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DANIELA FERREIRA DOMINGOS
PROSPECÇÃO DE BIOSSURFACTANTES A PARTIR DE MICROBIOTA DE MANGUEZAIS
PROSPECTION OF BIOSURFACTANT FROM MANGROVE MICROBIOTA
CAMPINAS
2014
ii
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Tese apresentada ao Instituto de Biologia da
Universidade Estadual de Campinas para a
obtenção do título de Doutora em Genética e
Biologia Molecular na Área de GENÉTICA DE
MICROORGANISMOS.
Thesis presented to the Institute of Biology of the
University of Campinas in partial fulfillment of the
requirements for the degree of Doctor in Genetics
and Molecular Biology the area of GENETICS OF
MICROORGANIMS.
PROSPECTION OF BIOSURFACTANT FROM MANGROVE MICROBIOTA
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ABSTRACT
Mangrove is an environment rich in microbial diversity, but little has been reported about it in Brazil,
making the knoledge and exploitation of new microorganisms in mangroves an imperative issue. The
prospection of microbial diversity in underexplored environments, such as mangroves, increses
possibility of success in looking for new bioactive molecules, contributing to a more sustentable
economy and environment. Although the cultivation techniques have been improved, allowing an
increased number of yet uncultivated microorganisms to be able recuperated in vitro, our knowledge
about their ecology is still insufficient to cultivate the marjority of them. Therefore, the metagenomic
library have emerged as a powerful tool to more widely access the overall microbial diversity in an
environment, enabling the functional analyses of genes and the discovery of new bioactive compounds,
mainly uncultured-microorganisms. The aim of the current work was the prospection of biosurfactant
from mangrove microbiota through a polifasica approach. For the independent-cultivation approach, a
metagenomic library of high molecular weight was constructed from mangrove sediment contaminated
with oil. The clones were subjected to functional and molecular screening to identify biosurfactant
activity. Three clones with the potential to procuce biosurfactant were selected, and the fosmid
sequencing for genetic chatacterization of the insert was carried out. Although the clones showed the
ability to reduce the surface tension, genes that may involved in biosurfactant synthesis were not
identified. The results showed that using the functional metagenomic to explore metabolic pathways of
microbial communities can have great limitation when in the prospection of biosurctants when the
operon are larger then 30-40 kb and the genome of wild bacteria contains sparse regulation elements.
For the dependent-cultivation approach, two strains that produce biosurfactant were selected: Bacillus
safensis CCMA-560 and Gordonia sp. CCMA-559. They were isolated and tested in previous study. The
biosurfactant production was opmized through the Placktt-Burman design and the Central Composite
Design. The pumilacidin produced by B. safensis CCMA-560 was chemically characterized, and the
metabolic pathway that is responsible for its production was genetically characterized. This work was
the first report the physiologic, genetic, and chemical analysis on the biosurfactant production by the B.
safensis strain.
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RESUMO
O manguezal é um ambiente rico em diversidade microbiana, entretanto existem poucos estudos sobre
esse tema no Brasil, tornando imperativo o conhecimento e a exploração de novos micro-organismos e
seus metabólitos neste ecossistema. A prospecção da diversidade microbiana em ambientes pouco
explorados, como os manguezais, potencializa as chances de sucesso na busca por novas moléculas
bioativas, contribuindo para o desenvolvimento econômico e ambiental mais sustentável. Entretanto,
sabemos que embora as técnicas de cultivo tenham sido aprimoradas e tenham permitido a
recuperação in vitro de um número crescente de micro-organismos ainda não cultivados, nosso
conhecimento sobre sua ecologia permanece insuficiente para cultivar a maioria deles. Neste contexto,
as bibliotecas metagenômicas surgem como uma ferramenta poderosa para acessar de maneira mais
abrangente a diversidade microbiana total em um dado ambiente, permitindo a análise e exploração de
genes funcionais de membros da microbiota, principalmente de micro-organismos não-cultivados, e a
descoberta de novos compostos bioativos. O objetivo geral desse trabalho foi a prospecção de
biossurfactantes a partir de microbiota de manguezal utilizando uma abordagem polifásica. Para a
abordagem independente-de-cultivo, foi construída uma biblioteca metagenômica de alto peso
molecular a partir de sedimento de manguezal contaminado com petróleo. Os clones obtidos foram
submetidos à triagem funcional e molecular para compostos com atividade biossurfactante. Três clones
potencialmente produtores foram selecionados e submetidos ao sequenciamento fosmidial para a
caracterização gênica dos insertos. Embora os clones apresentassem uma redução na tensão superficial,
não foram identificados genes que pudessem estar envolvidos na síntese de algum biossurfactante. Os
resultados obtidos revelaram que o uso da metagenômica funcional para a exploração metabólica de
uma comunidade microbiana pode oferecer grandes limitações quando se trata de prospecção de
biossurfactantes, cujos operons são muitas vezes maiores que 30-40 kb e podem conter elementos de
regulação esparsos no genoma da bactéria selvagem. Na abordagem dependente-de-cultivo, foram
selecionadas duas linhagens produtoras de biossurfactantes, Bacillus safensis CCMA-560 e Gordonia sp.
CCMA-559, isoladas e testadas em estudo prévio. Através de planejamento experimental do tipo
Plackett-Burman e Delineamento Composto Central Rotacional foi otimizada a produção do
biossurfactante por essas linhagens. A pumolicidina produzida pelo B. safensis CCMA-560 foi
caracterizada quimicamente, bem como a via metabólica responsável por sua produção. Este foi o
primeiro trabalho a reportar a análise fisiológica, genética e química da produção de biossurfactante por
representantes da espécie B. safensis.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO………………………………………………………………………………………………………………………. 1
2. REVISÃO DA LITERATURA…………………………………………………………………………………………………….. 3
2.1. Importância ecológica do mangue…………………………………………………………………………………….. 3
2.2. Os biossurfactantes…………………………………………………………………………………………………………… 6
2.3. Aplicação industrial dos biossurfactantes…………………………………………………………………………. 10
2.3.1. Aplicação dos biossurfactantes em indústria de petróleo................................................ 11
2.4. Metagenômica aplicada à Microbiologia............................................................................... 14
2.5. Referências Bibliográficas...................................................................................................... 16
3. APRESENTAÇÃO DA TESE........................................................................................................ 21
CAPÍTULO 1 – Prospecção de biossurfactantes em biblioteca metagenômica de sedimento de
manguezal.................................................................................................................................. 23
1. Introdução......................................................................................................................... 24
2. Objetivos............................................................................................................................ 25
3. Material e métodos............................................................................................................ 25
3.1. Coleta do sedimento de manguezal.................................................................................... 25
3.2. Extração de DNA de alto peso molecular de sedimento de manguezal.............................. 26
3.2.1. Extração pelo kit PowerSoil® DNA Isolation (MoBio Laboratories, Inc.)........................ 26
3.2.2. Extração pelo kit PowerMax® Soil DNA Isolation (MoBio Laboratories, Inc.)................ 26
3.2.3. Extração pelo método CTAB-SDS................................................................................... 27
3.2.4. Extração por Freeze-Thaw............................................................................................. 27
3.3 Eletroforese.......................................................................................................................... 28
3.4. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)………………………………………………………………………….. 28
3.5. PRC do gene RNAr 16S......................................................................................................... 28
3.6. Construção da biblioteca metagenômica de sedimento do mangue.................................. 29
3.6.1. Seleção de fragmentos de DNA de alto peso molecular................................................ 29
3.6.2. Purificação dos fragmentos de DNA de alto peso molecular......................................... 29
3.6.3. Reação de End-Repair.................................................................................................... 30
3.6.4. Reação de ligação.......................................................................................................... 30
3.6.5. Empacotamento............................................................................................................. 30
3.6.6. Transfecção.................................................................................................................... 31
xii
3.6.7. Validação da biblioteca metagenômica......................................................................... 31
3.6.8. Preservação dos clones.................................................................................................. 32
3.7. Screening funcional dos clones........................................................................................... 32
3.7.1. Colapso da gota............................................................................................................. 32
3.7.2. Colapso da gota modificado.......................................................................................... 33
3.7.3. Tensiometria.................................................................................................................. 33
3.8. Screening molecular dos clones.......................................................................................... 35
3.9. Sequenciamento dos fosmídios.......................................................................................... 37
3.9.1. Extração do DNA fosmidial............................................................................................ 37
3.7.2. Sequenciamento plea tecnologia do Ion-Torrent........................................................... 37
3.9.3. Assembling das sequências............................................................................................ 37
3.9.4. Fechamento dos gaps.................................................................................................... 38
3.9.5. Anotação dos genes....................................................................................................... 38
4. Resultados e Discussão..................................................................................................... 38
4.1. Construção da biblioteca metagenômica............................................................................ 38
4.2. Screening funcional............................................................................................................. 41
4.2.1. Colapso da gota............................................................................................................. 41
4.2.2. Tensiomentria................................................................................................................ 43
4.3. Screening molecular............................................................................................................ 49
4.4. Sequenciamento dos fosmídios.......................................................................................... 49
4.4.1. Montagem das sequências............................................................................................ 50
4.4.2. Características gerais dos fosmídios.............................................................................. 54
4.4.3. Anotação dos fosmídios................................................................................................. 57
4.4.3.1. Anotação do fosmídio A6........................................................................................ 57
4.4.3.2. Anotação do fosmídio F10....................................................................................... 63
4.4.3.3. Anotação do fosmídio H5........................................................................................ 70
5. Conclusões......................................................................................................................... 74
6. Referências Bibliográficas................................................................................................... 75
CAPÍTULO 2 - Planejamento experimental e otimização da produção de biossurfactantes nas
linhagens Gordonia sp. CCMA-559 e Bacillus safensis CCMA-560 isoladas de manguezal
contaminado com petróleo........................................................................................................ 79
1. Introdução......................................................................................................................... 80
xiii
2. Objetivos............................................................................................................................ 81
3. Material e Métodos............................................................................................................ 81
3.1. Linhagens bacterianas......................................................................................................... 82
3.2. Teste de emulsificação........................................................................................................ 82
3.3. Avaliação da produção de biossurfactantes........................................................................ 83
3.3.1. Seleção de variáveis utilizando o planejamento experimental do tipo Plackett–
Burman (P&B) no processo de produção de biossurfactantes........................................................... 83
3.4. Otimização da produção de biossurfactante por meio do planejamento experimental do
tipo DCCR........................................................................................................................................... 85
3.4.1. Bacillus safensis CCMA-560........................................................................................... 86
3.4.2. Validação e cinética....................................................................................................... 87
3.4.3. Gordonia sp. CCMA-559................................................................................................ 88
3.4.4. Validação e cinética....................................................................................................... 89
4. Resultados e Discussão................................................................................................. 90
4.1. Teste de Emulsificação........................................................................................................ 91
4.2. Avaliação da produção de biossurfactante......................................................................... 92
4.2.1. Planejamento do tipo Plackett-Burman (P&B) .............................................................. 92
4.2.2. Bacillus safensis CCMA-560........................................................................................... 92
4.3. P&B de Gordonia sp. CCMA-559....................................................................................... 97
4.3.1. Otimização da produção de biossurfactante por meio do planejamento experimental
DCCR de Gordonia sp. CCMA-559...................................................................................................... 98
5. Conclusões................................................................................................................... 102
6. Referências Bibliográficas............................................................................................. 102
CAPÍTULO 3 - Draft Genome Sequence of the Biosurfactant-Producing Bacterium Gordonia
amicalis Strain CCMA-559, Isolated from Petroleum-Impacted Sediment.................................. 105
CAPÍTULO 4 - Draft Genome Genome Sequence of Bacillus pumilus CCMA-560, Isolated from
an Oil-Contaminated Oil Swamp............................................................................................ 109
CAPÍTULO 5 - Genomic and chemical insights into biosurfactant production by the mangrove-
derived strain Bacillus safensis CCMA 560.................................................................................. 111
4. DISCUSSÃO GERAL.................................................................................................................. 151
5. CONCLUSÃO GERAL................................................................................................................ 159
6. PERSPECTIVAS FUTURAS......................................................................................................... 161
xiv
7. ANEXOS.................................................................................................................................. 163
xv
“It is not the strongest of the species that survives,
Nor the most intelligent that survives.
It is the one that is the most adaptable to change.”
(Charles Darwin)
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xvii
Aos meus queridos pais Márcio e Rose, que me fizeram estudar por acreditarem que a única herança que os
pais realmente podem deixar aos seus filhos é a moral e os estudos.
Ao meu marido Felipe pelo apoio incondicional em todos os momentos, principalmente nos de incertezas,
muito comum em quem trilha novos caminhos.
Dedico...
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xix
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Dra. Valéria Maia de Oliveira,
Pela dedicação, paciência e competência científica com que orientou ao longo desses anos, e também
por contribuir para o meu crescimento profissional e pela confiança depositada no meu trabalho.
Ao meu co-orientador Dr. Itamar Soares de Melo,
Por confiar em meu trabalho e as palavras de apoio.
Ao meu supervisor Dr. David J. Midgley,
Pela recepção, hospitalidade no CSIRO e incansável disposição em me apresentar à bioinformática.
À toda equipe do Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation (CSIRO – Animal, Food
and Health Sciences, Sydney – Austrália) – Phil Hendry, Nai Tran-Din, Wang Han, Dongmei Li e Carly
Rosewarne,
Pelos ensinamentos, infra-estrutura e os agradáveis momentos no laboratório.
À Profa. Dra. Vânia de Melo,
Por participar da minha qualificação com sugestões que foram fundamentais na continuidade deste
trabalho.
À Dra. Andréia Fonseca de Faria,
Por ajudar nas análises químicas e discussão deste trabalho.
À Profa. Dra. Suzan Pantaroto Vasconcellos,
Pela paciência e disposição em responder meus infinitos emails de dúvidas e perguntas sobre técnicas. E
também pela amizade adquirida ao longo desses anos.
À Profa. Dra. Rafaella Bonugli-Santos,
Pelo auxílio nas análises de planejamento experimental e discussão deste trabalho.
À Profa. Dra. Cynthia Canedo da Silva,
Por ensinar as técnicas de construção de bibliotecas metagenômicas.
A todos os membros da minha qualificação, pré-banca e banca,
Pela disponibilidade em participar de cada etapa e pelas críticas e sugestões.
Aos técnicos Milena, Éricka, Viviane e Túlio,
Pelos ensinamentos e amizade.
À minha companheira dos biossurfactantes Bruna M. Dellagnezze,
Pela colaboração nos meus experimentos e pela amizade ao longo desses anos.
xx
À minha querida companheira de mangue e metagenômica Júlia R. Ottoni,
Pelos incontáveis favores, colaboração no meu trabalho, companheirismo no laboratório e amizade ao
longo dos quatro anos de trabalho.
À minha querida amiga Samantha,
Pela amizade construída nos quatro anos trabalhando juntas, os almoços, momentos de descontração e
desabafos.
À toda equipe DRM,
Pelos momentos de descontração, amizade e companheirismo nesses anos trabalhando juntos.
Aos meus queridos e amados pais Márcio e Rose,
Pelo amor infinito, apoio incondicional, por serem os meus verdadeiros mestres. Me ensinaram as
coisas mais simples, porém não menos importantes, que é o caráter, responsabilidade e força de
vontade para correr atrás dos meus objetivos.
Ao meu marido, amigo e companheiro Felipe,
Por estar sempre ao meu lado, por ter paciência e saber lidar com uma esposa doutoranda.
À minha querida vózinha Tereza,
Pelas orações.
À toda a minha família,
Pelo apoio e palavras de incentivo.
À minha família australiana, Lyn e Emily,
Que me receberam tão bem em sua casa durante a minha estadia na Austrália.
À FAPESP,
Pela concessão da bolsa de doutorado.
Ao CPQBA,
Pela infa-estrutura.
À Deus,
Pela fé que tenho nele.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, colaboraram para que esse trabalho fosse concluído.
1
1. INTRODUÇÃO
A contaminação do solo e da água por petróleo e derivados é um problema de âmbito mundial.
Nesse sentido, micro-organismos capazes de degradar hidrocarbonetos e, portanto, adaptados ao
crescimento em ambientes contendo óleo, têm um importante papel no tratamento biológico desse
tipo de poluição. Muitos desses micro-organismos produzem, através de suas vias metabólicas,
biossurfactantes de natureza química diversificada e dos mais variados tamanhos moleculares. Algumas
bactérias se destacam como eficientes produtoras de biossurfactantes, dentre elas estão Bacillus spp.
(Cooper & Goldenberg, 1987), Halomonas spp. (Martínez-Checa et al. 2001), Volcaniella eurihalina
(Calvo et al. 2002), Pseudomonas spp., Corynebacterium spp. e Acinetobacter spp. (Rahman et al.
2002). Portanto, os biossurfactantes de origem microbiana constituem hoje um tópico atual e
importante nas pesquisas de biodegradação de petróleo, e oferecem enorme potencial de aplicação
tecnológica em processos de biorremediação de áreas impactadas e de MEOR (Microbial Enhancement
Oil Recovery), que visa aumentar a recuperação de óleos degradados a partir de reservatórios de
petróleo.
Embora as pesquisas sobre comunidades microbianas e suas funções nos manguezais ainda
sejam escassos, dados recentes levantados da literatura vêm demonstrando a grande diversidade
microbiana presente neste ecossistema, sendo a grande maioria ainda não cultivada (Dias et al. 2009;
Andreote et al. 2009; Taketani et al. 2010), e o potencial do seu arsenal enzimático para exploração na
busca de novos biocatalisadores e metabólitos bioativos a serem empregados em processos industriais e
biotecnológicos econômica e ambientalmente mais sustentáveis (Lin et al. 2007).
Nos últimos anos, várias iniciativas têm sido reportadas em âmbito mundial na tentativa de se
conhecer e explorar metagenomas de ambientes diversos, incluindo ambientes extremos, como
bacterioplâncton da Antártica, drenagem de minas ácidas, lagos salinos e hipersalinos, geizers do Parque
Yellowstone, dentre outros. No Brasil, a bioprospecção genômica microbiana é uma estratégia
inovadora na área de biotecnologia que poderá gerar grande impacto econômico para o setor industrial,
como a indústria farmacêutica, de detergentes, química fina, e até mesmo de biocombustíveis.
Neste contexto, o presente trabalho empregou uma abordagem polifásica, baseada na
investigação de bactérias cultivadas e de clones derivados de bibliotecas metagenômicas, para
2
exploração do vasto potencial biocatalítico de micro-organismos de áreas de manguezais. Este
ecossistema apresenta, em geral, condições de alta salinidade, anóxia, escassez de nutrientes, oscilações
de pH, entre outras condições adversas, e pressupõe a presença de uma microbiota adaptada a crescer
e proliferar sob estas condições, oferecendo assim arsenais enzimáticos únicos e versáteis com grande
potencial em processos e tecnologias sustentáveis, uma tendência global atualmente.
3
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Importância ecológica do manguezal
O manguezal é um sistema ecológico particular que ocorre em zonas litorâneas tropicais. É
localizado em terrenos baixos, planos e em regiões estuarinas, às margens de lagunas ou ao longo de
rios e de canais naturais, em áreas encharcadas, salobras e calmas, com influência das marés; porém,
não atingido pela ação direta das ondas. Nesses locais, a força das marés é branda e a velocidade das
correntes é baixa, favorecendo a intensa deposição de sedimentos finos e de matéria orgânica. A
palavra manguezal vem de mangue, que é a principal vegetação que constitui esse ecossistema. No
Brasil, a vegetação dos manguezais é representada pelos gêneros Rhizophora, Laguncularia e Avicennia.
O gênero Rhizophora compreende o mangue vermelho, R. mangle (Família Rhizophoraceae). O mangue
branco é representado pela Laguncularia racemosa (Família Combretaceae) e o mangue negro é
representado pelas espécies Avicennia germinans e Avicennia shaueriana (Família Verbenaceae)
(Gamero, 2001; Cury, 2002).
O ecossistema de manguezais é amplamente distribuído entre as zonas tropicais e subtropicais,
cobrindo aproximadamente 60 a 75% da linha costeira mundial (Figura 1). Brasil, Indonésia e Austrália
são os países com maior abundância de manguezais. Todos os países latino-americanos, tanto na costa
do oceano Atlântico como no Pacífico, possuem mangues que cobrem uma área total de 40.000 km2
(Holguin & Bashan, 2007).
4
Figura 1. Distribuição mundial do ecossistema de manguezal. (Fonte: http://www.thefishsite.com/articles/612/current-status-
of-south-east-asian-mangrove-ecosystems)
O Brasil é um dos países com maior área de manguezal do mundo, com aproximadamente
20.000 km2, e esse ecossistema é encontrado ao longo de todo o litoral brasileiro, desde o extremo
norte, no Amapá, até o sul de Santa Catarina, na foz do rio Araraguá (Cury, 2002; Holguin & Bashan,
2007). A região da Baixada Santista, no Estado de São Paulo, que compreende os municípios de Bertioga,
Cubatão, Guarujá, Itanhaém, Mongaguá, Peruíbe, Praia Grande, Santos e São Vicente, possui uma das
maiores concentrações de manguezal do estado, correspondendo à área de 125 km2.
Por ser um elo entre os ambientes marinho, terrestre e de água doce, caracteriza-se por um
grande acúmulo de sedimentos e detritos trazidos pelos rios e pelo mar, originando assim um substrato
pouco compactado, alagadiço, rico em matéria orgânica, pouco oxigenado e com salinidade variando de
5 a 30% (Rossi & Mattos, 2002).
Embora o manguezal seja rico em matéria orgânica e altamente produtivo, é um ambiente
pobre em alguns nutrientes, principalmente fósforo e nitrogênio (Alongi 1988; Vázquez et al. 2000;
Holguin & Basham, 2007). Este paradoxo pode ser explicado em função da ciclagem de nutrientes
altamente eficiente que se mantém dentro desse ecossistema, através da qual nutrientes essenciais são
mantidos e novos nutrientes são gerados a partir da decomposição das folhas mortas do mangue.
Evidências sugerem que há uma estreita relação entre micro-organismos-plantas-nutrientes que
funciona como um mecanismo para conservar os nutrientes escassos. Uma alta taxa de suprimento
5
desses nutrientes está relacionada à atividade bacteriana, que em manguezais tropicais e subtropicais
transforma a vegetação morta em fontes de nitrogênio, fósforo e outros nutrientes que podem ser
usados pelas plantas (Bashan & Holguin, 2002). Nesse contexto, as bactérias estão envolvidas em
processos de transformação (como amonificação, nitrificação e denitrificação), assim como são
responsáveis pela maior parte do fluxo de carbono em sedimentos de manguezais tropicais (Holguin et
al. 2001). Nestes, 91% da biomassa microbiana é composta por bactérias e fungos, enquanto algas e
protozoários representam somente 7% e 2%, respectivamente (Alongi, 1988).
Do ponto de vista ecológico, os manguezais apresentam condições propícias para alimentação,
proteção e reprodução de muitas espécies de animais aquáticos, que necessitam dessas áreas para se
reproduzirem durante o seu ciclo biológico e desenvolverem diferentes fases larvais das suas respectivas
proles (Correia, 2005). Por essas características, os manguezais são considerados áreas de preservação
permanente e verdadeiros santuários ecológicos, abrigando a maior biodiversidade em termos de
reprodução de espécies. Mesmo sendo uma Área de Preservação Permanente (Lei 4771 de 15 de
setembro de 1965 do código florestal), os manguezais têm sofrido diversas ações antrópicas, com a
finalidade de exploração econômica, agrícola, de pesca predatória e depósito de lixo, dentre outras. Foi
observado que nos últimos 20 anos, aproximadamente 50% dos manguezais existentes no mundo vêm
sendo destruídos por diversos fatores, como exploração de madeira, cultivo de crustáceos e o
desenvolvimento urbano. Holguin et al. (2007) sugerem que pela taxa anual de destruição os
manguezais desaparecerão em aproximadamente 50 anos. Segundo Oliveira & Ribeiro Netto (1989), no
litoral sudeste, os manguezais ainda existentes são frequentemente atingidos por vazamentos de
petróleo, dejetos, metais pesados, esgotos, depósito de lixo urbano-industrial e desmatamento para a
implantação de indústrias e domicílios. Ainda, os manguezais do estado de São Paulo vêm sofrendo
grande depreciação, sendo alvo de constante pressão sócio-econômica, dentre elas a construção de
aterros para edificação de marinas, condomínios náuticos e loteamentos, e o depósito de dejetos,
esgotos e produtos químicos diversos.
Embora as pesquisas sobre comunidades microbianas e suas funções nos manguezais ainda
sejam escassos, dados recentes levantados da literatura vêm demonstrando a grande diversidade
microbiana presente neste ecossistema, e o potencial do seu arsenal enzimático para exploração na
busca de novos biocatalisadores e metabólitos bioativos a serem empregados em processos industriais e
biotecnológicos economica e ambientalmente mais sustentáveis (Dias et al. 2009; Andreote et al. 2009;
Taketani et al. 2010; Andreote et al. 2012)
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2.2. Os biossurfactantes
Compostos bioativos são metabólitos sintetizados pelas células que apresentam inúmeras
atividades tanto na célula produtora como em organismos alvos. Atualmente, existe um grande
interesse por conhecer novos metabólitos que consigam atender a necessidades básicas, como vencer a
resistência de patógenos aos antibióticos clínicos, superar a resistência de células cancerígenas aos
diversos tratamentos quimioterápicos, assim como desenvolver novos medicamentos capazes de
bloquear a produção de colesterol, osteoporose e doenças respiratórias. Na indústria de papel, de
etanol de segunda geração, na produção de plásticos biodegradáveis, detergentes e emulsificantes, a
obtenção de enzimas com atividades diferenciadas também é uma prioridade (Xu, 2006).
Até hoje, a grande maioria de moléculas utilizadas pelo homem foi descoberta a partir de micro-
organismos do solo e, eventualmente, de plantas e organismos associados (endofíticos) (Anderson &
Wellington, 2001). O conhecimento sobre certos tipos de habitat, como manguezais, é quase nulo.
Estudos iniciais mostram uma população de micro-organismos muito bem adaptada a suas condições
peculiares, mas desconhecida quanto ao seu potencial de produção de compostos bioativos (Andreote
et al. 2012).
Entre os vários metabólitos bioativos produzidos por bactérias, os biossurfactantes e os
bioemulsificantes são de grande importância devido à diversidade estrutural e funcional e aplicações
industriais (Banat et al. 2000; Rodrigues et al. 2006).
Os surfactantes, tanto de origem biológica quanto de origem química, são compostos anfifílicos
que se acumulam na interface, tendo como característica principal a diminuição da tensão superficial e
interfacial. Os emulsificantes pertencem a uma sub-classe dos surfactantes que têm como característica
a emulsificação, ou seja, o processo que agrega estruturas em forma de micelas. Devido a essas
propriedades, os surfactantes estabilizam dispersões de um líquido em outro, como por exemplo,
emulsões óleo-água (Ron & Rosenberg, 2001; van Hamme et al. 2006).
Os micro-organismos são responsáveis pela produção de grande variedade de biossurfactantes,
como glicolipídios, lipopeptídios e lipoproteínas, ácidos graxos, lipídios neutros, fosfolipídios e
biossurfactantes poliméricos. Devido à grande variedade de biosurfactentes produzidos por micro-
organismos, estes compostos foram classificados de acordo com sua composição química, peso
molecular, propriedades fisico-químicas e modo de ação. De maneira mais ampla, os biossurfactantes
são divididos em duas classes: os de baixo peso molecular e os de alto peso molecular (Rosenberg &
Ron, 1999; Pacwa-Plociniczak et al. 2011), descritos abaixo.
7
Biossurfactantes de baixo peso molecular
Os biossurfactantes de baixo peso molecular são geralmente os glicolipídios, fosfolipídios e os
lipopeptídios. A característica principal dessa classe de surfactantes é que eles são extremamente
eficientes na redução da tensão superficial, entretanto não são bons emulsificantes.
Dentre os glicolipídios, o ramnolipídio é amplamente estudado. Ele é comumente produzido por
Pseudomonas aeruginosa e composto por uma ou duas unidades de ramnose ligadas por uma ou duas
caudas de ácido hidroxidodecanóico, sendo que o tamanho dessa cauda pode variar de 8 a 16 carbonos.
A bactéria Burkholderia plantarii também é conhecida por produzir um ramnolipídio incomum,
contendo três caudas de ácido hidroxidodecanóico (Hörmann et al. 2010). Os ramnolipídios são
eficientes na na redução da tensão superficial, e confere vantagem ao micro-organismo uma vez que
possuem uma ampla atividade antimicrobiana (van Delden et al. 1998).
Outro grupo bastante estudado dentro da classe dos biossurfactantes de baixo peso molecular
são os lipopeptídios, tendo como principal representante a surfactina, embora a itaurina e a liquesina
também façam parte dessa classe. Esses compostos são produzidos por espécies de Bacillus como
metabólito secundário através da via não-ribossomal (NRPS). A biossíntese desses compostos envolve
um complexo multienzimático conhecido por peptídio sintase. A surfactina é o biossurfactante mais
estudado dessa classe. É um lipopeptídio cíclico com uma cadeia fechada e uma cauda de ácido graxo
produzido por Bacillus subtilis e tem sido reportado como o biossurfactante mais eficiente descrito até
hoje (Nakano et al. 1992).
Biossurfactantes de alto peso molecular
Os surfactantes de alto peso molecular são produzidos por grande número de espécies
bacterianas e são compostos de polissacarídios, proteínas, lipopolissacarídios, lipoproteínas ou uma
mistura complexa desses biopolímeros. Essa classe de biossurfactantes não é tão efetiva na redução da
tensão supercial, mas são muito eficientes na estabilização de emulsões. Esses bioemulsificantes
apresentam uma considerável especificidade por determinados substratos. Por exemplo, alguns
emulsificam eficientemente hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, entretanto não emulsificam
compostos alifáticos puros, em outros casos, pode acontecer a emulsificação apenas de
hidrocarbonetos de alto peso molecular (Ron & Rosenberg, 1999).
Nesse grupo, os bioemulsans produzidos por diferentes espécies de Acinetobacter são os mais
estudados. Dentre eles, está o emulsan que é produzido por A. calcoaceticus RAG-1, que é um complexo
8
aniônico de heteropolissacarídio e proteínas. O emulsan é um emulsificante eficaz em baixas
concentrações e possui uma especificidade por substrato – ele não emulsifica hidrocarbonetos alifáticos,
aromáticos ou cíclicos puros, entretanto, ele emulsifica eficientemente hidrocarbonetos com a mistura
de todos os compostos citados anteriormente (Ron & Rosenberg, 2001).
O alasan e o dispersan são bioemulsificantes produzidos por A. radioresistens e A. calcoaceticus
A2 (Navon-Venezia et al. 1995), respectivamente. Ambos são complexos de polissacarídios aniônicos
com massa molecular maior que 50 kDa (Ron & Rosenberg, 2001).
Genes envolvidos na síntese dos biossurfactantes
Embora as técnicas de biologia molecular tenham sido aprimoradas, ainda existem poucos
estudos disponíveis na literatura elucidando as vias metabólicas responsáveis pela síntese de
biossurfactante. O que se sabe é que existe uma enorme variedade funcional e estrutural envolvida
neste processo. Na literatura existem estudos em nível molecular somente de dois biosurfactantes, os
ramnolipídios e as surfactinas (Hsieh et al. 2004; Reis et al. 2011). Ambos são controlados por quorum
sensing, ou seja, um sistema de comunicação bacteriana caracterizado pela secreção de moléculas
sinalizadoras – autoindutores – dentro de uma população bacteriana as quais são responsáveis por
comportamentos coordenados. O quorum sensing é um sistema regulatório encontrado na maioria das
espécies bacterianas que controla diversos fatores e funções biológicas, como virulência, formação de
biofilmes, bioluminescência e conjugação bacteriana (Williams & Camara, 2009).
A síntese de ramnolipídio em Pseudomonas aeruginosa é codificada pelo operon rhIAB (rhlA,
rhlB, rhlR, rhlI) e alguns genes adicionais também são requeridos. Um desses genes é o rhlG (Campos-
Garcia et al. 1998) que é homólogo ao gene fabG que codifica uma proteína transportadora redutase,
necessária na síntese de ácidos graxos. Em P. aeruginosa são produzidos dois principais tipos de
ramnolipídios: o monoramnolipídio, ramnosil-β-hidróxidecanoil-β-hidróxidecanoato (Rha-C10-C10) e o
diramnolipídio, ramnosil-ramnosil-β-hidróxidecanoil-β-hidróxidecanoato (Rha-Rha-C10-C10) (Deziel et al.
2003). A biossíntese do ramnolipídio ocorre através de reações sequenciais catalisadas pela enzima
ramnosiltransferase. Os monoramnolipídios são sintetizados pela ação da ramnosiltransferase-1, a partir
da timidina-difosfo-ramnose agindo como o dador e 3-hidroxi-decanoil-3-hidroxidecanoato agindo como
o receptor. Os diramnolipídios são sintetizados pela ramnosiltransferase-2 a partir de timidina-difosfato-
ramnose e mono-ramnolipídios. A produção desse biossurfactante ocorre durante a fase estácionaria de
crescimento e está relacionada à limitação de nitrogênio para a célula. Estudos revelam que a regulação
dos genes responsáveis pela biossíntese é feita pelo sistema de quorum sensing (Ochsner & Reiser,
9
1995). Existem dois sistemas convencionais de quorum sensing bem elucidados em P. aeruginosa, o las e
o rhl. A sintases LasI e RhlI produzem homoserina lactona do tipo 3OC12-HSL e C4-HSL, respectivamente,
que juntamente com seus reguladores transcripcionais, LasR e RHlR, regulam a transcrição de 5-10% de
todo o genoma da P. aeruginosa (Dekimpe & Deziel, 2009). Um terceiro sistema de quorum sensing é
formado pelo fator transcripcional PqsR, também chamado de MvfR (Cao et al, 2001), que é responsável
por ativar o cluster de genes phnAB e pqsABCDE, ambos requeridos na produção de 4-hidroxi-2-
alquilquinolonas (HAQs) e Pseudomonas quinolona sinal (PQS), esses genes influenciam a produção de
alastase, piocianina, lectina e ramnolipídio (Diziel et al. 2005). A produção de ramnolipídio por P.
aeruginosa tem se mostrado diretamente relacionada com o sistema de quorum sensing regulado pelo
fator transcripcional RhlR. O RhlR age como um ativador do sistema rhlAB quando forma um complexo
com C4-HSL e como repressor na ausência de um autoindutor. O gene rhlR é conhecido por ter quatro
diferentes formas de transcrição (Medina et al, 2003a, Medina et al, 2003b). Em condições favoráveis,
ou seja, em meio rico, a expressão do RhlR é dependente do LasR; entretanto, em condições de
limitação de fosfato, a expressão do RhlR é regulada por múltiplos promotores através de diferentes
ativadores transcripcionais, incluindo VfR, RhlR e o fator sigma σ54 (Jensen et al. 2006). Além disso, nos
últimos anos têm sido relatados outros sistemas de quorum sensing que influenciam direta ou
indiretamente a produção de biossurfactantes (Reis et al. 2011).
Em Bacillus subtilis a síntese de surfactina é regulada pelo operon SrfA, este com
aproximadamente 25 kb. A biossíntese da surfactina também está diretamente relacionada ao quorum
sensing. O operon SrfA é composto pelos genes srfAA, srfAB, srfAC e srfAD. O gene srfAA exerce uma
função importante na biossíntese da surfactina, essa região do operon serve como template para
enzima, enquanto o gene sfp localizado na região downstream do operon srfA codifica a enzima 4’-
fosfopantoteinil transferase. Essa região contem o promotor srfA e duas ORFs, srfAA e srfAB, que
codificam as enzimas surfactina sintase I e II (Tsuge et al. 2001; Hsieh et al. 2004). A srfAA codifica três
aminoácidos com sítio ativo para Glu, Val e Leu, enquanto o srfAB sintetiza peptídios contendo domínios
ativos em Val, Asp e D-Leu. O gene srfC contem região ativa para Leu e codifica a enzima tioesterase do
tipo I que é responsável pela modificação terminal do peptídio. O terceiro locus dentro do operon srfA
corresponde ao gene srfAB que é requerido para a síntese da surfactina. O gene srfB também é
necessário para a expressão do srfA-lacZ e ele regula positivamente o operon srfA (Nakano & Zuber
1989; D’Souza et al. 1993). A biossíntese da surfactina é dependente dos níveis de transcrição do ComA
(SrfAB), que em seguida é estimulada por SrfD e inicia do processo de síntese da surfactina. Entretanto,
o mecanismo de liberação da surfactina no meio ainda é desconhecido. Existe uma suposição que pode
10
ocorrer uma difusão passiva da surfactina através da membrana da célula. Uma vez que a densidade
celular atinge um nível alto, a proteína ComX que está acumulada no meio interage com as ligações de
histidina quinase (ComP) e ComA age como regulador de resposta. Além disso, após a fosforilação de
ComP, este fornece uma molécula de fosfato para a proteína ComA que então se liga ao promotor de
srfA e a transcrição é iniciada (Nakano & Zuber 1989; Steller et al. 2004). O fator estimulante de
competência (CSF) também é um peptídio sinal que influencia a expressão de srf. O CSF é transportado
através da membrana e interage com pelo menos dois diferentes receptores intracelulares, dependendo
de sua concentração. Além de todas as proteínas, ComR e SinR também estão envolvidas na expressão
de sfrA (Cosmina et al. 1993; D’Souza et al. 1993).
Os biossurfactantes poliméricos de alto peso molecular são mais complexos do que os de baixo
peso molecular. A síntese desses heteropolissacarídeos requer um grande número de genes e sua
organização genética torna-se mais complexa do que os outros tipos. O bioemulsificante desta categoria
mais bem estudado é um tipo produzido por Acinetobacter calcoaceticus BD4. Os genes responsáveis
pela produção deste estão organizados em um conjunto de genes com tamanho em torno de 60 kb e a
biossíntese do EPS é mediada por proteínas do tipo Ptk (proteína tirosina quinase) (Ron & Rosenberg,
2001).
2.3. Aplicação industrial dos biossurfactantes
Os surfactantes pertencem a uma classe de produtos químicos muito versátil, resultando em
diversas aplicações industriais (Singh et al. 2007; Makkar et al. 2011). Van Bogaert e colaboradores
estimaram que em 2007 a produção mundial de biossurfactante foi em torno de 10 milhões de
toneladas (van Bogaert et al, 2007). No ano de 2000, a produção mundial de surfactantes totalizou entre
17 a 19 milhões de toneladas, com um crescimento previsto entre 3 a 4% por ano. Isso ocorre devido à
crescente demanda em detergentes, setor que utiliza mais de 50% da produção de surfactantes. Entre
os principais setores que utilizam surfactantes estão incluídos os detergentes para uso doméstico,
produtos para uso pessoal (cosméticos, sabonetes, creme dentais), indústrias têxtil e petrolífera.
Os lipopeptídios cíclicos produzidos por espécies de Bacillus são muito utilizados como
antibióticos. Entre eles, o mais importante é a surfactina por sua diversidade e aplicação na indústria de
petróleo. A surfactina produzida por B. subtilis (98% pureza) é vendida pela empresa Sigma-Aldrich a um
valor de aproximadamente 295 dólares um frasco com 10 mg. Os ramnolipídios produzidos por P.
aeruginosa são comercializados pela empresa Jeneil Biotech Inc., EUA, e são utilizados principalmente
11
na agricultura como fungicida e como aditivos para melhorar a atividade de biorremediação. Algumas
linhagens bacterianas já estão sendo utilizadas nas indústrias para a produção de biossurfactante, com a
principal finalidade de uso na biorremediação de áreas contaminadas por óleo. Dentre as linhagens
utilizadas estão: P. aeruginosa S2 para a produção de ramnolipídio utilizado em biorremediação (Chen
et al. 2007), B. subtilis ZW-3 para a produção de surfactina com aplicações na indústria farmacêutica,
cosmética, alimentícia, proteção ambiental e recuperação de petróleo (Wang et al. 2008), Micrococcus
luteus BN56 que produz trealose tetraester para ser utilizado em biorremediação (Tuleva et al. 2009),
dentre outras. O aprimoramento nos procedimentos de produção e a tecnologia tem ajudado no
processo de obtenção do biossurfactante (Makkar et al. 2011).
A maioria de todo o surfactante atualmente em uso é produzida quimicamente, sendo derivado
do petróleo. Entretanto, na última década, a produção de surfactantes por micro-organismos tem sido
objeto de muitos estudos. Os surfactantes microbianos apresentam algumas vantagens de obtenção
quando comparados aos surfactantes sintéticos. Dentre elas, podemos citar: grande versatilidade dos
micro-organismos para sintetizar polissacarídeos neutros ou com cargas, com uma grande variedade de
composição e propriedades funcionais, fonte de produção renovável e inesgotável, produção
independente de condições climáticas, possibilidade de utilização de resíduos industriais como matérias-
primas, maior rapidez na obtenção do produto acabado e produção em espaço relativamente pequeno.
Além disso, apresentam maior uniformidade em suas propriedades físico-químicas, devido à
especificidade do micro-organismo utilizado e à possibilidade de um rígido controle dos parâmetros de
cultivo, como pH, temperatura, taxa de aeração, velocidade de agitação, tempo de crescimento do
micro-organismo e composição do meio de cultura. Outro aspecto positivo é a possibilidade de
manipular geneticamente os micro-organismos, produzindo polissacarídeos em maior quantidade e de
melhores propriedades funcionais (Mukherjee et al. 2006; Cameotra & Makkar, 2010).
2.3.1. Aplicação do biossurfactante em indústria de petróleo
Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR)
As tecnologias atuais de recuperação de petróleo recuperam no máximo 40-45% do óleo
presente no reservatório. Em geral, os métodos tradicionais de recuperação envolvem duas etapas: a
recuperação primária, que é o resultado da pressão natural da terra sobre a formação petrolífera, e a
recuperação secundária, que envolve a estimulação de poços de petróleo pela injeção de fluidos, o que
contribui para melhorar o fluxo de petróleo e gás à cabeça do poço (Sen, 2008). No entanto, mesmo
12
com a aplicação da recuperação secundária estima-se que dois terços do óleo residual permaneçam
retidos no reservatório. No intuito de minimizar as perdas econômicas, outras medidas vêm sendo
adotadas para este fim, como a recuperação terciária, a qual inclui o uso de métodos químicos, tais
como injeção de polímeros, surfactantes e fluidos alcalinos, e até mesmo recursos térmicos, como
injeção de vapor ou combustão in situ (Brown, 2010). Quando é feita a injeção de água como fluido, o
processo é chamado water-flooding. A injeção de gás natural, a qual é uma opção dispendiosa, é
chamada de pressure maintenance. Outras técnicas físicas e mecânicas também são utlizadas nese
processo, como a utilização de bombas. Enquanto o processo primário recupera 5-10% de pretróleo, a
eficiência da recuperação secundária é em torno de 10-40%. Com a intenção de melhorar ainda mais a
recuperação do petróleo, algumas tecnologias vêm sendo desenvolvidas e aprimoradas, como a
recuperação avançada utilizando micro-organismos - Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR).
Os pioneiros a estudarem e proporem essa tecnologia foi um grupo de pesquisa americano
conduzido por Claude ZoBell na década de 30. Nas décadas de 60 e 70, muitos países do leste europeu,
como Hungria e Polônia, realizaram ensaios de campo utilizando MEOR, e esses ensaios foram baseados
na injeção de consórcios de bactérias facultativas e anaeróbias, selecionadas com base em sua
capacidade de gerar grandes quantidades de gases, ácidos, solventes, polímeros, surfactantes e
biomassa. Em meados da década de 80, iniciaram muitos estudos de aplicação de MEOR, sendo que
uma infinidade de indústrias petrolíferas começou a utilizar consórcios bacterianos para injeção nos
poços de petróleo. A tecnologia se mostrou muito promissora, mas também se mostrou ineficaz em
alguns casos (Brown, 2010; Volk & Liu, 2010).
Existem três estratégias diferentes para a utilização de MEOR: i) produção do biossurfactante
em reatores e posterior aplicação no reservatório; ii) injeção de micro-organismos exógenos para a
produção de biossurfactante in situ e iii) injeção de nutrientes no reservatório para estimular a
microbiota a produzir biossurfactantes (Singh et al. 2007). O maior obstáculo para implementação da
tecnologia de MEOR no caso da injeção de micro-organismos nos reservatórios tem sido a dificuldade de
isolamento e/ou manipulação genética de micro-organismos que sobrevivam em ambientes extremos,
bem como alta pressão, temperaturas acima de 85°C, pH extremo e alta salinidade (Sen, 2008; Brown,
2010). Pesquisas em engenharia genética já estão sendo realizadas a fim de desenvolver micro-
organismos que sobrevivam e sejam metabolicamente ativos em ambientes extremos, essa tecnologia é
conhecida por Genetically engineered MEOR (GEMEOR) (Sen, 2008). Algumas espécies de Bacilus tem
sido utilizadas para aplicação em reservatório de petróleo, essas linhagens aplicadas isoladamente
13
podem reduzir a viscosidade do petróleo (Bryant, 1990). Entretanto, o processo pode ser mais eficiente
se for realizada a aplicação de um consórcio bacteriano. Esses consórcios podem contribuir para a
recuperação de duas formas: i) crescendo nas rochas do reservatório e produzindo gases,
biossurfactantes, biopolímeros e outros compostos não tóxicos, auxiliando assim a recuperação; e ii)
crescendo nos canais das rochas e aumentando a permeabilidade, favorecendo o processo de
recuperação (Brown, 2010; McInerney et al. 2005). O sucesso do MEOR in situ depende do
desenvolvimento do consórcio microbiano, ou seja, se consegue sobreviver e produzir metabólitos
ativos em ambientes extremos como os reservatórios. Então, as atividades em pesquisa tem focado em
bactérias anaeróbias extremófilas, incluindo halofílicas, barofílicas e termofílicas (Tango & Islam 2002;
Almeida et al. 2004).
Outra forma de MEOR é a injeção de nutrientes no reservatório para estimular a microbiota
endógena à produção de metabótitos de interesse. Alguns reservatórios requerem nutrientes
inorgânicos para o crescimento celular ou como aceptores de elétrons no lugar do oxigênio (Sundae &
Torsvik, 2004). Já foi patenteada a técnica de injeção de água contendo fontes de vitaminas, fosfatos,
nitratos para auxiliar o crescimento das bactérias anaeróbias sendo a principal fonte de carbono o
próprio óleo de reservatório (Sunde, 1992).
O método mais promissor para o MEOR é a utilização do biossurfactante produzido ex situ e
então aplicado no reservatório. Quando a solução entra em contato com as pequenas bolhas de óleo
aprisionadas nos poros das rochas, a tensão interfacial é drasticamente reduzida aumentando a
remoção do óleo por capilaridade. A formação da emulsão óleo em água geralmente aumenta a
eficiência na mobilidade do óleo nas rochas. Os biossurfactantes que apresentam os melhores
resultados na aplicação são os ramnolipídios, soforolipídios, glicolipídios e os lipopeptídios. Em uma
extensa revisão feita por Sen (2008) mostrou que muitos estudos, em escala laboratorial, tem sido
realizados com glicopeptídos produzidos por espécies de Pseudomonas, bem como a surfactina e
liquenisina, os lipopolissacarídios, representados pelo emulsan, tem apresentado resultados
satisfatórios. Mas a surfactina tem apresentado os melhores resultados, ela tem sido produzida em
fermentadores com rigorosos padrões de crescimentos e aplicada com muito sucesso em MEOR (Sen
2008). O bioprocesso desenvolvido para a produção de surfactina é dividido em três etapas: i)
otimização dos fatores nutricionais para o crescimento do micro-organismo; ii) otimização de
parâmetros físicos, incluindo pH, tempetatura e aeração e iii) otimização da concentração de inóculo.
Geralmente os biossurfactantes produzidos ex situ são injetados juntamente com água para facilitar a
14
emulsificação do óleo (Sen 1997, Sen & Swaminathan 1997; Sen & Swaminathan 2004; Sen &
Swaminathan 2005).
Biorremediação
A contaminação causada por atividades industriais, sendo ela acidental ou por liberação de
resíduos tóxicos orgânicos e/ou inorgânicos tem sido um problema de âmbito mundial. Tais
contaminantes causam dificuldades na remediação, uma vez que se ligam às partículas do solo. A
aplicação de biossurfactantes na remediação de compostos ôrganicos, como hidrocarbonetos, tem
como objetivo a aceleração de processos biodegradativos naturais em ambientes contaminados,
melhorando a disponibilidade de materiais (nutrientes e oxigênio), das condições (pH e teor de
umidade), e dos micro-organismos já existentes no ambiente. A aplicação de biossurfactante na
remediação de compostos inorgânicos, como metais pesados, visa quelar e remover ions durante o
processo de lavagem facilitando as intereções de moléculas anfifílicas e os íons de metais.
A biorremediação de petróleo e derivados é realizada por micro-organismos capazes de utilizar
hidrocarbonetos como fonte de energia e de carbono. Esses micro-organismos são ubíquos na natureza
e são capazes de degradar diversos hidrocarbonetos – de cadeia curta ou longa, assim como numerosos
compostos aromáticos, incluindo hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PHAs). Todos esses
compostos possuem uma baixa solubilidade em água e podem estar solubilizados na fase aquosa,
adsorvidos às partículas do solo, adsorvidos na superfície das células ou na fase insolúvel. O
biossurfactante adicionado ao meio pode interagir tanto com as partículas abióticas como com as
células bacterianas. Isso, aliado ao fato de que o primeiro passo na degradação de hidrocarbonetos
implica na atividade de uma oxigenase ligada à membrana, é essencial para que as bactérias entrem em
contato direto com o substrato. A emulsificação é uma estratégia biológica que pode aumentar o
contato entre os micro-organismos e os hidrocarbonetos insolúveis em água. Portanto, bactérias que
crescem em ambientes com petróleo geralmente produzem potentes emulsificantes (Rosenberg, 1993).
2.4. Metagenômica aplicada à Microbiologia
Durante muito tempo a única forma de se estudar os micro-organismos era através do
isolamento de culturas puras, sendo este o primeiro passo para o estudo do metabolismo bacteriano. O
cultivo de bactérias serviu de base para o conhecimento da fisiologia e genética microbiana até meados
da década de 80 (Handelsman, 2004). No entanto, estudos de diversidade microbiana, utilizando
15
técnicas de microscopia e contagem de células, mostraram que métodos tradicionais de isolamento e
cultivo são capazes de recuperar apenas uma pequena fração (1 a 10%) dos micro-organismos presentes
no ambiente (Amman et al. 1995). Isto é decorrente das limitações de técnicas de cultivo, uma vez que é
muito difícil reproduzir em laboratório as condições encontradas no meio ambiente.
Nas últimas décadas, muitas metodologias foram desenvolvidas na área de biologia molecular
(extração de ácidos nucleicos, amplificação por PCR, clonagem e sequenciamento de DNA), superando
limitações impostas pela abordagem clássica de estudo de populações microbianas, evitando o
isolamento e cultivo dos micro-organismos. A utilização destas metodologias vem permitindo uma
mudança drástica na perspectiva da diversidade microbiana no ambiente, com a descoberta de novos
grupos de organismos nunca antes cultivados (Hugenholtz et al., 1998; Rappé & Giovannoni, 2003).
Entretanto, estas metodologias não nos permitem ter acesso ao potencial metabólico destes novos
organismos, uma vez que as etapas de isolamento e cultivo são suprimidas nos estudos.
Porém, o uso dessas metodologias associado à estratégia de construção de bibliotecas
metagenômicas permite o acesso ao potencial metabólico de novos organismos, sendo uma alternativa
viável para a descoberta de novas enzimas e vias metabólicas (Handelsman, 2004).
As bibliotecas metagenômicas permitem ainda combinar o escrutínio de genes funcionais com a
análise de sequências de rRNA 16S, representando um mecanismo valioso no estabelecimento de
relações entre filogenia e função, podendo também ajudar a elucidar o papel ecológico dos
componentes da microbiota no ambiente.
A estratégia de bibliotecas metagenômicas consiste na clonagem de fragmentos grandes de DNA
(40 a 200 kb), que podem corresponder a um operon ou mesmo a uma via metabólica inteira, em
vetores do tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosome), cosmídios ou fosmídios, e transformação da
bactéria hospedeira, geralmente Escherichia coli, com subsequente análise das bibliotecas resultantes
em busca da expressão da atividade biológica de interesse (Rondon et al., 2000; Singh, 2009).
A triagem de bibliotecas metagenômicas pode ser baseada na sequência de DNA ou na análise
da expressão biológica. Esta última estratégia, conhecida por análise funcional, tem a vantagem de
permitir o acesso a genes ainda não conhecidos, oferecendo grande potencial para identificar novas
classes gênicas ou ainda funções não conhecidas. O método de triagem baseado em sequencia de DNA é
mais conservador, uma vez que os oligonucleotídeos (sequências curtas de DNA) necessários para
identificar os genes-alvo, utilizando PCR ou métodos de hibridização, são desenhados com base em
16
regiões conservadas das sequências de aminoácidos de proteínas conhecidas, de maneira a garantir uma
alta probabilidade de pareamento com sequências gênicas desconhecidas presentes no ambiente.
A viabilização das bibliotecas metagenômicas como um método para seleção de novos
compostos de interesse só é possível, no entanto, quando uma abordagem integrada é usada,
combinando metodologias de triagem de alto desempenho (high-throughput) recém-desenvolvidas,
como ensaios enzimáticos miniaturizados (em microplacas) associados a leitores de placa e tecnologia
de hibridização em microarrays de DNA, com sequenciamento em larga escala e a bioinformática. Esta
última envolve o desenvolvimento e o emprego de bases de dados e programas de análise de
sequências de DNA e proteínas para acelerar a análise funcional e comparativa dos genes ou operons
clonados (Oliveira et al., 2006).
Neste contexto, bibliotecas metagenômicas surgem como uma ferramenta poderosa para
acessar de maneira mais abrangente a diversidade microbiana total em um dado ambiente, permitindo
a análise de genes funcionais de membros da microbiota, principalmente de micro-organismos não-
cultivados, e a descoberta de novos produtos naturais. Aliado a isto, a prospecção da diversidade
microbiana em ambientes inóspitos, extremos e/ou pouco explorados, como no caso de manguezais,
potencializa as chances de sucesso na busca por novas moléculas bioativas, contribuindo para o
desenvolvimento industrial e econômico mais sustentável (Lorenz & Eck, 2005).
2.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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21
3. APRESENTAÇÃO DA TESE
Este trabalho empregou uma abordagem polifásica na prospecção de biossurfactantes. A
primeira abordagem foi a independente-de-cultivo, com a construção de uma biblioteca metagenômica
de DNA de alto peso molecular construída a partir de sedimento de manguezal contaminado por
petróleo. A outra abordagem foi a dependente-de-cultivo, prospectando biossurfactantes a partir de
bactérias isoladas da mesma área de manguezal. No Capítulo 1 serão apresentados os resultados da
construção da biblioteca metagenômica, da triagem para biossurfactantes e do sequenciamento dos
fosmídios selecionados. Nesse capítulo também será abordada a dificuldade de extração de DNA de alto
peso molecular a partir do sedimento de manguezal. No Capítulo 2 serão apresentados os resultados
dos ensaios com as melhores linhagens produtoras de biossurfactante. Também será apresentado o
planejamento experimental baseado em análises estatísticas para o melhoramento da produção de
biossurfactantes por essas linhagens. Os Capítulos 3 e 4 descrevem o sequenciamento do genoma das
duas linhagens que foram estudadas mais detalhadamente, os quais foram publicados na revista
Genome Announcement. E o Capítulo 5 apresentará os resultados da caracterização da via metabólica
do biossurfactante produzido pelo Bacillus safensis CCMA-560, bem como a sua caracterização química.
Estes resultados estarão disponíveis em formado de draft do artigo já aceito para publicação na revista
Applied Microbiology and Biotechnology.A seguir, todos os resultados serão discutidos de maneira
integrada no item Discussão Geral, e, finalmente, as Conclusões Gerais e as Perspectivas Futuras serão
apresentadas.
22
23
CAPÍTULO 1 Prospecção de biossurfactantes em biblioteca metagenômica de
sedimento de manguezal
24
1. INTRODUÇÃO
Mais recentemente, com o aumento da consciência ambiental e ênfase em uma sociedade
sustentável em harmonia com o meio ambiente, os surfactantes naturais têm atraído mais a atenção
que os surfactantes químicos. Dentre os surfactantes naturais, aqueles produzidos por micro-
organismos, conhecidos como biossurfactantes, são os mais promissores. Eles são conhecidos por serem
estruturalmente diversos e terem grupos de moléculas tenso-ativas heterogêneas. Considerando a
variedade de aplicações dos biossurfactantes, suas propriedades bioquímicas e fisiológicas têm sido foco
de muitos estudos (Ron & Rosenberg 2001).
Durante muitos anos, a biotecnologia microbiana foi limitada à descoberta de metabólitos ativos
produzidos por micro-organismos cultivados, entretanto estima-se que a fração cultivada da diversidade
microbiana é de 1-10% (Amman et al. 1995). Portanto, a maior fração ainda não foi estudada,
consequentemente os metabólitos ainda não são conhecidos. Com a evolução de técnicas moleculares,
o avanço das plataformas de sequenciamento e as poderosas ferramentas de bioinformática, a
metagenômica oferece uma alternativa para permitir o acesso ao arsenal metabólico, sem que que haja
a necessidade de cultivar o micro-organismo. Como mencionado pela primeira vez, o termo
“metagenômica” refere-se ao conjunto de todos os genomas de uma comunidade microbiana
(Handelsman et al. 1998).
O primeiro passo para a construção de uma biblioteca metagenômica é a obtenção do DNA total
da comunidade microbiana. Esse passo é crucial para a construção da biblioteca, uma vez que a
obtanção de um DNA livre de contaminantes facilita as etapas subsequentes de biologia molecular
(Smalla et al. 1993; Tsai et al. 1992). O tamanho do fragmento do DNA também é importante,
bibliotecas metagenômicas construídas a partir de DNA de alto peso molecular tem mais chance de
conter vias metabólicas completas.
Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi a construção de biblioteca metagenômica de DNA
de alto peso molecular proveniente de sedimento de manguezal contaminado com petróleo e
subsequente triagem de vias metabólicas de biossurfactantes.
25
2. OBJETIVOS
Construção de biblioteca metagenômica de sedimento de manguezal em vetor fosmidial;
Screening molecular e funcional visando a bioprospecção de biossurfactantes;
Sequenciamento dos clones fosmidiais de interesse (positivos nos ensaios de triagem) para
análises de genômica estrutural dos genes que codificam biossurfactantes;
Clonagem dos genes envolvidos na síntese de biossurfactantes em vetores de expressão
apropriados visando à purificação e caracterização química e funcional dos produtos gênicos.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Coleta do sedimento de manguezal
A coleta das amostras foi realizada pela equipe técnica da Embrapa Meio Ambiente, no âmbito
do Projeto “Biodiversidade e Atividades Funcionais de Micro-organismos de Manguezais do Estado de
São Paulo” (Processo FAPESP no 04/13910-6). Amostras de sedimentos foram coletadas de área de
manguezal altamente impactado localizado no município de Bertioga – SP (Figura 2). Foram coletadas
amostras em triplicata, usando tubos de polipropileno esterilizados, os quais foram totalmente
preenchidos com o sedimento para evitar a entrada de ar. As amostras foram imediatamente
congeladas em gelo seco e transportadas ao laboratório para subsequente extração de DNA.
26
Figura 2. Localização do manguezal e esquema de amostragem. A linha vermelha indica o ponto em que a amostra do sedimento foi coletada. (Fonte: Andreote et al. 2012)
3.2. Extração de DNA de alto peso molecular de sedimento de manguezal
Vários protocolos foram testados a fim de padronizar e otimizar a extração de DNA de alto peso
molecular a partir de amostras de sedimento, os quais são descritos abaixo.
3.2.1. Extração pelo kit PowerSoil® DNA Isolation (MoBio Laboratories, Inc.)
A extração de DNA de amostras de sedimento do mangue através do PowerSoil® DNA Isolation
kit foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.
3.2.2. Extração pelo kit PowerMax® Soil DNA Isolation (MoBio Laboratories, Inc.)
A extração de DNA de amostras de sedimento do mangue foi também realizada utilizando o kit
PowerMax® Soil DNA Isolation, de acordo com as instruções do fabricante e modificações sugeridas por
Sommer et al. (2010).
A extração foi realizada de acordo com o fabricante até o passo em que houve a passagem do
DNA pela coluna de purificação. A eluição foi realizada com 7,5 mL de Tris 10 mM pH 8,0. Para a
precipitação do DNA foi utilizado 0,1 volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e dois volumes de etanol
absoluto gelado e, a seguir, a solução foi incubada por duas horas a -20°C. Após a incubação, o material
foi centrifugado a 5.000 rpm por 45 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi eluído
27
em 500 µL de Tris 10 mM pH 8,0. Para que o DNA fosse completamente eluído, os tubos foram
incubados a 65°C por 1 hora.
3.2.3. Extração pelo método CTAB-SDS
O protocolo de extração de DNA de alto peso molecular foi realizado também de acordo com
Ghosh et al. (2010), com modificações. Um grama de sedimento foi misturado a 2,7 mL de tampão de
extração (100 mM Tris-HCl [pH 8,0]; 100 mM Na2EDTA [pH 8,0]; 100 mM Na2HPO4 [pH 8,0]; 1,5 M NaCl;
1% CTAB) e 10 µL de proteinase K (20 mg/mL), e incubado por 30 minutos a 37°C sob agitação de 225
rpm. Feito isso, foram adicionados 300 µL de SDS 20%, e a reação foi incubada novamente por 2 horas a
65°C sob agitação de 50 rpm. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 6.000 rpm por 10 minutos. O
sobrenadante foi transferido para um novo tubo, ao qual foram adicionados 900 µL de tampão de
extração e 100 µL de SDS 20%, seguido de incubação a 65°C por 10 minutos. Após a incubação, os tubos
foram centrifugados a 6.000 rpm por 10 minutos. Esse procedimento foi repetido por duas vezes. Após a
obtenção do sobrenadante, foi adicionado igual volume de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). A
separação das fases foi realizada por centrifugação a 8.000 rpm por 5 minutos. A fase aquosa foi
transferida para um novo tubo e o DNA foi precipitado com 0,6 volume de isopropanol e, a seguir,
incubado overnight em temperatura ambiente. Os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm por 20
minutos e o sobrenadante foi descartado. O pellet foi lavado com 5 mL de etanol 70% e eluído em Tris-
HCl 10 mM pH 8,0.
3.2.4. Extração por Freeze-Thaw
A extração de DNA pelo método Freeze-Thaw foi realizada utilizando uma combinação dos
protocolos descritos por Groβkopf . (1998) e Neria-Gonzáles . (2006), com modificações.
Foi adicionado em um microtubo 0,5 g de sedimento de manguezal, o qual foi lavado duas vezes
com tampão PBS. Feito isso, foram adicionados 600 µL de tampão PBS e lisozima na concentração final
de 17 mg/mL, incubando-se a 37°C por 30 minutos. Posteriormente, foi adicionada à solução proteinase
K na concentração final de 0,7 mg/mL e SDS na concentração final de 2%, seguido de incubação a 60°C
por 30 minutos. Em seguida, foram realizados três ciclos de 2 minutos cada de incubação em nitrogênio
líquido e banho-maria a 65°C. Após a lise mecânica da parede celular pelo ciclo de Freeze-Thaw, foi
realizada a limpeza com igual volume de fenol (pH 8,0) e, posteriormente, a centrifugação a 13.000 rpm
28
por 5 minutos. A fase superior da solução foi transferida para um novo tubo, adicionado de igual volume
de clorofórmio:álcool isolamílico (24:1) e centrifugada a 13.000 rpm por 5 minutos. A fase superior
dessa solução foi novamente transferida para um novo tubo e o DNA foi precipitado com 10% do
volume de NaCl 5 M e com duas vezes o volume de etanol absoluto gelado, e incubado overnight a -
20°C. A solução contendo o DNA precipitado foi centrifugada a 13.000 rpm por 5 minutos e o
sobrenadante foi descartado. O pellet foi lavado duas vezes com etanol 70%, seco e eluído em 50 µL de
água Milli-Q.
3.3. Eletroforese
Para analisar a concentração do DNA obtido, foi realizada a eletroforese em gel de agarose 0,8%
em tampão TEB (Tris-EDTA – Ácido bórico) 1 X corado com brometo de etídio a 0,01%.
3.4. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Para analisar com precisão o tamanho dos fragmentos de DNA previamente extraídos, foi
realizada a Eletroforese em Campo Pulsado utilizando o equipamento Pulsed-field CHEF III (BIORAD).
Cinco microlitros do DNA extraído foram misturados em 3 µL de tampão de corrida e aplicados
em gel de agarose low-melting 1% (BioRad) em TEB 0,5 X. Foi utilizado como padrão de peso molecular
o High MW DNA Marker (InvitrogenTM). Para a corrida, foram utilizados os seguintes parâmetros: 9 volts;
swich time inicial e final de 0,5; ângulo de 120°; 12°C de temperatura e 5 horas de corrida.
3.5. PCR do gene RNAr 16S
Foi realizada a amplificação por PCR do gene RNAr 16S para verificar a qualidade do DNA
extraído. Para a realização das reações de amplificação, foram utilizados os primers e reagentes nas
seguintes concentrações: tampão 1x (Invitrogen), MgCl2 50 mM (Invitrogen), 0,5 μM de cada um dos
primers 1100r (AGGGTTGCGCTCGTTG) e 10f (GAGTTTGATCCTGGCTCAG), 0,2 mM de dNTPs, 2,5 U de Taq
DNA polimerase (Invitrogen) e 1 μL do DNA diluído 1:10, 1:100 e puro. As condições de amplificação
consistiram dos seguintes ciclos de temperatura: 94°C por 2 min, 30 ciclos de 94°C por 1 min, 55°C por 1
min e 72°C por 3 min, e uma extensão final de 72°C por 3 min.
29
3.6. Construção da biblioteca metagenômica de sedimento do mangue
A construção da biblioteca metagenômica foi realizada de acordo com as especificações do
fabricante, com algumas modificações, utilizando o kit CopyControl™ Fosmid Library Production Kit
(Epicentre® Biotechnologies), conforme as etapas detalhadas abaixo.
3.6.1. Seleção de fragmentos de DNA de alto peso molecular
Para a seleção de fragmentos de DNA de alto peso molecular foi realizada nova eletroforese em
PFGE nas mesmas condições citadas no item 3.4. Entretanto, o DNA foi concentrado no Concentrator
plus (Eppendorf) e todo o volume obtido ( 20 g) foi aplicado em gel de agarose low-melting point 1%
(BioRad) em tampão TAE (Tris-EDTA – Ácido acético) 0,5 x. O tampão de corrida do PFGE foi trocado por
TAE uma vez que o ácido bórico inibe a ação da enzima utilizada nas etapas posteriores.
3.6.2. Purificação dos fragmentos de DNA de alto peso molecular
Após a seleção dos fragmentos de interesse, foi realizada a excisão do DNA do gel de agarose
com o auxílio de um bisturi, e então iniciado o processo de purificação.
Pequenas porções da agarose contendo o DNA de tamanho desejado foram pesadas, colocadas
em microtubos e aquecidas a 70°C por 10-15 minutos. Após completo derretimento da agarose, os
tubos foram transferidos para banho-maria a 45°C, adicionados de volume adequado de GELase 50 X
Buffer pré-aquecido para a concentração final de 1 X e homogeneizados delicadamente. Em seguida, foi
adicionada 1 U da enzima GELase para cada 100 mg de gel e os tubos foram incubados a 45°C por 1
hora. Para a inativação da enzima, os tubos foram transferidos para banho-maria a 70°C por 10 minutos.
Alíquotas de 500 µL da solução foram adicionadas em novos tubos esterilizados de 1,5 mL e resfriados
em gelo por 5 minutos. Posteriormente, foi realizada a centrifugação a 10.000 rpm por 20 minutos e 90-
95% do sobrenadante foi recolhido cuidadosamente em um novo tubo esterilizado.
A seguir, foi realizada a precipitação do DNA adicionando 1/10 do volume de acetato de sódio 3
M (pH 7,0) e 2,5 volumes de etanol absoluto, e a solução foi homogeneizada por inversão. Os tubos
foram incubados por 10 minutos em temperatura ambiente e posteriormente centrifugados a 10.000
rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet lavado duas vezes com etanol 70%
30
gelado. Após a segunda lavagem, o pellet foi seco em temperatura ambiente e o DNA suspenso em 53
µL de água ultra-pura estéril.
Para determinar a concentração de DNA, foi realizada a eletroforese utilizando 1 µL do DNA em
um gel de agarose 0,8% em tampão TEB 0,5 X. Como controle para a estimativa da concentração, foi
utilizado o Fosmid Control DNA.
3.6.3. Reação de End-Repair
Para a reação de end-repair, todos os reagentes foram descongelados em gelo e a reação
também foi realizada em banho de gelo. Para a montagem da reação, foram utilizados 52 µL de DNA
(aproximadamente 10 µg de DNA), 8 µL do End-Repair Buffer 10X, 8 µL do dNTP Mix 2,5 mM, 8 µL de
ATP 10 mM e 4 µL do End-Repair Enzyme Mix. A reação foi incubada por 45 minutos em temperatura
ambiente. Em seguida, para a inativação da enzima End-Repair Enzyme Mix, a reação foi levada ao
banho-maria a 70°C por 10 minutos. Posteriormente, foi realizada a precipitação do DNA seguindo o
mesmo procedimento descrito no item 3.6.2, entretanto, o DNA foi suspenso em 7 µL de água ultra-
pura estéril.
Para determinar a concentração do DNA, foi realizada a eletroforese utilizando 1 µL do DNA em
um gel de agarose 0,8% em tampão TEB 0,5 X. Como controle para a estimativa da concentração, foi
utilizado o Fosmid Control DNA.
3.6.4. Reação de ligação
Para a reação de ligação, todos os reagentes foram descongelados em gelo e a reação também
foi realizada em banho de gelo. Para a montagem da reação, foram utilizados 6 µL de DNA
(aproximadamente 0,25 µg de DNA), 1 µL do Fast-Link Ligation Buffer 10X, 1 µL de ATP 10 mM, 1 µL do
vetor CopyControl pCC2FOS (0,5 µg/mL) e 1 µL da enzima Fast-Link DNA Ligase. A reação foi incubada
em termociclador a 16°C overnight. Em seguida, para a inativação da enzima Fast-Link DNA Ligase, a
reação foi levada a banho-maria a 70°C por 10 minutos.
31
3.6.5. Empacotamento
A linhagem de E. coli EPI300-T1R utilizada como célula hospedeira na clonagem foi reativada em
meio LA (Luria-Bertani Ágar) a 37°C por 18 horas. Então, foi realizado o pré-inóculo de uma única colônia
da EPI300-T1R em 50 mL de meio LB + 10 mM de MgSO4 + 0,2% de maltose e incubado a 37°C por 18
horas sob agitação de 180 rpm.
Antes de iniciar a reação de empacotamento, 5 mL da cultura crescida no dia anterior foram
inoculados em um novo tubo contendo 45 mL de meio LB + 10 mM de MgSO4 + 0,2% de maltose e o
cultivo foi incubado a 37°C sob agitação de 180 rpm até atingir a OD600 = 0,8 - 1,0.
Um tubo de Lambda Packaging Extracts foi descongelado em banho de gelo e metade do volume
(25 µL) foi transferido para um novo microtubo esterilizado, sendo o restante do material novamente
congelado a -70°C. No tubo contendo 25 µL do extrato de fagos foi adicionado o volume total (10 µL) da
reação de ligação, seguido de incubação a 30°C por duas horas. Em seguida, o volume restante do
Lambda Packaging Extracts foi novamente descongelado em gelo, adicionado ao tubo com a reação de
empacotamento e incubado por mais duas horas a 30°C. Após a reação de empacotamento, foram
adicionados 940 µL de Phage Dilution Buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,3]; 100 mM NaCl; 10 mM MgCl2) e
12,5 µg/mL de clorofórmio para precipitação de qualquer resíduo de proteína.
3.6.6. Transfecção
Após a obtenção da biblioteca (≈1 mL), foi realizada a transfecção na célula hospedeira EPI300-
T1®. Alíquotas de 100 µL de células, previamente crescidas (DO600 = 0,8 - 1,0), foram distribuídas em
microtubos esterilizados e adicionadas de 10 µL da solução de fagos já empacotados. A reação foi
incubada em banho-maria a 37°C por 1 hora.
Em seguida, a reação foi inoculada com o auxílio de alça de Drigalsky em meio LA acrescido de
12,5 µg/mL de cloranfenicol e incubada a 37°C por 18 horas.
3.6.7. Validação da biblioteca metagenômica
Para a validação da biblioteca, dez clones foram selecionados aleatoriamente. O DNA fosmidial
foi extraído por lise alcalina (Sambrook et al. 1989) Aproximadamente, 500 ng de DNA fosmidial foram
clivados com a enzima de restrição NotI e o padrão de digestão dos fosmídios foi visualizado em gel de
32
agarose 1%, utilizando-se cuba de eletroforese em campo pulsado (PFGE) (CHEF-DR III, BIORAD®) a 6 V
cm-1, switch de 1-12 por 10 horas.
3.6.8. Preservação dos clones
Após o crescimento das colônias em meio LA, os clones foram repicados em placas de
polietileno de 96 poços em meio de cultura HMFM (1,6% triptona; 1% extrato de levedura; 0,5% de
NaCl; 8% Solução A [0,8 mM MgSO4 .7H2O; 3,4 mM citrato de sódio; 13,6 mM (NH4)SO4; 44% glicerol];
2% Solução B [0,66 M KH2PO4; 1,34 M K2HPO4]) e congelados em ultra-freezer -80°C.
3.7. Screening funcional dos clones
3.7.1. Colapso da gota
Para a realização dos ensaios de triagem de clones com atividade biossurfactante foi selecionada
a metodologia descrita no trabalho de Bodour et al. (2003) e denominada “teste do colapso da gota”.
Alíquotas de 5 μL de petróleo foram colocadas em microplacas de fundo chato (96 poços),
deixando- se por 24 horas à temperatura ambiente. Ao mesmo tempo, as culturas de clones foram
repicadas em LB contendo cloranfenicol (12,5 μg/mL) e incubadas até 24 horas a 37°C sob agitação de
180 rpm. Após este período, as placas contendo as culturas dos clones foram centrifugadas a 3.600 rpm
por 8 minutos e alíquotas de 5 μL do sobrenadante foram adicionadas ao petróleo com auxílio de
micropipeta. Os resultados foram considerados positivos quando a gota entrou em colapso. O resultado
foi considerado negativo para a atividade de biossurfactante quando a gota do permaneceu intacta na
amostra. Esse ensaio baseia-se na desestabilização da gota pelo biossurfactante. Uma gota da
suspensão celular ou sobrenadante da cultura são colocadas sobre uma superfície sólida revestida de
óleo. Se a amostra não tiver biossurfactante, as moléculas polares da água são repelidas a partir da
superfície hidrofóbica e as gotas permanecem estáveis. Se a amostra tiver biossurfactante a gota entra
em colapso, uma vez que a tensão interfacial entre o líquido da gota e a superfície do óleo é reduzida
(Jain et al. 1993).
33
3.7.2 Colapso da gota modificado
Inicialmente foi realizado o teste do colapso da gota com 4.800 clones, dos quais 1.122 foram
positivos. Um novo teste foi realizado a fim de confirmar os resultados obtidos, entretanto com algumas
modificações.
No primeiro ensaio, foi realizado um inóculo em microplacas com LB e então feito o teste. No
novo ensaio, foi realizado o pré-inóculo em LB e posteriormente o inóculo em meio mineral (5 g extrato
de levedura; 1 g (NH4)2SO4; 6 g Na2HPO4; 3 g KH2PO4; 2,7 g NaCl; 0,6 g MgSO4 ∙7H2O, 1000 mL água
destilada). Ao meio pronto foi adicionado 0,1 % (v/v) de solução de micronutrientes [10,95 g ZnSO4∙
7H2O; 5 g FeSO4∙ 7H2O; 1,54 g MnSO4∙ 7H2O; 0,39 g CuSO4∙ 5H2O; 0,25 g Co(NO3)2 6H2O; 0,17 g Na2B4O7
10H2O]) (Oliveira et al., 2013) acrescido de 1% de glicerol, e a seguir as culturas foram crescidas a 37°C,
sob agitação de 150 rpm por 120 horas. Após este período, as placas contendo as culturas dos clones
foram centrifugadas a 3.600 rpm por 8 minutos e alíquotas de 5 μL do sobrenadante foram adicionadas
ao petróleo com auxílio de uma pipeta.
3.7.3. Tensiometria
O ensaio de tensiometria foi realizado a fim de confirmar a produção de biossurfactantes pelos
clones que apresentaram resultados positivos no screening preliminar realizado pelo teste “colapso da
gota”.
Algumas tentativas de padronização do teste de tensiometria foram realizadas. O primeiro teste
foi realizado a fim de analisar a melhor fonte de carbono (hexadecano ou glicose) e também verificar a
medida da tensão superficial após remoção química do hexadecano com hexano. Para este teste, foram
utilizadas linhagens sabidamente produtoras de biossurfactantes, dentre elas: um pool de sete isolados
previamente caracterizados por Reys (2009) e a Pseudomonas aeruginosa CBMAI 602. Também foi
utilizada a linhagem hospedeira da biblioteca metagenômica (E. coli EPI-300) como controle negativo, e
dois pools de 20 clones foram testados. Antes da incubação em meio mineral (2 g NaCl; 0,4 g K2HPO4;
0,4g KH2PO4; 0,4 g (NH4)2SO4; 0,08 g MgSO4∙7H2O; 1,2 g NaNO3; 1000mL H2O), foi realizado um pré-
inóculo das amostras em tubos Falcon contendo 40 mL de meio LB acrescido de 12,5 µg/mL de
cloranfenicol e incubados por 24 horas a 37°C sob agitação de 180 rpm. Posteriormente, as amostras
foram transferidas para frascos “SCHOTT” com 200 mL de meio LB e crescidas nas mesmas condições.
Após o crescimento, as culturas foram centrifugadas a 8.000 rpm por 10 minutos e o pellet suspenso em
34
água ultra-pura. Alíquotas de 5 mL da suspensão de células ajustada na DO = 0,1 foram inoculadas em
frascos Erlenmeyer com 50 mL de meio mineral acrescido de 12,5 μg/mL de cloranfenicol, 250 μL de
solução de vitaminas e 0,5 % de hexadecano ou glicose como única fonte de carbono, e então as
culturas foram incubadas por 10 dias a 37°C sob agitação de 180 rpm. Após o término do período da
incubação, as culturas foram centrifugadas por 10 minutos a 8.000 rpm e 4°C. Uma alíquota de
aproximadamente 25 mL, da cultura crescida com o hexadecano, foi removido utilizando hexano. Para
tal procedimento, uma alíquota do sobrenadante livre de células foi colocada em um funil de separação
e adicionada de mesmo volume de hexano. O material foi homogeneizado vigorosamente e a primeira
fase foi coletada. Este procedimento foi repetido três vezes seguidas. O sobrenadante obtido foi
avaliado em tensiômetro (Digital Tensiometer K10-ST – Krüss®) utilizando água destilada como padrão
para calibrar o equipamento. Dezoito pools foram avaliados utilizando o método descrito acima usando
o hexadecano (sem a remoção química) como fonte de carbono, entretanto no decorrer do
experimento, foi observado que as replicatas não apresentavam boa reprodutibilidade e também que o
hexadecano por si só alterava a tensão superficial do meio.
Com base nesta observação, um segundo teste foi proposto. Para esse teste, o inóculo foi
realizado com o mesmo procedimento utilizado anteriormente. Entretanto, o hexadecano foi removido
fisicamente por centrifugação a 0°C. O sobrenadante obtido foi avaliado em tensiômetro (Digital
Tensiometer K10-ST – Krüss®), utilizando água destilada como padrão para calibrar o equipamento.
Foram analisadas duas linhagens sabidamente produtoras de biossurfactantes (CBMAI 557 e CBMAI
602), um pool de isolados sabidamente produtores de biossurfactante e como controle negativo a E. coli
EPI-300 (hospedeira da biblioteca metagenômica). Todas as amostras foram avaliadas na ausência e na
presença do hexadecano. Com esse teste, foi observado que o hexadecano realmente interfere na
leitura do equipamento, e que esta fonte de carbono não foi eficiente para estimular a produção de
biossurfactante.
Dessa forma, novos testes foram realizados a fim de verificar qual a melhor fonte de carbono
para estimular a produção de biossurfactante e o melhor tempo de produção. Alguns parâmetros foram
alterados, tais como o meio de cultura, o tempo de incubação e as fontes de carbono. Nestes testes, foi
utilizado o meio mineral (5 g extrato de levedura; 1 g (NH4)2SO4; 6 g Na2HPO4; 3 g KH2PO4; 2,7 g NaCl; 0,6
g MgSO4 ∙ 7H2O, 1000 mL água destilada). Ao meio pronto foi adicionado 0,1 % (v/v) de solução de
micronutrientes [10,95 g ZnSO4 ∙ 7H2O; 5 g FeSO4 ∙ 7H2O; 1,54 g MnSO4 ∙ 7H2O; 0,39 g CuSO4 ∙ 5H2O; 0,25
g Co(NO3)2 ∙ 6H2O; 0,17 g Na2B4O7 ∙ 10H2O]) e 1% de diferentes fontes de carbono, dentre elas: n-
35
hexadecano, n-fenantreno, glicose e glicerol. Uma alíquota de 10 % (v/v) da cultura em fase exponencial
de crescimento, com absorbância ajustada para DO600 = 0,150 ± 0,030 foi utilizada como inóculo. As
culturas foram incubadas sob agitação contínua de 150 rpm, a 37°C por oito diferentes tempos (48 h, 72
h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h, 192 h e 216 h). Após o período de incubação, o material foi centrifugado a
10.000 rpm por 15 minutos. As amostras acrescidas de hexadecano foram centrifugadas sob
refrigeração de 0 °C, a fim de remover fisicamente o composto, que em baixa temperatura solidifica-se
no meio. Os sobrenadantes livres de células foram utilizados para medida da tensão superficial
utilizando dois diferentes tensiômetros (Krüss - K10-ST e Sigma 701). Para essa análise, foi utilizado um
pool de clones produtores de biossurfactantes previamente selecionados por Dellagnezze (2010). Após a
seleção da melhor fonte de carbono e dos melhores tempos, o experimento foi realizado com a E. coli
linhagem EPI-300 (hospedeira da biblioteca metagenômica).
Após os ensaios preliminares, os testes foram realizados com os clones crescendo
individualmente em frascos Erlenmeyer com 25 mL de meio mineral (13,99 g K2HPO4; 6,0 g KH2PO4; 0,2
g MgSO4·H2O; 4,0 g (NH4)2SO4 e 0,04% extrato de levedura em 1.000 mL de água destilada) acrescido de
0,01% de elementos traços (2,5 g EDTA; 10,95 g ZnSO4; 5,0 g FeSO4·7H2O; 1,54 g MnSO4·H2O; 0,392 g
CuSO4·5H2O; 0,25 g Co(NO3)2·7H2O; 0,177 g Na2B4O7·10H2O em 1.000 mL de água destilada), 1% de fonte
de carbono (glicerol) e 12,5 µg/mL de cloranfenicol. Uma alíquota de 10% (v/v) da cultura em fase
exponencial de crescimento, com absorbância ajustada para DO600 = 0,150 ± 0,030 foi utilizada como
inóculo. As culturas foram incubadas sob agitação contínua de 150 rpm, a 37° C por 120 horas. Após o
período de incubação, o material foi centrifugado a 8.000 rpm por 15 minutos. Os sobrenadantes livres
de células foram utilizados para medida da tensão superficial utilizando tensiômetro (Krüss – K20
EasyDine).
3.8. Screening molecular dos clones
A triagem dos clones por similaridade de sequência foi realizada através de reações de
amplificação por PCR utilizando primers relacionados à síntese de biossurfactantes descritos na
literatura (McInerney et al. 2007; Bodour et al. 2003) (Tabela 1). As amplificações foram realizadas em
pools de 20 clones.
36
Primer Sequência (5’-3’) Referência
sfrA/licA (F) CAA AAK CGC AKC ATA CCA CKT TGA G McInerney et al. (2007) sfrA/licA (R) TCA TAR AGC GGC AYA TAT TGA TGC McInerney et al. (2007) rhlR (F) CTG CGC TCC WCG GAA ATG GTG McInerney et al. (2007) rhlR (R) TCT GGA TGW YCT TGW GGT GGA AGTT C McInerney et al. (2007) kpd1(F) GCC CAC GAC CAG TTC GAC Bodour et al. (2003) kpd2 (R) CAT CCC CCT CCC TAT GAC Bodour et al. (2003)
Para a amplificação do gene da ramnosil transferase (rhIB), que faz parte da via de biossíntese
do ramnolipídeo, foram realizadas reações de amplificação com os primers e reagentes nas seguintes
concentrações: tampão 1x (Invitrogen®), 50 mM MgCl2 (Invitrogen®), 0,5 μM de cada um dos primers
kpd1 e kpd2, 0,2 mM de dNTPs, 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen®) e 50 ng de DNA. As
condições de amplificação consistiram dos seguintes ciclos de temperatura: 94°C por 2 min; 30 ciclos de
94°C por 15 seg, 54°C por 15 seg e 72°C por 15 seg; e uma extensão final de 72°C por 2 min.
Para a detecção dos genes srfA/licA (biossíntese de surfactina) e rhIR (biossíntese de
ramnolipídio) foram utilizadas as mesmas concentrações de primers e reagentes estabelecidas por
McInerney et al. (2007), a saber: tampão 1x (Invitrogen®), 50 mM de MgCl2 (Invitrogen®), 10 mM dNTP,
5 μM primer, 2,5 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen®) e 50 ng de DNA. Para cada par de primers
foram realizadas reações de PCR com diferentes ciclos de temperatura. Para o par srfA/licA foi utilizado
um ciclo de desnaturação inicial a 95°C por 5 min, um touchdown de 10 ciclos a 94°C por 35 s, 55°C
(decrescendo 0,5°C por ciclo) por 35 s, e 72°C por 45 s para extensão. Foram adicionados mais 23 ciclos
a 95°C para desnaturação, 35 s a 50°C para anelamento, 45 s a 72°C para extensão, e um ciclo de
extensão final a 72°C por 6 min. Para o par de primers rhIR foi utilizado um ciclo de desnaturação inicial
a 95°C por 5 min, seguidos de 10 ciclos de 40 s a 95°C, 40 s a 57,3°C até 52,3°C (com touchdown para
anelamento), 45 s a 72°C para extensão. Foram adicionados mais 23 ciclos a 95°C para desnaturação, 40
s a 52,3°C para anelamento, 45 s a 72°C para extensão, seguidos de 7 min a 72°C para a extensão final.
Tabela 1. Primers utilizados para a triagem molecular por PCR
37
3.9. Sequenciamento dos fosmídios
Os três fomídios que apresentaram melhores resultados na análise de tensão superficial foram
selecionados para o sequenciamento e análise genômica.
3.9.1 Extração do DNA fosmidial
Para a extração do DNA fosmidial foi utilizado o kit QIAGEN® Large-Construct. O rendimento de
DNA com este kit foi de aproximadamente 150 µg. Embora sejam necessários somente 2 µg de DNA
para o sequenciamento, este kit foi utilizado uma vez que permite a obtenção de DNA fosmidial livre de
DNA genômico contaminante.
3.9.2 Sequenciamento pela tecnologia do Ion-Torrent
O sequenciamento dos fosmídios foi realizado pela empresa Helixxa. Para o sequenciamento foi
utilizado o 314™ Chip, Plataforma Ion Torrent (Life Technologies).
3.9.3. Assembling das sequências
A avaliação da qualidade e a montagem das sequências dos fosmídios foram realizadas através
do programa Velvet 1.1.17 (k = 41) (Zerbino & Birney, 2008). Essa ferramenta é ideal para a montagem
de genomas ou metagenomas sequenciados através de tecnologia que geram reads curtos (50 – 200
pb), p.ex. Illumina, Solexa e IonTorrent. O Velvet oferece um rico conjunto de diferentes opções de
algoritmos adaptados para diferentes tarefas e, assim, proporciona uma plataforma versátil de
montagem de genomas de procariotos e eucariotos. Este programa possui também a vantagem de fazer
o assembling com muita rapidez e eficiência. Zerbino e Birney (2008) fizeram a comparação da
montagem do genoma de uma linhagem de Streptococcus suis sequenciada pela plataforma Solexa e
observaram que utilizando o Velvet o tempo de montagem era de 2 min e 57 seg, ao passo que
utilizando as ferramentas SSAKE 2.0 e VCAKE 1.0 o tempo era de 1 h e 47 min e 4 h e 25 min,
respectivamente. A taxa de erro foi de 0,02% para o Velvet, 0,2% para o SSAKE 2.0 e 0,64% para VCAKE
1.0 (Zerbino & Birney, 2008). O assembling das sequências foi realizado em parceria com o Dr. Paul
Greenfield (CSIRO - Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation – Sydney, Austrália).
38
3.9.4. Fechamento dos gaps
Embora o sequenciamento dos fosmidíos tenha gerado uma cobertura de aproximadamente
85X, permaneceram alguns gaps. Ferramentas computacionais como Python 2.7, Biopython, Muscle e
BioEdit, e dados brutos obtidos no IonTorrent permitiram o fechamento destes gaps. Não foi necessária
a realização de novos sequenciamentos, já que tal análise foi baseada no princípio de sequenciamento
por primer walking in silico, permitindo assim a otimização de tempo.
3.9.5. Anotação dos genes
Para a identificação das ORFs (Open Reading Frames) e anotação dos genes contidos nos
fosmídios foi utilizada a ferramenta Integrated Microbial Genomes Expert Review (IMG/MER)
(Markowitz et al. 2012). O IMG é uma plataforma que otimiza a anotação de dados de genômica e
metagenômica de micro-organismos. Em um único programa, ele reúne vários bancos de dados, como
COG, Pfam, Ko, Enzyme, KEGG e MetaCyc. Após a predição pelo IMG/MER e anotação automática, foi
realizada também a anotação manual utilizando ferramentas de bioinformática, como a busca de
sequências similares utilizando BLASTx contra as bases de dados de sequências EMBL/GeneBank e de
famílias de proteínas utilizando InterProScan (combina diferentes métodos de reconhecimento de
proteínas contra proteínas nos bancos de dados PROSITE, PRINTS, Pfam, ProDom, SMART e
TIGRFAMMs) (Quevillon et al., 2005; http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Construção da biblioteca metagenômica
A construção de bibliotecas metagenômicas com DNA de alto peso molecular (25-40 kb) é uma
opção interessante para se ter o acesso a vias metabólicas completas, já que estas geralmente
abrangem operons inteiros para a síntese de compostos de interesse biotecnológico. Dessa forma, o
passo de extração de DNA de alto peso é crucial, pois irá determinar a integridade destas eventuais vias
metabólicas, viabilizando a busca pelo metabólito desejado.
Algumas dificuldades foram encontradas para a construção da biblioteca metagenômica a partir
da amostra de sedimento de manguezal impactado, dentre elas a obtenção do DNA de alto peso (acima
de 25 kb), e a concentração necessária para a clonagem e a purificação. O mangue é um ambiente rico
em matéria orgânica, e o processo de extração de DNA a partir de amostras de sedimento resulta em
39
uma alta concentração de compostos húmicos que inibem a ação de enzimas, como no caso das reações
de PCR (Smalla et al. 1993, Tsai et al. 1992), digestão com enzimas de restrição (Porteous et al. 1991) e
redução na eficiência de transformação (Tebbe et al. 1993).
As extrações de DNA do sedimento de mangue, realizadas pelos kits Power Soil® e PowerMax®
Soil com modificações (MoBio – Laboratories, Inc.), não foram eficientes. O DNA apresentou alta
concentração (Figura 3), porém os fragmentos apresentaram-se pequenos (< 10 kb), inviabilizando assim
a construção da biblioteca metagenômica. A quebra do DNA pode ter sido acarretada pela sua
passagem através da coluna de purificação. Então, essa metodologia para a obtenção do DNA foi
descartada.
O protocolo de CTAB-SDS foi utilizado para testes preliminares. A extração resultou em uma alta
quantidade de DNA de alto peso molecular (Figura 4), porém não foi obtida a pureza necessária para
reações de PCR ou outras reações enzimáticas necessárias para a construção da biblioteca
metagenômica. Mesmo após a purificação com cloreto de césio, não foi obtido o DNA puro para ensaios
posteriores. Para a confirmação da qualidade do material obtido, foi realizada a PCR do gene RNAr 16S,
mas não foi obtido sinal positivo de amplificação do gene em nenhuma das diluições testadas (1:10 e
1:100).
1 2 3 4
1 2 3 1 2 3
Figura 3. (A) Eletroforese das amostras de DNA extraídas de sedimento de manguezal em gel de agarose
0,8%. 1. DNA do fago λ usado como padrão de concentração: 50 ng; 2. DNA do fago λ: 100 ng; 3. DNA de
sedimento de mangue obtido pelo kit Power Soil®; 4. DNA obtido pelo kit PowerMax® Soil, com
modificações. (B) Gel de PFGE 1%. 1. High MW DNA Markers (InvitrogenTM
); 2. DNA fosmidial (Epicentre®
Biotechnologies); 3. Extração de DNA pelo kit Power Soil®. (C) Gel de PFGE 1%. 1. High MW DNA Markers
(InvitrogenTM
); 2. DNA fosmidial 36 kb (Epicentre® Biotechnologies); 3. Extração de DNA pelo kit
PowerMax Soil®.
19.399 pb 19.399 pb
12.220 pb
12.220 pb
(A)
(B) (C)
40
A extração pelo método Freeze-Thaw foi a mais eficiente na obtenção do DNA adequado para a
construção de bibliotecas metagenômicas (Figura 5), e gerou alta concentração de DNA e fragmentos
com alto peso molecular.
A construção da biblioteca metagenômica resultou em 12.800 clones. Dez clones foram
selecionados aleatoriamente e digeridos com a enzima NotI para validação da biblioteca (Figura 6).
Foram observados diferentes perfis de restrição e a presença de vetor em todas as amostras, indicando,
assim, que os clones correspondiam a eventos de inserção distintos e sugerindo que a biblioteca obtida
continha grande diversidade de genes a ser explorada.
1 2 3
1 2 3
Figura 5. (A) Gel de eletroforese 0,8%. 1. DNA do fago λ usado como padrão de concentração: 50 ng; 2. DNA
do fago λ: 100 ng; 3. DNA obtido do sedimento pelo método Freeze Thaw. (B) Gel de PFGE 1%. 1. High MW
DNA Markers (InvitrogenTM
); 2. DNA Fosmidial 36 kb (EPICENTRE®); 3. DNA obtido do sedimento pelo
método Freeze Thaw.
(A) (B) 1 2 3 1 2 3
24.776
19.399
12.220
Figura 4. (A) Eletroforese em gel de agarose 0,8%. 1. DNA do fago λ usado como padrão de
concentração: 50 ng; 2. DNA do fago λ: 100 ng; 3. DNA obtido pelo protocolo SDS-CTAB. (B) Gel de
PFGE 1%. 1. High MW DNA Markers (InvitrogenTM
); 2. DNA fosmidial 36 kb (Epicentre®
Biotechnologies); 3. DNA obtido pelo protocolo SDS-CTAB.
19.399
12.220
24.776
(A)
(B)
41
4.2. Screening funcional
4.2.1. Colapso da gota
Desde 1970, uma grande variedade de métodos de triagem de biossurfactantes produzidos por
micro-organismos tem sido desenvolvida e aplicada com sucesso. Entretanto, essas triagens têm sido
quase sempre limitadas a um número reduzido de amostras. Atualmente, métodos automatizados e
miniaturizados têm levado ao desenvolvimento de técnicas de High-Throughput Screening (HTS) ou
técnicas de triagem de alta eficiência, tornando viável a busca de novos biossurfactantes a partir de um
grande número de amostras (Walter et al. 2010) .
Os biossurfactantes pertencem a grupos de biomoléculas muito diversos, p.ex. glicolipídios,
lipopeptídios, lipoproteínas, lipopolissacarídios ou fosfolipídios. Sendo assim, a maioria dos métodos de
triagem dos surfactantes é baseada em seus efeitos físicos, podendo ser qualitativos e/ou quantitativos.
Para o primeiro screening de muitos isolados ou clones metagenômicos, o método qualitativo se mostra
mais eficiente (Walter et al. 2010).
Nesta proposta, o teste utilizado foi realizado através da metodologia descrita por Bodour et al.
(2003), denominado “teste de colapso da gota”, e permitiu a avaliação de 4.800 clones, dos quais 1.122
foram positivos para a produção de biossurfactantes (exemplo na Figura 7). Todos os clones
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Figura 6. Eletroforese de campo pulsado em gel de agarose Low Melting 1%. 1. High MW DNA Markers
(InvitrogenTM
); 2. DNA Fosmidial 36 kb (EPICENTRE®); 3. pCCFOS2; 4-12. Perfil dos clones com a enzima
de restrição NotI. A seta indica a banda que corresponde ao vetor.
42
considerados positivos foram selecionados para testes subsequentes de tensiometria para a
confirmação do resultado.
Após análise criteriosa do método, foi observado que muitas vezes são registrados resultados
falso-positivos, uma vez que fazer o screening com o auxílio de uma pipeta multi-canal acarreta a
pipetagem acidental no canto dos orifícios das placas e consequentes erros metodológicos.
Neste sentido, um novo ensaio foi realizado a fim de confirmar os resultados obtidos
anteriormente. Os 1.122 clones foram triados novamente, com o inóculo e o crescimento modificado, e
o teste foi realizado com o auxílio de uma pipeta monocanal a fim de minimizar os resultados falso-
positivos. Dos 1.122 clones testados, 266 apresentaram atividade surfactante no teste do colapso da
gota.
Embora Plaza et al. (2006) afirmem que o teste do colapso da gota não requer equipamentos
especializados, em nossos ensaios observamos que o teste realizado com pipeta multi-canal tem uma
grande margem de erro. Portanto, a fim de otimizar o processo de triagem, é sugerido que o teste seja
realizado utilizando sistema automatizado, uma vez que esta abordagem diminui consideravelmente o
erro de pipetagem e não incorre em resultados falso-positivos.
Embora o teste do colapso da gota não tenha se mostrado eficiente neste estudo utilizando
pipetas multi-canais, e ofereça uma baixa sensibilidade uma vez que a concentração do composto ativo
geralmente é baixa, esse teste ainda é o mais comumente utilizado em ensaios HTS para a triagem de
biossurfactantes (Boudor et al. 2003; Plaza et al. 2006; Youssef et al. 2005; Dellagnezze 2009). Além
disso, este teste pode ser realizado em microplacas de 96 poços (Tugrol & Cansunar, 2005), o que facilita
a condução do experimento.
Figura 7. Fotos ilustrativas do teste “colapso da gota” utilizado para screening funcional de biossurfactantes.
Seta vermelha indica resultado negativo para o colapso da gota; Seta azul indica resultado positivo para o
colapso da gota.
43
4.2.2. Tensiometria
Como descrito anteriormente, os ensaios de tensiometria foram realizados com o objetivo de
confirmar a produção de biossurfactantes pelos clones previamente selecionados pelo teste do colapso
da gota.
Um surfactante considerado ideal e eficiente seria aquele com baixa concentração micelar
crítica (CMC) e tensão superficial com valores menores que 30 mN/m (Ashby et al. 2008). Neste
trabalho, a avaliação da concentração micelar crítica foi deixada para uma etapa futura, após a seleção
dos melhores clones produtores.
O primeiro teste realizado permitiu concluir que o hexadecano foi a melhor fonte de carbono
para a produção de biossurfactante, e que fazendo a remoção química do mesmo utilizando o hexano,
houve alteração na tensão superficial. Isso sugere que o hexano também removeu o biossurfactante
produzido pelosmicro-organismos. O pool CCMA teve a redução da tensão superficial para 28,1 mN/m, e
fazendo a remoção química com hexano houve a redução para 52,5 mN/m. Em ambas as análises a
redução foi comparada aos controles negativos contendo o meio de cultura e a E. coli EPI 300. O uso da
glicose como substrato não promoveu redução significativa em comparação com o hexadecano. Todas
as amostras foram lidas em triplicatas e os resultados estão descritos na Tabela 2. A unidade de medida
utilizada na análise é mN/m.
Amostras MM + hexa MM - hex
b MM + glicose
c
Controle negativo (meio de cultura)
45,4 70,3 60,4
Controle negativo EPI 300
45,1 54,5 51,5
Controle positivo CBMAI 602
37,8 56,2 46,7
Controle positivo Pool CCMA
28,1 52,5 49,9
Pool 1 43,7 52,1 50,2
Pool 2 46,9 58,2 49,5
Após a seleção do hexadecano como a melhor fonte de carbono, mais 18 pools de clones foram
testados utilizando a mesma metodologia. Entretanto, os ensaios não apresentaram reprodutibilidade.
Tabela 2. Valores das médias de tensiometria das linhagens selecionadas para o teste
preliminar.
a. Meio Mineral com hexadecano;
b. Meio Mineral com o hexadecano removido
com hexano; c. Meio Mineral com glicose.
44
Foi possível observar uma película de hexadecano sobre a amostra analisada, sugerindo que este
composto, por si só, foi capaz de alterar a tensão superficial das amostras analisadas. Os resultados
estão descritos na Tabela 3.
Nas amostras em destaque, foi possível verificar que houve grande diferença nas análises das
replicatas. Embora seja um sistema biológico, a variação de leitura foi grande, não permitindo assim a
confiabilidade do teste realizado.
45
Pool Replicatas
A B C Média
MM s/ hex a 45,2 44,2 45,6 45
MM c/ hex b
38,2 40,1 38,9 39,1
Pool CCMA 26,2 26,7 25,9 26,3
EPI-300 45 46,2 46,7 46,0
3 27,2 28,4 39,1 31,6
4 30,6 40,2 39 36,6
5 27,5 31,2 36,6 31,8
6 28,7 38,4 28,8 31,9
7 36,5 36,4 44 38,8
8 37,8 43,2 42,5 41,2
9 40 40,5 41 40,5
10 40,2 47,1 36,1 41,1
11 41,5 27 36,4 35
12 37,3 26,3 28,8 30,8
13 26,7 27 31 28,2
14 46,8 28,4 28,8 34,7
15 46,6 27,3 28,9 34,3
16 29,1 27,5 30,7 29,1
17 28,2 27,6 30,1 28,6
18 42,2 39,9 30,9 37,7 a Meio Mineral sem hexadecano;
b Meio Mineral com hexadecano. As linhas destacadas representam os pools
cujos valores de redução da tensão superficial são se reproduziram dentre as replicatas.
Frente aos resultados obtidos, um novo experimento foi proposto no qual o hexadecano foi
removido fisicamente, o que permitiu verificar se realmente este composto interferiu na leitura da
tensão superficial. Foi observado que o hexadecano realmente apresentou interferência nas análises, e
que, portanto, não representa a melhor fonte para estimular a produção de biossurfactantes (Tabela 4).
Destaque deve ser dado para o pool CCMA, que na presença de hexadecano teve a redução da tensão
superficial para 35,4 mN/m, e na mesma replicata, removendo o hexadecano fisicamente, a tensão
superficial foi 52 mN/m. Estes resultados confirmaram que esta fonte de carbono não estimula a
produção de biossurfactante, e que o hexadecano estava interferindo na análise.
Tabela 3. Valores de tensiometria dos pools de clones positivos para o teste de colapso da gota
46
Amostras Replicatas
A B C Média
MM c/ hex a 47,9 45,2 47,1 46,7
MM s/ hex b 50,7 53,4 55,6 53,2
MM hex rem c 60,6 59,1 57,8 59,2
EPI-300 ch d 54,8 47,8 48,8 50,5
EPI-300 sh e
55,2 58,3 54,2 55,9
Pool CCMA ch 36,7 32,3 37,1 35,4
Pool CCMA sh 52,1 52,4 51,4 52,0
CCMA 557 ch 42,8 48,1 50,2 47,0
CCMA 557 sh 50,3 49,1 56 51,8
CBMAI 602 ch 46,1 45 48,9 46,7
CBMAI 602 sh 51,6 56,7 48,9 52,4
Este experimento foi conduzido utilizando o meio mineral (com ou sem hexadecano) e a
linhagem de E. coli EPI 300 como controles negativos, um pool de linhagens sabidamente produtoras de
biossurfactante, a linhagem CBMAI 557 e a linhagem CBMAI 602 como controles positivos. Após a
análise dos resultados, foi tomada a decisão de montar um experimento em maior dimensão com o
objetivo de: i. analisar a melhor fonte de carbono para estimular a produção de biossurfactante; ii.
otimizar o tempo de produção; iii. analisar as amostras em um equipamento diferente do utilizado nas
análises anteriores e, iv. alterar o meio de cultura, a fim de verificar se há melhora na produção.
Com base nos resultados obtidos por meio deste experimento, foi possível concluir que não
houve diferença significativa nas análises feitas com diferentes tensiômetros. A melhor fonte de
carbono foi o glicerol e, quanto ao tempo de incubação, a redução significativa da tensão superficial foi
constatada a partir de 168 horas. Os resultados estão demonstrados na Tabela 5. Os gráficos abaixo
ilustram mais claramente a redução da tensão superficial utilizando os tensiometros da Krüss (Figura 7)
e Sigma (Figura 8).
Tabela 4. Valores de tensiometria para análise da interferência do hexadecano.
a. Meio Mineral com hexadecano;
b. Meio Mineral sem hexadecano;
c. Meio
Mineral com hexadecano removido fisicamente; d.
ch = Com hexadecano; e.
sh = Sem hexadecano
47
Equip. Fonte
C. Controle 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 192 h 216 h
Sigma 701 Hexad.
62,95 48,07 49,83 50,35 53,30 46,67 50,24 50,35 53,21
Krüss K10 61,90 44,27 46,35 49,10 52,20 48,90 50,07 54,27 50,00
Sigma 701 Fenan.
62,85 58,16 55,75 56,37 53,43 55,42 58,40 57,56 56,33
Krüss K10 61,27 51,57 52,63 54,73 52,20 57,03 57,73 57,17 55,70
Sigma 701 Glicerol
58,92 59,51 58,88 60,11 53,34 42,63 43,75 45,38 42,61
Krüss K10 60,37 57,30 57,33 56,17 48,53 50,07 42,80 41,65 40,93
Sigma 701 Glicose
53,28 53,28 54,20 60,48 60,91 47,07 46,52 46,08 54,85
Krüss K10 58,67 58,67 57,67 58,03 56,53 56,57 42,57 53,47 50,40
Figura 7. Gráfico mostrando a redução da tensão superficial utilizando o equipamento Krüss – K10.
Figura 8. Gráfico mostrando a redução da tensão superficial utilizando o equipamento Sigma 701.
Tabela 5. Valores de tensiometria dos ensaios de otimização de tempo e fonte de carbono.
48
Após a fixação do melhor tempo de produção (a partir 168 h) e a melhor fonte de carbono
(glicerol), o mesmo experimento foi realizado com a E. coli EPI-300 para a sua padronização como
controle negativo e, o mais importante, para verificar se a linhagem hospedeira não produz
biossufactante, o que poderia interferir em análises posteriores. A linhagem foi cultivada nas mesmas
condições descritas anteriormente, e o sobrenadante livre de células foi lido no tensiômetro Krüss –
K10. Para uma melhor margem de análise foram avaliadas amostras com 96 h, 120 h, 144 h e 168 h de
crescimento.
Diante dos resultados apresentados na Tabela 6, foi possível verificar que a linhagem hospedeira
da biblioteca metagenômica, E. coli EPI-300, reduz significativamente a tensão superficial do meio, de
70,3 mN/m para 40,7 mN/m na cultura de 168 h.
Linhagem Tempo
96 h 120 h 144 h 168 h
Replicata
EPI-300
A 58,3 46,0 46,7 43,1
B 53,6 51,1 43,4 41,1
C 49,4 47,6 49,4 38,0
Média 53,8 48,2 46,5 40,7
Tendo em vista que a linhagem hospedeira E. coli EPI-300 possui a capacidade de reduzir a
tensão superficial, então tomamos o valor da tensão superficial desta bactéria como controle negativo
(53,8 mN/m). Além disso, após várias tentativas de padronização do ensaio de tensiometria, foi decidido
que os clones positivos para o ensaio do colapso da gota modificado seriam testados individualmente,
uma vez que existem bactérias com capacidade desemulsificante (Huang el at. 2008, Liu et al. 2011) as
quais poderiam mascarar algum possível resultado positivo. Dos 266 clones analisados, 90 apresentaram
tensão superficial abaixo de 53,8 mN/m, com valores de 47,4 ,47,1, 45,0 e 42,6 mN/m, entretando a
maioria apresentou tensão superficial igual ou superior ao valor da EPI-300. Embora um surfactante
considerado ideal e eficiente seja aquele com valores de tensão superficial menores que 30 mN/m
(Ashby et al. 2008), os resultados obtidos para alguns clones (A6, H5 e F10) foram considerados
satisfatórios, uma vez que se trata de um sistema de expressão heterólogo. Portanto, estes clones que
apresentaram a tensão superficial considerada satisfatória foram selecionados para o sequenciamento
do fosmídeo para a caracterização genética.
Tabela 6. Análise de tensiometria da E. coli linhagem EPI-300
49
4.3. Screening molecular
Como já descrito, para os ensaios baseados em similaridade de sequência por PCR foram
utilizados três pares de primers. O par srfA/lic (F) e srfA/lic (R) está relacionado à síntese de surfactina
em espécies de Bacillus e os outros dois, que são os pares de primers degenerados rhlR (F)/ rhlR (R) e
kpd1(F)/ kpd2 (R), estão relacionados à síntese de ramnolipídios em Pseudomonas aeruginosa.
Os ensaios de PCR utilizando culturas puras para padronização das condições de reação foram
bem sucedidos, mostrando sinal positivo de amplificação para Bacillus subtilis CBMAI 707, no caso dos
primers sfrA/lic (F)/ sfrA/lic (R) e, para Pseudomonas aeruginosa CBMAI 602, no caso dos pares de
primers kpd1/kpd 2 e rhlR (F)/ rhlR (R) (dados não apresentados). Por outro lado, os ensaios por PCR
com os 57 pools de clones não evidenciaram nenhum sinal positivo de amplificação para quaisquer dos
primers testados.
Há disponível na litetatura uma infinidade de trabalhos relatando a ocorrência de
biossurfactantes em linhagens de Acinetobacter (Navon-Venezia et al. 1995), Gordonia (Franzetti et al.
2009), Serratia (Ferraz et al. 2002), Rhodococcus (Philp et al. 2002), Halomonas (Donio et al. 2013), e
outras bactérias. Entretanto, é possível observar claramente que as pesquisas são focadas em sua
grande maioria em duas espécies apenas, Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis, produtores de
ramnolipídios e surfactina, respectivamente. Isso se dá não somente na área de caracterização química
dos compostos produzidos por esses micro-organismos, mas também em relação à caracterização
genética das vias metabólicas. Então, a maior dificuldade inerente ao screening molecular é que não há
na literatura informação disponivel sobre primers ou sondas específicas para genes de biossurfactantes,
diferentemente de enzimas como lipases, esterases e celulases. Em função disto, neste trabalho foi
investigada somente a ocorrência de surfactinas e ramnolipídios. Outro fator que dificulta o screening
molecular é que a vias metabólicas desses compostos são alocadas em grandes operons. Uma vez
clonados, eles podem não estar completos, e a região de anelamento dos primers pode não estar
presente, o que resulta em falsos-negativos.
4.4. Sequenciamento dos fosmídios
O sequenciamento dos fosmídios foi realizado utilizando 314TM Chip conforme descrito no item
3.6. Foram gerados aproximadamente 100 mil leituras de até 200 bases. No Chip foram sequenciados
seis fosmídios, então com uma cobertura de aproximadamente 85 X para cada fosmídio de 40 kb.
50
4.4.1. Montagem das sequências
Após a montagem dos reads utilizando o programa Velvet, foram obtidos quatro, cinco e seis
contigs para os fosmídios A6, F10 e H5, respectivamente. Como um dos objetivos do trabalho era fazer a
clonagem de possíveis genes envolvidos na síntese de biossurfactante, e considerando que os mesmos
poderiam estar em contigs diferentes, o fechamento das lacunas entre as sequencias (gaps) foi essencial
para a continuidade do trabalho. Como mencionado acima, este procedimento foi realizado pelo
princípio do sequenciamento de primer walking in silico.
Após a remoção manual da sequencia do vetor do fosmídio A6, obtivemos uma sequência com
somente dois contigs. Foi possível observar que o gap formado ocorreu devido a uma sobreposição de
apenas seis pares de base nas sequências (Figura 9). Com o auxílio do programa Python 2.7 e dos dados
brutos derivados do sequenciamento no IonTorrent foi possível afirmar que não era uma sequência
repetida de seis pares de base, uma vez que essa ferramenta fez uma busca nos dados brutos
sequenciados e mostrou que não havia ocorrência de sequências repetidas nessa região do fragmento
de DNA. Ao finalizar a montagem foi obtido um fragmento contíguo de DNA de 24.878 bp.
Figura 9. Esquema de montagem do Fosmídio A6.
Para a montagem do fosmídio F10, o primeiro passo foi identificar os contigs que tinham
fragmentos de vetores. Fazendo a remoção dos mesmos, foram obtidos três contigs para análise. O
primeiro gap fechado foi entre o contig 1 e o contig 4, este também não era um gap e sim uma
sobreposição de 10 bp do contig 1 em posição reversa complementar com o início do contig 4.
Conhecendo as extremidades dos contig 4 e do contig 2, e sabendo que ambos tinham
fragmentos de vetores, foi possível concluir que o contig 1 era uma continuidade do 2. Entretanto, entre
Sobreposição de 6 pb
51
eles havia um gap que, a princípio, não apresentava um tamanho identificável. Para que esse gap fosse
fechado, o princípio do primer walking foi utilizado. Sequências de 20 bp de ambas as extremidades
foram selecionadas e utilizadas como primer. O programa Python 2.7 foi utilizado para a busca de
sequências que anelassem nesses primers e então foi gerado um arquivo somente com os dados
(sequências) de interesse. Vale ressaltar, que todas as buscas foram realizadas também com os primers
em reverso complemento. Em seguida, todas as sequências foram alinhadas utilizando o programa
Muscle, gerando novamente um arquivo com as sequências alinhadas. Finalmente, esses dados foram
visualizados e analisados no programa BioEdit, o que permitiu identificar o gap formado, e com as
sequências alinhadas, foi possível fechar o gap de 18 bp entre os contigs 1 e 2 (Figura 10). Após a
conclusão, foi obtido um fragmento contíguo de DNA com 43.995 bp. O maior fragmento dentre os três
fosmídios estudados.
A montagem do fosmídio H5 foi iniciada da mesma forma que dos outros fosmídios,
identificando primeiramente os contigs que possuíam fragmentos de vetor. O primeiro gap fechado
estava localizado entre o contig 2 e contig 3. Foi possível observar nesse gap que havia uma sequência
repetida de sete nucleotídeos C no final do contig 2 e sete nucleotídeos C no início do contig 3. Assim
Figura 10. Esquema de montagem do Fosmídio F10.
Sobreposição de 10 pb
52
sendo, com o alinhamento das sequências no Muscle foi possível observar através do BioEdit que
algumas sequências possuíam seis, sete, oito ou nove nucleotídeos C. Após fazermos uma busca nos
dados brutos do sequenciamento, observamos que a maioria das sequências (75%) era composta de
sete nucleotídeos C, nos permitindo afirmar então que a sequência era composta de sete C. Sugere-se
que o Velvet, ao realizar o assembling, não obteve o k necessário para formar o contig.
O segundo gap fechado estava entre os contigs 1 e 4. O processo realizado foi mais trabalhoso,
uma vez que foi necessária a realização de dois primers walking para identificar a posição do gap em
ambos os contigs e assim identificar a sequência de 41 bp para o fechamento do gap. O contig 5 e o
contig 6 eram relativamente pequenos quando comparados com os demais, sendo de 902 e 349 bp,
respectivamente, supondo que poderiam estar correlacionados de alguma forma, seja por um overlap
ou mesmo por um gap. Então, novamente utilizando o princípio do primer walking, foi possível concluir
que entre os dois contigs havia um gap de 15 bp e ainda o contig 5 estava na posição de reverso
complemento.
Além disso, o fosmídio era composto por três contigs maiores. Uma vez que as extremidades
livres do contig 1 e do contig 2 eram compostas por vetor e eram coesivas, não haveria mais ligação de
fragmento exógeno de DNA no local. Com isso, depois das montagens dos fosmídios anteriores, uma
busca simples por sobreposição foi realizada entre os contigs 4 e 6, e desta forma mais um gap foi
fechado. A sequência do contig 4 estava em posição de reverso complemento com uma sobreposição de
13 bp com o contig 6. Finalmente, com dois grandes contigs a mesma busca simples por sobreposição
foi realizada, foi fechado então o último gap, havendo uma sobreposição de 9 bp entre os contigs 3 e 5.
O processo fica mais claro de ser compreendido através da Figura 11.
Entre todas as etapas de fechamento dos gaps, foram realizadas análises complementares
utilizando o Python 2.7 para confirmação das sobreposições e das sequências obtidas através do
método descrito acima.
53
Figura 11. Esquema de montagem do Fosmídio H5.
Sobreposição de 13 pb
Sobreposição de 9 pb
54
4.4.2. Características gerais dos fosmídios
As características gerais dos insertos dos 3 clones fosmidiais estudados estão descritas na Tabela
7.
Tabela 7. Resumo das características gerais dos três fragmentos metagenômicos analisados. Os números à frente
de cada fosmídio referem-se ao valor da tensão superficial analisada pelo médo Du-Nouy. A unidade de medida é
mN/m2
Dados
Fosmídio A6 (47,1) Fosmídio F10 (45,0) Fosmídio H5 (42,6)
N° % de Assembled
N° % de Assembled
N° % de Assembled
N° de sequências 1 100,00% 1 100,00% 1 100,00%
N° de nucleotídios 24.878 100,00% 43.995 100,00% 31.586 100,00%
% GC 16.133 64,85% 26.711 60,71% 20314 64,31%
Genes
Genes de RNA 1 3,45% * * * *
Genes de tRNA 1 3,45% * * * *
Genes de codificam proteínas
28 96,55% 46 100,00% 25 100,00%
Genes com classificação em:
16 55,17% 35 70,09% 18 72,00%
COG 18 62,07% 36 78,26% 17 68,00%
Pfam 21 72,41% 39 84,78% 23 92,00%
KO 10 34,48% 21 45,65% 7 28,00%
Enzyme 4 13,79% 12 20,09% 3 1,00%
MetaCyc 2 6,90% 9 19,17% 2 8,00%
KEGG 3 10,34% 13 28,26% 5 20,00%
COG Clusters 17 0,35% 40 0,82% 20 0,41%
Pfam Clusters 33 0,22% 56 0,38% 42 0,28%
Os produtos dos genes preditos foram divididos em categorias funcionais de acordo com a lista
fornecida pelo agrupamento de grupos ortólogos de proteínas (COGs), conforme descrito na Tabela 8.
55
Tabela 8. Resumo do número total de ORFs encontradas para cada fosmídio atribuídas em categorias COG
estabelecidas.
Código COG
n° ORF Fosmídio
A6
n° ORF Fosmídio
F10
n° ORF Fosmídio
H5
Categorias funcionais
E 1 3 1 Transporte e metabolismo de aminoácidos
G 1 1 1 Transporte e metabolismo de carboidratos
P 0 5 0 Transporte e metabolismo de íons inorgânicos
I 1 2 0 Transporte e metabolismo de lipídios
F 0 3 0 Transporte e metabolismo de nucleotídeos
U 0 4 0 Tráfico intracelular, secreção e transporte vesicular
V 1 0 0 Mecanismo de defesa
L 1 2 2 Replicação, recombinação e reparo
D 0 2 1 Controle de ciclo celular, divisão celular e divisão cromossômica
M 1 2 0 Biossíntese de parede celular/membrana/envelope
H 0 2 1 Transporte e metabolismo de coenzimas
C 0 1 1 Produção e conversão de energia
R 3 6 14 Predição funcional geral
O 6 0 1 Modificação pós-traducional e chaperonas
T 1 5 2 Mecanismos de transdução de sinal
K 1 4 0 Transcrição
J 0 2 0 Tradução, estrutura ribossomal e biogênise
S 2 3 1 Função desconhecida
Nenhum marcador taxonômico conhecido, como RNA ribossomal 16S, estava presente nas
sequências metagenômicas analisadas. Portanto, a origem taxonômica dos insertos foi predita com o
auxílio do programa IMG/MER, que baseia-se em homologia de sequências que codificam proteínas
disponíveis no BLAST (Markowitz et al. 2012). Os resultados da predição sugeriram que o fragmento
fosmidial A6 pertence ao filo Proteobacteria, o fragmento H5 ao filo Chloroflexi e o fragmento F10 ao filo
Acidobacteria. O fosmídio A6 apresentou uma sequência completa de RNA transportador (tRNA) com 76
bp. Esta sequência foi submetida ao BLASTn, apresentando 95% de similaridade com o micro-organismo
Desulfovibrio alaskensis (n° de acesso CP000112.1), corroborando com a análise do IMG, uma vez que
essa espécie pertence à classe Deltaproteobacteria. As espécies de Desulfovibrio são moderadamente
halofílicas, mesófilas, estritamente anaeróbias e sulfato-redutoras. A conversão de energia para sua
sobrevivência é decorrente da sua habilidade de utilização do sulfato em seu processo metabólico,
fermentando ácidos orgânicos e vivendo em associações sintróficas (Feio et al. 2004; Hauser et al.
2011). No geral, o sedimento de um manguezal é composto por uma fina camada superficial aeróbia e
os sedimentos mais profundos são anaeróbios, sendo nessa segunda camada onde ocorrem os
56
principais processos de degradação da matéria orgânica. Esse processo se dá devido à presença de
micro-organismos anaeróbios redutores de sulfato (Nedwell et al. 1994). No mangue de Goa, na Índia,
quatro espécies de Desulfovibrio foram isoladas, dentre elas D. desulfuricans, D. aestuarii, D. salexigens
e D. orientalis (Loka-Bharanthi et al. 1991). Os autores relatam que esse gênero bacteriano é
nutricionalmente versátil, pois tem a habilidade de metabolizar uma variedade de compostos simples
incluindo lactato, acetato, propionato, butirato e benzoato. A habilidade de uso de diferentes substratos
no manguezal permite que esses micro-organismos compitam eficientemente por nutrientes no
ambiente (Loka-Bharanthi et al. 1991), embora essa versatilidade esteja presente em outros gêneros de
micro-organismos associados à rizosfera (Bashan & Holguin, 1997). No sedimento do mangue, a
disponibilidade de ferro e fósforo depende da atividade de bactérias sulfato-redutoras. Em condição de
anóxia, o fosfato reage com o oxi-hidróxido, criando um composto insolúvel de FeOOH-PO4. Quando o
sulfato é reduzido pelos micro-organismos sulfato-redutores são formados compostos de sulfatos
solúveis, H2S e HS. Esse sulfato solúvel reage com o ferro, reduzindo Fe3 em Fe2 e produzido pirita (FeS2).
A pirita é o principal produto da redução de sulfato em salinas (Sherman et al. 1998). Os micro-
organismos redutores de sulfato representam os principais decompositores de matéria orgânica no
mangue e desempenham um papel importante na mineralização do enxofre orgânico e na produção de
ferro e fósforo solúveis utilizados por outros organismos associados ao ecossistema do manguezal
(Holguin et al. 2001).
O fragmento fosmidial H5 apresentou sete genes (28%) de similaridade com o filo Chloroflexi.
Esse filo é representado por bactérias filamentosas e é bastante diversificado, incluindo micro-
organismos aeróbicos e anaeróbicos termófilos, filamentosos fototróficos anoxigênicos, e anaeróbicos
com respiração organo-halógena, que utilizam compostos halógenos como aceptores de elétrons. Esse
filo tem sido estimado como comunidade dominante em alguns ambientes marinhos, podendo chegar
até 16% do total da comunidade. Também podem ser encontrados em ambientes salinos mesófilos e
hipersalinos. Entretanto, muitas espécies bacterianas pertencentes ao filo Chloroflexi foram encontradas
nesses ambientes em forma não cultivada, apenas baseado em estudos do gene RNAr 16S. Além disso,
ainda são poucos os estudos de fisiologia desse grupo de micro-organismos (Krzmarzick et al. 2013).
Nas análises realizadas pelo IMG-MER, o fragmento do fosmídio F10 apresentou sete genes
(15,22%) com o filo Acidobacteria, sete (15,22%) com o filo Proteobacteria e 15 sequências não foram
afiliadas a qualquer filo conhecido. Entretanto, na anotação manual realizada pelo BLASTx, 21 genes
foram afiliados ao filo Acidobacteria, sendo que alguns genes tiveram até 83% de similaridade com
57
Thermoanaerobaculum aquaticum. A maioria dos micro-organismos do filo Acidobacteria não tem
representantes cultivados, entretanto, nos estudos utilizando RNA ribossomal 16S, esse grupo de micro-
organismos tem sido amplamente detectado em uma variedade de ambientes, como solo (Zimmermann
et al. 2005; Chan et al. 2006), águas termais (Barns et al. 1999), pântanos (Juottonen et al. 2005; Dedysh
et al. 2006), esponjas marinhas (Hentschel et al. 2002) e mangue (Andreote et al. 2012). Embora os
micro-organismos do filo Acidobacteria sejam ubíquos e abundantes, o nosso conhecimento sobre este
filo ainda é limitado, uma vez que não existem muitas espécies descritas e caracterizadas.
4.4.3. Anotação dos fosmídios
4.4.3.1. Anotação do fosmídio A6
Após o fechamento dos gaps como descrito acima, os dados foram submetidos para o IMG/
MER. As funções preditas para as 28 ORFs detectadas no fosmídio A6 são descritas na Tabela 9, com
informação referente ao tamanho das regiões codificantes em nucleotídeos e suas referências
relacionadas à base de dados COG. Para 18 ORFs foi possível atribuir funções, enquanto dez ORFs
permaneceram com função desconhecida
58
Tabela 9. ORFs anotadas do fosmídio A6 proveniente da biblioteca metagenômica de manguezal
Identificação do Gene
Nome do gene Início Final Tamanho (bp) ID COG Função COG
FOSA6_1011 Acetylornithine deacetylase/Succinyl-diaminopimelate desuccinylase and related deacylases
3 1061 1059 COG0624 Acetylornithine deacetylase/Succinyl-diaminopimelate desuccinylase and
related deacylases
FOSA6_10110 hypothetical protein 7136 7687 552 *
FOSA6_10111 Glycine/sarcosine/betaine reductase selenoprotein B (GRDB)
7759 8241 483 *
FOSA6_10112 hypothetical protein 8251 8508 258 *
FOSA6_10113 hypothetical protein 8584 8937 354 *
FOSA6_10114 ABC-type multidrug transport system, ATPase and permease components
9075 10376 1302 COG1132 ABC-type multidrug transport system,
ATPase and permease components
FOSA6_10115 Putative protein-S-isoprenylcysteine methyltransferase
10381 10956 576 COG2020 Putative protein-S-isoprenylcysteine
methyltransferase
FOSA6_10116 hypothetical protein 11324 11695 372 *
FOSA6_10117 hypothetical protein 11727 12425 699 COG0478 RIO-like serine/threonine protein kinase
fused to N-terminal HTH domain
FOSA6_10118 hypothetical protein 12445 13659 1215 COG4717 Uncharacterized conserved protein
FOSA6_10119 hypothetical protein 13887 14294 408
FOSA6_1012 Acetyl-CoA acetyltransferase 1112 1318 207 COG0183 Acetyl-CoA acetyltransferase
FOSA6_10120 hypothetical protein 14321 15148 828 COG4717 Uncharacterized conserved protein
FOSA6_10121 DNA repair exonuclease 15148 16398 1251 COG0420 DNA repair exonuclease
FOSA6_10122 hypothetical protein 16403 17113 711
FOSA6_10123 Hydrogenase maturation factor 17113 18132 1020 COG0309 Hydrogenase maturation factor
FOSA6_10124 Hydrogenase maturation factor 18129 19235 1107 COG0409 Hydrogenase maturation factor
FOSA6_10125 Hydrogenase maturation factor 19232 19459 228 COG0298 Hydrogenase maturation factor
FOSA6_10126 yrdC domain 19628 21838 2211 COG0068 Hydrogenase maturation factor
FOSA6_10127 Ni2+-binding GTPase involved in regulation of expression and maturation of urease and hydrogenase
21985 22656 672 COG0378 Ni2+-binding GTPase involved in
regulation of expression and maturation of urease and hydrogenase
Continuação da Tabela 9.
59
FOSA6_10128 Zn finger protein HypA/HybF (possibly regulating hydrogenase expression)
22692 23060 369 COG0375 Zn finger protein HypA/HybF (possibly
regulating hydrogenase expression)
FOSA6_10129 Nucleoside-diphosphate-sugar epimerases
23229 24746 1518 COG0451 Nucleoside-diphosphate-sugar epimerases
FOSA6_1013 hypothetical protein 1455 1739 285 *
FOSA6_1015 hypothetical protein 2383 2601 219 COG1664 Integral membrane protein CcmA involved
in cell shape determination
FOSA6_1016 Predicted permease 2675 3829 1155 COG0628 Predicted permease
FOSA6_1017 hypothetical protein 3832 4125 294 *
FOSA6_1018 Predicted Zn-dependent peptidases 4768 6396 1629 COG0612 Predicted Zn-dependent peptidases
FOSA6_1019 hypothetical protein 6973 7173 201 *
60
A organização das ORFs presentes no inserto fosmidial encontra-se ilustrada na Figura 12.
A próxima etapa do trabalho foi a busca por possíveis genes que codificassem
biossurfactantes. De acordo com a literatura, os biossurfactantes são moléculas basicamente compostas
de lipídios e carboidratos, então as buscas se concentraram primeiramente em genes que codificam
esses tipos de moléculas. Foi identificada uma ORF (FOSA6_1012) que codifica uma enzima no
metabolismo de lipídio, acetil-CoA acetiltransferase, pertencente à família das tiolases (pfam00108).
Analisando a via metabólica de síntese de ácidos graxos através da plataforma KEGG (Figura 13), essa
enzima poderia estar relacionada à produção de biossurfactante, uma vez que pertence à via de 3-oxo-
hexanoil-CoA. Essa molécula já foi descrita no sistema de quorum sensing que está diretamente
relacionado com a regulação de genes envolvidos na produção de biossurfactante em micro-organismos
marinhos (Satpute et al. 2010).
Posteriormente, foi realizada a busca por genes que codificam moléculas de carboidrato,
sendo identificado um gene para nucleosideo-difosfato epimerase pertencente à família epimerase
(pfam01370). Essa enzima é produzida pela espécie de Bacillus subtilis em condição limitante de fosfato.
Ela catalisa a hidrólise de nucleosídeo-difosfato em nucleosídeo, fosfato inorgânico e açúcar (Mauck &
Glaser, 1970). Sendo assim, não há evidência que este gene possa estar envolvido na síntese de
biossurfactante. Nesse fosmídio ainda existem algumas proteínas hipotéticas, sendo possíveis alvos de
clonagem em estudos futuros.
Embora esse não seja o foco do trabalho, não podemos deixar de ressaltar que um cluster
gênico que codifica para hidrogenases foi predito nesse fosmídio. Foram identificados cinco genes da
Figura 12. Representação esquemática do inserto totalmente sequenciado do fosmídio A6 derivado da biblioteca
metagenômica. As diferentes cores indicam as categorias funcionais dos genes codificando proteínas putativas.
Genes relacionados ao transporte e metabolismo de aminoácidos (categoria E); Genes relacionados ao
transporte e metabolismo de lipídios (categoria I); Genes relacionados a bissíntese de parede, membrana e
envelope celular (categoria M); Genes relacionados a predição functional geral (categoria R); Genes
relacionados a mecanismos de defesa (categoria V); Genes relacionados modificação pós-traducional e
chaperonas (categoria O); Genes relacionados a mecanismos de transdução de sinal (categoria T); Genes
relacionados a replicação, recombinação e reparo do DNA (categoria L); Genes relacionados ao metabolismo e
transporte de carboidratos (categoria G); Gene de tRNA; Genes sem classificação.
61
enzima, e através da ORF FOSA6_10126 foi possível classificá-la dentro da classe das NiFe-hidrogenases.
Entretanto, para a completa maturação das hidrogenases é necessário um complexo que envolve pelo
menos sete proteínas, o qual é conhecido por Hyp. Dentro desse complexo estão as proteínas HypA – F
e uma endopeptidase. Esse conjunto de proteínas direciona a síntese e incorporação do metal (Ni ou Fe)
no centro na enzima, sendo essencial na via metabólica (Mulrooney & Hausinger, 2003). O metabolismo
de hidrogênio tem se mostrado essencial nas espécies de Desulfovibrio (Hauser et al. 2011),
corroborando assim a afiliação filogenética do inserto do fosmídio A6.
62
Figura 13. Via metabólica de ácidos graxos. A ORF FOSA6_1012 anotada no fosmídio A6, participa em dois processos do metabolismo, os quais estão
evidenciados na cor rosa. (fonte: IMG/MER)
63
4.4.3.2. Anotação do fosmídio F10
A anotação do fosmídio F10 também foi realizada com a ferramenta IMG/MER. Um total de 46
ORFs foi predito, sendo possível atribuir alguma função para 36 delas. A organização das ORFs presentes
no inserto fosmidial encontra-se ilustrada na Figura 14. As informações referentes ao tamanho das
regiões codificantes em nucleotídeos e suas referências relacionadas à base de dados COG estão
descritas na Tabela 10.
Figura 14. Representação esquemática do inserto totalmente sequenciado do fosmídio F10 derivado da biblioteca
metagenômica. As diferentes cores indicam as categorias funcionais dos genes codificando proteínas putativas.
Genes ralacionados ao transporte e metabolismo de aminoácidos (categoria E); Genes relacionados ao
transporte e metabolismo de nucleotídeos (categoria F); Genes relacionados à predição funcional geral (categoria R);
Genes relacionados ao transporte e metabolismo de íons inorgânicos Genes sem classificação; Genes
relacionados ao metabolismo e transporte de carboidratos (categoria G); Genes relacionados ao transporte e
metabolismo de co-enzimas (categoria H); Genes relacionados ao transporte e metabolismo de lipídios (categoria I);
Genes relacionados a transcrição (categoria K); Genes com função desconhecida (categoria S); ); Genes
relacionados a replicação, recombinação e reparo do DNA (categoria L); Genes relacionados ao tráfico intracelular,
secreção e transporte vesicular (categoria U); Genes relacionados a biossíntese de parede, membrana e envelope
celular (categoria M); Genes relacionados a mecanismos de transdução de sinal (categoria T); Genes
relacionados ao controle de ciclo celular, divisão celular e divisão cromossômica (categoria D).
64
Tabela 10. ORFs anotadas no fosmídio F10 proveniente da biblioteca metagenômica de manguezal
Identificação do
Gene Nome do Gene Início Final
Tamanho
(bp) COG ID Função COG
FOSF10_10011 hypothetical protein 46 171 126 COG0174 Glutamine synthetase
FOSF10_10012 Cytidylate kinase 236 1042 807 COG1102 Cytidylate kinase
FOSF10_10013 Cytidylate kinase 1524 2951 1428
COG0517;
COG1102;
COG4109
FOG: CBS domain; Cytidylate kinase; Predicted
transcriptional regulator containing CBS domains
FOSF10_10014 Di- and tricarboxylate
transporters 2944 3489 546 COG0471 Di- and tricarboxylate transporters
FOSF10_10015 Di- and tricarboxylate
transporters 3486 4517 1032 COG0471 Di- and tricarboxylate transporters
FOSF10_10016 Carbonic anhydrase 4564 5202 639 COG0288 Carbonic anhydrase
FOSF10_10017 hypothetical protein 5723 6367 645 *
FOSF10_10018 Glycine/serine
hydroxymethyltransferase 6416 7720 1305 COG0112 Glycine/serine hydroxymethyltransferase
FOSF10_10019 Ribose 5-phosphate isomerase
RpiB 7717 8148 432 COG0698 Ribose 5-phosphate isomerase RpiB
FOSF10_100110 dGTP triphosphohydrolase 8159 9493 1335 COG0232 dGTP triphosphohydrolase
FOSF10_100111 Folylpolyglutamate synthase 9490 10536 1047 COG0285 Folylpolyglutamate synthase
FOSF10_100112 hypothetical protein 10678 10821 144 COG0777 Acetyl-CoA carboxylase beta subunit
FOSF10_100113 Acetyl-CoA carboxylase beta
subunit 10842 11477 636 COG0777 Acetyl-CoA carboxylase beta subunit
FOSF10_100114 Tup N-terminal 11594 11821 228 *
FOSF10_100115 Serine/threonine protein kinase 11837 14632 2796
COG0515;
COG0745;
COG0810;
COG3827
Serine/threonine protein kinase; Response regulators
consisting of a CheY-like receiver domain and a
winged-helix DNA-binding domain; Periplasmic protein
TonB, links inner and outer membranes;
Uncharacterized protein conserved in bacteria
FOSF10_100116 Uncharacterized conserved
protein 14834 15583 750 COG0217 Uncharacterized conserved protein
65
Continuação da Tabela 10.
FOSF10_100117 Holliday junction resolvasome,
endonuclease subunit 15596 16081 486 COG0817 Holliday junction resolvasome, endonuclease subunit
FOSF10_100118 Biopolymer transport proteins 16307 16918 612 COG0811 Biopolymer transport proteins
FOSF10_100119 Biopolymer transport protein 16933 17397 465 COG0848 Biopolymer transport protein
FOSF10_100120 Biopolymer transport protein 17410 17907 498 COG0848 Biopolymer transport protein
FOSF10_100121 Gram-negative bacteria tonB
protein 17919 18641 723 COG0810
Periplasmic protein TonB, links inner and outer
membranes
FOSF10_100122 hypothetical protein 18651 19304 654 *
FOSF10_100123 hypothetical protein 19445 20755 1311 COG3851;
COG4783
Signal transduction histidine kinase, glucose-6-
phosphate specific; Putative Zn-dependent protease,
contains TPR repeats
FOSF10_100124 Cell division protein 20877 21731 855 COG2177 Cell division protein
FOSF10_100125 Predicted ATPase involved in cell
division 21728 22396 669 COG2884 Predicted ATPase involved in cell division
FOSF10_100126 Uncharacterized conserved
protein 22433 23227 795 COG1496 Uncharacterized conserved protein
FOSF10_100127 Predicted Fe-S-cluster redox
enzyme 23215 24246 1032 COG0820 Predicted Fe-S-cluster redox enzyme
FOSF10_100128 hypothetical protein 24262 24624 363 *
FOSF10_100129 Predicted phosphotransferase
related to Ser/Thr protein kinases 24714 25673 960 COG3178
Predicted phosphotransferase related to Ser/Thr
protein kinases
FOSF10_100130 Sec-independent protein
secretion pathway components 25707 25907 201 COG1826
Sec-independent protein secretion pathway
components
FOSF10_100131 FOG: GAF domain 25959 27140 1182 COG2199;
COG2203 FOG: GGDEF domain; FOG: GAF domain
FOSF10_100132 Stress-induced morphogen
(activity unknown) 27215 27499 285 COG0271 Stress-induced morphogen (activity unknown)
FOSF10_100133 Selenocysteine lyase 27519 28724 1206 COG0520 Selenocysteine lyase
FOSF10_100134 Transcriptional regulators 28733 29425 693 COG1802 Transcriptional regulators
FOSF10_100135 hypothetical protein 29516 30634 1119 *
66
Continuação da Tabela 10.
FOSF10_100136 Cytochrome bd-type quinol
oxidase, subunit 1 30631 32151 1521 COG1271 Cytochrome bd-type quinol oxidase, subunit 1
FOSF10_100137 Fe2+/Zn2+ uptake regulation
proteins 32416 32883 468 COG0735 Fe2+/Zn2+ uptake regulation proteins
FOSF10_100138 Tyrosyl-tRNA synthetase 33119 34354 1236 COG0162 Tyrosyl-tRNA synthetase
FOSF10_100139 hypothetical protein 34462 36372 1911 *
FOSF10_100140 CDP-alcohol
phosphatidyltransferase 36379 37314 936 *
FOSF10_100141 Ferritin-like protein 37412 37927 516 COG1528 Ferritin-like protein
FOSF10_100142
Glutathione synthase/Ribosomal
protein S6 modification enzyme
(glutaminyl transferase)
37934 38800 867 COG0189 Glutathione synthase/Ribosomal protein S6
modification enzyme (glutaminyl transferase)
FOSF10_100143 hypothetical protein 39045 40421 1377 *
FOSF10_100144 Histidine kinase-, DNA gyrase B-,
and HSP90-like ATPase 40424 42613 2190
COG2205;
COG2229;
COG3604
Osmosensitive K+ channel histidine kinase; Predicted
GTPase; Transcriptional regulator containing GAF,
AAA-type ATPase, and DNA binding domains
FOSF10_100145 hypothetical protein 42678 43589 912 *
FOSF10_100146 hypothetical protein 43740 43994 255 *
67
Conforme descrito para o fosmídio A6, as buscas se concentraram primeiramente em genes
que codificam moléculas de caboidratos e lipídios. O primeiro gene a ser investigado foi o da ORF
FOSF1_10019, ribose-5-fosfato isomerase, pertencente à familia LacAB_rpiB (pfam 02502). Este gene,
particularmente detectado neste fosmídio, está envolvido no metabolismo de pentose fosfato (Figuras
15 e 16). A enzima ribose-5-fosfato isomerase (Rpi, EC 5.3.1.6) é responsável por catalisar a conversão
reversível de aldose fosfato-ribose-5-fosfato (R5P) em metabolismo de pentose fosfato não oxidativo,
também está envolvida no ciclo de Kevin e no processo de fotossíntese (Ishikawa et al. 2002). Sendo
assim, também não há evidência que este gene esteja envolvido na síntese de biossurfactante.
Outras ORFs analisadas foram a FOSF10_10012 e FOSF10_10013. Embora para a primeira ORF
a predição não tenha atribuído nome ao produto gênico (proteína hipotética), foi predita a função de
metabolismo e transporte de lipídios no COG, sendo uma enzima com função de acetil-CoA carboxilase
de sub-unidade beta (pfam01039, pfam07282, pfam13719). A mesma classificação foi dada à ORF
FOSF10_10013. Analisando essa enzima no mapa KEGG, ela está envolvida no metabolismo de
propanoato, em fixação de carbono em procariotos, biossíntese de ácidos gráxos e metabolismo de
tetraciclina. Em todas essas vias a enzima é responsável na conversão de acetil-CoA em metonil-CoA.
Outro conjunto gênico que poderia estar envolvido no transporte de biossurfactante, são as
ORFS FOSF10_100118, FOSF10_100119 e FOSF10_100120, sendo proteínas envolvidas no transporte de
biopolímeros. Entretanto todas essas proteínas são da família ExbB/ExbD, que estão diretamente
envolvidas com a proteína TonB. O sistema multiproteico TonB envolve proteínas da membrana
citoplasmática e proteínas externas à membrana. Ainda não está claro o mecanismo de ação dessas
proteínas, entretanto é sabido que as proteínas TonB, ExbB e ExbD são requeridas no processo de
transporte de energia através da membrana citoplasmática. Em Escherichia coli essas proteínas estão
envolvidas no complexo de sideróforos, no transporte de vitamina B12 e colicinas e (Postle, 2007).
68
Figura 15. Via metabólica de pentose fosfato. A ORF FOSF1_10019 anotada do fosmídio F10, corresponde à enzima que participa na conversão de D-ribulose
5P em D-ribose 5P e vice-versa, a qual está evidenciada na cor rosa (5.3.1.6). (fonte: IMG/MER)
69
Figura 16. Via metabólica de fixação de carbono em organismos fotossintéticos. Neste processo A ORF FOSF1_10019 anotada no fosmídio F10, corresponde à
enzima que participa somente na conversão de D-ribose 5P em D-ribulose 5P, a qual está evidenciada na cor rosa (5.3.1.6). (fonte: IMG/MER)
70
4.4.3.3. Anotação do fosmídio H5
A anotação do fosmídio H5 também foi realizada com a ferramenta IMG/MER. Um total de 25
ORFs foi predito, sendo que foi possível atribuir alguma função para 17 delas. A organização das ORFs
presentes no inserto fosmidial encontra-se ilustrada na Figura 17. As informações referentes ao
tamanho das regiões codificantes em nucleotídeos e suas referências relacionadas à base de dados COG
estão descritas na Tabela 11.
Embora o fosmídio H5 tenha apresentado a melhor redução na tensão superficial, foi
detectado somente uma ORF (FOSH5_100123) relacionada ao metabolismo de carboidrato, classificada
em pfam07690, sendo uma proteína transportadora da superfamília de facilitadores (MFS). Essa classe
de proteínas é responsável pelo transporte secundário de pequenas moléculas através do gradiente
quimiosmótico (Paulsen et al. 1998; Gould et al. 1998). As proteínas MSF foram originalmente descritas
com a função de absorção de açúcar, mas estudos revelaram que também estão envolvidas no sistema
de efluxo de antibióticos, de metabólitos gerados no ciclo de Krebs, na transformação de
organofosforados em fosfato, dentre outras. Esses estudos mostraram que as MFS são mais difundidas
no ambiente do que se imaginava e com as mais diversas funções. Hoje, são conhecidos 17 subgrupos
dessa proteína e mais de 4.900 espécies bacterianas possuem esse sistema de efluxo MSF (Pao et al.
1998). Analisando essa ORF na categoria COG, foi possível observar que é uma proteína envolvida no
efluxo de arabinose (COG2814). Com essas evidências podemos concluir que essa ORF não está
envolvida na síntese ou transporte de algum biossurfactante.
De acordo com a classificação COG, a ORF FOSH5_10017, está relacionada a lipoproteínas
periplasmáticas (COG5633) e na função pfam está relacionada à formação de lipídios (pfam06474).
Figura 17. Representação esquemática do inserto totalmente sequenciado do fosmídio H5 derivado da biblioteca
metagenômica. As diferentes cores indicam as categorias funcionais dos genes codificando proteínas putativas.
Genes relacionados a predição funcional geral (categoria R); Genes relacionados a mecanismos de transdução de
sinal (categoria T); Genes sem classificação; Genes relacionados ao controle de ciclo celular, divisão celular e divisão cromossômica (categoria D); Genes relacionados ao transporte e metabolismo de co-enzimas (categoria H);
Genes relacionados com a produção e conversão de energia (categoria C) e Genes relacionados ao metabolismo e transporte de carboidratos (categoria G).
71
Entretanto, essa relação não está bem elucidada, não sendo assim possível afirmar se seria um alvo para
clonagem e estudos posteriores ou não.
72
Tabela 11. ORFs anotadas no fosmídio H5 proveniente da biblioteca metagenômica de manguezal.
Gene ID Nome do gene Início Final Tamanho
(pb) COG ID Função COG
FOSH5_10011 Uncharacterized protein, 4-oxalocrotonate
tautomerase homolog 82 288 207 COG1942
Uncharacterized protein, 4-oxalocrotonate
tautomerase homolog
FOSH5_10012 Putative homoserine kinase type II (protein kinase
fold) 374 1273 900 COG2334
Putative homoserine kinase type II (protein
kinase fold)
FOSH5_10013 hypothetical protein 1529 1972 444 COG3903 Predicted ATPase
FOSH5_10014 hypothetical protein 1920 4052 2133 COG3899 Predicted ATPase
FOSH5_10015 DNA-binding transcriptional activator of the SARP
family 4150 5208 1059
COG3629;
COG3899
DNA-binding transcriptional activator of the
SARP family; Predicted ATPase
FOSH5_10016 hypothetical protein 5397 5693 297 *
FOSH5_10017 MLTD_N 5749 6237 489 COG5633 Predicted periplasmic lipoprotein
FOSH5_10018 hypothetical protein 6275 9883 3609 COG2866;
COG3401
Predicted carboxypeptidase; Fibronectin type
3 domain-containing protein
FOSH5_10019 Predicted ATPase 10033 13767 3735
COG3629;
COG3899;
COG3903
DNA-binding transcriptional activator of the
SARP family; Predicted ATPase; Predicted
ATPase
FOSH5_100110 hypothetical protein 13782 14174 393 *
FOSH5_100111 Thrombospondin type 3 repeat 14452 18294 3843 *
FOSH5_100112 Cysteine protease 18422 20002 1581
COG3087;
COG4870;
COG5513
Cell division protein; Cysteine protease;
Predicted secreted protein
FOSH5_100113 Protein of unknown function (DUF998) 20498 20746 249 *
FOSH5_100114 hypothetical protein 20768 21250 483 *
FOSH5_100115 hypothetical protein 21250 22449 1200 *
FOSH5_100116 Acetyltransferases 22651 23724 1074 COG0456 Acetyltransferases
FOSH5_100117 Predicted esterase of the alpha-beta hydrolase
superfamily 23823 24791 969 COG1752
Predicted esterase of the alpha-beta hydrolase
superfamily
Continuação da Tabela 11.
73
FOSH5_100118 Conserved protein/domain typically associated
with flavoprotein oxygenases, DIM6/NTAB family 24832 25005 174 COG1853
Conserved protein/domain typically associated
with flavoprotein oxygenases, DIM6/NTAB
family
FOSH5_100119 Methylase involved in ubiquinone/menaquinone
biosynthesis 25054 25716 663 COG2226
Methylase involved in
ubiquinone/menaquinone biosynthesis
FOSH5_100120 NADPH:quinone reductase and related Zn-
dependent oxidoreductases 25713 26747 1035 COG0604
NADPH:quinone reductase and related Zn-
dependent oxidoreductases
FOSH5_100121 SUR7/PalI Family 26785 27297 513 *
FOSH5_100122 Major Facilitator Superfamily 27314 27487 174 *
FOSH5_100123 Major Facilitator Superfamily 27484 28572 1089 COG2814 Arabinose efflux permease
FOSH5_100124 Exopolyphosphatase-related proteins 28585 29595 1011 COG0618 Exopolyphosphatase-related proteins
FOSH5_100125 Phosphotransacetylase 29613 31586 1974 COG0280;
COG0857
Phosphotransacetylase; BioD-like N-terminal
domain of phosphotransacetylase
74
5. CONCLUSÕES
Embora a metagenômica seja uma ferramenta poderosa para acessar de maneira mais
abrangente a diversidade microbiana total, permitindo a análise de genes funcionais de membros da
microbiota, principalmente de micro-organismos não-cultivados, e a descoberta de novos produtos
naturais, infelizmente não obtivemos sucesso com essa abordagem na busca de biossurfactantes em
sedimentos de manguezal.
Após os obstáculos encontrados em relação à bactéria hospedeira, E. coli EPI-300, e o árduo
trabalho de screening, a perspectiva de que três fosmídios pudessem ter genes de biossurfactantes por
apresentarem redução da tensiometria foi grande. Com o sequenciamento e análise de cada uma das
ORFs dos fosmídios foi possível concluir que as chances de haver gene de biossurfactante nos clones
analisados são mínimas.
A via metabólica de biossurfactante é extremamente complexa, ela é composta por grandes
operons e, em alguns micro-organismos já estudados, outros genes que não fazem parte do operon
regulam a transcrição dos genes. Em Pseudomonas spp. a via de biossurfactante é regulada em duas
regiões diferentes do cromossomo e um complexo sistema de quorum-sensing regula o processo de
transcrição (Reis et al. 2011). Em Bacillus spp. a via de biossurfactante é regulada por um grande
operon, de aproximadamente 25 kb, entretanto, genes regulatórios que não fazem parte desse operon
são essenciais para a produção do biossurfactante (D’Souza et al. 1993). Em Acinetobacter spp. e
Serratia spp., as vias metabólicas não são tão bem elucidadas quanto os gêneros citados acima, mas do
que é conhecido, genes que não fazem parte do operon também são importantes para a produção de
biossurfactantes (Satpute et al. 2010).
Não há duvidas de que a a abordagem metagenômica é uma ferramenta poderosa para acessar
e explorar o potencial metabólico de uma dada microbiota, porém esta deve se mostrar mais profícua
na busca de compostos com vias metabólicas mais simples, que não envolvam genes presentes em
grandes operons ou localizados em outras regiões no cromossomo.
75
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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78
79
CAPÍTULO 2 Planejamento experimental e otimização da produção de
biossurfactantes nas linhagens Gordonia sp. CCMA-559 e Bacillus
safensis CCMA-560 isoladas de manguezal contaminado com petróleo
80
1. INTRODUÇÃO
Muitos micro-organismos procariotos e eucariotos sintetizam uma variedade de moléculas
anfifílicas com diferentes estruturas químicas. Esses compostos podem ser extracelulares ou ligados à
membrana da célula. Neu (1996) separou os compostos ativos em superfície (CASs) em dois grupos: os
CASs de baixo peso molecular, também chamados de biossurfactantes, e os de alto peso molecular, que
compreendem os polissacarídeos, proteínas, lipopolissacarídios, lipoproteínas ou uma mistura complexa
de biopolímeros. Como principais características, os CASs de baixo peso molecular são eficientes na
redução da tensão superficial e os CASs de alto peso molecular são bons estabilizadores de emulsão
(água-óleo), sendo também chamados de bioemulsificantes (Ron & Rosenberg, 2002).
Atualmente os biossurfactantes/bioemulsificantes tem ganho importância em aplicações de
MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery), biorremediação, indústrias de alimentos e indústrias
farmacêuticas devido às suas propriedades, como alta biodegradabilidade, baixa toxicidade, e estável
em condições extremas de pH, temperatura e salinidade. Entretanto, a produção em larga-escala desses
compostos ainda não é viável em função do baixo rendimento de produção e o alto custo de
recuperação e purificação do composto. Neste sentido, algumas alternativas têm sido adotadas para
tornar o processo mais economicamente atrativo, isto inclui o uso de matéria prima mais barata,
otimização no processo de produção, obtenção e purificação e desenvolvimento de cepas mutantes e
recombinantes.
A seleção de variáveis que interferem significativamente sobre a atividade de produção de
biossurfactantes pode ser feita variando-se um fator por vez ou através de métodos estatísticos. O
primeiro método é o procedimento experimental mais difundido e usual, e envolve o estudo de uma
variável por vez, “one-at-a-time”, no qual é avaliada uma das variáveis estudadas em diferentes
condições e as demais são fixadas. Este método negligencia possíveis interações entre os fatores por
não explorar completamente o espaço experimental. Além disso, experimentos com todas as
combinações de variáveis são praticamente impossíveis de reproduzir, levando em consideração,
principalmente, o número de ensaios. Tais limitações podem ser eliminadas empregando-se
planejamentos experimentais estatísticos que usam um número menor de medidas e exploram todo o
espaço experimental (Montgomery, 2007).
Inicialmente, quando se conhece pouco do processo, o ideal é utilizar metodologias de triagem
das condições de cultivo, entre elas o planejamento fatorial fracionado e o planejamento do tipo
Plackett - Burman (P&B), que promove a seleção de variáveis com foco na redução do número de
81
ensaios (Rodrigues & Iemma 2009). Nesta primeira triagem, recomenda-se avaliar o resultado e estimar
os efeitos principais de acordo com um modelo linear, e as variáveis que exibirem maior influência no
processo são selecionadas para novos estudos e otimização. Nesta segunda fase, a mais bem sucedida
técnica usada para análise e otimização das variáveis de um processo é conhecida por Delineamento
Composto Central Rotacional (DCCR), que possibilita a avaliação dos efeitos de cada variável
individualmente e de suas interações sobre uma dada resposta. Ao final, a metodologia de superfície de
resposta pode ser empregada para obtenção de um modelo teórico e dedução das condições otimizadas
(Rodrigues & Iemma, 2009). O planejamento estatístico de experimentos implica grande economia de
tempo e custos devido à diminuição considerável do número de ensaios necessários ao estudo de um
processo influenciado por diversas variáveis.
Neste contexto, a proposta desse capítulo foi a otimização do processo de produção de
biossurfactantes utilizando a metogologia de planejamento experimental.
2. OBJETIVOS
Avaliar a produção de biossurfactante das linhagens selecionadas;
Selecionar as variáveis que interferem na produção de biossurfactante através do planejamento
experimental do tipo Plackett–Burman;
Otimizar a produção do biossurfactante por meio do Delineamento Composto Central
Rotacional – DCCR (software STATISTICA 7.0);
Realizar o estudo cinético do processo otimizado de produção de biossurfactante.
82
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Linhagens bacterianas
As sete bactérias utilizadas neste estudo (Tabela 1) foram isoladas de sedimentos de manguezais
contaminados com petróleo, localizados em Bertioga, no âmbito do Projeto Temático “Biodiversidade e
Atividades Funcionais de Microrganismos de Manguezais do Estado de São Paulo” (Processo FAPESP n°
04/13910-6), coordenado pelo Dr. Itamar Soares de Melo. Estas bactérias são sabidamente produtoras
de biossurfactante e fazem parte do acervo de pesquisa da Coleção de Micro-organismos de
Importância Agrícola e Ambiental da Embrapa Meio Ambiente (Jaguariúna, SP).
Linhagem Identificação Preliminar Fonte de isolamento Referência
CCMA-553 Sphingomomas paucimobilis
Sedimento de
manguezal
contaminado com
petróleo
Reyes, 2009
CCMA-557 Nocardia brasiliensis
CCMA-558 Pseudomonas mendocina
CCMA-559 Gordonia rubripertincata
CCMA-560 Sem identificação
CCMA-561 Achromobacter xylosoxidans
CCMA-580 Pseudomonas stutzeri
3.2. Teste de emulsificação
Foi realizado o pré-inóculo em meio Caldo Nutriente e as culturas foram incubadas a 30° C por
24 horas sob agitação contínua de 150 rpm. Posteriomente, uma alíquota de 10 % (v/v) com
absorbância ajustada para DO600 = 0,150 ± 0,030 foi utilizada como inóculo nos ensaios em meio mineral
(5 g extrato de levedura; 1 g (NH4)2SO4; 6 g Na2HPO4; 3 g KH2PO4; 2,7 g NaCl; 0,6 g MgSO4 ∙7H2O, 1000
mL água destilada). Ao meio pronto foi adicionado 0,1 % (v/v) de solução de micronutrientes [10,95 g
ZnSO4∙ 7H2O; 5 g FeSO4∙ 7H2O; 1,54 g MnSO4∙ 7H2O; 0,39 g CuSO4∙ 5H2O; 0,25 g Co(NO3)2 6H2O; 0,17 g
Na2B4O7 10H2O]) acrescido de 1% de glicose, seguido de incubação a 30° C por 96 horas sob agitação
contínua de 150 rpm. As linhagens CBMAI 602 e CBMAI 707 foram utilizadas como controles biológicos
positivos, o Tween 80 como controle químico positivo, e como controle negativo foram utilizados o meio
de cultura sem inóculo e água.
Em um tubo de ensaio com rosca (10 x 130 mm) foram adicionados 1 mL do sobrenadante da
cultura livre de células e 1 mL de querosene. A solução foi homogeneizada vigorosamente em vórtex por
2 minutos e deixada em repouso por 24 horas à temperatura ambiente. Para avaliar a atividade
Tabela 1. Linhagens utilizadas neste trabalho
83
emulsificante, a altura da mistura foi mensurada bem como a altura da emulsão formada na interface.
Os valores foram aplicados na fórmula (Pruthi & Cameotra, 1997):
E24 =
3.3. Avaliação da produção de biossurfactantes
As duas linhagens bacterianas, CCMA-559 (Gordonia sp.) e CCMA-560 (Bacillus safensis), foram
reativadas em meio Ágar Nutriente e incubadas por 24 horas a 30°C. Posteriormente, uma única colônia
foi inoculada em meio Caldo Nutriente e incubada novamente por 24 horas a 30°C. Após o crescimento,
a cultura foi centrifugada e uma alíquota de 10 % (v/v) com absorbância ajustada para DO600 = 0,150 ±
0,030 foi utilizada como inóculo nos ensaios determinados com base no planejamento experimental.
3.3.1. Seleção de variáveis utilizando o planejamento experimental do tipo Plackett–Burman (P&B) no
processo de produção de biossurfactantes
Inicialmente foi realizado um planejamento Plackett-Burman para avaliação de 12 variáveis
(Tabela 2). Todas as diferentes variáveis foram preparadas em dois níveis, designados como -1 para o
inferior e +1 para o superior. Três ensaios no ponto central foram acrescentados à matriz para a
determinação do erro padrão durante a análise dos resultados.
84
As bactérias foram inoculadas em 50 mL de meio de cultura em frascos Erlenmeyer de 125 mL e
incubadas a 30° C por 96 horas sob agitação contínua de 150 rpm. O pH do meio de cultura foi ajustado
para 7,0 antes de autoclavar. A composição do meio de cultura bem como as concentrações neste
primeiro P&B para a produção de biossurfactante está descrita na Tabela 3. Em todos os frascos, foi
adicionado 0,01% de solução de elementos traços (0,625 g EDTA; 2,74 g ZnSO4; 1,25 g FeSO4.7H2O; 0,385
g MnSO4.7H2O; 0,098 g CuSO4.5H2O; 0,044g Na2B4O7.10H2O).
Tabela 2. Matriz do planejamento experimental Plackett-Burman com 12 variáveis. Variáveis reais e variáveis
codificadas (-1, 0 e +1).
Nº Exp. F1
(%)
F2
(%)
F3
(%)
F4
(%)
F5
(%)
F6
(%)
F7
(g/L)
F8
(g/L)
F9
(g/L)
F10
(g/L)
F11
(g/L)
F12
(%)
1 1(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 2(+1) 0(-1)
2 1(+1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 5(+)1 0(-1) 0(-1) 5(+1) 2(+1) 0(-1) 3(+1)
3 1(+1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 2(+1) 2(+1) 0(-1)
4 1(+1) 1(+1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 2(+1) 3(+1)
5 0(-1) 1(+1) 1(+1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 3(+1)
6 1(+1) 0(-1) 1(+1) 1(+1) 1(+1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 2(+1) 0(-1) 0(-1)
7 0(-1) 1(+1) 0(-1) 1(+1) 1(+1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 2(+1) 0(-1)
8 1(+1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 1(+1) 5(+1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 3(+1)
9 1(+1) 1(+1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 0(-1) 0(-1)
10 0(-1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 5(+1) 2(+1) 0(-1) 0(-1)
11 0(-1) 0(-1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 2(+1) 2(+1) 0(-1)
12 1(+1) 0(-1) 0(-1) 1(+1) 1(+1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 5(+1) 2(+1) 2(+1) 3(+1)
13 0(-1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 1(+1) 5(+1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 2(+1) 2(+1) 3(+1)
14 0(-1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 5(+1) 0(-1) 2(+1) 3(+1)
15 0(-1) 0(-1) 0(-1) 1(+1) 0(-1) 0(-1) 5(+1) 5(+1) 0(-1) 2(+1) 0(-1) 3(+1)
16 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1) 0(-1)
17(C) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 1(0) 1(0) 1,5(0)
18 (C) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 1(0) 1(0) 1,5(0)
19 (C) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 0,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 2,5(0) 1(0) 1(0) 1,5(0)
85
Tabela 3. Componentes do meio de cultura utilizados nos experimentos de Plackett-Burman e suas determinadas concentrações
Variáveis Constituintes do
meio Unidade -1 0 +1
F1 Sacarose % 0 0,5 1
F2 Hexadecano % 0 0,5 1
F3 Glicerol % 0 0,5 1
F4 Óleo de soja % 0 0,5 1
F5 Glicose % 0 0,5 1
F6 Uréia g/L 0 2,5 5
F7 (NH4)2SO4 g/L 0 2,5 5
F8 Peptona g/L 0 2,5 5
F9 Ex. levedura g/L 0 2,5 5
F10 K2HPO4 g/L 0 1 2
F11 KHHPO4 g/L 0 1 2
F12 NaCl % 0 1,5 3
Na primeira triagem foi utilizada a redução da tensão superficial (tensiometria) como resposta.
Para tal, foi analisada a tensão superficial do sobrenadante livre de células pelo método Du-Noi em
tensiômetro K-20 EasyDine – Krüss. Os resultados foram analisados pelo software STATISTICA 8. O nível
de significância de 10% (p <0,1) foi considerado para as variáveis que tiveram influência significativa na
redução da tensão superficial.
3.4. Otimização da produção de biossurfactante por meio do planejamento experimental do tipo
DCCR
Após o planejamento P&B, as variáveis significativas foram selecionadas e utilizadas no
Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), visando a otimização da produção de
biossurfactante. Estes experimentos foram realizados para obter um modelo de segunda ordem, que
poderá prever, ao final dos estudos, o melhoramento da produção de biossurfactante em função das
diferentes variáveis estudadas. Todos os experimentos foram realizados em um estudo randomizado, e
as distâncias dos pontos axiais foram calculadas pela equação:
α = (22)¼ ou α = (23)¼,
onde α é a distância dos pontos axiais e n o número de variáveis independentes.
86
Os dados foram tratados com o auxílio do software STATISTICA 8 (2325 13th Street Oriente,
Tulsa, OK, 74 104, EUA). A qualidade do ajuste da equação do modelo foi expressa pelo coeficiente de
determinação R2, e sua significância estatística foi determinada pelo teste F (análise de variância -
ANOVA). De acordo com os resultados do P&B, estratégias diferentes foram empregadas para cada
isolado.
3.4.1. Bacillus safensis CCMA-560
Com base nos efeitos do P&B, foi realizado um delineamento composto central rotacional
(DCCR) 23 com 3 repetições no ponto central capaz de avaliar o efeito de três variáveis sobre as
respostas (Tabela 3). Neste experimento foi estudada a influência dos fatores: concentração de peptona,
extrato de levedura e óleo de soja (Tabela 4). O inóculo inicial de cada ensaio foi realizado de acordo
com o item 2.3, sendo as demais condições de cultivo fixadas a 30° C, 96 horas e 150 rpm. Os fatores
hexadecano, glicerol, glicose e uréia foram eliminados, pois os níveis -1 estudados foi de 0 g/L. Os
demais elementos, bem como a sacarose, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4 e NaCl foram fixados no ponto
central.
Tabela 4. Matriz com as variáveis reais e codificadas do DCCR.
ENSAIOS Óleo de soja
(%)
Peptona
(g/L)
Ex. Levedura
(g/L)
1 1,2 (-1) 5,2 (-1) 5,2 (-1)
2 1,79 (1) 5,2 (-1) 5,2 (-1)
3 1,2 (-1) 5,79 (1) 5,2 (-1)
4 1,79 (1) 5,79 (1) 5,2 (-1)
5 1,2 (-1) 5,79 (1) 5,79 (1)
6 1,79 (1) 5,2 (-1) 5,79 (1)
7 1,2 (-1) 5,79 (1) 5,79 (1)
8 1,79 (1) 5,79 (1) 5,5 (1)
9 1 (-1,68) 5,5 (0) 5,5 (0)
10 2 (1,68) 5,5 (0) 5,5 (0)
11 1,5 (0) 5 (-1,68) 5,5 (0)
12 1,5 (0) 6 (1,68) 5,5 (0)
13 1,5 (0) 5,5 (0) 5 (-1,68)
14 1,5 (0) 5,5 (0) 6 (1,68)
15 1,5 (0) 5,5 (0) 5,5 (0)
16 1,5 (0) 5,5 (0) 5,5 (0)
17 1,5 (0) 5,5 (0) 5,5 (0)
87
Para avaliação da melhor resposta a ser usada na a análise do DCCR, foi realizada a quantificação
do extrato bruto, bem como a tensiometria e o teste E24 (item 3.2 deste capítulo). A tensiometria
sabidamente não seria a melhor resposta para análise, uma vez que quando chega ao ponto de
saturação não é possível mais identificar se houve ou não maior produção de biossurfactante. Desta
forma, a quantificação do extrato bruto e o teste E24 foram selecionados para analisar as respostas.
Obtenção do extrato bruto. O procedimento para a obtenção do extrato bruto foi realizado de acordo
com Mnif et al. (2012), com modificações. Uma alíquota de 25 mL do sobrenadante livre de células foi
acidificada utilizando HCl 6 N e incubada a 4°C por 24 horas. Após esse período, as amostras foram
filtradas em papel filtro e secas a 80°C por 2 horas. A massa do extrato bruto foi calculada pela diferença
entre o peso seco total e o peso seco do papel de filtro.
3.4.2. Validação e cinética
Com base na análise do DCCR foram derivadas as condições para a validação da produção de
biossurfactante. Apesar dos experimentos não resultarem em condições estatisticamente significativas
para a avaliação em nível de otimização (gráfico de superfície de resposta e curva de contorno), o
resultado encontrado foi significante do ponto de vista da redução da tensão superficial, e o
experimento foi validado com os dois ensaios que apresentaram maior significância nas análises
matemáticas, ensaios 10 e 14 (Tabela 2.3). A validação foi realizada em triplicata seguindo as condições:
0,5% sacarose, 2% óleo de soja, 5 g/L (NH4)2SO4, 2 g/L K2HPO4, 1 g/L KH2PO4, 5,5% peptona, 5,5% extrato
de levedura e 3% NaCl, e a bactéria foi crescida em Erlenmeyer de 125 mL a 30 °C por 96 horas sob
agitação contínua de 150 rpm. Para a avaliação da resposta foram utilizados a tensiometria e o teste
E24.
A cinética foi utilizada para otimizar o melhor tempo de produção do biossurfactante. Para tal,
os ensaios 10 e 14 foram reproduzidos em triplicatas e incubados por 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Após
esse período, os frascos foram sacrificados e o teste de emulsificação E24 e a tensiometria foram
avaliados como resposta para a cinética.
88
3.4.3. Gordonia sp. CCMA-559
De acordo com os efeitos observados no planejamento P&B, foi realizado um delineamento
composto central rotacional (DCCR) 23 com 3 repetições no ponto central capaz de avaliar o efeito de
três variáveis sobre as respostas (Tabela 5). Neste experimento foi estudada a influência dos fatores
concentração de hexadecano, óleo de soja e peptona (Tabela 6). O inóculo inicial de cada ensaio foi
realizado de acordo com o item 3.3, sendo as demais condições de cultivo fixadas a 30° C, 96 horas, 150
rpm. Os fatores sacarose, glicerol, uréia, (NH4)2SO4 e KH2PO4 foram eliminados, pois os níveis -1
estudados foram de 0 g/L. Os demais elementos, bem como a glicose, extrato de levedura, K2HPO4, e
NaCl foram fixados.
Tabela 5. Matriz com as variáveis reais e codificadas do DCCR (23).
ENSAIOS Hexadecano
(%)
Óleo de soja
(%) Peptona (g/L)
1 1,2 (-1) 1,2 (-1) 5,2 (-1)
2 1,79 (1) 1,2 (-1) 5,2 (-1)
3 1,2 (-1) 1,79 (1) 5,2 (-1)
4 1,79 (1) 1,79 (1) 5,2 (-1)
5 1,2 (-1) 1,79 (1) 5,79 (1)
6 1,79 (1) 1,2 (-1) 5,79 (1)
7 1,2 (-1) 1,2 (1) 5,79 (1)
8 1,79 (1) 1,79 (1) 5,79 (1)
9 1 (-1,68) 1,5 (0) 5,5 (0)
10 2 (1,68) 1,5 (0) 5,5 (0)
11 1,5 (0) 1 (-1,68) 5,5 (0)
12 1,5 (0) 2 (1,68) 5,5 (0)
13 1,5 (0) 1,5 (0) 5 (-1,68)
14 1,5 (0) 1,5 (0) 6 (1,68)
15 1,5 (0) 1,5 (0) 5,5 (0)
16 1,5 (0) 1,5 (0) 5,5 (0)
17 1,5 (0) 1,5 (0) 5,5 (0)
Para avaliação da resposta do DCCR, foi realizado o teste de espalhamento do óleo, bem como a
tensiometria e o teste E24 com hexadecano, óleo diesel e querosene.
89
Teste de espalhamento do óleo. O método de espalhamento do óleo foi realizado de acordo com
Youssef et al. (2004). Em uma placa de Petri (150 x 30 mm) foram adicionados 100 mL de água
deionizada e 30 μL de petróleo bruto foram depositados na superfície da água de modo a formar uma
fina película de óleo. Uma gota de 10 μL do sobrenadante da cultura livre de células foi cuidadosamente
depositada sobre a película de óleo. Para verificar a atividade do biossurfactante foi realizada a medida
do diâmetro do halo claro formado no filme de óleo. Ainda não há disponível surfactante comercial
produzido por espécies de Gordonia para que seja feita a curva padrão e o cálculo da concentração.
Entretanto, o teste se mostrou bastante eficiente para essa análise.
Embora alcançando resultados satisfatórios com o DCCR 23, não foi possível gerar o gráfico de
superfície. Então, um novo planejamento do tipo DCCR 22 com três repetições no ponto central foi
realizado a fim de avaliar o efeito de duas variáveis, o hexadecano e a peptona (Tabela 6). O óleo de soja
foi fixado na menor concentração (1%), e a glicose, extrato de levedura, K2HPO4, e NaCl foram mantidas.
Tabela 6. Matriz com as variáveis reais e codificadas do DCCR (22)
ENSAIOS Hexadecano (%)
Peptona (g/L)
1 1,65 (-1) 5,65 (-1)
2 2,35 (1) 5,65 (-1)
3 1,65 (-1) 6,35 (1)
4 2,35 (1) 6,35 (1)
5 1,5 (-1,41) 6 (0)
6 2,5 (1,41) 6 (0)
7 2 (0) 5,5 (-1,41)
8 2 (0) 6,5 (1,41)
9 2 (0) 6 (0)
10 2 (0) 6 (0)
11 2 (0) 6 (0)
3.4.4. Validação e cinética
Com base na superfície de resposta foram derivadas as condições para a validação da produção
de biossurfactante pela linhagem de Gordonia sp. CCMA-559. Foi realizado o inóculo conforme descrito
no item 3.3 em Erlenmeyer de 125 mL contendo 50 ml do meio líquido preparado com 2,5% de
hexadecano, 6 g/L de peptona, 1% de óleo de soja, 0,5% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, 2 g/L
de K2HPO4 e 3% de NaCl, ao meio pronto foi acrescentado 0,01% de elemento traço. Todos os ensaios
foram realizados em triplicatas e o ensaio E24 foi utilizado como resposta.
90
A cinética foi utilizada concomitantemente ao ensaio de validação com o objetivo de avaliar o
melhor tempo de produção do biossurfactante. Para tal, os ensaios foram incubados por 24, 48, 72, 96 e
120 horas. Após esse período, os frascos foram sacrificados.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Teste de Emulsificação
Das sete linhagens analisadas neste estudo, duas apresentaram melhores resultados, a CCMA-
560 e a CCMA-559, com 30 e 35% de emulsificação, respectivamente. Embora as linhagens testadas
tenham apresentado valores abaixo de 50%, que indica boa atividade, houve uma alteração bem visível
na interface entre o sobrenadante da linhagem e o querosene. Uma emulsão esbranquiçada e micro-
bolhas puderam ser observadas (Figura 1), diferente do controle negativo (água), sugerindo a atividade
emulsificante.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
(G)
a b c a b c a b c
a b c a b c a b c
a b c
(A) (B) (C)
Figura 1. Teste de emulsificação das linhagens isoladas de mangue. Os itens (a), (b) e (c) são representados
pelo controle negativo (água), controle positivo (Tween 80) e a linhagens em estudo, respectivamente. (A)
CCMA 560; (B) CCMA 580; (C) CCMA 561; (D) CCMA 559; (E) CCMA 556; (F) CCMA 553 e (G) CCMA 557.
91
4.2. Avaliação da produção de biossurfactante
4.2.1. Planejamento do tipo Plackett-Burman (P&B)
Visando obter os melhores resultados para a produção de biossurfactantes, a avaliação das
condições fisico-químicas do processo pode ser considerada como um fator relevante. Neste sentido, o
uso de abordagens estatísticas tem sido amplamente empregado. Assim, o objetivo desta etapa foi a
seleção de componentes do meio de cultura com efeito positivo sobre a produção de biossurfactante
pelos isolados, verificada através dos valores de tensiometria. A estratégia utilizada foi um
planejamento experimental do tipo Plackett-Burman, recomendada quando se deseja avaliar um grande
número de fatores através de uma triagem experimental com foco na redução do número de ensaios
(Rodrigues & Iemma, 2005).
Foram avaliadas inicialmente 12 variáveis, dentre elas cinco fontes de carbono (sacarose, glicose,
glicerol, óleo de soja e hexadecano), quatro fontes de nitrogênio (uréia, (NH4)2SO4, extrato de levedura e
peptona) e três fontes de sais (NaCl, K2HPO4 e KH2PO4). Os valores centrais dos níveis estudados (PC),
bem como os constituintes do meio são dados disponíveis na literatura (Sanket et al. 2007; Franzetti et
al. 2009; Onwosi & Odibo 2012).
4.2.2. Bacillus safensis CCMA-560
No planejamento do tipo P&B a linhagem CCMA-560 de B. safensis apresentou melhor resposta
(tensiometria) no ensaio em que o óleo de soja, a peptona e o extrato de levedura foram utilizados
(Anexo 1). A linhagem reduziu a TS (tensão superficial) a 29,5 mN/m.
A análise estatística do cálculo do efeito e o erro padrão (Anexo 2) identificaram as variáveis
óleo de soja, extrato de levedura e peptona como significativas no processo em um nível de significância
de 10% (p < 0,1), todos com efeito positivo, ou seja, o aumento da resposta pode ser alcançado
trabalhando com concentrações maiores das três variáveis. Neste sentido, no delineamento do próximo
ensaio visando a otimização, os efeitos das variáveis significativas foram considerados (Figura 2) e novos
valores foram delimitados, levando em consideração o ensaio com a maior redução da tensão superficial
e seu efeito positivo. As variáveis não significativas: sacarose, K2HPO4, KH2PO4 e NaCl foram fixadas, com
base no ensaio com a maior redução da tensão superficial (Tabela 4, ensaio 14). Além disso, as variáveis
não significativas com efeito negativo (hexadecano, glicerol, glicose e uréia) foram retiradas, uma vez
que o valor mínimo avaliado foi zero. Assim, três variáveis foram selecionadas para o estudo numa nova
92
faixa: óleo de soja, extrato de levedura e peptona, permitindo a otimização da produção de
biossurfactante através de um Delineamento Composto Central Rotacional – DCCR do tipo 23.
Embora as condições que afetam a síntese de biossurfactantes tenham sido extensivamente
estudadas, principalmente nas espécies B. subtilis, B. amyloliquefaciens e B. licheniformis (Joshi et al.
2007, Liu et al. 2012, Najafi et al. 2012), ainda existem poucos estudos mostrando que o óleo vegetal é
uma boa fonte de carbono para a produção de biossurfactantes. Já em linhagens de Pseudomonas
aeruginosa, esta fonte foi utilizada com sucesso (Benincasa et al. 2002; Nitschke et al. 2010) e os
ramnolipídios são estimulados por ponte de carbono hidrofóbicas (Abbasi et al. 2013). Das e
colaboradores (2009) estudaram óleos vegetais (óleo de mostarda, girassol e arroz) como fonte de
carbono para a produção de biossurfactante em B. circulans e não obtiveram sucesso na produção.
Entretanto, no presente trabalho, os ensaios de P&B mostraram que o óleo de soja influenciou
positivamente (efeito = 12) na produção do biossurfactante por B. safensis CCMA-560 com alta
probabilidade estatística (p = 0,009). Por outro lado, muitos trabalhos mostram o efeito positivos do uso
de glicose (Mukherjee et al. 2008, Najafi et al. 2010, Mnif et al. 2012), e neste trabalho esta fonte de
carbono teve efeito negativo na produção (efeito = -0,25).
De acordo com estudos já realizados, a limitação de nitrogênio acarreta o aumento na produção
de biossurfactante em micro-organismos como P. aeruginosa (Ramana & Karant, 1989), Candida
tropicalis (Singh et al. 1990) e Nocardia sp. (Kosaric et al. 1990). Matsufuji e colaboradores aumentaram
-4.00000
-2.00000
0.00000
2.00000
4.00000
6.00000
8.00000
10.00000
12.00000
14.00000
Efe
ito
mN
/m
Compostos do meio de cultura
Bacillus safensis CCMA-560
*
Figura 2. Efeito de cada variável estudada na matriz. *Variáveis que apresentaram melhor resposta (significância
estatística) no P&B.
*
93
significativamente a produção de ramnolipídio por P. aeruginosa quando cultivaram o micro-organismo
sob limitação de nitrogênio na proporção 18:1 (C:N) (Matsufuji et al. 1997). Neste trabalho, as fontes de
nitrogênio utilizadas no meio de cultura apresentaram efeito positivo na produção de biossurfactante, a
peptona apresentou efeito de 6,03 e o extrato de levedura de 6,25. Diferente dos micro-organismos
citados acima, há relatos na literatura que o nitrogênio age positivamente na produção de
biossurfactantes em espécies de Bacillus (Najafi et al. 2010; Liu et al. 2012). Isso sugere que além do
nitrogênio ter papel importante no crescimento e metabolismo dos micro-organismos, ele é um
importante constituinte da porção peptídica da molécula de lipopeptídio, tipo de biossurfactante
produzido por espécies de Bacillus.
4.2.3. Otimização da produção de biossurfactante por meio do planejamento experimental DCCR de B.
safensis CCMA-560
Após a realização do P&B para a linhagem CCMA-560, conforme a análise das variáveis e do
efeito (item 4.2.2), três variáveis foram selecionadas para o estudo numa nova faixa: óleo de soja,
extrato de levedura e peptona. Para a variável óleo de soja um valor intermediário de 1 a 2% foi testado,
uma vez que no P&B foi estudado de 0 a 1%. Já para o extrato de levedura e para a peptona, a faixa
selecionada foi de 5 a 6 g/L. Os resultados mostram que a resposta da tensão superficial não teve
variação significativa. A tensão superficial diminui gradativamente com o aumento da concentração de
biossurfactante. Mas em determinada concentração, conhecida por concentração micelar crítica (CMC),
a diminuição é cessada. Quando é atingido o CMC, a tensão superficial permanece constante, mesmo
que a concentração de biossurfactante seja aumentada (Butt et al. 2004). Portanto, embora muitos
estudos tenham sido realizados somente com a análise da tensão superficial (Sanket et al. 2007,
Khopade et al. 2012, Liu et al. 2012, Mnif et al. 2012), este trabalho mostrou que a estratégia de
planejamento experimental para produção de biossurfactante foi capaz de explorar mais do que análise
da tensão superficial é capaz de detectar. Embora a tensão superficial não tenha se mostrado uma
metodologia aquedada para a análise do DCCR, ela foi adequada e teve resposta significativa na análise
da matriz de P&B, onde foi realizado o screening prévio para os ensaios seguintes. E além disso, é
possível considerar o resultado da tensiometria favorável, uma vez que em vários ensaios foram obtidos
valores abaixo de 29,5 mN/, este que foi obtido no P&B (Anexo 3). Portanto, para análise do DCCR, além
da tensão superficial, foi realizada a análise do teste de emulsificação (E24) e quantificação do extrato
bruto.
94
De acordo com as análises estatísticas, nenhuma variável foi significante com base na resposta
da tensiometria e do extrato bruto (Anexos 4 e 5), uma vez que nenhuma demonstrou p-valor inferior a
0,1. Este resultado indica que nenhuma das variáveis estudadas está interferindo de maneira efetiva no
resultado, sem a presença de um perfil (positivo ou negativo) em relação as suas variações nos
diferentes ensaios.
A análise estatística da resposta do teste de emulsificação mostrou que a variável peptona não
foi significativa, as variáveis com significância de 10% foram: óleo de soja quadrático, e a interação óleo
de soja e extrato de levedura (Anexo 6).
Baseado nos resultados do coeficiente de regressão (Tabela 7), um modelo de segunda ordem
para o teste de emulsificação foi estabelecido:
% de Emulsificação por Bacillus safensis linhagem CCMA-560 = 0,11 + 0,05 X2 + 0,07 X vs Y, onde
X = óleo de soja e Y = extrato de levedura.
Tabela 7. Coeficiente de regressão das variáveis significativas.
Regressão Erro
padrão t(14) p-valor
Mean/Interc. 0,112003 0,030247 3,702949 0,002363
Óleo de soja (Q) 0,047340 0,025493 1,857000 0,084474
Óleo de soja e Ex. Levedura (L) 0,068750 0,032472 2,117194 0,052630
A significância estatística do modelo (Tabela 8) não foi confirmada pelo teste F (Anova), pois o
valor do teste F (6,51) para a regressão foi inferior ao F tabelado = 3,01. Esse baixo valor do teste F,
juntamente com o baixo valor de R2 (36%), que é a porcentagem de variação explicada pela equação,
mostra que não houve um bom ajuste dos valores experimentais ao modelo, indicando que não é
adequado utilizar o modelo matemático para gerar a superfície de resposta e consequentemente a
otimização. Contudo, o resultado encontrado foi significante do ponto de vista da redução da tensão
superficial nos primeiros ensaios.
95
Fonte de Variação Soma dos quadrados Grau de liberdade Quadrado médio F calculado
Regressão 0,066902 2 0,033451 3,965469356
Resíduo 0,118098 14 0,008435571
Total 0,185 16 0,0115625
R2 = 36% e p-valor = 0,0001
F = 2; 14; 0,1 (F Tabelado) = 2,73
Embora não tenha sido possível gerar o gráfico de contorno e superfície de resposta, julgamos
que os resultados foram satisfatórios uma vez que conseguimos identificar variáveis importantes na
produção de biossurfactante, responsáveis pelo aumento da quantidade produzida pela bactéria. Desta
forma, foi possível obter quantidades suficientes de biossurfactante para a caracterização química e
avaliação da sua aplicação potencial em ensaios de MEOR.
Com base nos resultados do DCCR, os ensaios 10 e 14 foram validados utilizando como resposta
a emulsificação e a tensiometria, respectivamente. Concomitantemente, o ensaio de cinética também
foi realizado.
Emulsificação. Na validação, com 96 horas de crescimento, a linhagem emulsificou o querosene em
26%, valor um pouco inferior ao obtido no ensaio de DCCR, cujo valor máximo foi de 35%. Na cinética foi
possível observar que a emulsificação ocorreu a partir de 96 horas, sendo que em 120 horas não houve
aumento da atividade emulsificante (Figura 3).
Tensiometria. Na validação do ensaio 14, com 96 horas de crescimento a tensão superficial média foi de
28,1 mN/m e com 120 horas foi de 28,5 mN/m. Estes dados sugerem que não é necesessário o
crescimento da bactéria por mais de 96 horas. Então, para ensaios posteriores essa será a condição
Tabela 8. Anova do modelo quadrático para a produção de biossurfactante por Bacillus safensis CCMA-560.
Figura 3. Gráfico da cinética do ensaio 10 (DCCR) com Bacillus safensis CCMA-560.
96
utilizada. Nos ensaios de cinética, foi possível observar que a redução da tensão superficial foi
significativa após 72 horas de crescimento, chegando ao seu ápice com 96 h (Figura 4).
Corroborando com os resultados do P&B e do DCCR, a produção de biossurfactante se deu a
partir de 96 horas de crescimento, sendo então o tempo necessário de incubação do micro-organismo.
O lipopeptídio produzido por espécies de Bacillus é sintetizado em um operon de aproximadamente 25
kb, sob regulação do sistema de quorum-sensing (D’Souza et al. 1994). Uma vez que a alta densidade
celular é atingida, um sinal molecular é liberado e então é iniciada a expressão dos genes, o que ocorre
normalmente na fase estacionária de crescimento (Ron & Rosenberg, 2002). Embora as espécies de
Bacillus tenham o crescimento rápido e alguns estudos tenham mostrado que a bactéria é capaz de
produzir biossurfactante com menos de 72 horas de cultivo (Abdel-Mawgoud et al. 2008), a linhagem de
B. safensis CCMA-560 produziu o biossurfactante a partir de 96 horas de crescimento. Isto pode ter sido
resultadodo uso de óleo de soja como principal fonte de carbono, que pode ter interferido no
crescimento bacteriano. O óleo utilizado é uma fonte de carbono complexa e, em outros relatos, as
fontes de carbono utilizadas eram simples, como sacarose e glicose. Ainda assim, a utilização do óleo de
soja é vantajosa comparada ao uso de glicose e sacarose, uma vez que é uma fonte mais barata. O custo
elevado e o baixo rendimento na produção ainda são fatores limitantes para a maior utilização do
biossurfactante (Mukherjee et al. 2006), portanto matérias primas baratas tem sido uma alternativa
para o aumento do potencial de utilização.
Figura 4. Gráfico da cinética do ensaio 14 (DCCR) com Bacillus safensis CCMA-560.
97
4.3. P&B de Gordonia sp. CCMA-559
No planejamento do tipo P&B, a linhagem CCMA-559 de Gordonia sp. apresentou melhor
resposta no ensaio em que o hexadecano, o óleo de soja e a peptona foram utilizados. A linhagem
reduziu a tensão superficial para 37,2 mN/m (Anexo 6).
A análise estatística do cálculo do efeito e o erro padrão (Figura 5, Anexo 7) identificou as
variáveis de hexadecano, óleo de soja e peptona como significativas no processo com um nível de
significância de 10% (p<0,1), todos com efeito positivo, ou seja, o aumento da resposta pode ser
alcançado trabalhando com concentrações maiores das três variáveis. Neste sentido, no delineamento
do próximo ensaio visando a otimização, os efeitos das variáveis significativas foram considerados
(Anexo 7) e novos valores foram delimitados, levando em consideração o ensaio com a maior redução
da tensão superficial e seu efeito positivo. As variáveis não significativas, glicose, extrato de levedura,
K2HPO4, e NaCl, foram fixadas, com base no ensaio com a maior redução da tensão superficial (ensaio
15). Além disso, as variáveis não significativas com efeito negativo (sacarose, glicerol, uréia, (NH4)2SO4 e
KH2PO4) foram retiradas, uma vez que o valor mínimo avaliado foi zero. Assim, três variáveis foram
selecionadas para o estudo em uma nova faixa: hexadecano, óleo de soja e peptona, permitindo a
otimização da produção de biossurfactante através de um Delineamento Composto Central Rotacional –
DCCR do tipo 23.
Figura 5. Efeito de cada variável estudada na matriz sobre a redução da tensão superficial para a Gordonia
sp. CCMA-559.
98
Em estudos já realizados com espécies de Gordonia foi mostrado que a produção de
biossurfactante é estimulada com o uso do hexadecano (Franzetti et al. 2009; Pagilla et al. 2002),
entretanto, não há relatos da utilização de óleo vegetal. E como foi possível observar, o hexadecano e o
óleo de soja afetaram positivamente a produção, com efeito de 5,68 e 10,76, respectivamente.
Conforme já citado anteriormente, em algumas espécies de micro-organismos a limitação de nitrogênio
no cultivo estimula a produção de surfactantes, mas neste trabalho foi possível observar que a peptona
afetou positivamente a produção, com efeito de 6,33. Contrariamente aos dados apresentados por
Franzetti et al (2009), que observaram que a linhagem de Gordonia sp. BS29 não sofreu influência na
síntese de biossurfactante com a utilização de (NH4)2SO4, neste planejamento P&B foi observado que
essa fonte de nitrogênio apresentou efeito negativo na produção (efeito = -1,76).
4.3.1. Otimização da produção de biossurfactante por meio do planejamento experimental DCCR de
Gordonia sp. CCMA-559
Após a realização do P&B para a linhagem CCMA-559, conforme as análises das variáveis e do
efeito, três variáveis foram selecionadas para o estudo numa nova faixa: hexadecano, óleo de soja e
peptona. Para as variáveis hexadecano e óleo de soja, um valor intermediário de 1 a 2% foi testado, uma
vez que no P&B foi estudado de 0 a 1%. Já para peptona, a faixa selecionada foi de 5 a 6 g/L. Nas
análises da tensão superficial foi possível observar que a resposta não teve variação significativa,
corroborando o fato de que após alcançar o CMC não é possível detectar se houve aumento na
produção do biossurfactante (Anexo 8). Por esse motivo, as análises do espalhamento do óleo e da E24
foram adotadas como resposta.
De acordo com as análises estatísticas, nenhuma variável foi significativa para a resposta de
tensiometria e espalhamento do óleo, uma vez que nenhuma demonstrou p-valor > 0,1 (Anexos 9 e 10).
Como resultados do primeiro DCCR, não foi obtida a otimização (gráfico de superfície), então um
novo DCCR do tipo 22 foi realizado. O óleo de soja foi fixado na menor concentração (1%) e uma faixa
mais estreita das variáveis significativas (hexadecano e peptona) foram trabalhadas. Os resultados das
respostas analisadas estão descritos na Tabela 9.
99
Ensaio Hexadecano (%)
Peptona (g/L)
Tensiometria* (mN/m)
Espalhamento* (mm)
Emulsificação*ɸ (%)
1 -1 -1 49,5 6 32,6
2 1 -1 45,1 14 25
3 -1 1 42,9 3 23,3
4 1 1 39,8 19 42,3
5 -1,41 0 38,4 5 16,6
6 1,41 0 49,1 2 53,3
7 0 -1,41 56,8 0 0
8 0 1,41 48,7 1 41,3
9 0 0 37,2 5 40
10 0 0 40,5 5 46,6
11 0 0 37,7 4 46
* Todas as leituras foram realizadas em triplicata e os valores da tabela representam a média. ɸ Ensaio realizado com querosene.
Na análise estatística das respostas dos testes de tensiometria e espalhamento de óleo foi
possível observar que nenhuma variável testada foi significativa, uma vez que os resultados dep-valor
foram < 0,1 (Anexos 11 e 12).
De acordo com os resultados do DCCR 22, apenas a variável resposta (%) de emulsificação foi
estatisticamente significativa (p < 0,1). A maior (%) de emulsificação foi obtida no ensaio 6 (53,3%, com
2,5 mL.L-1 de hexadecano e 6 g.L-1 de peptona, Tabela 9). O hexadecano e a peptona na forma linear
influenciaram positivamente e a peptona na forma quadrática influenciou negativamente (p < 0,1)
(Anexo 13).
A significância estatística das análises (Tabela 10) foi confirmada pelo teste F (ANOVA), como o
valor do teste F (7,9586) para a regressão foi significativo [maior do que o F tabelado (3,11)] e a
porcentagem de variação explicada pelo modelo foi adequado (R2= 67%), o modelo foi considerado
previsível e, portanto, utilizado para gerar os gráficos de contorno e a superfície de resposta
apresentados na Figura 6. O modelo estatístico do DCCR 22 para (%) de emulsificação pela linhagem de
Gordonia sp. CCMA-559 foi:
% Emulsificação = 40,56638 + 7,91693 (x) + 8,3038306 (y) - 9,93332 (y)2 , onde x = hexadecano
e y = peptona.
Tabela 9. Matriz do planejamento DCCR 22
e respostas das análises de Gordonia sp. linhagem
CCMA-559
100
Fonte de Variação
Soma dos quadrados
Graus de liberdade
Quadrado médio
F calculado
Regressão 1653,928 2 826,9641 7,958684
Resíduo 831,2571769 8 103,9071
F ajuste 804,617 5 160,9234
12,08134 Erro puro 26,640 2 13,32
Total 2485,185 10 248,5185
R2
= 67%; p-valor = 0,1 F-tabelado = 2; 8; 0,1 (3,11)
Os resultados derivados da superfície de resposta mostraram que os ensaios ficaram próximos
do ponto de otimização, trabalhando com o máximo de hexadecano (2,5%) e ponto central de peptona
(6 g/L). Com base neste resultado foram determinadas as condições de validação do experimento,
utilizadas nos ensaios de caracterização química do biossurfactante. Nos ensaios de validação e cinética,
foi possível observar que a linhagem inicia o processo de produção de biossurfactante a partir de 72
horas de crescimento (23% de emulsificação), atingindo a melhor produção com 96 horas (52% de
emulsificação). Esses dados confirmam que o melhor tempo de crescimento para que a Gordonia sp.
CCMA-559 atinja a melhor produção é de 96 horas (Figura 7).
Tabela 10. Tabela ANOVA do DCCR 22 (hexadecano vs peptona) para (%) de
emulsificação
Figura 6. Superfícies de resposta e de contorno para (%) de emulsificação. DCCR 22 com a função
hexadecano vs. peptona (p < 0,05).
101
Foi observado que no primeiro DCCR (23) a Gordonia sp. CCMA-559 apresentou excelentes
resultados de redução da tensão superficial e no ensaio de espalhamento do óleo, mostrando que a
linhagem produz biossurfactante. Mas nos mesmos ensaios não foram observados resultados
satisfatórios de emulsificação dos substratos testados. Entretanto, após a realização do novo DCCR (22),
houve a inversão dos resultados. A tensiometria e o ensaio de espalhamento do óleo não apresentaram
boas respostas, ao passo que foram observados excelentes resultados no ensaio de emulsificação,
utilizando o querosene como substrato. Esses dados sugerem que a linhagem de Gordonia sp. CCMA-
559 possui duas vias metabólicas distintas para a produção de CASs, uma de biossurfactante e outra de
bioemulsificante. Estes dados corroboram com aqueles apresentados por Franzetti et al (2009a) que
mostraram que a linhagem de Gordonia sp. BS29 apresenta pelo menos dois diferentes CASs, um
bioemulsificante extracelular com capacidade de estabilizar emulsões, mas que não é eficiete na
redução da tensão superficial, e um biossurfactante glicolipídico, eficiente na redução da tensão
superficial.
As análises estatísticas foram essenciais para a conclusão dos resultados obtidos, onde 12
fatores foram estudados em apenas duas bateladas para a linhagem de Bacillus safensis CCMA-560 e
três bateladas de ensaio para a linhagem de Gordonia sp. CCMA-559. Com o total de 36 ensaios para o
B. safensis CCMA-560 e 47 ensaios para Gordonia sp. CCMA-559 foi possível avaliar o fator de cada
variável na produção de biossurfactante e também a interação desses fatores, dado que não seria
possível interpretar em experimentos de “um-fator-por-vez”. Além disso, o modelo matemático
Figura 7. Gráfico da cinética do teste E24 de Gordonia sp. CCMA-559.
102
permitiu a obtenção da condição otimizada da produção de biossurfactante com a redução de tempo e
dos gastos laboratoriais.
5. CONCLUSÕES
O planejamento de P&B foi útil para a seleção de variáveis significantes utilizando a tensão
superficial como resposta. É importante salientar que as análises estatísticas permitiram explorar o
universo de variáveis do meio de cultivo e suas interações, o que não é possível com o uso da
tensiometria por si só. Os resultados mostraram que testes complementares são necessários para
avaliar a produção dos biossurfactantes e bioemulsificantes.
Este foi o primeiro relato de otimização da produção de biossurfactantes em Bacillus safensis
utilizando o planejamento experimental. Embora não tenha chegado na superfície de resposta (condição
otimizada), o uso do DCCR aumentou a produção de biossurfactante pela linhagem de B. safensis CCMA-
560, mostrando que o óleo de soja e o extrato de levedura interferem positivamente na produção. E, de
acordo com os resultados da validação e cinética, o tempo de cultivo de 96 horas foi o mais adequado
para o experimento.
Com o uso do P&B e DCCR foi possível chegar na condição otimizada da produção de CASs pela
linhagem de Gordonia sp. CCMA-559. Com base nos resultados obtidos, foi observado que a peptona e o
hexadecano interferem positivamente na produção de CASs. Também foi possível concluir que esse
micro-organismo, possivelmente, apresenta duas vias metabólicas distintas para a produção de CASs,
uma para bioemulsificante e outra de biossurfactante, sendo estimulados por hexadecano e óleo de
soja, respectivamente. Com os resultados obtidos na validação, o modelo estatístico foi considerado
confiável para a previsão da produção de biosurfactante pela Gordonia sp. CCMA-559.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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104
105
CAPÍTULO 3 Draft Genome Sequence of the Biosurfactant-Producing Bacterium
Gordonia amicalis Strain CCMA-559, Isolated from Petroleum-
Impacted Sediment Daniela F. Domingos, Bruna M. Dellagnezze, Paul Greenfield, Luciana R. Reyes, Itamar S. Melo, David J.
Midgley & Valéria M. Oliveira
Artigo publicado pela revista Genome Announcements
106
107
108
109
CAPÍTULO 4 Draft Genome Genome Sequence of Bacillus pumilus CCMA-560,
Isolated from an Oil-Contaminated Oil Swamp Daniela F. Domingos, Bruna M. Dellagnezze, Paul Greenfield, Luciana R. Reyes, Itamar S. Melo, David J.
Midgley & Valéria M. Oliveira
Artigo publicado pela revista Genome Announcements
110
CAPÍTULO 5
111
Genomic and chemical insights into biosurfactant production by the
mangrove-derived strain Bacillus safensis CCMA 560 Daniela F. Domingos, Andreia F. Faria, Renan S. Galaverna, Marcos N. Eberlin, Paul Greenfield, Tiago D. Zucchi, Itamar S. Melo, Nai Tran-Dinh, David J. Midgley & Valéria M. Oliveira Artigo aceito pela revista Applied Microbiology and Biot echnology
112
113
Genomic and chemical insights into biosurfactant production by the mangrove-derived strain Bacillus
safensis CCMA 560
Daniela Ferreira Domingos1*, Andreia Fonseca de Faria2, Renan de Souza Galaverna3, Marcos Nogueira
Eberlin3, Paul Greenfield4, Tiago Domingues Zucchi5, Itamar Soares Melo5, Nai Tran-Dinh6, David
Midgley6 and Valéria Maia de Oliveira1
1Microbial Resources Division, Research Center for Chemistry, Biology and Agriculture (CPQBA),
University of Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil;
2 Department of Chemical and Environmental Engineering, Yale University, New Haven,
Connecticut, 06520-8286, United States of America.
3ThoMSon Mass Spectrometry Laboratory, Institute of Chemistry, University of Campinas (UNICAMP),
Campinas, SP Brazil;
4CSIRO Mathematics, Informatics and Statistics, North Ryde, NSW, Australia 2113;
5Laboratory of Environmental Microbiology, EMBRAPA Environment, Jaguariúna, São Paulo, Brazil;
6CSIRO Animal, Food and Health Sciences, North Ryde, NSW, Australia 2113.
*email: [email protected]
Av. Alexandre Cazelatto, 999
Paulínia – SP – Brazil, CEP 13148-218
phone: +55 19 2139-2873
fax: +55 19 2139-2852
114
ABSTRACT
Many Bacillus species can produce biosurfactant, although most of the studies on lipopeptide
production by this genus have been focused on B. subtilis. Surfactants are broadly used in
pharmaceutical, food and petroleum industry and biological surfactant shows some advantages over the
chemical surfactants, such as, less toxicity, production from renewable, cheaper feedstocks and
development of novel recombinant hyperproducer strains. This study is aimed to unveil the
biosurfactant metabolic pathway and chemical composition in Bacillus safensis strain CCMA 560. The
whole genome of CCMA 560 strain was previously sequenced and with aid of bioinformatics tools its
biosurfactant metabolic pathway was compared to other pathways of closely related species. Fourier
transform infrared (FTIR) and high resolution TOF mass spectrometry (MS) were used to characterize the
biosurfactant molecule. B. safensis CCMA 560 metabolic pathway is similar to other Bacillus species,
however some differences in amino acid incorporation were observed and chemical analyses
corroborated the genetic results. The strain CCMA 560 harbours two genes flanked by srfAC and srfAD
not present in other Bacillus spp., which can be involved in the production of the analogue gramicidin.
FTIR and MS showed that B. safensis CCMA 560 produces a mixture of at least four lipopeptides with
seven amino acids incorporated and a fatty acid chain with 14 carbons, which makes this molecule
similar to the biosurfactant of B. pumilus, namely pumilacidin. This is the first report on the
biosurfactant production by B. safensis, encompassing investigation of the metabolic pathway and
chemical characterization of the biosurfactant molecule.
KEYWORDS
Pumilacidin, metabolic pathway, chemical characterization, surfactant, Bacillus.
115
INTRODUCTION
Bacillus species are abundantly recovered members of global microbial surveys. These ubiquitous
organisms have been isolated from air samples, soil, sediments, subsurface, inhabiting plant tissues and
animal digestive tracts (Vilas-Bôas et al., 2007). Most species are aerobes or facultative anaerobes, and
form highly resistant endospores which allow them to survive in extremely challenging conditions. Given
that spores readily germinate in laboratory conditions, but may not be represented by vegetative cells in
the environment, means that describing an environmental niche for these taxa is surprisingly difficult
(Earl, Losick, & Kolter, 2008). The genus has been the focus of significant research as taxa therein
produce an array of antimicrobial compounds, extracellular enzymes and surface-active compounds
(surfactants). The best studied group within the genus is probably the taxon that includes Bacillus
thuringiensis, Bacillus cereus and Bacillus anthracis which, depending on their plasmids, can cause insect
disease, food borne illnesses and anthrax, respectively (Helgason et al., 2000). Bacillus subtilis and
Bacillus licheniformis are also comparatively well studied (Al-Wahaibi et al., 2014; Fang et al., 2013; Liu
et al., 2013), the former has been particularly important in the understanding of the biofilm formation
by bacterial populations (Colledge et al., 2011). Furthermore, it has been demonstrated that surfactants
play an important role on the biofilm formation (as signal molecules) and/or as (as signal molecules) and
as antimicrobial compounds (Dunlap et al., 2013).
Chemically, surfactants are usually organic, amphiphilic compounds that comprise both a
hydrophobic ‘tail’ and a hydrophilic ‘head’ group. The purpose of such molecules in microbial
environments is to alter conditions at interfaces between surfaces. These molecules can be divided into
two broad groups based on their molecular weight (MW). Low-MW surfactants include glycolipids and
lipopeptides, while the high-MW surfactants include lipoproteins, lipopolysaccharides, polysaccharides
and proteins.
116
The global market in surfactants is significant and generated US$ 24 million in revenues in 2009
and is predicted to reach ~US$40 million by 2018. They are used in a wide range of industries. For
instance, in the oil industry they are important lubricants, may be deployed to recover oil from declining
assets, or may be used to clean-up oil spills (Bannat et al., 2010; Singh et al., 2007). Surfactants are also
widely used in cosmetic manufacture, food industry, paper processing and are agriculturally and
medically important due to their antimicrobial and antitumor properties (Rodrigues LR, Teixeira JA,
2010). Increasingly, surfactant-producing bacteria have become appealing targets for industry as they
are less toxic, may be produced from renewable, cheaper feedstocks and are more suitable to the global
trend of environmental-friendly products (Mukherjee, 2006).
Mostly due to its nonpathogenic nature, most of the effort has been focused on B. subtilis which has
arguably the best studied surfactant producing pathway. In this taxon, the regulatory system for
surfactin is relatively complex (D’Souza et al., 1994, Peypoux et al., 1999) and consists of a cell-density
dependant pheromone (ComX), a two-component response regulatory system (ComA/ComP), the
extracellular-signalling factor (PhrC) and the phosphatase (RapC). Increasing cell density leads to
increases in extracellular concentrations of ComX. The cell-wall bound ComP responds to ComX by
phosphorylating ComA, which in turn binds to the promoter region of the srf operon. In reverse, RapC
suppresses expression by dephosphorylating ComA, and is in turn dependant on (high) intracellular
concentrations of PhrC (Setpute et al., 2010). A similar system was reasonably well described for B.
licheniformis (Yakimov et al., 1995).
Despite their wide occurrence the related taxa Bacillus pumilus and Bacillus safensis have been
the subject of scarce biotechnological study. They have been found growing in a range of environments
including bulk soil, rhizosphere soil, sediment, host plant, and in the ultra-clean assembly rooms for
spacecraft (Agbobatinkpo et al., 2013; Hernandez et al., 2009; Kavamura et al., 2013; Lorenz et al.,
2013;Nicholson et al., 2012). In both taxa, the mechanisms of their extreme spore resistance to a range
117
of stressors have been the focus of the majority of studies, and the surfactant production systems of
these taxa remain largely unexplored. The aims of the current study were to understand the genetic
basis and chemically characterize the biosurfactant molecule produced by Bacillus safensis CCMA 560.
MATERIAL AND METHODS
Bacterial strains
A biosurfactant-producing strain, Bacillus sp. CCMA 560 was isolated from oil contaminated swamp and
its whole genome sequence was done previously (Domingos et al., 2013). This strain showed
biosurfactant production in different carbon sources, such as glucose, glycerol and soybean oil.
Details about the Bacillus strains and their genomes used to compare the biosurfactant metabolic
pathways in this study are listed in Table 1.
Table 1. Genome details of Bacillus spp. strains used in this study.
Genome Size (bp) G+C% Genes Habitat Reference
Bacillus safensis CCMA 560 3848972 41.4 4121 Mangrove sediment Domingos et al., 2013
Bacillus safensis VK 3683090 41.6 3908 Rhizosphere from desert Kothari et al., 2013
Bacillus safensis CFA-06 3771318 41.5 3824 Petroleum reservoir Unpublished
Bacillus pumilus ATCC 7061 3833614 41.7 4162 Soil Tirumalai et al., 2013
Bacillus pumilus BA06 3747338 41.3 3923 Soil Zhao et al., 2012
Bacillus pumilus SAFR 032 3704441 41.3 3822 Space craft surface and
assembly facility
Gioia et al., 2007
Bacillus pumilus S-1 3692856 41.3 3873 Soil Hua et al., 2007
Bacillus pumilus INR7 3681709 41.3 3818 Cucumber stem Unpublished
Bacillus pumilus Fairview 3840236 41.5 3992 Coal Vockler et al., 2014
Bacillus amyloliquefaciens
FBZ42
3918589 46.5 3812 Rhizosphere Chen et al., 2007
Bacillus licheniformis
DSM13
4222334
46.2 4332 Soil Rey et al., 2004
118
Phylogenetic analysis
The almost complete 16S rRNA gene sequences (1,416 nucleotides [nt]) were aligned manually using
MEGA version 5 software (Tamura et al., 2011) against corresponding sequences of closely related type
strains of Bacillus species retrieved from the GenBank database using the EzTaxon-e server (Kim et al.,
2012; http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/). The gyrase subunit A (gyrA) and B (gyrB) genes (Satomi et al.,
2006) were also evaluated for further enhancing the taxonomic position of isolate CCMA 560; sequences
of closely related strains were retrieved from the GenBank database. Phylogenetic trees and bootstrap
analysis were inferred following the procedures described by Zucchi et al. (2013). The root position of
the neighbor-joining tree was inferred by using Paenibacillus polymyxa ATCC 842T (GenBank accession
no. D16276). Finally, the average nucleotide identity against the closest phylogenetic available whole-
genome sequence (B. pumilus ATCC 7061) was determined by using the JSpecies package (Richter &
Rosselló-Móra, 2009).
Biosurfactant metabolic pathway comparisons
Since the metabolic pathway of lipopeptide in B. subtilis is already known, the operon that encodes the
biosurfactant was identified in B. subtilis 6051 HGW genome and the comparison with B. safensis CCMA
560 genome was carried out using IMG-ER (Markowitz et al., 2012), which provides tools for automatic
annotation and comparative analysis of available whole-genome sequences. When the putative genes
were found out, all of them were thoroughly analysed using the automatic annotation performed by
IMG-ER, as well as the manually annotation by BLASTx, thus providing more detailed function
information for each gene.
As it is already elucidated, the lipopeptide synthesis is mediated via nonribosomal peptidase
synthetase (NRPS), thus the prediction of the protein structure from the biosurfactant operon was
detailed using AntiSMASH 2.0 plataform (Blin et al., 2013; Medema et al., 2011). Muscle 3.8.31 (Edgar,
119
2009) and BioEdit 7.1.9 (Hall, 1999) were used to compare the sequence similarity among the genes
involved in the biosurfactant pathway. In addition, a complementary analysis based on the full operon of
the 12 Bacillus strains under study was carried out on VISTA website (Frazer et al., 2004) in order to
show the relationships among the species.
Chemical characterization
Growth conditions
Strain CCMA 560 was cultivated in Nutrient Agar (Difco®) and incubated at 30°C for 24 hours.
Subsequently, a single colony was inoculated in Nutrient Broth (Difco®) and the cultivation was carried
out in a rotary shaker (Innova® 44R, New Brunswick, USA) at 30°C at 150 rpm for 24 hours. After growth,
the culture was pelleted by centrifugation for 5 minutes at 8,000 rpm (Eppendorf 5810R). The pellet was
suspended in water, adjusted to ODλ600 = 0.15 ± 0.03 and an aliquot of 10% (v/v) was used as inoculum in
Mineral Medium containing per liter: 5 g yeast extract; 1 g (NH4)2SO4; 6 g Na2HPO4; 3 g KH2PO4:; 2.7 g
NaCl; 0.6 g MgSO4 7 H2O and 0.1% trace solution containing per liter: 10.95 g ZnSO4 7 H2O; 5 g FeSO4 7
H2O; 1.54 g MnSO4 7 H2O; 0.39 g CuSO4 5 H2O; 0.25 g Co(NO3)2 6 H2O; 0.17 g Na2B4O7 10 H2O
supplemented with 1% glucose. The flasks were incubated in a rotary shaker (Innova® 44R, New
Brunswick, USA) at 30°C at 150 rpm for 96 hours.
Biosurfactant recovery and purification
The culture broth was centrifuged at 10,000 x g for 20 min at 15°C (Eppendorf 5810R), the cell-free
supernatant was collected and the pH adjusted to 2.0 by adding 6 M HCl. The resultant solution was
maintained at rest for 12 h to allow surfactin to settle. The precipitate was collected by centrifugation at
120
10,000 × g for 15 min at 15°C for the recovery of the crude surfactin. The precipitate was washed twice
with acidified water at pH 2.0 and then resuspended in distilled water at pH 7.0.
Crude biosurfactant was purified through dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa (Fisher Scientific)
for 72 hours; the water was changed every 4 hours. After purification the material was freeze-dried for
48 hours.
Fourier transform infrared (FTIR) analysis
The FTIR analysis was performed by mixing approximately 1 mg of purified biosurfactant with 100 mg of
KBr and pressing the mixture at 134 MPa for 2-3 minutes to obtain transparent pellets. The FTIR
spectrum was collected from 400 to 4000 wavelengths (cm-1) and 32 scans using a FTIR (FTLA2000)
spectrometer.
Mass Spectrometry
The sample was prepared by dissolving 2 µg of biosurfactant in methanol/water solution (1:1 v/v). For
Electrospray Ionization in the positive ion mode, ESI(+), formic acid 0.1% was added to facilitate
protonation of the basics compounds to yield [M + H]+ ions. The sample solution was directly infused
into the ESI source of the Citius LC−HRT system with the following parameters: spray voltage, +2.8 kV;
nozzle potential, +110 V; Q1 direct current (DC) potential, +100 V; skimmer potential, +41 V; nebulizer
pressure, 30 psi; N2 desolvation flow, 6.0 L min−1; desolvation temperature, 300°C; and nozzle
temperature, 120°C. In this exploratory study, to ensure full coverage of the m/z range of interest for
biosurfactants studies, data were recorded in full MS mode along the m/z 100-1200 range. Mass spectra
were the result of over 100 scans at 50,000 resolving power (m/Δm) accumulated via the Chroma-TOF
software (LECO Corporation, St. Joseph, MI).
121
The MS/MS experiments were performed using ESI(+) and a HCT Ultra Mass Spectrometer
(Bruker Daltonics). The width isolation and fragmentation amplitude were adjusted to obtain the best
condition for each experiment. Data acquisition was performed along the m/z 100-1200 range and
accumulated via the DataAnalysis 4.0 software.
RESULTS
Phylogenetic analysis
Strain CCMA 560 was previously classified as Bacillus pumilus based on whole genome similarity data
with other related species (Domingos et al., 2013). However, accurate phylogenetic analysis carried out
based on the 16S rRNA gene sequence revealed that the isolate CCMA 560 was strongly related with the
type strain of B. safensis FO-036bT (AF234854) and other two biosurfactant producers; a taxonomic
position supported by all of the tree-making algorithms and by a bootstrap value of 87% (Figure 1). The
organism shares a 16S rRNA gene similarity of 100% with B. safensis FO-036bT (AF234854). The 16S rRNA
similarities with B. aerophilus, B. altitudinis, B. pumilus and B. stratosphericus type strains fell within the
range 99.6-99.8%, values corresponding to 6 and 3 nt differences, respectively.
122
Figure 1. Neighbor-joining tree based on nearly complete 16S rRNA gene sequences (~1400 bp) showing
relationships between isolate CCMA 560 and the type strains of phylogenetically close Bacillus species. White
circles indicate branches of the tree that were recovered with the maximum-likelihood and maximum-parsimony
tree-making algorithms; the black diamond stands for a branch which was recovered using the maximum-
parsimony tree-making algorithm. Numbers at the nodes are percentage bootstrap values based on a neighbor-
joining analysis of 1000 resampled datasets; only values above 50% are given. Paenibacillus polymyxa ATCC 842T
(D16276) was used as the outgroup; the arrow indicates the inferred root position. Bar, 0.01 substitutions per
nucleotide position.
A similar phylogenetic structure was observed in the housekeeping genes analysis (Figure 2) and
therefore, isolate CCMA 560 was strongly associated with B. safensis gene subclade. The result for the
gyrA was underpinned by all tree-making algorithms and by a bootstrap value of 100% (Figure 2a). The
123
isolate phylogenetic position in the gyrB phylogenetic tree was not supported by other tree-making
algorithms, but it was supported by a high bootstrap value (83%). Both gyrase gene-based phylogenetic
trees showed clearly the distinct phylogenetic position of isolate CCMA 560 from B. pumilus. In addition,
the average nucleotide identity (ANI) between isolate CCMA 560 and B. pumilus was 91.4%,
corroborating that they are different species.
124
Figure 2. Neighbor-joining tree based on nearly complete gyrase subunit A (gyrA; A) and B (gyrB; B) gene
sequences (~2000 bp) showing relationships between isolate CCMA 560 and strains of Bacillus species.
Paenibacilus validus JCM 9077 (AB769953) and Paenibacillus polymyxa ATCC 842T (D16276) were used as the
outgroups. Bar, 0.05 substitutions per nucleotide position.
125
Bacillus sp. CCMA 560 was further deposited at the Brazilian Collection of Environmental and
Industrial Microorganisms (CBMAI/UNICAMP, Brazil) as Bacillus safensis under the acronymous CBMAI
1669.
Biosurfactant pathway comparison
All species studied in this work showed a structurally conserved region represented by sfp (Figure 3). In
B. safensis strain CCMA 560, the sfp gene is 693 bp in length and codes for a 230 amino acid- protein, in
other B. safensis, such as Injune, CFA-06 and VK strains and in B. pumilus SARF-032 and ATCC7061 the
sfp gene codes for a similar size protein. In B. subtilis 6051 HGW and B. amyloliquefaciens FZB472, the
sfp gene is 675 bp in length and codes for a protein of 224 amino acids. In B. licheniformis DSM13, the
sfp gene is 681 bp in length and codes for a protein containing 226 amino acids. The nucleotide and
amino acid sequences between B. safensis and B. pumilus species are very similar, over 80%. On the
other hand, B. safensis and the species B. subtilis, B. amyloliquefaciens and B. licheniformis showed
53.8%, 54.5% and 51% nucleotide sequence similarity, respectively.
126
Figure 3. Phylogenetic tree based on MLAGAN and diagram showing biosurfactant metabolic pathway comparison among Bacillus spp. Arrows with the same
color correspond to orthologous genes. Numbers into arrows, base pair (bp) length.
127
Another structurally conserved region found among the biosurfactant pathways was the end of
Srf operon, represented by srfAD gene. In B. safensis CCMA 560, as well as in all B. pumilus and B.
licheniformis strains under study, srfAD gene is 741 bp and codes for a protein containing 246 amino
acids. In B. subtilis and B. amyloliquefaciens, this gene is smaller, corresponding to 729 bp and 732 bp,
respectively. As observed for the sfp gene, the similarity of B. safensis CCMA 560 srfAD gene with B.
subtilis, B. licheniformis and B. amyloliquefaciens was smaller.
The complex SrfA-C was also structurally conserved (Figure 3). Through amino acid sequence
analysis, seven modules typical of peptide synthetases could be identified within the characterized srfA-
C genes in B. safensis CCMA 560. The SrfAA, SrfAB and SrfAC proteins are arranged in modules of 10, 10
and 4 domains, respectively. The srfAA gene is 10713 bp in length and codes for a 3570 amino acid-
protein. This protein has 10 modules, three of them are AMP-binding sites that are activated by Glu/Gln-
Leu-Leu amino acids, present in the biosurfactant structure. Furthermore, this gene has tree
condensation sites (C), three peptidyl carrier domains (PCP) and one epimerization domain (E) (Figure 4).
Although the amino acid sequences between B. safensis CCMA 560 and B. subtilis, B. amyloliquefaciens
and B. licheniformis have shown low similarity, the protein structure is very similar. The srfAB gene is
10701 bp in length and codes for a protein with 3566 amino acids. This protein also has shown
conserved modules, with three condensation sites, three peptidyl carrier domains (PCP) and one
epimerization domain (E) and all of them incorporate Val/Leu/Ile-Asp-Leu to the peptide. Finally, srfAC
gene is 3834 bp in length and codes for a protein containing 1277 amino acids. As well as the other
proteins belonging to the NRPS operon, it has shown structurally conserved domains among the species
under study. The protein structure has a C domain, followed by an AMP-binding domain that
incorporates isoleucine to the chain, a PCP domain and a TE domain attached to the end of the protein.
In B. subtilis and B. amyloliquefaciens, the operon structure is the same, although the AMP-binding
domain incorporates valine.
128
Figure 4. NRPS operon prediction diagram by antiSMASH for B. safensis strain CCMA 560. A, B, C and D: homologous structure with SrfA-D operon in B. subtilis. X and Y: different genes inserted in the metabolic pathway.
The greatest difference observed between B. safensis and the species B. subtilis, B.
amyloliquefaciens and B. licheniformis is the occurrence of two genes, ORFy and ORFx, inserted in the
operon and flanked by srfAC and srfAD genes. The ORFy is 8193 bp in length and codes for a protein
with 2730 amino acids. This protein has seven domains, two AMP-binding sites, a keto-redutase (KR),
two PCP, a condensation site and a TE. The ORFx is 10134 bp in length and codes for a protein
containing 3377 amino acids. The protein structure is also arranged in modules, the first module is
comprised by an AMP-binding site, a KR site and a PCP domain, followed by a second module with a C
domain, an AMP-binding site and a PCP domain, and the last domains are comprised by the
epimerization and condensation domains.
ORFx and ORFy (Figure 3) were analysed at the IMG/ER in order to find similar genes in other
genomes with the same top COG (COG1020) hit and roughly the same matching length. The results
showed that in addition to B. pumilus, other bacteria such as Bacillus sp. HYC-10, B. aerophilus KACC
16563 and B. stratosphericus LAMA-585 also harbour these ORFs in the same region of B. safensis
strains. The function of these ORFs has not been elucidated yet, but they showed 90% similarity with
linear gramicidin synthetase of B. pumilus ATCC 7061.
The phylogenetic tree generated using the MLAGAN alignment program (Brudno et al., 2003) is
represented by 2 main clades (Figure 3); clade A is represented by the species B. subtilis, B.
129
amyloliquefaciens and B. licheniformis and is responsible for the production of surfactin and lichenysin,
while clade B, where B. safensis CCMA 560 is located, is able to produce pumilacidin. Such
complementary analysis clearly shows that B. subtilis and B. amyloliquefaciens have a closely related
metabolic pathway, and both produce surfactin. B. pumilus and B. safensis species belong to clade B,
and both produce pumilacidin and have similar metabolic pathways (Table 2).
130
Table 2. Surfactin, linchenysin and pumilacidin variants.
Bacteria Lipopeptide
type
Position amino-acid sequence
Fatty-acid Ref.
1 2 3 4 5 6 7
B.subtilis and
B.amyloliquefaciens Surfactin
Glu Leu D-Leu Val Asp D-Leu Leu C14, C15 or C16
data reviewed
by Bonmatin
et al., 2003
Glu Orn D-Leu Val Asp D-Leu Ile C13 to C15
Glu Leu D-Leu Ala Asp D-Leu Leu C14 or C15
Glu Leu D-Leu Leu Asp D-Leu Leu C15
Glu Leu D-Leu Ile Asp D-Leu Leu C15
Glu Leu D-Leu Val Asp D-Leu Leu C14 or C15
Glu Leu D-Leu Val Asp D-Leu Ile C14 or C15
Glu Leu D-Leu Val Asp D-Leu Cys
Glu Leu D-Leu Val Asp D-Leu Orn
Glu Leu D-Leu Val Asp D-Leu Phe
Glu Ile D-Leu Ile Asp D-Leu Leu C15
Glu Val D-Leu Val Asp D-Leu Val C13 to C15
Glu Val D-Leu Val Asp D-Leu Ile C13 to C15
Glu Ile D-Leu Val Asp D-Leu Val C13 to C15
Glu Ile D-Leu Ile Asp D-Leu Ile C15
B.licheniformis Lichenysin
Gln Leu D-Leu Val Asp D-Leu Ile C13 to C15
Gln Leu D-Leu Ile Asp D-Leu Ile C15
Gln Leu D-Leu Val Asp D-Leu Val C13 to C15
Gln Ile D-Leu Val Asp D-Leu Ile C15
B.pumilus Pumilacidin Glu Leu D-Leu Leu Asp D-Leu Val
Naruse et al.
1990
131
Chemical characterization
The biosurfactant produced by B. safensis CCMA 560 was investigated trough FTIR analysis. The FTIR
spectrum displayed strong absorbing bands which are consistent with the presence of peptide and fatty
acid components (Figure 5). The stretching modes at 3300 cm-1 and 1650 cm-1 are related to N-H and
CO-N bond, respectively. In addition, the stretching mode at 1535 cm-1 can be associated to the
deformation mode of the N-H bond combined with the C-N stretching mode. The presence of an
aliphatic chain was indicated by the C-H stretching modes from 2970 to 2850 cm-1 and 1470-1370 cm-1.
Figure 5. Fourier transform infrared (FTIR) spectrum of the biosurfactant produced by B. safensis CCMA 560.
The chemical structure of the biosurfactant produced by B. safensis strain CCMA-560 was
confirmed by mass spectrometry analysis. The ESI(+)-MS showed ions of m/z 1036 [M + H]+, 1058 [M +
132
Na]+, and 1072 [M + Na]+, whereas the sodiated molecule of m/z 1072 was the most predominant
homologue in the biosurfactant sample (Figure 6).
Figure 6: ESI-HRT-MS data for the biosurfactant produced by B. safensis CCMA-560 with detection of Lipopeptides isoforms ions.
The peptide sequence was investigated by collision induced dissociation (Figure 7). The ion of
1036 [M+H]+ produced fragment ions of m/z 923, 808, 709, 596, 483, 370, and 227, which correspond to
the sequential loss of the amino acid residues Leu/Asp/Val/Leu/Leu/Leu/Glu-OMe (leucine, aspartic
acid, valine, and glutamic acid). The amino acid residues were present at a ratio of 4:1:1:1
(Leu/Asp/Val/Glu-OMe). As it can be observed, the loss of a 143 Da residue from m/z 370 to m/z 227
corresponds to the mass of methylated glutamic acid (Glu-OMe), confirming that the glutamic acid
residue was esterified with a methyl group (Figure 7a). Additionally, the ion of m/z 227 is associated
with an aliphatic fatty acid chain containing 14 carbons in the normal, iso or anteiso forms. The
fragmentation would be however indistinguishable from Ile by mass spectrometry because Ile and Leu
are isomers presenting the same molecular mass.
Figure 7b shows the ESI(+)-MS/MS data with the dissociation pattern of the ion of m/z 1058, and
two different sequential losses of amino acids are noted The first is assigned with the amino acid
133
sequence of Leu/Val/Asp/Leu/Leu/Leu/GluOMe. The second suggests an amino acid sequence
equivalent to Val/Leu/Asp/Leu/Leu/Leu/GluOMe. It was possible to observe that both homologues are
structurally similar although the amino acids at the positions 1 and 2 are different. This is an indicative
that the biosurfactant sample contains two different homologues/isoforms for the same protonated
molecule of m/z 1058. The peptide sequence of the ion of m/z 1072 was also investigated (Figure 7c),
and found to be Leu/Asp/Leu/Leu/Leu/Leu/GluOMe. This sequence was very similar to the previous
sequence described for the ion of m/z 1036, except by the replacement of amino acid at position 3 (Val)
by Leu. Additionally, the presence of an ion of m/z 391 indicates that the Glu-OMe is directly linked with
the C14 fatty acid chain.
The biosurfactant produced by B. safensis strain CCMA-560 is likely comprised therefore by a
cyclic heptapeptide and a lipid portion with a chain length of 14 carbons (Figure 8). The amino acids
composition between the isoforms is very similar, although its sequence can be variable. Specifically for
the ions of m/z 1036, 1058, and 1072, it was observed that the amino acids at positions 1, 2, and 3
change positions in the peptide ring. For instance, the ion of m/z 1036 displayed the amino acids
Leu/Asp/Val at position 1, 2, and 3 whereas the ion of m/z 1072 showed an amino acid sequence of
Leu/Asp/Leu. On the other hand, the ion of m/z 1058 was found to have two different isoforms with the
amino acids sequences of Leu/Val/Asp or Val/Leu/Asp at the positions 1, 2, and 3 in the peptide moiety.
Finally, the biosurfactant was found to be composed by a mixture of at least 4 lipopeptides which differ
in their sequence of amino acids in the peptide ring. For all of those homologues, the lipid portion was
comprised by a fatty acid with length chain of 14 carbons.
134
Figure 7. ESI(+)-HRT-MS/MS for CID of the ions of (a) m/z 1036, (b) m/z 1058, and (c) m/z 1072.
135
Figure 8: Illustration of the primary chemical structure for the biosurfactant produced by B. safensis strain CCMA-560. R represents the isomers for the terminal part of the fatty acid chain (iso, anteiso, and normal).
DISCUSSION
The biosurfactant production in Bacillus safensis, as well as in other Bacillus spp. is regulated via non-
ribosomal peptidase synthetases (NRPS) and the corresponding genes are organized in an operon.
Downstream to this operon there is a sfp gene, required for the members of the genus Bacillus to
become a lipopeptide producer (Nakano et al., 1992). Although the similarity was low between B.
safensis and other Bacillus studied in this work, the Sfp protein encoded by B. safensis CCMA 560
belonged to the 4'-phosphopantetheinyl transferase family (pfam01648), as well as the B. subtilis Sfp
protein, which has been characterized elsewhere (Nakano et al., 1992). The B. pumilus sfp gene is an
136
orthologous of sfp from B. subtilis, and due to the evidences showed herein, we can suggest that this
gene has the same function in B. safensis.
As already described above, the SrfA-D complex also showed structurally conserved region. The
srfAD locus has already been elucidated in B. subtilis; in this species the surfactin can be formed by the
interaction of the three amino acid activating components of surfactin synthetase SrfA, B and C in a
process stimulated by SrfD (Steller et al., 2004). Although the amino acid sequence similarity was lower
than 50% between B. subtilis and B. safensis, the protein encoded by B. safensis CCMA 560 srfAD gene
has a thioesterase domain, such as in B. subtilis. This protein is required for the addition of the last
amino acid to the peptide, thereby forming a cyclic biosurfactant (Schneider et al., 1998). As well as sfp
and srfAD, the SrfA-C complex has structurally conserved domains among the species under study. All
peptide synthetases involved in lipopeptide production have a C domain as their very first position. This
C domain is supposed to serve as an acceptor for a fatty acid which is transferred by acyltransferase.
This acylation process has been observed for surfactin biosynthesis (Konz et al., 1999). Basically, the
operon and protein structures are conserved in all strains surveyed in this work, however the sequence
similarity is low due to the different aminoacids incorporated in the AMP-binding sites, which lead to
differences in the metabolite structure.
B. safensis CCMA 560 operon coding for the lipopeptide harbours two ORFs flanked by sfrAC and
srfAD. ORFx and ORFy are probably not involved in biosurfactant synthesis due to two apparent reasons.
Firstly, the biosurfactant structure observed through chemical analyses (FTIR and MS) was shown to
have almost the same amino acid sequence that was predicted by antiSMASH, suggesting that although
the metabolic pathway harbours these two ORFs, they have not incorporated any amino acid into the
lipopeptide. Secondly, unlike what has been described so far for peptide synthetases involved in the
production of lipopeptides, the first domain of ORFX and ORFY proteins is an AMP-binding instead of a C
137
domain (Koss et al., 1999). Both ORFs were analysed at the IMG/ER showing 90% similarity with linear
gramicidin synthetase. This is a cycle decapeptide antimicrobial compound produced by Bacillus brevis
also via NRPS (Kessler et al., 2004). These data altogether suggest that the B. safensis CCMA 560
produces an analogue of gramicidin using the same gene regulation system of the lipopeptide.
The antiSMASH pipeline is capable of identifying biosynthetic loci covering the whole range of
known secondary metabolite compound classes and it is an effective tool for in silico identification of
the most promising targets within genomes (Madena et al., 2011). Although amino acid prediction
carried out using this pipeline was different from the one inferred by chemical characterization, this
platform was useful to unveil the protein structure, specially the inserted genes in the operon.
The surfactin is the lipopeptide produced by B. subtilis composed by a heptapeptide interlinked
with a β-hydroxy fatty acid containing 13 to 15 C atoms (Arima et al., 1968). Our results strongly indicate
that the biosurfactant produced by B. safensis contains a peptide-like moiety and also an aliphatic chain
in its structure. Furthermore, the biosurfactant seems to belong to the well-known class of biological
surfactants so-called as lipopeptides. Besides, the FTIR spectrum for the biosurfactant produced by B.
safensis CCMA 560 was very similar to the ones of other lipopeptides described previously (Joshi et al.,
2004; Pueyo et al., 2009; Faria et al., 2011) and its chemical structure slightly different from the surfactin
produced by B. subtilis. Several Bacillus strains were shown to be able to produce surfactin homologues
(Nitschke and Pastore, 2006; Liu et al., 2009; Li et al., 2010; Pereira et al., 2013). The original surfactin,
produced by a soil isolated B. subtilis strain, is a cyclic lipopeptide with seven amino acids
(Glu/Leu/Leu/Val/Asp/Leu/Leu) in the protein moiety and a fatty acid portion containing from 13 to 15
carbon atoms (Arima et al., 1968). Although the amino acid composition in the biosurfactant of B.
safensis CCMA 560 is almost the same to the one of surfactin (Sigma), some differences in the structural
composition could be detected. For instance, valine has been replaced by leucine at position 4 in the ion
138
at m/z 1036. In addition, the acid glutamic residue in the biosurfactant produced by B. safensis CCMA
560 was found to be esterified when compared with surfactin (Sigma). Moreover, the lipophilic
component in the biosurfactant has a fatty moiety of 14 carbon atoms instead of 15 found in the
commercial surfactin Sigma. Naruse et al. (1990) described the production of a complex mixture of
biosurfactant homologues by a B. pumilus strain. The biosurfactant was called as pumilacidin and the
homologue structures were systematically categorized in seven different groups (A, B, C, D, E, F, and G)
based on the differences in their fatty acid chain and/or amino acid composition. In general, they were
classified as lipopeptides composed by a hydroxyl fatty acid and a peptide portion containing L-Leu/D-
Leu/L-Glu/L-Asp/L-Ileu (or Val). Kalinoviskaya et al. (1995) also studied the production of lipopeptides by
a B. pumilus strain isolated from the marine sponge Ircina sp. They identified the biosurfactant sample
as a complex mixture of pumilacidins, which had an identical peptide ring, but the length of the fatty
acid chains was different. More recently, Kalinoviskaya et al. (2002) studied the surfactants produced by
a marine B. pumilus KMM 1364 isolated from the surface of the ascidian Halocynthia aurantium. The
structural characterization revealed the presence of a mixture of lipopeptides which presented a
chemical composition very close to the surfactin. Similarly to the present work, these lipopeptides
produced by the KMM 1694 strain differed from surfactin by a substitution of valine residue by leucine
at position 4. They have also isolated two surfactin isoforms with valine or isoleucine at position 7 in the
peptide ring. In addition, homologues with lipophilic chains of 15, 16, and 17 carbon atoms were also
determined. It can be assumed that the surface active compounds produced by B. pumilus and other
strains of the Bacillus genus are closely related, but may eventually differ in terms of the fatty acid
length and as well as sequence and amino acid composition. Finally, the structural diversity of
biosurfactants might be affected by the fermentative conditions such as the source of nutrients,
temperature and pH. A better understanding about the genetics of the biosurfactant production and the
139
regulatory mechanisms that control the lipopeptide biosynthesis will be of great relevance for future
biotechnological applications.
This is the first report on the biosurfactant production by Bacillus safensis, as well as its
metabolic pathway and chemical characterization. Although the biosurfactant produced by B. safensis
CCMA 560 was shown to be chemically similar to the ones produced by B. subtilis, B. licheniformis and B.
amyloliquefaciens strains, the genetic and chemical data gathered in this work contribute to broaden
the knowledge about microbial surfactants and pave the way for the prospection of new biosurfactant
molecules from other Bacillus species. Finally, the genetic knowledge may allow further development
and use of overproducing or recombinant strains for enhanced biosurfactant yields.
ACKNOWLEDGEMENTS
We acknowledge the São Paulo Research Foundation - FAPESP for financial support (Process numbers
2010/15519-3, 2011/50809-5 and 2011/50243-1). Genome sequencing, correction, and assembly were
funded by CSIRO Animal, Food and Health Sciences. We are thankful to Prof. Dr. Anita J. Marsaioli and
Prof. Dr. Anete Pereira de Souza for sharing the genome data of Bacillus safensis CFA-06. The authors
thank Prof. Dr. Oswaldo Luiz Alves for his valorous assistance with the FTIR analysis.
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151
4. DISCUSSÃO GERAL
O petróleo é uma das substâncias mais utilizadas na sociedade moderna. Ele não é só matéria
prima de plásticos e outros produtos, mas também é combustível para a produção de energia, para a
indústria, aquecimento e transporte. Os combustíveis derivados do petróleo fornecem mais da metade
da energia consumida no planeta. A gasolina, querosene e óleo diesel são combustíveis para
automóveis, caminhões, tratores, navios e aviões. O óleo combustível e o gás natural são usados para
aquecimento de residências e prédios comerciais, bem como em gerador de eletricidade. Ainda, os
produtos derivados do petróleo são materiais utilizados em fibras sintéticas para roupa e plástico, tintas,
fertilizantes, inseticidas, sabões e borracha sintética. Portanto, o petróleo é fonte de matéria prima em
uma infinidade de produtos da indústria moderna (Speight, 2014).
Devido à crescente demanda de utilização do petróleo, é inevitável a ocorrêcia de problemas
inerentes à exploração e contaminação ambiental, tornando premente o desenvolvimento de pesquisas
que permitam a viabilização de processos economica e ambientalmente sustentáveis. Atualmente, uma
alternativa que tem se destacado, é a utilização dos surfactantes biológicos, ou biorssurfactantes, para
aplicação em tecnologias como Microbial Ehnhanded Oil Recovery (MEOR) ou mesmo na
biorremediação. Os biossurfactantes tem oferecido a possibilidade de subtituição dos surfactantes
químicos, que são produzidos por fontes não renováveis.
O uso dos surfactantes tem crescido muito ao longo das últimas décadas, entretanto, é difícil
determinar números exatos de produção em um mercado tão variado. No entanto, foi estimado que 8,8
kilotoneladas foram utilizadas em 1995 e esse número subiu para 13 kilotoneladas em 2008 (Marchant
& Banat, 2012). Uma estimativa mostra que para a produção de 1 tonelada de surfactante químico são
emitidas 4,27 toneladas de CO2 na atmostera (Petel et al. 1999). De acordo com a Agência de Proteção
Ambiental dos Estados Unidos, a combustão de um galão de gasolina produz aproximadamente 8,8 kg
de CO2, sendo assim, a estimativa anual do uso de surfactantes químicos é equivalente à combustão de
3,6 bilhões de galões de gasolina. Se a produção de todo o surfactante químico fosse substituída pela
produção de surfactante a partir de óleo vegetal, a emissão de CO2 cairia 37% (Patel, 2004). Entretanto,
essa hipótese tem necessidade de gerenciamento cuidadoso para evitar que a produção de óleo vegetal
152
destrua a vegetação nativa, uma vez que esta é essencial no ciclo do CO2 e manutenção da
biodiversidade (Danielson et al. 2009; Fitzherbert et al. 2008).
Frente ao cenário mundial de proteção ambiental e desenvolvimento sustentável, há uma
grande necessidade de se recorrer a fontes alternativas para produção de surfactantes, e uma das
possibilidades é a utilização de micro-organismos. Estes, por sua vez, tem a capacidade de produzir
biossurfactante a partir de fonte renovável, produção independente de condições climáticas,
possibilidade de utilização de matérias-primas regionais, maior rapidez na obtenção do produto acabado
e produção em espaço relativamente pequeno (Parikhi & Madamwar, 2006). Entretanto, ainda existem
algumas limitações na utilização dos biossurfactantes, uma vez que o baixo rendimento e o alto custo de
produção inviabilizam o processo, sendo difícil a competição com os surfactantes de origem química
(Marchant & Banat, 2012). Neste sentido, o processo do crescimento do micro-organismo é a chave
para a redução do custo de produção, o qual pode empregar diferentes bactérias e substratos.
Neste trabalho, um dos objetivos foi otimizar a produção de biossurfactante para melhorar o
rendimento e diminuir o custo de produção em escala laboratorial. A metodologia de planejamento
Plackett - Burman (P&B) foi eficiente como método de triagem das melhores fontes de carbono e
nitrogênio para a produção de biossurfactantes pelas linhagens estudadas, B. safensis CCMA-560 e
Gordonia sp. CCMA-559, com redução da tensão superficial para 29,5 mN/m e 37,2 mN/m,
respectivamente. A Gordonia sp. CCMA-557 aumentou ainda a capacidade emulsificante de 35% para
53%. Resultados similares aos observados nesse trabalho foram obtidos por Joshi e colaboradores
(2008) quando estudaram a linhagem B. subtilis 20B. Com a utilização do planejamento experimental
para a otimização da produção de biossurfactantes, essa linhagem passou a reduzir a tensão superficial
para 29,2 mN/m. Outros estudos também foram realizados com espécies de Bacillus e todos
demonstraram resultados bem sucedidos com a utilização de metodologias de planejamento
experimental (Liu et al. 2012; Abdel-Mawgoud et al. 2008). Entretanto, em todos os estudos foi
observado que a fonte de carbono que mais influencia positivamente a produção do biossurfactante é a
glicose. No presente trabalho observamos que a glicose é um fator que interfere negativamente na
produção, sendo o óleo de soja a melhor fonte de carbono a ser trabalhada. Sendo assim, como
perspectiva futura para melhorar o custo de produção, um novo planejamento experimental para
otimização poderá ser realizado com óleo residual de fritura, estratégia que já vem sendo utilizada por
Halim et al. (2009). A utilização de resíduos industriais de baixo-custo como substrato para o
crescimento dos micro-organismos é uma alternativa para reduzir significativamente o custo de
153
produção (Pacwa-Plociniczak et al. 2011). O principal desafio na utilização de resíduos é a obtenção do
substrato com o equilíbrio apropriado para suportar o crescimento celular, bem como o rendimento
adequado e consistente do produto final (Nitschke & Pastore, 2006). Fontes de nitrogênio também
foram avaliadas neste trabalho, além de papel fundamental no crescimento celular, estas também se
mostraram importantes na produção de biossurfactante pela linhagem B. safensis CCMA-560. É sugerido
que a importância de fontes de nitrogênio na produção do biossurfactante por Bacillus spp. é devida à
composição da molécula de lipopeptídios.
No planejamento experimental da linhagem de Gordonia sp. CCMA-559 foram obtidos bons
resultados com relação à otimização das condições de crescimento para a produção de CASs. Além de
obter as condições ideais de crescimento desse micro-organismo para a produção de CASs, também foi
observado nitidamente que dependendo das condições de cultivo a linhagem tem resposta fisiológica
diferente, produzindo biossurfactante ou bioemulsificante. Ao avaliar as fontes de carbono que
influenciam a produção, observamos que o hexadecano responde positivamente, bem como o óleo de
soja. A utilização do hexadecano para a produção de CASs por linhagens de Gordonia também foi
realizada com sucesso por outros grupos de pesquisa, sendo observando o aumento na produção de
CASs (Franzetti et al. 2009, Pagilla et al. 2002). Nos experimentos realizados, quando a concentração de
hexadecano foi aumentada, a linhagem diminuiu a produção de biossurfactante e passou a produzir
com maior eficiência um emulsificante. Franzetti e colaboradores também observaram a produção de
dois tipos CASs pelA linhagem Gordonia sp. BS29, um que apresenta boa atividade emulsificante
(exopolissacarídio) e um que apresenta boa atividade de biossurfactante (glicolipídio) (Franzetti et al.
2009a).
Também, podemos citar outra forma de melhoramento da produção dos biossurfactantantes, o
melhoramento genético. Para isso, é fundamental o conhecimento detalhado das vias metabólicas e dos
genes que estão envolvidos no processo. Os bioprocessos normalmente dependem de micro-
organismos superprodutores, mesmo com a utilização de matéria prima de baixo custo, otimização nas
condições de cultivo e métodos eficientes de recuperação do produto final, o processo só é viável se
houver alto rendimento (Mukherjee et al. 2006). Mesmo conhecendo a importância de se estudar as
vias metabólicas dos micro-organismos produtores de biossurfactantes, ainda há poucos estudos
disponíveis na literatura, talvez devido à diversidade dessas vias, o que dificulta as análises. Os estudos
concentram-se em espécies de B. subtilis, B. licheniformis e P. aeruginosa. Neste trabalho, foi estudada a
via metabólica da produção de pumolicidina, lipopeptídio produzido por linhagens de B. safensis. Este
154
foi o primeiro trabalho de caracterização química e genética do biossurfactante produzido por essa
espécie de Bacillus. Os dados fisiológicos, obtidos através do planejamento experimental, químicos e
genéticos combinados fornecem informações importantes para estudos posteriores visando a produção
do biossurfactante por micro-organismo recombinante com maior rendimento e melhores
características químicas.
A outra linhagem bacteriana que despertou interesse ao longo desse trabalho foi Gordonia sp.
CCMA-559. O gênero Gordonia tem sido amplamente estudado e tem gerado interesse na comunidade
científica devido ao grande potencial de biorremediação e biodegradação (Yoon et al. 2000). Muitas
espécies de Gordonia apresentam a capacidade de degradar ou modificar hidrocarbonetos alifáticos e
aromáticos, compostos aromáticos halogenados, poli-isopreno, xileno, entre outros. A incorporação das
cadeias alifáticas longas dos ácidos micólicos na parede celular está associada com a hidrofobicidade e
adesão de superfície, e pode ter um papel importante na degradação de poluentes hidrofóbicos
(Bendinger et al. 1993). Esse gênero de bactérias também tem a habilidade de degradar outros
compostos xenobióticos, como butil-éter, metil-butil-éter, alcanos cíclicos e hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos (Kastner et al. 1998, Hernandez-Perez et al. 2001).
A capacidade de biodegradação de compostos insolúveis e hidrofóbicos está geralmente
associada com a produção de (CASs) pelo micro-organismo (Banat et al. 2000). A importância dos CASs
na degradação de poluentes ocorre devido a: (i) o biossurfactante, tal como o ácido micólico, causa a
aderência da célula microbiana em fases hidrofóbicas em sistemas bifásicos (Nazina et al. 2003); (ii) os
surfactantes promovem o acesso do micro-organismo a fontes hidrofóbicas através da redução da
tensão superficial (Fiechter, 1992); e (iii) os CASs dispersam os compostos hidrofóbicos, aumentanto a
área de superfície para o ataque microbiano (Finnerty, 1994). A produção de CASs tem sido relatada em
diversas espécies de Gordonia, sendo que, em geral, G. amarae é a mais estuda. Tendo em vista a
capacidade de espécies de Gordonia produzirem CASs e apresentarem alta capacidade de degradação,
isso foi abordado neste trabalho. Embora os dados do sequenciamento do genoma tenham sido
apresentados neste trabalho, dificuldades foram encontradas para a caracterização genética da via
metabólica em função da escassez de informações sobre as bases genéticas da produção de
biossurfactantes por micro-organismos similares nas bases de dados. Entretanto, essa espécie de micro-
organismo tem fornecido dados promissores de produção de enzimas, degradação de hidrocarbonetos
(dados não mostrados) e produção de CASs.
155
Além da abordagem dependente-de-cultivo (cultivo, avaliação e otimização da produção de
biossurfactante e genômica), também foi utilizada neste trabalho a abordagem independente-de-cultivo
(metagenômica) para a prospecção de biossurfactantes a partir de sedimentos de manguezais. Esta
etapa teve início com a construção de uma biblioteca fosmidial de DNA com alto peso molecular (25-40
kb) visando a subsequente triagem de vias metabólicas completas de biossurfactantes, uma vez que
essas normalmente estão localizadas em grandes operons. Muitos trabalhos empregaram essa
abordagem para a prospecção de enzimas, como esterases (Henne et al. 2000; Rondon et al. 2000),
proteases (Gupta et al. 2002), quitinases (Cottreel et al. 1999) e celulases (Rees et al. 2002, Kim et al.
2013), resultando na detecção e caracterização genética e/ou química das mesmas. Um dos fatores que
contribuem para isso, é que normalmente essas enzimas são codificadas por genes pequenos, os quais
independem da regulação por genes localizados em outra região do genoma, diferente do que ocorre
com os biossurfactantes. Do pouco que é conhecido da genética dos biossurfactantes, podemos afirmar
que as vias metabólicas são muito complexas, sendo reguladas por genes externos ao operon, ou ainda
sendo expressas de acordo com o ambiente que o micro-organismo se encontra (Nakano et al. 1988,
Ochsner et al. 1994, Rahim et al. 2001, Nakar& Gutnik 2003). Aliado a isto, a grande diversidade química
dos biossurfactantes compromete as metodologias para o screening, dificultando ainda mais o sucesso
dessa abordagem.
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158
159
5. CONCLUSÃO GERAL
I) Embora a metagenômica seja uma ferramenta eficiente na prospecção de novos compostos
microbianos, neste trabalho não tivemos sucesso na busca de biossurfactantes. Isto ocorreu
devido à complexidade das vias metabólicas, o que dificultou o acesso através de bibliotecas
metagenômicas.
II) Este foi o primeiro trabalho na literatura a reportar análises fisiológica, genética e química
da produção de biossurfactantes em linhagem de Bacillus safensis. Além disso, esse micro-
organismo teve a capacidade de reduzir a tensão superficial do meio para 29,5 mN/m,
mostrando um potencial de aplicação em biorremediação e Microbial Enhanced Oil
Recovery.
III) O biossurfactante produzido pela linhagem de B. safensis CCMA-560 é semelhante ao
produzido por espécies de B. pumilus, ainda assim o conhecimento e caracterização desses
compostos são importantes no sentido em que podem permitir a manipulação genética
futura para a construção de micro-organismos superprodutores visando a aplicação na
indústria.
IV) O planejamento experimental do tipo P&B e DCCR foi uma abordagem eficiente para
aumentar a produção do biossurfactante nas linhagens estudadas. Com essa metodologia,
poucas bateladas de experimentos foram realizadas para analisar multi-fatores que
influenciam a produção de biosurfactantes, otimizando o tempo e o custo de produção.
V) Com base nos dados obtidos no planejamento experimental da linhagem da Gordonia sp.
CCMA-559, a produção de Compostos Ativos de Superfície é estimulada por fontes de
carbono hidrofóbicas, como o hexadecano e o óleo de soja. Quando a concentração de
hexadecano é maior que a de óleo de soja, a linhagem produz mais bioemulsificante;
entretanto, em concentrações iguais das duas fontes há uma maior produção de
biossurfactante, indicando que a linhagem apresenta duas vias metabólicas distintas, uma
para a produção de bioemulsificante e outra de biossurfactante.
VI) Devido a diminuição das reservas petrolíferas e a elevação no custo de obtenção do
petróleo, o MEOR mostra-se uma tecnologia promissora para o aumento de recuperação
deste recurso energético. No entanto, a aplicação in situ de micro-organismos produtores
de CASs apresenta uma grande limitação que é o crescimento microbiano sob as condições
extremas presentes nos reservatórios. Desta forma, a produção do CASs ex situ para a
posterior aplicação no reservatório mostra-se uma alternativa em potencial. Sendo assim, o
melhoramento da produção CASs através de planejamento experimental, bem como o
160
conhecimento das estruturas químicas e das vias metabólicas envolvidas na síntese de
biossurfactantes/bioemulsificantes, agregam conhecimento para a otimização e redução de
custo no processo.
161
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
Os biossurfactantes produzidos por B. safensis CCMA-560 e Gordonia sp. CCMA-559 serão
testados em ensaios de recuperação de petróleo em núcleo poroso em escala laboratorial a fim
de avaliar seu potencial de aplicação em MEOR;
Serão realizados ajustes na metodologia de extração e purificação dos CASs produzidos por
Gordonia sp. CCMA-559 visando a caracterização química dos compostos;
Após a caracterização química dos CASs produzidos por Gordonia sp. CCMA-559, será realizada a
caracterização genética das vias metabólicas;
Com o sequenciamento e a disponibilização dos dados do genoma das duas linhagens utilizadas
nesse trabalho, outros estudos de prospecção de enzimas e/ou outros metabólitos poderão ser
realizados, com a vantagem de conhecer a anotação desses micro-organismos
A biblioteca metagenômica obtida, com 12.800 clones, encontra-se preservada em glicerol a -
80oC na Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria (CBMAI/UNICAMP) e
poderá ser utilizada em estudos futuros para a prospecção de compostos com atividade
biológica cujos operons ou vias metabólicas não sejam complexas.
162
163
7. ANEXOS
Anexo 1. Resposta do ensaio
P&B de B. safensis CCMA 560
N° do
ensaio Resposta (mN/m)
1 44,1
2 46,1
3 55,3
4 42,4
5 41,6
6 45,4
7 50,3
8 50,6
9 39,1
10 51,5
11 36,2
12 36,1
13 50
14 49,8
15 29,5
16 69,2
17 39,5
18 43,2
19 36,7
164
Anexo 3. Respostas das análises de DDCR de B. safensis
CCMA-560
Ensaio Tensiometria
(mN/m)
E24
(%)
Ex. Bruto
(g)
1 28 15 0,1429
2 28,5 10 0,1421
3 28,8 25 0,1304
4 29 5 0,0982
5 30,4 0 0,0966
6 28,7 20 0,1519
7 29,1 20 0,1149
8 28,5 30 0,1311
9 29,4 15 0,0911
10 28,2 35 0,1237
11 29,2 30 0,111
12 28,9 15 0,1324
13 29,1 10 0,1128
14 27,6 0 0,1249
15 28,8 10 0,1579
16 35,3 0 0,0629
17 29,4 15 0,1312
Anexo 2. Efeito de cada variável e estimativa do p-valor.
Efeito Erro Padrão t(6) p-valor
Mean/Interc. 24,11579 1,470202 16,40305 0,000003
Sacarose 2,37500 3,204231 0,74121 0,486553
Hexadecano -1,92500 3,204231 -0,60077 0,569977
Glicerol -1,05000 3,204231 -0,32769 0,754277
Óleo de soja 12,00000 3,204231 3,74505 0,009565
Glicose -0,25000 3,204231 -0,07802 0,940348
Uréia 0,27500 3,204231 0,08582 0,934399
(NH4)2SO4 1,60000 3,204231 0,49934 0,635318
Peptona 6,30000 3,204231 1,96615 0,096866
Ex. levedura 6,02500 3,204231 1,88033 0,109106
K2HPO4 4,62500 3,204231 1,44340 0,199014
KH2PO4 1,10000 3,204231 0,34330 0,743085
NaCl 5,62500 3,204231 1,75549 0,129702
As variáveis destacadas em vermelho foram as que apresentaram nível de significância (p<0,1) na produção de biossurfactante pela linhagem CCMA-560.
165
Anexo 4. Coeficientes de regressão gerados a partir da tensiometria
Fator Coefiente de
regressão Erro padrão t(7) p-valor
Mean/Interc. 28,72389 0,391653 73,34015 0,000000
Óleo de soja (L) -0,26501 0,184031 -1,44002 0,193044
Óleo de soja (Q) 0,05523 0,202743 0,27241 0,793166
Peptona (L) -0,05159 0,184031 -0,28036 0,787307
Peptona (Q) 0,14381 0,202743 0,70930 0,501071
Ex. levedura (L) -0,00879 0,184031 -0,04779 0,963220
Ex. levedura (Q) -0,10421 0,202743 -0,51400 0,623077
Óleo de soja e Peptona (L) 0,10000 0,240342 0,41607 0,689816
Óleo de soja e Ex. Levedura (L) -0,37500 0,240342 -1,56028 0,162661
Peptona e Ex. Levedura (L) -0,35000 0,240342 -1,45626 0,188662
(L) – Linear / (Q) – Quadrátrático
Anexo 5. Coeficientes de regressão gerados a partir do extrato bruto
Fator Coefiente de
regressão Erro padão t(7) P
Mean/Interc. 0,116659 0,016805 6,942047 0,000223
Óleo de soja (L) 0,006835 0,007896 0,865655 0,415360
Óleo de soja (Q) -0,001263 0,008699 -0,145162 0,888674
Peptona (L) -0,001682 0,007896 -0,212989 0,837406
Peptona (Q) 0,003804 0,008699 0,437265 0,675091
Ex. levedura (L) 0,000090 0,007896 0,011398 0,991224
Ex. levedura (Q) 0,002794 0,008699 0,321187 0,757446
Óleo de soja e Peptona (L) -0,008813 0,010312 -0,854554 0,421079
Óleo de soja e Ex. Levedura (L) 0,013063 0,010312 1,266680 0,245787
Peptona e Ex. Levedura (L) 0,006738 0,010312 0,653340 0,534400
166
Anexo 6. Coeficientes de regressão gerados a partir do teste E24
Fator Coefiente de
regressão Erro Padrão t(7) P
Mean/Interc. 0,084968 0,051958 1,635334 0,145994
Óleo de soja (L) 0,028289 0,024414 1,158728 0,284564
Óleo de soja (Q) 0,053581 0,026896 1,992126 0,086619
Peptona (L) 0,007182 0,024414 0,294185 0,777149
Peptona (Q) 0,044723 0,026896 1,662798 0,140304
Ex. levedura (L) -0,001319 0,024414 -0,054034 0,958418
Ex. levedura (Q) -0,017281 0,026896 -0,642497 0,541014
Óleo de soja e Peptona (L) -0,031250 0,031884 -0,980106 0,359685
Óleo de soja e Ex. Levedura (L) 0,068750 0,031884 2,156233 0,067985
Peptona e Ex. Levedura (L) 0,031250 0,031884 0,980106 0,359685
Anexo 7. Resposta do ensaio P&B de Gordonia sp. CCMA-559.
N° do ensaio
Resposta (mN/m)
1 50,3
2 42,7
3 61,4
4 39,2
5 41,7
6 44,5
7 46,6
8 56,7
9 42,3
10 45,5
11 45,6
12 48,6
13 46,6
14 57,5
15 37,2
16 71,1
17 45,8
18 41,4
19 37,9
167
Anexo 8. Efeito de cada variável e estimativa do p-valor.
Efeito Erro padrão t(6) p-valor
Mean/Interc. 23,59474 1,713356 13,77107 0,000009
Sacarose 0,76250 3,734172 0,20420 0,844951
Hexadecano 5,68750 3,734172 1,52310 0,178566
Glicerol -0,83750 3,734172 -0,22428 0,829982
Óleo de soja 10,76250 3,734172 2,88217 0,027978
Glicose 2,06250 3,734172 0,55233 0,600675
Uréia 1,56250 3,734172 0,41843 0,690195
(NH4)2SO4 -1,76250 3,734172 -0,47199 0,653609
Peptona 6,33750 3,734172 1,69716 0,140589
Ex. levedura 3,63750 3,734172 0,97411 0,367621
K2HPO4 4,16250 3,734172 1,11470 0,307625
KH2PO4 -1,76250 3,734172 -0,47199 0,653609
NaCl 4,63750 3,734172 1,24191 0,260612
As variáveis destacadas em vermelho foram as que apresentaram nível de significância (p<0,1) na produção de biossurfactante pela linhagem CCMA-
559.
168
Anexo 9. Respostas das análises de DDCR 2
3 de Gordonia sp. linhagem CCMA-559
Ensaio Tensiometria
(mN/m)* Espalhamento do óleo (mm)*
E24 (%) *
Hexadecano Óleo diesel Querosene
1 29,2 37 0 0 0
2 31,1 32 0 0 0
3 30,4 19 0 0 0
4 31,2 14 0 0 0
5 29,1 28 0 0 0
6 30 27 0 0 0
7 33,6 15 0 0 0
8 29,4 30 0 0 0
9 31,1 26 0 0 0
10 40,9 3 0 0 0
11 43,9 0 0 0 0
12 34,2 6 0 0 0
13 39,7 10 0 0 0
14 29,7 21 0 0 0
15 40,6 16 0 0 0
16 38,9 16 0 0 0
17 40 17 0 0 0
* Todas as leituras foram realizadas em triplicata e os valores da tabela representam a média.
Anexo 10. Coeficientes de regressão para o DCCR 23 gerados a partir da tensiometria
Coeficiente
de regressão Erro
padrão t(7) p-valor
Mean/Interc. 3,67474 3,186794 1,153115 0,286713
Hexadecano(L) -1,16264 1,497421 -0,776429 0,462919
Hexadecano(Q) 2,66988 1,649675 1,618425 0,149604
Óleo de soja(L) 0,81320 1,497421 0,543070 0,603936
Óleo de soja(Q) 1,58923 1,649675 0,963362 0,367457
Peptona (L) 1,21658 1,497421 0,812451 0,443282
Peptona (Q) 3,13048 1,649675 1,897632 0,099552
Hexadecano (L) e Óleo de soja (L) 0,77500 1,955611 0,396296 0,703690
Óleo de soja (L) e Peptona (L) 0,75000 1,955611 0,383512 0,712722
Hexadecano (L) e Peptona (L) -0,32500 1,955611 -0,166188 0,872707
169
Anexo 11. Coeficientes de regressão para o DCCR 23 gerados a partir do espalhamento do óleo
Coeficiente de regressão
Erro padrão
t(7) p-valor
Mean/Interc. 15,36095 7,276039 2,111169 0,072663
Hexadecano(L) -2,53870 3,418888 -0,742550 0,481923
Hexadecano(Q) 2,60480 3,766512 0,691567 0,511487
Óleo de soja(L) -2,63250 3,418888 -0,769989 0,466492
Óleo de soja(Q) -1,46975 3,766512 -0,390215 0,707980
Peptona (L) 1,20779 3,418888 0,353269 0,734287
Peptona (Q) 2,95911 3,766512 0,785635 0,457844
Hexadecano (L) e Óleo de soja (L) 2,00000 4,465021 0,447926 0,667741
Óleo de soja (L) e Peptona (L) 3,00000 4,465021 0,671889 0,523203
Hexadecano (L) e Peptona (L) 3,25000 4,465021 0,727880 0,490312
Coeficiente de regressão
Erro padrão
t(5) p-valor
Mean/Interc. 38,48247 2,607468 14,75856 0,000026
Hexadecano (L) 0,95120 1,599141 0,59482 0,577857
Hexadecano (Q) 1,64772 1,908191 0,86350 0,427333
Peptona (L) -2,92382 1,599141 -1,82837 0,127034
Peptona (Q) 6,17466 1,908191 3,23587 0,023055
Hexadecano (L) e Peptona (L) 0,32500 2,258160 0,14392 0,891183
Coeficiente de regressão
Erro padrão
t(5) p-valor
Mean/Interc. 4,632888 4,036292 1,147808 0,302983
Hexadecano (L) 2,478624 2,475428 1,001291 0,362651
Hexadecano (Q) 1,571810 2,953830 0,532126 0,617425
Peptona (L) 0,427522 2,475428 0,172706 0,869656
Peptona (Q) 0,062832 2,953830 0,021271 0,983852
Hexadecano (L) e Peptona (L) 2,000000 3,495573 0,572152 0,591982
Anexo 12. Coeficientes de regressão para o DCCR 22 gerados a partir de tensiometria
Anexo 13. Coeficientes de regressão para o DCCR 22 gerados a partir de espalhamento do
óleo
170
Coeficiente de regressão
Erro padrão
t(5) p-valor
Mean/Interc. 44,1877 6,167500 7,16461 0,000824
Hexadecano (L) 7,9169 3,782483 2,09305 0,090548
Hexadecano (Q) -3,8674 4,513486 -0,85684 0,430673
Peptona (L) 8,3038 3,782483 2,19534 0,079560
Peptona (Q) -11,0602 4,513486 -2,45047 0,057903
Hexadecano (L) e Peptona (L) 6,6500 5,341276 1,24502 0,268293
Anexo 14. Coeficiente de regressão para o DCCR 22 gerados a partir de emulsificação.
171
Anexo 16. Aprovação do CNBio