I

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINRIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS VETERINRIAS

PYTHIUM INSIDIOSUM: AVALIAO DE IMUNOTERPICO PARA

EQINOS, UTILIZANDO-SE COELHOS COMO MODELO

EXPERIMENTAL.

Autor:

Md. Vet. JANIO MORAIS SANTURIO

Tese apresentada como requisito parcial

para obteno do grau de Doutor em

Cincias Veterinrias na rea de

Micologia.

Orientador:

PROF. DR. LAERTE FERREIRO

PORTO ALEGRE

2004

II

Autor: Md. Vet. JANIO MORAIS SANTURIO

Ttulo: PYTHIUM INSIDIOSUM: AVALIAO DE IMUNOTERPICO PARA EQINOS, UTILIZANDO-SE COELHOS COMO MODELO EXPERIMENTAL.

Aprovada em 04 fevereiro de 2004

APROVADO POR:

____________________________________________________

Prof. Dr. LAERTE FERREIRO

Orientador e Presidente da Comisso

___________________________________________________

Prof. Dr. DAVID DRIEMEIER

Membro da Comisso

___________________________________________________

Prof. Dr. MARIO CARLOS ARAJO MEIRELES

Membro da Comisso

___________________________________________________

Prof. Dr. SYDNEY HARTZ ALVES

Membro da Comisso

III

S237p Santurio, Janio Morais Pythium Insidiosum : avaliao de imunoterpico para eqinos, utilizando- se coelhos como modelo experimental / Janio Morais Santurio ; orientador Laerte Ferreiro. Porto Alegre, 2004. 71 f. : il. Tese ( doutorado ) Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2004. 1. Medicina veterinria 2. Medicina veterinria Micologia 3. Micologia - Medicina veterinria 4. Medicina veterinria Imunoterapia 5. Imunoterapia - Medicina veterinria 6. Pitiose Imunoterapia 7. Pitiose Imunoterpicos 8. Pitiose Vacina 9. Vacina Pitiose 10. Pythium insidiosum 11. Coelho - Animais para experincias 12. Animais para experincias Coelho I. Ferreiro,. Laerte *orientador II. Ttulo. CDU : 619 619:616.99 619:57.084

Ficha catalogrfica elaborada por Rosa Maria Fristsch Feij CRB-10/662 Biblioteca Central - UFSM

IV

DEDICATRIA

Clris, Deise e Roberta, principalmente pela compreenso.

V

AGRADECIMENTOS:

- A Deus pela vida e suas circunstncias;

- Ao meu orientador, colega e amigo Prof. Laerte Ferreiro, pela ajuda e

compreenso em todos os momentos;

- Aos Colegas Alexandre e Adriana Leal pela pacincia e auxlio no

desenvolvimento experimental deste trabalho;

- Ao Colega Prof. Sydney Hartz Alves pela colaborao nas aulas na graduao e

pelo apoio nos momentos difceis;

- Colega Prof. Agueda Castagna de Vargas por ter assumido as minhas tarefas

de docncia durante meu afastamento;

- Colega Prof Maristela Lovato Flores pelo auxlio decisivo nas aulas da

graduao;

- Prof. Virginia Peretti Torelly pelo auxlio nas tradues para a lngua inglesa;

- Aos alunos bolsistas do Laboratrio de Pesquisas Micolgicas (LAPEMI) da

Universidade Federal de Santa Maria, pela amizade e ajuda.

VI

RESUMO:

A pitiose uma doena granulomatosa, tendo como agente etiolgico Pythium

insidiosum De Cock, 1987, que atinge eqinos, provocando quadro infeccioso na pele e

tecido subcutneo , caninos com apresentao gastrintestinal e cutnea , bovinos com

doena cutnea , felinos e humanos, com quadro clinico de arterite, queratite e celulite

periorbital. Esta enfermidade mais prevalente em reas tropicais, subtropicais ou

temperadas. Tambm animais silvestres podem se infectar pela doena. O gnero

Pythium pertence ao Reino Stramenopila, Filo Oomycota, cujos membros caracterizam-

se por produo de zosporos biflagelados durante a reproduo assexuada. O

desenvolvimento de pitiose experimental nas espcies naturalmente infectadas no foi

ainda relatado, mas os coelhos so sensveis inoculao de zosporos e podem ser

usados como modelo experimental para estudo da pitiose. Este trabalho teve como

objetivo avaliar a eficincia de 3 processos de produo de imunoterpicos contra

pitiose, produzidos a partir do cultivo e posterior macerao ou sonicao, em coelhos

infectados experimentalmente com 17.500 zosporos do oomiceto Pythium insidiosum

(cepa CBS 101555). Todos os coelhos foram inoculados com zosporos 1 ms antes da

aplicao dos imunoterpicos. Para avaliao dos imunoterpicos, os coelhos que

desenvolveram leses foram divididos em 4 grupos de 5 animais: Grupo 1 Tratado

com placebo; grupo 2 tratado com o imunoterpico sonicado; grupo 3 tratado com o

imunoterpico misto e o grupo 4 - Imunoterpico macerado mecanicamente. Todos os

animais receberam 8 doses do imonoterpico ou placebo com intervalos de 14 dias. Um

ms aps a inoculao dos zosporos mveis, foram iniciadas as medies das reas

inoculadas. Os resultados indicaram que o imunoterpico macerado, utilizado no grupo

4, foi estatisticamente (P

VII

Palavras-chave: : Pythium insidiosum, pitiose, fungo, coelho, imunoterapia, zosporo,

Oomycota

VIII

ABSTRACT:

The pythiosis is a granulomatous disease, tends as aetiologic agent Pythium

insidiosum De Cock, 1987, that reaches equine and provoking infectious picture in the

skin and subcutaneous area, canine with gastrintestinal and cutaneous presentation;

bovine with cutaneous disease, felines and human, with arteritis, queratitis and

periorbital cellulitis. Pythiosis happening in tropical, subtropical or temperate areas of

the world. Wild animals can also be infected by the disease. The genera Pythium

belongs to the Kingdom Stramenopila, Philum Oomycota, whose members are

characterized by production of biflagelated zoospores during the anamorphic

reproduction. Experimental models of pythiosis in naturally infected species have not

yet been reported but, rabbits may be inoculated with zoospores as an experimental

model for studying the disease. The present study evaluates the efficacy of three

different of immunotherapics in the rabbit model. Approximately 17,500 zoospores of

oomycete Pythium insidiosum (CBS 101555 strain) were inoculated in each animal to

generate the disease. Immunotherapics were produced from vortexed or sonicated

cultures of the same strain. Four groups of 5 animals were employed: Group 1 =

Placebo, Group 2= Sonicated Immunotherapic, Group 3= Mixed Immunotherapic,

Group 4= Vortexed Immunotherapic. All rabbits were inoculated with viable zoospores

one month before administration of the immunotherapics. Eight doses of

immunotherapic or placebo were used in each animal with a 14 day interval between

injections. Rabbits receiving the vortexed immunotherapic were most effectively

protected, (P

IX

SUMRIO:

DEDICATRIA .............................................................................................................IV AGRADECIMENTOS: ................................................................................................... V RESUMO:.......................................................................................................................VI ABSTRACT: ................................................................................................................. VIII INTRODUO: .............................................................................................................11

Objetivos: ....................................................................................................................13 1.1 Objetivo geral:.................................................................................................13 1.2 Objetivos Especficos:.....................................................................................14

REVISO DA LITERATURA ......................................................................................15 1.1 Histrico e Taxonomia....................................................................................15 1.2 Pythium insidiosum.........................................................................................17 1.3 Epidemiologia .................................................................................................19 1.4 PITIOSE..........................................................................................................22

1.4.1 Eqinos....................................................................................................22 1.4.2 Ces e Gatos............................................................................................25 1.4.3 Bovinos ...................................................................................................27 1.4.4 Humanos .................................................................................................28 1.4.5 Coelhos....................................................................................................29

1.5 Histopatologia ...............................................................................................31 1.6 Diagnstico....................................................................................................31 1.7 Tratamento.....................................................................................................35 1.8 Imunoterapia..................................................................................................38

ARTIGO PUBLICADO:.................................................................................................44 DISCUSSO ..................................................................................................................51 CONCLUSES: .............................................................................................................55 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................................56 ANEXOS ........................................................................................................................69

X

LISTA DE FIGURAS:

Figura 1: Imunoterpico contra pitiose nos eqinos PitiumVac........................13 Figura 2: Esporngio lobulado de Pythium insidiosum, cepa CBS 101555..........18 Figura 3: Fenograma UPGMA apresentando as interrelaes entre isolados

de P. insidiosum. ..........................................................................................19 Figura 4: Eqinos em seu habitat no pantanal matogrossense..............................20 Figura 5: Esquema do ciclo biolgico do Pythium insidiosum .............................21 Figura 6. Eqino do pantanal com pitiose clssica na pata em processo de

auto mutilao . .............................................................................................24 Figura 7: Leso atpica de pitiose no pantanal brasileiro .....................................24 Figura.8: Colite infecciosa de um co com pitiose.. .............................................27 Figura 9: Bovinos da raa nelore de 6 meses de idade com leso de pitiose .......28 Figura 10: Fibrogranuloma em coelho aps 30 dias de inoculao com

17.500/mL zosporos de Pythium insidiosum . ............................................30 Figura 11 : Coelho com fibrogranuloma supurado aps 60 dias da

inoculao com 17.500 zosporos/mL de Pythium insidiosum.. ..................30 Figura 12: Cultivo de P. insidiosum em caldo sabouraud a 37C........................34 Figura 13: Hifas de Pyhium insidiosum em cultivo em gar farinha de

milho ............................................................................................................34 Figura 14: Cultivo de isolado de P. insidiosum, para produo induo de

zoosporangnese. ..........................................................................................35 Figura 15: Hiptese proposta para os efeitos curativos dos imunoterpicos

contra pitiose baseado em dados de humanos e eqinos...............................41 Figura 16: Eqino com pitiose clnica na pata (A) e o mesmo animal

totalmente curado (B) aps receber 4 doses do imunoterpico PitiumVac......................................................................................................43

11

Pythium insidiosum: avaliao de imunoterpico para eqinos, utilizando-se coelhos como modelo experimental.

INTRODUO:

A pitiose uma doena granulomatosa que atinge eqinos, provocando quadro

infeccioso na pele e tecido subcutneo, caninos com apresentao gastrintestinal e

cutnea, bovinos com doena cutnea, felinos e humanos apresentando quadro clinico

de arterite, queratite e celulite periorbital. mais prevalente em reas tropicais,

subtropicais ou temperadas (MEIRELES et al., 1993; MENDOZA et al., 1996;

SANTURIO et al. 1998; GROOTERS, 2003). causada pelo oomiceto pertencente ao

Reino Stramenopila, Pythium insidiosum (DE COCK et al., 1987, ALEXOPOULUS,

1996). Nas espcies no domsticas, o Pythium insidiosum foi reconhecido como causa

de doena pulmonar primria num jaguar (Pantera onca) da Amrica Central, alm de

leses cutneas e gastrintestinais em um urso de zoolgico e, tambm, como causa de

leso mandibular subcutnea em um camelo (GROOTERS, 2003).

A enfermidade nos eqinos caracteriza-se pela formao de granulomas com

infiltraes de eosinfilos, com a presena de massas necrticas denominadas de

kunkers (MENDOZA & ALFARO, 1986; MEIRELES et al, 1993; SANTURIO et

al.; 2003).

Os caninos so a segunda espcie mais atingida e as infeces caracterizam-se

pela formao de piogranulomas gastrintestinais e cutneos ( MILLER et al., 1983;

FOIL et al., 1984; BENTINCK-SMITH et al., 1989; HOWERTH et al., 1989;

FISCHER et al., 1994; GROOTERS, 2003). Em humanos, a doena comum no

sudeste da sia, principalmente na Tailndia. A doena apresenta-se nas formas

subcutnea, sistmica e oftlmica, sendo que as formas cutneas e sistmicas esto

associadas sndrome de e -talassemia, comuns nessa regio (IMWIDTHAYA,

1994a; IMWIDTHAYA, 1995).

Diversos protocolos para o tratamento da pitiose tm sido utilizados,

principalmente em eqinos, incluindo tratamento qumico (antifngicos), cirrgico e de

imunoterapia . A imunoterapia, proposta inicialmente por MILLER (1981), surgiu como

12

uma alternativa concreta para o controle da doena e tem apresentado resultados

animadores (MONTEIRO, 1999; MENDOZA et al.2003).

O coelho o nico animal no qual se conseguiu reproduzir a pitiose cutnea a

partir da inoculao de zosporos produzidos por zoosporangnese em laboratrio

(MILLER & CAMPBELL, 1983b). Passa, ento, esta espcie animal a ser modelo

natural para testes com drogas e imunoterapia contra a pitiose.

Desde 1993, o Laboratrio de Pesquisas Micolgicas da Universidade Federal de

Santa Maria [LAPEMI] vem utilizando um imunoterpico (IMT) contra a pitiose em

eqinos, desenvolvido em conjunto com a Embrapa Pantanal. Este IMT, com o nome de

PitiumVac foi registrado no Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI), visando

a obteno de patente de inveno para a UFSM e EMBRAPA .Tambm este IMT est

em processo de registro junto ao Ministrio da Agricultura.

O IMT PitiumVac mostrou-se eficiente para eqinos com pitiose clnica , porm,

na tentativa de seu aperfeioamento, substituindo-se o processo de macerao das hifas,

pelo processo de sonio, empregano-se um disrruptor de clulas. Observou-se que este

IMT perdeu sua eficincia em mais de 70% dos eqinos tratados (OBSERVAES

PESSOAIS). Diante disso procurou-se investigar se as causas do baixo desempenho do

PitiumVac (figura 1 e anexo 2) estavam na liberao dos antgenos, desnaturao destes

ou em seu processo de liofilizao. Para tal, foram propostos 3 processos de preparo do

IMT os quais foram testados em coelhos infectados experimentalmente.

13

Figura 1: Imunoterpico contra pitiose nos eqinos PitiumVac com

registro de inveno pertencente ao LAPEMI/UFSM e EMBRAPA (anexo 3).

Objetivos:

Este estudo foi objetivado a:

1.1 Objetivo geral:

Avaliar, na pitiose experimental em coelhos os imunoterpicos obtidos a partir

de 3 diferentes protocolos fundamentados na: a)sonicao das hifas de P.

insidiosum (cepa DMVP118/98 CBS 105555 anexo b)liquidificao ou

maceraomecnica das hifas c) imunoterpico misto, produzido com 50% de

sonio e 50% de macerao, comparando-os a um grupo controle tratado com

placebo.

14

1.2 Objetivos Especficos:

1.2.1. Comparar a atividade dos diferentes imunoterpicos, atravs de medidas

da involuo dos fibrogranulomas da pitiose experimental em coelhos, aps

aplicao de 8 doses.

1.2.2. Avaliar, microscopicamente, as alteraes histopatolgicas da pitiose

experimental em coelhos, aps a aplicao dos diferentes imunoterpicos.

15

REVISO DA LITERATURA

1.1 Histrico e Taxonomia

O agente da pitiose - Pythium insidiosum , atualmente, classificado como um

organismo zoosprico, habitante de solo e de gua. So conhecidas muitas espcies de

Pythium como patgeno de plantas importantes economicamente, mas P. insidiosum

o nico, dentro deste gnero, reconhecido como patgeno para mamferos.

Manifestaes clnicas de pitiose foram, pela primeira vez, diagnosticadas na ndia na

metade do sculo 19, por veterinrios ingleses. Eles observaram doena granulomatosa

cutnea crnica que denominaram bursattee (GROOTERS, 2003). No final do sculo

XIX, a etiologia fngica, baseada em dados histopatolgicos, foi proposta pelos

investigadores SMITH, (1884) e DROUIN, (1896). O primeiro isolamento desse

organismo filamentoso foi realizado, no incio do sculo XX, por DE HAAN &

HOOGKAMER (1901), a partir de granulomas subcutneos em eqinos na Indonsia,

Estes autores o classificaram como sendo um fungo zigomiceto ou ficomiceto baseados

apenas nas caractersticas morfolgicas da hifa vegetativa. Propuseram, tambm, o

nome hyphomycoses destruens para a doena, porm no conseguiram classificar o

agente etiolgico. Somente em 1961 foi possvel o isolamento e identificao do agente,

o qual recebeu o nome de Hyphomyces destruens, baseado no nome da doena sugerido

anteriormente (BRIDGES & EMMONS, 1961). Em 1964, EMMONS sugeriu o termo

ficomicoses para designar as micoses (humanas e animais) causadas por fungos com

hifas grandes e poucos septos, incluindo os gneros Absidia, Mucor, Rhizopus,

Basiodobolus, Entomophothora, Hyphomyces e Mortierella. Em 1974, foi possvel o

isolamento e a caracterizao mais detalhada do agente etiolgico a partir de eqinos

infectados, quando, ento, foi observada a sua capacidade de produzir zosporos

biflagelados a partir de isolados de eqinos originrios da Nova Guin. Baseados nessa

caracterstica, AUSTWICK & COPLAND, (1974) classificaram o H. destruens como

um fungo da famlia Pythiaceae, ordem Peronosporales e que deveria ser includo no

gnero Pythium. No entanto, a denominao Hyphomyces destruens continuou sendo

16

utilizada nas descries da doena (McMULLAN et al., 1977; MURRAY et al., 1978;

GONZLEZ et al., 1979).

Em 1980, ICHITANI & AMEMIYA compararam um isolado de eqino com

outras espcies de Pythium, atravs de suas caractersticas reprodutivas (oognia e

zosporos), identificando o agente como Pythium gracile Middleton, 1943. Somente em

1987, DE COCK et al. ao analisarem isolados de eqinos, bovinos, ces e humanos,

oriundos de diferentes locais, concluram que tratava-se do mesmo organismo, que foi

denominado Pythium insidiosum. Nesse mesmo estudo, concluiu-se que essa nova

espcie era igual s anteriormente descritas, Pythium sp -Austwick e Copland; Pythium

gracile Ichitani e Amemiya; e Hyphomyces destruens Bridges e Emmons. Tambm

em 1987, Shipton (apud MENDOZA & MARIN, 1989) analisou um isolado de eqino

da Austrlia e classificou-o como uma nova espcie: Pythium destruens. No entanto, em

1989, provas sorolgicas realizadas com anti-soro produzido em coelhos e soro de

eqinos infectados, frente a antgenos de P. insidiosum (De Cock) e P. destruens

(Shipton), demonstraram o mesmo perfil antignico e estabeleceu-se a nomenclatura

definitiva para o agente etiolgico da pitiose: Pythium insidiosum (MENDOZA &

MARIN, 1989).

Embora o nome do agente tenha sido estabelecido, a sua classificao

taxonmica continuou sendo discutida nos anos seguintes. Segundo DE COCK et al.

(1987), os oomicetos so seres eucariotas produtores de zosporos biflagelos,

caracterstica comum ao Pythium insidiosum, incluindo-o na ordem Peronosporales,

filo Oomycota e reino Protista. MENDOZA et al. (1996), baseados em um estudo de

CORLISS (1994) sobre a classificao e caractersticas dos Protistas, apresentaram o P.

insidiosum como um organismo do reino Chromista, filo Pseudo-fungi, classe

Oomycetes, ordem Pythiales, e famlia Pythiaceae. Entretanto, estudos detalhados sobre

a classificao dos fungos, baseados em sistemtica filogentica e anlises moleculares,

entre outros, dividiram os organismos anteriormente classificados como fungos em trs

reinos: Fungi, Stramenopila e Protista (ALEXOPOULOS et al., 1996). Baseado nessa

nova classificao, o agente etiolgico da pitiose pertence ao Reino Stramenopila,

Classe Oomycetes, Ordem Pythiales, Famlia Pythiaceae, Gnero Pythium e espcie P.

insidiosum (MONTEIRO, 1999; LEAL, 1999). Estudos taxonmicos mais

aprofundados, baseados em anlises de sequenciamento de gene do RNA ribossomal de

P. insidiosum, confirmaram que os membros da classe Oomycetes so filogeneticamente

distantes dos membros do Reino Fungi e estariam relacionados de maneira mais

17

prxima das algas que dos fungos (KWON-CHUNG , 1994). A distncia taxonmica

entre os oomicetos e os fungos esto retratados ao nvel celular atravs de diferenas na

parede e composio da membrana. A quitina, um componente essencial da parede

celular fngica, est geralmente ausente na parede celular dos oomicetos, onde

aparecem como componentes predominantes celulose e -glucana (HENDRIX, 1964).

Tambm os oomicetos diferem dos fungos quanto ao papel do ergosterol na membrana

celular, ou seja, nos primeiros ele no o principal esteride . Nenhum dos oomicetos

compartilham da mesma bioqumica dos esterides como os fungos. Espcies dos

gneros Pythium, Lagenidium, e Phytophthora possuem esterides auxotrficos, ou

seja, eles incorporam os esterides do ambiente em lugar de os produzirem como ocorre

com os fungos. Os esterides so importantes para produo de estruturas sexuadas in

vitro, mas no so necessrios para o crescimento da hifa vegetativa (GROOTERS,

2003).

1.2 Pythium insidiosum

O gnero Pythium pertence ao filo Oomycota, cujos membros caracterizam-se

por: 1) produo de zosporos biflagelados durante a reproduo assexuada); 2)

reproduo sexuada oogmica; 3) parede celular composta de -glucanas, celulose e

hidroxipolina; 4) talo diplide; 5) mitocndria com crista tubular; 6) caractersticas

moleculares e bioqumicas peculiares, como uma rota alternativa para sntese do

aminocido lisina (MOORE-LANDECKER, 1996; ALEXOPOULOS et al., 1996). Esse

gnero possui mais de 120 espcies distribudas em todo planeta, sendo a maioria

habitantes do solo e patgenos de plantas. Espcies de Pythium so a principal causa da

doena damping-off de plantas, ocasionando severos prejuzos em lavouras. Algumas

espcies tem sido estudadas para utilizao como controle biolgico de fungos

patgenos e larvas de mosquito, enquanto apenas a espcie P. insidiosum conhecida

como patgeno de mamferos. A identificao das espcies de Pythium no uma tarefa

fcil, pois est baseada principalmente nas caractersticas morfolgicas dos

zoosporngios (figura 2), zosporos, oognia e anterdio (ALEXOPOULOS et al.,

1996; MOORE-LANDECKER, 1996).

18

Figura 2: Esporngio lobulado de Pythium insidiosum, cepa CBS 101555, produzido em meio de induo sobre folhas da grama Paspalum notatum. Este esporngio est em estgio intermedirio e tem 6 minutos de desenvolvimento (400x). [Foto LAPEMI].

SCHURKO et al. (2003), ao compararem 28 espcies de P.insidiosum originrias

das Amricas, sia e Austrlia, atravs de comparao do espao ribossomal

intergnico pela tcnica molecular de RFLP (restriction fragment-lenght

polymorphism) e anlise dos clusters (figura 3), demonstraram haver grandes

diferenas entre os isolados de P. insidiosum das 3 regies estudadas (figura 3) com a

possibilidade real de no serem todas a mesma espcie. Estes autores levantam a

possibilidade de uma reclassificao como sub-espcies, pois cada cluster dos isolados

representa populaes geneticamente distintas.

19

Figura 3: Fenograma UPGMA apresentando as interrelaes entre isolados

de P. insidiosum. O hospedeiro e o pas de origem esto indicados entre parnteses (hospedeiro/Pas) com as seguintes abreviaes : Hospedeiro Ca, canino; Cq, Culex quinquefasciatus larva; Eq, eqino; Hu, humano; To, Tremarctos ornatus (spectacled bear); Pas AU, Austrlia; BR, Brasil; CR, Costa Rica; HA, Haiti; IN, ndia; JA, Japo; NG, Nova Guin; TH, Tailndia; US, Estados Unidos. (SCHURKO et al., 2003)

1.3 Epidemiologia

A pitiose ocorre em regies de clima tropical, subtropical e temperado, tendo

sido relatada nas Amricas, alguns pases europeus, sudeste asitico e Oceania

(CHAFFIN et al., 1995; FOIL, 1996; MENDOZA et al., 1996). No h predisposio

por sexo, idade ou raa e a fonte de infeco so os zosporos ambientais, no havendo

relatos de transmisso direta entre animais e entre animais e homens (MENDOZA et al.,

1996).

As condies ambientais so determinantes para o desenvolvimento do

organismo em seu ecossistema. Segundo MILLER & CAMPBELL (1982a), para a

produo de zosporos so necessrias temperaturas entre 30 e 40C e o acmulo de

gua em banhados e lagoas (figura 4). A grande maioria dos casos de pitiose foram

20

observados durante ou aps a estao chuvosa. Baseados nos dados epidemiolgicos, os

autores acreditam na existncia de um perodo de incubao de vrias semanas. No

Pantanal brasileiro, a maioria dos casos de pitiose eqina so registrados entre os meses

de fevereiro e maio (vero-outono), perodo que corresponde ao pice das cheias (LEAL

et al., 2001). Grande parte dos 38 casos de pitiose observados por TABOSA et al.

(1999) na Paraba, foram registrados nos meses de julho a outubro, sete a dez meses

aps o incio das chuvas na regio.

Figura 4: Eqinos em seu habitat no pantanal matogrossense. Destaca-se a

macia proliferao de plantas aquticas onde se reproduz o P. insidiosum. (Foto SANTURIO et al. 2003)

Em 1983, MILLER props um ciclo ecolgico para descrever o comportamento

ambiental e a cadeia infecciosa desse organismo. O ciclo baseia-se na colonizao de

plantas aquticas, que servem de substrato para o desenvolvimento e reproduo do

organismo, formando os zoosporngios. Os zosporos livres na gua, movimentam-se

at encontrar outra planta (ou animal), onde se encistam e emitem tubo germinativo,

dando origem a um novo miclio e completando seu ciclo (figura5). Anlises in vitro

demonstraram a atrao dos zosporos por plos, tecidos animal e tecido vegetal, sendo

a quimiotaxia atribuda a algumas substncias presentes nesses tecidos. Uma substncia

amorfa liberada pelo zosporo aps o seu encistamento, a qual provavelmente

produzida em resposta ao fator quimiotxico do hospedeiro; essa substncia agiria como

21

um adesivo para ligar o zosporo a superfcie do hospedeiro e permitir a formao de

tubo germinativo (MENDOZA et al., 1993).

Z o sp o r o s e m Z o sp o r o s e m g u a s p a ra d a s g u a s p a ra d a s

F o rm a oF o rm a o Z o o p o r n g io sZ o o p o r n g io se Z o sp o r o se Z o sp o r o s Z o sp o r o s liv r e sZ o sp o r o s liv re s

Z o s p o r o s a tr a d o s Z o s p o r o s a tr a d o s p a r a o s p e lo sp a r a o s p e lo sd o sd o s e q u in o se q u in o s

F ix a mF ix a m -- s e n u m a s e n u m a fe r id a e g e r m in a mf e r id a e g e r m in a m

Z o sp o r o s f ix a mZ o sp o r o s f ix a m -- s es en a s p la n ta s d a g u an a s p la n ta s d a g u a

G e r m in a m p la n taG e r m in a m p la n tah o sp e d e irah o sp e d e ira

M ic lio p la n taM ic lio p la n tah o sp e d e irah o sp e d e ir a

C r e s c im e n toC r e s c im e n tov e g e ta t iv ov e g e ta t iv on o s te c id o s n o s te c id o s (P I T IO S E )(P I T IO S E )

K u n k e rK u n k e r s o ltas o lta -- s es ed od o g r a n u lo m ag r a n u lo m a e c a ie c a in a g u an a g u a

C ic lo C ic lo N o r m a lN o r m a l

Figura 5: Esquema do ciclo biolgico do Pythium insidiosum adaptado de

MILLER (1983).

Essas observaes sustentaram a teoria de infeco, sugerindo que os cavalos em

contato com guas contaminadas poderiam atrair os zosporos, os quais germinariam a

partir de uma pequena leso cutnea (MILLER, 1983; MENDOZA et al., 1993). Outros

autores sugeriram a possibilidade de penetrao dos zosporos atravs dos folculos

pilosos, baseados na deteco de hifas no interior do folculo de bovinos infectados

naturalmente e no fato do quimiotaxismo ser mais ativo na regio localizada dentro do

folculo piloso (SANTURIO et al.,1998). Essa observao pode questionar a

necessidade de leso na pele para que ocorra a germinao dos zosporos. Por outro

lado, nos casos e relatos acompanhados no Brasil, foi possvel detectar diferenas na

suscetibilidade de equinos infeco. Comparando-se com os dados de pitiose humana,

onde a maior parte dos casos ocorrem em indivduos talassmicos, pode-se suspeitar da

presena de alguma(s) caracterstica(s) que torne alguns animais mais suscetveis. So

necessrias mais investigaes nesse sentido (SANTURIO et al., 2003).

No Brasil, a pitiose foi descrita em eqinos, bovinos e caninos, porm a maioria

dos casos relatados corresponde a leses cutneas em eqinos. O primeiro relato

ocorreu no Rio Grande do Sul, por SANTOS & LONDERO (1974). Os relatos de

22

pitiose eqina no Brasil somam mais de 90 casos e foram descritos em vrios estados

como Rio Grande do Sul (SANTOS, et al., 1987; MEIRELES et al. 1993, SALLIS et

al., 2003), Mato Grasso do Sul (MONTEIRO, 1999; LEAL et al., 2001), So Paulo

(RODRIGUES & LUVIZOTTO, 2000), Par (TRY & CORA, 1997), Paraba

(TABOSA et al. 1999), Paran (HEADLEY & ARRUDA Jr, 2004) e Rio de Janeiro

(SANAVRIA et al., 2000). Alm dos casos descritos na literatura, existem informaes

de mdicos veterinrios de vrias regies do pas, demonstrando a presena da doena

em vrios estados. Esses relatos comprovam a provvel existncia da pitiose equina em

todo o Pas. Alm disso, o Pantanal brasileiro provavelmente o local de maior

incidncia e prevalncia de pitiose eqina do mundo (MENDOZA et al., 1996, LEAL et

al., 2001; SANTURIO et al., 2003). O Pantanal uma plancie inundvel de

aproximadamente 140.000 km2 e possui em torno de 139.760 eqinos (SILVA et

al.,1995). Embora no exista um levantamento preciso da incidncia no Brasil, a pitiose

equina representa um problema criao de eqinos, especialmente em regies

alagadias como no pantanal brasileiro.

1.4 PITIOSE

1.4.1 Eqinos

A doena conhecida por outros nomes como hifomicose, zigomicose, dermatite

granular, bursattee, Florida leeches, granuloma ficomictico e swamp cancer

(CHAFFIN et al., 1995; FOIL, 1996); nos estados de Mato Grosso e Mato Grosso do

Sul o nome popular mais conhecido ferida da moda (LEAL et. al., 2001). O termo

hifomicose inclui outras doenas causados por fungos, especialmente Conidiobolus

ranarum e Basidiobolus haptosporum, alm de membros da ordem Mucorales

(BROWN & ROBERTS, 1988).

A espcie eqina a mais atingida pela pitiose, no havendo predisposio de

raa, sexo ou idade (MENDOZA & ALFARO, 1986; FOIL, 1996). As leses cutneas

so as mais freqentes e atingem principalmente as extremidades distais dos membros e

poro ventral da parede toraco-abdominal, provavelmente devido ao maior tempo de

contato com guas contaminadas com zosporos (MILLER & CAMPBELL, 1982a;

CHAFFIN et al., 1995). O zosporo de P. insidiosum em contato com uma ferida,

produz tubo germinativo com secreo de enzimas proteolticas que penetram

23

ativamente no tecidos exercendo presso de 0,14N m-2 sobre eles para sua penetrao

(RAVISHANKAR et al., 2001; MACDONALD et al., 2002). Os sinais clnicos

caracterizam-se por leses ulcerativas granulomatosas, formando grandes massas

teciduais (5 a 500mm), com bordas irregulares, de aparncia tumoral e com hifas

recobertas por clulas necrticas, que formam massas branco-amareladas semelhante a

corais, chamadas internacionalmente de kunkers. Os kunkers variam de 2 a 10 mm

de dimetro, tem forma irregular, ramificada, com aspecto arenoso e penetram no tecido

granular, dentro de sinus formados ao longo do seu trajeto. O tamanho das leses

depende do local e durao da infeco e, apresentam secreo sero-sanguinolenta,

muco-sanguinolenta, hemorrgica e, s vezes, mucopurulenta que flui atravs dos sinus.

Os animais apresentam intenso prurido e normalmente mutilam a leso na tentativa de

aliviar o desconforto (Figura 6). Claudicao freqente nos cavalos atingidos nos

membros (MILLER & CAMPBELL, 1982a; MEIRELES et al., 1993; CHAFFIN et

al.,1995; MENDOZA et al., 1996; LEAL et al., 2001). A maioria dos casos descritos

relata apenas uma leso em cada animal, porm podem existir leses cutneas

multifocais, como as descritas por MILLER & CAMPBELL (1982a), MENDOZA &

ALFARO (1986) e CHAFFIN et al. (1992). Tambm a pitiose pode se disseminar para

rgos internos a partir de infeces sub-cutneas (REIS et al., 2003). Esses autores

detectaram infeco generalizada em 3 equinos no estado de Minas Gerais,

principalmente pulmes e fgado, sendo o achado de hifas confirmado atravs de PCR

do DNA ribossomal como P. insidiosum. Em 2001, LEAL et al., relatam casos atpicos

de pitiose eqina no pantanal brasileiro. Os animais mostram leses deformantes mas,

de forma diversa, no ocorre a sada constante de linfa e outros fludos corporais e o

tecido granulomatoso recoberto com pele escurecida e grossa (figura 7). Ao ser

pressionada a leso, facilmente consegue-se extrair kunkers com facilidade de onde

foram isoladas estruturas posteriormente identificadas como Pyhium insidiosum. Os

eqinos com tais leses atpicas de pitiose no apresentam emagracimento progressivo

e, aps um ano de observao as leses permanecem do mesmo aspecto e tamanho.

Segundo Leal et al. (2001), somente no pantanal brasileiro so registradas estas formas

bizarras da pitiose nos eqinos.

24

Figura 6. Eqino do pantanal com pitiose clssica na pata em processo de

auto mutilao . Os eqinos com pitiose apresentam intenso prurido no local da leso.(Foto LAPEMI)

Figura 7: Leso atpica de pitiose no pantanal brasileiro descrita por LEAL

et al. (2001). Observa-se leso no supurativa, recoberta com pele escura e, sob presso, saem com facilidade kunkers. (Foto LAPEMI)

O envolvimento intestinal a segunda forma mais freqente da infeco pelo

Pythium insidiosum em eqinos. Os casos descritos apresentaram-se como episdios de

clica, cuja causa a presena de massas teciduais, com diminuio e obstruo do

lmen intestinal ou ambos. Os achados de necropsia e exciso cirrgica revelaram

25

ulcerao intestinal e massas nodulares localizadas na parede do jejuno, podendo atingir

20cm de dimetro (SANTURIO et al., 2003).

Alm da pitiose cutnea e intestinal, outros rgos e tecidos podem ser atingidos

secundariamente s leses cutneas. As leses sseas descritas na literatura referem-se a

cavalos com leses cutneas crnicas, localizadas nos membros e com grande

proliferao do tecido granulomatoso. Estas leses sseas ficaram limitadas aos ossos

adjacentes s leses cutneas crnicas e, caracterizaram-se por exostoses, ostelises e

osteomielite no exame radiolgico alm da presena de granulomas com infiltrado de

eosinfilos com reas de necrose e massas necrticas contendo hifas no exame

histopatolgico (MENDOZA et al., 1988; ALFARO & MENDOZA, 1990; EATON,

1993).

Casos de metstase via sistema linftico para pulmes e linfonodos regionais j

foram relatados (CHAFFIN et al., 1996). Foram descritos casos nos linfonodos

cervicais inferiores, inguinais e submandibulares (CONNOLE, 1973; MURRAY et al.,

1978; LEAL et al., 1997), sendo sempre os responsveis pela drenagem linftica da

regio atingida pela leso cutnea. Os linfonodos atingidos apresentavam kunkers,

dos quais foi possvel o isolamento do agente etiolgico. Na maioria dos casos de

pitiose cutnea, os linfonodos regionais encontram-se aumentados. No entanto, esse

achado pode ser utilizado apenas como um indicativo de metstase. Em um estudo de

MILLER & CAMPBELL (1984), foram examinados os linfonodos de 15 cavalos com

pitiose e todos apresentavam-se aumentados e edematosos, porm em apenas trs

animais foi detectada metstase no linfonodo inguinal.

1.4.2 Ces e Gatos

Os caninos so a segunda espcie mais atingida pela pitiose, tambm nas formas

cutnea e gastrintestinal. A forma gastrintestinal a mais comum e manifesta-se com

distrbios digestivos como vmito, anorexia crnica, perda de peso, diarria (s vezes

sanguinolenta) e presena de massas nodulares, quando submetidos a palpao

abdominal (MILLER et al., 1983; BENTINCK-SMITH et al., 1989; FISCHER et al.,

1994; DYKSTRA et al., 1999; GROOTERS, 2003). Os ces afetados so normalmente

26

oriundos de regies rurais ou estiveram, esporadicamente, em locais alagados como

audes e banhados (FOIL et al., 1984; FISCHER et al., 1994; DYKSTRA et al., 1999).

As leses gastrintestinais caracterizam-se pela formao de grandes massas nas paredes

do estmago e intestino que so compostas por inflamao granulomatosa e

piogranulomatosa com reas de necrose, intenso infiltrado eosinoflico e presena de

hifas (BENTINCK-SMITH et al., 1989; MILLER et al., 1983; MILLER, 1985;

FISCHER et al., 1994; LILJEBELKE et al., 2002). O trato digestivo superior tambm

pode ser atingido pela doena, em que PATTON et al. (1996) relataram 2 casos de

esofagite crnica devido infeco pelo Pythium insidiosum, enquanto HELMAN &

OLIVER (1999) descreveram um caso de pitiose canina com uma massa na orofaringe,

envolvendo a laringe e esfago cranial. J JAEGER et al. (2002) descreveram a

infeco no clon e metstases na prstata, com sinais hipertrofia do rgo e sintomas

de tenesmo de um co macho da raa Irish Setter com 4 anos de idade.

As leses cutneas apresentam-se como dermatite piogranulomatosa ulcerativa,

contendo reas de necrose infiltrada por neutrfilos e macrfagos e granulomas

eosinoflicos (FOIL et al., 1984; ENGLISH & FROST, 1984; HOWERTH et al., 1989;

DYKSTRA et al., 1999). Em 1997, LARSSON et al. relataram o primeiro caso de

pitiose canina no Brasil, afetando uma fmea com leso cutnea no membro posterior

direito e RIET-CORREA et al. (1998) e RECH et al. (2002) descreveram um caso de

pitiose entrica, em Pelotas e Santa Maria, RS, respectivamente (figura 8).

27

Figura.8: Colite infecciosa de um co com pitiose. Observa-se formao de

massas tumorais e obliterao parcial do rgo. (Foto Setor de Patologia Veterinria, UFSM).

A pitiose em gatos rara, havendo poucos relatos na literatura. Um relato refere-

se a uma infeco nasal e retrobulbar, sem envolvimento de orgos internos, cujo

diagnstico baseou-se em imunohistoqumica, sorologia atravs de imunodifuso e

isolamento do agente (BISSONNETTE et al., 1991). FOIL apud MENDOZA et al.

(1996) mencionou a ocorrncia de novos casos de pitiose em gatos na Flrida.

1.4.3 Bovinos

A pitiose bovina tambm pouco freqente, havendo apenas dois relatos na

literatura. O primeiro na regio de Louisiana, EUA (MILLER et al., 1985) e o segundo

na regio do Pantanal, Brasil (SANTURIO et al., 1998). Esses relatos descreveram

leses cutneas, geralmente nos membros e caracterizadas por ulceraes, espessamento

da derme e edema na regio afetada (figura 9). A idade dos animais infectados variou

entre trs e nove meses de idade. Histologicamente, as leses apresentaram-se como

granulomas dermais multifocais rodeados por tecido conjuntivo fibroso. No centro dos

granulomas havia um pequeno nmero de hifas ramificadas, sem formao de

kunkers (MILLER et al., 1985; SANTURIO et al., 1998). Incrustao granular ao

redor de pores de hifas, sugestiva de deposio de complexos antgeno-anticorpo ou

28

reao de Splendore-Heoppli, foi observada nos casos descritos por MILLER et al.

(1985). O relato de SANTURIO et al. (1998) menciona a cura espontnea das leses.

Figura 9: Bovinos da raa nelore de 6 meses de idade, com leso de pitiose

(SANTURIO et. al. ,1998)

1.4.4 Humanos

A maioria dos casos de pitiose humana foram observados na Tailndia e

esporadicamente, nos EUA, Austrlia, Haiti e Nova Zelndia. Os primeiros casos foram

relatados em 1986, por Thianprasit na Tailndia (apud MENDOZA et al., 1996).

Segundo IMWIDTHAYA (1994b), as infeces por Pythium insidiosum em humanos,

podem apresentar-se de trs formas: 1- Leses granulomatosas no tecido subcutneo de

pacientes talassmicos. 2- Forma sistmica, caracterizada por desenvolvimento de

arterite crnica, trombose arterial e gangrena, atingindo geralmente a extremidade dos

membros inferiores de pacientes talassmicos. 3- Ceratite; podendo ou no ser associada

talassemia.

SATHAPATAYAVONGS et al. (1989) relataram cinco casos de arterite, desses

relatos de arterite, dois evoluiram para a ruptura fatal da aorta, dois necessitaram a

amputao da perna afetada e um paciente foi curado com resseco do aneurisma. A

evoluo desses casos demonstra a gravidade da pitiose arterial em humanos. Dois

29

fatores contribuem para importncia da pitiose humana na Tailndia: a prevalncia da

alfa e beta-talassemia e presena de grandes reas algadias utilizadas para agricultura

(IMWIDTHAYA, 1994b). TRISCOTT et al. (1993) descreveram dois casos de pitiose

subcutnea na Austrlia. As leses apresentaram-se na regio periorbital e o aspecto

histopatolgico apresentou-se similar ao das infeces em eqinos, porm no foram

detectados kunkers. Casos de ceratite, causada por Pythium insidiosum, foram

descritos na Nova Zelndia (MURDOCH & PARR, 1997) e Tailndia

(IMWIDTHAYA, 1995). No ano de 2002, HEALTH et al., relatam um caso de pitiose

pulmonar, em um menino com 12 anos de idade, portador de leucemia, que entrou no

hospital com sintomas de febre, tosse e dificuldade respiratria.

1.4.5 Coelhos

At o presente momento, no foi possvel reproduzir a enfermidade atravs de

infeco experimental nas espcies animais infectadas naturalmente. No entanto,

MILLER & CAMPBELL (1983) demonstraram a susceptibilidade de coelhos como

modelo experimental para a pitiose. Inoculao subcutnea de gua rica em zosporos

produziu ndulos que evoluiram para fibrogranulomas eosinoflicos. Os coelhos

inoculados por via intra-peritonial desenvolveram hepatite severa e peritonite, com

reas de necrose contendo hifas, reao granulomatosa com infiltrado de neutrfilos e

eosinfilos. As leses apresentaram caractersticas similares infeco natural dos

eqinos e o Pythium insidiosum foi isolado das mesmas (MILLER & CAMPBELL,

1983).

A inoculao subcutnea com zosporos provoca abscedao progressiva, mas

no ocorrem ulceraes comparveis com a doena natural nos eqinos, e tampouco a

formao de kunkers(figuras 10 e 11). No entanto, na avaliao leucocitria, o quadro

da pitiose em coelhos semelhante aos equinos, ou seja, ocorre progressiva leucocitose

com moderada neutrofilia e leve monocitose (MILLER & CAMPBELL, 1983;

MILLER & CAMPBELL, 1983b). Portanto esta espcie serve como modelo

experimental para estudo sorolgico e avaliao de imunoterapia (LEAL et al. 2002).

30

Figura 10: Fibrogranuloma em coelho aps 30 dias de inoculao com

17.500/mL zosporos de Pythium insidiosum (foto LAPEMI).

Figura 11 : Coelho com fibrogranuloma supurado aps 60 dias da inoculao com 17.500 zosporos/mL de Pythium insidiosum. Grupo 2 inoculado com imunoterpico sonicado (foto LAPEMI).

31

1.5 Histopatologia

Histologicamente nos eqinos, os kunkers apresentam-se como cogulos

eosinoflicos de tamanho variado e forma circular com contornos irregulares. Estes

cogulos so compostos de hifas, colgeno, arterolas e clulas inflamatrias,

especialmente eosinfilos. Em torno das hifas, os eosinfilos esto degranulados e em

direo a periferia os grnulos tornam-se mais evidentes. Na borda comum encontrar-

se eosinfilos intactos. A rea ao redor do cogulo composta por um exsudato

inflamatrio espesso de neutrfilos e eosinfilos. A rea entre os kunkers

caracterizada por inflamao granulomatosa e supurativa (MILLER & CAMPBELL,

1984; BROWN et al., 1988). Em cortes histolgicos corados com colorao especial de

prata, pode-se observar as hifas com paredes espessas, esparsamente septadas,

irregularmente ramificadas (normalmente em ngulo reto) e medindo de 2 a 6 m de

dimetro (MILLER & CAMPBELL, 1984; CHAFFIN et al., 1995).

Os achados histopatolgicos da pitiose intestinal eqina variam de tecido

conjuntivo fibroso com reas de necrose de coagulao e focos de mineralizao,

clulas inflamatrias (macrfagos e neutrfilos) degeneradas, sem infiltrado eosinoflico

(BROWN & ROBERTS, 1988), at ao granuloma eosinoflico crnico (ALLISON &

GILLIS, 1990; MORTON et al., 1991; PURCELL et al., 1994). As hifas so

visualizadas atravs da colorao especiais com sais de prata, medindo de 2 a 8 m de

dimetro, com parede espessa, raras septaes e ramificaes irregulares, geralmente

encontrados dentro de focos de mineralizao. Os kunkers, caractersticos das leses

cutneas no foram observados nos casos de pitiose intestinal (BROWN & ROBERTS,

1988; ALLISON & GILLIS, 1990; MORTON et al., 1991; PURCELL et al., 1994).

A histopatologia das leses da pele de coelhos inoculados via subcutnea,

apresentaram alteraes progressivas com necrose aguda acompanhada de infiltrado

granuloctico 3 dias aps a inoculao experimental. Vinte dias ps-inoculao, os

coelhos passaram a apresentar leses com abscesso eosinoflico fibrogranulomatoso

(MILLER & CAMPBELL, 1983).

1.6 Diagnstico

Tradicionalmente, o diagnstico da pitiose baseava-se nos aspctos clnicos,

histopatolgicos e no isolamento e identificao do agente atravs de suas

caractersticas culturais, morfolgicas e reprodutivas. A identificao precoce da

32

doena, no entanto, torna-se difcil atravs desses mtodos. Atualmente, mtodos como

imunohistoqumica e tcnicas sorolgicas auxiliam e suportam um diagnstico precoce

e correto (MENDOZA et al., 1996). Em 1988, BROWN et al., descreveram pela

primeira vez o mtodo de imunohistoqumica para diagnstico da pitiose eqina, que foi

posteriormente utilizada por vrios autores (HOWERTH et al., 1989; FISCHER et al.,

1994; PURCELL et al., 1994). O diagnstico diferencial inclui habronemose, neoplasia,

tecido de granulao exuberante e granulomas fngicos e bacterianos (CHAFFIN et al.,

1992).

O desenvolvimento de tcnicas sorolgicas foi impulsionado por MILLER &

CAMPBELL (1982b), que desenvolveram tcnicas para o diagnstico e monitoramento

da resposta imunolgica em eqinos afetados. Esses autores desenvolveram as tcnicas

de imunodifuso em gel de gar (ID), fixao do complemento (FC) e um teste de

hipersensibilidade intradrmica (TI), para diagnosticar e avaliar a resposta imune

humoral e celular de cavalos com pitiose. Os testes realizados em cavalos com pitiose

clnica comprovada, diagnosticaram positivamente 100% (ID), 82% (FC) e 64% (TI)

dos casos. Esses dados comprovaram que o teste de ID apresenta alta sensibilidade e

especificidade para a deteco de anticorpos anti P. insidiosum (MILLER &

CAMPBELL, 1982b). O teste de FC foi utilizado somente na Austrlia, pois alm de

menos sensvel e especfico que ID, um teste difcil de realizar e requer pessoal

experiente para sua realizao (MENDOZA et al., 1996).

KAUFMAN et al. (1990) demonstraram a eficincia da ID para o soro-

diagnstico das zigomicoses causadas por Basidiobolus ranarum e Conidiobolus

coronatus em humanos e animais, assim como para pitiose e, comprovaram que o teste

eficiente para o diagnstico diferencial destas trs micoses em humanos e animais.

Outros autores tambm demonstraram a eficincia e utilidade da ID para o diagnstico

da pitiose.

MENDOZA et al. (1997) desenvolveram um teste de ELISA para o soro-

diagnstico de pitiose em humanos e animais, utilizando antgeno solvel de hifas

sonicadas. Amostras de soro de humanos e animais saudveis e com pitiose clnica

foram testadas e os resultados comparados com o teste de ID. Os resultados indicam que

o teste de ELISA eficiente para o diagnstico da pitiose, e possui especificidade

semelhante ID, porm com melhor sensibilidade. No Brasil, ROSA et al. (1999)

desenvolveram um teste ELISA para diagnstico de pitiose eqina e, ALVES et al.

(2001) desenvolveram a tcnica de ELISA-conta para deteco de soropositividade

33

para pitiose, enquanto SANTURIO et al. (2001) descreveram a padronizao de teste

ELISA para deteco de IgG em coelhos imunizados com antgenos de P. insidiosum.

J, GROOTERS et al. (2002) desenvolveram teste de ELISA para diagnstico

sorolgico precoce de pitiose em caninos, enquanto KRAJAEJUN et al. (2002) fizeram

o mesmo para diagnstico de pitiose em humanos.

Um teste de dot-blot modificado foi desenvolvido para deteco de IgG anti-

pythium em coelhos e eqinos. A tcnica desenvolvida utilizou sistema de

luminescncia qumica para visualizao da reao, no entanto, a tcnica pode ser

adaptada para um sistema de visualizao direta na membrana, podendo ser utilizada

como um teste de campo, pela sua especificidade, sensibilidade, praticidade e baixo

custo (LEAL,1999).

O sucesso no isolamento de P. insidiosum alto quando amostras de bipsias

forem armazenadas ou transportadas temperatura ambiente, com o acrscimo de

antibiticos, entre 1 e 3 dias antes de seu processamento no laboratrio. Quando o meio

de transporte da bipsia no contiver antibiticos melhor transport-la a 4C

(GROOTERS et al., 2002b). Estes dados sugerem que a inibio do crescimento

bacteriano, que contamina a amostra, aumenta as chances de isolamento de P.

insidiosum de tecidos infectados. Estes autores sugerem, tambm, o uso, como rotina

para isolamento do agente, de gar V8 (MILLER, 1955), acrescido de estreptomicina

(200g/mL) e ampicilina (100g/mL). Pedaos pequenos de tecido fresco , no

macerados, podem ser distribudos diretamente na superfcie do gar e incubado a 37C.

Crescimento tpico observado entre 12 e 24 horas aps (GROOTERS, 2003). A

identificao de isolados de P. insidiosum pode ocorrer atravs do aspecto da colnia e

na caracterstica das hifas. As colnias em gar V8, sabouraud dextrose (figuras 12 e

13) ou gar farinha de milho (CMA), apresentam-se submersas de colorao branca ou

hialina (DE COCK et al.,1987). Os zosporos podem ser produzidos, a partir do cultivo

de P. insidiosum com 1 a 2 dias de cultivo (figura 14), em folhas de grama estreis

sobre gar gua a 2% e incubao a 37C pelo perodo de 18 a 24 horas. Aps as folhas

infectadas pelo Pythium so colocadas em soluo de sais minerais diluda a 1%. Cerca

de 2-4 horas de incubao a 37C os zosporos crescem a partir de hifas terminais

(GROOTERS, 2003).

O sequenciamento gnico com amplificao do RNA ribossomal, regio ITS 1,

atravs de PCR (reao de polimerase em cadeia) uma ferramenta poderosa para

deteco e identificao de P. insidiosum (GROOTERS & GEE, 2002; REIS et al.,

34

2003).

Figura 12: Cultivo de P. insidiosum em caldo sabouraud a 37C com

crescimento em 24 horas. (foto LAPEMI)

Figura 13: Hifas de Pyhium insidiosum em cultivo em gar farinha de

milho (400x) [foto LAPEMI]

35

Figura 14: Cultivo de isolado de P. insidiosum, para produo induo de

zoosporangnese, em folhas de Paspalum notatum em gar gua a 2%, temperatura de 37C. direita crescimento em 24 horas e esquerda crescimento de 56 horas. (Foto LAPEMI).

1.7 Tratamento

O tratamento de infeces causadas pelo Pythium insidiosum em animais e

humanos complicado pelas caractersticas singulares do agente. O P. insidiosum

difere dos fungos verdadeiros na produo de zosporos mveis e na composio de sua

parede celular. Os fungos verdadeiros possuem quitina em sua parede, enquanto o

Pythium contm celulose e -glucanas. A membrana plasmtica no contm esterides,

como o ergosterol, que o componente-alvo de ao da maioria das drogas antifngicas

(FOIL, 1996). Devido essas caractersticas, no existe droga antifngica eficiente

contra o P. insidiosum (SATHAPATAYAVONGS et al., 1989; FOIL, 1996). Os

fitopatgenos do gnero Pythium so sensveis aos inseticidas normalmente utilizados

em plantas, porm esses compostos so txicos aos mamferos, impossibilitando seu uso

para o tratamento da pitiose (SATHAPATAYAVONGS et al., 1989). Um fungicida

utilizado em plantas (Metalaxil), foi testado no tratamento de ces, porm com

resultados pouco consistentes, em parte pela toxicidade do composto (FOIL, 1996).

O sucesso das diferentes formas de tratamento varivel e, em muitos casos

influenciado pelo tamanho e durao da leso, idade e estado nutricional do animal. O

tratamento tradicional da pitiose eqina cirrgico, sendo o procedimento mais

utilizado. A interveno cirrgica requer retirada de toda rea afetada, com margem de

segurana para evitar as recidivas, porm isso dificultado pelas estruturas anatmicas

envolvidas, principalmente nos membros (MILLER, 1981). O tratamento cirrgico

36

apresenta bons resultados apenas em leses pequenas e superficiais, onde seja possvel a

retirada de toda rea afetada.

No tratamento qumico as drogas mais utilizadas at o momento foram a

anfotericina B, cetoconazole, miconazole, fluconazole e itraconazole, alm dos

compostos iodnicos como iodeto de potssio e sdio (SANTURIO et al.,2003).

McMULLAN et al. (1977), obteve 50% de eficincia associando a remoo cirrgica e

anfotericina B; 30% apenas com anfotericina B e 20% das ficomicoses subcutneas no

responderam aos tratamentos.

Segundo GONZALES et al. (1979) o tratamento das ficomicoses subcutneas

respondem ao iodeto de potssio mais eficiente quando usado aps a extirpao

cirrgica do granuloma. CHAFFIN et al. (1992) tambm relataram o sucesso do

tratamento cirrgico seguido de iodeto de sdio em um potro com pitiose cutnea.

Entretanto, MEIRELES et al. (1993) no obtiveram sucesso em dois eqinos tratados

com iodeto de potssio endovenoso, at mesmo quando associado cirurgia.

At o presente momento, nenhuma das terapias antifngicas propostas para a

pitiose canina (sistmica ou cutnea) apresentaram resultados satisfatrios (tabela 1),

entre as drogas testadas destacam-se a anfotericina B, iodeto de sdio, flurocitosina,

cetoconazole (ADER, 1979; ENGLISH & FROST, 1984; DYKSTRA et al., 1999). A

ltima droga testada foi o itraconazole (5mg/kg/60 dias), porm no apresentou

nenhuma melhora (DYKSTRA et al., 1999). Segundo HNILICA (1998), a cirurgia

continua como opo mais segura para o tratamento da pitiose canina.

37

Tabela 1: Descrio de 15 casos de pitiose em ces, mostrando que o tratamento com

antifngicos no mostrou eficincia na cura da enfermidade (DYKSTRA et al., 1999).

Co (n)

Idade

(meses)

Raa

Sexo

Durao sinais

clnicos (meses)

Co nadava

Regularmente?

Terapia

Antifngica

Resultado

01 11 English Setter

F 4 + Itraconazole, Vacina pitiose

Eutanasia

02 11 Labrador M 3 + Cetoconazole, Itraconazole,

Nistatina lipossomica

Cirurgia

Curado aps 2 anos

03 24 German Shepherd

F Desconhecida Desconhecido Anfotericina B,

itraconazole, cirurgia

Eutansia

04 12 Mista F Desconhecida Desconhecido Itraconazole, cirurgia

Eutansia

05 9 Poodle M 2 Desconhecido Nenhuma Desconhecido06 9 German

Shepherd F 6 Desconhecido Nenhuma Desconhecido

07 48 Catahoula F 5 Desconhecido Nenhuma Desconhecido08 24 Sheltie F 1 Desconhecido Nenhuma Eutansia 09 24 Mista F 4 + Nenhuma Eutansia 10 36 German

Shepherd M 1,5 Desconhecido Cetoconazole Desconhecido

11 24 German Shepherd

M 6 + Cetoconazole Desconhecido

12 24 German Shepherd

F Desconhecida + Nenhuma Eutansia

13 12 German Shepherd

M 0,5 + Cetoconazole Eutansia

14 12 Labrador F 6 + Anfotericina B,

cetoconazole, itraconazole, vacina pitiose

Eutansia

15 48 Retriever Mix

M 3 Desconhecido itraconazole Eutansia

Os resultados obtidos com as drogas antifngicas so controvertidos, tanto no

tratamento clnico como nos testes de sensibilidade in vitro. Em um estudo de SEKHON

et al. (1992) os polinicos anfotericina B, hamycina e seus anlogos no apresentaram

atividade satisfatria, enquanto os azlicos fluconazole, cetoconazole e miconazole

inibiram os isolados de P. insidiosum testados in vitro, com o miconazole apresentando

38

os melhores resultados. Em outro teste as drogas anfotericina B, flucitosina, miconazole

e griseofulvina no inibiram o crescimento do fungo, enquanto o itraconazole

apresentou atividade moderada e a terbinafina foi ativa contra o P. insidiosum testado

(SHENEP et al., 1998). De acordo com estes autores, a associao de terbinafina e

itraconazole apresentaram efeito sinrgico e foram utilizados, com sucesso, no

tratamento de um menino com infeco facial. Em outro relato, dois jovens com

infeco subcutnea na regio periorbital responderam bem ao tratamento com

anfotericina B (TRISCOTT et al., 1993), contrariando os resultados obtidos nos testes

in vitro. Tambm se obteve remisso clinica de um quadro de pitiose pulmonar, em um

menino com 12 anos de idade acometido de leucemia, aps 12 meses de tratamento com

itraconazole em combinao com anfotericina B lipossmica (HEALTH et al., 2002).

SEDRISH et al. (1997) relataram o sucesso do uso de raio laser vermelho de

alumnio, neodmio e trio como tratamento suplementar aps a remoo cirrgica de

leses de pitiose eqina.

Segundo HUBERT & GROOTERS (2002), a resseco cirrgica total do

granuloma combinada com imunoterapia especifica para P. insidiosum o tratamento

mais indicado para cura de pitiose clnica em eqinos.

1.8 Imunoterapia

Uma alternativa para o tratamento da pitiose eqina foi proposto por MILLER,

(1981), que desenvolveu um imunobiolgico (imunoterpico) a partir de culturas do

prprio agente, no qual utiliza-se um macerado de hifas, sonicadas e acondicionados em

frascos. O ndice de eficincia da imunoterapia foi em torno de 53% e 75% quando

associado a cirurgia (MILLER, 1981; MILLER & CAMPBELL, 1982b)

No decorrer da dcada de 80 e 90 vrios autores utilizaram a imunoterapia, cada

um com modificaes na tcnica originalmente descrita por MILLER. Em 1986,

MENDOZA & ALFARO utilizaram como antgeno apenas o sobrenadante das culturas,

objetivando diminuir a reao no local de aplicao. Foram utilizados cinco animais

para o teste, dos quais trs foram recuperados. MENDOZA et al. (1992a), compararam

duas vacinas para tratamento da pitiose equina, em 71 cavalos infectados. Uma vacina

utilizou massa celular como antgeno e a outra utilizou um antgeno solvel

39

concentrado. As duas vacinas apresentaram resultado positivo em cavalos com leses

com menos de dois meses, com 60% e 70% de eficincia, respectivamente (tabela 2).

MONTEIRO (1999) relatou o teste de eficincia de um imunobiolgico

(PitiumVac) para o tratamento da pitiose equina, produzido a partir de culturas do

Pythium insidiosum, baseando-se na metodologia descrita por Miller (1981). O ndice

de cura variou de 50% a 83,3% entre os grupos tratados (figura 16) .

Em 1998, THITITHANYANONT et al. descreveram o uso de um imunoterpico

em um menino talassmico de 14 anos de idade, infectado pelo P. insidiosum. Aps

insucesso com tratamentos a base de anfotericina B, iodetos, cetoconazole e cirurgia, a

cura foi obtida aps duas aplicaes (100l) do imunoterpico, com intervalo de 14

dias.

Apesar dos estudos sobre a doena e a imunoterapia, ainda no h um completo

conhecimento dos mecanismos envolvidos na infeco por Pythium insidiosum, em

parte pelas diferenas entre o Pythium insidiosum e os fungos patognicos para os

mamferos. De acordo com MILLER (1981), o carter progressivo da doena em

eqinos imunocompetentes sugere uma resposta imunolgica inadequada ou um

bloqueio na resposta imunolgica. Esse autor acredita que mesmo sendo antignicas, as

hifas no so completamente reconhecidas pelo hospedeiro, devido marcante reao

inflamatria. Em 1996, MENDOZA et al. props o possvel mecanismo imunolgico

desencadeado na pitiose eqina. No incio da infeco, as hifas de P. insidiosum

liberariam antgenos solveis que estimulariam a produo de IgE. Essas

imunoglobulinas ligariam-se a superfcie das hifas e ativariam os mastcitos, que

liberariam seus fatores quimiotxicos para atrair eosinfilos para o stio da infeco. Os

eosinfilos ligar-se-iam a poro Fc das IgE nas hifas e eventualmente degranulariam,

protegendo a hifa do sistema imune. O mecanismo proposto seria semelhante ao

relatado nas infeces parasitrias. Segundo os autores, h evidncias da presena de

antgenos solveis dispersos na leso e no apenas no interior dos kunkers. Mais

tarde, no ano de 2003, MENDOZA et al. ampliam sua hiptese conforme o esquema da

figura 15.

As explicaes para cura induzida pela imunoterapia so apenas propostas,

baseadas nas caractersticas clnicas, histopatolgicas e sorolgicas da infeco e seu

tratamento. Acredita-se que os antgenos citoplasmticos expostos ao sistema imune dos

animais via vacinao originariam uma resposta humoral e celular capaz de combater a

infeco natural. A resposta humoral pode ser demonstrada pelos testes de

40

imunodifuso e Western immunoblot, enquanto que a resposta celular pode ser

evidenciada pelo teste de hipersensibilidade intradrmica e alterao no infiltrado

inflamatrio (MENDOZA et al., 1996). Segundo MENDOZA et al. (1992b), o soro de

equinos infectados, testados pelo immunoblot, demonstraram a presena de trs

protenas imunodominantes (28, 30 e 32 kDa) e, amostras de soro eqino obtidas um

ano aps a cura pela imunoterapia tambm apresentaram anticorpos contra esses trs

antgenos.

Trabalho com western immunoblot (LEAL, dados no publicados) sugere a

presena de 5 antgenos imunodominantes e na avaliao de soro equino pr e ps-

tratamento com imunoterpico, no apresentou alteraes no perfil de IgG durante a

imunoterapia. Isso questiona sobre a real importncia desses antgenos

imunodominantes na cura dos eqinos.

MILLER (1981) props dois modelos para explicar a ao dos anticorpos. O

primeiro seria um mecanismo de citotoxicidade dependente de anticorpo e mediado por

clulas, que envolveria linfcitos, macrfagos e talvez eosinfilos ligados a anticorpos,

sobretudo IgG. O segundo modelo proposto envolveria anticorpos e o sistema

complemento, os anticorpos especficos estimulados pela vacina ativariam o sistema

complemento, danificando a parede celular e promovendo a lise do agente.

MENDOZA et al. (1996) acreditam que os mecanismos envolvidos na cura pela

imunoterapia, baseiam-se principalmente na resposta celular. Isto sustentado pelas

alteraes teciduais aps incio da imunoterapia, com mudana de inflamao

eosinoflica no inicial para uma resposta mononuclear, mediada por macrfagos e

linfcitos T. Os autores acreditam que os antgenos presentes no imungeno induziriam

esta alterao no padro inflamatrio, culminando com a cura dos animais. Entretanto,

NEWTON & ROSS (1993) verificaram que o nvel de anticorpos anti-Pythium aumenta

em eqinos doentes submetidos imunoterapia. De acordo com os autores, o aumento

do nvel de anticorpos auxiliaria na cura.

41

Tabela 2: Efeitos de imunoterpicos em diversos processos de fabricao:

Processo fabricao de

imunoterpico contra pitiose

Animais

testados (n)

Doses

(n)

Cura

(%)

Autores

Hifas sonicadas 30 equinos 3 53 Miller, 1981

Antgenos solveis 5 equinos 3 60 Mendoza &

Alfaro, 1989

Hifas liquidificadas ou maceradas

liofilizadas

110 equinos 6 83 Monteiro, 1999

Antgeno solvel + hifas

sonicadas

18 equinos 3 72 Mendoza et al.

2003

Antgeno solvel + hifas

sonicadas

6 ces 4 33 Mendoza et al.,

2003.

Figura 15: Hiptese proposta para os efeitos curativos dos imunoterpicos contra pitiose baseado em dados de humanos e eqinos (MENDOZA et al. 2003). A Pitiose quando o hospedeiro entra em contato, atravs de uma ferida, com zooporos de P. insidiosum, formado um tubo germinativo que penetra mecanicamente no tecido. Uma vez nos

42

tecidos, as hifas de P. insidiosum liberam exoantgenos [pontos grandes no desenho] denominados de antgenos de apresentao celular(APC). Os APC liberam IL4 (interleucina 4) que estimula a atrao dos linfcitos T auxiliar (Th0), que tambm estimulam linfcitos Th2 , que por sua vez induzem a produo de mais IL4 e IL5. As IL4 regulam a expresso de Th1 (seta pontilhada) e estimulando, por sua vez, clulas B para produo de IgE, IgM e IgG que uma vez precipitados so detectados por testes de diagnstico. As IL5 e IgE desencadeiam a mobilizao de eosinofilos e mastcitos para o local da leso (seta). Estas clulas vo degranular (so responsveis pelas leses teciduais) sobre as hifas de P. insidiosum, provocando o fenmeno de Hoeppli-Splendore que, mais tarde, ir desenvolver os kunkers na pitiose eqina, somente (seta). As hifas de P. insidiosum multiplicam-se no interior dos kunkers onde produzem exoantgenos em grande quantidade; um evento que, no final, bloqueia a resposta imune devido ao Th2. Quando os imungenos do imunoterpico so injetados no hospedeiro com pitiose (parte superior direita do esquema), os antgenos que esto presentes no seu APC so distintos que na infeco natural. Os APC liberam interferon (INF ) que ativam Th0 para Th1. O Th1 ativado produz mais IFN e, tambm, IL2. Por sua vez, IL2 e INF iro ativar mediadores de clulas mononucleares como resposta imune (CMI) composta por linfcitos T e macrfagos que danificam de destroem a hifa de P. insidiosum (seta). No est claro se durante a imunoterapia, as IL2 e IFN tambm estimulariam linfcitos B para produzir IgG protetores. A produo de IFN , no local da infeco, pelos APC e o Th1 produzidos, iro resultar numa menor transformao Th2. Portanto, a atrao de Th1 e o bloqueio de Th2 poderia explicar porque eqinos, ces e humanos com pitiose so curados aps injees com imunoterpicos.

43

A

B

Figura 16: Eqino com pitiose clnica na pata (A) e o mesmo animal totalmente curado (B) aps receber 4 doses do imunoterpico PitiumVac, produzidas a partir de hifas maceradas (liquidificadas) de Pythium insidiosum (cepa DMVP 118/98 CBS 101555) [Foto LAPEMI].

Os imunoterpicos em uso podem ter sua atuao prolongada e potencializada

atravs de adjuvantes, como ficou demonstrado por LEAL et al. (2002) em uso em

coelhos.

44

ARTIGO PUBLICADO:

O artigo Three types of immunotherapics against pythiosis insidiosi developed

and evaluated, publicado na Revista Vaccine vol.21 p. 2535-2540, em 2003, anexado

nas pginas seguintes, a ncora desta tese e comprova que a sonicao no bom

mtodo para disponibilizar todos os antgenos do Pythium insidisum.

45

46

47

48

49

50

51

DISCUSSO

A imunoterapia uma ferramenta teraputica muito utilizada em vrios campos da

medicina, inclusive, com testes iniciais, para controle de algumas neoplasias em

humanos.

Epidemiologicamente a pitiose est relacionada aos ambientes alagados em funo

da multiplicao do agente Pythium insidiosum ocorrer na gua. Por isso regies como o

pantanal brasileiro e campos de cultivos de arroz do sudeste asitico a doena ser muito

prevalente. No primeiro local atacando eqinos e nos campos de cultivo em humanos

que ficam parcialmente imersos nas guas das lavouras a repicarem mudas de arroz.

No existem relatos de pitiose humana no pantanal brasileiro, provavelmente devido aos

hbitos dos habitantes da regio, onde as pessoas quase no tm contato direto com a

gua de crregos e lagoas. No existem lavouras na regio e a imerso na gua evitada

devido presena de piranhas (OBSERVAO PESSOAL).

Diversos processos de produo de imunoterpicos foram desenvolvidos para

combater a pitiose clnica em eqinos no final do sculo XX (MILLER, 1981,

MENDOZA et al. 1986, MONTEIRO, 1999). Esses processos foram desenvolvidos

utilizando-se metodologias distintas para a liberao dos antgenos de Pythium

insidiosum que modificam a resposta imune dos animais infectados. Um mtodo

utilizado foi o de sonicao das hifas cultivadas em caldo Sabouraud, com auxlio de

disrruptor ultra snico de clulas (MILLER, 1981; MENDOZA et al., 2003); outro

mtodo foi a utilizao das protenas solveis retiradas de filtrado da massa micelial

(MENDOZA et al., 1992a) e um terceiro mtodo com a macerao ou liquidificao das

hifas sob cultivo em caldo Sabouraud, seguida de extrao dos antgenos atravs de ter

sulfrico, filtragem do produto macerado e secagem por liofilizao (MONTEIRO

1999). A inovao positiva em relao aos protocolos de vacinas de Miller (1981) e

Mendoza (1992a), est em que os produtos testados neste experimento foram

liofilizados, ficando os imunoterpicos com prazo de validade acima de 1 ano, alm do

processo de liberao de imunognicos ocorrerem a partir da massa micelial macerada

ou liquidificada. Normalmente, a produo de um imunoterpico requer a mais segura e

correta identificao do agente imunognico. Neste caso do imunoterpico, produzido

no LAPEMI/UFSM, tem-se a certeza absoluta de que nos processos de fabricao foi

52

utilizadado um isolado de P. insidiosum a partir de um potro com pitiose clnica no

municpio de Jaguari, RS. A cultura utilizada teve sua identificao confirmada deste

isolado no Centrabraalbureau voor Schimmelcultures - CBS da Holanda, recebendo o

registro CBS 101555 (anexo 1). Recentemente Shurko et al., (2003), utilizaram este

isolado CBS 101555 para estudar as diferenas moleculares entre cepas de P.

insidiosum originrias da sia, Austrlia e Amricas. O isolado em CBS 101555

mostrou, nesta publicao, o mesmo perfil molecular de isolados de eqinos da Costa

Rica e Estados Unidos.

De acordo com Miller (1981) o mecanismo de ao dos imunoterpicos contra

pitiose estaria baseado na exposio de antgenos estimulantes de resposta a base de

anticorpos solveis e complemento que, na infeco ativa, normalmente no seriam

expressos. Conforme este autor, a infeco natural pelo oomiceto P. insidiosum,

induziria o hospedeiro a engendrar uma resposta macia mobilizao de eosinfilos ,

provocando, ento, a formao de kunkers. Os kunkers so uma capa esinofilica

que protege as hifas do ataque da imunidade celular e impedindo a regresso da

estrutura granulomatosa. As afirmativas de Miller (1981) foram confirmadas, de

maneira detalhada por Mendoza et al. (2003), onde estes autores afirmam que a resposta

alternativa doena pelo imunoterpico seria o estmulo produo de linfcitos T

auxiliares do tipo 1 (Th1), mobilizadores de clulas mononucleares da resposta imune,

principalmente macrfagos, linfcitos alm da substncia interleucina 2 (IL2), em vez

da resposta clssica do organismo animal infeco natural ao Pythium, composta por

linfcitos T auxiliares tipo 2 (Th2) com a mobilizao de eosinfilos e mastcitos,

induzindo somente ao desenvolvimento de kunkers. Esta afirmativa foi confirmada na

histopatologia das leses dos coelhos inoculados com Pythium insidiosum, neste

trabalho. Nos grupos 3 e 4 (os coelhos em processo de cura que recebiam imunoterpico

misto e macerado, respectivamente) foram detectados junto ao foco de necrose a

presena macia de macrfagos, linfcitos, clulas plasmticas, clulas gigantes e

escassos eosinfilos. A resposta imune eficiente ao ataque de fungos e oomicetos

realmente atravs de linfcitos T auxiliares, estimulados principalmente por antgenos

oriundos de epitopos da membrana fngica. Quem deu passo importante no

esclarecimento destes mecanismos imunolgicos que corrobora os dados da frase

anterior, foram Pinto et al. (2000) que permitiram a fabricao de vacina contra o fungo

Paracoccidioides brasiliensis ao trabalharem com paracoccidioidomicose murina. Estes

53

autores descobriram a existncia, na membrana do Paracoccidioides brasiliensis, de

uma protena antignica denominada GP 43, que realmente induz resposta imune

consistente contra a paracoccidioidomicose.

Por outro lado, ao se observar a tabela 2 ficam dois questionamentos, pois os dados

de eficincia dos imunoterpicos em eqinos apresentados por Miller (1981) e Mendoza

et al. (1992a) e Mendoza et al. (2003) em ces , no foram satisfatrios. E que os dados

em eqinos vacinados com imunoterpico contra Pythium, avaliados por Monteiro

(1999), foram satisfatrios com 83% de cura. Primeira pergunta: Se o imunoterpico

realmente modifica a resposta imune, conforme a hiptese de Mendoza et al. (2003),

porque os ndices de cura foram to baixos? Segunda pergunta: Porque o imunoterpico

desenvolvido no LAPEMI e testado por Monteiro (1999) foi muito mais eficaz que os

demais?

A resposta para estas perguntas est no experimento agora mostrado nesta tese, ou

seja, o experimento que avaliou 3 processos diferentes de exposio dos antgenos

mostrou de forma inequvoca que a raiz do problema est no processo de sonicao que

desnatura os antgenos citoplasmtico que iro provocar uma modificao na resposta

imune do animal. Isto confirma os resultados de baixa eficincia do imunoterpico

desenvolvido por Miller et al. (1981) onde foram liberados os antgenos atravs de

sonicao. O imungeno desenvolvido por Mendoza et al. (1992a), no mostrou

eficincia devido a sua constituio a base de antgenos solveis diludos no meio de

cultivo. Conforme ficou demonstrado por Pinto et al. (2000), os antgenos que induzem

proteo esto na membrana e no citoplasma, necessitando, ento, que as hifas sejam

rompidas e os antgenos separados. Os processos de sonicao podem, devido a sua

elevada freqncia snica, provocar a desnaturao de protenas de P. insidiosum e,

entre elas, os antgenos que provocam a resposta diferenciada (PAL et al. 2001). Isto

pode explicar o melhor desempenho do IMT PitiumVac, produzido no LAPEMI/UFSM.

Nos nossos protocolos de imunoterapia ainda no sabemos quais os antgenos

especficos que induziria uma resposta efetiva, pois a constatao de que 3 antgenos

dominantes seriam a fonte de proteo ainda pouco consistente; mas, em razo dos

resultados ruins do grupo 2 (coelhos que receberam imunoterpico sonicado), eles

seriam desnaturados pelo uso da sonicao. No entanto, quando o miclio foi inativado

com ter sulfrico e macerado atravs de liquidificao, no houve desnaturao de

antgenos , como indicam os resultados dos grupos 3 e 4 , onde o grupo 4, aps 8 doses

54

com intervalo de 14 dias entre aplicaes, (coelhos que receberam o imunoterpico

macerado ou liquidificado) este grupo 4, mostrou-se mais eficiente em controlar a

infeco dos coelhos. Resultados semelhantes, em relao eficincia da vacina

liquidificada, foram encontrados por Pal et al. (2001) ao utilizarem protocolos com

vacinas sonicadas e maceradas em camondongos a partir de protenas de membrana de

Chlamydia trachomatis. O processo de liquidificao resulta num IMT que tem

mostrado efetividade em outros testes desenvolvidos, principalmente em eqinos

naturalmente infectados por Pythium insidiosum, com leses de qualquer tamanho ou

idade (OBSERVAO PESSOAL).

Quadro de semelhante eficincia se repetiu nos coelhos deste experimento, mesmo

sem a presena de kunkers. As mesmas leses foram tambm encontradas por Miller

e Campbell (1983). Isto permite confirmar que os coelhos se constituem em bons

modelos para estudo da pitiose. Ademais, ainda no se conseguiu a doena experimental

em eqinos ou qualquer outro animal, com exceo de coelhos.

Por outro lado, a importante publicao de Shurko et al., no ano de 2003, levanta

um novo questionamento sobre a etiologia da pitiose em diferentes continentes. Ficaram

demonstradas as diferenas genticas entre os isolados de P. insidiosum, ou seja, as

grandes diferenas entre os isolados inferem a uma concluso de que, no mnimo,

possam existir algumas variedades ou sub-espcies de P. insidiosum; e no seria

demasiado afirmar que existam outras espcies de Pythium produzindo o quadro clnico

da pitiose em animais e humanos nos diversos continentes.

Os dados gerados nesta tese podem inferir que, no futuro, novas perspectivas se

abrem para o estudo da pitiose e seu controle. Pode-se destacar que o aperfeioamento

da imunoterapia com o uso de uma padronizao de procedimentos em sua produo, ou

seja, ruptura das hifas de P. insidiosum cultivadas, atravs de macerao por

liquidificao e posterior precipitao das protenas com ter sulfrico, seguida de

liofilizao, so os primeiros passos que sedimentam a busca de novas perspectivas. O

nosso plano de pesquisa almeja que, nos anos futuros, ocorra a descoberta dos antgenos

especficos que realmente induzam resposta imune diferenciada, onde a cura ocorra

em no mnimo 95% dos animais doentes e submetidos imunoterapia. Outro objetivo

que ser buscado o aperfeioamento dos estudos sobre a resposta imune dos animais

com pitiose clnica. Deste entendimento vir, com certeza, a produo de uma vacina e

no apenas de um imunoterpico, que capacitar os animais para uma proteo

preventiva da doena por um determinado perodo de tempo.

55

CONCLUSES:

1. Dentre os processos de produo de imunoterpicos contra a pitiose equina, o nico

realmente eficiente foi o macerado, onde houve uma diminuio da rea das leses em

71,8% (P

56

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