PRÁTICA I

1. PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA E TÉCNICAS DE MANUTENÇÃO DE CULTURA (REPIQUES)

1.1 OBJETIVOS DAS PRÁTICAS

- Aprender os procedimentos de esterilização de meios de cultura e de vidrarias. - Aprender a trabalhar de forma asséptica visando evitar a contaminação das células e do

ambiente. - Preparar meios de cultura visando à concentração de culturas e os procedimentos para

iniciar um processo fermentativo. - Repicar as culturas visando sua manutenção e isolamento. - Aprender a diferenciar os meios de culturas para as bactérias, fungos filamentosos e

leveduras. 1.2 PREPARAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

Meios de cultura são, em microbiologia, o nome que se dá “a associação, quali e quantitativamente equilibrada, de substâncias que, por natureza, permitem o cultivo dos microrganismos fora de seu “habitat”, ou meio natural. A possibilidade do cultivo artificial, e portanto, em condições previamente fixadas e sempre reprodutíveis, integra, junto com a esterilização e a prática asséptica, o fundamento científico da técnica microbiológica e possibilita a aplicação industrial dos microrganismos visando a produção de bioprodutos. Classificação dos meios de culturas: - Quanto à apresentação, podem ser líquidos e sólidos. Os líquidos são usados quando se

deseja um grande número de células, sendo muito usado principalmente para iniciar uma fermentação ou como pé de cuba para grandes escalas. Os meios sólidos são usados principalmente para o isolamento de espécies microbianas, para conservação de cultura e para o esgotamento. Para fazer o meio sólido utiliza-se o polissacarídeo Agar-agar.

- Quanto à origem dos constituintes, naturais e sintéticos. - Quanto à natureza dos constituintes, meios minerais (todos os constituintes são minerais),

meios orgânicos (fontes de carbono são açúcar, proteínas ou aminoácidos), meios mistos (fonte de carbono orgânico e demais componentes minerais) e meios complexos (além de fontes de carbono, nitrogênio e enxofre têm-se “fatores de crescimento” como vitaminas).

- Quanto à finalidade eles podem ser: meios de cultivo, meios de enriquecimento, meios de identificação, meios diferenciais, meios especiais e meios para conservação. Para as bactérias os meios mais indicados são o caldo simples ou gelose nutriente e o meio de Huddlesom. Para leveduras as geloses Sabourand ou YED e para os bolores as geloses Czapeck e Sabourand.

1.2.1 Procedimento Experimental Preparação dos meios de cultura

A solubilização dos componentes é muito importante para a produção de meios claros, proporcionando melhor observação de crescimento dos microrganismos nele cultivados e a presença de contaminantes no mesmo.

a) OS sais minerais devem ser pesados de acordo com a formulação de cada meio, dissolvidos em um béquer contendo quantidade suficiente de água destilada.

b) Os açúcares, a peptona, o extrato de carne e de levedura devem ser pesados e a seguir dissolvidos separadamente em um béquer contendo água destilada. Se houver dificuldade de dissolver os dois últimos deve-se aquecê-los levemente.

c) O agar-agar (para meios sólidos) deve ser pesado e a seguir dissolvido em presença de água e aquecido para dissolução e posteriormente reunidos os demais componentes.

Juntar em erlenmeyer as soluções obtidas na seguinte ordem: peptona, extratos, sais minerais, açúcares, outros componentes se houver e Agar-agar. Ajustar o pH com solução 0,1 N de ácido clorídrico ou 0,1 N de hidróxido de sódio dependendo do pH do meio. Se o meio apresentar proceder a clarificação com a filtração à vácuo do mesmo utilizando funil de Buchner e filtro de papel em meio sem gelose e filtro d algodão hidrófilo para meio com gelose (neste caso o mesmo deve estar aquecido de 80 a 90C). Enquanto alguns alunos preparam os meios de cultura outros preparam as rolhas de algodão e gases para os recipientes que receberam os meio. A DISTRIBUIÇÃO DOS MEIOS EM ERLENMEYER E GARRAFAS DE VIDRO QUE POSSAM SER AUTOCLAVADAS PARA SER UTILIZADO EM EXPERIMNTOS DE QUANTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS E EM TUBOS DE ENSAIO para a manutenção de cultura. Esses recipientes devem estar tampados com rolhas feitas de algodão e gases. Para a distribuição utiliza-se funil de vidro, adaptado com uma mangueira de borracha vedada por uma pinça na ponta. Deixar a gelose escorrer sem molhar a boca dos recipientes, senão a rolha de algodão pode aderir as paredes do tubo de ensaio ou do erlenmeyer. Em tubos de ensaios deve-se adicionar de 5 a 20 mL dependendo do diâmetro do tubo. Terminada a distribuição, os tubos de ensaios, garrafas de vidro e erlenmeyer de vidro são arrolhadas com rolhas de algodão e gases, condicionadas em cestas e recobertas com papel impermeável e levados à esterilização. Para meios com glicose e lactose utilizar 110 0C por 15 minutos para os meios sem essas substâncias utilizar 121 0C e 20 minutos. Após a esterilização os meios em tubos de ensaios que serão utilizados para conservação de cultura devem ser colocados inclinados visando solidificar a gelose de forma escorrida até a metade do tubo de ensaio, com a finalidade de aumentar a área para o esfregaço da cultura. Fórmulas dos meios de cultura: Caldo Nutriente (Simples) – Para cultivo e contagem em placa de bactérias aeróbias totais. Extrato de carne de boa fabricação (por exemplo: Difco e BBL) (3 g); peptona (10g); fosfato de potássio dibásico (1 g); cloreto de sódio (5g); agar-agar (30 g); água destilada (1 L). Ajustar o pH para 7,4 a 7,6. Esterilizar a 121 0C/ 20 minutos. Meio YMA – Também para o cultivo e a contagem em placa de bactérias aeróbias totais. Glicose 10 g, Extrato de levedura (3,0 g); Peptona (5,0 g); agar-agar (18-19 g); água destilada (1L). Ajustar pH para 6,0. Esterilizar a 120 0C/ 20 minutos. Gelose Sabourand–dextrose - Para cultivo e contagem em placa de leveduras e fungos não filamentosos. Peptona (10g); dextrose (40g); agar-agar (20 g) e água destilada (1L). Ajustar o pH em 5,5. Esterilizar a 110 0C por 15 minutos. Gelose Czapeck - Para cultivo e contagem em placa de fungos filamentosos. Glicose (20 g); nitrato de sódio (2g); fosfato dibásico de potássio (1g); sulfato de magnésio (0,5 g); cloreto de potássio (0,5 g); sulfato ferroso (0,01 g); sulfato de amônio (1g); agar-agar (20 g) e água destilada (1L). Ajustar o pH em 5,5 e esterilizar a 110 0C por 15 minutos.