). Eles observaram que a enzima modificada

por mutagênese sítio-específica (mutante Q59L) conseguia matar as células leucêmicas

não produtoras de asparagina sintetase (ASNS negativas), mas que não tinha atividade

alguma sobre as células cancerígenas produtoras dessa enzima (ASNS positivas). Esse

resultado sugere que a ausência de atividade glutaminásica em variantes da enzima L-

ASNase poderia alcançar melhor resultado terapêutico em células leucêmicas ASNS

negativas e talvez possa ser interessante em alguns casos, já que supostamente reduziria

a toxicidade no tratamento com L-ASNase. Por outro lado, a atividade glutaminásica

continua sendo essencial para matar as células leucêmicas produtoras de asparagina

sintetase (ASNS positivas) (CHAN et al., 2014). Faltam na literatura estudos adicionais

que corroborem e se aprofundem mais nesse assunto.

25

1.3. Leucemia Linfoblástica Aguda

O termo leucemia refere-se a um grupo de doenças complexas e diferentes entre

si que afetam a produção dos glóbulos brancos (HAMERSCHLAK, 2010). Pode ser

classificada como linfoide ou mieloide, de acordo com o tipo celular afetado, e quanto

ao tempo de desenvolvimento, podendo ser de forma aguda ou crônica. A forma aguda é

caracterizada pelo aumento rápido de células imaturas no sangue, fazendo com que a

medula óssea seja incapaz de produzir células sanguíneas saudáveis (INCA, 2016). A

leucemia corresponde a aproximadamente 1/3 dos casos de câncer em crianças de 0-14

anos em todo o mundo, sendo a LLA o tipo mais freqüente (STELIAROVA-FOUCHER

et al., 2017).

De acordo com dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2018), no Brasil,

para o biênio de 2018-19 estimam-se 5.840 casos novos de leucemia em homens e

4.860 em mulheres, aproximadamente 7% de aumento em relação a estimativa para os

anos 2016-17 (INCA, 2016). Os valores atuais correspondem a um risco estimado de

5,75 casos novos a cada 100 mil homens e 4,56 para cada 100 mil mulheres. Sem

considerar os tumores de pele não melanoma, a leucemia em homens é o quinto tipo de

câncer mais frequente na Região Norte (4,17/100 mil), na Região Nordeste ocupa a

oitava posição (4,90/100 mil), nas Regiões Sudeste (5,79/100 mil) e Sul (8,67/100 mil)

ocupa a décima posição e na Região Centro Oeste (4,88/100 mil) está na décima

primeira posição. Para as mulheres, é a sexto tipo de câncer mais frequente na Região

Norte (3,29/100 mil), o nono tipo mais frequente na Região Sul (6,50/100 mil), ocupa a

décima posição na Região Nordeste (3,66/100 mil) e a décima primeira nas Regiões

Sudeste (4,86/100 mil) e Centro-Oeste (3,93/100 mil).

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) resulta na produção descontrolada de

blastos de características linfoides e no bloqueio da produção normal de glóbulos

vermelhos, brancos e plaquetas. É o tipo de câncer mais comum em crianças,

representando, aproximadamente, 25% dos cânceres diagnosticados na população com

menos de 15 anos (EGLER et al., 2016). Seu pico de incidência ocorre entre os 2 e 5

anos de idade, sendo quatro vezes mais freqüente que a leucemia mieloide aguda

(http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/inca, acesso em 22/10/2018). Nos Estados

Unidos, dos 4.000 casos de LLA diagnosticados anualmente, dois terços são em

crianças e adolescentes (LOPES et al., 2017). Nessa faixa etária, a melhora pode ocorrer

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/inca/Avaliacao_epidemiologica_das_leucemias_linfoblasticas.pdf

26

em até 80% dos casos com uma taxa de sobrevivência de 90% a depender do acesso ou

não ao tratamento.

Desde a inserção de L-ASNase no tratamento de LLA, há mais de 40 anos,

houve aumento da sobrevida dos pacientes de <10% a >80% (AVRAMIS;

PANOSYAN, 2005). Apesar desse avanço, ainda se observa recidiva em 10-25% dos

casos, principalmente após longos períodos de tratamento. No caso de pacientes na fase

da adolescência e adultos jovens, entre 15-39 anos e diagnosticados com LLA, o

tratamento não tem sido tão favorável, embora a literatura sugira aumento substancial

da sobrevida de jovens adultos tratados com protocolos similares aos pediátricos,

inclusive com L-ASNase (EGLER et al., 2016).

1.4. Tratamento de LLA

O tratamento completo da LLA deve considerar a idade do paciente, a

imunofenotipagem, a citogenética, a contagem inicial de glóbulos, as condições clínicas

e o envolvimento ou não do sistema nervoso, testículos e gânglios, e é realizado com

quimioterapia. Os pacientes necessitam ser tratados assim que o diagnóstico é

confirmado e o objetivo inicial é a remissão com restauração da produção normal de

glóbulos vermelhos, brancos e plaquetas (HAMERSCHLAK, 2010).

No Brasil, o tratamento da LLA também se dá com a combinação de várias

drogas. É importante a escolha adequada do melhor esquema de tratamento e sua

sequência para garantir as melhores chances de cura aos pacientes. A escolha do

esquema quimioterápico deve ser feita com base na idade, quadro clínico, resultados

laboratoriais e resposta ao tratamento inicial. A presença de fatores prognósticos

desfavoráveis ou recidiva de doença deve dirigir a abordagem do paciente para

tratamentos mais agressivos, incluindo o transplante de medula óssea nas suas diversas

modalidades (HAMERSCHLAK, 2010).

O tratamento de LLA consiste em quatro fases ou blocos, cada uma composta

por um coquetel de medicamentos, a fim de evitar resistência ao tratamento. São elas

indução da remissão, consolidação, reindução e manutenção ou continuação, com uma

duração total de tratamento de 2 a 3,5 anos, com terapia intensiva após os primeiros 6 a

9 meses (EGLER et al., 2016). O primeiro bloco de quimioterapia dura de 4 a 6

semanas e tem como objetivo induzir a remissão completa do câncer, a qual pode

ocorrer em até 90% dos casos (COOPER et al., 2015). O tratamento nessa fase inclui,

dentre outras drogas, L-ASNase que é também utilizada na segunda fase do tratamento

27

(consolidação), com duração de 4 a 8 meses e que serve de terapia preventiva para

eliminar doenças subclínicas do sistema nervoso central (EGLER et al., 2016). Esse

medicamento, que é um biofármaco, desde que começou a ser utilizado há

aproximadamente 50 anos, permanece como um dos mais importantes agentes no

tratamento de LLA (MARINI et al., 2017). Sua importância pode ser estimada em

termos de seu valor de mercado, cuja contribuição fica em torno de 40 % em relação ao

total de enzimas que são produzidas atualmente para uso médico (VIMAL; KUMAR,

2017a). Foi estabelecido por estudos em macacos Rhesus e humanos que o nível de

atividade enzimática de L-ASNase deve ser ≥ 0,1 U/mL para adequada depleção do

aminoácido asparagina (MARINI et al., 2017).

Atualmente três formas de L-ASNase estão disponíveis no mercado para

tratamento de LLA: a forma nativa obtida da linhagem bacteriana Escherichia coli K12,

de nome comercial Elspar®, Merck & CO (JAFFE et al., 1971); a sua forma peguilada

(PEG-ASNase), que possui uma ligação covalente com metoxi-polietileno glicol, m-

PEG (PASUT; VERONESE, 2012), comerciamente denominada Oncaspar® (Enzon

Pharmaceuticals, Inc.); e a L-asparaginase obtida da linhagem bacteriana Erwinia

chrysanthemi, denominada crisantaspase e comercialmente chamada de Erwinase®,

EUSA Pharma Inc (KEEGAN et al., 2011). As diferentes formulações apresentam

diferenças em relação à atividade, afinidade pelo substrato (Km), peso molecular, tempo

de meia vida, ponto isoelétrico (PI), resultando em asparaginases com diferentes

propriedades, toxicidade e eficácia (Tabela 1).

Tabela 1 – Propriedades das L-ASNases disponíveis comercialmente. Fontes: ABUD,

2005 e NARTA et al., 2007.

E. coli Erwinia chrysanthemi

nativa Nativa peguilada

atividade específica (U.mg-1

) 280-400 280-400 650-700

KM (µM)-L-asparaginase 12 12 12

KM (µM)-L-glutaminase 3000 3000 1400

massa molecular (kDa) 141 145 138

ponto isolelétrico (PI) 5 5 8,7

tempo de meia-vida (dias) 1,24 ± 0,17 5,73 ± 3,24 0,65 ± 0,13

28

Dois mecanismos de resistência ao tratamento com L-ASNase têm sido

propostos. O primeiro refere-se ao aumento dos níveis de produção de asparagina

sintetase pelas células leucêmicas, de forma que elas conseguem ser auto-suficientes na

produção do aminoácido Asn; o outro mecanismo seria a produção de anticorpos anti-

asparaginase que neutralizariam a enzima impedindo a sua ação enzimática (EL-

GHONEMY, 2014).

Aprovada pela FDA (do inglês, Food and Drug Administration) em 1978, a

forma nativa de E. coli é a mais imunogênica (RIZZARI et al., 2013). Sua degradação

pelas proteases lisossomais catepsina B e asparaginil endopeptidase resulta na

inativação e exposição de epítopos, com consequente ativação da resposta imune

(OFFMAN et al., 2011). Essa resposta pode ser sintomática, com sinais de

hipersensibilidade clínica, ou assintomática, quando está associada com o aparecimento

de anticorpos neutralizantes, efeito conhecido por “inativação silenciosa”, resultando

em declínio rápido dos níveis de atividade enzimática (COVINI et al., 2012). Um

estudo com 154 crianças com LLA mostrou que, após 29 dias do início do tratamento,

aproximadamente 35% das crianças tratadas com L-ASNase de E. coli desenvolveram

anticorpos anti-asparaginase, dos quais 56% apresentaram sintomas clínicos e 44%

apresentaram inativação silenciosa (RIZZARI et al., 2013). A estimativa é que pelo

menos 10% dos pacientes tratados com L-ASNase desenvolvem inativação silenciosa

durante a terapia (MARINI et al., 2017).

A forma peguilada foi aprovada pelo FDA em fevereiro de 1994 como a segunda

linha de tratamento para pacientes com LLA sensibilizados pela formulação nativa de E.

coli (PIETERS et al., 2011). Essa formulação reduz a imunogenicidade da proteína,

aumentando sua estabilidade no plasma, tem meia vida mais longa e pode ser

administrada a doses mais baixas e intervalos mais longos (apud EL-GHONEMY,

2014).

Por outro lado, além de também induzir a inativação silenciosa, é comprovada a

existência de reação-cruzada entre anticorpos desenvolvidos nos pacientes previamente

tratados com L-ASNase nativa e PEG-ASNase, não sendo recomendada neste caso a

mudança de uma para outra (PIETERS et al., 2011).

A alternativa quando há reação a alguma das formulações de E. coli é substituí-

la por crisantaspase, aprovada em 2011 pelo FDA para utilização em segunda ou

terceira linha de tratamento de LLA (KEEGAN et al., 2011). Embora a crisantaspase

não apresente reação-cruzada com os outros dois tipos, ainda pode induzir reações

29

alérgicas em um terço dos pacientes (PIETERS et al., 2011; RIZZARI et al., 2013).

Além disso, apresenta meia vida biológica menor e maior neurotoxicidade do que as

outras asparaginases de E. coli (OFFMAN et al., 2011). De acordo com a literatura, os

efeitos neurotóxicos são atribuídos à atividade de glutaminase, que é de

aproximadamente 2% para E. coli e de 10% para E. chrysanthemi (PIETERS et al.,

2011; AVRAMIS, 2012).

Dessa forma, a imunogenicidade continua sendo uma problemática na utilização

de L-ASNase no protocolo de tratamento de LLA. Atribuída à forma tetramérica da

enzima e, sobretudo, à presença de agregados nas formulações, reflete um sistema de

produção ineficiente que tem prejudicado a aprovação dessas preparações (PIETERS et

al., 2008). Por essa razão, a elucidação das propriedades dessa enzima, bem como a

busca por novas fontes e condições otimizadas de cultivo, poderão contribuir para o

desenvolvimento de um biofármaco antileucêmico que não possua as limitações

presentes nas formulações já existentes no mercado.

1.5. Outras aplicações da enzima L-ASNase

Apesar da enzima L-ASNase ser mais conhecida e explorada como agente

quimioterápico, possui outras propriedades interessantes para a indústria médica e

veterinária que, inclui o tratamento de doenças infecciosas, autoimunes, câncer em cães

e gatos (VIMAL; KUMAR, 2017a).

Bactérias patogênicas do gênero Streptococcus, por exemplo, durante aderência

a células hospedeiras, libera toxinas (estreptolisinas) que induzem o estresse celular e,

por consequência, o aumento dos níveis de asparagina sintetase e produção do

aminoácido asparagina, que está envolvida com a expressão aumentada de genes da

proliferação dessa bactéria (BARUCH et al., 2014). L-ASNase age bloqueando a

proliferação do patógeno, de forma que esse estudo sugere o uso terapêutico dessa

enzima contra esse tipo de infecção (VIMAL; KUMAR, 2017a; BARUCH et al., 2014).

Outra área de aplicação para essa molécula, cujo interesse tem sido crescente, é

na indústria de alimentos, como agente mitigante da acrilamida (VIMAL; KUMAR,

2017a; ALAM et al., 2018). Alguns alimentos ricos em amido quando fritos ou

aquecidos em temperatura elevada (acima de 120°C) liberam acrilamida. Ela é

resultante da reação de Maillard que ocorre entre os grupos carbonil dos açúcares

redutores e o grupamento amino do aminoácido asparagina, que estão presentes nesses

alimentos (VIMAL; KUMAR, 2017a; ALAM et al., 2018; QESHMI et al., 2018). O uso

30

da asparagina como agente mitigante da acrilamida é importante porque a acrilamida é

neurotóxica e classificada como agente carcinogênico (MEDEIROS et al., 2012). Há

duas marcas de L-ASNase no mercado lançadas com esse propósito, para atender a

indústria de alimentos: Acrylaway® e PreventASe®. Alimentos industrializados como

biscoitos, salgadinhos, batata frita, cafés, cereais e torradas quando pré-tratados com

Acrylaway® apresentaram redução de 50 a 90% dos níveis de acrilamida (VIMAL;

KUMAR, 2017a). No entanto, existe demanda do mercado para buscar novas fontes de

L-ASNase, com propriedades desejáveis para a indústria de alimentos, como

estabilidade em ampla variedade de pH e temperaturas, elevada taxa de conversão de

substrato, baixo Km (elevada especificidade pelo substrato) e alto Kcat (elevada

eficiência catalítica) para reduzir o tempo dessa etapa no processo industrial (VIMAL;

KUMAR, 2017a).

1.6. Em busca de alternativas às L-ASNases convencionais

Estratégias têm sido desenvolvidas com o intuito de melhorar a estabilidade das

L-ASNases, aumentar a meia vida e reduzir a imunogenicidade dessas enzimas.

Inicialmente, foram propostas modificações químicas como forma de ocultar epítopos

expostos na estrutura proteica dessa enzima, imunologicamente ativos e capazes de

estimular as reações de hipersensibilidade (NARTA et al., 2007). A proposta mais

conhecida nesse sentido resultou no desenvolvimento da forma peguilada da enzima

(ABUCHOWSKI et al., 1979). Outra alternativa seria eliminar os epítopos

imunodominantes por mutagênese sítio-específica. OFFMAN et al. (2011), através de

estudos de modelagem e dinâmica molecular com L-ASNase nativa de E. coli,

mostraram que a substituição de um único aminoácido pode bloquear a clivagem dessa

enzima por proteases presentes no soro, mantendo ou melhorando a sua atividade

enzimática.

Além do melhoramento das L-ASNases já existentes no mercado, muito estudos

têm apostado na busca por outras fontes da enzima. Um exemplo são as L-ASNases

produzidas por bactérias termofílicas, as quais possuem a vantagem de serem mais

estáveis em temperaturas elevadas (PRITSA; KYRIAKIDIS, 2001; BANSAL et al.,

2012); produzidas por bactérias do gênero Rhizobium (HUERTA-SAQUERO et al.,

2013); Yersinia pseudotubercullosis (POKROVSKAYA et al., 2012); actinobactérias

(KHAMNA et al., 2009; MEENA et al., 2015b; SAXENA et al., 2015); Erwinia spp.

(KOTZIA; LABROU, 2007); Pectobacterium spp. (KUMAR et al., 2010); linhagens de

31

Bacillus (ALRUMMAN et al., 2019; ERVA et al., 2018; GHOLAMIAN et al., 2013;

HYMAVATHI et al., 2010); Pseudomonas aeruginosa (GECKIL et al., 2006) e

Zymomonas mobilis (EINSFELDT, 2014).

Embora as L-ASNases bacterianas continuem sendo as mais estudadas, alguns

trabalhos têm apontado o interesse por fontes eucarióticas (leveduras e fungos

filamentosos) em razão dessas células realizarem diversas modificações pós-

traducionais (glicosilação, fosforilação, acilação, metilação, formação de pontes

dissulfeto) que podem estar relacionadas à estabilidade proteica e ao mascaramento de

sítios imunogênicos. Dessa forma, a busca por fontes eucarióticas de L-ASNase poderia

resultar em uma enzima que produzisse menos efeitos colaterais em humanos

(SHRIVASTAVA et al., 2015).

Microrganismos eucarióticos como fungos filamentosos do gênero Aspergillus,

Penicillium e Fusarium, são comumente reportados na literatura como produtores de L-

ASNase (da ROCHA et al., 2019; CACHUMBA et al., 2019; COSTA-SILVA et al.,

2018a; VALA et al., 2018; KUMAR; SOBHA, 2012), além de Trichosporon asashii

(ASHOK et al., 2019) e espécies endofíticas (SILVA et al., 2018). Também já foi

registrada a produção de L-ASNase por microalgas das espécies Spirulina maxima (El

BAKY; El BAROTY, 2016) e Chlorella vulgaris (EBRAHIMINEZHAD et al., 2014).

Há poucos trabalhos abordando a pesquisa de L-ASNases produzidas por

leveduras. KRISHNAPURA et al. (2015) citam em seu artigo de revisão alguns

trabalhos nesse sentido, de produção de L-ASNase por Rhodosporidium toruloides,

Candida guilliermondii e S. cerevisiae, todos eles trabalhos muito antigos da década de

80. RAMAKRISHNAN; JOSEPH (1996) reportaram a caracterização de uma L-

ASNase de Rhodosporidium toruloides, sugerindo que esta seria um homodímero (e não

um tetrâmero, como são as de origem bacteriana), com uma subunidade de massa

molecular de 87 kDa, e kM 1,43 mM para asparagina e 6,45 mM para glutamina, com

atividade ótima em pH 6,35 e temperatura de 37ºC (RAMAKRISHNAN; JOSEPH,

1996). Esse trabalho traz a possibilidade de que novas estruturas moleculares da enzima,

menores que os seus congêneres bacterianos, possam ser menos imunogênicos e, por

isso, uma alternativa interessante no tratamento de LLA.

LOPES et al. (2017) também relatam em seu artigo de revisão a produção de L-

ASNase pelos mesmos gêneros já citados aqui, em publicações também antigas. Uma

busca no banco de dados do PUBMED (acesso em Janeiro de 2019) mostrou as

seguintes referências, mais recentes, sobre a produção de L-ASNase por leveduras

32

(Tabela 2): produção heteróloga de ASP3 de S. cerevisiaepor P. pastoris (FERRARA et

al., 2006; 2010; GIRÃO et al., 2016), produção de L-ASNase em biorreator por

linhagem de Candida utilis (MOMENI et al., 2015) e a produção dessa enzima pela

levedura Yarrowia lipolytica (DARVISHI et al., 2019). A tese de MOGUEL (2018) traz

resultados sobre a produção de L-ASNase de linhagem de L. scotti, levedura isolada de

sedimentos marinhos coletados na Antártica. Alguns métodos de rompimento celular

foram avaliados utilizando a linhagem L. muscorum CRM 1648, alvo do presente

trabalho, mostrando que os métodos mecânicos, principalmente rompimento por pérolas

de vidro e sonicação, foram mais eficientes para a recuperação de L-ASNase (COSTA-

SILVA et al., 2018b). Esses e todos os trabalhos que envolvem o tema estão

referenciados na Tabela 2 a seguir.

Tabela 2 – Referências encontradas na literatura relacionadas à produção de L-ASNase

por espécies de leveduras.

Taxonomia Referências

Candida utilis KIL et al., 1995; MOMENI et al., 2015

Candida guilliermondii STEPANYAN; DAVTYAN, 1988

Pichia polymorpha FODA et al., 1980

Rhodosporidium toruloides RAMAKRISHNAN; JOSEPH, 1996

Rhodotorula sp. FODA et al., 1980

Saccharomyces cerevisiae FERRARA et al., 2006 e 2010; GIRÃO et al., 2014 e 2016

Leucosporidium scotti MOGUEL, 2018

Leucosporidium muscorum COSTA-SILVA et al., 2018b

Yarrowia lipolytica DARVISHI et al., 2019

Portanto, ainda há muito a ser explorado entre as leveduras que, por serem

organismos eucarióticos e apresentarem as vantagens já citadas anteriormente em

relação a sistemas procarióticos, apresentam grande perspectiva de uso para a produção

de biofármacos, como a L-ASNase. Dessa forma, a pesquisa desses microrganismos em

diversos nichos traz uma perspectiva para encontrar uma L-ASNase com ação

antileucêmica e, ao mesmo tempo, menos imunogênica que as congêneres disponíveis

no mercado.

33

1.7. Produção de L-ASNase em biorreator

A produção de L-ASNase é feita principalmente por cultivo submerso (em meio

líquido), embora também haja relatos na literatura de produção em meio sólido por

fungos filamentosos do gênero Aspergillus. (CACHUMBA et al., 2019; DUTTA et al.,

2015) e Trichoderma viride (ELSHAFEI; EL-GHONEMY, 2015), pela bactéria

Myroides gitamensis (PRASAD TALLURI et al., 2019) e actinobactérias do gênero

Streptomyces (BASHA et al., 2009). As vantagens da produção submersa é que esta é

bem estabelecida, a manipulação dos componentes do meio é mais simples, não requer

pré-tratamento do substrato, além do controle dos parâmetros físicos (pH, OD e

temperatura) e purificação do produto serem realizados mais facilmente do que na

fermentação em estado sólido (VIMAL; KUMAR, 2017a).

A otimização do processo de produção tem papel importante na indústria

biotecnológica por melhorar os rendimentos e produtividade do processo sendo,

portanto, decisiva para o sucesso comercial do produto (KUMAR et al., 2017). O

melhoramento do processo é feito por meio da manipulação dos nutrientes e das

condições do processo (pH, temperatura, tempo de cultivo, concentração inicial do

inóculo, agitação) utilizando metodologias de análises estatísticas.

Uma das técnicas mais simples e mais utilizada é a análise univariada (OFAT,

do inglês one-factor at a time), na qual é avaliado um fator por vez, pela variação dos

níveis do fator em estudo (FUKUDA et al., 2018). Essa metodologia, por não conseguir

avaliar a interação entre os fatores, costuma ser associada a técnicas de Delineamento

Experimental (DoE) que se divide em: técnicas de rastreamento dos fatores (variáveis

independentes – x) que são ou não significativos para as respostas avaliadas (variáveis

dependentes – y), como por exemplo o estudo fatorial completo de dois níveis ou

fracionado e Plackett-Burmann; e técnicas de otimização, como Box-Behnken,

delineamento composto central (CCD, do inglês Central Composite Design) e fatorial

completo de 3 níveis (FUKUDA et al., 2018). Como mostra o Apêndice A, as análises

mais utilizadas para o melhoramento do processo de produção de L-ASNase de

diferentes origens têm sido até então a análise univariada, o CCD e o fatorial completo

e/ou fracionado.

A otimização do meio e condições de cultivo enfrentam alguns limites, pois

ainda é possível melhorar a produtividade e o rendimento do processo caso aumente a

capacidade de produção (volume de meio) e crie condições apropriadas de oxigenação

34

em um sistema que permita o controle e monitoramento dos parâmetros principais,

como a aeração, agitação, pH e o oxigênio dissolvido. Por essa razão, a etapa seguinte

ao melhoramento dos parâmetros nutricionais e de cultivo em frascos agitados é o

cultivo em biorreator. O tipo de processo mais utilizado para cultivo em biorreator e

produção de L-ASNase é a batelada (cultivo descontínuo) seguida pela batelada

alimentada (descontínuo alimentado), como sugere o Apêndice A.

Ao analisar as publicações nos últimos 5 anos envolvendo o termo em inglês

“asparaginase production” (Apêndice A), realizada no banco de dados do PUBMED e

no Google Acadêmico, observa-se que os grupos que mais tem publicado estão

localizados no Brasil e, principalmente, na Ásia e Sudoeste da África (Índia, Irã e

Egito). Bactérias e fungos filamentosos são os grupos de microrganismos que mais têm

sido explorados para a produção dessa enzima. Além disso, é possível encontrar

organismos produtores de L-ASNase em nichos diversos ao redor do mundo, desde

solo, rizosfera a ambiente marinho. As fontes de carbono e de nitrogênio utilizadas para

produção dessa enzima variam muito de acordo com o microrganismo utilizado na

produção, mas parece existir uma tendência maior no uso de glicose como fonte de

carbono e asparagina como fonte de nitrogênio (Apêndice A).

A bactéria Pectobacterium carotovorum foi detectada como produtora de uma

L-ASNase livre de atividade glutaminásica e cultivada em biorreator com 1,5 litros de

volume útil, por 12 horas, em cultivo descontínuo e descontínuo alimentado, utilizando

um meio com glicose e asparagina como fontes principais de carbono e nitrogênio, pH

controlado em 8,6, a 30°C, com cascata de agitação variando de 160 a 600 rpm, aeração

de 1,5 vvm e OD de 20% da saturação com ar. Nessas condições, a bactéria foi capaz de

produzir, aproximadamente, 40 U.mL-1

da enzima, valor duas vezes maior do que o

obtido nos cultivos em batelada (KUMAR et al., 2017).

Fungo filamentoso da espécie Aspergillus terreus foi cultivado em meio Czapek-

Dox contendo glicose e prolina como fontes de carbono e nitrogênio em cultivo

descontínuo com 5 litros de volume útil, pH 9,5, sendo cultivado a 35°C e aeração de

0,5 vvm, obtendo uma produção final aproximada de 14 U.g-1

de massa seca celular

(COSTA-SILVA et al., 2018a).

A levedura Yarrowia lipolytica foi avaliada quanto a produção de L-ASNase, em

um processo descontínuo, utilizando meio Czapek-Dox, pH inicial igual a 7,0, com

glicose e asparagina como fontes de carbono e nitrogênio. Essa levedura foi cultivada

por 24 horas em um biorreator de 5 litros a 29°C, 500 rpm e 1 vvm de aeração,

35

produzindo 210 U.mL-1

da enzima, valor 12 vezes maior do que o obtido em frascos

agitados (DARVISHI et al., 2019).

A levedura Candida utilis foi cultivada em biorreator (cultivo descontínuo) com

melado de beterraba e extrato de levedura como fontes de carbono e nitrogênio, pH

ajustado para 7,0 e temperatura de 30°C. A produção de L-ASNase foi máxima e igual a

245,6 U.mL-1

com 20 horas de cultivo sob agitação controlada em 300 rpm e aeração de

1,25 vvm (MOMENI et al., 2015).

Mais raramente, a produção de L-ASNase foi feita em cultivo contínuo. Bactéria

da espécie Zymomonas mobilis foi cultivada em biorreator com 0,3 litros úteis de meio

contendo sacarose, asparagina e extrato de levedura como fontes de carbono e

nitrogênio, a 30°C, em modo descontínuo até atingir a fase exponencial, quando o

sistema passou a ser alimentado continuamente. A maior produção (117 U.L-1

) ocorreu

em uma taxa de diluição igual a 0,20 h-1

(MENEGAT et al., 2016).

Os métodos de quantificação da enzima são variados e os mais utilizados,

segundo o Apêndice A, é o Método de Nessler, seguido pelo método de L-aspartil-β-

hidroxâmico, este último sendo utilizado com bem menos freqüência do que o primeiro.

O problema do uso do método de Nessler é que, por quantificar indiretamente a enzima

L-ASNase através da amônia que é liberada da reação de hidrólise da asparagina, pode

superestimar a atividade enzimática em razão da presença de interferentes no caldo de

cultivo (proteínas que, ao serem metabolizadas, liberam amônia). Os resultados de

produção da enzima são expressos em diferentes unidades, em unidades totais da

enzima (U), unidades por volume de cultivo (U.mL-1

ou U.L-1

), unidades por massa seca

de células (U.g-1

ou U.mg-1

) ou unidades da enzima por mg de proteínas totais (U.mg-1

).

Essas diferenças acabam dificultando a análise comparativa da produção de L-ASNase

entre os diversos microrganismos estudados.

1.8. Leveduras da região Antártica

As leveduras são microrganismos eucarióticos que habitam quase todos os

ambientes terrestres, inclusive ambientes onde ficam expostas permanentemente a

temperaturas abaixo de 5 °C (CARRASCO et al., 2016). Mais de 80% da biosfera da

Terra é permanentemente ou periodicamente exposta a essas temperaturas baixas, o que

incluem mares profundos (90% dos oceanos apresentam temperaturas < 5 °C), desertos

gelados e regiões glaciais, como o ambiente Ártico e Antártico (BUZZINI et al., 2012;

TSUJI et al., 2013).

36

O primeiro registro de vida microbiana em um ambiente frio data de 400 anos

AC, em escritos do filósofo grego Aristóteles que mostravam a descrição do que depois

descobriram ser um organismo fotossintético que deixava a neve avermelhada

(DEMING, 2009). Apenas em 1887 o cientista germânico Forster descreveria a

capacidade de uma bactéria reproduzir-se a 0 °C e em 1902 seria cunhada a

terminologia psicrófilo por Schmidt-Nielsen para descrever microrganismos com tal

comportamento (DEMING, 2009).

A definição clássica utilizada para classificar organismos adaptados ao frio se

baseia nos parâmetros cinéticos de crescimento em diferentes temperaturas, de acordo

com o qual o termo psicrófilo é reservado a organismos que podem crescer em

temperatura abaixo ou igual a 0°C e cujas temperaturas ótima e máxima para

crescimento são ≤ 15°C e ≤ 20°C, respectivamente. Aqueles que podem crescer a 0 °C

e cuja máxima temperatura de crescimento pode estar acima de 20 °C são denominados

psicrotolerantes ou psicrotróficos (MORITA, 1975).

Embora até hoje esses termos sejam ainda os mais utilizados, foi proposto o uso

do termo estenopsicrófilo para o grupo que inclui os psicrófilos estritos ou obrigatórios,

e euripsicrófilo, para o grupo que inclui os organismos psicrófilos ou psicrotróficos

facultativos (WANG et al., 2017). Essa definição leva em consideração que, em

ambientes frios, o que diferencia um grupo do outro não é a temperatura ótima e

máxima de crescimento, mas sim a extensão da faixa de temperatura em que o

microrganismo é capaz de crescer (RUSSELL, 2006). A maioria dos microrganismos

recuperada de amostras das regiões Ártica e Antártica são psicrófilos euritérmicos,

justamente porque a temperatura do solo nessas regiões pode sofrer grandes variações,

de 30 a 40 °C (RUSSELL, 2006).

1.8.1. Interesse biotecnológico

A região Antártica, situada no polar austral, é a porção mais ao sul da Terra, com

uma área correspondente a 14 milhões Km2, o que faz da Antártica o quinto maior

continente do mundo (TSUJI et al., 2013; SHIVAJI; PRASAD, 2009).

Aproximadamente 98% dessa região da Terra é coberta por gelo e neve, com

temperaturas na região costeira que variam de 5 a -35 °C (TSUJI et al., 2013).

O estudo de microrganismos provenientes da Antártica tem atraído o interesse de

pesquisadores desde 1960 em razão das condições climáticas severas, onde predominam

o frio extremo, ciclos de congelamento/descongelamento, alta salinidade, exposições

37

excessivas a luz UV alternadas com longos períodos de escuridão e baixa

disponibilidade de nutrientes (apud DUARTE et al., 2013; apud BUZZINI et al., 2012;

di MENNA, 1958). Desde então, espécies de bactérias, leveduras e fungos filamentosos

tem sido isoladas de diversos habitats na Antártica, como solo, gelo, liquens,

macroalgas, esponjas, sedimento marinho, água do mar, plantas briófitas e

angiospermas (Deschampsia antarctica e Colobanthus quitensis) e biofilmes (VAZ et

al., 2011; DUARTE et al., 2013; TSUJI et al., 2013; DUARTE et al., 2016;

CARRASCO et al., 2016; MARTORELL et al., 2017; INFORSATO, 2017; WENTZEL

et al., 2018; FERREIRA et al., 2019). Foram identificadas aproximadamente 70

espécies de leveduras provenientes da Antártica, sendo 13 do filo Ascomycota e 57 do

filo Basidiomycota (BUZZINI et al., 2012). Aparentemente 90% das leveduras isoladas

na Antártica e em regiões de clima frio pertencem ao filo Basidiomycota, sendo que

desse grupo espécies dos gêneros Cryptococcus, Candida, Rhodotorula e Mrakia são

mais comumente reportadas (CARRASCO et al., 2012; MARTORELL et al., 2017;

DUARTE et al., 2018).

Estudos têm mostrado que a capacidade de microrganismos crescerem em

temperaturas tão baixas e condições tão adversas estaria associada a ajustes estruturais e

fisiológicos, adaptações evolutivas para amenizar a redução das reações químicas

devido às baixas temperaturas (de GARCIA; van BROOCK, 2016; FELLER, 2013;

D’AMICO et al., 2002). Entre os mecanismos de adaptação estão a modificação de

lipídeos de membrana, com maior presença de ácidos graxos insaturados ou

poliinsaturados, que aumenta a fluidez da membrana; a síntese de proteínas termo-

protetoras (proteínas de choque-frio) e de crioprotetores, reduzindo a presença de

cristais de gelo no citoplasma; e desenvolvimento de mecanismos de proteção contra

espécies reativas de oxigênio (FELLER, 2013; de GARCIA; van BROOCK, 2016). A

produção de enzimas hidrolíticas extracelulares, por exemplo, seria uma forma de

adaptação já que, com essas enzimas é possível aproveitar as fontes de carbono

disponíveis no ambiente, contribuindo para o reciclo de nutrientes e mineralização da

matéria orgânica (apud BUZZINI et al., 2012; apud CARRASCO et al., 2016). Além

disso, também é relatada a produção de outras enzimas de adaptação ao frio e proteínas

anticongelantes, que controlam a formação de cristais de gelo, evitando danos físicos na

estrutura da célula (TSUJI et al., 2013).

O efeito da temperatura sobre as reações químicas é descrito pela equação de

Arrhenius k = Ae-Ea/RT

, onde k é a constante da reação, A é uma constante para cada

38

sistema, relacionada à colisão das moléculas, EA é a energia de ativação (energia

mínima requerida para que uma reação se inicie), R é a constante universal dos gases e

T é a temperatura absoluta em Kelvin. Por essa reação percebe-se que qualquer redução

na temperatura provoca uma redução exponencial na velocidade de reação. Para superar

esse efeito, os psicrófilos e psicrotolerantes sintetizam enzimas com maior eficiência

catalítica, pelo aumento do seu poder catalítico (kcat) ou da redução de sua afinidade

pelo substrato (Km) ou ainda pela mudança em ambos os parâmetros (D’AMICO et al.,

2002; FELLER, 2013), como mostra a Figura 3.

Figura 3 – A atividade enzimática em relação a temperatura. A atividade das enzimas

psicrófilas (círculo vazio) α- amilase (gráfico esquerdo) e celulase (gráfico direito) e

seus correspondentes mesófilos (círculo cheio). Fonte: Adaptado de Feller (2013).

O aumento do poder catalítico dessas enzimas pode ser até 10 vezes maior a

baixas (e moderadas) temperaturas do que por seus homólogos mesófilos (FELLER;

GERDAY, 2003). Isso é possível em razão dessas enzimas apresentarem uma estrutura

mais flexível no sítio catalítico, que permite fazer e desfazer interações não covalentes,

tornando-as mais ou menos ativas (FELLER, 2013). Essas propriedades fazem com que

as enzimas adaptadas ao frio sejam altamente promissoras do ponto de vista

biotecnológico, pois aceleram o tempo de processos realizados a temperaturas

baixas/moderadas, reduzem a concentração enzimática requerida, resultam em alta

produtividade nas reações com componentes termo-sensíveis, previnem transformações

químicas indesejáveis e a perda de compostos voláteis e ainda diminuem os gastos com

energia elétrica (MARGESIN et al., 2003).

39

A produção de enzimas psicrófilas – amilases, lipases, proteases, celulases,

pectinases, β-gluconidades, esterases – tem sido reportada em leveduras e diferem dos

similares produzidos por outros microrganismos (HAMID et al., 2014; CARRASCO et

al., 2016). Amilases ativas no frio e celulases possuem alto potencial de aplicação em

processos que requerem baixas temperaturas, como os requeridos na indústria de

alimentos, biocombustíveis e detergentes (apud CARRASCO et al., 2016).

A triagem de microrganismos isolados a partir de amostras coletadas nas Ilhas

Shetland do Sul, na Antártica, produtores de lipases, proteases e xilanases, revelou a

presença de 21 espécies de leveduras dos filos ascomicota e basidiomicota, entre elas as

mais abundantes foram Candida glaebosa, Cryptococcus victoriae, Meyerozyma

(Pichia) guilliermondii, Rhodotorula mucilaginosa e R. laryngis (DUARTE et al.,

2013). Entre as leveduras avaliadas nesse estudo, 46,4%, 37,1% e 14,4% foram capazes

de produzir lipases (a 15 °C), xilanases (a 15 °C) e proteases (a 25 °C), respectivamente.

Uma protease ácida produzida pela levedura isolada de ambiente marinho na

Antártica, Rhodotorula muscilaginosa, foi purificada e caracterizada (LARIO et al.,

2015). Essa enzima apresentou características interessantes como ótima atividade

catalítica em pH 5,0 e temperatura de 50 °C, além de ser estável em altas concentrações

salinas.

Um total de 226 microrganismos (60 fungos filamentosos e 166 leveduras)

isolados de amostras de sedimento marinho, coletadas próxima a Estação Antártica

Comandante Ferraz (EACF), estação brasileira localizada na Ilha Rei George (Antártica

marítimica) foram avaliados quanto a produção de lipases e proteases. A levedura da

espécie Metschnikowia australis foi a mais abundante na região e a que apresentou

maior atividade lipolítica (0,88 U.mL-1

), enquanto o fungo filamentoso do gênero

Pseudogymnoascus apresentou a maior atividade proteolítica (6,21 U.mL-1

) entre os

isolados avaliados (INFORSATO, 2017).

Enzimas pectinolíticas são utilizadas para a degradação de compostos de pectina

nas indústrias de processamento de frutas e vegetais (apud HAMID et al., 2014). Essas

enzimas produzidas por leveduras psicrófilas Candida capitatum e R. muscilaginosa

exibiram 50-80% de sua atividade catalítica ótima em pH 3-5 e temperaturas de 6 e 12

°C, propriedades estas interessantes para a indústria de vinhos e clarificação a baixas

temperaturas (SAHAY et al., 2013). Além disso, pectinases psicrófilas têm potencial

para manter valores nutricionais, sabor e características sensoriais, propriedades

importantes na indústria de alimentos (NAKAGAWA et al., 2002).

40

Uma linhagem de Leucosporidium scotti, também isolada da Península

Antartica, foi avaliada e mostrou capacidade para a produção de L-ASNase e de

acumular lipídios mono e poliinsaturados, ao ser cultivada em substratos de baixo custo,

como sacarose e glicerol (MOGUEL, 2018). Seu cultivo em biorreator resultou em

produtividade de 36,9 U.L-1

.h-1

dessa enzima em condições otimizadas de cultivo (15

°C, X0: 5 g.L-1

; pH 7,0; 48 h; kLa: 89-92 h-1

). Esse trabalho apontou que L-ASNases

advindas desse gênero de levedura tem potencial terapêutico, com uma eficiência

catalítica próxima a da congênere de E. coli e mais elevada que a congênere de S.

cerevisiae, indicando que as L-ASNases de espécies de Leucosporidium sp. possam

apresentar propriedades interessantes para a indústria farmacêutica e de alimentos.

1.8.2. Leucosporidium muscorum

Do reino Fungi, filo Basidiomicota e família Leucosporidiales, a espécie

Leucosporidium muscorum já teve outras denominações, entre elas: Candida muscorum,

Azymocandida muscorum, Rhodotorula muscorum, Leucosporidiella muscorum e

Vanrija muscorum (www.mycobank.org, acesso em: 10/01/19). Foi primeiramente

isolada de solo de floresta na Ilha de Chatham, localizada aproximadamente a 800 km a

Leste da Ilha Sul de Nova Zelândia, também denominada Ilha Te Waipounamu (di

MENNA, 1958). Também foi registrado o isolamento dessa espécie de levedura em

pequenas poças no glacial de Midre Lovénbreen, localizado em Spitsbergen, território

ártico da Noruega (PATHAN et al., 2010); de musgos em decomposição do tipo

Sphagnum, coletados na Nova Zelândia (SAMPAIO et al., 2003; GARCÍA et al., 2015);

de esponja marinha nas proximidades da Baia Fildes, na Ilha do Rei George (LAICH et

al., 2014); e de sedimentos marinhos próximo as bases brasileira e peruana na Baia do

Almirantado (INFORSATO, 2017), local de onde vieram as amostras utilizadas neste

trabalho.

Quando cultivada em agar Sabouraud, apresenta colônia cremosa e de coloração

creme ou amarelada, célula ovóide ou cilíndrica (2,5-4) x (7-19) µ (di MENNA, 1958).

Essa espécie foi avaliada em diferentes temperaturas (25, 30, 35, 37, 40, 42 e 45°C),

mas não houve crescimento em temperatura acima de 25 °C

(http://www.westerdijkinstitute.nl/collections, acesso em 12/11/18). Outro trabalho

mostrou que essa levedura é capaz de crescer a 4, 22 e 25 °C, mas não a 30 °C

(PATHAN et al., 2010). O mesmo trabalho mostra que L. muscorum consegue crescer

em meio com alta concentração de sais (≤ 4,0 % de NaCl, m/v) e foi capaz de produzir

http://www.mycobank.org/


41

urease, pectinase e amilase, quando cultivadas a 8°C e 22°C, mas não produziu

proteases, celulases, nem lipases nas condições avaliadas (PATHAN et al., 2010). Por

outro lado INFORSATO (2017) avaliou 170 isolados da Antártica e observou que um

isolado da espécie L. muscorum foi aquele que mais produziu protease.

Aparentemente, a espécie L. muscorum não realiza fermentação e assimila as

seguintes fontes de nutrientes: D-glicose, L-sorbose, D-xilose, D-arabinose, sacarose,

maltose, trealose, celobiose, rafinose, glicerol, manitol, D-gluconato, succinato, citrato,

nitrato, nitrito, cadaverina, lisina, creatinina, D-galactose, D-glucosamina, D-ribose e

lactose (KURTZMAN; FELL, 1998). De acordo com di MENNA (1958), a assimilação

de galactose e lactose é mais fraca. Parte desses testes foi avaliado e confirmado em

outro trabalho (LAICH et al., 2014). O seu principal mecanismo de adaptação ao frio

parece estar associado a elevada concentração de ácidos graxos insaturados presentes

em sua membrana celular (PATHAN et al., 2010; GARCÍA et al., 2015).

Figura 4 – Imagem de células em microscópio e morfologia da colônia de linhagem de

L. muscorum. Fonte: http://www.westerdijkinstitute.nl/collections, acesso em 12/12/18.


42

II. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Avaliar a capacidade de crescimento e produção de L-ASNase por leveduras

isoladas de amostras de sedimentos marinhos coletados na Península Antártica,

especialmente pela linhagem Leucosporidium muscorum CRM 1648, em condições

diversas de cultivo em frascos agitados e em biorreator.

2.2. Objetivos específicos

2.2.1 Rastrear e selecionar leveduras produtoras de L-ASNase isoladas na

Antártica (seleção qualitativa).

2.2.2 Avaliar a produção de L-ASNase por esses microrganismos e selecionar o

melhor produtor (seleção quantitativa).

2.2.3 Avaliar as melhores fontes de carbono e de nitrogênio para o crescimento e

produção da enzima pela levedura L. muscorum CRM 1648.

2.2.4 Avaliar por delineamento experimental a melhor combinação entre as

fontes de carbono e nitrogênio selecionadas na etapa anterior para o melhoramento da

produção de L-ASNase.

2.2.5 Avaliar as melhores condições de cultivo (concentração inicial do inóculo,

pH inicial, temperatura e presença de água do mar) para a produção de L-ASNase e

crescimento de L. muscorum CRM 1648.

2.2.6 Avaliar em biorreator (cultivo descontínuo) o crescimento de L. muscorum

CRM 1648 e a produção de L-ASNase em situações de baixa e alta disponibilidade de

oxigênio dissolvido.

43

III. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Leveduras isoladas de sedimento marinho na Antártica

As linhagens de leveduras utilizadas neste trabalho foram isoladas de amostras

de sedimentos marinhos coletadas na fase IV da OPERANTAR XXXIII, em Janeiro de

2015, pelo grupo de pesquisa da Profa. Dra. Lara Sette (UNESP, Rio Claro-SP), no

âmbito do projeto MICROSFERA, edital PROANTAR/CNPq, coordenado pela prof.

Dra. Vivian Pellizari, IO/USP, São Paulo-SP (INFORSATO, 2017). A coleta foi

realizada na Baia do Almirantado, na Ilha Rei George, localizada na Península Antártica

(Figura 5). Neste trabalho foram utilizados 150 isolados, cujas fontes e locais de coleta

estão listados na Tabela 3 e apontados na Figura 5.

Tabela 3 – Informações sobre a espécie, material de origem e local de coleta dos

isolados identificados neste trabalho como produtores de L-ASNase.

código do

isolado espécies material de origem local de coleta (dado GPS)

1 Leucosporidium

muscorum

sedimento marinho

(zona entre marés)

Refugio 2

(62˚ 04.341'S 58˚ 25.233'W)

2 L. muscorum sedimento marinho Botany Point

(62˚ 05.734'S 58˚ 19.919'W)

16 L. muscorum sedimento marinho

(zona entre marés)

Refugio 2

(62˚ 04.341'S 58˚ 25.233'W)


(zona entre marés)

Refugio 2

(62˚ 04.341'S 58˚ 25.233'W)


(zona entre marés)

Refugio 2

(62˚ 04.341'S 58˚ 25.233'W)

86 L. muscorum sedimento marinho Refugio 2

(62˚ 04.373'S 58˚ 25.335'W)


(zona entre marés)

Refugio 2

(62˚ 04.341'S 58˚ 25.233'W)

74 Glaciozyma antarctica sedimento marinho EACF

(62˚ 05.130'S 58˚ 23.356'W)

17 G. antarctica sedimento marinho EACF

(62˚ 05.130'S 58˚ 23.356'W)

EACF: Estação Antártica Comandante Ferraz, base brasileira de pesquisa.

44

Figura 5 – Mapa da Baia do Almirantado, localizada na Ilha do Rei George, Península

Antártica. Os números no mapa da Baia do Almirantado (A) indicam os lugares onde as

amostras foram coletadas. 1. Refúgio 2; 2. EACF (Estação Antártica Comandante

Ferraz, base brasileira de pesquisa); 3. Botany Point. Fontes: (A) cedida pelo grupo de

pesquisa da Profa. Dra. Lara Sette (UNESP/Rio Claro); (B) acesso no Google Maps; e

(C) adaptada de ANDRADE et al., 2015.

45

3.2. Preservação das linhagens

As linhagens foram preservadas por ultracongelamento em freezer a -80 °C,

conforme a literatura (HUNTER-CEVERA; BELT, 1996; KIRSOP; DOYLE, 1991).

Para cada isolado, uma colônia foi semeada em meio sólido inclinado ágar Sabouraud e,

após 72 horas de crescimento em estufa a 15 °C, foi adicionada a cada tubo solução de

glicerol (10% v/v). As células foram ressuspendidas nessa solução e a suspensão foi

aliquotada em microtubos de 1,5 mL. Por fim, as alíquotas foram pré-resfriadas por 20

minutos a - 20°C, tendo-se o cuidado de evitar o congelamento da suspensão e,

consequentemente, a formação de cristais que possam danificar as células do

microrganismo. Esse resfriamento tem a função de permitir que o crioprotetor envolva

inteiramente as células, aumentando a sua ação de proteção. Após esse tempo de pré-

resfriamento, os microtubos foram mantidos em ultrafreezer (- 80°C).

3.3. Meios de cultivo

Neste trabalho foi utilizado caldo Sabouraud para preservação e ativação dos

isolados; ágar Sabouraud para a manutenção das linhagens; e meio Czapek Dox (CD)

(SAXENA; SINHA, 1981), para crescimento e produção de L-ASNase (Tabela 4). Este

último meio também serviu como base para a avaliação de diversas fontes de carbono e

nitrogênio. Os componentes dos meios foram esterilizados em autoclave (120 °C, 15

minutos). Os elementos traços do meio CD foram preparados a parte em uma solução

concentrada 50 vezes, esterilizados e mantido resfriado. Dados da literatura (SAXENA;

SINHA, 1981) mostram que a asparagina é utilizada para substituir o aminoácido

prolina no meio CD, mas optou-se por utilizar este último em razão desta fonte de

nitrogênio ter se mostrado melhor para a produção de L-ASNase em testes realizados

pelo grupo (MOGUEL, 2018; COSTA-SILVA et al., 2018a). Após o preparo do meio, o

pH foi ajustado para 5,5, utilizando-se soluções de NaOH e HCl (0,5 M cada).

46

Tabela 4 – Meios de cultivo utilizados para a preservação, manutenção e crescimento de

leveduras isoladas da Antártica

Meio Finalidade

Concentração (g.L-1

)

DEC

glic

ose

prol

ina

saca

rose

extra

to d

e le

vedu

ra

KCl

KH 2

PO4

MgS

O 4 *

7 H 2

O

CU

NO 3

*3H 2

O

ZnSO 4

*7H 2

O

Fe(S

O 4) 2

*7H 2

O

agar

Meio Finalidade

Caldo

Sabouraud

preservação

e ativação10 20 - - - - - - - - - -

Agar

Sabouraudmanutenção 10 20 - - - - - - - - - 15

CDcrescimento

e produção- 2 10 - - 0,52 1,52 0,52 0,001 0,001 0,001 -

CDMcrescimento

e produção- - 20 20 5 0,52 1,52 0,52 0,001 0,001 0,001 -

CD – Czapek Dox (SAXENA; SINHA, 1981); CDM – Czapek Dox Modificado (neste trabalho); DEC –

digestivo enzimático de caseína.

3.4. Condições de cultivo em frascos agitados (shaker)

Uma alíquota de 1 mL de criopreservado foi descongelada e inoculada em meio

caldo Sabouraud Dextrose. O isolado cresceu por 72 horas em frascos agitados, com

defletores, a 15 °C e 250 rpm. Após esse período, o caldo foi centrifugado (3220g, 10

minutos, 25 °C) e lavado duas vezes com água destilada estéril para a remoção do meio.

As células foram inoculadas em meio líquido CD (meio de produção), com densidade

óptica inicial (DO600) igual a 0,2. O volume de pré-inóculo transferido para o meio de

produção foi calculado conforme a equação 1:

(Eq. 1)

Sendo Ci a concentração inicial (absorbância do pré-inóculo), Vi o volume

inicial (volume de pré-inóculo a ser transferido para o meio de produção), Cf a

concentração final no meio de produção (DO = 0,2) e Vf o volume final (50 mL).

As amostras foram coletadas a cada 24 horas por até 4-5 dias para análise de

crescimento celular e produção de L-ASNase.

3.5. Seleção dos isolados produtores de L-ASNase

Para avaliar a produção da enzima L-ASNase, as 150 leveduras foram pré-

cultivadas em placas de 96 poços contendo caldo Sabouraud Dextrose por 72 horas, a

47

15 °C e sob agitação de 300 rpm. As placas foram seladas com BreathSeal, adesivo que

permite trocas gasosas com o meio externo sem que haja contaminação. Palitos estéreis

foram utilizados para inocular cada isolado, um a um, por poço, conforme distribuição

apresentada na Figura 6.

Figura 6 – Distribuição de cada cepa e dos brancos (amostras sem microrganismo) em

placas de 96 poços para pré-inóculo e produção.

Foram denominadas “Branco” (B) as amostras contendo apenas o meio de

cultivo estéril, para controle de contaminação das placas. Após 72 horas de crescimento,

uma alíquota de cada isolado foi transferida para outra placa (obedecendo a ordem

estabelecida na Figura 6) contendo meio CD. Os isolados foram então cultivados por

mais 120 horas, a 15 °C e agitação de 800 rpm. Após esse período, cada isolado foi

avaliado qualitativamente para a produção da enzima L-ASNase pelo método

colorimétrico L-aspartil-β-hidroxâmico (ver metodologias analíticas, item 3.11.3). O

critério de seleção foi a intensidade da coloração vermelha, após revelação com cloreto

férrico.

As leveduras identificadas como produtoras nesta etapa foram cultivadas em

volumes maiores (50 mL), utilizando para isso frascos de 250 mL com defletores.

Foram feitos dois blocos, em um deles foi adicionado azul de bromotimol (0,007%)

para inferir a produção de L-ASNase através da mudança de pH e, consequentemente,

da coloração do meio de cultivo, que se torna azul quando básico. Para isso, foi utilizada

a metodologia proposta por MAHAJAN et al. (2013). O azul de bromotimol é um

indicador de pH que em meio ácido, como é o caso do meio CD (pH = 5,5), é

alaranjado, enquanto em meio básico, torna-se azul. Como a produção de L-ASNase e

consequente degradação de asparagina resulta em amônia e, portanto, aumento do pH, a

48

mudança de coloração dos meios para a cor azul é indicativo da produção da enzima de

interesse. Meios CD não inoculados e sem fonte de nitrogênio (prolina) foram utilizados

como controle.

O outro bloco foi cultivado conforme já descrito (item 3.4). Alíquotas foram

retiradas de cada frasco a cada 24 horas durante 5 dias para avaliação quantitativa do

crescimento e da produção de L-ASNase. A partir dessa fase, foi escolhido um isolado

para dar continuidade ao trabalho e o critério de escolha foi a produção da enzima alvo.

O melhor produtor foi taxonomicamente identificado como pertencente a espécie

Leucosporidium muscorum e depositado na Central de Recursos Microbianos da

UNESP (CRM-UNESP) sob o código de acesso CRM 1648.

3.6. Análise univariada de fontes de carbono

Sete fontes de carbono (glicerol, sacarose, xilose, extrato de levedura, sorbitol,

frutose, além de glicose) foram avaliadas na composição do meio CDM com o intuito

de observar qual desses nutrientes teria impacto mais positivo sobre o crescimento da

levedura e produção de L-ASNase. Os demais componentes do meio foram mantidos

nas mesmas concentrações já descritas (Tabela 4). As fontes de carbono e concentrações

utilizadas estão descritas na Tabela 5. A prolina foi mantida como fonte de nitrogênio

em todas as análises. O cultivo foi feito em triplicata, conforme já descrito (item 3.4).

Tabela 5 – Fontes de carbono e respectivas concentrações (C) em g.L-1

de cada fonte

avaliada no meio CD para crescimento da levedura alvo e produção de L-ASNase.

Fonte C (g.L-1

)

1 glicose 2,0

2 glicerol 2,0

3 sacarose 2,0

4 xilose 2,0

5 extrato de levedura 2,0

6 sorbitol 2,0

7 frutose 2,0

3.7. Análise univariada de fontes de nitrogênio

Este ensaio foi feito como o ensaio anterior, mas manteve-se a glicose como

fonte de carbono, variando a fonte de nitrogênio. Foram avaliadas 9 fontes de

49

nitrogênio: asparagina, glutamina, cloreto de amônio, sulfato de amônio, ureia,

casaminoácidos, acetato de amônio, extrato de levedura e prolina (Tabela 6).

Tabela 6 – Fontes de nitrogênio e respectivas concentrações (C) em g.L-1

de cada fonte

avaliada no meio CD para crescimento da levedura e produção de L-ASNase.

Fonte C (g.L-1

)

1 asparagina 10,0

2 glutamina 10,0

3 prolina 10,0

4 cloreto de amônio 10,0

5 sulfato de amônio 10,0

6 ureia 10,0

7 casaminoácidos 10,0

8 acetato de amônio 10,0

9 extrato de levedura 10,0

3.8. Avaliação da interação de fontes nutricionais por delineamento fatorial completo

para melhoramento do crescimento e produção de L-ASNase

A fim de avaliar as possíveis interações e efeitos sinérgicos entre as variáveis

que melhor favoreçam o crescimento da levedura selecionada e produção da enzima L-

ASNase, foi utilizado um planejamento experimental do tipo fatorial completo 33 com

27 ensaios e 4 replicações no ponto central. Os dados foram gerados e analisados pelo

programa Minitab® 17, sendo X1 (sacarose), X2 (extrato de levedura) e X3 (prolina) as

variáveis independentes selecionadas nas análises univariadas anteriores, e avaliadas em

três níveis (-1, 0, +1), conforme Tabela 7.

Tabela 7 – Fatores e níveis avaliados em delineamento fatorial completo (I) para

melhoramento do crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase.

Fatores níveis (g.L

-1)

-1 0 1

X1 5 10 15

X2 0 5 10

X3 5 10 15

50

Com base nos resultados do delineamento anterior, foi estruturado um segundo

planejamento experimental, também do tipo fatorial completo 33, para a maximização

das respostas. Neste novo planejamento, o ponto central do planejamento anterior

passou a ocupar o nível -1 (Tabela 8). Os experimentos 1, 2, 4, 5, 10, 11, 13 e 14 não

foram repetidos nesta etapa em razão de terem sido realizados na etapa anterior. Foram

realizadas 4 repetições no ponto central.

Tabela 8 – Fatores e níveis avaliados em delineamento fatorial completo (II) para

melhoramento do crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase.

Fatores níveis (g.L

-1)

-1 0 1

X1 10 15 20

X2 5 10 15

X3 10 15 20

As respostas avaliadas Y1 e Y2, massa seca celular (g.L-1

) e produção de L-

ASNase (U.L-1

), respectivamente, foram analisadas pelas seguintes equações, que

incluem todos os termos de interações, sem considerar a significância.

3.9. Análise univariada das condições de cultivo: temperatura, pH inicial,

concentração celular inicial (X0) e concentração de água do mar no meio

A levedura L. muscorum CRM 1648 foi pré-cultivada em caldo Sabouraud

dextrose e transferida para o meio de produção, conforme já descrito (item 3.4). Czapek

Dox modificado (CDM) foi utilizado como meio de produção. Foram avaliados em

blocos separados as seguintes variáveis: temperatura, pH inicial do meio, concentração

de água do mar e a concentração inicial do inóculo (X0), com a finalidade de avaliar o

efeito de cada uma dessas variáveis sobre o crescimento da levedura e produção de L-

ASNase. As temperaturas avaliadas foram: 9, 12, 15, 18, 21 e 30°C; pH inicial: 6,5, 5,5

51

e 4,5; concentração de água do mar: 0, 25 e 50% do volume total de meio (50 mL); e

X0: 0,5; 1,0 e 1,5 g.L-1

. Cada condição foi feita em triplicata.

3.10. Ensaios em biorreator

3.10.1. Preparo do biorreator

Todos os experimentos em biorreator foram realizados no modelo BIOSTAT®

B-MO (Figura 7), do fabricante Sartorius, equipado com sonda de temperatura, pH e de

O2 dissolvido (OD). Ao equipamento está acoplado também um analisador de gases (O2

e CO2), que permite detectar as porcentagens dos gases no gás de saída da dorna.

Assim, é possível ter a informação a respeito do O2 consumido e CO2 produzido ao

longo do cultivo, além de permitir a medição, regulação e avaliação online de

temperatura, aeração, agitação, volume de meio ou qualquer substrato, ácido, base ou

antiespumante que seja adicionado ao cultivo, pH e OD no meio. Os parâmetros e

variáveis foram registradas a cada minuto pela unidade de controle.

Figura 7 – Biorreator BIOSTAT®

B-MO em uso para cultivo de L. muscorum CRM

1648 e produção de L-ASNase.

A sonda de pH foi calibrada antes da esterilização da dorna, utilizando dois

pontos de calibração: uma solução tampão onde pH = 7,0, seguida de outra solução

tampão (pH = 4,0). Após montagem e esterilização do biorreator (121 °C, 1 atm, 30

minutos), o sensor de O2 foi conectado ao equipamento e polarizado por no mínimo 3

horas nas condições de máxima agitação e aeração a ser utilizada no experimento. Após

esse período, a sonda de O2 foi calibrada também por uma calibração de dois pontos. O

52

ponto 0 (0% de OD) foi obtido pela desconexão do conector da sonda de O2 com a

unidade de controle, enquanto o ponto 100 (100% de OD) foi obtido pela reconexão

desta mesma sonda com a unidade de controle, estando o meio de cultivo saturado com

ar.

3.10.2. Ensaios em biorreator: condições de cultivo e oxigênio dissolvido

Para os cultivos em biorreator foi utilizado o meio CDM. O pré-inóculo foi feito

como já descrito (item 3.4). As células foram centrifugadas (3220g, 10 minutos, 25 °C),

ressuspendidas em meio CDM e uma alíquota dessa suspensão celular foi transferida

para um frasco de 250 mL contendo 100 mL de meio CDM estéril, conforme equação 1

(item 3.4). Esse volume foi inoculado na dorna de forma asséptica, sendo X0 igual a 1

g.L-1

e Vf igual a 1 litro (volume útil do biorreator).

Durante o cultivo microbiano, o oxigênio gasoso foi transferido para o meio de

cultivo através de ar aspergido, mas em algumas situações foi necessária a adição de

oxigênio puro. O balanço gasoso foi calculado de acordo com a relação de transferência

de O2 para o meio de cultivo (OUR, do inglês Oxygen Uptake Rate) e produção de CO2

(CER, do inglês Carbon Dioxide Evolution Rate), através das medidas de fração molar

gasosa que são obtidas pelo analisador de gases acoplado a saída de ar do biorreator. A

relação do consumo de O2 e produção de CO2 é denominada Coeficiente Respiratório

(RQ, do inglês Respiratory Coefficient). Dessa forma, o balanço gasoso foi feito

conforme as equações:

Onde,

RQ: coeficiente respiratório

OUR: velocidade de consumo de O2 dissolvido (mmol O2.L-1

.h-1

)

CER: velocidade de produção de CO2 (mmol CO2.L-1

.h-1

)

QO2: velocidade específica de respiração (mmol O2.g-1

.h-1

)

53

X: concentração de células na dorna (g.L-1

)

V: volume de meio de cultivo (L)

: fluxo de gás (mmol.h-1

) de entrada (Φe) ou saída (Φs).

y: Fração molar de entrada (ye) ou saída (ys) de O2 (Eq. 4) ou CO2 (Eq. 5)

O fluxo de ar de saída (Φs) foi calculado supondo que o fluxo de gases inertes,

basicamente nitrogênio, não varia na entrada e saída de ar. Dessa forma, Φs foi

calculado conforme equação a seguir:

Sendo que, no caso do gás de entrada ser ar, a expressão (1 – yO2e – yCO2e)

corresponde a 0,7901.

No cultivo descontínuo, durante a fase Lag (fase em que as células ainda estão

em adaptação, ou seja, X = X0 e não há reprodução celular) e na fase de transição da

fase Lag para a fase de crescimento exponencial, o valor de X é muito baixo e há pouco

consumo de oxigênio pelas células, ou seja, QO2 é mínimo. Durante o cultivo, X

aumenta e o mesmo ocorre com QO2 (aumenta a demanda respiratória por célula), que

atinge o seu valor máximo na fase exponencial, quando a velocidade específica de

crescimento (µ) é máxima.

Em razão do sistema de transferência de O2 ser muito importante em um sistema

aeróbico de cultivo, como é o caso do empregado neste trabalho, foi avaliado qual seria

a demanda de oxigênio dissolvido (OD) pela levedura L. muscorum CRM 1648 que

permitiria maior crescimento e produção da enzima L-ASNase, visto que não foram

encontrados trabalhos na literatura que tragam informações a respeito da fisiologia

desse microrganismo. As condições avaliadas foram: Ensaio 1 - sem controle de OD

(OD < 20%), Ensaio 2 - sem controle de OD (OD > 20%), Ensaio 3 – OD controlado

em 80% e Ensaio 4 – OD controlado em 20%. Em todos os ensaios foi adicionado

previamente no meio de produção 2 mL de antiespumante.

O Ensaio 1 (OD não controlado e < 20%) foi realizado a 15 °C, 500 rpm e

controle do pH através da adição de HCl (20%) e NaOH (20%) para mantê-lo igual a

5,5. Neste ensaio, a entrada de ar (1) foi ativada, com aeração de 1 LpM (litro de ar por

litro de meio por minuto), e a entrada de O2 puro (2) foi mantida desligada (Figura 8).

54

Os outros ensaios em biorreator (ensaios 2, 3 e 4) também foram conduzidos na mesma

temperatura, com algumas mudanças na agitação e aeração, e sem controle do pH (sem

adição de ácido e base) porque foi observado após o ensaio 1 que este parâmetro

poderia interferir na produção de L-ASNase.

O Ensaio 2 (OD não controlado e > 20%) foi conduzido com cascata de agitação

variando de 200 a 1200 rpm e aeração com ar puro e igual a 1 LpM (entrada de O2 puro

desligada, conforme ensaio anterior). No entanto, como o aumento da agitação para o

máximo programado (1200 rpm) não foi suficiente para evitar a queda de OD ao longo

do tempo, a aeração foi alterada para 1,5 LpM após 20 horas de cultivo. Os parâmetros

de agitação e aeração utilizados neste ensaio não foram capazes de controlar OD, mas

este se manteve acima de 20%.

O Ensaio 3 (OD controlado em 80%) foi conduzido com agitação constante de

600 rpm, aeração de 1 LpM com ar puro e cascata de adição de oxigênio (O2) puro à

linha de ar variando de 0 a 60% (porcentagem do tempo de abertura da válvula de O2).

Nesse ensaio, as entradas 1 e 2 estão ligadas, permitindo o incremento do ar com O2

puro (Figura 8). Para controlar OD, o equipamento foi programado para abrir a válvula

de O2 (3) sempre que OD < 80%, de forma que o ar puro seria incrementado com esse

gás de acordo com o consumo de O2 por L. muscorum CRM 1648.

O Ensaio 4 (OD controlado em 20%) foi conduzido de forma que OD se

mantivesse em torno de 20%. Para isso, no início, gás nitrogênio foi conectado à entrada

de ar (1) e à entrada de O2 puro foi conectado ar puro (2). No entanto, por problemas na

fonte de nitrogênio no início do cultivo (nas primeiras 6 horas) e na tentativa de manter

os níveis de OD dentro do planejado, a entrada de N2 foi desligada, mantendo-se apenas

pulsos de ar puro (entrada 2 ligada e entrada 1 desligada), com a abertura da válvula (3)

controlada em 0-20% (Figura 8). Quando OD atingiu um valor próximo a 20%, a

configuração do sistema foi restabelecida para o original, conforme Figura 8 (Ar na

entrada de ar e O2 na entrada de O2). Dessa forma, entradas 1 e 2 foram mantidas

ligadas, com aeração de 1LpM de ar puro e cascata de O2 puro, com abertura da válvula

controlada em 0-30%. A cascata seria acionada sempre que OD < 20%. A agitação foi

mantida em 600 rpm durante todo o ensaio. Os limites da cascata de O2 puro precisaram

ser ajustados ao longo de todo o cultivo nos ensaios 3 e 4, de acordo com o crescimento

da levedura e consumo de O2.

Em todos os ensaios, foram retiradas amostras de, aproximadamente, 12-15 mL

a cada 3, 6 ou 12 horas, a depender da fase de cultivo (no início a freqüência de coleta

55

foi maior) para a medição das seguintes variáveis: densidade óptica (DO) e massa seca

celular para avaliar o crescimento; medida de pH offline para a confirmação dos valores

obtidos de forma online; avaliação do consumo dos substratos prolina e sacarose; e

atividade enzimática de L-ASNase. Os valores das variáveis dos processos referentes

aos quatro ensaios estão registrados nos Apêndices B a I.

Figura 8 – Representação do painel de controle do biorreator BIOSTAT® B-MO e todos

os parâmetros possíveis de controle: agitação, temperatura, pH, OD, vazão de ar puro de

entrada (1) e vazão de O2 puro de entrada (2), este último controlado por pulsos de

abertura (% de tempo de abertura) da válvula de O2 (3). No início do ensaio 4 a

configuração foi modificada, conforme representado no círculo pontilhado.

3.11.Metodologias Analíticas

3.11.1.Monitoramento do pH

O pH foi medido em pHmetro de bancada (KASVI, modelo K39-1014B). O

equipamento foi calibrado antes das medições utilizando dois pontos de calibração: uma

solução tampão com pH = 7,0 e outra solução tampão com pH = 4,0.

56

3.11.2.Monitoramento do crescimento celular

O crescimento celular foi avaliado por densidade óptica e gravimetria. A medida

de densidade óptica foi realizada em comprimento de onda (λ) igual a 600 nm em

espectrofotômetro Expectra Max Plus 384. Em todas as análises utilizou-se como

“branco” o próprio meio de cultivo sem células ou água (para as amostras diluídas em

água destilada).

A concentração celular também foi avaliada pela massa seca celular

(gravimetria) e expressa em g.L-1

. Amostras de 1 a 5 mL foram centrifugadas (3220g x

5 min) em tubo previamente pesado, o sobrenadante foi removido e reservado (para as

medidas de substrato e pH), as células lavadas (duas vezes) e centrifugadas novamente.

A água foi removida com cuidado e as células foram secadas em estufa em temperatura

acima de 60 °C. O valor da concentração de biomassa em gramas por litro foi calculado

conforme equação a seguir:

(Eq. 8)

Onde,

P1 – peso do tubo vazio (g)

P2 – peso tubo com a biomassa seca (g)

V – volume de cultivo centrifugado (L)

A relação entre DO e massa seca celular (X), apresentada na Figura 9, foi

estabelecida pela equação:

(Eq. 9)

Figura 9 – Valores de densidade óptica em função de valores de massa seca celular,

sendo o R2 = 0,987.

57

3.11.3. Dosagem de atividade enzimática (L-ASNase e atividade glutaminásica)

A produção de L-ASNase e a presença ou não de atividade glutaminásica foi

avaliada pelo método do ácido L-aspartil-β-hidroxâmico, utilizando como amostra

alíquota da suspensão celular (adaptado de DRAINAS et al., 1977; FERRARA et al.,

2004). De acordo com esse método, a atividade de L-ASNase pode ser determinada de

forma indireta, pela quantificação do ácido L-aspartil-β-hidroxâmico (ou β-hidroxamato

aspártico, como mostra a Figura 10) produzido na reação de hidroxilaminólise efetuada

pela enzima L-ASNase na presença de hidroxilamina, que resulta no complexo

cromogênico -hidroxamato aspártico férrico. Esse composto dá um tom vermelho ao

meio, cuja tonalidade é mais intensa quanto maior é a sua concentração (Figuras 10 e

11).

Figura 10 – Reações químicas no método do ácido L-aspartil-β-hidroxâmico de

quantificação de L-ASNase. Fonte: adaptada de MAGRI et al, 2018.

A reação foi montada em microtubos com capacidade igual a 2 mL, onde foram

adicionados: 600 microlitros de tampão Tris-HCl 50 mM e pH 8,6, 100 microlitros de

amostra de suspensão celular, 200 microlitros de solução do substrato asparagina (0,1

M) ou glutamina (0,1 M) e 200 microlitros de solução de hidroxilamina neutralizada

com hidróxido de sódio (NaOH 2 M) em pH neutro (entre 6,8 e 7,2). Para a reação, os

microtubos “branco” e “teste” foram agitados em termoshaker a 850 rpm e 37°C

durante 30 minutos. Nos tubos “branco” a solução de hidroxilamina só foi adicionada

após o período de reação, conforme mostra a Figura 11, juntamente com uma solução de

58

TCA e cloreto férrico (100 g.L-1

FeCl3, 50 g.L-1

TCA em uma solução de HCl a 0,66M),

que também foi adicionada nos tubos “teste”. Os microtubos foram centrifugados 3220g

por 5 minutos e 1 mL do sobrenadante foi utilizado para a medição, que foi feita em

espectrofotômetro Expectra Max Plus 384, em comprimento de onda (λ) igual a 500

nanômetros (nm).

Figura 11 – Sequência de passos para a execução do teste de atividade pelo método do

ácido L-aspartil-β-hidroxâmico.

*Solução de hidroxilamina (2M) neutralizada com solução de NaOH (2M).

**10 % (p/v) FeCl3, mais 5 % (p/v) ácido tricloroacético (TCA) em solução de HCl (0,66M).

Uma unidade de atividade (L-ASNase ou atividade glutaminásica) foi definida

como a quantidade de enzima capaz de produzir 1 µmol de β-hidroxamato aspártico ou

1 µmol de ácido γ-hidroxamato glutâmico (no caso de a glutamina ser utilizada como

substrato) por minuto de tempo e por volume de amostra (MOGUEL, 2018). O valor de

produção de L-ASNase foi calculado em U.L-1

(unidade de enzima por volume de

meio). A atividade total (U) foi calculada multiplicando o valor de atividade em U.L-1

pelo volume total (v) do meio de produção.

59

3.11.4. Dosagem de sacarose

Para a dosagem de sacarose, foi utilizado o método colorimétrico GOD/invertase

(TEIXEIRA et al., 2012). Nesse método, foi adicionado 85 µL de água destilada, 5 µL

de amostra (sobrenadante das amostras coletadas nos experimentos em biorreator) e 10

µL de invertase por poço de uma placa de 96 poços. A invertase foi diluída em água até

atingir a concentração de 8000 U.mL-1

. A reação ocorreu a 55°C por 10 minutos. Nessa

etapa, a invertase atua catalisando a quebra de sacarose, formando glicose e frutose.

Após esse período, 200 µL de GOD/POD (sigla em inglês para glicose

oxidase/peroxidase) foi adicionado em cada poço e a placa foi encubada por mais 15

minutos a 37 °C. Nessa etapa, a enzima GOD catalisa a reação de oxidação de uma

molécula de glicose formando peróxido (H2O2) e ácido glucurônico. A molécula de

H2O2por sua vez reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob a ação catalisadora da

peroxidase, através de uma reação oxidativa de acoplamento formando uma

antipirilquinonimina vermelha, cuja intensidade da cor é proporcional a concentração de

glicose na amostra e no padrão (e, portanto, proporcional a concentração de sacarose). A

leitura foi feita em espectrofotômetro Expectra Max Plus 384 a 490 nm. A curva padrão

foi construída com sacarose diluída em água nas concentrações de 0,0, 0,05, 0,1, 0,15,

0,20 e 0,25% (g/100 mL), faixa onde mostrou linearidade. Cada análise foi feita em

duplicata.

3.11.5. Dosagem de prolina

A análise do consumo de prolina foi feita colorimetricamente como descrito por

ABRAHAM et al. (2010). Em microtubos de 2 mL foi adicionado 100 µL de amostra,

100 µLde ácido sulfosalicílico (solução a 3%), 200 µL de ácido acético glacial e 200 µL

de nihidrina ácida (1,25 g de nihidrina em 30 mL de ácido acético glacial e 20 mL de

ácido ortofosfórico a 6M). Os microtubos foram incubados a 96 °C por 1 hora e depois

desse período colocados em gelo para a adição de 1 mL de tolueno com o intuito de

parar a reação. As amostras foram agitadas em vortex por 20 segundos e a fase orgânica

(fase topo) foi coletada. A leitura foi feita em cubeta de vidro, no espectrofotômetro

Expectra Max Plus 384 a 520 nm.

60

3.11.6. Cálculo dos parâmetros cinéticos

Os resultados obtidos nos ensaios em biorreator referentes ao crescimento celular,

formação do produto (L-ASNase) e consumo de substratos (sacarose e prolina) foram

colocados em gráficos para a determinação dos seguintes parâmetros cinéticos:

a) velocidade específica de crescimento (µx)

Foi calculada nos ensaios em frascos agitados e biorreator a partir de dados de

biomassa. Foram utilizados os pontos da fase logarítmica de crescimento, onde a

velocidade específica de crescimento é constante e máxima (µx = µmax) (SCHMIDELL

et al., 2001).

Supondo µx constante, o valor de µmax foi calculado pela inclinação da reta

tangente resultante da representação gráfica do logaritmo natural (Ln) de X em função

do tempo. Essa relação é estabelecida pelas equações:

(Eq. 10)

Quando µx é constante, a integral da equação acima resulta em:

(Eq. 11)

b) Produtividade

O desempenho do processo de produção de células e produto (L-ASNase) foi

avaliado pela produtividade ao longo do cultivo, respectivamente, Px e Pp, calculada

conforme as equações 15 e 16, sendo o sufixo f = final e i = inicial.

(Eq. 12)

(Eq. 13)

61

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A região Antártica é conhecida pelas suas condições inóspitas, apresentando o clima

mais frio e seco da terra, além de alta salinidade, baixa precipitação e disponibilidade de

nutrientes, ciclos alternados de congelamento e descongelamento e alta irradiação UV

alternada por longos períodos de escuridão (apud DUARTE et al., 2013). Apesar do

ambiente adverso, essa região tem se revelado uma fonte de numerosos microrganismos

psicrófilos e psicrotolerantes, denominados de forma generalizada de microrganismos

adaptados ao frio, com grande capacidade metabólica para produzir uma diversidade de

substâncias de interesse industrial. Por essa razão tem sido cada vez mais comum a

triagem de biomoléculas em microrganismos isolados dessa região, inclusive em

leveduras (BUZZINI et al., 2012; DUARTE et al., 2013; LARIO et al., 2015;

CARRASCO et al., 2016).

4.1. Triagem de leveduras adaptadas ao frio produtoras de L-ASNase (avaliação

qualitativa)

A triagem de microrganismos, principalmente leveduras e fungos filamentosos,

produtores de L-ASNase normalmente é feito em meio sólido Czapek Dox (CD)

suplementado com o indicador vermelho de fenol na concentração de 0,009% (m/v) ou

azul de bromotimol a 0,007% (m/v) (MAHAJAN et al., 2013). A avaliação qualitativa

da produção de L-ASNase em meio sólido, no entanto, não foi empregada neste

trabalho porque foi observado por outros pesquisadores desse grupo de pesquisa que a

habilidade de certos fungos de produzirem L-ASNase em meio sólido pode ser diferente

da habilidade de produção em meio líquido. Essa observação também foi reportada por

LAPMAK et al. (2010).

Foram cultivadas em caldo CD, 150 leveduras de amostras isoladas de

sedimentos marinhos na Península Antártica, provenientes das regiões Refúgio 2, EACF

e Botany Point (Figura 5), em busca de produtores da enzima L-ASNase. Após 120

horas de cultivo, cada amostra foi avaliada quanto a presença dessa enzima na

suspensão celular. Nesse momento o objetivo não era fazer uma avaliação quantitativa,

mas identificar qualitativamente os produtores, conforme mostrado na Figura 12. Foi

considerado produtor da enzima aquele que assumiu a coloração vermelha no meio de

reação após a adição de cloreto férrico/TCA/HCl. Como existe relação entre a

intensidade da coloração vermelha e a produção do complexo L-aspartil-β-hidroxamato

62

com íon férrico, as amostras com coloração amarelo-alaranjada foram consideradas

negativas para a produção de L-ASNase. Os isolados 17 (placa II, B6-7) e 74 (placa I,

E7) aparentemente produziram menos que os demais (coloração rosa claro), porém os

isolados 85 (placa II, G3) e 94 (placa II, D5) foram aqueles que visualmente produziram

mais enzima, pois atingiram uma coloração vinho, bem mais escura que os demais. Esse

resultado foi confirmado posteriormente, com o cultivo em frascos agitados em maior

volume útil (50 mL), no qual foi possível avaliar a produção de L-ASNase ao longo do

tempo. Os isolados 17 e 74 foram descartados na etapa de cultivo em frascos devido a

contaminações sucessivas com fungos filamentosos.

Figura 12 – Triagem de produtores de L-ASNase entre 150 isolados da Antártica pelo

método do ácido L-aspartil-β-hidroxâmico. A maior intensidade da cor vermelha indica

maior produção da enzima.

Os isolados identificados nesta etapa como produtores da enzima alvo foram

cultivados em frascos agitados contendo meio líquido CD e azul de bromotimol

(0,007%), de acordo com a metodologia proposta por MAHAJANet al. (2013). Um

frasco com meio estéril e outro com meio CD sem prolina (fonte de nitrogênio) foram

utilizados como controle. A produção da enzima foi avaliada visualmente pela mudança

63

de coloração do meio, que se tornou azul após 72 horas de cultivo. Como azul de

bromotimol é um indicador de pH, ficando laranja em meio ácido e azul quando em

meio básico, a intensidade da cor azul indicou maior produção de L-ASNase (a reação

catalisada por esta enzima resulta na produção de amônia, que torna o meio básico). O

resultado deste cultivo (Figura 13) confirma maior produção de L-ASNase pelos

isolados 85 e 94.

Figura 13 – Resultado do cultivo dos isolados produtores de L-ASNase em meio CDM

com azul de bromotimol. Da esquerda para a direita: meio não inoculado, meio sem

fonte de nitrogênio, isolados 2, 26, 1, 16, 86, 94 e 85.

Os resultados do seqüenciamento de marcadores taxonômicos e análises

filogenéticas (INFORSATO, 2017) revelaram que os isolados 17 e 74 pertencem a

mesma espécie Glaciozyma antarctica e que os outros isolados produtores pertencem a

espécie Leucosporidium muscorum.

A morfologia das colônias dos isolados produtores (Figura 14) confirma que

todos eles apresentaram colônias de cor creme, com superfície lisa, aspecto cremoso e

textura mucoide. Nenhum desses isolados produziram pigmento em meio ágar

Sabouraud. A morfologia das colônias mostrada na Figura 14 corrobora com as

características morfológicas já descritas para a espécie tipo L. muscorum (di MENNA,

1958).

Nessa etapa do trabalho, 9 isolados (6%) foram identificados como potenciais

produtores de L-ASNase, sendo que desse total 7 (77,8%) pertencem a espécie L.

muscorum. Espécies da ordem Leucosporidiales reconhecidas como potenciais fontes

de enzimas extracelulares adaptadas ao frio e de interesse industrial tem sido isoladas

predominantemente de ambientes frios e reportadas como leveduras psicrotolerantes

(VAZ et al., 2011). O isolamento de leveduras de regiões diversas na Antártica resultou

em 89 isolados dentre os quais dois eram da espécie L. muscorum, um proveniente da

rizosfera de uma planta nativa da Antártica (Deschampsia antarctica) e o outro de

64

sedimento marinho próximo a estação Machu Picchu, na Baia do Almirantado (VAZ et

al., 2011), muito próximo ao local onde foram isoladas as leveduras utilizadas neste

trabalho.

Pode-se supor, portanto, que a espécie L. muscorum é característica de regiões

polares, de clima mais frio,por ter sido isolada até então apenasde regiões mais

próximas aos pólos (di MENNA, 1958; SAMPAIO et al., 2003; PATHAN et al., 2010;

GARCÍA et al., 2015), uma vez que não foram encontrados registros

dessemicrorganismo em regiões tropicais. Por ser essa espécie filogeneticamente

próxima a leveduras do gênero Glaciozyma spp., e dos gêneros Rhodotorula spp. e

Rhodosporidium spp. (WANG et al., 2015), que já foram identificados como produtores

de L-ASNase (RAMAKRISHNAN; JOSEPH, 1996; FODA et al., 1980; IMADA et al.,

1973), associado ao fato de que outra espécie do gênero Leucosporidium sp. também foi

identificada como produtora dessa enzima (MOGUEL, 2018),é possível haver alguma

correlação entre esse grupo de leveduras e a produção de L-ASNase, que precisa ser

melhor investigada.

Figura 14 –Morfologia das colônias dos isolados produtores.

Já foi demonstrado que a espécie L. muscorum é capaz de produzir diversas

enzimas, incluindo proteases, amilases, pectinases, urease (INFORSATO, 2017;

PATHAN et al., 2010), mas não foi identificada a produção de L-ASNase por essa

65

levedura, sendo este trabalho o primeiro a trazer essa informação. É válido registrar que

os isolados 85 e 94 são provenientes de uma mesma região (Refúgio 2, entre marés) e,

portanto, poderiam tratar da mesma linhagem, sugerindo que mesmo uma mesma

linhagem pode trazer especificidades quanto a produção de biomoléculas. O mesmo

pode-se dizer dos isolados 1, 16 e 26, também isolados de uma mesma região (tabela 3).

4.2. Perfil de produção de L-ASNase pelas leveduras selecionadas (avaliação

quantitativa) e seleção do melhor produtor

As leveduras selecionadas na etapa anterior (no total 7 isolados: 1, 2, 16, 26, 85,

86 e 94) foram cultivadas em volume maior de meio (50 mL), utilizando frascos do tipo

Erlenmeyer com defletores e 250 mL de volume total. O objetivo desta etapa foi avaliar

a produção de L-ASNase por cada isolado ao longo do cultivo e selecionar um deles,

com maior capacidade de produção da enzima, para dar continuidade às etapas

subsequentes.

O perfil de crescimento foi muito similar entre eles, mas os isolados 85 e 94

produziram 2 vezes mais do que os demais (Figura 15), com produtividade média igual

a 4,8 e 5,6 U.L-1

.h-1

em 96 horas de cultivo, respectivamente.

Como os resultados do teste quantitativo foi bem similar ao obtido

qualitativamente nas placas de 96 poços, é possível concluir que esse método de triagem

foi eficiente na seleção de microrganismos produtores de L-ASNase e vale ser

valorizado no presente trabalho, já que o uso desse tipo de metodologia para a avaliação

da produção de L-ASNase não foi previamente encontrado na literatura consultada. A

triagem normalmente é realizada em meio sólido (MAHAJAN et al., 2013) e isso tem se

mostrado um problema quando o cultivo é feito em meio líquido, pois nem sempre

aqueles que se mostram produtores em meio sólido conseguem manter a produção em

meio submerso, como já havia sido notado em nosso grupo de pesquisa (dados não

publicados).

O isolado 94 foi identificado como sendo da espécie Leucosporidium muscorum

e depositado na Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP), com o

número de acesso CRM 1648. Nessa estapa do trabalho a linhagem L. muscorum CRM

1648 foi selecionada e se tornou o microrganismo alvo deste trabalho. Esse isolado foi o

escolhido porque, apesar de ter apresentado um perfil de produção de L-ASNase muito

semelhante ao do isolado 85 até aproximadamente 85 horas de cultivo, atingiu maior

produção eprodutividade após esse período (Figura 15).

66

Figura 15 – Curva de crescimento e produção de L-ASNase por sete idolados da

Antartica.

Legenda:

Também foi avaliada apresença de atividade glutaminásica na suspensão celular

e de atividade de L-ASNase no sobrenadante. O resultado das análises indicou ausência

de atividade glutaminásica e de enzima extracelular para os 7 isolados analisados.

A avaliação de 108 cepas de Rhodotorula spp., entre as espécie R. flava, R.

rubra, R. macerans, mostrou que 30 delas apresentaram atividade de L-ASNase, 8 delas

apresentaram atividade de L-ASNase e glutaminase e que nenhuma apresentou apenas

atividade glutaminásica (IMADA et al., 1973). Linhagem de Leucosporidium scotti

produtora de L-ASNase apresentou atividade glutaminásica baixa, próxima a zero

(MOGUEL, 2018). Como já comentado anteriormente, a ausência de atividade

glutaminásica pode ter um efeito positivo no tratamento de pacientes com LLA, uma

vez que a hidrólise de glutamina por L-ASNase contribuiria com os efeitos neurotóxicos

no tratamento desse tipo de leucemia (COVINI et al., 2012), além disso, a ausência de

atividade glutaminásica em algumas variantes de L-ASNase teria melhor resultado

terapêutico em células leucêmicas ASNS negativas (CHAN et al., 2014).

A produção extracelular de L-ASNase foi identificada para leveduras da espécie

Rhodotorula rosa (ARIMA et al., 1972) e R. rubra (IMADA et al., 1973). Mais

frequentemente, a enzima produzida por leveduras parece ficar alojada no periplasma da

célula (MOGUEL, 2018; FERRARA et al., 2004). Dessa forma, é possível que a

enzima L-ASNase produzida pela levedura L. muscorum CRM 1648 seja do tipo

periplasmática.

67

4.3.Triagem e seleção de fatores nutricionais

A triagem e seleção dos componentes do meio de cultivo são importantes para

tornar o processo de produção economicamente viável, principalmente porque essa

composição é específica para cada organismo produtor (GHOLAMIAN et al., 2013).

Dessa forma, não há parâmetros físicos nem nutricionais estabelecidos para a máxima

produção de L-ASNase pelas diferentes fontes microbianas (ELSHAFEI; EL-

GHONEMY, 2015). Em estudos prévios, a produção de L-ASNase pela bactéria

Serratia marcescens foi maior na presença de extrato de levedura, lactose e frutose, mas

reduziu na presença de glicose (HEINEMANN; HOWARD,1969). Por outro lado, a

produção dessa enzima pela bactéria Erwinia aroideae foi melhorada na presença de

lactose, mas reprimida quando na presença de glicose (LIU; ZAJIC, 1971). Em

mutantes de S. marcescens, nomeados 933 e WF, a produção de L-ASNase foi

estimulada na presença de glicose e sacarose e inibida por lactose, respectivamente, mas

em ambos mutantes a produção dessa enzima foi estimulada por extrato de levedura

(SUKUMARAN et al., 1979).

De acordo com a literatura (SCHIMIDELL et al., 2001), algumas características

gerais devem ser consideradas ao compor o meio de cultivo: 1. Este deve ser o mais

barato possível, embora, no caso de produtos de alto valor agregado como um

biofármaco, o custo do meio não impacte tanto no valor final do produto; 2. Atender às

necessidades nutricionais do microrganismo; 3. Auxiliar no controle do processo, por

exemplo, evitando variações drásticas do pH ou formação excessiva de espuma; 4. Não

dificultar a recuperação do produto; 5. Ter composição razoavelmente fixa para não

prejudicar a manutenção do controle de qualidade do processo; 6. Não dificultar o

tratamento final do efluente (SCHIMIDELL et al., 2001). A princípio, foi levado em

conta principalmente o item 2, a fim de avaliar quais fontes de carbono e nitrogênio

mais favorecem o crescimento de L. muscorum CRM 1648 e a produção de L-ASNase

por essa levedura.

Os microrganismos utilizam como fonte de carbono e, frequentemente, também

como fonte de energia, diversos açúcares, entre eles: glicose, sacarose, frutose, ou ainda

polissacarídeos, como o amido e a celulose (SCHIMIDELL et al., 2001). Como fonte de

nitrogênio são frequentemente utilizados sais, como o sulfato de amônio ((NH4)2SO4), o

fosfato de amônio ((NH4)2HPO4), aminoácidos e uréia. Como fontes de fósforo são

utilizadas comumente os sais de fosfato (fosfato de sódio, potássio, amônio etc). Ainda

necessita-se adicionar outros elementos, entre minerais como Na (sódio), Ca (cálcio),

68

Mg (magnésio) e elementos traços como Mn (manganês), Cu (cobre), Fe (ferro), Zn

(Zinco), entre outros a depender da composição média do microrganismo usado. Para

leveduras, a composição média de carbono é de 48% da massa seca celular, podendo

variar de 46-52%, enquanto a composição média de nitrogênio é de 7,5 % (6 a 8,5%) da

massa seca celular (OKAFOR, 2007).

A produção de enzimas pode ser influenciada por diferentes fatores incluindo

pH, salinidade, disponibilidade de oxigênio e fontes de nutrientes. O estudo das

variáveis em um bioprocesso pode ser feito em um procedimento experimental do tipo

OFAT, análise univariada, que envolve o estudo de uma variável por vez,fixando-se as

demais variáveis envolvidas no processo (FUKUDA et al., 2018).Esse foi o

procedimento experimental utilizado para avaliar o efeito de 7 diferentes fontes de

carbono (FC) e 9 fontes de nitrogênio (FN) sobre o crescimento celular e produção de

L-ASNase pela levedura L. muscorum 1648. Algumas fontes de nitrogênio, como

prolina, extrato de levedura, glutamina são também fontes de carbono, mas foram

utilizadas neste trabalho como fonte única de nitrogênio na composição do meio CD e,

por essa razão, foram classificadas dessa forma.O extrato de levedura foi a única fonte

avaliada nas duas situações, ora como fonte de carbono, ora como fonte de nitrogênio.

4.3.1.Avaliação de fontes de carbono

No meio de cultivo, as fontes de carbono são utilizadas para melhorar o

crescimento e, subsequentemente, melhorar a produção de metabólitos primários, por

exemplo, enzimas (KALYANASUNDARAM et al., 2015). Nesta etapa, glicose,

glicerol, sacarose, xilose, extrato de levedura, sorbitol e frutose foram utilizados na

concentração inicial de 2 g.L-1

, mantendo-se os outros componentes do meio CD nas

suas respectivas concentrações, conforme materiais e métodos. Essas fontes de carbono

foram escolhidas por estarem disponíveis no laboratório e porque são frequentemente

citadas na literatura em experimentos de otimização do meio de cultivo para a produção

de L-ASNase por diferentes tipos de microrganismos (GHOLAMIAN et al., 2013;

KALYANASUNDARAM et al., 2015).

De acordo com os resultados (Figura 16), o extrato de levedura foi a fonte de

carbono que proporcionou maior crescimento de L. muscorum CRM 1648 nas primeiras

72 horas de cultivo (DO = 13,2 ± 1,0), três vezes maior quando comparado ao meio CD

com glicose (DO = 3,7 ± 0,17). Embora a quantidade de carbono seja similar em todos

os meios, além de carbono, o extrato de levedura é fonte adicional de outros nutrientes,

69

que se encontram disponíveis para a célula crescer (fatores de crescimento, vitaminas,

sais, açúcares, proteínas), o que possivelmente tenha favorecido o rápido crescimento de

L.muscorum CRM 1648 no meio CD com extrato de levedura.

Depois do extrato de levedura, as fontes de carbono que mais favoreceram o

crescimento da levedura alvo foram, nessa ordem (valores em 72 horas de cultivo),

sacarose (DO = 4,8 ± 0,18), glicose (DO = 3,7 ± 0,17), sorbitol (DO = 3,4 ± 0,38) e

frutose (DO = 3,1 ± 0,09). As fontes que menos favoreceram o crescimento de L.

muscorum CRM 1648 foram xilose (DO = 1,8 ± 0,3) e glicerol (DO = 1,7 ± 0,1).

Figura 16 – Crescimento celular (A) e produção de L-ASNase (B) pela linhagem L.

muscorum CRM 1648 em meio Czapek Dox com adição de diferentes fontes de

carbono. Legenda:

.

O crescimento de L. muscorum CRM 1648 em meio com sacarose indica que

essa levedura é capaz de metabolizar esse açúcar, o que corrobora com outros trabalhos

que mostram que espécies do gênero Leucosporidium são capazes de crescer em meio

com sacarose, maltose, glicerol, pentoses (xilose e ribulose), dentre outras fontes de

carbono (MAŠÍNOVÁ et al., 2017; FILIPPUCCI et al., 2016; WANG et al., 2015). O

catabolismo de sacarose por leveduras, especialmente Saccharomyces cerevisiae, resulta

na dissociação desse açúcar em frutose e glicose pela enzima invertase, a qual age

extracelularmente (BATISTA et al., 2004). Nem todos os microrganismos são

produtores dessa enzima e, por isso, não conseguem metabolizar a sacarose. Supõe-se,

portanto, que a levedura L. muscorum CRM 1648 produza invertase ou alguma enzima

similar que tenha a mesma função, até porque há registros na literatura da produção da

enzima β-frutofuranosidase (outra denominação dada à enzima invertase) por espécies

A B

70

de leveduras taxonomicamente próximas ao gênero Leucosporidium como, por

exemplo, a espécie Rhodotorula dairenenses (GUTIÉRREZ-ALONSO et al., 2009) e R.

glutinis (RUBIO et al., 2002).

Sacarose foi a fonte de carbono que resultou em maior produção de L-ASNase

(1028,3 ± 81,4 U.L-1

) no final do cultivo (após 120 horas), seguida por sorbitol (895,8 ±

77,5 U.L-1

), glicose (878,8 ± 32,8 U.L-1

), frutose (856,5 ± 9,2 U.L-1

) e extrato de

levedura (806,4 ± 19,7 U.L-1

). Meio CD com xilose ou glicerol resultou em uma

produção pelo menos duas vezes menor (471,7 ± 59,7 U.L-1

e 439,6 ± 28,9 U.L-1

,

respectivamente) em relação ao meio com sacarose.

Linhagem de Leucosporidium scotti isolada de amostra da Península Antártica

foi avaliada em meio CD com diferentes fontes de carbono e nitrogênio e, dentre as

fontes de carbono consideradas no estudo, sacarose seguida por glicerol foram as que

mais favoreceram tanto o crescimento como a produção de L-ASNase por essa levedura

(MOGUEL, 2018). Resultado similar foi obtido por linhagem de Leucosporidium

creatinivorum, que mostrou crescimento também em meio com xilose e maltose, mas

não foi capaz de crescer em galactose e celobiose (FILIPPUCCI et al., 2016). Em outro

estudo, L. muscorum foi capaz de assimilar sorbose, xilose, lactose e rafinose (LAICH

et al., 2014). Sacarose e glicerol não foram avaliadas nesse trabalho.

Como conclusão desta etapa, sacarose foi a fonte de carbono que mais favoreceu

a produção de L-ASNase e, juntamente com o extrato de levedura, a que mais

contribuiu para o crescimento de L. muscorum CRM 1648.

4.3.2.Avaliação de fontes de nitrogênio

O nitrogênio (orgânico e inorgânico) é metabolizado para produzir aminoácidos,

ácidos nucléicos, proteínas e componentes da parede celular. Juntamente com o

carbono, a fonte de nitrogênio (FN) auxilia no crescimento e maior produção de enzimas e,

dependendo do tipo de fonte de carbono adicionada no meio, podem proporcionar maior ou

menor produção de L-ASNase (KALYANASUNDARAM et al., 2015).

De acordo com o gráfico de crescimento (Figura 17), L. muscorum CRM 1648

não foi capaz de crescer em meio com ureia ou com cloreto de amônio. Por outro lado,

o crescimento foi mais acelerado em meio CD com extrato de levedura (DO = 6,4 ±

0,12 em 75 horas de cultivo). Meio CD com prolina resultou em maior valor de DO no

final do cultivo (DO = 8,2 ± 0,14). Dessa forma, as fontes de nitrogênio que

proporcionaram maior crescimento foram, nessa ordem, prolina, casaminoácidos e

71

extrato de levedura, cujo valor final de DO foi igual a 8,2, 6,7 e 6,5, respectivamente,

embora o extrato de levedura novamente tenha sido a fonte que resultou em crescimento

mais acelerado.

Figura 17 – Crescimento celular (A) e produção de L-ASNase (B) pela linhagem L.

muscorum CRM 1648 em meio Czapek Dox com diferentes fontes de nitrogênio.

Legenda:

.

Ao avaliar a produção de L-ASNase (Figura 17), observa-se ausência de

produção nos meios contendo ureia e cloreto de amônio, além de uma produção lenta e

muito baixa em meio com sulfato de amônio, no qual a produtividade foi zero até as

primeiras 100 horas de cultivo. A produção da enzima foi maior em meio CD com

prolina (294 ± 35,4 U.L-1

), seguido por casaminoácido (181,2 ± 6,6U.L-1

) e glutamina

(173,8 ± 35,4 U.L-1

).

Portanto, o aminoácido prolina foi a fonte de nitrogênio que mais contribuiu para

a produção de L-ASNase por L. muscorum CRM 1648. Esse aminoácido também se

mostrou a melhor opção de fonte de nitrogênio para a produção dessa enzima por uma

linhagem de L. scotti (MOGUEL, 2018) e por fungo filamentoso da espécie Aspergillus

terreus (COSTA-SILVA et al., 2018a). De acordo com DUNLOP et al. (1975), a

levedura Saccharomyces cerevisiae quando cultivada em fontes pobres em nitrogênio

como a prolina ou quando sujeita a falta desse elemento, produziria 0,4% de L-

asparaginase tipo II (ASP3), do tipo periplasmática, em relação a quantidade de

proteínas totais. A enzima ASP3 não seria induzida por L-asparagina que, na realidade,

seria uma das fontes de nitrogênio mais eficientes na repressão da biossíntese de L-

ASNase. De acordo com DUNLOP et al. (1980), a biossíntese de ASP3 está sujeita a

72

forte repressão catabólica por uma variedade de compostos de nitrogênio, fenômeno

denominado de repressão catabólica pelo nitrogênio (RCN).

SARQUIS et al. (2004) avaliaram a produção de L-ASNase por espécies de

fungos do gênero Aspergillus spp. em diferentes FN, inclusive prolina, e também

observaram que esse aminoácido era aquele que mais favorecia a produção de L-

ASNase pela espécie A. terreus e que glutamina e ureia foram as fontes que resultaram

em menor produção da enzima, indicando que a metabolização de fontes de nitrogênio

por esses fungos filamentosos sofre influência do fenômeno de RCN (SARQUIS et al.,

2004).

Embora microrganismos consigam utilizar uma grande variedade de fontes de

nitrogênio, o crescimento irá variar conforme o tipo de FN disponível no meio. Por essa

razão, a fim de selecionar a melhor FN, os microrganismos desenvolvem mecanismos

de regulação que permitem o uso de nutrientes que melhor suportem o seu crescimento

(SANCHEZ; DEMAIN, 2002). Amônia, glutamina e asparagina são reconhecidas como

fontes de nitrogênio mais facilmente metabolizáveis ou mais ricas. A ausência de fontes

ricas em nitrogênio resulta na liberação a nível transcricional das vias de catabolismo de

fontes de N consideradas não preferenciais ou “pobres” (prolina, ureia, glutamato), o

que caracteriza o fenômeno de repressão catabólica pelo nitrogênio (HOLFMAN-

BANG, 1999). Segundo a literatura (MAGAZANIK; KAIZER, 2002), as leveduras ao

crescerem nessas fontes de nitrogênio aumentam a expressão de enzimas envolvidas na

síntese de glutamato e glutamina e, por consequência, aumentam a atividade de

permeases responsáveis pela captação de aminoácidos a serem utilizados como fonte de

N.

Segundo ARIMA et al (1972), os fungos e as leveduras mostram modos de

regulação de L-ASNase similar aos das células vegetais, onde a produção extracelular

da enzima é estimulada por uma carência de nitrogênio. Há na literatura estudos sobre o

mecanismo de RCN na levedura S. cerevisiae (DUNLOP et al., 1980; OLIVEIRA,

1999; HOFMAN-BANG, 1999). OLIVEIRA (1999) cita que a produção de ASP3 seria

induzida pela falta de nitrogênio e não pela presença de asparagina. MOGUEL (2018)

também sugere que este fenômeno ocorra em linhagem de L. scotti.

Com base nessas informações, a ausência de atividade no meio com ureia,

sulfato de amônio e cloreto de amônio, observada quando L. muscorum CRM 1648 foi

cultivada nessas fontes de nitrogênio, muito provavelmente é consequência do

fenômeno de RCN. A presença de atividade após 120 horas de cultivo nos meios com

73

essas fontes de nitrogênio indica que esta foi consumida (falta de nitrogênio, do inglês

nitrogen starvation), desreprimindo o catabolismo de fontes de N. Além disso,

explicaria também o fato da prolina, que é uma das FN mais pobres, ser aquela que mais

favorece a produção de L-ASNase.

Como conclusão desta etapa, o aminoácido prolina foi a FN que mais favoreceu

a produção de L-ASNase e, juntamente com o extrato de levedura, a que mais

contribuiu para o crescimento de L. muscorum CRM 1648. Sacarose, extrato de

levedura e prolina foram, portanto, as fontes de carbono e nitrogênio que mais

contribuíram para o crescimento dessa levedura e produção da enzima e, por isso, foram

selecionadas para compor o meio Czapek-Dox Modificado (CDM), que foi otimizado

na etapa a seguir.

4.4. Otimização dos fatores nutricionais por delineamento fatorial completo

As combinações e resultados obtidos no delineamento experimental (I) estão

dispostos na Tabela 9. Os resultados experimentais referentes aos pontos centrais para

ambas as respostas (crescimento e produção) foram muito próximos, indicando

confiabilidade nos resultados.

O delineamento experimental mostrou que a produção da enzima tende a

aumentar com o aumento da concentração de prolina e sacarose (15 g.L-1

cada), porém

em nível intermediário de extrato de levedura (5 g.L-1

), como mostra o experimento 26

(3658,3 U.L-1

de L-ASNase), que teve a maior produção de L-ASNase (Tabela 9). A

análise estatística desse ensaio foi realizada por Análise de Variância (ANOVA) para

ambas as respostas, sendo significativos os valores de p< 0,1 (Tabela 10).

Os resultados de ANOVA (Tabela 10) mostram que as concentrações de

sacarose, extrato de levedura e prolina têm relação direta com o crescimento e produção

da enzima, uma vez que os termos lineares desses três fatores foram significativos (p<

0,1) para as duas respostas. Ao analisar a Soma dos Quadrados, a resposta crescimento

sofre maior influência do fator sacarose (SQ = 167,58), seguida pelo fator extrato de

levedura (SQ = 35,77) e, em menor grau, pela prolina (SQ = 8,9). Esses fatores têm

menor influência sobre a produção de L-ASNase, mas também existe um efeito sobre

essa resposta, que é mais afetada pela sacarose (SQ = 7,78) e em menor grau pelos

outros dois fatores (SQ aproximadamente igual a 0,7 para ambos). Os termos

quadráticos não influenciaram nenhuma das respostas, mas as interações foram

significativas, exceto a interação de sacarose ou de extrato de levedura com prolina, que

74

não foi significativa para o crescimento de L. muscorum CRM 1648 (p>0,1). Os valores

de R2 e R

2ajustado estão bem próximo a 100%, indicando que os resultados estão bem

ajustados com o modelo.

Tabela 9 – Matriz do planejamento fatorial completo (I) e suas respectivas respostas

para a avaliação do crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase.

Exp.

Fatores (g.L-1

) X (g.L-1

) L-ASNase (U.L-1

)

sacarose ext. de

levedura prolina experimental previsto experimental previsto

1 5 0 5 2,36 1,72 911,79 797,25

2 5 5 5 4,13 4,94 430,83 1075,00

3 5 10 5 5,13 6,15 681,52 408,75

4 5 0 10 3,23 4,62 1463,32 1450,50

5 5 5 10 7,65 7,84 2150,42 1924,25

6 5 10 10 8,88 9,05 1996,29 1454,00

7 5 0 15 3,80 5,89 1377,9 1149,75

8 5 5 15 7,82 9,11 1184,77 1819,50

9 5 10 15 9,68 10,33 1210,77 1545,25

10 5 0 5 5,74 1,72 367,69 797,25

11 10 5 5 9,35 10,55 623,96 974,00

12 10 10 5 11,98 12,53 870,94 536,50

13 10 0 10 8,74 9,46 1996,29 1525,00

14 10 5 10 11,88 13,45 2098,42 2227,50

15 10 10 10 13,14 15,43 1327,76 1986,00

16 10 0 15 9,15 10,74 1485,61 1628,50

17 10 5 15 12,4 14,73 3240,48 2527,00

18 10 10 15 14,44 16,71 2813,37 2481,50

19 15 0 5 7,99 8,69 397,40 137,75

20 15 5 5 12,02 13,45 809,66 873,00

21 15 10 5 15,12 16,19 882,08 664,25

22 15 0 10 8,65 11,59 1374,19 1599,50

23 15 5 10 14,41 16,34 2896,94 2530,75

24 15 10 10 16,94 19,09 1819,87 2518,00

25 15 0 15 8,53 12,87 1541,32 2107,25

26 15 5 15 15,01 17,62 3658,31 3234,50

27 15 10 15 16,61 20,37 3491,18 3417,75

PC1 10 5 10 11,86 13,45 2330,55 2227,50

PC2 10 5 10 11,93 13,45 2135,56 2227,50

PC3 10 5 10 11,75 13,45 2525,53 2227,50

PC4 10 5 10 11,47 13,45 2107,71 2227,50

Dados do 4° dia de cultivo


Exp – experimento; PC – ponto central.

75

Tabela 10 –Análise de Variância (ANOVA) por regressão de superfície de resposta de

X (Y1) e atividade de L-ASNase (Y2) em função da concentração de sacarose, extrato

de levedura e prolina – delineamento experimental I.

Modelo X (g.L

-1) L-ASNase (U.L

-1)

GL SQ Valor p GL SQ Valor p

Regressão 7 230,818 5 0,3567

X1 2 167,577 0,000 1 7,7813 0,084

X2 2 35,768 0,000 1 0,7272 0,000

X3 2 8,922 0,000 1 0,6917 0,012

X1 X2 4 2,273 0,006 0,7486 0,061

X1 X3 4 0,235 1 1577187 0,010

X2 X3 4 0,290 0,3567 0,048

Erro 12 4,239 16 0,9850

Total 30 463,371 30 12,0162

X1 – sacarose; X2 – extrato de levedura; X3 – prolina; GL – graus de liberdade; SQ – soma dos

quadrados. R2

= 99,1%, R2 ajustado = 97,7% (Resposta Y1). R

2 = 91,8%, R

2 ajustado = 84,6% (Resposta

Y2). Interações significativas para p <0,1. Foi realizada transformação Box Cox (λ = 0) para ajuste do

modelo.

Por ter sido observado nesse ensaio que era possível aumentar a produção de L-

ASNase com o aumento do nível de sacarose e prolina, foi feito outro delineamento

experimental (II), no qual foi observado que há uma tendência de aumento nos níveis

dos três fatores resultarem em maior produção de L-ASNase (4582,5 U.L-1

) no ensaio

27) e crescimento de L. muscorum CRM 1648. Na resposta crescimento isso não fica

tão claro, visto que a massa seca celular é maior no experimento 8 (28,3 g.L-1

), cuja

composição do meio é 10 g.L-1

(sacarose), 5 g.L-1

(extrato de levedura) e 20 g.L-1

(prolina). Nesse ensaio foi observado que nos níveis mais baixos de sacarose e prolina,

o aumento de extrato de levedura parece prejudicar o crescimento, mas que esse efeito é

amenizado e até revertido quando os níveis daqueles fatores são aumentados (Tabela

11). Assim como no DoE (I), os resultados referentes aos pontos centrais no DoE (II)

também foram muito próximos, indicando confiabilidade nos resultados.

76

Tabela 11 – Matriz do planejamento fatorial completo (II) e suas respectivas respostas

para a avaliação do crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase.

Exp.

Fatores (g.L-1

) X (g.L-1

) L-ASNase (U.L-1

)

sacarose ext. de

levedura L-prolina experimental previsto experimental previsto

1 10 5 10 17,85 13,45 2355,62 2227,50

2 10 10 10 22,50 15,43 2714,02 1986,00

3 10 15 10 12,60 15,41 2481,06 800,50

4 10 5 15 20,25 14,73 1757,66 2527,00

5 10 10 15 25,05 16,71 3032,50 2481,50

6 10 15 15 17,73 16,68 2673,16 1492,00

7 10 5 20 26,97 14,38 4216,64 1872,50

8 10 10 20 28,30 16,36 3992,89 2023,00

9 10 15 20 19,59 16,34 2235,91 1229,50

10 15 5 10 20,10 16,34 2697,31 2530,75

11 15 10 10 23,15 19,09 2948,00 2518,00

12 15 15 10 17,24 19,83 3292,31 1561,25

13 15 5 15 16,94 17,62 1648,09 3234,50

14 15 10 15 16,61 20,37 1880,42 3417,75

15 15 15 15 20,97 21,11 3585,41 2657,00

16 15 5 20 20,10 17,27 3061,58 2984,25

17 15 10 20 19,94 20,02 3567,24 3363,50

18 15 15 20 23,46 20,76 3312,22 2798,75

19 20 5 10 17,05 16,51 3633,12 2834,00

20 20 10 10 17,41 20,03 3884,90 3050,00

21 20 15 10 18,94 21,54 3378,75 2322,00

22 20 5 15 21,38 17,79 1762,36 3942,00

23 20 10 15 20,66 21,31 3920,72 4354,00

24 20 15 15 22,81 22,81 3681,28 3822,00

25 20 5 20 23,78 17,45 3065,73 4096,00

26 20 10 20 25,30 20,96 4279,65 4704,00

27 20 15 20 24,24 22,47 4582,47 4368,00

PC1 15 10 15 18,26 20,37 3887,69 3417,75

PC2 15 10 15 19,12 20,37 4081,61 3417,75

PC3 15 10 15 19,57 20,37 3558,09 3417,75

PC4 15 10 15 19,17 20,37 3457,53 3417,75

Dados do 4° dia de cultivo


Exp – experimento

PC – ponto central

Pela Tabela ANOVA do segundo delineamento experimental (Tabela 12), todos

os termos lineares foram significativos para ambas as respostas, exceto a sacarose, que

não foi significativa para a produção de L-ASNase (p>0,1). Ao avaliar a relevância dos

77

termos lineares para cada resposta (soma dos quadrados), observou-se que para a

resposta crescimento, novamente sacarose teve maior influência sobre essa resposta (SQ

= 2,33), seguida por extrato de levedura (SQ = 1,59) e prolina (SQ = 0,63). Por outro

lado, ao avaliar a resposta produção de L-ASNase, sacarose praticamente não

influenciou essa resposta (SQ = 0,07), mas esta foi influenciada pelos outros dois

fatores, principalmente por prolina (SQ = 5,31). Dessa vez, os termos quadráticos

influenciaram a resposta crescimento e apenas o termo quadrático de prolina teve

influência sobre a produção da enzima. Apenas a interação de sacarose e extrato de

levedura influenciou a resposta crescimento, embora não tenha sido significativo

(p>0,1), enquanto que para a resposta produção isso foi observado de forma

significativa apenas para a interação de sacarose com prolina. O valor de R2 foi um

pouco mais baixo do que no primeiro ensaio, principalmente para a resposta atividade

de L-ASNase (79,34%), mas esse valor ainda permite dizer que os resultados estão bem

ajustados com o modelo.

Tabela 12 –Análise de Variância (ANOVA) por regressão de superfície de resposta de

X (Y1) e atividade de L-ASNase (Y2) em função da concentração de sacarose, extrato

de levedura e prolina – delineamento experimental II.

Modelo X (g.L

-1) L-ASNase (U.L

-1)

GL SQ Valor p GL SQ Valor p

Regressão 7 15.9504 0.000 5 18.7184 0.000

X1 1 2.3332 0.000 1 0.0709 0.371

X2 1 1.5950 0.000 1 1.0340 0.001

X3 1 0.6377 0.000 1 5.3111 0.000

X1 X1 1 0.9099 0.000

X2 X2 1 0.2100 0.025

X3 X3 1 0.4075 0.002 1 4.3099 0.000

X1 X2 1 0.1294 0.075

X1 X3 1 0.4501 0.027

X2 X3

Erro 54 2.1204 56 4.8757

Total 61 18.0708 61 23.5941

X1 – sacarose; X2 – extrato de levedura; X3 – prolina; GL – graus de liberdade; SQ – soma dos

quadrados.R2

= 88,27%, R2 ajustado = 86,75% (Resposta Y1). R

2 = 79,34%, R

2 ajustado = 77,49%

(Resposta Y2). Interações significativas para p <0,1. Foi realizada transformação Box Cox (λ = 0) para

ajuste do modelo.

Os gráficos gerados pelas análises (Figura 18) confirmam o que já foi observado

nas tabelas anteriores (Tabelas 9 e 11), que há uma tendência de maior crescimento de

78

L. muscorum CRM1648 nos níveis mais elevados dos três fatores. Na produção de L-

ASNase por essa levedura, observa-se um comportamento sinérgico entre a sacarose e o

extrato de levedura, indicando uma maior produção quanto maior é o nível de cada um

desses nutrientes, sugerindo inclusive a possibilidade de melhorar ainda mais a

produção ao extrapolar os níveis desses dois fatores. Por outro lado, ao avaliar o

sinergismo entre prolina e sacarose ou prolina e extrato de levedura, observa-se que os

fatores sacarose e extrato de levedura praticamente não influenciam a resposta produção

e que esta depende quase que exclusivamente do aumento de prolina no meio, indicando

a grande relevância desse fator para a produção de L-ASNase por L. muscorum CRM

1648.

Figura 18. Gráfico da superfície de resposta em 3D de MSC (Y1) e atividade de L-

ASNase (Y2) em função da concentração de sacarose (X1), extrato de levedura (X2), e

prolina (X3). Valores fixados: X1 = 17, X2 = 15 e X3 = 16.

79

A metodologia de delineamento experimental por fatorial completo resultou em

crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase por essa levedura

aproximadamente 10 vezes maior do que no meio de cultivo inicial CD (Figura 19),

indicando que essa metodologia foi relevante para atingir o propósito de otimização do

meio de cultivo nas condições avaliadas até aqui.

Figura19 – Efeito do meio Czapek Dox no crescimento de L. muscorum CRM 1648 e

produção de L-ASNase após o delineamento experimental. CD: meio Czapek Dox

inicial, com glicose e prolina; CDM: meio Czapek Dox melhorado neste trabalho,

contendo prolina (20 g.L-1

), extrato de levedura (15 g.L-1

) e sacarose (20 g.L-1

).

Legenda: .

4.5. Análise univariada das variáveis temperatura (°C), concentração inicial de células

(X0), pH inicial e concentração de água do mar na composição do meio de cultivo.

Foram avaliados três valores distintos de concentração inicial do inoculo (X0 =

0,5 g.L-1

; X0= 1,0 g.L-1

e X0 = 1,5 g.L-1

), com o objetivo de observar o efeito desse fator

no crescimento de L.muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase. A avaliação de X0

mostrou que o crescimento da levedura e produção da enzima alcançou o seu ápice com

48 horas de cultivo nas três condições avaliadas (Figuras 20 e 21). Há uma pequena

diferença na velocidade específica máxima de crescimento (µmax) para cada condição de

X0, sendo µ0,5 (µmax quando X0 = 0,5 g.L-1

) igual a 0,064 h-1

; µ1,0 = 0,054 h-1

e µ1,5 =

0,041 h-1

(Figura 20). Ainda assim, a análise dos dados por regressão indicou que a

inclinação das curvas não teve diferença significativa entre elas, ou seja, X0 nas

80

concentrações avaliadas não interferiu nem no crescimento de L. muscorum CRM 1648

nem na produção da enzima de interesse por essa levedura (Figura 22).

Figura 20 – Avaliação do crescimento de L. muscorum CRM 1648 em meio CDM por

análise de DO (preto) e X (vermelho), bem como de Ln(X), quando X0 = 0,5 g.L-1

(A),

X0 = 1,0 g.L-1

(B) e X0 = 1,5 g.L-1

(C).

81

Figura 21 – Curva comparativa de crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção

de L-ASNase quanto a concentração celular inicial (X0).

Legenda:

Figura 22 –Análise dos dados de inclinação das curvas de crescimento de L. muscorum

CRM 1648 (A) e produção de L-ASNase (B) por regressão linear em cada nível de X0.

Foi avaliada a capacidade de crescimento de L. muscorum CRM 1648 e

produção de L-ASNase nas seguintes temperaturas: 9, 12, 15, 18 e 21 °C. A levedura foi

capaz de crescer em todas as temperaturas avaliadas (Figura 23). O crescimento foi

maior quanto maior a temperatura até 18°C. Quando cultivada a 21°C, o crescimento

caiu depois de 48 horas de cultivo. Por esse experimento é possível supor que a

temperatura ótima de crescimento dessa levedura é em torno de 18 °C. Pela definição de

Morita (1975), essa levedura seria psicrotrófica ou psicrotolerante (temperatura ótima

de crescimento acima de 15 °C e máxima acima de 20°C), corroborando com dados

descritos na literatura que mostram que a espécie L. muscorum é capaz de crescer até 25

°C (PATHAN et al., 2010). Para a produção de L-ASNase foi observado que

temperaturas mais altas (18 e 21°C) e na temperatura mais baixa (9°C) a produção não

82

alcançou 4.000 U.L-1

. A produção foi maior quando a levedura foi cultivada a 12 e 15°C

(acima de 7000 U.L-1

), indicando que esta é a faixa mais indicada para maior produção

dessa enzima. Em 18°C a produção em 120 horas de cultivo é 3718,7 ± 217,7 U.L-1

,

enquanto a 12 e 15°C nesse intervalo de tempo foi obtido quase o dobro de atividade de

L-ASNase (respectivamente, 6973,1 ± 492,4 e 7112,3 ± 761,6 U.L-1

). Dessa forma,

como a produção de L-ASNase é a resposta mais importante nesse trabalho e em 15°C a

levedura L. muscorum cresce um pouco mais rápido do que a 12°C, a temperatura de

15°C, parece ser a melhor opção para cultivar a linhagem CRM 1648 para a produção

de L-ASNase. De acordo com PATHAN et al. (2010), essa espécie é capaz de crescer a

4, 22 e 25 °C, mas não a 30 °C. Em outro estudo foi observado que outra espécie do

mesmo gênero, Leucosporidium escuderoi, não foi capaz de crescer em temperaturas

acima de 25 °C (LAICH et al., 2014).

Figura 23 – Curva de crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase

em diferentes temperaturas. Legenda:

O pH inicial do meio de cultivo CDM também foi avaliado e, de acordo com os

resultados não houve interferência desse fator no crescimento de L. muscorum CRM

1648, mas esta interferência se fez presente na avaliação da produção da enzima (Figura

24). A produtividade foi menor em 72 horas de cultivo para a condição em que o pH

inicial do meio era igual a 4,5 (64 U.L-1

.h-1

em relação a 77 e 78 U.L-1

.h-1

obtido nas

outras condições, respectivamente), sugerindo que valores de pH mais baixos são

prejudiciais a produção de L-ASNase por essa levedura.

83


em diferentes valores de pH inicial do meio CDM.

Legenda:

A avaliação da água do mar na composição do meio CDM mostrou que essa

variável favoreceu tanto o crescimento como a produção de L-ASNase (Figura 25). Nos

casos avaliados o pico de crescimento e produção ocorreu em 72 horas de cultivo. Nesse

ponto, as condições com 25% e 50% de água do mar resultaram em um crescimento 1,4

e 1,3 vezes maior que no cultivo sem água do mar, respectivamente. Na produção da

enzima, a adição de água do mar, independente da quantidade, resultou em uma

atividade 1,4 vezes maior do que no meio sem água do mar. Esses resultados sugerem

que até 25% de água do mar no meio promove uma diferença significativa nas respostas

crescimento e produção, mas acima dessa concentração (ou pelo menos até 50%, que foi

o máximo avaliado), não há incremento nem prejuízo das respostas. O bom desempenho

da levedura em meio com alta salinidade, como é o caso da água do mar, corrobora com

o fato de que L. muscorum CRM 1648 foi isolada de material coletado em sedimento

marinho, na Península Antártica, como já comentado em materiais e métodos (capítulo

3, item 3.1).

A análise univariada das condições de cultivo (X0, pH inicial e temperatura) e

concentração de água do mar no meio CDM mostrou que L. muscorum CRM 1648 deve

ser cultivada em meio CDM com pelo menos 25% (v/v) de água do mar, pH ajustado

para 5,5 ou 6,5, a 15 °C. A variável X0, nos valores avaliados, não intereferiu

significativamente no crescimento da levedura nem na produção da enzima.

84


em diferentes concentrações de água do mar no meio CDM.

Legenda:

4.6. Cultivos em biorreator e avaliação do oxigênio dissolvido

4.6.1. Ensaio 1: sem controle de oxigênio dissolvido (OD < 20%)

Os dados desse ensaio estão apresentados nas Figuras 26 a 29 e Apêndices B e

C. Esse ensaio teve duração de 96 horas e o crescimento da levedura L. muscorum CRM

1648 alcançou o máximo de 26 g.L-1

de massa seca celular (Apêndice B). A temperatura

e agitação se mantiveram durante todo o cultivo em torno de 15°C e 500 rpm,

respectivamente (Figura 27, Apêndice C). O pH também se manteve em torno de 5,5,

através da adição de ácido (HCl 20%) e base (NaOH 20%), como mostra a Figura 26.

Figura 26 – Perfil das variáveis pH, temperatura (°C), agitação (rpm) e volumes

adicionados de ácido (HCl 20%) e base (NaOH 20%) registradas pelo biorreator durante

o ensaio 1.

Legenda: .

85

O sistema foi alimentado com ar atmosférico e a aeração se manteve em torno de

1 LpM em todo o processo (Figura 27). O oxigênio dissolvido mostra uma queda

constante nas primeiras 24 horas (Figura 27), período que corresponde à fase

exponencial, no qual se observa a maior velocidade de produção de CO2, µmax = 0,169

mmol CO2.L-1

.h-1

(Figura 29). Depois desse período até quase 75 horas, o OD cai com

menor velocidade até quase 5% e aumenta para, aproximadamente, 30%, indicando que

as células diminuiram o consumo de oxigênio. Isso pode ocorrer porque as células

pararam de crescer, talvez devido ao oxigênio ser limitante ou pelo término de uma das

fontes de carbono.

Figura 27 – Perfil das variáveis aeração e oxigênio dissolvido (OD) no Ensaio 1 em

biorreator. Legenda: .

A Figura 28 mostra o perfil de crescimento por massa seca celular [X] e

densidade óptica (DO 600 nm), pH e atividade de L-ASNase ao longo de quase 96

horas de cultivo. Observa-se que praticamente não houve produção da enzima e que, no

final do cultivo, L. muscorum não havia ainda estacionado o seu crescimento, indicando

que algo, possivelmente o O2, seria o fator limitante. A análise do crescimento [X] e

taxa de produção de CO2 e os respectivos perfis de Ln dessas variáveis ao longo do

tempo (Figura 30) mostram que a velocidade de crescimento foi constante nas primeiras

24 horas de cultivo, sendo µmax calculado pelo Ln da concentração de CO2 produzido

(CER) igual a 0,169 h-1

e µmax pelo Ln de [X] igual a 0,084 h-1

. Como esses valores

estão muito diferentes, a avaliação da velocidade de crescimento foi feita por Ln(X) nos

ensaios subseqüentes.

86

Figura 28 – Perfil das variáveis crescimento (DO e MSC), pH e produção de L-

ASNaseno ensaio 1 em biorreator.

Legenda: .

Figura 29 – Perfil das variáveis produção de CO2 (CER) e Ln de CER na fase

exponencial (A) e crescimento celular (massa seca celular, [X]) mais ln(X) e ln(X) na

fase exponencial (ln(X)exp) no Ensaio 1. Legenda:

(A)

(B)

Como já havia sido observado nos cultivos em frascos agitados que o pH tende a

aumentar bastante quando há a produção de L-ASNase, variando de um pH inicial igual

a 5,5 até, aproximadamente, 8,5 no final do cultivo (dados não mostrados), havia nessa

87

altura a suspeita de que o pH, ao ser controlado em 5,5 durante todo o cultivo, poderia

estar interferindo na produção da enzima. Por essa razão, o ensaio seguinte em

biorreator foi conduzido sem controle de pH (sem adição de ácido e base ao sistema).

4.6.2. Ensaio 2: sem controle de oxigênio dissolvido (OD > 20%)

O objetivo deste ensaio foi avaliar o crescimento de L. muscorum CRM 1648 e

produção de L-ASNase em biorreator, em condição de alta concentração de oxigênio

dissolvido (OD controlado em 80%). Os dados obtidos desse ensaio estão informados

nos Apêndices D e E e nas Figuras 30 a 34. A agitação variou de 200 a 1200 rpm,

alcançando o valor máximo em 11 horas de cultivo, onde se manteve até o final (Figura

24). A temperatura foi mantida em 15 °C e o pH, que não foi controlado, aumentou de

5,5 a, aproximadamente, 8,6 (Figura 30).

Figura 30 – Perfil das variáveis pH, temperatura (°C) e agitação (rpm) registradas pelo

biorreator durante o Ensaio 2. Legenda: .

A aeração foi mantida em 1 LpM nas primeiras 24 horas, mas com a condição

escolhida não foi possível manter OD = 80%, mesmo quando a agitação estava no seu

valor máximo, por isso, a aeração foi aumentava para 1,5 LpM na tentativa de evitar o

decaimento de OD (Figura 31). Ainda assim, OD decaiu até se estabilizar por volta de

30%, após 50 horas de cultivo. Como o aumento da aeração não foi suficiente para

88

manter OD em 80% e o aumento da agitação poderia provocar o cisalhamento da célula,

a adição de oxigênio puro foi a alternativa adotada no ensaio seguinte (ensaio 3).


biorreator. Legenda: .

A Figura 32 mostra o perfil de crescimento [X], produção de L-ASNase e

consumo dos substratos sacarose e prolina. Dessa vez, foi detectada produção de L-

ASNase. A produtividade em células e em produto é máxima por volta de 47 horas de

cultivo e, respectivamente, igual a 0,58 g.L-1

.h-1

e 75,4 U.L-1

.h-1

(Apêndice D). Nessa

condição e intervalo de tempo L. muscorum CRM 1648 produziu, aproximadamente, 27

g.L-1

de massa seca celular e 3.500 U.L-1

de L-ASNase (Apêndice D). A velocidade

específica de crescimento é constante e máxima nesse intervalo de tempo (Figura 33),

sendo µmax de [X] igual a 0,085 h-1

. A produção parece estar associada ao crescimento,

pois se observa que o consumo dos substratos e produção de células e produtos ocorrem

simultaneamente e, quando acabam os dois substratos, por volta de 47 horas de cultivo,

não se observa mais crescimento nem produção da enzima (Figura 32). Os substratos

são consumidos ao mesmo tempo, embora o consumo de sacarose seja um pouco mais

rápido que o consumo de prolina.

89

Figura 32 – Perfil de crescimento [X], consumo de sacarose e de prolina [S] e produção

de L-ASNase no Ensaio 2 em biorreator. Legenda:

Figura 33 – Perfil das variáveis crescimento celular (massa seca celular, [X]), ln(X) e

ln(X) na fase exponencial (ln(X)exp) no Ensaio 2.

Legenda: .

Como nesse experimento não houve controle de pH, foi observado que houve

produção e que existe uma correlação entre o aumento dessa variável e aprodução de L-

ASNase (Figura 34). Não é possível dizer que o aumento do pH ao longo do cultivo está

associado a produção da enzima L-ASNase, mas sugere que o seu monitoramento

90

poderia ser utilizado na indústria como método simples, rápido e de baixo custo para

monitorar a produção da enzima por L. muscorum CRM 1648.

Figura 34 – Medida de pH do meio CDM e atividade de L-ASNase ao longo do cultivo

de L. muscorum CRM 1648 em biorreator no Ensaio 2. Legenda:

4.6.3. Ensaio 3: oxigênio dissolvido controlado em 80%

Os resultados desse ensaio estão apresentados nas Figuras 35 a 38 e Apêndices F

e G. Como as condições estabelecidas não foram suficientes para manter OD em torno

de 80 %, foi feito outro ensaio no qual a agitação foi mantida em 600 rpm e foi

adicionado oxigênio puro. A temperatura foi mantida a 15°C e o pH aumentou ao longo

do cultivo de 5,5 até aproximadamente 8,5 (Figura 35, Apêndice F).

A aeração foi mantida em 1 LpM e, embora OD tenha oscilado bastante ao longo

do tempo, mostrou um perfil bem diferente do apresentado nos dois ensaios anteriores,

não houve uma queda constante, mas oscilações em torno do valor médio de 85 %

(Figura 36). A manutenção de OD foi feita com a adição de oxigênio puro na corrente

de vazão fixa de ar e esse procedimento requer atenção 24 horas e modificação

constante da porcentagem de fechamento e abertura da válvula, que dar acesso a

mangueira de O2 puro (valvO2). A válvula só foi aberta a partir de 15 horas de cultivo,

aproximadamente, quando L. muscorum CRM 1648 começou a crescer

exponencialmente (Figuras 37-38). Até 50 horas de cultivo foi observada muita

oscilação na abertura e fechamento da válvula de O2 e conseqüente variação de OD no

91

meio, período que coincide com a fase exponencial de crescimento. Depois desse

período, e com o término dos substratos, que foram completamente consumidos,

observou-se que a vazão de ar foi suficiente para manter os níveis de OD, de forma que

ValvO2 foi mantida fechada.


biorreator durante repetição do Ensaio 3. Legenda:

.


biorreator. O valor médio de OD foi de 85,3 %. Legenda:

.

Neste ensaio a produtividade em células e em produto foi maior por volta de 40

horas de cultivo (0,49 g.L-1

.h-1

e 115,5 U.L-1

.h-1

, respectivamente), como mostram a

92

Figura 37 e o APÊNDICE F. Nesse intervalo, foram produzidas, aproximadamente, 20

g.L-1

de células e 4700 U.L-1

de L-ASNase. Também foi observado que o consumo,

crescimento e produção da enzima ocorreram concomitantemente. Os substratos foram

consumidos completamente, mas a sacarose foi consumida primeiro, após 35 horas de

cultivo, enquanto a concentração de prolina só zerou em 50 horas (Figura 37). A

velocidade específica máxima de crescimento foi maior neste ensaio, igual a 0,11 h-1

(Figura 38).

Figura 37 – Perfil de crescimento [X], consumo de sacarose e prolina [S] e produção de

L-ASNase no Ensaio 3 em biorreator. Legenda:

.


ln(X) na fase exponencial (ln(X)exp) no Ensaio 3. Legenda:

.

93

4.6.4. Ensaio 4: oxigênio dissolvido controlado em 20%

O objetivo deste ensaio foi avaliar o crescimento de L. muscorum CRM 1648 e

produção de L-ASNase em biorreator, em condição de baixa concentração de oxigênio

dissolvido (OD controlado em 20%). Os dados obtidos desse ensaio estão informados

nos Apêndices H e I e nas Figuras 39 a 42. A agitação foi mantida em 600 rpm e a

temperatura foi controlada em 15 °C durante todo o cultivo. O pH aumentou ao longo

do cultivo como nos ensaios anteriores, chegando a 8,6 no final (Figura 39).


biorreator no ensaio 4. Legenda: .

Este ensaio foi montado de forma que nitrogênio puro era injetado na entrada de

ar do biorreator e era alimentado com pulsos de ar puro na entrada de O2, conforme

descrito em materiais e métodos (item 3.10.2). Isso foi feito para que OD do meio caísse

rapidamente para 20%. No entanto, após 6 horas de cultivo, a mangueira de nitrogênio

rompeu e esvaziou a fonte de nitrogênio. Por isso, a entrada de nitrogênio foi fechada e

OD caiu continuamente durante as primeiras 15 horas de cultivo até, aproximadamente,

20%, quando pequenos pulsos de ar começaram a ser injetados no meio provocando

oscilações, inicialmente sutis, de OD (Figura 40). Essas oscilações se tornaram maiores

quando L. muscorum CRM 1648 começou a crescer exponencialmente. Quando os

pulsos de ar não eram mais capazes de manter OD em torno de 20% e este começou a

cair abaixo desse valor, a entrada de ar foi aberta (aeração do sistema igual a 1 LpM a

partir de 43 horas de cultivo) e o sistema foi alimentado com ar puro (nessa etapa, o ar

puro foi ligado na entrada de ar e O2 puro na entrada de O2). No intervalo de tempo de

94

43-53 horas de cultivo o sistema foi alimentado com pulsos de O2 puro para tentar

manter OD = 20% e sustentar o crescimento das células, que ainda estavam em fase

exponencial (Figuras 41 e 42). O sistema deixou de ser alimentado com O2 puro depois

de 53 horas, pois as células pararam de crescer a partir desse ponto, já que nesse

momento as células passaram a respirar menos, de forma que havia menor necessidade

de OD no meio. Embora OD tenha oscilado, o valor médio dessa variável ao longo do

cultivo foi de 25,1% (Figura40).


biorreator. O valor médio de OD foi de 25,1 %.

Legenda: .

No final do crescimento exponencial, com aproximadamente 52 horas de

cultivo, foi obtida a maior produtividade em células e em produto (0,51 g.L-1

.h-1

e 97,5

U.L-1

.h-1

, respectivamente) deste ensaio, como mostra o Apêndice H. Nesse intervalo,

foram produzidas, aproximadamente, 27 g.L-1

de células e 5116 U.L-1

de L-ASNase.

Novamente foi observado que o consumo, crescimento e produção da enzima ocorreram

concomitantemente, mas dessa vez, a prolina não foi consumida em sua totalidade, ao

contrário da sacarose, que em 43 horas já não foi mais detectada no meio de cultivo

(Figura 41). Este ensaio resultou em menor valor de velocidade específica máxima de

crescimento, igual a 0,07 h-1

(Figura 42).

95

Figura 41 – Perfil de crescimento [X], consumo de sacarose e de prolina [S] e produção

de L-ASNase no Ensaio 4 em biorreator. Legenda:

.


ln(X) na fase exponencial (ln(X)exp) no Ensaio 4. Legenda:

.

4.6.5. Avaliação comparativa dos ensaios em biorreator

Ao avaliar comparativamente a relação de OD no meio de cultivo dos quatro

ensaios em biorreator (Figura 43) com o crescimento de L. muscorum CRM 1648

(Figura 44 A), foi observado crescimento mais rápido nos ensaios 2 e 3, nos quais OD

96

se manteve bem acima de 20%, quando comparado aos ensaios 1 e 4, nos quais OD se

manteve em torno de 20% e até abaixo desse valor, chegando a 5% em alguns

momentos. Além disso, a curva de crescimento no Ensaio 1 começa a se distanciar das

curvas dos outros três ensaios após 40 horas de cultivo, quando OD nesse ensaio já está

muito próximo a 10% (Apêndice C). Outra observação é que, no Ensaio 1 as células de

L. muscorum CRM 1648 ficaram expostas por, aproximadamente, 12 horas a um valor

de OD em torno de 5% (de 64 a 75 horas de cultivo, como mostra o Apêndice C),

enquanto no Ensaio 4 OD se manteve em 20%, havendo oscilações nesse valor que fez

OD cair em torno de 5% por 2 horas (entre 36 e 37 horas de cultivo), e outra oscilação

logo em seguida (próximo a 50 horas), quando OD subiu acima de 100% (Figura 43,

Apêndice I). Essa diferença, aparentemente, fez com que a levedura desacelerasse seu

crescimento no Ensaio 1, mas continuasse a crescer progressivamente no ensaio 4. O

valor final de X nos 4 ensaios foi semelhante e igual a, aproximadamente, 26 g. L-1

, no

entanto observa-se uma grande diferença no comportamento das curvas nos Ensaios 2, 3

e 4 em relação ao Ensaio 1 (Figura 44 A). Dessa forma, OD demonstrou ser uma

variável crítica por interferir na velocidade de crescimento da levedura, embora a

produção de células no final do cultivo tenha sido igual nas quatro condições.

A análise da relação de OD com a síntese de produto mostrou que essa variável

também foi crítica para a produção da enzima L-ASNase pela levedura L. muscorum

CRM 1648. No Ensaio 3 a produção foi maior e mais rápida possivelmente porque

nesse ensaio OD se manteve sempre elevado, controlado em 80%. Nos Ensaios 2 e 4,

nos quais OD se manteve acima de 20%, a produção foi bastante similar até

aproximadamente 50 horas de cultivo, quando no Ensaio 4 ocorre o pico de OD, que

extrapola 100%. Nesse ponto, observa-se que a enzima continua sendo produzida no

Ensaio 4, onde as células por alguns instantes (50 a 53 horas de cultivo, como mostra o

Apêndice I) são expostas a concentrações elevadas de OD. Em contrapartida, no Ensaio

2, a partir desse ponto, OD cai progressivamente de, aproximadamente, 35% a 30%

(Apêndice E). Esse comportamento sugere que não só valores elevados de OD são

favoráveis para a produção de L-ASNase, como também valores abaixo de 35% já

começam a prejudicar a sua produção.

A curva de produção de L-ASNase no Ensaio 1 não foi adicionada a Figura 44 B

porque esse resultado teve influência de outro fator, o pH, que interferiu com a análise

de OD nesse ensaio. Ainda assim, como existe correlação entre o crescimento de L.

muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase por essa levedura, é possível supor que,

97

a produção da enzima seria mais baixa no Ensaio 1 em relação aos outros três ensaios,

já que OD se mostrou limitante tanto para o crescimento de L. muscorum CRM 1648

como para a produção de L-ASNase por esse microrganismo.

Figura 43 – Comparação do perfil de OD em cada ensaio. Legenda: Ensaio 1: triângulo

azul vazio; Ensaio 2: círculo vermelho vazio; Ensaio 3: quadrado verde cheio; Ensaio 4:

losango roxo cheio.

Figura 44 – Comparação do perfil de crescimento (A) e de produção de L-ASNase (B)

nas condições de OD avaliadas em biorreator. Legenda: Ensaio 1: triângulo azul; Ensaio

2: círculo vermelho; Ensaio 3: quadrado verde; Ensaio 4: losango roxo.

A produtividade em células (Px) foi maior entre 40 e 50 horas de cultivo (Figura

45) nos ensaios 2 (0,58 g.L-1

.h-1

) e 3 (0,50 g.L-1

.h-1

), que tiveram níveis mais elevados

98

de OD no meio, em relação aos ensaios 4 (0,51 g.L-1

.h-1

) e, principalmente, em relação

ao ensaio 1 (0,34 g.L-1

.h-1

).

A produtividade em produto L-ASNase (Pp) também foi maior nesse mesmo

intervalo de tempo, entre 40 e 50 horas, nos ensaios 2 (75 U.L-1

.h-1

) e 3 (116 U.L-1

.h-1

),

confirmando que existe correlação entre o crescimento de L.muscorum CRM 1648 e a

produção da enzima. O valor de Pp do Ensaio 2 chega no seu máximo em

aproximadamente 50 horas de cultivo quando começa a cair, o que possivelmente está

relacionado a queda contínua de OD para valores abaixo de 35%. Pelo perfil de Px e Pp

do Ensaio 2 é possível supor que a manutenção de valores mais elevados de OD é mais

importante para a produção de L-ASNase do que para o crescimento da levedura, visto

que a queda de OD abaixo de 35% teve um efeito mais negativo sobre Pp do que sobre

Px. Como o controle e manutenção do pH prejudicou a produção de L-ASNase no

Ensaio 1, o perfil de Pp desse ensaio não foi incluído na Figura 45.

Figura 45 – Perfil comparativo da produtividade em células Px (A) e em produto L-

ASNase Pp (B) nos Ensaios 1-4 em biorreator. Legenda: Ensaio 1: triângulo azul;

Ensaio 2: círculo vermelho; Ensaio 3: quadrado verde; Ensaio 4: losango roxo.

Quanto ao perfil de consumo dos substratos (Figura 46), embora L. muscorum

CRM 1648 tenha consumido sacarose mais rapidamente do que prolina em todas as

condições de OD avaliadas, o consumo desses dois nutrientes foi mais rápido em

condição de maior disponibilidade de oxigênio no meio, ou seja, nos ensaios 2, 3 e 4,

respectivamente, mostrando que OD é importante por interferir na velocidade de

consumo das fontes de carbono (e nitrogênio, no caso de prolina) e, consequentemente,

99

na velocidade de crescimento dessa levedura. Aparentemente OD influenciou mais no

consumo de prolina, já que no Ensaio 4, no qual OD é mais baixo, o consumo de prolina

é mais lento e ela nem chega a ser consumida completamente em 68 horas de cultivo

como ocorre nos outros dois ensaios, nos quais OD é mantido elevado e acimade 20%ao

longo de todo o cultivo.

Figura 46 – Perfil comparativo do consumo dos substratos sacarose (A) e prolina (B)

nos ensaios 2-4 em biorreator. Legenda: Ensaio 2: círculo vermelho; Ensaio 3: quadrado

verde; Ensaio 4: losango roxo.

100

V. CONCLUSÕES

Este trabalho explorou o potencial de um ambiente extremo (Antártica

marítima), ao investigar novas fontes microbianas produtoras da enzima L-ASNase que,

dentre outras aplicações, possui papel chave no tratamento da leucemia linfoblástica

aguda. Dos 150 isolados pesquisados, 6% produziu a enzima e desses quase 80% era da

espécie Leucosporidium muscorum, sugerindo que não há muitos produtores de L-

ASNase nesse ambiente (ou pelo menos não foi detectado), mas que os poucos que tem

em sua maioria pertencem ao gênero Leuscosporidium.

De acordo com os resultados apresentados, a linhagem L. muscorum CRM 1648

foi capaz de produzir uma L-ASNase sem atividade glutaminásica em maior quantidade

do que os demais isolados, tornando-se alvo deste trabalho. Ao estudar as condições de

cultivo e substratos (fontes de carbono e nitrogênio) para melhor crescimento e

produção de L-ASNase foi possível conhecer um pouco das características dessa

levedura, que cresceu melhor em meio CD com extrato de levedura e produziu mais L-

ASNase com sacarose como fonte de carbono e prolina como fonte de nitrogênio. A

preferência dessa linhagem por fontes pobres de nitrogênio como a prolina sugere a

presença do fenômeno de Repressão Catabólica pelo Nitrogênio, que ocorre em outras

espécies de levedura, como Saccharomyces cerevisiae.

O estudo da temperatura de cultivo indicou que a temperatura ótima de

crescimento dessa levedura é 18°C, mas que a produção da enzima é mais favorecida

quando o cultivo é realizado a 15°C. A condição de cultivo que mais favoreceu a

produção de L-ASNase por L. muscorum CRM 1648 foi o cultivo a 15°C, pH inicial

igual a 5,5 ou 6,5 com adição de pelo menos 25% de água do mar. A concentração

inicial do inoculo (X0), por outro lado, não influenciou significativamente nenhuma das

respostas.

Os cultivos em biorreator com diferentes ofertas de oxigênio dissolvido às

células mostraram que o crescimento da levedura e, em especial, a produção da enzima

são favorecidos quando OD é mantido elevado, em torno de 80%.

Embora seja necessário purificar e caracterizar a enzima produzida por L.

muscorum CRM 1648 este trabalho mostrou que esse microrganismo é produtor de uma

L-ASNase livre de atividade glutaminásica, característica que pode ser interessante para

o uso dessa enzima no tratamento de LLA.

101

Além disso, todo o trabalho referente ao melhoramento do meio e das condições

de cultivo em biorreator resultou em valores aproximadamente 10 vezes mais elevados

de produção de L-ASNase e produtividade (4582 U.L-1

e 63,6 U.L-1

.h-1

,

respectivamente) quando comparado aos valores obtidos antes do delineamento

experimental.

Essa etapa (upstream) é de suma importância para tornar o processo viável

industrialmente, visto que a baixa produtividade pode tornar o processo muito caro e

inviabilizá-lo, ainda que o produto seja de alto valor agregado, como é o caso de uma

enzima de uso clínico. Somado a isso, não foram encontrados relatos de produção de L-

ASNase por essa levedura e o que tem acerca do metabolismo e crescimento é muito

escasso e superficial. As informações que resultam desse trabalho são, portanto, inéditas

e importantes para o desenvolvimento de um processo produtivo que vise à produção de

L-ASNase pela levedura de origem antártica L. muscorum CRM 1648.

102

VI. PERSPECTIVAS FUTURAS

Embora este trabalho tenha sido relevante no que concerne ao estudo da fase

upstream, no melhoramento das condições de cultivo para a produção de L-ASNase,

pela levedura adaptada ao frio L. muscorum CRM 1648, se faz necessário purificar a

enzima, caracterizá-la e avaliá-la quanto ao potencial antileucêmico para poder afirmar

seu uso no tratamento de LLA.

Esses estudos foram iniciados e parte dele resultou no artigo COSTA-SILVA et

al., 2018b, no qual colaborei, mas encontramos algumas dificuldades na recuperação da

enzima nas etapas finais de purificação. Foram avaliados alguns sistemas de duas fases

aquosas, além de cromatografia de troca iônica e por exclusão molecular, até então sem

sucesso. É preciso, portanto, avaliar outros sistemas de purificação e testar alguns

inibidores de proteases para reduzir a degradação do produto ao longo do processo.

Outro ponto interessante seria explorar a produção de outros potenciais produtos

de interesse industrial por L. muscorum CRM 1648, como por exemplo, lipídios mono e

poliinsaturados, visto que há relatos na literatura que confirmam a produção desse tipo

de lipídio por leveduras do gênero Leucosporidium, que pode ser interessante para a

indústria de biodiesel e de alimentos.

103

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117

APÊNDICES

118

APÊNDICE A. Dados comparativos sobre publicações envolvendo a produção de L-ASNase por bactérias, fungos filamentosos, leveduras e

microalgas nos últimos 5 anos de acordo com dados do PUBMED e Google Acadêmico (acesso: março de 2019).

espécie origem

condições de cultivo indicador de produção de L-

ASNase

análise da

atividade

análise

estatística referência país

cultivo FC FN pH T°C agitação

(rpm) aeração (vvm)

tempo (dias)

Bacillus licheniformis solo ferment. submersa glicose cloreto de

amônio 7,4 39,6 200

sem

aeração 1 8,0 U.mL-1.h-1 Nessler CCD

ABDELRAZEK et al.

(2019) Egito

Bacillus licheniformis costa do Mar

Vermelho ferment. submersa glicose

sulfato de

amônio 6,5 37 250

sem

aeração 3 11,74 U.mL-1 Nessler univariada

ALRUMMAN et al.

(2019)

Arábia

Saudita

Myroides gitamensis solo de matadouro fermentação em

estado sólido farelo de trigo

extrato de levedura

7,5 37 120 sem

aeração 2 296,0 U Nessler

univariada; CCD

PRASAD TALLURI et al. (2019)

Índia

Bacillus subtilis coleção de cultura ferment. submersa glicose asparagina 8,3 35 200 sem

aeração 6 2,9 U.mL-1 Nessler

univariada;

ANNs ERVA et al. (2018) Índia

Streptomyces

brollosae solo ferment. submersa glicose asparagina 7 30 150

sem

aeração 7 795,0 U Nessler ausente

EL-NAGGAR et al.

(2018) Egito

Pseudomonas plecoglossicida

ambiente marinho ferment. submersa cascas de

cebola e alho asparagina ND 37 estático

sem aeração

1 1,1 U.mL-1 Nessler CCD SHAKAMBARI et

al. (2017) Índia

Halomonas sp. ambiente halofílico ferment. submersa glicose asparagina 7 30 180 sem

aeração 1 6,2 U.mL-1 Nessler CCD

SHARAFI et al.

(2017) Irã

Pectobacterium carotovorum

coleção de cultura

ferment. submersa

(descontínuo e desc.

alimentado)

glicose asparagina e ext.

levedura 8,5 30 160-600 1,5-2,0 0,5 40,0 U.mL-1 Nessler ausente KUMAR et al. (2017) Índia

Enterobacter sp. coleção de cultura ferment. submersa citrato de sódio cloreto de

amônio 6 33 200

sem

aeração 1,5 18,35 U.mL-1 Nessler

univariada;

CCD ERVA et al. (2017) Índia

119

espécie origem

condições de cultivo indicador de

produção de

L-ASNase

análise de L-ASNase

análise estatística

referência país


(rpm)

aeração

(vvm)

tempo

(dias)

pseudomonas

pseudoalcaligenes fontes termais

fermentação

submersa glicose asparagina ND 30 160

sem

aeração 2 240,0 U.mL-1 Nessler ausente

BADOEI-

DALFARD (2016) Irã

Bacillus subtilis coleção de cultura

fermentação

submersa (descontínuo e

desc. alimentado)

sacarose asparagina ND 37 600-1000 1,8 2 407,6 U.mL-1 Nessler ausente FENG et al. (2016) China

Zymomonas mobilis coleção de cultura fermentação

submersa

(contínuo)

sacarose extrato de levedura e

asparagina

ND 30 ND ND 1 117,4 U.L-1 Nessler fatorial

completo

MENEGAT et al.

(2016) Brasil

Streptomyces ghanensis

solo fermentação

submersa glicerol

sulfato de amônio

7 28 200 sem

aeração 5 106, 9 U Nessler univariada

MOSTAFA et al. (2016)

Egito

Rhodococcus erythropolis

sedimento marinho fermentação

submersa glicerol

extrato de levedura

7 30 ND sem

aeração 3 10,9 U Nessler univariada

NARAGANI; MUVVA (2016)

Índia

Streptomyces

phaeochromogenes solo

fermentação

submersa amido asparagina 7,2 28 150

sem

aeração 2 19,2 U.mL-1 Nessler ausente

SAXENA et al.

(2015) Índia

Streptomyces parvus

solo fermentação

submersa glicose, amido

asparagina,

extrato de

levedura

7 30 200 sem


Plackett

Burman; Box-

Behnken

EL-NAGGAR et al. (2015)

Egito

Streptomyces olivaceus

solo fermentação

submersa glicose asparagina 6,8 35 200

sem aeração

3 68,6 U.mL-1 Nessler

Plackett-

Burman;

CCD

EL-NAGGAR et al. (2015)

Egito

Streptomyces griseus sedimento marinho fermentação

submersa amido

extrato de

levedura 8 35 estático

sem


Box-

Behnken

MEENA et al.

(2015b) Índia

Nocardiopsis alba sedimento marinho fermentação

submersa maltose

extrato de

levedura 8 30 125

sem


MEENA et al.

(2015a) Índia

Streptomyces

ginsengisoli sedimento de rios

fermentação

submersa glicose peptona 8 30 120

sem


DESHPANDE et al.

(2014) Índia

120

espécie origem


produção de

L-ASNase



referência país


(rpm)

aeração

(vvm)

tempo

(dias)

Aspergillus terreus coleção de cultura fermentação em

estado sólido

bagaço de

cana

asparagina e

glutamina ND 30 ND 0,7 4 121,0 U.L-1

L-aspartil-β-

hidroxâmico

fatorial

completo

CACHUMBA et al.

(2019) Brasil

Aspergillus terreus Solo de Caatinga

fermentação

submersa (descontínuo e desc.

alimentado)

glicose prolina 5,7 -

7 29

***tipo pneumática

0,5 5 75,0 U L-aspartil-β-hidroxâmico

fatorial

completo;

fracionado

da ROCHA et al. (2019)

Brasil*

Trichosporon asahii musgo do

continente Antartico

fermentação

submersa glicose asparagina 7 30 180

sem

aeração 2,5 20,6 U.mL-1 Nessler Taguchi

ASHOK et al.

(2019) Índia

Aspergillus terreus solo brasileiro

fermentação

submersa (descontínuo)

glicose prolina 9,5 35 ***tipo

pneumática 0,5 5 13,8 U.g-1

L-aspartil-β-

hidroxâmico

fatorial

completo; fracionado

COSTA-SILVA et

al (2018) Brasil*

Penicillium sp. e

Tillandsia catimbauensis

planta típica da

caatinga

fermentação

submersa glicose asparagina 6 30 120

sem

aeração 4 1,3 U.g-1

L-aspartil-β-

hidroxâmico

fatorial

completo

SILVA et al.

(2018) Brasil*

Aspergillus niger ambiente marinho

fermentação


resíduo do

óleo de amendoim

asparagina 4 28 150 0,4 7 16,0 U.mL-1 Nessler ausente VALA et al. (2018) Índia

Aspergillus oryzae coleção de cultura fermentação

submersa glicose prolina 8 30 150

sem aeração

3 67.5 U mL-1 Nessler

Plackett-

Burman;

CCRD

DIAS; SATO (2016)

Brasil

Penicillium sp. e

Fusarium sp. coleção de cultura

fermentação

submersa

(descontínuo)

glicerol asparagina 5,5 30 estático sem

aeração 3

8,3 e 11,4

U.mL-1 Nessler ausente

GONÇALVES et

al. (2016) Brasil

Trichoderma viride solo fermentação em

estado sólido glicose caseina 5 28 ND

sem

aeração 4 113, 4 U.g-1 Nessler univariada

ELSHAFEI; EL-GHONEMY

(2015)

Egito

121

espécie origem


produção de

L-ASNase



referência país


(rpm)

aeração

(vvm)

tempo

(dias)

Aspergillus terreus costa do Mar

Vermelho fermentação

submersa glicose asparagina 6 35 estático

sem aeração

5 *33,9 U.mg-1 Nessler Plackett- Burman

FARAG et al. (2015) Egito

Talaromyces

pinophilus rizoma

fermentação

submersa amido

extrato de

levedura 6,5 25 120

sem


KRISHNAPURA;

BELUR (2016) Índia

Aspergillus

fumigatus solo

fermentação em

estado sólido

farelo de

trigo asparagina 5 37 estático

sem

aeração 4

*321, 7

U.mg-1 Nessler ausente DUTTA et al. (2015) Índia

Aspergillus sp. folhas da planta

Sueada monoica

fermentação

submersa

glicose; farelo de

trigo

sulfato de

amônio 7 30 estático

sem


KALYANASUNDARAM

et al. (2015) Índia

Yarrowia lipolytica coleção de cultura fermentação

submersa

(descontínuo)

glicose asparagina 7 29 500 1 1 210,0 U.mL-1 Nessler CCD DARVISHI et al. (2019) Irã

Candida utilis coleção de cultura

fermentação


melado de

beterraba

extrato de

levedura 7 30 300 1,25 1 245,6 U.mL-1

L-aspartil-β-

hidroxâmico ausente MOMENI et al. (2015) Irã

Spirulina maxima ND aquário de vidro CO2 nitrato de sódio 8,5 37 ND **20 18 51,3 U.L-1 Nessler univariada El BAKY; El BAROTY

(2016) Egito

Chlorella vulgaris amostras de água e

solo fermentação

submersa CO2 asparagina ND 25 ND ND 14 10 U.g-1 Nessler ausente

EBRAHIMINEZHAD et al. (2014)

Irã

*U. mg-1

refere-se a unidade de atividade em relação a quantidade de proteínas totais em miligrama.

** unidade: L.h-1

***Agitação tipo pneumática é feita em biorreator do tipo “coluna de bolhas”, no qual a transferência de oxigênio e agitação ocorre devido a bolhas de pequeno diâmetro que

saem de uma serpentina localizada no fundo do reator (SCHIMIDELL et al., 2001).

Ausente: não foi realizado.

O termo “sem aeração” significa que não foi injetado ar ou qualquer outro gás no meio de cultivo.

ND: parâmetro não determinado ou não encontrado.

ANNs: do inglês “artificial neural networks”; CCD: “Central Composite Design”; CCRD: “Central Composite Rotational Design”.

122

APÊNDICE B. Dados do cultivo de L.muscorum CRM 1648 em biorreator no Ensaio 1 (sem controle de OD, OD < 20%).

Amostras tempo

(h)

crescimento pH

L-ASNase

(U.L-1

)

L-ASNase

total (U)

Px

(g.L-1

.h-1

)

Pp

(U.L-1

.h-1

) DO600 [X] (g.L-1

)

A1 0,00 1,84 1 5,5 ND ND 0 0

A2 20,21 5,77 5,54 5,67 71,18 71,90 0,27 3,52

A3 45,30 25,45 15,54 5,52 77,37 78,95 0,34 1,71

A4 67,05 38,25 17,92 5,54 58,80 60,62 0,27 0,88

A5 92,86 49,45 26,02 5,45 57,26 59,64 0,28 0,62

DO600: densidade óptica, λ=600 nm. [X]: massa seca celular. Px: produtividade em célula. Pp: produtividade em produto (L-ASNase).

ND: não determinado.

APÊNDICE C. Dados online do Biorreator BIOSTAT® B-MO no Ensaio 1 (sem controle de OD, OD < 20%). Os valores de OUR, CER e RQ

foram calculados com base em dados do fluxo de entrada e frações molares dos gases na saída de ar fornecidos pelo equipamento.

Data/hora tempo temperat agitação pH OD aeração HCl 20% NaOH 20% OUR CER RQ

(h) (°C) (rpm) (pH) (%sat) (LpM) (ml) (ml) mmol/L.h mmol/L.h

26/02/2018 19:18 0 15,0 600 5,43 90,08 1,0 2 4 0,513 -0,311 -0,606

26/02/2018 20:18 1 15,0 600 5,54 79,50 1,0 2 4 1,350 0,234 0,173

26/02/2018 21:18 2 15,0 600 5,56 77,16 1,0 2 4 1,355 0,220 0,162

26/02/2018 22:18 3 15,0 600 5,59 73,90 1,0 2 4 1,362 0,203 0,149

26/02/2018 23:18 4 15,0 600 5,63 71,79 1,0 2 4 1,368 0,186 0,136

27/02/2018 00:18 5 15,0 600 5,63 68,46 1,0 2 4 1,364 0,209 0,153

27/02/2018 01:18 6 15,0 600 5,63 65,09 1,0 2 4 1,729 0,329 0,190

123



27/02/2018 02:18 7 15,0 600 5,64 62,60 1,0 2 4 2,092 0,500 0,239

27/02/2018 03:18 8 15,0 600 5,68 60,19 1,0 2 4 2,636 0,657 0,249

27/02/2018 04:18 9 15,0 600 5,73 57,66 1,0 2 4 3,039 0,929 0,306

27/02/2018 05:18 10 15,0 600 5,79 55,04 1,0 2 4 3,142 1,025 0,326

27/02/2018 06:18 11 15,0 600 5,85 52,71 1,0 2 4 3,102 1,205 0,388

27/02/2018 07:18 12 15,0 600 5,90 50,89 1,0 2 4 3,467 1,341 0,387

27/02/2018 08:18 13 15,0 600 5,95 49,45 1,0 2 4 3,011 1,589 0,528

27/02/2018 09:18 14 15,0 600 6,01 47,39 1,0 2 4 3,372 1,745 0,517

27/02/2018 10:18 15 15,0 600 6,06 45,21 1,0 2 4 3,131 2,126 0,679

27/02/2018 11:18 16 15,0 600 6,12 42,72 1,0 2 4 2,878 2,505 0,870

27/02/2018 12:18 17 15,0 600 6,18 40,28 1,0 2 4 2,775 2,887 1,040

27/02/2018 13:18 18 15,0 600 5,54 38,77 1,0 4 9 3,376 3,376 1,000

27/02/2018 14:18 19 15,0 600 5,55 35,81 1,0 4 9 3,313 3,877 1,170

27/02/2018 15:18 20 15,0 600 5,54 33,33 1,0 4 9 4,098 4,499 1,098

27/02/2018 16:18 21 15,0 600 5,55 29,54 1,0 5 9 3,959 5,081 1,283

27/02/2018 17:18 22 15,0 600 5,54 25,92 1,0 5 9 5,407 5,712 1,056

27/02/2018 18:18 23 15,0 600 5,55 23,56 1,0 5 9 6,521 6,135 0,941

27/02/2018 19:18 24 15,0 600 5,55 20,86 1,0 5 9 7,005 6,690 0,955

27/02/2018 20:18 25 15,0 600 5,54 19,85 1,0 5 9 8,274 6,963 0,842

27/02/2018 21:18 26 15,0 600 5,52 19,07 1,0 5 9 8,448 7,418 0,878

27/02/2018 22:18 27 15,0 600 5,54 18,50 1,0 5 9 8,839 7,520 0,851

27/02/2018 23:18 28 15,0 600 5,53 17,75 1,0 5 9 8,826 7,657 0,868

28/02/2018 00:18 29 15,0 600 5,55 17,30 1,0 5 9 9,264 7,835 0,846

28/02/2018 01:18 30 15,0 600 5,53 16,61 1,0 5 9 9,349 8,103 0,867

28/02/2018 02:18 31 15,0 600 5,55 16,10 1,0 6 9 9,662 8,523 0,882

124



28/02/2018 03:18 32 15,0 600 5,53 15,89 1,0 6 9 9,645 8,682 0,900

28/02/2018 04:18 33 15,0 600 5,55 15,43 1,0 6 9 9,991 8,935 0,894

28/02/2018 05:18 34 15,0 600 5,53 14,90 1,0 6 9 10,556 9,212 0,873

28/02/2018 06:18 35 15,0 600 5,55 14,45 1,0 6 9 10,670 9,520 0,892

28/02/2018 07:18 36 15,0 600 5,53 15,10 1,0 6 9 8,913 9,728 1,091

28/02/2018 08:18 37 15,0 600 5,51 15,59 1,0 6 9 7,500 9,819 1,309

28/02/2018 09:18 38 15,0 600 5,52 14,86 1,0 6 9 7,981 9,947 1,246

28/02/2018 10:18 39 15,0 600 5,55 14,70 1,0 6 9 7,800 9,959 1,277

28/02/2018 11:18 40 15,0 600 5,48 14,70 1,0 6 9 10,045 12,085 1,203

28/02/2018 12:18 41 15,0 600 5,12 12,52 1,0 16,48 21,97 8,804 12,601 1,431

28/02/2018 13:18 42 14,9 600 6,56 11,87 1,0 32,48 25,97 6,513 9,453 1,451

28/02/2018 14:18 43 15,0 600 6,62 12,33 1,0 34,48 25,97 7,987 10,229 1,281

28/02/2018 15:18 44 15,0 600 6,70 11,97 1,0 35,48 25,97 5,997 9,948 1,659

28/02/2018 16:18 45 15,0 600 6,74 11,21 1,0 36,48 25,97 6,544 9,507 1,453

28/02/2018 17:18 46 15,0 600 5,53 11,05 1,0 37,48 26,97 8,083 10,069 1,246

28/02/2018 18:18 47 15,0 600 5,52 10,74 1,0 37,48 26,97 8,696 10,465 1,204

28/02/2018 19:18 48 15,0 600 5,51 10,70 1,0 37,48 26,97 9,402 10,732 1,141

28/02/2018 20:18 49 15,0 600 5,52 10,26 1,0 37,48 26,97 9,447 10,363 1,097

28/02/2018 21:18 50 15,0 600 5,50 9,56 1,0 37,48 26,97 9,577 10,168 1,062

28/02/2018 22:18 51 15,0 600 5,49 9,23 1,0 37,48 26,97 9,490 10,050 1,059

28/02/2018 23:18 52 15,0 600 5,45 9,01 1,0 37,48 26,97 9,633 10,127 1,051

01/03/2018 00:18 53 15,0 600 5,47 8,85 1,0 37,48 26,97 9,404 9,928 1,056

01/03/2018 01:18 54 15,0 600 5,50 8,64 1,0 37,48 26,97 9,410 9,713 1,032

01/03/2018 02:18 55 15,0 600 5,53 8,39 1,0 37,48 26,97 9,120 9,305 1,020

01/03/2018 03:18 56 15,0 600 5,47 8,31 1,0 37,48 26,97 9,485 9,331 0,984

125



01/03/2018 04:18 57 15,0 600 5,50 8,11 1,0 37,48 26,97 9,529 9,243 0,970

01/03/2018 05:18 58 15,0 600 5,46 7,91 1,0 37,48 26,97 9,550 9,116 0,955

01/03/2018 06:18 59 15,0 600 5,46 7,96 1,0 37,48 26,97 9,569 9,205 0,962

01/03/2018 07:18 60 15,0 600 5,54 8,04 1,0 37,48 26,97 9,100 9,173 1,008

01/03/2018 08:18 61 15,0 600 5,55 8,24 1,0 37,48 26,97 8,569 9,112 1,063

01/03/2018 09:18 62 15,0 600 5,53 8,11 1,0 37,48 26,97 6,958 8,809 1,266

01/03/2018 10:18 63 15,0 600 5,46 8,16 1,0 37,48 26,97 7,009 8,604 1,228

01/03/2018 11:18 64 14,9 600 5,18 6,02 1,0 37,48 32,97 9,630 10,873 1,129

01/03/2018 12:18 65 15,0 600 5,55 7,25 1,0 37,48 32,97 9,747 10,949 1,123

01/03/2018 13:18 66 15,0 600 4,61 6,13 1,0 37,48 32,97 11,105 13,560 1,221

01/03/2018 14:18 67 15,0 600 5,56 6,07 1,0 37,48 32,97 13,288 12,694 0,955

01/03/2018 15:18 68 15,0 600 5,54 6,40 1,0 37,48 32,97 11,062 10,976 0,992

01/03/2018 16:18 69 15,0 600 5,51 6,71 1,0 37,48 32,97 15,126 14,196 0,939

01/03/2018 17:18 70 14,9 600 5,56 5,54 1,0 38,48 33,77 17,984 14,095 0,784

01/03/2018 18:18 71 15,0 600 5,51 5,60 1,0 38,48 33,77 16,205 14,529 0,897

01/03/2018 19:18 72 15,0 600 5,56 5,67 1,0 38,48 33,77 16,781 14,949 0,891

01/03/2018 20:18 73 15,0 600 5,53 5,60 1,0 38,48 33,77 16,856 14,915 0,885

01/03/2018 21:18 74 15,0 600 5,56 5,61 1,0 38,48 33,77 18,323 14,846 0,810

01/03/2018 22:18 75 15,0 600 5,51 5,55 1,0 38,48 33,77 18,417 14,877 0,808

01/03/2018 23:18 76 14,9 600 5,54 23,01 1,0 38,48 33,77 7,796 6,733 0,864

02/03/2018 00:18 77 15,0 600 5,54 27,62 1,0 38,48 33,77 5,746 2,843 0,495

02/03/2018 01:18 78 15,0 600 5,53 28,41 1,0 38,48 33,77 5,384 2,258 0,419

02/03/2018 02:18 79 15,0 600 5,51 28,87 1,0 38,48 33,77 5,259 1,890 0,359

02/03/2018 03:18 80 15,0 600 5,54 29,18 1,0 38,48 33,77 5,347 1,598 0,299

02/03/2018 04:18 81 15,0 600 5,52 29,33 1,0 38,48 33,77 4,732 1,385 0,293

02/03/2018 05:18 82 15,0 600 5,55 29,53 1,0 38,48 33,77 4,959 1,207 0,243

126



02/03/2018 06:18 83 15,0 600 5,53 29,73 1,0 38,48 33,77 4,835 1,059 0,219

02/03/2018 07:18 84 15,0 600 5,55 29,93 1,0 38,48 33,77 4,353 1,037 0,238

02/03/2018 08:18 85 15,1 600 5,52 30,48 1,0 38,48 33,77 2,168 1,148 0,529

02/03/2018 09:18 86 15,0 600 5,55 30,65 1,0 38,48 33,77 1,766 1,079 0,611

02/03/2018 10:18 87 15,0 600 5,51 30,85 1,0 38,48 33,77 0,660 1,059 1,605

02/03/2018 11:18 88 15,0 600 5,54 30,78 1,0 38,48 33,77 0,218 1,049 4,817

02/03/2018 12:18 89 15,0 600 5,50 30,78 1,0 38,48 33,77 -0,754 1,038 -1,377

02/03/2018 13:18 90 15,0 600 5,53 30,78 1,0 38,48 33,77 -1,349 1,053 -0,780

02/03/2018 14:18 91 15,0 600 5,52 30,62 1,0 38,48 33,77 -2,254 1,078 -0,478

02/03/2018 15:18 92 15,0 600 5,54 29,99 1,0 38,48 33,77 0,315 0,689 2,185

02/03/2018 16:18 93 15,0 600 5,48 29,63 1,0 38,48 33,77 1,496 0,472 0,315

APÊNDICE D. Dados do cultivo de L.muscorum CRM 1648 em biorreator no Ensaio 2 (sem controle de OD, OD> 20%)

Amostras tempo

(h)

crescimento pH

L-ASNase

(U.L-1

)

L-ASNase

total (U) [S]sac

(g.L-1

)

[S]pro

(g.L-1

)

Px

(g.L-1

.h-1

)

Pp

(U.L-1

.h-1

) DO600 [X] (g.L-1

)

A1 0,00 1,28 0,61 5,50 72,91 72,19 16,13 16,36 0,00 0,00

A2 6,55 2,08 0,98 ND 82,75 81,09 18,89 18,21 0,15 12,63

A3 15,10 3,57 1,68 6,54 108,96 105,69 18,60 17,32 0,11 7,22

A4 16,49 4,40 3,03 6,67 131,90 126,63 15,54 17,57 0,18 8,00

A5 18,07 5,24 3,27 6,81 155,66 147,88 16,91 17,78 0,18 8,61

A6 20,19 5,87 4,38 6,96 210,55 197,92 15,21 14,91 0,22 10,43

A7 24,29 7,60 5,48 7,27 330,98 307,82 17,74 15,40 0,23 13,63

127

A8 27,31 11,48 7,62 7,50 609,54 560,77 15,92 14,51 0,28 22,32

A9 30,21 14,4 9,89 7,62 881,53 802,20 14,52 12,24 0,33 29,18

A10 33,28 21,04 12,39 7,70 1074,88 967,39 13,08 8,48 0,37 32,30

A11 36,55 30,2 16,11 7,75 1712,27 1523,92 11,58 3,51 0,44 46,85

A12 42,42 50,8 22,61 7,85 3154,19 2775,68 5,76 1,20 0,53 74,36

A13 47,35 58,6 27,41 8,23 3572,01 3107,65 2,32 0,52 0,58 75,44

A14 63,16 50,9 27,26 8,65 3793,22 3262,17 0,42 0,25 0,43 60,06

A15 74,22 53,8 26,49 8,48 3817,79 3245,13 0,07 0,31 0,36 51,44

A16 89,02 45,6 25,74 8,68 3801,41 3193,18 0,11 0,14 0,29 42,70

DO600: densidade óptica, λ=600 nm. [X]: massa seca celular. [S]sac: concentração de sacarose. [S]pro: concentração de prolina. Px:

produtividade em célula. Pp: produtividade em produto (L-ASNase).

APÊNDICE E. Dados online do Biorreator BIOSTAT® B-MO no ensaio 2 (sem controle de OD, OD > 20%). Os valores de OUR, CER e RQ

foram calculados com base em dados do fluxo de entrada e frações molares dos gases na saída de ar fornecidos pelo equipamento.

Data/hora tempo temperat. agitação pH OD aeração OUR CER RQ

(h) (°C) (rpm) (%sat) (LpM) mmol/L.h mmol/L.h

30/06/2018 16:08 0 15,0 200 5,16 93,72 1,0 0,089 0,609

30/06/2018 17:08 1 15,0 200 5,23 86,95 1,0 0,457 -0,048 -0,105

30/06/2018 18:08 2 15,0 200 5,30 84,30 1,0 0,840 0,000 0,000

30/06/2018 19:08 3 15,0 200 5,36 83,22 1,0 0,849 -0,016 -0,018

30/06/2018 20:08 4 15,0 200 5,41 80,47 1,0 1,223 0,083 0,068

30/06/2018 21:08 5 15,0 274 5,44 79,83 1,0 1,941 0,088 0,045

30/06/2018 22:08 6 15,0 385 5,50 79,74 1,0 2,114 0,239 0,113

30/06/2018 23:08 7 15,0 406 5,57 79,80 1,0 2,849 0,388 0,136

128



01/07/2018 00:08 8 15,0 555 5,70 79,72 1,0 2,737 0,563 0,206

01/07/2018 01:08 9 15,0 626 5,79 79,35 1,0 3,118 0,694 0,223

01/07/2018 02:08 10 15,0 1116 5,81 78,89 1,0 3,822 0,893 0,234

01/07/2018 03:08 11 15,0 1200 5,70 79,53 1,0 3,686 0,982 0,266

01/07/2018 04:08 12 15,0 1200 5,69 77,40 1,0 4,196 1,098 0,262

01/07/2018 05:08 13 15,0 1200 5,70 74,57 1,0 4,550 1,332 0,293

01/07/2018 06:08 14 15,0 1200 5,72 71,95 1,0 4,812 1,634 0,340

01/07/2018 07:08 15 15,0 1200 5,75 70,52 1,0 5,084 1,874 0,369

01/07/2018 08:08 16 14,9 1200 5,82 69,84 1,0 5,333 2,214 0,415

01/07/2018 09:08 17 15,0 1200 5,93 67,25 1,0 5,247 2,644 0,504

01/07/2018 10:08 18 15,0 1200 6,04 65,30 1,0 5,168 3,056 0,591

01/07/2018 11:08 19 15,0 1200 6,13 63,43 1,0 5,565 3,628 0,652

01/07/2018 12:08 20 15,0 1200 6,22 61,89 1,0 5,498 4,139 0,753

01/07/2018 13:08 21 15,0 1200 6,30 61,53 1,0 6,253 4,800 0,768

01/07/2018 14:08 22 15,0 1200 6,38 60,84 1,5 6,109 5,373 0,880

01/07/2018 15:08 23 15,0 1200 6,44 59,57 1,5 6,257 6,207 0,992

01/07/2018 16:08 24 15,0 1200 6,52 58,18 1,5 6,556 6,883 1,050

01/07/2018 17:08 25 15,0 1200 6,62 55,32 1,5 7,553 7,331 0,971

01/07/2018 18:08 26 15,0 1200 6,71 52,36 1,5 9,807 8,107 0,827

01/07/2018 19:08 27 15,0 1200 6,77 50,60 1,5 11,308 8,920 0,789

01/07/2018 20:08 28 14,9 1200 6,84 49,01 1,5 13,366 9,729 0,728

01/07/2018 21:08 29 15,0 1200 6,91 47,58 1,5 13,959 10,694 0,766

01/07/2018 22:08 30 15,0 1200 6,94 46,62 1,5 15,352 12,030 0,784

01/07/2018 23:08 31 15,0 1200 6,95 45,46 1,5 16,033 12,861 0,802

02/07/2018 00:08 32 15,0 1200 7,04 44,02 1,5 17,682 14,141 0,800

02/07/2018 01:08 33 15,0 1200 7,09 43,01 1,5 18,110 14,991 0,828

129



02/07/2018 02:08 34 15,0 1200 7,11 41,91 1,5 18,890 15,664 0,829

02/07/2018 03:08 35 15,0 1200 7,10 40,86 1,5 21,233 16,972 0,799

02/07/2018 04:08 36 15,0 1200 7,09 39,87 1,5 21,847 18,405 0,842

02/07/2018 05:08 37 15,0 1200 7,11 39,16 1,5 21,846 18,930 0,867

02/07/2018 06:08 38 15,0 1200 7,12 37,89 1,5 22,720 20,022 0,881

02/07/2018 07:08 39 15,0 1200 7,12 37,19 1,5 25,060 20,867 0,833

02/07/2018 08:08 40 15,0 1200 7,13 36,95 1,5 24,776 21,440 0,865

02/07/2018 09:08 41 15,0 1200 7,14 36,97 1,5 25,051 22,226 0,887

02/07/2018 10:08 42 15,0 1200 7,17 36,89 1,5 24,959 22,889 0,917

02/07/2018 11:08 43 15,0 1200 7,21 36,89 1,5 24,187 23,068 0,954

02/07/2018 12:08 44 15,0 1200 7,25 36,43 1,5 22,777 23,196 1,018

02/07/2018 13:08 45 15,0 1200 7,30 36,32 1,5 22,270 22,743 1,021

02/07/2018 14:08 46 15,0 1200 7,39 36,66 1,5 18,769 17,029 0,907

02/07/2018 15:08 47 15,0 1200 7,50 37,36 1,5 14,218 12,959 0,911

02/07/2018 16:08 48 15,0 1200 7,58 37,00 1,5 12,221 10,961 0,897

02/07/2018 17:08 49 15,0 1200 7,63 35,84 1,5 11,547 9,778 0,847

02/07/2018 18:08 50 15,0 1200 7,67 34,84 1,5 11,837 8,944 0,756

02/07/2018 19:08 51 15,0 1200 7,71 34,44 1,5 12,047 8,399 0,697

02/07/2018 20:08 52 15,0 1200 7,75 33,98 1,5 11,451 7,837 0,684

02/07/2018 21:08 53 15,0 1200 7,78 33,51 1,5 11,675 7,521 0,644

02/07/2018 22:08 54 15,0 1200 7,80 33,16 1,5 11,797 7,320 0,621

02/07/2018 23:08 55 15,0 1200 7,81 32,71 1,5 11,908 7,193 0,604

03/07/2018 00:08 56 15,0 1200 7,82 32,34 1,5 12,076 7,127 0,590

03/07/2018 01:08 57 15,0 1200 7,83 31,99 1,5 12,284 7,021 0,572

03/07/2018 02:08 58 15,0 1200 7,84 31,58 1,5 12,187 6,978 0,573

03/07/2018 03:08 59 15,0 1200 7,87 31,29 1,5 12,328 6,741 0,547

130

Data/hora

tempo temperat. agitação pH

OD aeração OUR CER RQ


03/07/2018 04:08 60 15,0 1200 7,92 31,00 1,5 13,310 7,324 0,550

03/07/2018 05:08 61 15,0 1200 7,61 31,00 1,5 13,162 7,207 0,548

03/07/2018 06:08 62 15,0 1200 7,51 30,94 1,5 13,324 6,819 0,512

03/07/2018 07:08 63 15,0 1200 7,47 30,76 1,5 13,230 6,673 0,504

03/07/2018 08:08 64 15,0 1200 7,48 30,71 1,5 13,010 5,654 0,435

03/07/2018 09:08 65 15,0 1200 7,53 30,76 1,5 11,079 5,687 0,513

03/07/2018 10:08 66 15,0 1200 7,59 30,82 1,5 9,948 5,651 0,568

03/07/2018 11:08 67 15,0 1200 7,64 30,71 1,5 9,195 5,682 0,618

03/07/2018 12:08 68 15,0 1200 7,67 30,45 1,5 9,381 5,180 0,552

03/07/2018 13:08 69 15,0 1200 7,69 30,12 1,5 9,745 5,055 0,519

03/07/2018 14:08 70 15,0 1200 7,71 29,89 1,5 9,148 5,038 0,551

03/07/2018 15:08 71 15,0 1200 7,72 29,60 1,5 9,667 4,837 0,500

03/07/2018 16:08 72 15,0 1200 7,73 29,42 1,5 9,777 4,645 0,475

03/07/2018 17:08 73 15,0 1200 7,74 29,07 1,5 10,750 4,377 0,407

03/07/2018 18:08 74 15,0 1200 7,75 28,84 1,5 12,101 4,347 0,359

03/07/2018 19:08 75 15,0 1200 7,75 28,66 1,5 10,985 4,034 0,367

03/07/2018 20:08 76 15,0 1200 7,75 28,43 1,5 12,150 3,889 0,320

03/07/2018 21:08 77 15,0 1200 7,76 28,31 1,5 12,488 3,771 0,302

03/07/2018 22:08 78 15,0 1200 7,76 28,25 1,5 13,684 3,622 0,265

03/07/2018 23:08 79 15,0 1200 7,76 28,14 1,5 12,759 3,377 0,265

04/07/2018 00:08 80 15,0 1200 7,77 28,08 1,5 12,892 3,178 0,246

04/07/2018 01:08 81 15,0 1200 7,78 28,02 1,5 12,967 3,238 0,250

04/07/2018 02:08 82 15,0 1200 7,79 27,90 1,5 9,686 3,009 0,311

04/07/2018 03:08 83 15,0 1200 7,80 27,85 1,5 12,793 2,854 0,223

04/07/2018 04:08 84 15,0 1200 7,81 27,85 1,5 11,960 2,945 0,246

04/07/2018 05:08 85 15,0 1200 7,81 27,81 1,5 12,126 2,624 0,216

131

Data/hora

tempo temperat. agitação pH

OD aeração OUR CER RQ


04/07/2018 06:08 86 15,0 1200 7,83 27,79 1,5 12,251 2,454 0,200

04/07/2018 07:08 87 15,0 1200 7,83 27,79 1,5 12,390 2,235 0,180

04/07/2018 08:08 88 15,0 1200 7,83 27,73 1,5 12,498 2,173 0,174

04/07/2018 09:08 89 15,0 1200 7,82 27,98 1,5 11,457 1,815 0,158

04/07/2018 10:08 90 15,0 1200 7,81 27,90 1,5 10,458 1,679 0,161

04/07/2018 11:08 91 15,0 1200 7,83 27,85 1,5 10,293 2,081 0,202

04/07/2018 12:08 92 15,0 1200 7,85 27,85 1,5 9,105 1,915 0,210

04/07/2018 13:08 93 15,0 1200 7,86 27,85 1,5 8,786 1,626 0,185

04/07/2018 14:08 94 15,0 1200 7,87 28,02 1,5 7,370 1,777 0,241

04/07/2018 15:08 95 15,0 1200 7,89 28,14 1,5 5,510 2,119 0,385

04/07/2018 16:08 96 15,0 1200 7,91 27,96 1,5 2,604 1,749 0,671

132

APÊNDICE F. Dados do cultivo de L.muscorum CRM 1648 em biorreator no Ensaio 3 (OD controlado em 80%)

Amostras tempo

(h)

crescimento pH

L-ASNase

(U.L-1

)

L-ASNase

total (U) [S]sac

(g.L-1

)

[S]pro

(g.L-1

)

Px

(g.L-1

.h-1

)

Pp

(U.L-1

.h-1

) DO600 [X] (g.L-1

)

A1 0,00 1,28 0,43 5,77 101,21 100,19 17,87 14,87 0,00 0,00

A2 10,22 2,63 1,03 6,24 146,70 143,77 18,72 18,50 0,10 14,35

A3 13,72 3,15 1,08 6,62 116,06 112,58 16,13 15,55 0,08 8,46

A4 16,30 5,60 1,86 6,72 202,41 194,32 17,53 16,53 0,11 12,42

A5 19,52 7,13 3,94 6,97 309,19 293,73 17,21 15,96 0,20 15,84

A6 24,70 13,72 7,08 7,31 726,09 682,53 14,04 13,99 0,29 29,40

A7 30,81 25,92 10,6 7,48 1782,73 1657,94 6,72 12,27 0,34 57,86

A8 35,14 39,36 13,43 7,41 2799,44 2575,49 0,90 8,82 0,38 79,67

A9 38,64 50,88 19,06 7,62 3723,31 3388,21 0,39 6,59 0,49 96,36

A10 41,08 67,70 20,22 7,89 4763,23 4286,91 0,52 3,27 0,49 115,95

A11 50,0 60,80 24,14 8,3 5338,90 4751,62 0,46 0,64 0,48 106,78

A12 66,0 60,20 26,15 8,32 4958,22 4363,23 0,37 0,16 0,40 75,70



133

APÊNDICE G. Dados online do Biorreator BIOSTAT® B-MO no Ensaio 3 (OD 80%). Os valores de OUR, CER e RQ foram calculados com

base em dados do fluxo de entrada e frações molares dos gases na saída de ar fornecidos pelo equipamento. ValvO2 corresponde a porcentagem

de tempo de abertura da válvula de O2 puro.

Data/Hora tempo temperat. agitação pH OD aeração ValvO2 CER

(h) (°C) (rpm)

(%sat) (LpM) (%) mmol/L.h

24/08/2018 21:17 0 15,7 600 5,65 99,08 1,0 0,0 -0,140

24/08/2018 22:17 1 15,0 600 5,93 96,80 1,0 0,0 -0,031

24/08/2018 23:17 2 15,0 600 5,95 96,30 1,0 0,0 0,077

25/08/2018 00:17 3 15,0 600 5,95 95,39 1,0 0,0 0,204

25/08/2018 01:17 4 15,0 600 5,98 94,96 1,0 0,0 0,272

25/08/2018 02:17 5 15,0 600 6,07 93,84 1,0 0,0 0,351

25/08/2018 03:17 6 15,0 600 6,26 93,33 1,0 0,0 0,560

25/08/2018 04:17 7 15,0 600 6,32 92,61 1,0 0,0 0,668

25/08/2018 05:17 8 15,0 600 6,39 91,54 1,0 0,0 0,911

25/08/2018 06:17 9 15,0 600 6,45 89,77 1,0 0,0 1,101

25/08/2018 07:17 10 15,0 600 6,51 89,09 1,0 0,0 1,202

25/08/2018 08:17 11 15,0 600 6,58 86,52 1,0 0,0 1,482

25/08/2018 09:17 12 15,0 600 6,63 86,20 1,0 0,0 1,737

25/08/2018 10:17 13 15,0 600 6,68 81,79 1,0 0,0 2,133

25/08/2018 11:17 14 15,1 600 6,73 81,45 1,0 0,6 2,468

25/08/2018 12:17 15 15,0 600 6,81 81,60 1,0 1,2 2,806

25/08/2018 13:17 16 15,0 600 6,89 79,90 1,0 0,8 3,317

25/08/2018 14:17 17 15,0 600 6,96 87,30 1,0 1,3 3,846

25/08/2018 15:17 18 15,0 600 7,08 79,85 1,0 3,9 4,263

25/08/2018 16:17 19 15,0 600 7,20 82,48 1,0 5,4 4,981

25/08/2018 17:17 20 15,0 600 7,35 77,88 1,0 5,4 5,555

134


(h) (°C) (rpm)


25/08/2018 18:17 21 15,0 600 7,51 81,62 1,0 4,7 6,298

25/08/2018 19:17 22 15,0 600 7,55 88,21 1,0 1,1 6,717

25/08/2018 20:17 23 15,0 600 7,66 75,50 1,0 9,5 7,364

25/08/2018 21:17 24 15,0 600 7,70 99,63 1,0 8,9 8,240

25/08/2018 22:17 25 15,0 600 7,77 83,18 1,0 12,6 8,933

25/08/2018 23:17 26 15,0 600 7,85 90,23 1,0 11,6 10,163

26/08/2018 00:17 27 15,0 600 7,93 86,86 1,0 8,8 9,654

26/08/2018 01:17 28 15,0 600 7,95 78,04 1,0 11,2 10,915

26/08/2018 02:17 29 15,0 600 7,98 87,90 1,0 18,1 10,362

26/08/2018 03:17 30 15,0 600 8,01 88,19 1,0 14,6 11,030

26/08/2018 04:17 31 15,0 600 8,03 64,44 1,0 27,4 10,217

26/08/2018 05:17 32 15,0 600 8,05 72,25 1,0 22,8 12,631

26/08/2018 06:17 33 15,0 600 8,09 83,03 1,0 9,6 10,675

26/08/2018 07:17 34 15,0 600 8,09 98,73 1,0 16,6 10,833

26/08/2018 08:17 35 15,0 600 8,12 56,65 1,0 29,7 11,302

26/08/2018 09:17 36 15,0 600 8,15 72,10 1,0 23,7 11,210

26/08/2018 10:17 37 15,0 600 8,11 68,71 1,0 24,3 10,583

26/08/2018 11:17 38 15,0 600 8,12 80,10 1,0 17,0 12,620

26/08/2018 12:17 39 15,0 600 8,12 83,69 1,0 15,9 13,567

26/08/2018 13:17 40 15,0 600 8,13 72,36 1,0 16,7 13,917

26/08/2018 14:17 41 15,0 600 8,12 78,39 1,0 16,4 14,147

26/08/2018 15:17 42 15,0 600 8,13 80,30 1,0 16,1 14,062

26/08/2018 16:17 43 15,0 600 8,16 93,13 1,0 15,7 12,027

26/08/2018 17:17 44 15,0 600 8,24 88,94 1,0 10,0 9,405

26/08/2018 18:17 45 15,0 600 8,27 101,40 1,0 10,0 7,568

26/08/2018 19:17 46 15,0 600 8,29 122,52 1,0 10,0 6,831

135


(h) (°C) (rpm)


26/08/2018 20:17 47 15,0 600 8,32 111,81 1,0 10,0 6,267

26/08/2018 21:17 48 15,0 600 8,32 117,98 1,0 10,0 5,821

26/08/2018 22:17 49 15,0 600 8,33 119,43 1,0 10,0 5,309

26/08/2018 23:17 50 15,0 600 8,29 75,99 1,0 2,5 6,301

27/08/2018 00:17 51 15,0 600 8,30 76,14 1,0 2,5 6,161

27/08/2018 01:17 52 15,0 600 8,30 79,06 1,0 2,5 6,021

27/08/2018 02:17 53 15,0 600 8,27 77,10 1,0 2,4 5,565

27/08/2018 03:17 54 15,0 600 8,27 78,50 1,0 2,5 5,639

27/08/2018 04:17 55 15,0 600 8,27 79,81 1,0 2,2 5,653

27/08/2018 05:17 56 15,0 600 8,25 79,54 1,0 2,2 5,551

27/08/2018 06:17 57 15,0 600 8,27 82,79 1,0 2,2 5,502

27/08/2018 07:17 58 15,0 600 8,26 82,87 1,0 2,3 5,312

27/08/2018 08:17 59 15,0 600 8,25 81,28 1,0 2,0 5,351

27/08/2018 09:17 60 15,0 600 8,25 70,96 1,0 2,0 5,195

27/08/2018 10:17 61 15,0 600 8,24 69,56 1,0 2,0 5,242

27/08/2018 11:17 62 15,0 600 8,24 78,59 1,0 1,1 4,992

27/08/2018 12:17 63 15,0 600 8,22 78,00 1,0 1,6 4,834

27/08/2018 13:17 64 15,0 600 8,22 79,23 1,0 1,6 4,742

27/08/2018 14:17 65 15,0 600 8,21 76,25 1,0 1,6 4,661

136

APÊNDICE H. Dados do cultivo de L.muscorum CRM1648 em biorreator no Ensaio 4 (OD controlado em 20%).

Amostras tempo

(h)

crescimento pH

L-ASNase

(U.L-1

)

L-ASNase

total (U) [S]sac

(g.L-1

)

[S]pro

(g.L-1

)

Px

(g.L-1

.h-1

)

Pp

(U.L-1

.h-1

) DO600 [X] (g.L-1

)

A1 0,00 2,12 0,60 5,68 203,34 203,34 15,77 21,01 0,00 0,00

A2 6,00 1,88 0,90 6,30 100,28 97,75 12,13 16,98 0,10 16,71

A3 17,00 5,43 2,02 6,39 287,84 269,18 17,84 25,52 0,12 16,93

A4 23,24 7,58 4,08 6,83 412,26 376,63 14,13 20,13 0,18 17,74

A5 29,20 13,62 6,44 7,24 698,24 622,80 11,99 16,84 0,22 23,91

A6 37,20 28,64 13,10 7,60 1816,16 1567,62 5,28 13,55 0,35 48,82

A7 42,60 41,90 14,76 7,50 2822,66 2385,53 0,50 11,20 0,35 66,26

A8 47,05 55,20 20,28 7,57 3992,57 3302,36 0,50 9,40 0,43 84,86

A9 52,50 66,80 26,68 8,19 5116,06 4139,48 0,41 3,95 0,51 97,45

A10 60,95 61,20 23,50 8,33 6063,14 4709,20 0,27 3,15 0,39 99,48

A11 68,10 56,60 40,50 8,61 5143,92 3865,54 0,33 2,05 0,59 75,53



137

APÊNDICE I. Dados online do Biorreator BIOSTAT® B-MO no ensaio 4 (OD 20%). Os valores de OUR, CER e RQ foram calculados com base

em dados do fluxo de entrada e frações molares dos gases na saída de ar fornecidos pelo equipamento. ValvO2 corresponde a porcentagem de

tempo de abertura da válvula de O2 puro.

Data/hora tempo temperat. agitação pH OD aeração ValvO2 CER

(h) (°C) (rpm) (%sat) (LpM) (%) mmol/L.h

14/09/2018 23:37 6 15 600 5,9 70,3 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 00:37 7 15 600 5,9 57,2 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 01:37 8 15 600 5,9 50,8 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 02:37 9 15 600 6,0 40,1 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 03:37 10 15 600 6,0 28,0 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 04:37 11 15 600 6,0 23,0 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 05:37 12 15 600 6,1 20,2 0,0 0,3 0,00

15/09/2018 06:37 13 15 600 6,1 20,6 0,0 0,6 0,00

15/09/2018 07:37 14 15 600 6,2 24,1 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 08:37 15 15 600 6,2 23,2 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 09:37 16 15 600 6,3 27,1 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 10:37 17 15 600 6,3 34,7 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 11:37 18 15 600 6,4 19,7 0,0 1,1 0,00

15/09/2018 12:37 19 15 600 6,4 34,5 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 13:37 20 15 600 6,5 20,4 0,0 0,3 0,00

15/09/2018 14:37 21 15 600 6,6 20,8 0,0 0,5 0,00

15/09/2018 15:37 22 15 600 6,6 17,2 0,0 7,0 0,00

15/09/2018 16:37 23 15 600 6,7 19,8 0,0 1,2 0,00

15/09/2018 17:37 24 15 600 6,8 29,5 0,0 0,0 0,00

15/09/2018 18:37 25 15 600 6,9 19,5 0,0 1,7 0,00

15/09/2018 19:37 26 15 600 7,0 21,3 0,0 9,9 0,00

138



15/09/2018 20:37 27 15 600 7,0 20,3 0,0 1,6 0,00

15/09/2018 21:37 28 15 600 7,1 22,5 0,0 6,3 0,00

15/09/2018 22:37 29 15 600 7,2 15,4 0,0 19,3 0,00

15/09/2018 23:37 30 15 600 7,2 19,8 0,0 14,5 0,00

16/09/2018 00:37 31 15 600 7,3 20,8 0,0 15,1 0,00

16/09/2018 01:37 32 15 600 7,4 21,0 0,0 11,6 0,00

16/09/2018 02:37 33 15 600 7,5 19,5 0,0 19,5 0,00

16/09/2018 03:37 34 15 600 7,5 10,5 0,0 20,0 0,00

16/09/2018 04:37 35 15 600 7,5 10,2 0,0 20,0 0,00

16/09/2018 05:37 36 15 600 7,6 5,2 0,0 20,0 0,00

16/09/2018 06:37 37 15 600 7,6 5,8 0,0 20,0 0,00

16/09/2018 07:37 38 15 600 7,7 17,3 0,0 42,4 0,00

16/09/2018 08:37 39 15 600 7,8 18,5 0,0 49,2 0,00

16/09/2018 09:37 40 15 600 7,8 21,3 0,0 64,6 0,00

16/09/2018 10:37 41 15 600 7,9 11,1 0,0 100,0 0,00

16/09/2018 11:37 42 15 600 7,9 9,0 0,0 100,0 0,00

16/09/2018 12:37 43 15 600 7,8 18,8 1,0 11,0 16,87

16/09/2018 13:37 44 15 600 7,7 19,5 1,0 16,0 15,81

16/09/2018 14:37 45 15 600 7,7 14,6 1,0 16,0 16,33

16/09/2018 15:37 46 15 600 7,7 12,3 1,0 16,0 16,94

16/09/2018 16:37 47 15 600 7,7 12,0 1,0 16,0 17,43

16/09/2018 17:37 48 15 600 7,8 23,9 1,0 25,0 13,12

16/09/2018 18:37 49 15 600 7,8 28,6 1,0 24,0 11,91

16/09/2018 19:37 50 15 600 8,0 58,0 1,0 24,0 6,79

16/09/2018 20:37 51 15 600 8,1 76,3 1,0 24,0 5,04

16/09/2018 21:37 52 15 600 8,1 113,8 1,0 24,0 4,39

139



16/09/2018 22:37 53 15 600 8,1 117,2 1,0 24,0 4,07

16/09/2018 23:37 54 15 600 8,1 17,8 1,0 1,0 6,96

17/09/2018 00:37 55 15 600 8,1 16,2 1,0 1,0 6,94

17/09/2018 01:37 56 15 600 8,1 11,5 1,0 1,0 6,64

17/09/2018 02:37 57 15 600 8,1 11,1 1,0 1,0 6,51

17/09/2018 03:37 58 15 600 8,2 9,4 1,0 1,0 6,33

17/09/2018 04:37 59 15 600 8,2 8,8 1,0 1,0 6,32

17/09/2018 05:37 60 15 600 8,2 8,4 1,0 1,0 6,24

17/09/2018 06:37 61 15 600 8,2 8,3 1,0 1,0 6,21

17/09/2018 07:37 62 15 600 8,2 8,5 1,0 1,0 6,21

17/09/2018 08:37 63 15 600 8,3 18,8 1,0 4,0 6,08

17/09/2018 09:37 64 15 600 8,3 20,0 1,0 3,8 5,91

17/09/2018 10:37 65 15 600 8,3 19,9 1,0 3,9 5,92

17/09/2018 11:37 66 15 600 8,3 19,4 1,0 4,0 5,86

17/09/2018 12:37 67 15 600 8,3 19,7 1,0 3,7 5,78

17/09/2018 13:37 68 15 600 8,3 21,8 1,0 3,0 5,75

17/09/2018 14:37 69 15 600 8,3 23,5 1,0 3,0 5,65

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