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PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde e da Vida
Aline Gurski Bolzan
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
RELAÇÃO DA SÍNDROME METABÓLICA E ESTRESSE OXIDATIVO
EM MULHERES IDOSAS PARTICIPANTES DE GRUPOS DE
CONVIVÊNCIA DA CIDADE DE SANTA MARIA
Santa Maria, RS
2017
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ALINE GURSKI BOLZAN
RELAÇÃO DA SÍNDROME METABÓLICA E ESTRESSE OXIDATIVO
EM MULHERES IDOSAS PARTICIPANTES DE GRUPOS DE
CONVIVÊNCIA DA CIDADE DE SANTA MARIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Ciências da Saúde e da Vida como
requisito parcial para obtenção do grau de Mestre
em Ciências da Saúde e da Vida.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Natielen Jacques Schuch
Santa Maria
2017
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PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde e da Vida
A comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
RELAÇÃO DA SÍNDROME METABÓLICA E ESTRESSE OXIDATIVO
EM MULHERES IDOSAS PARTICIPANTES DE GRUPOS DE
CONVIVÊNCIA DA CIDADE DE SANTA MARIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Ciências da Saúde e da Vida como
requisito parcial para obtenção do grau de Mestre
em Ciências da Saúde e da Vida.
Aprovado em: 19/02/2018
COMISSÃO EXAMINADORA
________________________________________
Prof. Drª. Natielen Jacques Schuch
Centro Universitário Franciscano
(Orientadora)
________________________________________
Prof. Drª. (Cristina Bragança de
Moraes) Centro Universitário Franciscano
(Banca Interna)
________________________________________
Prof. Dr. (Maurício Beux dos Santos)
Universidade Federal de Santa Maria (Banca Externa)
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, primeiramente, por me guiar, iluminar e me dar tranquilidade para
seguir sempre em frente.
Agradeço a Natielen Jacques Schuch. Resumi-la a minha orientadora é muito pouco,
foi uma amiga e tenho certeza de que ela sente a importância que teve e tem para mim não só
na condução deste trabalho, mas também por todo apoio, confiança e dedicação nesta
caminhada.
Agradeço de forma especial à minha mãe Neusa Regina Gurski Bolzan e ao meu pai
Airton Bolzan, por não medirem esforços para que eu pudesse levar meus estudos adiante.
Ao meu namorado João Tonetto, por todo o incentivo, carinho, companheirismo.
Agradeço aos meus amigos, por confiarem em mim e estarem do meu lado em todos os
momentos da vida.
Ao Centro Universitário Franciscano e Universidade de Santa Maria e ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde e da Vida
E enfim, a todos que contribuíram para a realização deste trabalho, seja de forma direta
ou indireta, fica registrado aqui, o meu muito obrigado!
Muito obrigada!!
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RESUMO
RELAÇÃO DA SÍNDROME METABÓLICA E ESTRESSE OXIDATIVO EM
MULHERES IDOSAS PARTICIPANTES DE GRUPOS DE CONVIVÊNCIA DA
CIDADE DE SANTA MARIA
Introdução: A síndrome metabólica (SM) é fator de risco para o desenvolvimento de diversas
comorbidades, como aterosclerose, diabetes mellitus, dislipidemia, esteato hepatite não
alcoólica, hipertensão arterial, resistência à insulina, entre outras. A disfunção endotelial,
resistência insulínica, dislipidemia e obesidade abdominal são eventos que podem estar
associados ao estresse oxidativo. Este estudo teve o objetivo de determinar a relação da SM
com o estresse oxidativo em mulheres idosas. Metodologia: Trata-se de um estudo transversal,
constituído por 79 mulheres idosas. Coletaram-se amostras sanguíneas para as dosagens
laboratoriais dos marcadores de estresse oxidativo e exames bioquímicos relacionados à SM.
Além disso, foi realizada a avaliação antropométrica (peso, altura, circunferência abdominal)
das idosas. Foram realizados dois artigos, um relacionando a SM com o estresse oxidativo e
outro relacionando o estado nutricional com o estresse oxidativo. A SM foi classificada usando
o critério proposto pelo National Cholesterol Education Programme Adult Treatment Panel III
(NCEP/ATPIII) e o estado nutricional das idosas foi classificado segundo Lipschitz. O dano
oxidativo foi avaliado através da análise da malondialdeído (MDA) e dosagens da atividade da
defesa antioxidante catalase (CAT) e glutationa (GSH). A análise descritiva dos dados foi
realizada através de medidas de frequência absoluta e relativa, tendência central (média) e
dispersão (desvio-padrão). A comparação entre as médias dos grupos com e sem SM, foram
avaliadas por teste t de Student independente e as correlações entre as variáveis e o estresse
oxidativo foi avaliado através da correlação de Pearson. Estas análises foram conduzidas no
software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) para Windowns versão 22.
Considerou-se p<0,05 como significante. Resultados: A média de idade da amostra total foi
de 70,3 (dp±8,2) anos. No artigo 1, no qual foi relacionado o estresse oxidativo com a SM,
encontramos prevalência de 45,6% (n=36) de SM. Os níveis de MDA foram significativamente
maiores nas idosas com SM e os níveis de GSH foram positivamente correlacionados com a
atividade da CAT e negativamente correlacionados com a pressão arterial diastólica (PAD) nas
idosas com SM. Já nas idosas sem SM, o GSH correlacionou-se positivamente com o IMC e
Circunferência abdominal (CA) e a atividade da CAT correlacionou-se positivamente com a
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idade. Níveis de MDA foram negativamente correlacionados com a pressão arterial sistólica
(PAS). No artigo 2, que correlacionou o estado nutricional com o estresse oxidativo, 57%
(n=45) das idosas tinham sobrepeso. Não encontramos diferença significativa nos marcadores
de estresse oxidativo entre os grupos em estudo. O teste de correlação de Pearson revelou uma
correlação positiva entre os níveis de GSH e a atividade da CAT e um correlação negativa entre
os níveis de GSH e os valores médios de PAD. Conclusão: Nossos achados sugerem que a SM
está vinculada ao estresse oxidativo, demostrado pelos níveis de MDA estatisticamente mais
elevados nas idosas com SM e correlação negativa entre a atividade da GSH e a PAD. Já o
sobrepeso não foi relacionado com o estresse oxidativo. Estudos anteriores com idosos são
controversos, visto que alguns estudos demonstram relação entre o excesso de peso e níveis de
biomarcadores da oxidação de lipídios e outros não.
Palavras chaves: Síndrome Metabólica; Obesidade; Estresse Oxidativo; Espécies Reativas de
Oxigênio; Idosas.
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ABSTRACT
RELATION OF METABOLIC SYNDROME AND OXIDATIVE STRESS IN
ELDERLY WOMEN PARTICIPATING IN GROUPS OF COEXISTENCE IN THE
CITY OF SANTA MARIA
Introduction: Metabolic syndrome (MS) is a risk factor for the development of several
comorbidities, such as atherosclerosis, diabetes mellitus, dyslipidemia, non-alcoholic hepatic
steatosis, hypertension, insulin resistance, among others. Endothelial dysfunction, insulin
resistance, dyslipidemia and abdominal obesity are events that may be associated with
oxidative stress. This study aims to determine the relationship of MS with oxidative stress in
elderly women. Methodology: This is a cross-sectional study of 79 elderly women. Blood
samples were collected for the laboratory dosages of oxidative stress markers and biochemical
tests related to MS. In addition, it was performed the anthropometric evaluation (weight, height,
waist circumference) of the elderly women. Two articles were carried out, one relating MS to
oxidative stress and the other relating nutritional status to oxidative stress. MS was classified
using the criteria proposed by the National Cholesterol Education Program Adult Treatment
Panel III (NCEP / ATPIII) and the nutritional status of the elderly women was classified
according to Lipschitz. Oxidative damage was evaluated through the analysis of
malondialdehyde (MDA) and dosages of antioxidant catalase (CAT) and glutathione (GSH)
activity. Descriptive data analysis was performed using absolute and relative frequency
measurements, central tendency (mean) and dispersion (standard deviation). The comparison
between the means of the groups with and without MS, was evaluated by independent Student's
t test and the correlations between the variables and the oxidative stress were evaluated through
the Pearson correlation. These analyzes were conducted in the Statistical Package for Social
Sciences (SPSS) software for Windowns version 22. p <0.05 was considered significant.
Results: The mean age of the total participants was 70.3 (dp ± 8.2) years. In article 1, in which
oxidative stress was associated with MS, we found a prevalence of 45.6% (n = 36) of MS.
MDA levels were significantly higher in elderly women with MS and GSH levels were
positively correlated with CAT activity and negatively correlated with diastolic blood pressure
(DBP) in the elderly women with MS. In the elderly without MS, GSH correlated positively
with body mass index (BMI) and abdominal circumference (WC) and CAT activity was
positively correlated with age. MDA levels were negatively correlated with systolic blood
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pressure (SBP). In article 2, which correlated nutritional status to oxidative stress, 57% (n =
45) of the elderly women were overweight. We found no significant difference in oxidative
stress markers between the groups under study. The Pearson correlation test revealed a positive
correlation between GSH levels and CAT activity and a negative correlation between GSH
levels and mean DBP values. Conclusion: Our findings suggest that MS is linked to oxidative
stress, demonstrated by statistically higher levels of MDA in elderly women with MS and
negative correlation between GSH activity and DBP. However, overweight was not related to
oxidative stress. Previous studies with the elderly are controversial, since some studies
demonstrate relationship between overweight and levels of biomarkers of lipid oxidation and
others not.
Keywords: Metabólic Syndrome; Obesity; Oxidative Stress; Oxigen-reactive Species; Eldarly.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 10
1.1 SINDROME METABÓLICA ............................................................................................ 10
1.2 ESTRESSE OXIDATIVO ............................................................................................... 111
1.3 SÍNDROME METABÓLICA E ESTRESSE OXIDATIVO ........................................... 155
2 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 188
2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................ 188
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 188
3 METODOLOGIA ............................................................................................................... 19
3.1 DELINEAMENTO AMOSTRAL ..................................................................................... 19
3.2 ÁREA ESTUDADA E TAMANHO AMOSTRAL....................................................... 1919
3.2.1 Critérios de exclusão......................................................................................................19
3.3 COLETA DE DADOS........................................................................................................19
3.4 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA...............................................................................20
3.5 COLETA DE SANGUE.....................................................................................................20
3.5.1 Metodologia das dosagens laboratoriais......................................................................21
3.6 AFERIÇÃO DA PRESSÃO ARTERIAL...........................................................................22
3.7 CLASSIFICAÇÃO DA SÍNDROME METABÓLICA.....................................................22
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................23
3.9 ASPÉCTOS ÉTICOS..........................................................................................................23
4 RESULTADOS.....................................................................................................................24
ARTIGO 1.................................................................................................................................25
ARTIGO 2.................................................................................................................................41
5 DISCUSSÃO.........................................................................................................................57
6 CONCLUSÃO......................................................................................................................60
REFERÊNCIAS......................................................................................................................61
APÊNCICE A – Questionário de Identificação e de Saúde......................................................70
APÊNDICE B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido..............................................71
APÊNDICE C - Autorização do Laboratório Escola de Análise Clínica (LEAC)..................73
APÊNDICE D – Autorização do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular...............74
APÊNDICE E - Aprovação pelo comitê de ética e pesquisa....................................................75
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APRESENTAÇÃO
O formato desta dissertação está conforme a deliberação da comissão de Pós graduação
do Centro Universitário Franciscano. Sua organização foi feita da seguinte forma: (1)
introdução - contemplando o conhecimento sobre assunto. Serão abordados nesta seção:
síndrome metabólica, estresse oxidative e por último, a interação do estresse oxidativo com a
síndrome metabólica; (2) na seção dos métodos são detalhados com rigor científico os
procedimentos empregados na coleta, tratamento e análise dos dados; (3) os resultados são
apresentados na forma de 2 artigos originais, que apresentam todos os produtos das análises
estatísticas; (4) a discussão será pautada nos resultados encontrados nos 2 artigos científicos.
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1 INTRODUÇÃO
1.1 SÍNDROME METABÓLICA
Originalmente descrita por Reaven e Chen (1988), como síndrome X, a síndrome
metabólica (SM) é caracterizada por uma constelação de fatores de risco cardiovascular,
incluindo dislipidemia aterogênica, intolerância à glicose, hipertensão e obesidade visceral,
condições que estão intimamente associadas com resistência à insulina. O maior risco de
desenvolvimento de doença cardiovascular e de diabete mellitus tipo 2 (DM2) são dois dos
vários fatores que determinam a importância do diagnóstico da SM (ISOMAA et al., 2001).
Sua etiologia é multifatorial, estando ligada a fatores metabólicos, genéticos e
ambientais. Entre os fatores ambientais, a dieta é um dos principais fatores de risco associados
com o aumento da prevalência de SM (I Diretriz Brasileira para o diagnóstico e tratamento da
síndrome metabólica, 2005).
Segundo Cavali et al. (2010), é observada uma ampla variabilidade na prevalência da
SM entre os diversos estudos, o que reflete os diferentes critérios diagnósticos utilizados. Isso
indica falta de consenso para o diagnóstico da SM, o que influencia as estimativas de risco para
doenças cardiovasculares na população mundial. Além disso, a comparação entre os estudos
epidemiológicos se torna limitada, pois a ocorrência da SM e dos fatores independentemente
associados a ela pode variar conforme o critério diagnóstico escolhido (FREITAS et al., 2008).
Com o objetivo de superar os problemas relacionados à definição da SM e facilitar as
investigações clínicas e epidemiológicas, em 1998, um grupo de consultores da Organização
Mundial da Saúde (OMS), propôs o primeiro critério diagnóstico para SM (OMS, 1998). Seria
preciso a constatação da resistência à insulina, mediante o método de clamp euglicêmico
hiperinsulinêmico, aliado a dois ou mais dos seguintes componentes: obesidade, dislipidemia,
hipertensão arterial e microalbuminúria. Em 1999, essa definição foi revisada para atender a
novos critérios diagnósticos de hipertensão arterial que passaram a ser adotados pela OMS.
A complexidade do método para determinar a resistência à insulina utilizando o clamp
euglicêmico hiperinsulinêmico e o uso do teste de tolerância à glicose tornam a definição da
OMS pouco utilizada na prática clínica.
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Em 2002 o "Third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel
on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults" (NCEP/ATPIII)
foi apresentada como parte de um programa educacional para prevenção de doença cardíaca
coronariana, sendo proposta como forma de facilitar o diagnóstico clínico. Segundo os critérios
estabelecidos pela NCEP/ATPIII (2002), para ser considerado portador de SM, um indivíduo
deverá apresentar pelo menos 3, dos seguintes critérios: Glicemia de jejum ≥ 110 mg/dl ou
tratamento com droga para Diabetes Mellitus; Circunferência abdominal ≥ 102 ou ≥ 88 cm
(homens e mulheres, respectivamente); Triglicerídeos ≥ 150 mg/dl; HDL < 40 ou < 50 mg/dl
(homens e mulheres, respectivamente) e PAS ≥ 130 mmHg ou PAD ≥ 85 mmHg ou em
tratamento medicamentoso.
Em 2005, a International Diabetes Federation (IDF) propôs uma nova definição de SM
valorizando a obesidade abdominal, através da circunferência abdominal (CA), tornando-a
imprescindível ao diagnóstico (ALBERTI et al., 2006).
Ainda em 2005, a American Heart Association e o International Heart, Lung and Blood
Institute (AHA-IHLBI) atualizaram a definição do NCEP/ATPIII, alterando o ponto de corte da
glicemia de jejum, passando de 110 mg/dL para 100 mg/dL. Tal modificação solidificou os
critérios para a SM do NCEP/ATPIII, que ficou conhecido também como NCEP/ATP III
modificada e AHA-NHLBI.
A definição da NCEP/ATPIII é a mais amplamente usada, tanto na prática clínica como
em estudos epidemiológicos e é recomendada pela I Diretriz Brasileira de Diagnóstico e
Tratamento da Síndrome Metabólica (2005). Trata-se de um guideline com foco no risco
cardiovascular, que não usa como critério obrigatório a evidência de anormalidades na insulina
ou na glicemia.
1.2 ESTRESSE OXIDATIVO
O estresse oxidativo é classicamente definido como um evento resultante do
desequilíbrio entre substâncias oxidantes e antioxidantes geradas em um cenário de reações de
óxido-redução, onde a oxidação implica em perda de elétron e a redução em ganho
(HALLIWELL; WHITEMAN, 2004). Visto que a geração e a ação dessas substâncias
dependem desse sistema de óxido-redução, autores têm usado o termo desequilíbrio do sistema
redox para se referir ao estresse oxidativo (POLI et al., 2008; SANTOS et al., 2009).
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Conhecidos como radicais livres, os produtos oxidantes incluem espécies reativas de
oxigênio (EROs) e de nitrogênio, (ERNs). As espécies reativas de nitrogênio (ERNs) são
representadas pelo óxido nítrico (•NO), dióxido de nitrogênio (•NO2) e as não radicalares como
o peroxinitrito (ONOO-) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). ERN são formadas por
diferentes processos endógenos e exógenos a partir da reação de •NO (AUGUSTO et al., 2002).
Esta espécie é formada pela ação da enzima NO sintase através da reação da L-arginina e O2. O
•NO é uma molécula pouco reativa que se difunde com facilidade pelas células, e por isso,
apresenta função importante na sinalização celular (LANCASTER, 1997). Além disso, este
radical está envolvido no aumento de tônus muscular, adesão celular, função renal, atividade
antioxidante, danos ao DNA, lipoperoxidação, entre outras (AUGUSTO, 2006).
Dentre estas espécies reativas de oxigênio (EROs), destacam-se: radicais superóxido
(O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e os radicais hidroxila (OH) (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2006). As EROs são constantemente produzidas durante reações do
metabolismo humano, normalmente produzidos no metabolismo aeróbico, como produto
intermediário do metabolismo do oxigênio (WARNER, 1994). Possuem meia vida
extremamente curta, são altamente reativas, produzidas em todos os sistemas biológicos e
reagem facilmente com moléculas que se localizam em torno do seu sítio de formação
(ROBERTS; SINDHU, 2009).
Foram desenvolvidos métodos para quantificar marcadores que refletem o estado redox
em amostras biológicas, como por exemplo produtos de oxidação de lipídeos, DNA e proteínas
(PETRAMALA, et al. 2014). Dentre os mais comuns estão os produtos de peroxidação lipídica
pelo fato dos ácidos graxos poliinsaturados (como fosfolipídeos e glicolipídos) e colesterol
serem as moléculas mais vulneráveis às espécies reativas. Quando esses lipídeos são oxidados,
ocorre a formação de dois produtos classicamente aferidos em amostras biológicas, o
malondialdeído (MDA) e o isoprostrano (BASU, 2010; PETRAMALA, et al. 2014).
A relação entre estresse oxidativo e processos fisiológicos acontece por causa da
propriedade que os radicais livres tem de reagir com ácidos graxos poliinsaturados, servindo
como iniciadores do processo de peroxidação lipídica (LPO) (LIMA; ABDALLA, 2001).
Os produtos oxidantes realizam a oxidação de lipídeos (lipoxidação) e glicose
(glicação), essas substâncias se encontram em excesso na obesidade, seja por um consumo
excessivo de alimentos, o qual aumenta a quantidade de nutrientes energéticos na circulação,
bem como pelo processamento desses nutrientes dentro das células (DANDONA, et al., 2010).
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Os produtos gerados na lipoxidação são o MDA, glioxal, acroleína, 4-hidroxi-nonenal
(HNE) e os gerados na glicação são o glioxal e o metil glioxal, esses compostos se ligam ao
grupamento amino dos aminoácidos, resultando em produtos finais de glicação (AGEs) e de
lipoxidação (ALEs) que são altamente reativos e participam do desenvolvimento de outros
componentes da SM, como a hipertensão, resistência insulina, adiposidade abdominal e
alterações no perfil lipídico (ALDINI et al., 2007). Vários parâmetros são utilizados a fim de
mensurar LPO, como a dosagem do MDA a partir do método de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS), que é bastante utilizado como biomarcador do extresse oxidativo
(BARBOSA et al., 2010).
Sob condições normais, as células possuem um sistema antioxidante de eliminação de
radicais livres, que limitam a superprodução de espécies reativas, e reparam os danos celulares.
Este sistema antioxidante é constituído por vários componentes endógenos e exógenos
(adquirida pela dieta) e enzimas antioxidantes (GUPTA et al., 2006).
Os antioxidantes são capazes de interceptar os radicais livres por meio da doação de
átomos de hidrogênio a estas moléculas, interrompendo a reação em cadeia, impedindo o ataque
sobre lipídeos, aminoácidos e proteínas-, e as bases do DNA, evitando a formação de lesões e
perda da integridade celular (SIES, 1993). Outro papel dos antioxidantes é reparar as lesões
causadas pelos radicais livres, um processo relacionado à remoção de danos da molécula de
DNA e à reconstituição das membranas celulares danificadas (SIES, 1991).
O sistema de defesa enzimático inclui as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase
(CAT) e glutationa peroxidase (GPx) (AVELAR et al., 2015). A enzima SOD é a primeira
enzima na eliminação do ânion superóxido, essa enzima possui duas isoformas: A CuZnSOD,
ligada aos íons cobre e zinco, e a MnSOD, ligada ao íon manganês. A CuZnSOD apresenta-se
no citoplasma das células e a MnSOD em suas mitocôndrias. A função é comum às duas formas:
converter O2- em H2O2 (MATES; SANCHEZ-JIMENEZ, 1999).
As enzimas CAT e GPx agem com o mesmo propósito, ou seja, o de impedir o acúmulo
de H2O2. Tal ação integrada é de grande importância, uma vez que essa espécie reativa, por
meio das reações de Fenton e Haber-Weiss mediante a participação dos metais ferro e cobre,
culmina na geração do radical •OH, contra o qual não há sistema enzimático de defesa
(FERREIRA; MATSUBARA, 1997; SCHNEIDER, OLIVEIRA, 2004).
Segundo Halliwell; Gutteridge (1985), o sistema de defesa não enzimático é constituído,
especialmente, pelos compostos antioxidantes de origem dietética, que incluem as vitaminas,
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minerais e compostos fenólicos, além dos compostos dietéticos o sistema antioxidante não
enzimático também inclui a glutationa (GSH), um tripeptídio composto de aminoácidos não
essenciais, descrita como um importante agente antioxidante e marcador da saúde celular.
Portanto, a redução de sua concentração é indicativa de lesão oxidante. Seu déficit acarreta
diminuição da resistência às drogas e radiações, da capacidade de reversão de tumores e da
síntese do ascorbato em animais (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1985).
A figura 1 esquematiza a atuação do sistema antioxidante na detoxificação das EROs,
onde o oxigênio é convertido em •O2- via ativação de caminhos enzimáticos e não enzimáticos,
que é então desmembrado para H2O2 por SOD. O H2O2 pode ser convertido em H2O por CAT
ou GPx ou para •OH após reação com Cu ou Fe. A GSH-Rd regenera a GSH. Além disso, •O2-
reage rapidamente com •NO para formar ONOO- (JOHANSEN et al. (2005).
Figura 1: Geração de espécies reativas e mecanismo de defesa antioxidantes envolvidos.
Fonte: Adaptado de Johansen et al. (2005).
O comprometimento ou saturação dos sistemas antioxidantes são fatores determinantes
para o acúmulo de espécies reativas e surgimento do estresse oxidativo. Como consequência,
este conduz à oxidação de biomoléculas, resultando na perda de suas funções biológicas e/ou
desequilíbrio homeostático, cuja manifestação é o dano oxidativo potencial em células e tecidos
(BIRBEN et al., 2012; HALLIWELL, WHITEMAN, 2004).
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1.3 SÍNDROME METABÓLICA E ESTRESSE OXIDATIVO
O estresse oxidativo vem sendo, continuamente, associado ao processo etiológico de
algumas enfermidades crônicas não transmissíveis, como o DM2 e as doenças cardiovasculares.
Essas enfermidades são decorrentes de alterações metabólicas, que compreendem
principalmente a resistência à insulina, dislipidemia e hipertensão arterial, que em conjunto,
caracterizam a SM (ROBERTS; SINDHU, 2009). Observando esses componentes que
classificam o indivíduo como portador de SM, pode-se notar que todos eles são complicações
que comumente acometem indivíduos obesos, mostrando que existe uma ligação direta entre
essas duas doenças (DUPUY et al., 2007).
Em geral, o aumento do tecido adiposo abdominal, o qual é metabolicamente mais ativo,
contém uma quantidade maior de macrófagos residentes comparado a outros depósitos de
gordura (LUNA-LUNA et al., 2015). Essa condição favorece a inflamação e o estresse
oxidativo, que são fatores precursores de diversas complicações, mas principalmente de
componentes que envolvem SM, como resistência à insulina, hipertensão arterial e
hiperlipidemia (YAO et al., 2014; FRANCISQUETI et al., 2015). A resistência à insulina é
considerada a base da SM, sendo que o estresse oxidativo exerce papel importante na sua
etiologia e complicações relacionadas, e o aumento da glicemia está diretamente associado ao
aumento de EROs em outros tecidos (TELES et al., 2015).
Muitas vias metabólicas associadas com a hiperglicemia, tais como a auto-oxidação da
glicose, a glicosilação de proteínas e a ativação da via do poliol aumentam a produção de EROs
(WOLFF, DEAN, 1987). Os mecanismos de defesa antioxidante para os radicais livres têm sido
descritos como reduzidos no diabetes, em particular a glutationa, a SOD e a CAT (BAYNES;
THORPE, 1999). A figura 2 demonstra as implicações do estresse oxidativo no diabetes.
Um mecanismo potencial que pode levar à disfunção endotelial no diabético é a
formação dos AGEs, quando as proteínas plasmáticas e da membrana celular estão expostas a
concentrações elevadas de glicose por períodos prolongados elas sofrem glicação não
enzimática podendo se depositar na camada subendotelial e induzir disfunção endotelial. Com
efeito, AGEs podem diretamente inativar o -NO e determinar o impedimento da vasodilatação
endotélio-dependente, além de aumentar a permeabilidade vascular e a sua captação por
macrófagos subendoteliais, resultando em ativação da resposta local inflamatória, contribuindo
para o estresse oxidativo (WAJCHENBERG, 2002).
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Figura 2: Mecanismos que leva à disfunção endotelial no diabético é a formação dos produtos
finais de glicação avançada (AGEs).
Fonte: Wajchenberg (2002).
Considerando que tanto o diabetes quanto a aterosclerose são fortemente prevalentes em
indivíduos portadores de SM, alguns autores têm sugerido que o estresse oxidativo também atue
como uma variável biológica relacionada a esse distúrbio (GOTTLIEB et al., 2010). Dessa
forma, o estresse oxidativo pode ser considerado um evento prematuro ou desencadeador da
etiopatogênese da SM e não uma mera consequência (URAKAWA et al., 2003).
Um estudo conduzido por Gottlieb et al (2010) suporta a hipótese da associação entre
SM e estresse oxidativo, uma vez que foram observados níveis elevados de moléculas
associadas com o estresse oxidativo, tais como a lipoproteína de baixa densidade oxidada
(Ox-LDL) e o auto anticorpo contra lipoproteína de baixa densidade oxidada (antiOx-LDL),
bem como moléculas envolvidas na resposta inflamatória, como a proteína C reativa-ultra
sensível (PCR-us) e a interleucina-6 (IL-6).
Em estudo transversal comparativo em 113 indivíduos idosos (50 com SM e 63 sem
SM), realizado por SANCHEZ RODRIGUEZ et al., 2010, foi observado um aumento
estatisticamente significativo de estresse oxidativo em indivíduos idosos com SM em
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comparação a idosos saudáveis. No mesmo estudo, foi observado que indivíduos com 5
componentes da SM tinham 10 vezes maior risco de desenvolver estresse oxidativo que os
indivíduos com apenas um componente (SÁNCHEZ-RODRÍGUEZ et al., 2010).
Vàvrová et al., 2013 avaliou a atividade de enzimas antioxidantes em 40 indivíduos com
SM e 40 voluntários da mesma idade e sexo sem SM. Os indivíduos com SM apresentaram um
estresse oxidativo aumentado e uma defesa antioxidante diminuída em relação ao grupo
controle. Youn et al (2014), em estudo desenvolvido em ratos, indicou que o aumento da
produção de ROS induz o desenvolvimento de obesidade e SM, provavelmente devido à
regulação da inflamação vascular e um aumento da adipogênese.
Yubero-Serrano, et al (2013) investigou a relação entre o número de componentes da
SM com o grau de estresse oxidativo em 91 pacientes com SM. Foram divididos em quatro
grupos com base no número de componentes da SM e foram medidos LPO, H2O2, SOD e GPx.
As atividades de H2O2 e LPO foram menores em sujeitos com 2 ou 3 componentes da SM do
que em indivíduos com 4 ou 5 componentes da SM. As atividades de SOD e GPx foram menores
em indivíduos com 2 componentes da SM do que em indivíduos com 4 e 5 componentes da SM,
sugerindo que indivíduos com mais componentes da SM podem ter um nível de estresse
oxidativo superior.
Em contraste, Abdilla et al., 2007 não encontrou uma relação entre o número de
componentes da SM e o estresse oxidativo em adultos. Sánchez-Rodriguez et al (2010) sugerem
que o envelhecimento pode ser um fator que aumenta a vulnerabilidade do estresse oxidativo
em idosos com SM.
Neste sentido, a interação de componentes da SM tem um efeito sinérgico sobre o
estresse oxidativo. No entanto, há poucos estudos avaliando o estresse oxidativo em indivíduos
idosos. Portanto, este estudo objetiva-se em determinar a relação da SM com o dano oxidativo
em mulheres idosas.
18
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Determinas a relação entre a SM e o estresse oxidativo em mulheres idosas.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a prevalência de SM em idosas;
Verificar a atividade da enzima antioxidante catalase (CAT);
Determinar os níveis de glutationa (GSH), defesa antioxidante não enzimática;
Determinar o dano oxidativo em lipídios pelo método de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS).
Identificar a correlação dos marcadores de estresse oxidativo com os componentes da SM;
Determinas a relação entre o estado nutricional e o estresse oxidativo em mulheres idosas.
Os objetivos foram contemplados nos 2 artigos originais
Artigo 1 - There is a relationship between some parameters of metabolic syndrome and
oxidative stress in Brazilian elderly women.
Artigo 2 - O estresse oxidativo não está associado com o estado nutricional de idosas com
e sem sobrepeso da comunidade de Santa Maria/RS.
19
3 METODOLOGIA
3.1 DELINEAMENTO
Estudo transversal realizado na cidade de Santa Maria, no período de março a julho de 2017.
Segundo Rouquayrol (1994), a pesquisa transversal é definida como sendo o estudo epidemiológico
no qual fator e efeito são observados num mesmo momento histórico e, atualmente, tem sido o mais
empregado.
3.2 ÁREA ESTUDADA E TAMANHO AMOSTRAL
A amostra foi do tipo conveniência, constituída por 79 mulheres idosas (60 anos ou mais),
frequentadores dos Grupos de Convivência da cidade de Santa Maria/RS. O convite e recrutamento
das idosas para participação da pesquisa ocorreu nos grupos de convivências da cidade de Santa
Maria.
3.2.1 Critérios de exclusão
Foram excluídas da pesquisa, idosas que faziam uso de suplementos antioxidantes
(vitaminas ou minerais) por pelo menos 6 meses antes, fumantes e portadores de doenças
crônicas como insuficiência renal crônica, câncer e insuficiência cardíaca, artrite e artrose.
3.3 COLETA DE DADOS
A avaliação antropométrica, a aferição da pressão arterial e a aplicação do questionário
de identificação (APENDICE A) e saúde foram realizadas no Laboratório de Avaliação
Nutricional do Centro Universitário Franciscano. O recrutamento das idosas ocorreu nos grupos
de convivência. Foram convidadas e informadas de como aconteceria a pesquisa e as
interessadas foram agendadas com dia e horário para irem até o Centro Universitário
Franciscano para coleta de dados.
Todos os indivíduos que concordaram participar da pesquisa assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (APÊNDICE B) e compareceram ao Centro Universitário
Franciscano em dia e horário pré-estabelecido. Neste local foram realizadas as coletas de
sangue, medidas antropométricas, de composição corporal e aferição da pressão arterial.
Após a coleta de dados, as participantes receberam um lanche. Os resultados dos exames
foram entregues pessoalmente e foram fornecidas orientações nutricionais. As participantes
20
realizaram a avaliação antropométrica e verificação de pressão arterial e a coleta de sangue para
determinação das concentrações de glicemia de jejum (mg/dL), colesterol total e frações
(mg/dL), triglicérides (mg/dL) e biomarcadores de estresse oxidativo (CAT, GSH, MDA).
3.4 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA
Para avaliação do peso corporal foi utilizada uma balança eletrônica do tipo plataforma,
com capacidade para 180 kg, sensibilidade de 100 gramas, da marca Filizola®. As participantes
foram avaliadas com roupas leves e descalças, posicionados em postura ereta, com os pés
inteiramente compreendidos na plataforma, de forma paralela com braços ao longo do corpo e
olhar no horizonte.
Para a aferição da estatura foi utilizado um estadiômetro com escala em milímetros, da
marca Sanny®, por ser fixado na parede. Para esta medida os participantes permaneceram com
os pés unidos, em postura ereta, olhando para frente, sem fletir ou estender a cabeça. Depois
que a barra móvel do estadiômetro foi abaixada e apoiada sobre a cabeça, efetuou-se a leitura
em centímetros.
Estes dados foram utilizados para calcular o Índice de Massa Corporal (IMC), definido
como massa corporal em quilos dividido pela estatura em metro elevada ao quadrado (kg/m2),
e posterior classificação de acordo com os critérios propostos por Lipchitz (1994), que classifica
em baixo peso o idoso com IMC < 22 Kg/m²; eutrófico IMC entre 22 e 27 Kg/m² e sobrepeso
idosos com IMC > 27 Kg/m².
A circunferência abdominal (CA) foi realizada com a fita métrica da marca Cescorf ®
posicionada sobre o ponto médio entre o último arco costal e a crista ilíaca do indivíduo em pé,
com a leitura feita no momento da expiração. Considerou-se o ponto de corte proposto pelo
NCEP/ATPIII (2005).
3.5 COLETA DE SANGUE
A coleta de sangue e o rastreamento dos participantes foram realizados durante o período
de março a julho de 2017. As idosas foram instruídas a realizar jejum de 12h, após o qual foi
realizada a coleta de sangue. As amostras de sangue foram coletadas e depositadas em tubos de
coleta em duas frações do sangue total: (1) 5 mL em EDTA para análise de colesterol e frações,
triglicerídeos e glicose; (2) 5 mL de heparina para análise da atividade da CAT e dos níveis de
21
GSH e MDA. O sangue foi aliquotado em microtubos e imediatamente estocados a uma
temperatura de –80oC até a análise bioquímica
A coleta de sangue foi realizada na sala de coletas, situada na clínica de Fisioterapia do
Centro Universitário Franciscano, sob supervisão do responsável técnico do LEAC
(APÊNDICE C). Foram coletados 20mL de sangue periférico de cada paciente. As análises
bioquímicas de triglicerídeos (mg/dL), glicemia (mg/dL) e colesterol e frações (mg/dL) foram
analisados pelo responsável técnico do LEAC. As análises de CAT (U/mL), GSH (nmol
NPSH/mg de proteína) e MDA (MDA/mg de proteína) foram realizadas no Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade federal de Santa Maria (UFSM). Para isto as
amostras sorológicas foram encaminhadas dentro de uma caixa isotérmica (2ºC a 8ºC)
apropriada para evitar alterações do material biológico até o local de processamento.
Este estudo contou com a colaboração da Profª Drª Cristina Wayne Nogueira do
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFSM, que cedeu seu laboratório para
execução das análises bioquímicas (APÊNDICE D).
Durante a coleta de dados, não foi possível avaliar os níveis de MDA de 12 idosas, os
níveis de GSH de 23 idosas e a atividade da CAT de 22 idosas.
Foi preenchido um questionário estruturado com as informações referentes à
identificação, idade, pressão arterial, avaliação antropométrica (peso, estatura e circunferência),
variáveis de estilo de vida tais como: uso de suplementos vitamínicos, tabagismo (fumantes ou
não fumantes) e uso de bebida alcoólica.
3.5.1 Metodologia das dosagens laboratoriais
Colesterol total e frações, triglicerídeos (TG) e glicose: determinados pelo método
enzimático usando kits comerciais (Labtest®). Colesterol LDL foi calculado de acordo com a
equação de Friedewald et al (1972).
MDA: utilizou-se a dosagem de MDA a partir do método de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS), gerando um produto corado que pode ser medido opticamente
em 532 nm, com o auxilio de um espectrofotômetro (OHKAWA et al., 1979). Uma alíquota de
sangue total foi precipitada com ácido tricloroacético (TCA) 40%, na proporção de 2 de
sangue/1 de TCA, homogeneizadas e centrifugadas por 10 minutos a 3000 rpm para obtenção
22
de sobrenadante (S1). Uma alíquota de S1 foi incubada com 0.6% de ácido tiobarbitúrico, 1%
de ácido fosfórico a 95 °C durante 1 h. A reação de cor foi medida a 532 nm. Os níveis de
TBARS foram expressos em nmol MDA/mg de proteína.
GSH: Os níveis de GSH foram avaliados através dos níveis de tióis não proteicos NPSH
pelo método de Ellman (1959). Primeiramente, 10% de surfactante não iônico com uma cadeia
de óxido de polietileno hidrófilo (Triton) foi adicionado a uma alíquota de sangue total e
misturados por 30 segundos em vórtex e deixados em repouso durante 10 min para ocorrer
hemólise. Após, foi acrescentado 240 µl de TCA 20 % e as amostras foram homogeneizadas e
centrifugadas por 10 minutos a 3000 rpm. Após centrifugação, o precipitado proteico foi
descartado e os níveis de (NPSH) livres foram determinados no sobrenadante, adicionando-se
50µl do sobrenadante a 50 µl de DTNB (ácido 5-5-ditio-bisnitrobenzoico) 10mM em 900 µl de
tampão fosfato de potássio (TFK) na concentração de 1M pH 7.4. A absorbância foi lida em
412 nm e os resultados foram expressos nmol de NPSH/mg de proteína.
CAT: A atividade da CAT foi determinada através da reação enzimática, iniciada pela
adição de uma alíquota de eritrócitos previamente hemolisado com 10% de Triton e do substrato
(H2O2) em uma concentração de 0,3 mM em um meio contendo tampão fosfato de potássio na
concentração de 50 mM, pH 7,5. A atividade enzimática foi medida em 240 nm e expressa como
unidade (U)/mg de proteína (1U decompõem 1 mmol de H2O2 por minuto a 25ºC, pH 7 (AEBI,
1984).
3.6 AFERIÇÃO DA PESSAO ARTERIAL
A pressão arterial foi obtida por meio do Esfigmomanômetro Aneróide. Foram aferidas
três medidas de pressão arterial com adequação do manguito à circunferência braquial. Após 5
minutos de repouso na posição sentada, com o braço direito apoiado na altura do átrio esquerdo,
o manguito é automaticamente insuflado, além do valor de oclusão do pulso braquial. Para os
valores finais de pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial diastólica (PAD) (em mmHg)
foram considerados aqueles que representam a média aritmética das 2 últimas medidas.
3.7 CLASSIFICAÇÃO DA SÍNDROME METABÓLICA
Foram utilizados os critérios NCEP/ATPIII de 2005, para classificação da SM, a saber:
Presença de pelo menos 3, dos seguintes critérios: Glicemia de jejum ≥ 100 mg/dl ou uso de
23
medicação; Cintura > 88 cm; Triglicérides ≥ 150 mg/dl; HDL < 50 mg/dl; Pressão arterial ≥
130/85 mmHg ou uso de medicação.
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram armazenados em banco de dados Excel e analisados pelo pacote
estatístico Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 22.0. A análise descritiva foi
realizada através de medidas de frequência absoluta e relativa, tendência central (média) e
dispersão (desvio-padrão). A comparação entre as médias dos grupos em estudo foram avaliadas
por teste T de Student e as correlações entre as variáveis e o estresse oxidativo foi avaliado
através da correlação de Pearson. Considerou-se estatisticamente significativo p <0,05.
3.9 ASPÉCTOS ÉTICOS
O estudo realizado foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Centro Universitário
Franciscano (CAAE: 61258116.2.0000.5306) (APÊNDICE E). Todas as participantes
assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), ficando uma cópia com a
pesquisadora e outra com a participante.
24
4 RESULTADOS
Os resultados que fazem parte desta dissertação estão apresentados sob a forma de artigos
científicos (1 e 2). Os itens “Materiais e Métodos”, “Resultados”, “Discussão” e “Referências”
estão contidos nos manuscritos. O artigo cientifico 1 está disponível da mesma forma que será
submetido para publicação na Revista Annals of Nutrition & Metabolism. O artigo científico 2
será submetido para publicação na Revista Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e
Metabologia e está disponível da mesma forma que será submetido para publicação na Revista.
25
RESULTADOS
ARTIGO 1:
“The relationship between parameters of metabolic syndrome and oxidative stress in
brazilian elderly women”
Artigo original, será submetido para a Revista Annals of Nutrition & Metabolism.
26
THE RELATIONSHIP BETWEEN PARAMETERS OF METABOLIC SYNDROME AND
OXIDATIVE STRESS IN BRAZILIAN ELDERLY WOMEN
Aline Gurski Bolzan1; Matheus da Cunha Goggia Neves1; Stéphany Rittes Nass1; Karen Mello de Mattos Margutti1; Bruna da Cruz Weber Fulco2; Cristina Wayne Nogueira2; Natielen Jacques Schuch1
1 Postgraduate Program in Health and Life Sciences, Franciscan University Center, Santa Maria, Brazil 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa
Maria, Santa Maria, Brazil.
N. J. Schuch
Fone: (55)55 3025 9000
Fax: (55) 55 3025 9002
E-mail: [email protected]
Key words:
Overweight; obesity; body mass index; oxidative stress
Abstract
Background/Aim: To determine the relationship between metabolic syndrome (MetS) and oxidative
stress in Brazilian elderly women. Methods: A cross-sectional comparative study was carried out on a
sample of 79 elderly women (≥60 years old); 43 of them did not have MetS and 36 did have MetS. MetS
was defined according to the criteria established in the Third Report of the National Cholesterol
Education Program Adult Treatment Panel III. We measured plasma lipid peroxidation (LPO),
antioxidant activity of catalase and glutathione (GSH). Results: LPO levels were statistically higher
when compared to the elderly women without MetS. GSH levels were negatively correlated with diastolic blood pressure in elderly women with MetS. In women without MetS, GSH levels correlated
positively with body mass index and Waist Circumference. Conclusions: The elderly with metabolic
syndrome may have a higher level of oxidative damage. These findings suggest that the study of redox
status in elderly women with MetS may provide a starting point for the pathways of understanding that
contribute to the development of metabolic syndrome and its subsequent ones.
Introduction
Metabolic syndrome (MetS) is characterized by different combinations of three or more
features such as hyperglycemia, hypertriglyceridemia, low level of high-density lipoprotein
cholesterol (HDL-C), hypertension and abdominal obesity, as defined by the criteria of the
Third Report of the National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III
(NCEP/ATPIII) [1].These defined clinical parameters are used to identify patients having MetS
27
and view cardiovascular disease (CVD) as the primary clinical outcome of this disease [2, 3].
The clustering of MetS’ factors and the associated 5-fold increased risk of diabetes and 2-fold
risk of atherosclerotic CVD are a major concern for global health [4]. These diseases may
associate with MetS. Studies have revealed that elevated oxidative stress (OS) play a significant
role in beginning and development of atherosclerotic vascular disease [5, 6].
Oxidative stress is defined as an imbalance between the production of reactive oxygen
and nitrogen species and their insufficient decomposition by the antioxidant system which
results in macromolecular damage and disruption of redox signaling and control [7]. On the
other hand, aging is too accompanied by an increase in oxidative damage due to an impaired
physiological function [8].
Oxidative stress is widely accepted as playing a key mediatory role in the development
and progression of multiple pathophysiological conditions, such as endothelial dysfunction,
hypertension and atherosclerotic cardiovascular disease [9]. MetS patients exhibit activation of
biochemical pathways leading to an increased delivery of reactive oxygen species, altered
antioxidant protection and increased lipid peroxidation (LPO) [10]. The endogenous
antioxidants, including non-enzymatic scavengers as glutathione (GSH) and such antioxidant
enzyme catalase (CAT), are the first lines of defense against OS and act by scavenging
potentially damaging reactive oxygen species [11]. The LPO constitutes a chain reaction in the
polyunsaturated fatty acids of cell membranes, altering their permeability, fluidity and integrity.
Consequently, there is loss of selectivity in the ion exchange and release of the organelles
content, such as the hydrolytic enzymes of the lysosomes, and the formation of cytotoxic
products, such as malondialdehyde (MDA), culminating in cell death [12].
There are a relatively large number of studies looking at changes in OS with certain
metabolic conditions such as diseases, inactivity and obesity [13, 14], but the results of studies
28
investigating OS in aging are controversial. In institutionalized or frail subjects, OS was
reported to increase which was related to low antioxidant status, while in indepently living
elderly this increase is not always significant [15]. The age-related alterations of antioxidant
defenses and OS in elderly women with MetS compared with healthy elderly individuals are
not yet ascertained and there is a lack of information regarding the interactions between MetS
and aging on OS status.
Wherefore, the objective of the present study was to determine the relationship between
metabolic syndrome and OS in Brazilian elderly women.
Methods
Subjects and Design.
A cross-sectional comparative study was carried out on a sample of 79 elderly women
(≥60 years old); 43 of them did not have MetS and 36 did have MetS. The women were elderly,
Brazilian, living in the city of Santa Maria, randomly recruited in community. None of the
subjects had taken antioxidant supplements (vitamins or minerals) for at least 6 months prior to
the study and none of them smoked. The subjects agreed to participate in the study by giving
their informed consent. The Ethics Committee of the Centro Universitário franciscano approved
the research protocol for this study.
Metabolic Syndrome
MetS was defined according to the criteria established in the NCEP/ATPIII [1].
Anthropometric Measurements
After recording the clinical history and conducting the physical examination, we
obtained the following anthropometric measurements: weight, height, body mass index (BMI)
29
and waist circumference. Weight was measured while the subject was wearing light indoor
clothing, in the morning and in a fasted state, it was used a platform-type electronic scale, with
capacity for 180 kg, sensitivity of 100 grams, of Filizola® brand. To measure the height, a
stadiometer with a scale of 200 centimeters, of the Sanny® brand, was used. The nutritional
status was calculated using the BMI and classified according Lipschitz (1994), which classifies
as low weight the elderly with BMI <22 kg/m²; eutrophic BMI between 22 and 27 kg/m2 and
overweight elderly with BMI >27 kg/m² [16]. Waist circumference (WC) was measured with
the Cescorf ® brand tape measure positioned at the umbilical scar level of the standing subject
and considered the cut-off point proposed by the NCEP/ATPIII.
Blood pressure was assessed on the right arm by a calibrated mercury
sphygmomanometer. Blood pressure was classified according to the NCEP/ATPIII criteria.
Blood Samples
After 12 hours of fasting, the blood samples were collected and deposited in collection
tubes in two fractions of the whole blood: (I) 5 mL in ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)
for analysis of cholesterol and fractions, triglycerides and glucose; (II) 5 mL in heparin for
analysis of CAT activity, and GSH and LPO levels. Serum was used for all other parameters.
Methods
Total cholesterol (TC), triglyceride (TG), glucose and HDL-C were determined by
enzymatic methods using commercial kits (Labtest®). Low-density lipoprotein cholesterol
(LDL-C) was calculated according to Friedewald’s formula [17].
30
LPO: To determine the LPO, the dosage of malondialdehyde (MDA) was used from the
thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) method, producing a color product that can be
measured optically at 532 nm [18]. An aliquot of whole blood was precipitated with 40%
trichloroacetic acid (TCA) in the proportion of 2 blood / TCA, homogenized and centrifuged
for 10 minutes at 3000 rpm to obtain supernatant (S1). An aliquot of S1 was incubated with
0.6% thiobarbituric acid, 1% phosphoric acid at 95 ° C for 1 h. The color reaction was measured
at 532 nm. TBARS levels were expressed in nmol MDA / mg protein.
GSH: GSH levels were evaluated through NPSH levels by the method of Ellman (1959)
[19]. First, 10% Triton was added to an aliquot of whole blood and mixed for 30 seconds in
vortex and allowed to stand for 10 min for haemolysis to occur. After 240 μl of 20% TCA was
added and the samples were homogenized and centrifuged for 10 minutes at 3000 °C. After
centrifugation, the protein precipitate was discarded and the free non-protein sulfhydryl (NPSH)
levels were determined in the supernatant, 50 μl of the supernatant was added to 50 μl of DTNB
(5-5-dithio-bis-nitrobenzoic acid); 10mM in 900 μl of potassium phosphate buffer (TFK) at 1M
concentration pH 7.4. The absorbance was read at 412 nm and the results were expressed nmol
of NPSH / mg protein.
CAT: The CAT activity was determined by the enzymatic reaction, initiated by the
addition of an aliquot of erythrocytes previously hemolysed with 10% Triton and the substrate
(H2O2) in a concentration of 0.3 mM in a medium containing phosphate buffer potassium at the
concentration of 50 mM, pH 7.5. The enzyme activity was measured at 240 nm and expressed
as unit (U) / mg protein (1U decomposes 1 mmol H2O2 per minute at 25 ° C, pH 7 [20].
During a data collection, it was not possible to evaluate LPO levels of 12 elderly, GSH
levels of 23 elderly and a CAT activity of 22 elderly.
31
Statistical Analysis
Data were processed using statistical software SPSS 22.0. The comparison between
elderly women with and without MetS were calculated by independent t test and Pearson’s
correlations were obtained, and p < 0.05 was considered significant.
Results
The mean age was 70.3 (SD = 8.2) years, 45.6% had MetS, the mean BMI was 28.7kg /
m2. Of the 79 elderly women evaluated, 57.0% (n = 45) were overweight according to BMI.
As expected, elderly women with MetS had significantly higher values of body mass,
BMI (p<0.05) and WC (p<0.05). They also presented higher values of SBP, glucose,
triglycerides, as well as a lower HDL-C value. The general characteristics of the total sample
and the groups with and without SM, are presented in table 1.
Table 1. Biochemical, blood pressure and anthropometric characteristics of the elderly
women.
Parameter Total Sample
(n=79) With Mets
(n=36) Without Mets
(n=43) p value
Age (years) 70.3 ± 8.2 71.3 ± 8.5 69.5 ± 8 0.353
Weight (Kg) 71.2 ± 12.9 75 ± 12.8 68.1 ± 12.3 0.019*
Height (m) 1.6 ± 0.06 1.57 ± 0.06 1.58 ± 0.06 0.211
BMI (Kg/m2) 28.7 ± 5.4 30.5 ± 5 27.2 ± 5.3 0.005**
Waist circunference (cm) 96.1 ± 11.9 100.2 ± 9 92.6 ± 13 0.003**
SBP (mm Hg) 13.7 ± 1.4 14 ± 1.4 13.4 ± 1.4 0.052
DBP (mm Hg) 8.2 ± 0.9 8.5 ± 1.1 8 ± 0.8 0.036*
Glucose (mg/dL) 97.8 ± 32.3 111.5 ± 43.8 86.4 ± 6.4 0.002**
Total Cholesterol 202.8 ± 38.3 205.8 ± 39.9 200.3 ± 37.2 0.533
HDL-C (mg/dL) 49.5 ± 14.7 41 ± 8.5 56.6 ± 15.1 0.000**
LDL-C (mg/dL) 126.9 ± 38.0 129.7 ± 39.5 124.7 ± 36.9 0.565
Triglycerides (mg/dL) 129.6 ± 63.4 173.8 ± 62 92.7 ± 34.6 0.000**
*p value < 0,05; ** p value <0,01. Student's t-test.
32
In the group with MetS, the LPO levels were statistically higher when compared to the
elderly women without MetS (p<0.05). Regarding antioxidant defense markers, GSH levels and
CAT activity were lower in the elderly women with MetS, although this relationship was not
statistically different when compared to the elderly women without MetS. The OS parameters
evaluated in this study, levels of lipid peroxidation (LPO) and antioxidant defenses, CAT
activity and GSH levels, are presented in table 2.
Table 2. OS biomarkers by study group
Parameter With Mets Without Mets p value
LPO (#) (n=67) 8.72 ± 6.3 5.9 ± 2.2 0.020*
GSH (##) (n=56) CAT (U/mL) (n=57)
502.3 ± 252.3
599.7 ± 94.1 558.7 ± 277.0 619.0
± 89.0 0.429 0.425
*p value < 0,05. Student's t-test. #nmol MDA/mg protein. ##nmol NPSH/mg protein
GSH levels were positively correlated with CAT activity (r = 0.447, p <0.05), as well as
negatively with DBP (r = -0.479, p <0.05) in elderly women with MetS. In women without
MetS, GSH levels correlated positively with BMI (r = 0.429, p <0.05) and WC (r = 0.368, p
<0.05). CAT activity correlated negatively with age (r = -0.363, p <0.05) and LPO levels were
negatively correlated with SBP (r = 0.348, p <0.05). The Pearson correlations among the
selected variables are shown in table 3.
33
Table 3. Pearson’s correlations coefficients of the metabolic syndrome and parameters of
OS in the group with MetS and Without MetS.
LPO GSH CAT
With MetS
Age (years) 0.19 0.124 -0.94
Weight (Kg) 0.089 -0.176 0.055
BMI (Kg/m2) -0.009 -0.254 -0.029
Waist circunference (cm) 0.184 -0.004 0.155
SBP (mm Hg) -0.205 -0.190 0.011
DBP (mm Hg) -0.022 -0.479* 0.069
Glucose (mg/dL) 0.141 0.036 0.340
Total Cholesterol -0.216 -0.058 0.014
HDL-C (mg/dL) 0.328 -0.111 0.003
Triglycerides (mg/dL) -0.078 -0.303 0.149
LDL-C (mg/dL) -0.264 0.051 -0.035
LPO (#) 1 0.338 0.178
GSH (##) 0.338 1 0.447*
CAT (U/mL) 0.178 0.447* 1
Without MetS
Age (years) -0.238 0.100 -0.363*
Weight (Kg) -0.015 0.356 0.230
BMI (Kg/m2) -0.040 0.429* 0.240
Waist circunference (cm) -0.010 0.368* 0.233
SBP (mm Hg) -0.348* 0.274 -0.006
DBP (mm Hg) 0.197 -0.156 -0.032
Glucose (mg/dL) -0.259 -0.063 -0.304
Total Cholesterol -0.079 0.226 0.100
HDL-C (mg/dL) 0.010 -0.145 0.114
Triglycerides (mg/dL) 0.332 0.137 0.011
LDL-C (mg/dL) -0.141 0.250 0.051
LPO (#) 1 -0.137 -0.089
GSH (##) -0.137 1 0.324
CAT (U/mL) -0.089 0.324 1
*p value < 0,05. #nmol MDA/mg protein. ##nmol NPSH/mg protein.
34
Discussion
Previous findings have shown an increased level of OS in frail and institutionalized
elderly individuals, which may result in an accelerated aging process and a high incidence of
oxidative stress related diseases, including cancers, CVD, or dementia [21]. Similar findings of
increased markers of oxidative damage and a decrease in antioxidant markers in patients with
MetS have been reported in previous studies [21-25].
In this study, the elderly women with MS presented significantly higher values of
weight, BMI and WC, DBP, glucose, triglycerides and a lower HDL-C value. Results already
expected, as they are the main risk factors associated with MetS.
Although older women with MetS had greater changes in risk factors for MetS, older
women without MetS had a higher mean BMI, WC and CT than the reference values [16, 1].
LPO levels were significantly higher in the MetS group. This finding is consistent with
results showing significantly higher levels of LPO in adult [26] and elderly [25] women with
MetS. In addition, plasma lipid peroxidation products were found in aging individuals and
positively correlated with atherosclerosis and cognitive deficits in the elderly [27].
Peroxidation of membrane lipids leads to changes in the structure and permeability of
cell membranes, as well as the production of lipid peroxides. These changes in membranes alter
selective permeability, altering the flow of ions and other substances, resulting in loss of
selectivity for entry and / or exit of nutrients and toxic substances to the cell, DNA alterations,
LDL-C oxidation and matrix components impairment intra and extracellular. The production of
lipid peroxides in the vascular endothelium walls contributes to atherosclerosis, stroke risk and
myocardial infarction [28].
In this study, GSH levels and CAT activity showed lower values in the elderly women
with MetS, although these values were not statistically significant, these results corroborate with
35
the data found by other authors that demonstrated a reduction of the antioxidant defenses in
individuals with MetS [22-25].
It is important to highlight that in the present study, a relationship was found between
the reduction of GSH levels and the reduction of CAT activity, as demonstrated by Pearson's
positive correlation (r = 0.447, p <0.05). That is, enzymatic antioxidant defense (CAT) and non-
enzymatic (GSH) parameters follow the same direction, reducing one is related to the reduction
of the other in elderly women with MetS. The role of these antioxidant defenses is to remove
reactive oxygen species (ROS) [29].
The elderly women with MetS had significantly higher values of DBP, which, in turn,
showed a negative correlation with GSH levels (r = -0.479, p <0.05). These findings corroborate
the results found in the literature that demonstrated lower levels of GSH in hypertensive
individuals [30, 31].
When we analyzed the elderly without MetS, we observed that this group also presents
high values of BMI and WC, but the values of SBP are within the reference parameters.
Knowing that excess weight is related to an increase in OS [32, 33], the negative correlation
between LPO levels and SBP values may be influenced by the excess weight present in this
group.
In addition, a positive correlation was found between GSH levels and BMI (r = 0.429, p
<0.05), as well as between GSH levels and mean values of WC (r = 0.368, p <0.05) both in the
MS group and in the MetS group. It is important to emphasize that the group without MetS had
altered mean BMI and WC values and in this group GSH levels were higher, which could be
explained by the attempt of GSH, the most important non-enzymatic antioxidant defense, to
protect individuals without MS of oxidative damage.
36
ROS accumulation can result in direct cell damage. In addition to the accumulation of
oxidative damage throughout life, aging is directly related to the reduction of endogenous
antioxidant defenses. The Increase of age especially in women may increase the risk of OS [34-
36].
It is important to note that the increase in age is related to the reduction of CAT activity,
according to Pearson's negative correlation (r = -0.363, p <0.05). A reduction in antioxidant
defenses can result in elevated levels of ROS, which may eventually directly or indirectly cause
oxidative damage to organs. Therefore, the OS in aging, besides being directly related to organ
damage, would aggravate risk factors for vascular damage, including MetS [37, 21].
Our study has some limitations such as the relatively small sample size. A greater
number of older women would be desirable to strengthen some significant marginal values.
Moreover, the absence of women under 60 years of age limits our conclusions, since aging
contributes to the increase of OS [38].
In conclusion, the elderly with metabolic syndrome may have a higher level of oxidative
damage. These findings suggest that the study of redox status in elderly women with MetS may
provide a starting point for the pathways of understanding that contribute to the development of
metabolic syndrome and its subsequent ones.
Conflicts of Interest Statement
No potential conflict of interest relevant to this article has been reported.
37
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41
RESULTADOS
ARTIGO 2:
“O estresse oxidativo não está relacionado com o estado nutricional de idosas com e sem
sobrepeso da comunidade de Santa Maria/RS”
Artigo original, será submetido aos Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia
42
O ESTRESSE OXIDATIVO NÃO ESTÁ ASSOCIADO COM O ESTADO NUTRICIONAL EM
IDOSAS COM E SEM SOBREPESO DA COMUNIDADE DE SANTA MARIA/RS
Aline Gurski Bolzan1; Matheus da Cunha Goggia Neves2; Stéphany Rittes Nass2; Karen Mello de Mattos Margutti2; Bruna da Cruz Weber Fulco3; Cristina Wayne Nogueira3; Natielen Jacques Schuch1
1 Mestrado em Ciências da Saúde e da Vida, Centro Universitário Franciscano, Santa Maria, RS, Brasil.
2Curso de Nutrição, Centro Universitário Franciscano, Santa Maria, RS, Brasil
3Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade
Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil.
Correspondência para:
Natielen Jacques Schuch, Departamento de Nutrição. Área das Ciências da Saúde. Centro Universitário
Franciscano, Santa Maria, RS, Brasil. Fone: (55) 3025.9000, Fax: (55) 3025.9002,
RESUMO
Objetivo: Determinar a relação entre o sobrepeso e o estresse oxidativo em idosas participantes de
grupos de convivência da cidade de Santa Maria/RS. Metodologia: Estudo comparativo transversal,
realizado 79 mulheres idosas. Aferiu-se o peso e altura para determinar o estado nutricional através do
índice de massa corporal (IMC). Aferiu-se a pressão arterial e foi coletado amostra de sangue para
análise de colesterol e frações, triglicerídeos e glicose e análise da atividade da catalase (CAT), níveis
de glutationa (GSH) e malondialdeído (MDA). Resultados: 57% das idosas tinham sobrepeso. A média
de idade da amostra foi de 70,3 anos. A classe medicamentosa mais prevalente foi a de antihipertensivos
com 61%, seguido de antiplaquetários (27%) e hipolipimiantes (25%). Não houve diferença significativa
dos biomarcadores de dano oxidativo (MDA, GSH e CAT) entre os grupos eutróficas e sobrepesos. O
teste de correlação de Pearson revelou uma correlação positiva entre os níveis de GSH (r=0,378, p<0,01)
e a atividade da CAT e um correlação negativa entre os os níveis de GSH e os valores médios de pressão
arterial diastólica (PAD) (r=-0,336, p<0,05). Conclusão: O sobrepeso não foi relacionado com o estresse
oxidativo. Mais estudos relacionando o estresse oxidativo e o estado nutricional com a população idosa
são necessários para confirmar nossos achados.
Palavras-chave: Sobrepeso; obesidade; índice de massa corporal; estresse oxidativo
43
ABSTRACT
Objective: To determine the relationship between overweight and oxidative stress in elderly participants
of cohabitation groups in the city of Santa Maria / RS. Methodology: A comparative cross-sectional
study of 79 elderly women. Weight and height were measured to determine nutritional status through
body mass index (BMI). Blood pressure was measured and cholesterol, fractions, triglycerides and
catalase activity (CAT), glutathione (GSH) levels and malondialdehyde (MDA) were collected. Results:
57% of the elderly and overweight. An average sample age of 70.3 years. The most prevalent drug class
was antihypertensive drugs with 61%, followed by antiplatelet drugs (27%) and lipid-lowering drugs
(25%). There was no significant difference in the biomarkers of oxidative damage (MDA, GSH and
CAT) between the eutrophic and overweight groups. The Pearson correlation test revealed a positive
correlation between GSH levels (r = 0.378, p <0.01) and CAT activity and a negative correlation between
GSH levels and mean diastolic blood pressure (DBP) values (r = -0.336 , p <0.05). Conclusion:
Overweight was not related to oxidative stress. Further studies relating oxidative stress and nutritional
status with an elderly population are needed to confirm our findings.
Keywords: Overweight; obesity; body mass index; oxidative stress
INTRODUÇÃO
O processo de envelhecimento é marcado por uma série de mudanças metabólicas, entre as quais
se destaca o aumento da susceptibilidade ao estresse oxidativo, induzido pelo declínio da função
respiratória mitocondrial (1).
O processo de envelhecimento é marcado por uma série de mudanças, seja em níveis
bioquímicos, fisiológicos, funcionais e psicológicos, além dos aspectos sociais, que tornam os idosos
mais suscetíveis a doenças, afetando diretamente o estado nutricional desses indivíduos (2).
A obesidade também vem alcançando proporções alarmantes em todo o mundo e é um
importante fator de risco para o desenvolvimento de diversas comorbidades, como aterosclerose,
diabetes mellitus, dislipidemia, esteato hepatite não alcoólica, hipertensão arterial, resistência à insulina,
entre outras (3). Nos pacientes obesos há diversos fatores que interferem na suscetibilidade do indivíduo
à presença do excesso de lesões oxidativas contribuintes para as comorbidades (4). Dentre eles se
destacam a hiperglicemia, a atividade muscular aumentada, os níveis elevados de lipídios teciduais, a
inflamação crônica, as defesas antioxidantes inadequadas e a hiperleptinemia (3).
44
A instalação do processo de estresse oxidativo decorre da existência de um desequilíbrio entre
compostos oxidantes e antioxidantes, em favor da geração excessiva de radicais livres ou em detrimento
da velocidade de remoção desses. Tal processo conduz à oxidação de biomoléculas com consequente
perda de suas funções biológicas e/ou desequilíbrio homeostático, cuja manifestação é o dano oxidativo
potencial contra células e tecidos (5).
A lipoperoxidação de membranas é habitualmente monitorada pelo método do MDA
(malondialdeido), que é um biomarcador, produto secundário da peroxidaçaõ lipídica, derivado da
ruptura de endociclização de ácidos gordos polinsaturados, tais como ácido linoléico, araquidônico e
docosahexaenóico (6). O MDA é considerado, atualmente, um candidato potencial para ser escolhido
como um biomarcador geral de lesão oxidativa em plasma (7).
Os antioxidantes, sejam naturais ou sintéticos, desempenham papel fundamental na prevenção
da oxidação resultante da ação dos radicais livres. Os sistemas antioxidantes existem sob a forma de
compostos enzimáticos e não enzimáticos. O sistema antioxidante enzimático inclui a superóxido
dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GSH-Rd) e a catalase (CAT). Já o
sistema antioxidante não enzimático inclui a glutationa (GSH), ubiquinona, ácido úrico e compostos
obtidos diretamente da dieta, tais como α-tocoferol (vitamina-E), β-caroteno (pro-vitamina-A), ácido
ascórbico (vitamina-C) e compostos fenólicos onde se destacam os flavonoides e poliflavonoides (5,
8).
A obesidade aumenta a necessidade metabólica do miocárdio, com o consequente aumento do
consumo de oxigênio. Com isso, a produção de espécies reativas de oxigênio, como os superóxidos e os
peróxidos de hidrogênio aumenta devido à maior respiração mitocondrial. Se a produção dessas espécies
de oxigênio exceder a capacidade antioxidante da célula, o estresse oxidativo pode ocorrer, resultando
em peroxidaçã̧ o lipídica (9). Outro mecanismo através do qual a obesidade pode aumentar a peroxidação
lipídica é através da lesão celular progressiva e cumulativa devido à pressão pela grande massa corporal
(10). Além disso, estudos sustentam a hipótese de que uma dieta hiperlipídica altere o metabolismo do
oxigênio podendo levar a peroxidação lipídica (10, 11).
45
Indivíduos com excesso de peso comumente possuem um desequilíbrio entre peso corporal,
lipoproteínas e lipídios, o que aumenta a suscetibilidade do organismo a lesões oxidativas. A cronicidade
desse estresse oxidativo, no ambiente celular, pode causar severos problemas metabólicas e estar
envolvida na origem e no desenvolvimento de numerosas doenças (12-14). No entanto, são escassos na
literatura estudos avaliando este dano oxidativo na população idosa, desta forma, o objetivo do presente
artigo é determinar a relação entre o sobrepeso e o estresse oxidativo em idosas participantes de grupos
de convivência da cidade de Santa Maria/RS.
MATERIAIS E MÉTODOS
Delineamento e amostra
Estudo comparativo transversal, realizado em uma amostra de 79 mulheres idosas (≥60 anos),
realizado em uma população de idosas com idade igual ou superior a 60 anos, frequentadores de Grupos
de Convivências do município de Santa Maria/RS.
A amostra foi constituída por 79 idosas, das quais 45 (57%) delas tinham sobrepeso e 34 (43%)
eram eutróficas. Foram excluídas da pesquisa, idosas que fazem uso de suplementos antioxidantes
(vitaminas ou minerais) por pelo menos 6 meses antes, fumantes e portadores de doenças crônicas como
insuficiência renal crônica, câncer e insuficiência cardíaca, artrite e artrose. Os sujeitos concordaram em
participar do estudo dando seu consentimento informado. O Comitê de Ética do Franciscano aprovou o
protocolo de pesquisa para este estudo.
Medidas antropométricas
O peso corporal foi aferido em balança eletrônica tipo plataforma, com capacidade para 180 kg,
sensibilidade de 100 gramas, da marca Filizola® e para aferição da altura um estadiômetro com escala
em 200 centímetros, da marca Sanny®. O estado nutricional foi calculado pelo IMC e classificado de
acordo com Lipchitz (1994) (15) que considera excesso de peso IMC > 27kg/m².
46
A pressão arterial foi avaliada no braço direito por um esfigmomanômetro de mercúrio
calibrado. Consideramos que a pressão arterial é alta, de acordo com os critérios NCEP / ATPIII (16).
Uso de medicamentos
O uso de medicamentos foi avaliado através das informações obtidas diretamente das idosas,
solicitando-se que a idosa trouxesse ao alcance do pesquisador todas as medicações utilizadas. Os
medicamentos foram divididos de acordo com a classe medicamentosa e para a análise dos dados
utilizou-se a estatística descritiva.
Amostras de sangue
Após 12 horas de jejum, as amostras de sangue foram coletadas e depositadas em tubos de coleta
em duas frações do sangue total: (1) 5 mL em EDTA para análise de colesterol e frações, triglicerídeos
e glicose; (2) 5 mL de heparina para análise da atividade da CAT e dos níveis de GSH e
TBARS.
Métodos
Os níveis de colesterol total e das frações, triglicerídeos (TG) e glicose foram determinados
usando método enzimático com kits comesciais (Labtest®). Os níveis de colesterol LDL foram
calculados de acordo com a formula de Friedewald (17).
- MDA: Utilizou-se a dosagem de malondialdeído (MDA) a partir do método de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), gerando um produto corado que pode ser medido opticamente
em 532 nm (18). Uma alíquota de sangue total foi precipitada com ácido tricloroacético (TCA) 40%, na
proporção de 2 de sangue/1 de TCA, homogeneizadas e centrifugadas por 10 minutos a 3000 rpm para
obtenção de sobrenadante (S1). Uma alíquota de S1 foi incubada com 0.6% de ácido tiobarbitúrico, 1%
de ácido fosfórico a 95 °C durante 1 h. A reação de cor foi medida a 532 nm. Os níveis de MDA foram
expressos em nmol MDA/mg de proteína.
47
GSH: Os níveis de GSH foram avaliados através dos níveis de NPSH pelo método de Ellman
(1959) (19). Primeiramente, 10% de Triton foi adicionado a uma alíquota de sangue total e misturados
por 30 segundos em vórtex e deixados em repouso durante 10 min para que a hemólise ocorra. Após foi
acrescentado 240 µl de TCA 20 % e as amostras foram homogeneizadas e centrifugadas por 10 minutos
a 3000. Após centrifugação, o precipitado proteico foi descartado e os níveis de non-protein sulfhydryl
(NPSH) livres foram determinados no sobrenadante, adicionando-se 50µl do sobrenadante a 50 µl de
DTNB (ácido 5-5-ditio-bis-nitrobenzoico); 10mM em 900 µl de tampão fosfato de potássio (TFK) na
concentração de 1M pH 7.4. A absorbância foi lida em 412 nm e os resultados foram expressos nmol de
NPSH/mg de proteína.
CAT: A atividade da CAT foi determinada através da reação enzimática, iniciada pela adição de
uma alíquota de eritrócitos previamente hemolisado com 10% de Triton e do substrato (H2O2) em uma
concentração de 0,3 mM em um meio contendo tampão fosfato de potássio na concentração de 50 mM,
pH 7,5. A atividade enzimática foi medida em 240 nm e expressa como unidade (U)/mg de proteína (1U
decompõem 1 mmol de H2O2 por minuto a 25ºC, pH 7 (20).
Durante uma coleta de dados, nao foi possível avaliar o TBARS de 12 idosas, os níveis de GSH de 23
idosas e a atividade da CAT de 22 idosas.
Análise Estatística
Os dados foram processados usando o software estatístico SPSS 22.0. As características
clínicas dos participantes nos dois grupos (sobrepesos e eutróficos) foram avaliadas por teste t
Student independente e as correlações de Pearson foram obtidas.
Considerou-se p<0,05 como significativo.
48
RESULTADOS
A média de idade da amostra total foi de 70,3 anos. Como esperado, as mulheres idosas com
sobrepeso apresentaram valores significativamente maiores de peso (p<0,05), IMC (p<0,05) e
triglicerídeos (p<0,05). As características gerais da população estão expressas na tabela 1.
Tabela 1 – Características antropométricas, bioquímicas e de pressão arterial das idosas eutróficas e
com sobrepeso
Variáveis Total (n=79) Sobrepeso (n-
45) Eutróficas
(n=34) p
Idade (anos)** 70,3 ± 8,2 70,09 ± 8,4 70,59 ± 8,2 0,792
Peso (Kg)** 71,2 ± 12,9 78,8 ± 0,5 61,14 ± 13,0 0*
Altura (m)** 1,6 ± 0,06 1,57 ± 13,0 1,59 ± 0,1 0,066
IMC (kg/m2)** 28,7 ± 5,4 32,15 ± 0,1 24,21 ± 4,4 0*
PAS (mm Hg)** 13,7 ± 1,4 13,89 ± 0,4 13,35 ± 1,4 0,095
PAD (mm Hg)** 8,2 ± 0,9 8,33 ± 1,4 8,06 ± 0,9 0,2
Glicemia (mg/dL)** 97,8 ± 32,3 102,16 ± 0,3 92,098 ± 32,7 0,168
CT (mg/dL)** 202,8 ± 38,3 203,87 ± 0,4 201,32 ± 38,0 0,768
HDL (mg/dL)** 49,5 ± 14,7 47,29 ± 0,5 52,44 ± 14,4 0,125
TG (mg/dL)** 129,6 ± 63,4 143,71 ± 0,5 111,03 ± 64,0 0,02*
LDL (mg/dL)** 126,9 ± 38,0 127,36 ± 0,5 126,38 ± 38,1 0,911
IMC: índice de massa corporal; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; CT:
colesterol total; HDL: colesterol lipoproteína de alta densidade; TG: triglicerídeos; LDL: colesterol
lipoproteína de baixa densidade. Teste t-student. *p < 0,05. **Média ± desvio padrão.
Em relação às classes medicamentosas mais utilizadas por idosos, a maior prevalência foi o uso
de medicamentos anti-hipertensivos com 61%, seguido de antiplaquetários (27%), hipolipimiantes
(25%) (tabela 2).
49
Tabela 2 – Uso de medicamentos de acordo com a classe
medicamentosa das idosas eutróficas e sobrepesos
Classe medicamentosa Total %(n)
Anti-hipertensivo 61(48)
Medicamento para hipotireoidismo 19(15)
Hipolipemiante 25(20)
Ansiolitico 8,9(7)
Inibidores da bomba de prótons 7,6(6)
Antiplaquetário 27(21)
Antidepressivo 11(9)
Hipoglicemiante 15(12)
n= número.
A atividade da CAT e os níveis de GSH e MDA estão apresentadas na tabela 3. Não teve
diferença significativa nos marcadores de estresse oxidativo entre os grupos em estudo.
Tabela 3. Marcadores de estresse oxidativo nos grupos em estudo.
Parâmetros Sobrepeso Eutróficas P
MDA (MDA/mg de proteína) 7,3 ± 0,7 7,18 ± 4,8 0,92
GSH (NPSH/mg de proteína) 534,1 ± 4,8 527,85 ± 265,0 0,929
CAT (U/mL) 592,61 ± 274,7 634,12 ± 91,0 0,075
Teste t-student.
O teste de correlação de Pearson revelou uma correlação positiva entre os níveis de GSH
(r=0,378, p<0,01) e a atividade da CAT e um correlação negativa entre os os níveis de GSH e os valores
médios de PAD (r=-0,336, p<0,05) (tabela 4).
50
Tabela 4. Coeficientes de correlação de Pearson da estado nutricional e
parâmetros do estresse oxidativo no grupo de idosas eutróficas e sobrepesos
MDA GSH CAT
Idade (anos) 0,113
0,088 -0,246
Peso (Kg) 0,123 0,086 0,109
IMC (kg/m2) 0,066 0,104 0,080
PAS (mm Hg) -0,116 0,024 -0,033
PAD (mm Hg) 0,109 -0,336* -0,015
Glicose (mg/dL) 0,222 -0,027 0,142
CT (mg/dL) -0,133 0,081 0,040
HDL (mg/dL) -0,021 -0,057 0,114
TG (mg/dL) 0,184 -0,174 -0,002
LDL (mg/dL) -0,186 0,046 -0,001
MDA (#) 1 0,146 0,054
GSH (##) 0,146 1 0,378**
CAT (U/mL) 0,054 0,378** 1
#MDA/mg de proteína. ##NPSH/mg de proteína. *p
< 0,05; ** p <0,01.
DISCUSSÃO
Os pacientes obesos comumente possuem um desequilíbrio entre gordura, peso corporal,
lipoproteínas e lipídios, o que interfere na suscetibilidade do organismo a lesões oxidativas (3) O excesso
de peso é uma realidade sempre presente, incluindo entre idosos, como demonstrado em estudos recentes
(21-23). O processo de envelhecimento é acompanhado por diversas alterações, dentre as quais ocorrem
mudanças na composição corporal dos indivíduos. Nesse contexto, há não só um aumento progressivo
na deposição da gordura corporal, como também a sua redistribuição, sendo observada uma diminuição
na região dos membros e um maior acúmulo na região abdominal (24).
Ao analisar as características gerais da amostra, encontramos uma alta média em relação ao IMC
e CT e HDL reduzido em relação aos valores de referência (15, 16). Estes resultados, podem estar
relacionados com o hábito alimentar da população da Região Sul do Brasil, o qual tem como principal
fonte de proteína na dieta as carnes em geral (23). Sabe-se que os produtos de origem animal são também
as principais fontes de gordura saturada, composta principalmente de ácidos graxos de cadeia longa,
51
como ácido palmítico, mirístico e esteárico, capazes de aumentar os níveis séricos de LDL e apo-
lipoproteína B, além de diminuir a razão HDL/LDL (25).
A maioria das idosas apresentam sobrepeso 57% (n=45), Silveira et al. (2009) (26) ao analisar a
prevalência de excesso de peso em dois municípios do sul do Brasil (Antônio Carlos-SC e Pelotas-RS)
encontraram esta condição em 52,8% (Antônio Carlos - SC) e 48% (Pelotas-RS) na população idosa.
Como esperado, as mulheres idosas com sobrepeso apresentaram valores estatisticamente
maiores de peso, IMC e Triglicerídeos (p<0,05), estando em concordância com o estudo de Venturini et
al (2013), onde os valores de triglicerídeos aumentaram conforme o aumento do IMC em idosas do
município de Porto Alegre, RS, Brasil. O consumo excessivo de carne (churrasco) pode ser responsável
pela alta prevalência de obesidade, dislipidemia e doenças cardiovasculares nessa população (27).
Ao analisar os biomarcadores de estresse oxidativo (MDA, GSH e CAT) entre os grupos
eutróficas e sobrepesos, não encontramos diferenças estatisticamente significativas. Na literatura, a
relação do estresse oxidativo com o estado nutricional em idosos é controverso, alguns estudos
demonstram relação entre o excesso de peso e os níveis de biomarcadores da oxidação de lipídios (28,
29), em outros não foi encontrada nenhuma associação (30, 31).
Sabe-se que a ingestão de uma dieta altamente calórica resulta num estado pós-prandial de
hipertrigliceridemia, hiperglicemia e níveis elevados de ácidos graxos livres na circulação,
podendo gerar um estado de estresse oxidativo (32). No entanto, algumas medicações para hipertensão
e diabetes mellitus, como por exemplo: enalapril, captopril (33), losartana (34), betabloqueadores (35),
metformina (36), aminoguanidina (37) são potentes antioxidantes. Quando analisamos o uso de
medicamentos, observamos que 61%(n=48) das idosas fazem uso de medicamentos anti-hipertensivos,
25%(n=20) e 15%(n=12) utilizam hipoglicemiantes. Desse modo, é possível que os idosos que fazem
uso de medicamentos, poderiam estar sob a influência de medicações com função antioxidante e
portanto, não apresentar modificação no estresse oxidativo.
Segundo os resultados de correlação, os níveis de GSH, tiveram uma correlação negativa com
os valores médios da PAD (r=-0,336, p<0.05). Corroborando com os resultados encontrados na literatura
que demostraram menores níveis de GSH em indivíduos hipertensos (38, 7).
52
É importante destacar que a redução dos níveis de GSH está relacionada com a redução da
atividade da CAT (r=0,378, p<0,01). Os parâmetros de defesa antioxidante enzimático e não enzimático
seguem a mesma direção, isto é a redução de uma está relacionada com a redução da outra. O papel
destas defesas antioxidantes consiste em remover as espécies reativas de oxigênio (39).
No presente estudo o tamanho amostral foi uma importante limitação. Uma amotragem maior
de idosas seria desejável para fortalecer alguns valores estatisticamente marginais. Além disso, a amostra
é constituída por idosas que fazem uso de um elevado número de medicações, o que poderia influenciar
no resultado de marcadores do estresse oxidativo.
Em conclusão, o sobrepeso não foi relacionado com o estresse oxidativo. Mais estudos
relacionando o estresse oxidativo e o estado nutricional com a população idosa são necessários para
confirmar nossos achados.
Agradecimentos: Esta pesquisa foi apoiada em parte por meio de doações do Centro Universitário
Franciscano, através das analises do perfil lipídico e glicemico realizado pela responsável técnica do
Laboratório de Eansino e Análise Clínica e dos estagiários do curso de biomedicina. As analises dos
marcadores de estresse oxidative foram financiados pela Universidade Federal de Santa Maria.
Contribuintes dos autores: as responsabilidades dos autores foram as seguintes: AG-B escreveu o
manuscrito, MdaC-G e BdaC-F analises bioquímicas, SR-N análise bioquímica e coleta de dados,
KMdeM-M W análise estatística, CW-N interpretação dos resultados NJ-S forneceu conselho e apoio
significativo na revisão e elaboração do documento.
Declaração: nenhum conflito potencial de interesse relevante para este artigo foi relatado.
53
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57
5 DISCUSSÃO
Estudos anteriores mostraram um aumento do nível de estresse oxidativo em indivíduos
idosos frágeis e institucionalizados, o que pode resultar em um processo de envelhecimento
acelerado e elevada incidência de doenças relacionadas ao estresse oxidativo, incluindo
cânceres, doenças cardiovasculares, demência e obesidade (MAUGERI et al., 2004; OHMORI
et al., 2005; KARAOUZENE et al., 2011; BAKHTIARI et al., 2017).
Quando analisamos os níveis de MDA nas idosas com e sem SM, encontramos níveis de
MDA significativamente mais elevados no grupo com SM. Esse achado é consistente com
estudo de Sarbijani et al. (2016), onde avaliaram a peroxidação lipídica através do MDA em 40
sujeitos com SM e 40 sem SM, e encontraram níveis de MDA significativamente maior nas
mulheres com SM.
Estudo recente de Bakhtiari et al. (2017) analizou o estresse oxidativo e os componentes
da SM em 75 mulheres idosas com SM e 89 sem a SM. Os autores encontraram níveis de MDA
significativamente maiores nas idosas com SM. Além disso, a SM teve um poder de predição
muito maior do que a idade no estresse oxidativo.
Níveis de GSH e a atividade da CAT mostraram valores menores nas idosas com SM.
Embora estes valores não tenham sido estatisticamente significativos, estes resultados
corroboram com os dados encontrados por outros autores que demonstraram uma redução das
defesas antioxidantes em indivíduos com SM (BITLA et al., 2012; VENTURINI, 2015;
GRADINARU, 2017; BAKHTIARI, 2017).
É importante destacar que encontramos uma correlação positiva entre a redução dos
níveis de GSH e a redução da atividade da CAT. Ou seja, os parâmetros de defesa antioxidante
enzimática (CAT) e não enzimática (GSH) seguem a mesma direção. O papel destas defesas
antioxidantes consiste em remover as EROs (GOMES et al., 2012).
Encontramos uma correlação negativa dos níveis de GSH com PAD, sugerindo que a
pressão arterial elevada pode reduzir a defesa antioxidante. Este achado vai ao encontro de
Redón et al., 2003, que avaliaram 66 hipertensos e 16 controles e encontraram redução
significativa das defesas antioxidantes SOD, CAT e GPx. Outro estudo também avaliou o
estresse oxidativo em 20 indivíduos hipertensos e 21 controles e encontrou níveis
significativamente menores de GSH em indivíduos hipertensos (VASCONCELOS et al., 2011).
58
Quando analisamos as idosas sem SM, observamos que este grupo também apresenta
valores elevados de IMC e CA, mas os valores de PAS encontram-se dentro dos parâmetros de
referência. Sabendo que o excesso de peso está relacionado com um aumento do estresse
oxidativo (OLUSI et al., 2002; FRANÇA et al., 2013), a correlação negativa entre os níveis de
MDA e os valores de PAS pode estar sendo influenciada pelo excesso de peso.
Além disso, uma correlação positiva foi evidenciada entre os níveis de GSH e os dados
de IMC, bem como, entre os níveis de GSH e valores médios de CA. É importante enfatizar que
o grupo sem SM apresentou valores médios de IMC e CA alterados. Neste grupo os níveis de
GSH foram maiores, o que pode ser explicado pela ação da GSH, a mais importante defesa
antioxidante não enzimática, em proteger os indivíduos sem SM dos danos oxidativos.
É importante salientar que o aumento da idade está relacionado com a redução da
atividade da CAT. Uma redução nas defesas antioxidantes pode resultar em elevação dos níveis
de EROs, que eventualmente pode direta ou indiretamente causar dano oxidativo aos órgãos.
Portanto, o estresse oxidativo no envelhecimento, além de estar diretamente relacionado à
indução de danos aos órgãos, agrava os fatores de risco de danos vasculares, incluindo a SM
(JANSEN; RUSKOVSKA, 2013; MAUGERI et al.,2004).
Quando separamos os participantes em grupo com sobrepeso e grupo eutrófico, não
encontramos diferenças estatisticamente significativas nos marcadores de dano oxidativo. Na
literatura, a relação do estresse oxidative com o estado nutricional em idosos é controverso, pois
alguns estudos demonstram relação entre o excesso de peso e níveis de biomarcadores da oxidação
de lipídios (OHMORI et al., 2005; KARAOUZENE et al., 2011) enquanto outros não demonstram
nenhuma associação (MOREIRA, 2010, NAROTZKI et al., 2014).
Sabe-se que algumas medicações para hipertensão e diabetes mellitus (KIM et al., 2013; de
CAVANAGH et al., 2003; MAK, WEGLICKI, 2004; STADLER et al., 2005) são potentes
antioxidantes. Quando analisamos o uso de medicamentos, observamos que grande parte das idosas
fazem uso de medicamentos anti-hipertensivos e hipoglicimiantes. Desse modo, é possível que os
idosos que fazem uso de alguns medicamentos poderiam estar sob a influência de medicações com
função antioxidante.
Este estudo apresenta algumas limitações tais como o tamanho relativamente pequeno da
amostra. Um número maior de idosas seria desejável para fortalecer alguns valores significativos
marginais. Além disso, a ausência de mulheres com idade inferior a 60 anos limita nossas
59
conclusões, pois tanto o envelhecimento quanto o uso de medicamentos podem contribuir para a
indução de alterações nos marcadores de dano oxidativo (TEIXEIRA et al., 2014).
60
6 CONCLUSÃO
Nossos achados sugerem que a SM está vinculada ao estresse oxidativo, demostrado
pelos níveis de MDA estatisticamente mais elevados nas idosas com SM e correlação negativa
entre a atividade da GSH e a PAD. Já o sobrepeso não foi relacionado com o estresse oxidativo.
Esses achados sugerem que o conjunto de fatores associados a SM contribuem mais para o dano
oxidativo do que somente a obesidade.
No entanto, nosso estudo é transversal e a amostra não é representativa. Portanto, torna-
se necessário realizar estudos prospectivos com amostras representativas para confirmar nossos
achados.
61
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70
APÊNDICE A - Questionário de Identificação e de Saúde
Dados de identificação:
Data da avaliação: ____/____/______
Nome: _____________________________________________________________________
Data de nascimento: ____/____/____ 2. Idade: ____anos Telefone:___________
Endereço:___________________________________Bairro:__________________________
Cidade:_____________________________________________________________________
Comorbidades associadas:
( )Diabetes ( )Hipertensão ( ) Asma ( ) Doença cardíaca
( ) Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica ( ) Obesidade ( ) Osteoartrite
( ) Artrite reumatóide ( ) Câncer ( ) Aterosclerose periférica (
) AVC ( ) AVE
Fumante: ( )Sim ( ) Não Quantidade:__________________
Bebida alcólica: ( )Sim ( ) Não Quantidade:_____________
Medicamentos utilizados: conforme critérios de exclusão
( ) antibiótico [1] ( ) anti-inflamatório [2] ( ) corticóide [3] ( ) antidepressivo [4]
( ) medicamento para HAS [5] ( ) medicamento para DM [6] ( ) AAS [7] (
) polivitamÍnicos
Medicamento Horário de administração Quantidade recomendada
Dados antropométricos e pressão arterial:
Peso:_____________ Kg Altura:____________ m
IMC: _______ Kg/m2 Estado nutricional: ( ) < 22 Kg/m2 – Baixo peso [1]
( ) 22- 27 Kg/m2 – Adequado [2] ( ) > 27 Kg/m2 – Adequado [3] Circunferência cintura: ___ cm
PAD1 _______ mmHg PAS1 _____________ mmHg
PAD2 _______ mmHg PAS2 _____________ mmHg
PAD3 ______ mmHg PAS3 _____________ mmHg
Média PAD _______ mmHg Média PAS ________________ mmHg
71
APÊNDICE B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
O sr.(a) está sendo convidado(a) a participar como voluntário(a), da pesquisa
RELAÇÃO DA SÍNDROME METABÓLICA E ESTRESSE OXIDATIVO EM MULHERES
IDOSAS PARTICIPANTES DE GRUPOS DE CONVIVÊNCIA DA CIDADE DE SANTA
MARIA, da aluna de mestrado e pesquisadora Aline Gurski Bolzan sob a orientação da Prof.
Dra. Natielen Jacques Schuch do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde e da Vida
do Centro Universitário Franciscano.
JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS DA PESQUISA
A Síndrome Metabólica é um transtorno complexo representado por um conjunto de
fatores de risco cardiovascular, usualmente relacionados à deposição de gordura visceral ou
abdominal, dislipidemia (gordura no sangue), diabetes mellitus tipo 2 (excesso de açúcar no
sangue), obesidade e hipertensão arterial sistêmica (pressão alta).
Essas doenças quando presentes no organismo ocasionam a produção e liberação de
espécies reativas de oxigênio (EROS), os radicais livres. As EROS quando aumentadas no
organismo, podem causar o estresse oxidativo. Um aumento no estresse oxidativo pode estar
relacionado com várias doenças, tais como as doenças cardiovasculares, o diabetes mellitus e
inflamação crônica, como a asma, artrite, doenças reumáticas e também tem sido considerado
importante na síndrome metabólica.
PROCEDIMENTOS A SEREM REALIZADOS
Se a Srª. concordar em participar do estudo, realizará exame de sangue e a coleta será
feita por uma biomédica habilitada. Para o exame a Srª. deverá estar em jejum de 12 horas. Será
coletado 20ml de sangue (equivalente a 2 colheres de sopa) para análise da glicemia de jejum
(açúcar do sangue), triglicerídeos, colesterol total, HDL e LDL (gorduras do sangue), enzimas
antioxidantes (catalase, glutationa peroxidase, superóxido dismutase e glutadiona reduzida).
Além dessas analises será realizado testes para quantificar o estresse oxidativo em gorduras e
proteínas. O sangue será descartado após as análises bioquímicas. Após o exame de sangue, a
Srª. receberá um lanche e após, será realizada a avaliação antropométrica, feita por nutricionista.
Será avaliado o peso, altura, circunferência da cintura e circunferência do abdômen e realizada
a aferição da pressão arterial. Após será aplicado o questionário sobre saúde contendo uma mini
avaliação nutricional (complementa a avaliação nutricional).
Rubrica do participante Rubrica da pesquisadora
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INFORMAÇÕES IMPORTANTES
A Srª. não terá custo nenhum em participar da pesquisa, nem com seu deslocamento
até o local das coletas e também não será remunerada por sua participação. Garantimos, no
entanto, que se ocorrerem despesas decorrentes da pesquisa estas serão ressarcidas, quando
devidas e decorrentes especificamente de sua participação.
Os benefícios da sua participação serão: a realização de exames de sangue específicos
gratuitos, avaliação nutricional e contribuir para elaboração de novas ações específicas em
nutrição e saúde. Os riscos da sua participação na pesquisa são mínimos. No exame de sangue
raramente, a coleta de sangue pode provocar um pequeno hematoma (mancha roxa) no local da
punção, que, em geral, desaparece após 3 a 5 dias. Na avaliação nutricional, se detectarmos
alterações, a Srª. receberá orientações nutricionais e de saúde e será encaminhado para
acompanhamento nutricional no Centro Universitário Franciscano. Caso houver alguma outra
alteração, a Srª. será orientado a procurar um profissional devidamente habilitado.
Sua participação é totalmente voluntária e a Srª. pode desistir e retirar seu
consentimento em qualquer momento no decorrer da pesquisa sem nenhum prejuízo. Seus dados
são secretos e sigilosos de acordo com as normas brasileiras. Os resultados desta pesquisa
poderão ser publicados em revistas científicas, mas a sua identidade será preservada.
Eu, _____________________________, declaro que li o termo de consentimento livre
e esclarecido para esse estudo e aceito participar voluntariamente desse estudo. Também declaro
concordar com os termos do estudo e ter assinado (ou meu representante legal) o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido em duas vias, tendo recebido uma via devidamente
rubricada e assinada pelo pesquisador. A outra via será arquivada pelo pesquisador responsável,
de acordo com a Resolução CNS 466/2012. Sei que terei garantias de confidencialidade, poderei
alterar minha decisão sobre o consentimento de participação e ou solicitar novos
esclarecimentos à pesquisadora Aline Gurski Bolzan através do telefone (55)99946-5018. Fui
informada e estou ciente que, caso ocorram danos devidamente comprovados da minha
participação na pesquisa, poderei ser indenizada. Em caso de dúvida sobre os meus direitos ou
questões éticas como participante de pesquisa, sei que posso entrar em contato com Comitê de
Ética em Pesquisa do Centro Universitário Franciscano, na Rua dos Andradas, 1614 - 7º andar
- Prédio da Administração Central - Conjunto I, CEP: 97010032 - Santa Maria, RS; Fone: (55)
3220 1200 Ramal 1289; E-mail: [email protected], de segunda à sexta-feira nos seguintes horários:
Manhã: das 7:30 às 11h e tarde: das 13:30 às 17:30.
Nome do participante (ou representante legal):______________________________________
Assinatura do participante: (ou representante legal):__________________________________
Nome da pesquisadora: ________________________________________________________
Assinatura da pesquisadora: ____________________________________________________
Data:_____/______/_________
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APÊNDICE C – Autorização do Laboratório Escola de Análise Clínica
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APÊNDICE D – Autorização do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular
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ANEXO E – Aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa