quantificação de glicose via acido picrico

6
183 Original Article DETERMINAÇÃO RÁPIDA DE AÇÚCARES REDUTORES COM ÁCIDO PÍCRICO PARA USO BIOTECNOLÓGICO RAPID DETERMINATION OF REDUCING SUGARS WITH PICRIC ACID FOR BIOTECHNOLOGICAL USE Nilson PENHA-SILVA 1 ; Alessandra Martinele FONSECA 2 ; Ana Graci BRITO 2 ; Marcia Aguiar de SOUZA- PENHA 2 ; Tales Alexandre Aversi FERREIRA 2 RESUMO: A glicose, bem como outros açúcares redutores, reage com o ácido pícrico, por oxirredução, produzindo um composto colorido que exibe uma extinção molar máxima em 530 nm. Como a extinção em 530 nm é linearmente dependente da concentração ou massa de glicose, esta reação também pode ser usada para a quantificação de açúcares redutores. Este trabalho descreve a padronização do método do ácido pícrico para quantificação de açúcar redutor a partir de condições padronizadas para o método da ortotoluidina. As condições aqui descritas para o método têm sido correntemente utilizadas em nosso laboratório em estudos sobre osmorregulação de proteínas. Sob as condições utilizadas, a relação entre a absorvância em 530 nm e a massa de glicose foi linear na faixa de 0 a 1200 µg do açúcar, sendo descrita pela equação de regressão A 530 = -0,081 + 0,0031 µg de glicose. A utilização de ácido benzóico a 0,25% como solvente da glicose produziu dados que se ajustaram à linha de regressão dada pela equação A 530 = -0,077 + 0,0030 µg de glicose. A comparação das inclinações das duas curvas indicou que a utilização do ácido benzóico como conservante da glicose não afetou o padrão de dependência de A 530 com a massa de glicose (p < 0,0001). A utilização de frutose como açúcar redutor produziu um padrão semelhante de dependência. A sensibilidade do método do ácido pícrico mostrou-se semelhante ao da ortotoluidina quando a concentração de ácido pícrico é de 1,0%, podendo ser superior se a concentração de ácido pícrico for de 2,0%, embora nesta concentração haja precipitação de picrato. UNITERMOS: Determinação de açúcares redutores, Ácido pícrico, Biotecnologia. 1 Professor titular do Instituto de Genética e Bioquímica da Universidade Federal de Uberlândia. 2 Pesquisadores associados ao Laboratório de Enzimologia da Universidade Federal de Uberlândia. INTRODUÇÃO A quantificação de glicose no sangue têm um impor- tante papel no diagnóstico de desordens metabólicas, como o diabetes mellitus, bem como no monitoramento da saúde de seus portadores. O primeiro método para determinação de glicose no sangue foi descrito há mais de 100 anos e desde então vários outros métodos têm sido propostos, tanto de natureza enzimática quanto não enzimática (BURRIN; PRICE, 1985). Os métodos enzimáticos são mais específicos para a quantificação de glicose do que os métodos não enzimáticos de dosagem, sendo mais apropriados para os ensaios clínicos. Entretanto, todos os primeiros métodos de dosagem utilizados eram não enzimáticos (ADDIS; SHEVKY, 1918; BENEDICT, 1919; BENEDICT, 1926; DUBOIS et al., 1956; FOLIN, 1926; FOLIN; WU, 1920; NELSON, 1944; SUMNER, 1924). Os métodos de dosagem por oxirredução, dentre todos os métodos não enzimáticos, mostraram ter uma vali- dade limitada quando os objetos das análises eram materiais biológicos como sangue e urina, cuja composição complexa compreende várias substâncias com caráter redutor (HILLER; LINDER; VAN SLYKE, 1925; WIENER, 1995). Além disto, alguns componentes daqueles materiais bioló- gicos por vezes também mostravam reatividade orgânica com o reagente utilizado. Esta situação pode ser bem exem- plificada pela reação da creatinina com o ácido pícrico, a qual com certeza prejudica a exatidão da dosagem de glicose com este reagente, embora tenha fundamentado o desenvol- vimento de um método de dosagem de creatinina na urina (GREENWALD, 1930; GREENWALD; GROSS, 1924). Além disto, os métodos de dosagem de açúcar por oxirredu- ção demandam um laborioso protocolo de desproteinização (ADDIS; SHEVKY, 1918). Todas estas desvantagens limitaram o uso dos méto- dos oxirredutimétricos em ensaios clínicos e estimularam o Biosci. J., v. 20, n. 3, p. 183-188, Sept./Dec. 2004

Upload: emmanuel-freitas-ferreira

Post on 12-Jul-2016

215 views

Category:

Documents


0 download

DESCRIPTION

Um metodo alternativo para quantificar glicose

TRANSCRIPT

Page 1: quantificação de glicose via acido picrico

���

+ �!����$ ����

����� ��������� ��� �����/�������������������� ������� ������� ��� � ��������� ��

����� ���������� ��� ������� ������� ���� ����� ���� ��������������������

! ������%!(�2�������� ������������� ���.#!�%������������� � -��"#������� ����� ��� �� �#*+�2�%!(����"������$��������� �.%��%����

('��,%H�$�!�����3���#��#����� ����/9� ��� ����� ��3� ��!���#���7�����I ��3��� ��6� ���/0�3�� ���-����#��#��������� ����4����6�����#���6��/0��#��� �#76�#���#���*�#��"�#�����6��/0���#���*�#�@����� #������������������ �/0�����#��������!�����3������ ��/0����#�@#�������� ��������� ����4�������/0������/9� �� ����� ����E����� ���������� ��������� ��-�/0�����#@��������7�����I ����� ��4�������/0������/9� � ����� ����� �� ������/5������ ��-������� ����#@��������� ������������$�����/5����4������ ������� ����#@������J#������� ���#��������-������#���������� ��2 ����#������������ ����#� �!���/0������ ���I����B���������/5��������-����3��� ���/0���� ������� �G����#���*�#�����#��������!�������������� ������6�����*����&**�u!�����/9� 3��������� ����������4��/0���� �! ���0��$

���Z�.*3*���c�*3**���u!����!�������$������-�/0�����7������-2�����*3&�K��#�������������!�����

� ���-���������4�������1���� �#�N��������� �! ���0�������������4��/0��$���Z�.*3*''�c�*3**�*�u!����!�������$��#�� �/0�

��������/5������������� ����������4����������-�/0�����7������-2����#����� ��������!������0������������� 0����������J������$

����#���#��������!������:��v�*3***�;��$������-�/0������ �������#���/9� � ����� �� ���-��

�#���� 0����#���������������J����$�����������������#@��������7�����I ���#��� ��.�����#�������������� ����������4���������� �/0�����7�����I ���@�����3*K3���������� ����� �� ��������� �/0�����7�����I ����� ����&3*K3�#�� ���������� �/0����1��� ������/0������� ����

���.'(,%�H�<��� #��/0������/9� ��� ����� ��3�b�����I ��3���������!���

�����4����������!�����$���������������3������M��O�( ����������������� ����!�����"��!#���������O��������������������B"�������������A� �!������������������ ����!�����"��!#����

��.(%#�RS%

$�4�������/0�����!����������!����J#��#��#�� .����������������!2������������ ����#����2����3��#�����)����������3���#��#����#���� �#���������9������������ ���� ����+�� �#�� ��#@������� ������ #��/0����!����������!���������� �����7�#��������**��������������0���7 ������� ���#@�������J#������� �������3����������� �-���-�#7����4�����0���-�#7����:��,,DCF%,D"E3�����;��+��#@�������-�#7������0��#��������I������ �� �� 4�������/0�� ��� !������ ��� 4��� ���#@������ 0��-�#7������������!�#3������#������ �� �������� ������������I�����E� �����3����������� �#�� ���#@������������!�#� �����-����� � �#� 0�� �-�#7����� :$<<DBFB?EYS 3� ����F��ECE<D"�3� ����F��ECE<D"�3� ��&)F<��+DB�������3����)F��+ADC3���&)F��+ADCF�L�3���&*FCEAB+C3���((F�B�>CE,3���&(;�

+��#@�������������!�#��� ��6� ���/0�3���� �

���������#@������0���-�#7����3�#��� � �#��� ��#������.�������#������4����������1����������7������� �#�#��� ��������2!�����#����!������ ��3��1���#����/0���#���6��#� ����� �7 ���� �����G���� �#� � 7�� � ����� :?DAAE,F�ADC<E,F�Y$C�BA SE3���&�F�LDECE,3�����;�$�@#������3���!����#���������4������#��� ���������2.!������ ���-�����#�@#�#��� ���#� ������������ !G���#��� ��!���������-�����E���������/0��������� ���#��6�#.�������������� ��/0����� ��������#���7�����I ��3��4�����#�� ��-��� �1��������6����0���������!�#����!������#������ ��!���3��#�� �����������#���������������.��#��������#�#@������������!�#���� ���������� ��: ,EECL$A<3����*F� ,EECL$A<F� ,+BB3� ��&(;�$�@#������3����#@�������������!�#�����/9� ��� ��6� ���./0����#���#��#����� ������ �������������� �����-�/0�:$<<DBF�B?EYS 3�����;�

�������������������!�����#��� �#�����������#@��.�����6� �����#@� �����#���������I����������#��� �#��

���������������)*�����+��,��.?+�.??��/�,��0�����)**1

Page 2: quantificação de glicose via acido picrico

��(

+�����������;�� �� ���F������� 6&�2�G�����������������

���������������)*�����+��,��.?+�.??��/�,��0�����)**1

���������#�������#@������0���6� �����#@� ���3��#���#@��������� ������������$� ��/0����� �#@� ����#��� ������������� ��.����#�� ��-����#@�����0���-�#7���#���� �� !�#���� �����-���� �� �� ����!�#���� !������ �##��� ���������2!����:%$BBE^�������3���'';�

E� �����3����#@�������6� �����#@� ���3��#��� ��/0���#���7�����I ��3��0��#�������#��������� ������� �4�������/0������/9� ��� ����� ����#�#��� ���������2!���#�����#���6������4�������!�������� ����C�������� �����#����� � �/9� ��� ����� ��� �#�� ������������� 2����������������� ����� � ���� J��������� 2����� �����I��������� ������ �� ���I��3� �#��������� ��� ����#� �!���/0����� ���I����� ��/9� ��3��������������� ��-� ���#@�������7�����I ����#����/5���#�������#�������� 7�����

E����� ���������������������������� �/0�����7����I ���������������������#@������� ��4�������/0���������!������4��������� �����3�����#�@#��������������������-�./0�����7������-2�����*3&�K��#����� ���������/9� �+�7������-2���@������-�����#����� ��������!����������� 5���4�����#����#����U�����������!�#����!����������#@��������� �����������

,).'(�)*�'�,V.%#%�

��������� ��!�������������� �������#������! ������� �-���+�7�����I ��3���!����������� �������� �#���4��. ��������B�!#��"��#����"�#���3������ ����������2�������7������-2������8��#����$������/5��������-������� �#� ��� �������#���#�����#�7!���������-�����$������.!����� �#��6���������#�����/�����I����B� �� �����$�#��������������#���� �#���������#��#�#��#��! ��������������! ���������������#@� ����� ����#������� ��-�.�����$������� ���������� �G����� �#���������#������ ���.�H#�� ��M�����#������B��U����+��7�����3�! 7��������7��.������� �! ���0������ ��� �#�������������-������� �! �#�+ �!��)�*����>� ����

E#��#��6�� �#�����I���3��� �#�� ��� �����4��� �����/5���� �#7 ���R�$;�C�

�"+

����&*K��O���#�7!��������.

�-���F��;� 7�����I ��� ��*3&F� *3�F� �3*� ��&3*K��#�7!��������-���F� ";� 7���� ��-2��� �� *3&�K� �O�� �#� 7!��������-���F���<;�����/0�.����4������!���������� ���������3&!O�**�#A��#�7!���������-��������#�7������-2�����*3&�K�$������/5�������������!���������� �������� �#�� ��� ���������� �/5������*3�F�*3&F�*3(F�*3)F�*3�F��3*����3&�!O�**#A����7!���������-����������7������-2�����*3&�K�

C��� ������.��� 0�3������ ��� �����#���@ �������������������3��#�����������+�����.�� ���� ���������.��#����*3��#A������������:7!���������-�������7������.-2�����*3&�K;3��4����������#���������� �����#�*3��#A���!���������� ��������*3�F�*3&F�*3(F�*3)F�*3�F��3*����3&�!O�**#A�:�#�7!���������-�������7������-2�����*3&�K;��E#

��!�������������� �������3��#A����C��"+

����&*K��3���

��#3��3��#A����7�����I ���:��*3&F�*3�F��3*����&3*�K;��$�2�#���� �3������������ �#����������� ��*�#�������#�����.#� ����#������/0�3���� ������ ����� ��������� ���$�2�������/0������������� �#� ��� �����3��������� �!��� ����$

����� ��������.�� ����

('��*.)#%��'�#��&���S%

+�� � �#�� ���#@������ ������� �� �� ����!�#����/9� �����!���� �#�#@������0���-�#7�����:�ECE.<D"�3���&)F�<��+DB�������3����)F��+ADC3���&)F��+ADCFL�3���&*F�CEAB+C3���((F�B�>CE,3���&(;3�4���0������. ���#���!���������� ������������!�������3���#�@#�� �.����������!����E������!���� �#��������������I������ #@�������-�#7����3�4����0������I������� ����!�����3������#� �!�#��-�#����#����!�����.�6�����3���!���.4������ ��� �� !�����.����� �!����� :��,,DCF� %,D"E3����F�"++%E,F�>"<$CDEA3���'*F�B$"SB3�����F�^�FAD�F���3�&**�;�

C0�� �7� �9����� 4����� N� ����!�#�����#@������-�#7�����4���������1������@����� �!��������� ���/���� ��� ��� �����G���� ����� ����C�� �����3� 4����� �� ��2����� @� ���� � �/9� ��� ����� ��3� ���#@������ 0��-�#7����� �0��#����� ����1����� �� � �� �#� ��#����� ��� ����3�������������#��#������������������#�� ��2������������2!����:>+C�,+BBF�",+�"?E"S3�&**(;�

$� ��/0������/9� ��� ����� ����#���7�����I ��� ���-�7������ G#��3��1���6��/0��#��� �#76�#���#��*�#�@����� #����������������#����������� �/0����!������:$<<DBF�B?EYS 3�����;��C��U >3�����@��� �.��������� ���.��� 0�����!������������������#@�������7�����I ������K��O�3�������!����������I����#�7!������#7������-2�����*3&�K3�#��� ����4������ ���/�����7�����-2����#����� ��������!������0���������� �������������!�������#����!���� �#�!J��3������1�3�0����� �� �������!�#�

+�������������� �/5��� ����������7�����I �.��:���*3&���&K;���� ���� ���.��� 0�����!���������7�#��� �.�����U >3������+���#���������� �/0�����7�����I ����@�&K�#���� ��������������������#@����3��#��������� �������������#�����������/0����� �����E� �����3��#��� �/5�����#������K3���7�����I ����������� ����.�� ���#������� ��/0��

$�U >3����#��� ����� ����.��� 5������!�������� �������#�7������-2�����*3&�K���2�� ��/0���#�7����I ������K��"�#��������� ����� ����3��� �������������7�����I ����#��#��������/9� ���@���J���3�������4�����#@������������ ������-������ ������!�#�������������/9� ��� ����� ����E#�����/0����� ������ ��#����7���3���� #��� ���#�����@�����#�������I���� ��� �����#�

Page 3: quantificação de glicose via acido picrico

���

+�����������;�� �� ���F������� 6&�2�G�����������������

���������������)*�����+��,��.?+�.??��/�,��0�����)**1

�� ������$� �� #�� ��� !������ 4��� ��@#� �� � ���������I���� ��� �� @� ����#���� ���7���� �� ���7� � ������ �#��� �/5���#�������4������#�����/0���4������E#��?

0 200 400 600 800 1000 1200-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

�������������� �����������

�����

�����������µ

U >3����� 8�������/0�����!�����������#@��������7�����I ����$��������I��� �� �������� ������� �! ���0������ �������!�#����!�������#�7!���:�;3������������4��/0��J�i�������j��������B3��#� ��Z�*3��'&�:�Z���F���v*3***�;��$�����������I��� �� �������� ������� �! ���0���� ����!�������#�7������-2�����*3&�K�:6;3�����������4��/0��J�i������$�j��������B3��#� ��Z�*3��))�:�Z�&'3���v�*3***�;�

U >3����� E������������ �/5��� ����������7�����I ������ ���� ���.��� 0�����!�������#�7!���������-�����"�#7�����I �����*3&K3����4��/0��@�J�i������$Z�j��������B�: ��Z�*3���&3��Z��&3���v�*3***�;��"�#�7����I ������3*K3����4��/0��@�J�i�������$$�j��������B�: ��Z�*3��))3��Z�&'3���v�*3***�;��"�#�7�����I ����&3*K3����4��/0��@�J�i���������j�����$���B�: ��Z�*3��)�3��Z�&&3���v�*3***�;�

������3���!�������� #���#��� �������3&.������3�4����� ��#��4���I� ����#���� ����������#����3�#������ I����4�����#�@#��6���#���������� ����� �3��#����!������

0 200 400 600 800 1000 1200-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

�������

�����������µ

�����

�����

�����

Page 4: quantificação de glicose via acido picrico

��)

+�����������;�� �� ���F������� 6&�2�G�����������������

���������������)*�����+��,��.?+�.??��/�,��0�����)**1

$�U >3���$��#�� ����� ����.��� 5������!������#�7������-2�����*3&�K�������#@���������� ���������������7�����I ����E����0���� �����#����� �/�����!���.

U >3���� "�#�� �/0������ ����.��� 5������!��������� �����3��#��������/5�������#��������/9� ����#�7������-2����*3&�K�����7�����I ������3*K��O���$��������� �! ���0���� ����� ������� ������:�;�@������������4��/0���Z�.�*3����c�*3**��(�63��#� ��Z�*3���&�:�Z�&�3���v�*3***�;��$� ������� �! ���0���� ����!������:6;�@���Z�.�*3�*(c�*3**�*��63��#� ��Z�*3��))�:�Z�&'F���v�*3***�;�

U >3���$� "�#�� �/0������ ����.��� 5������!������������#@���������� ����������������7�����I ��3��#�7�����I �����3*K��O���$� ���.��� 0�������� �����������:�;�@������������4��/0��J�i���������j��������B3��#� ��Z�*3�&��:�Z�)3���Z�*3**&�);3��4������� ���.��� 0�������7�����I ���:6;�@�������� �J�i���������j��������B3��# ��Z�*3���*�:�Z�&�3���v�*3***�;�

0 200 400 600 800 1000 1200-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

������

����������µ

��� ����

��������

-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

0

1

2

3

������

�����������µ

��� � ����������������������

������� �����:�v*3*�;3������ ����#�#@������7������� ���� �� ���� ��� �� :A$,SF�",$YECF��+BL+,�?3��)�;�

Page 5: quantificação de glicose via acido picrico

��'

+�����������;�� �� ���F������� 6&�2�G�����������������

���������������)*�����+��,��.?+�.??��/�,��0�����)**1

&%�&*��W'�

�;�$������-�/0�����7������-2�����*3&�K��#������������!������0�� ��� �� ��������!�#����!����������#@��������7�����I ��F�&;��������-�/0�����7�����I �����3*K���#����������������������#@����F��;��� ���.��� 0����!������0������ ����!��������#������� ���.��� 0����� �������� ������#@����F�(;��������-�/0�����7�����I �����K�������������������/0������#����������������4�������������#@��������� ����������F��;��������-�/0�����7�����I ����&K���#�������������������������#@������#� ���/0����#@��������� ����������3��#�� ���� ��/0���� ���#���!�#�� ������/0����� ��!����

$�� �����������@�����I������ ���������3��#���4�������������������4���#������� ���/�����7����@����:��,,DCF�%,D"E3�����F�"++%E,F�>"<$CDEA3��'*F�B$"SB3�����;��E#�� �������#@������6�����6�������� ������:%$BBE^�������3���'';3������� �������#���.��������@ ��3�4���@���� ��!���������� ���I���N�� ����.�������:��,,DCF�%,D"E3�����;��+�7�����I ��3�4��� ��!��#�4���4�� ��/9� � ����� 3�0���� ������� �� �������� ��!J���3���������������������������� #����������#��7 ������ #���/5����� #�J������

)��.()&.H� �����3���������������� � ����!���!� �3� ������������ �����3�����6� ������3�� ����!����� ����#������������������#�6�#���#��� ��6�����������*�#��B����6�����������*�#�������� ���������������������� ������ �#�������!�����3������ ������������������ �4�������������� ����!���!� ������������ ���� ������������� ��-�������������� ������#������� �#������������ ������� �� ������������#�������"���������� ����� ������ �����#���������������� �������������� ����� ��� ��������������������#� �!����������� ���������� ����������������3����� ��������������$

����������!������#������������ �������� �!�����*�����&**�u!������!� 3����!���� ����

��������4������$���Z�.*3*���c�*3**���u!�!������������-����������-����������*3&�K��O�������������� �!������� �����

��������������������4������$���Z�.*3*''�c�*3**�*�u!����!�������"�#�� �����������������������������������-�������

��-����������!������� ��� ����������Q�������� ���������������$��������!������#���� :�v*�*�;�������-�������

� ��������� ����!���!� �� ������������#������� ������������������������������������� ������#��������������������#��� ��������� ��������������3������� ��������� ���������3*K3����#�!��������� �� ������ ��������� �������&3*K3�������!�������� ����� ��������������������� �����

������������ �R�%,+%%.�������"C%4�

���.'(,�H�<��� #��������� ����!���!� �3�%� �����3����������!�

('U'(X�&�)�

$<<DB3���F�B?EYS 3�$��E���$�#������������������� ����#�������� ���������!� ����� #���������3������:�� ���> ���&8�6 �!�J3������#� �3������3����3������.��3�����������

�ECE<D"�3�B��,��C�������������� #�����������������!� ��������#���������� ������#���������3������:�� ���> ���&8�6 �!�J3������#� �3�����'3���(3�����*�.�*(3�$� �������

�ECE<D"�3�B��,����������#����������!� ������������� #���� ������3������:�� ���> ����&8�6 �!�J3������#� �3����)�3���3����'��.')'3�������&)�

��,,DC3����>�F�%,D"E3�"��%��>���� �#������������!�������)�������:�&� � ����� ��8�6 �!�J��A���3����&&3���(3����&'.�(&3�����������

"++%E,3� ��,�F�>"<$CDEA3�Y���������� #���������!�������������� ������������#�������DR�>$"<+C$A<3�,��%�:E��;���!�������6�!8�����:��� � �����8�6 �!�J��C��� � UR�$���#�3���'*�����)3�������.�'*�

<��+DB3�>�F� DAAEB3�S��$�F�?$>DA�+C3����S�F�,E�E,B3�%��$�F�B>D�?3����"��� �#�� ��#�������� ����� #����������!� ����� �����������������)���J! ����&8�6 �!�J3�L����!��3����&�3����3������*.��)3�>� �����)�

Page 6: quantificação de glicose via acido picrico

���

+�����������;�� �� ���F������� 6&�2�G�����������������

���������������)*�����+��,��.?+�.??��/�,��0�����)**1

�+ADC3�+���������� #�����������!� ��������������� #���� ������3������:�� ���> ����&8�6 �!�J3������#� �3����)'3��&3������'.�'*3��������&)�

�+ADC3�+�F�L�3�?��$���#������������#� �����#�������� ����� #�����������!� ����3������:�� ���> ����&8�6 �!�J3�����#� �3����(�3����3�����)'.�'(3�>� ����&*�

,EECL$A<3�D��������#��� ����������Q�� �������� � ��������YD��$��#���������� ���������������#���������� ��������D����#����������������������U�������3������:�� ���> ����&8�6 �!�J3������#� �3�����)3����3�������.�(�3>� �����*�

,EECL$A<3� DF� ,+BB3� ������� ��#��� ����� �����Q�� ������ �� � ��������$� ��� �����#� ���� ��������� ������3������:�� ���> ����&8�6 �!�J3������#� �3������3����3����)*�.)�&3�$� ����&(�

?DAAE,3�$�F� ADC<E,3� ��"�F�Y$C�BA^SE3�<��<������ ����!� ��������� ��� ���� ���������3����� �:�� ���> ���&8�6 �!�J3������#� �3����)(3����3����)&�.)��3��������&��

A$,S3�%��<�F�",$YEC3����,�F��+BL+,�?3�,��"��A��.8��8���� �>��:��8�6 ������!���+6�� �R�%� !�#�3���)����'����

>+C�,+BB3�>��<�F�",+�"?E"S3�"��A��E������������� �� ����������� �!��#��������!������� ��������� �!�-�#������� ��������� �����3����.��8����>J3�C��� � U3�����&3����3����&)�.&'(3�>���&**(�

CEAB+C3�C��$������#�� �������������������B�#�!���#�������� ��������� #���������!�������.8����3������:�� ���> ���&8�6 �!�J�������#� �3�������3���&3�����'�.��*3�>�����((�

%$BBE 3�,����F� DAA�>3�,��A�F���AAE,3������F��,, 3����>�F� DAEB3�>��A��E�������������#�� ��������*�!�����#�������������� ��� ���#������ ��##������������ �������� ��������������� ��:��'(;��&� � ����&8�6 �!�J�L����!��3����&�3����3�������.���3�������''�

B$"SB3�<����� ��I������DR���,�DB3�"��$�F�$B?L++<3�E��,��:E���;��. �!9�:3���6��!������C3=6 �����=� ����,��������� �R� ����� ��S��!�3�����������(�.�)��

B�>CE,3���������������#����������!� ������������ ��3����!����� ��������������.8����3������:�� ���> ����&8�6 �!�J3�����#� �3����)&3���&3����&�'.&�*3�<�����&(�

LDECE,3�S��L�����������!�����R������� �������������#���� �!n�)�������:�&� � ����� ��8�6 �!�J3�A���3�����&3���3�����.�3����������

^�3���F�AD�3�B�F���3�?�� ���������� ��� �������1������������������ �#�!���������������##�����-��������!������6������������������.!���#�#� ����� �������������� �����!��� ��3��� U�!3������3���(3����(*�.(*�3�<���&**��