microssistemas de anÁlises quÍmicas. introduÇÃo ... · bas, micro-válvulas e sensores...

Quim. Nova, Vol. 30, No. 8, 1986-2000, 2007Rev

isão

*e-mail: [email protected]

MICROSSISTEMAS DE ANÁLISES QUÍMICAS. INTRODUÇÃO, TECNOLOGIAS DE FABRICAÇÃO,INSTRUMENTAÇÃO E APLICAÇÕES

Wendell Karlos Tomazelli Coltro, Evandro Piccin e Emanuel Carrilho*Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, CP 780, 13560-970 São Carlos - SP, BrasilDosil Pereira de Jesus e José Alberto Fracassi da SilvaInstituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971 Campinas - SP, BrasilHeron Domingues Torres da Silva e Claudimir Lúcio do LagoInstituto de Química, Universidade de São Paulo, CP 26077, 05513-970 São Paulo - SP, Brasil

Recebido em 9/11/06; aceito em 2/3/07; publicado na web em 9/11/07

MICRO CHEMICAL ANALYSIS SYSTEMS. INTRODUCTION, FABRICATION TECHNOLOGIES, INSTRUMENTATION ANDAPPLICATIONS. The amazing world of micro total analysis systems has provided a true revolution in analytical chemistry in recentyears. The application of the microfluidic devices for chemical and biochemical processing has attracted considerable interest due to itsadvantages such as reduced sample and reagent consumption, processing time, energy, waste, cost, and portability. The aim of the presentreport is to disseminate the state of the art related to the miniaturization science in Analytical Chemistry. Historical progress,microfabrication technologies, required instrumentation and applications of the μTAS are presented in the current article, with specialattention to the Brazilian contributions.

Keywords: micro total analysis systems; microfabrication; miniaturization.

INTRODUÇÃO

A comunidade científica tem observado, nas últimas décadas, osurgimento, o crescimento e a consolidação de uma nova tendênciamundial: a miniaturização. Em diferentes ramificações da ciência écomum, e cada vez mais necessário, o uso de dispositivosminiaturizados. Na Química Analítica não é diferente, e o uso desistemas miniaturizados é uma realidade em âmbito mundial. Estetrabalho visa a divulgação do estado da arte deste micro-mundoanalítico para a comunidade científica nacional. Os principais as-pectos relacionados à evolução histórica, incluindo os efeitos e be-nefícios da miniaturização, tecnologias de microfabricação,instrumentação e algumas aplicações realizadas em sistemasmicrofabricados são abordados nesta revisão. Obviamente, muitasdas informações estarão condensadas no texto. No entanto, há naliteratura artigos de revisão que podem auxiliar como material parauma leitura complementar e mais aprofundada1-5.

Miniaturização

A miniaturização de dispositivos eletrônicos, a partir da décadade 60, provocou uma verdadeira revolução na eletrônica e nainformática. O rápido desenvolvimento de sistemas miniaturizados,nos mais diferentes campos de pesquisas, tem dominado o progres-so da tecnologia moderna. Atualmente, a miniaturização de rádio,televisão, gravador, telefone, discos rígidos e microcomputadores éalgo comum e presente no cotidiano do ser humano. Nesse contex-to, indústrias ligadas a setores como o automobilístico, informática,entretenimento, telecomunicações e medicina têm faturado milhõesde dólares na comercialização de seus produtos6,7.

Da mesma forma que os microchips eletrônicos revolucionaramo universo dos computadores e da eletrônica, os microchips analíti-cos têm revolucionado a química analítica nos últimos anos3-5. Ini-

cialmente, a principal razão para a miniaturização era aumentar odesempenho analítico mais do que reduzir seu tamanho. No entan-to, com a mudança da escala macro para a micro, outras vantagensforam obtidas, como a redução do volume de reagentes e amostras(da ordem de pL-nL), baixo custo de fabricação e análise em temporeduzido8.

O primeiro dispositivo analítico miniaturizado foi um sistemade cromatografia em fase gasosa9, apresentado na década de 70. Omicro-cromatógrafo foi construído em lâmina circular de silício comdiâmetro de 5 cm. Neste substrato, foi construída uma válvula deinjeção e uma coluna de separação de 1,5 m de comprimento. Umdetector de condutividade térmica foi fabricado em um outrosubstrato, sendo posteriormente prensado mecanicamente paraintegrá-lo ao substrato contendo a coluna de separação. A Figura 1apresenta uma imagem desse primeiro microdispositivo analítico.

Apesar da capacidade de realizar rápidas separações, o primei-ro microdispositivo não foi prontamente aceito pela comunidadecientífica, devido à falta de experiência tecnológica em métodos deseparação. Com isso, pesquisas relacionadas à miniaturização fica-ram limitadas, na década de 80, ao desenvolvimento de micro-bom-bas, micro-válvulas e sensores químicos2.

O renascimento dos microdispositivos analíticos ocorreu no ini-cio da década de 90, com a apresentação de um microssistema paracromatografia em fase líquida10. Esse cromatógrafo foi fabricadoem um substrato de silício com dimensões de 5 × 5 cm contendouma coluna tubular aberta, um detector condutométrico e conexõesexternas para uma bomba de cromatografia líquida e válvulas paraaplicação de pressão.

Simultaneamente à apresentação desse microdispositivo, Manze colaboradores11 propuseram o conceito de microssistemas paraanálises totais, ou simplesmente µTAS. Com o desenvolvimentodos µTAS, tornou-se possível integrar várias etapas analíticas, comointrodução da amostra, pré-tratamento da amostra, reações quími-cas, separação analítica e detecção em um único dispositivo8,11.Devido à idéia de inserir várias etapas, normalmente desenvolvidas

1987Microssistemas de análises químicasVol. 30, No. 8

em um laboratório, em um chip, os µTAS são também denomina-dos “lab-on-a-chip” (LOC)12. Os µTAS, ou LOC, transformam in-formações químicas em sinais elétricos ou ópticos, possibilitandouma fácil automação. Estes aspectos se tornaram relevantes para ocampo clínico e ambiental em que o termo “point-of-care” vem sen-do utilizado12,13. Todos estes fatores, aliados à portabilidade, impul-sionaram o desenvolvimento explosivo e maciço dos sistemas ana-líticos em micro-escala nos últimos anos4,5. A Figura 2 apresenta aevolução do número de publicações, relacionada ao uso demicrossistemas analíticos, no período de 1990 a 2006, conforme abase de dados da “Web of Science”. Muitos destes artigos podemser encontrados em periódicos específicos para as áreas de micro enanotecnologia como, por ex., “Journal of Micromechanics andMicroengineering, Lab on a Chip, Nano Letters, e Small”. Destes,os periódicos “Lab on a Chip” e “Nano Letters” apresentam umelevado fator de impacto (5,2 e 9,8, respectivamente), aspecto quecomprova a expansão e importância desta nova fronteira. Além dis-so, o periódico “Electrophoresis” também publica anualmente umaedição especial sobre miniaturização. Adicionalmente, a “AnalyticalChemistry”, principal periódico em Química Analítica, tem publi-cado bienalmente, desde de 2002, revisões científicas abrangendoa evolução e consolidação destes microssistemas analíticos.

TECNOLOGIAS DE MICROFABRICAÇÃO

Os µTAS, LOC´s, microchips ou microdispositivos podem serfabricados através de tecnologias convencionais ou alternativas,usando diferentes substratos planares. Nas tecnologias convencio-nais, há a necessidade do uso de uma fonte energética para fazer atransferência da imagem dos microcanais para o substrato utiliza-do. Tipicamente, essa transferência é primeiramente feita para asuperfície de um polímero sensível à radiação utilizada (fotorresiste).A exposição à radiação promove uma interação entre o feixe inci-dente e o substrato sólido. Conseqüentemente, a absorção de luz ouo espalhamento inelástico das partículas pode afetar a estruturaquímica do fotorresiste alterando sua solubilidade, permitindo a

revelação da imagem fotogravada. Processos litográficos, como alitografia por raios-X, a litografia “soft”, a litografia por feixe deelétrons ou a litografia com radiação ultra-violeta (UV), são osmais utilizados14.

TECNOLOGIAS CONVENCIONAIS

Processos fotolitográficos

A fotolitografia6 consiste em transferir estruturas micrométricas,da ordem de 10 a 100 µm, para um substrato sólido com o auxíliode radiação UV ou raios-X. Este processo foi desenvolvido nasdécadas de 70 e 80 pela indústria microeletrônica e foi adaptadopara fabricação dos primeiros dispositivos microfluídicos, sendo osilício o substrato pioneiro, devido ao seu amplo emprego na cons-trução de circuitos integrados. Entretanto, em decorrência do seuelevado custo e por possuir propriedades físicas, químicas e elétri-cas limitadas para este tipo de aplicação, o silício vem sendo subs-tituído por quartzo e vidro. De modo genérico, a Figura 3 apresen-ta as principais etapas de um processo fotolitográfico para a fabri-cação de microcanais em vidro. As etapas apresentadas podem sertambém utilizadas para a fabricação de microestruturas em outrossubstratos.

Resumidamente, o processo fotolitográfico consiste na escolhae limpeza do substrato, fotogravação dos microcanais em um polímerofotossensível (fotorresiste), corrosão do substrato e selagem dosmicrocanais. A limpeza das lâminas de vidro (alcalino, borossilicatoou de sílica), com espessuras inferiores a 10 mm, é realizada comágua, detergentes, solventes orgânicos (isopropanol e acetona) e so-luções altamente oxidantes, tais como NH

4OH/H

2O

2 e H

2SO

4/H

2O

2

(solução piranha). Uma fina camada metálica (20-100 nm) pode serdepositada sobre o substrato (I), através da técnica de “sputtering”ou evaporação térmica, para atuar como máscara na etapa de corro-são do substrato. Essa camada metálica é, geralmente, constituídade Cr/Au, sendo que a camada de Cr é depositada para aumentar aaderência da camada de Au à superfície. Para a etapa de fotogravação,inicialmente uma camada de fotorresiste (20-50 µm) é depositadasobre o filme metálico (I) através da técnica de “spin coating”15. Aradiação UV ou raios-X atinge seletivamente a superfície dofotorresiste após atravessar uma máscara, posicionada entre a fontede radiação e o substrato (II). As máscaras convencionais, com reso-lução da ordem de 1 µm, são fabricadas em uma placa de vidrorecoberta por filme fino de Cr, no qual é gravado, também por

Figura 1. Ilustração do primeiro microssistema para cromatografia em fase

gasosa fabricado em substrato de silício, com diâmetro de 5 cm, na

Universidade de Stanford, no fim da década de 70. Adaptado da ref. 9

Figura 2. Evolução do número de publicações relacionadas aosmicrossistemas analíticos entre 1990 e 2006. Pesquisa realizada na “Web of

Science” com as seguintes palavras-chave: “lab on a chip, micro total

analysis system, microchannels, fluidic microdevices, microfluidic devices,minuaturized system, electrophoresis microchip, microchip electrophoresis,

planar chips e micromachined systems”

1988 Quim. NovaColtro et al.

fotolitografia, o padrão dos microcanais a serem transferidos para osubstrato. Máscaras com resolução da ordem de 30 μm podem serpreparadas em fotolitos, cuja tecnologia é mais rápida e economica-mente mais atrativa. De acordo com a natureza do fotorresiste, ascadeias poliméricas nas regiões expostas à radiação podem sofreruma reticulação e se tornarem insolúveis (fotorresiste negativo) oupodem sofrer uma degradação e se tornarem solúveis (fotorresistepositivo). No processo de microfabricação apresentado na Figura 3 éutilizado fotorresiste negativo, que é o mais utilizado. Dependendoda característica do fotorresiste, há a necessidade de etapas de trata-mento térmico antes e depois da fotogravação, de modo a eliminarqualquer presença de solvente e reduzir o estresse intrínseco do ma-terial. A imagem fotogravada é revelada (III) com solventes orgâni-cos específicos para cada tipo de fotorresiste.

Uma vez transferido o padrão dos microcanais para o fotorresisteé realizada a corrosão da camada metálica exposta (IV). Para corro-são do Au utilizam-se soluções contendo KI/I

2 ou HCl/HNO

3 (água

régia) e para corrosão de Cr solução de K3Fe(CN)

6 ou de

Ce(NH4)

2(NO

3)

6. Após a corrosão da camada metálica, a superfície

do substrato torna-se acessível e passa por um processo de corrosãoúmida (usando soluções de HF/NH

4F ou HF/HNO

3) ou seca (plas-

ma de íons reativos, RIE, “reactive ion etching”), transferindo aimagem dos microcanais para o próprio substrato (V). A profundi-dade dos canais formados pode ser controlada pelo tempo de corro-são, desde que a taxa de corrosão tenha sido previamente determi-nada. A taxa de corrosão depende do material do substrato, da com-posição química da solução, da concentração analítica e da tempe-ratura. Normalmente utilizam-se canais com profundidades de pou-cas dezenas de micrometros e larguras de até centenas demicrometros. Após a formação dos canais, a camada de fotorresisteé removida com solvente orgânico (acetona), enquanto o filme me-tálico é retirado com as soluções corrosivas, já mencionadas.

Existem algumas variações menos usuais desta técnica demicrofabricação para vidro, como por ex., a utilização de silícioamorfo ou policristalino como máscara para corrosão16-18. Este tipode silício é depositado sobre o vidro por processos envolvendo plas-ma6. Em alguns processos, não são usados filmes metálicos comomáscara e, nesse caso, apenas o fotorresiste é empregado para essafunção19,20. Além do uso das máscaras convencionais, estudos re-centes têm demonstrado que uma camada de toner, transferida ter-micamente para a superfície do substrato, pode ser perfeitamente

utilizada como máscara para corrosão por via úmida21.As técnicas de microfabricação envolvendo silício são seme-

lhantes às empregadas para o vidro, entretanto há algumas diferen-ças técnicas. Por ex., enquanto que no vidro não é possível realizarcorrosão anisotrópica (corrosão preferencial em um sentido), no si-lício isto é obtido empregando-se solução de KOH ou corrosão porplasma6,22. Outra diferença está na possibilidade da utilização deóxido de silício como máscara, o qual é crescido a partir do própriosubstrato por oxidação térmica23,24.

Após a transferência dos microcanais para o substrato na etapade corrosão, é realizada a etapa de selagem (ou vedação) (VI) dosmicrodispositivos, que consiste em vedar os microcanais empre-gando-se uma cobertura, a qual pode possuir composição idênticaou diferente à do substrato. Para dispositivos microfluídicos obti-dos por métodos fotolitográficos, em que os substratos geralmentesão silício, quartzo ou vidro, a selagem pode ser realizada por pro-cessos térmicos6,25. Nestes processos, o substrato é colocado em con-tato com outra lâmina de vidro ou silício e aquecido a temperaturassuperiores a 500 °C, ocasionando a formação de ligações covalentesentre o substrato e a cobertura. No entanto, a elevada temperaturaempregada neste processo é uma desvantagem, uma vez que podecausar deformações nos perfis dos microcanais. Processos de sela-gem conduzidos a temperaturas menores vêm sendo desenvolvidose tem ganhado preferência26. Entre estes processos destaca-se a se-lagem anódica, a qual envolve o aquecimento (200 a 500 °C) e asimultânea aplicação de uma diferença de potencial (300 a 1000 V)entre o substrato e a cobertura. A selagem anódica é empregadapara selagem vidro-silício, silício-silício e silício-metal. Outras téc-nicas de selagem a baixa temperatura envolvem o emprego de umfilme metálico (selagem eutética) ou de silicato entre o substrato ea cobertura26. Os processos de selagem descritos são consideradosirreversíveis, uma vez que a cobertura não é facilmente removidaapós o processo. No entanto, selagens reversíveis podem ser obti-das através do emprego de coberturas confeccionadas com polímeroselastoméricos como, por exemplo, o polidimetilsiloxano (PDMS)27.A vedação ocorre devido à formação de interações de van der Waalse, dessa forma, não resistem à aplicação de pressões superiores a30 kPa.

TECNOLOGIAS ALTERNATIVAS

As tecnologias convencionais, propiciam a fabricação demicroestruturas com excelente definição e resolução. No entanto, ocusto de implementação de um laboratório é extremamente alto.Para a construção de um laboratório de microfabricação contendoambiente completamente limpo, estação fotolitográfica, “spinner”,chapas de aquecimento, perfilômetro, dentre outros, é necessárioum investimento superior a um milhão de reais. Além disso, há anecessidade de material de consumo como fotorresistes, reveladores,máscaras metálicas, substratos de vidro, silício e quartzo, os quaistambém apresentam custo elevado. Estes fatores desencorajammuitos pesquisadores a se aventurarem nessa área. No Brasil, háum laboratório multi-usuários no qual toda a infra-estrutura neces-sária para a fabricação de microestruturas está disponível aos pes-quisadores. O Laboratório de Microfabricação (LMF) está localiza-do no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), vinculadoao Ministério de Ciência e Tecnologia/CNPq, localizado na cidadede Campinas/SP. Informações sobre o acesso a esta infra-estruturapodem ser encontradas em http://www.lnls.br.

Apesar dos processos convencionais serem os métodos maisutilizados na preparação dos µTAS, a pesquisa por métodos alter-nativos e economicamente viáveis, é um permanente objetivo dacomunidade científica.

Figura 3. Principais etapas da construção de microdispositivos sobre

substrato de vidro através da técnica de fotolitografia: (I) deposição de filmes

metálicos e de fotorresiste sobre o substrato; (II) posicionamento da máscarae exposição à radiação UV; (III) revelação da imagem fotogravada no

fotorresiste; (IV) corrosão das regiões da camada metálica não protegida

pelo fotorresiste; (V) corrosão do substrato transferindo a configuração dosmicrocanais para o vidro e, (VI) remoção das camadas de fotorresiste e metal

e selagem do microdispositivo


Técnicas de microfabricação por moldagem

Nas técnicas de microfabricação por moldagem, inicialmenteum molde rígido é fabricado contendo a imagem negativa da estru-tura microfluídica de interesse. Este molde é utilizado na etapa dereplicação dos microdispositivos, a qual consiste em transferir aestrutura microfluídica do molde para o substrato, através demoldagem28-30. Geralmente o substrato é um material polimérico,embora metais e cerâmicas também possam ser utilizados. São pro-cessos mais rápidos e de menor custo que as técnicas convencio-nais (fotolitográficas), o que os tornam adequados para produçãode dispositivos microfluídicos em larga escala. A seguir, serão dis-cutidas as etapas de fabricação do molde, de replicação e selagemdos microdispositivos.

Fabricação dos moldesÉ a etapa que consome maior tempo e também representa o

maior custo do processo. No entanto, o molde pode ser empregadodiversas vezes na etapa de replicação dos dispositivos microfluídicos.O material empregado na fabricação dos moldes depende do pro-cesso de replicação empregado. O molde mais simples, relatado naliteratura31, é aquele no qual se emprega um fio metálico com pou-cas dezenas de micrometros de diâmetro, para gerar microcanaissobre substratos poliméricos. No entanto, moldes com estruturasmais complexas são fabricados sobre substrato de silício ou vidro,empregando técnicas de fotolitografia com corrosão úmida ou secado substrato32,33. Quando o processo de replicação não envolve altaspressões e temperaturas o molde pode ser confeccionado apenascom fotorresiste, sem necessidade de corrosão do substrato34. Ofotorresiste SU-8 tem sido o mais empregado para esta finalidade,devido à sua elevada resistência química, possibilidade de deposi-ção de filmes espessos e alta fotossensibilidade (menor tempo deexposição à radiação).

Outro processo de microfabricação bastante difundido envolven-do confecção de moldes é o LIGA (“Lithography, Galvo andAbformung”), sigla em alemão que significa litografia, eletroformaçãoe moldagem. A Figura 4 apresenta as principais etapas do processoLIGA para obtenção do molde6.

Um filme de fotorresiste é depositado por “spin coating” sobrea superfície de um substrato. A seguir, uma etapa de fotolitografia érealizada, em que a estrutura do molde é transferida para ofotorresiste. A próxima etapa envolve o preenchimento dosmicrocanais formados com metal, geralmente níquel, através dedeposição eletrolítica ou não eletrolítica. O molde é finalizado coma remoção do fotorresiste, formando uma microestrutura de metalem alto relevo. No início do desenvolvimento da técnica LIGA aetapa de fotolitografia era conduzida com raios-X provenientes deuma fonte de radiação síncrotron. A maior penetrabilidade e oparalelismo desta fonte de radiação garantem a obtenção demicroestruturas com grande razão de aspecto (relação entre a altu-ra e a largura do canal). No entanto, uma fonte de luz síncrotronrepresenta um custo elevado e logo o processo foi adaptado paraluz ultravioleta (LIGA-UV), com decorrente perda de resolução35.

Replicação dos dispositivos microfluídicos a partir de moldesO processo de replicação dos microdispositivos a partir de um

molde é genericamente representado na Figura 5. Os processos dereplicação mais utilizados são a estampagem a frio, estampagem aquente, moldagem por injeção e litografia macia.

No processo de estampagem a frio o padrão microfluídico, prepa-rado em um molde, é transferido para o substrato através de prensagemà temperatura ambiente, enquanto na estampagem a quente o proces-so é realizado sob aquecimento. Nestes processos, geralmente o

substrato deve apresentar elevada dureza, o que exige grande resis-tência mecânica dos moldes. Por esse motivo, os moldes sãocomumente confeccionados em silício ou metal. Os dispositivosmicrofluídicos obtidos por estampagem a quente apresentam dimen-sões muito próximas às do molde de origem. Por outro lado, os ob-tidos por estampagem a frio dependem das características dosubstrato, da pressão aplicada e do tempo de prensagem28. No entan-to, o tempo de produção de um microdispositivo por estampagem afrio é menor que o processo com aquecimento. Os moldes emprega-dos em estampagem a quente apresentam tempo de vida maior devi-do à menor pressão utilizada, uma vez que o substrato é aquecido auma temperatura próxima à de transição vítrea do material. Ossubstratos poliméricos mais empregados em estampagem a frio e aquente são o poli(metilmetacrilato) (PMMA), poliestireno (PE),poli(cloreto de vinila) (PVC), poli(etilenotereftalato) (PET) epolicarbonato (PC). Equipamentos comerciais destinados a proces-sos de estampagem a quente podem ser adquiridos29.

No processo de moldagem por injeção um polímero termoplásticoé fundido e injetado (despejado) sobre o molde28. Como a viscosida-de do polímero fundido é baixa, o mesmo acaba por recobrir inte-gralmente o molde. Após o resfriamento, o conjunto molde/substratoé desmoldado e obtém-se o substrato com a estrutura microfluídicado molde (uma imagem negativa). Como a pressão envolvida namoldagem por injeção é menor que a empregada nos processos deestampagem, o molde não necessita ser confeccionado em metal.Moldes obtidos a partir de corrosão de silício ou por deposição defotorresiste são adequados para este processo. PMMA e PC são ospolímeros mais empregados no processo de microfabricação envol-vendo moldagem por injeção.

No processo de litografia macia um polímero linear é mistura-do a um agente reticulador e colocado em contato com um molde.Após a reticulação, o polímero torna-se sólido e, de maneira análo-ga ao processo de moldagem por injeção, a estrutura microfluídicado molde é transferida para o polímero reticulado36,37. O PDMS é omaterial mais empregado neste processo, devido às excelentes pro-priedades ópticas, baixo custo, boa resistência química e alta flexi-bilidade27,34,38,39. No entanto, outros materiais, tais como a poliuretana

Figura 4. Principais etapas da construção de um molde envolvendo processo

LIGA: (I) deposição de fotorresiste negativo sobre o substrato condutor oucom condutor depositado; (II) posicionamento da fotomáscara e exposição

à radiação UV; (III) revelação da imagem fotogravada no fotorresiste; (IV)

deposição de metal a partir de processo eletrolítico; (V) obtenção do moldemetálico, após remoção do fotorresiste


elastomérica40, preparada a partir do óleo de mamona, e resinasepóxi41 também podem ser empregados na litografia macia. Por nãoenvolverem altas pressões e temperaturas na etapa de replicação,os moldes não necessitam apresentar altas resistências mecânica etérmica, de modo que geralmente são confeccionados em silício oufotorresiste reticulado.

Selagem dos microdispositivos fabricados por moldagemOs microdispositivos obtidos por moldagem em substratos

poliméricos são selados com maior facilidade que osmicrodispositivos fabricados sobre substratos de silício e vidro.Geralmente a cobertura e o substrato apresentam a mesma compo-sição e as selagens são conduzidas a baixas temperaturas. Um dosmétodos de selagem mais empregados é a térmica, na qual o substratoe a cobertura são pressionados e aquecidos em temperaturas próxi-mas à de fusão ou transição vítrea dos materiais42. O aquecimentopode ser realizado direta ou indiretamente empregando-se ultra-som, laser, microondas ou radiofreqüência. A temperatura da sela-gem pode ser consideravelmente reduzida se uma camada depoliimida, resina epóxi, adesivo termoplástico ou camada defotorresiste for colocada entre o substrato e a cobertura. Em algunscasos esta selagem pode ser realizada à temperatura ambiente, po-rém um cuidado especial deve ser adotado para evitar a obstruçãodos canais com a camada adesiva. Outro método de selagem bas-tante difundido emprega polímeros elastoméricos, como o PDMS,para selagens reversíveis, na qual o polímero é utilizado como co-bertura e adere ao substrato através de forças de van der Waals27.No entanto, também é possível realizar selagens irreversíveis comPDMS com uma prévia ativação da superfície deste polímero porplasma, de maneira que ocorram ligações covalentes entre substratoe PDMS34, ou ainda, manter contato direto com uma superfície du-rante o processo de cura do polímero.

Ablação a laser

Nesta técnica de microfabricação, um laser UV pulsado incidesobre a superfície de um substrato polimérico, causandofotodegradação e termodegradação do material28,29. As elevadas tem-peraturas locais atingidas geram ondas de choque, as quais causampequenas explosões na superfície do polímero, de maneira que pe-quenas partículas e produtos gasosos (CO, CO

2 etc.) são expelidos.

Empregando-se uma máscara é possível transferir seu padrãomicrofluídico para o substrato. No entanto, a máscara pode sereliminada realizando-se a escrita (ablação) diretamente sobre osubstrato, através de um laser focalizado e um suporte para osubstrato que permita uma movimentação precisa (programável)nos eixos x-y, permitindo o desenho da estrutura microfluídica. Asfontes de laser mais empregadas são compostas de ArF (193 nm) eKrF (248 nm). A profundidade dos canais produzidos depende deparâmetros, tais como absorção de radiação pelo substrato, potên-cia do laser, taxa de pulsação do laser e tempo de exposição. Ossubstratos poliméricos mais empregados são PMMA, PC, PVC, PET,PE, politetrafluoretileno e poliimida28,29,43. Como geralmentesubstratos poliméricos são empregados na microfabricação porablação a laser, a selagem dos microdispositivos pode ser realizada

através dos processos apresentados para a técnica demicrofabricação por moldagem.

Processo de impressão direta

Outro processo alternativo e economicamente atrativo baseia-seno uso de toner para a fabricação de microdispositivos analíticos. Ahistória do toner na microfabricação é curta, porém, altamente pro-missora. Tan e colaboradores44 inicialmente propuseram o uso demáquinas fotocopiadoras para gerar moldes descartáveis, os quaisforam então empregados para a rápida prototipagem de micro-estruturas em PDMS. Do Lago e colaboradores45 propuseram umprocesso de impressão direta para a rápida produção de micro-dispositivos. Neste processo, os padrões de imagens são impressossobre um filme de poliéster (transparência de retroprojeção) usandouma impressora laser para depositar seletivamente uma camada detoner, a qual define as dimensões dos canais microfluídicos. Apósserem impressos, estes padrões são laminados contra uma folha detransparência limpa ou contra uma imagem especular do padrão, for-mando canais com simples ou dupla camada de toner, respectiva-mente. Os padrões de imagem (configuração dos microdispositivos)podem ser projetados em “softwares” como o Corel Draw ou AutoCad,sendo impressos na transparência através de uma impressora laser. Aimpressora produz a imagem enviada pelo computador através deuma série de pontos. Conseqüentemente, a resolução é geralmenteexpressa em “dpi” (“dots per inch” – pontos por polegada). Estatecnologia brasileira resultou no processo mais simples, fácil e rápi-do, e de menor custo por dispositivo, entre todos os processos demicrofabricação descritos na literatura, até o momento.

A tecnologia de impressão direta tem sido utilizada para con-fecção de microdispositivos para separações eletroforéticas45-49, paramistura de soluções50, microeletrodos em discos compactos(CDtrodos)46,51,52, celas microfluídicas com eletrodos interdigitados53,além de moldes descartáveis para a rápida prototipagem de micro-estruturas poliméricas54.

Os microdispositivos fabricados em poliéster-toner têm sidoaplicados para rápidas separações eletroforéticas de ânions46 ecátions inorgânicos45,49, catecolaminas47 e fármacos48, utilizandodetecção amperométrica (DA)46-48 e detecção condutométrica semcontato (C4D)45,49. Além dos métodos de detecção eletroquímicos,do Lago e colaboradores45 também mostraram que a fabricação demicrochips para formação de “eletrospray” para espectrometria demassas é perfeitamente aplicável.

A tecnologia de impressão direta vem sendo utilizada para fabrica-ção de microeletrodos de Au em discos compactos regraváveis (CDs)51.Neste caso, as máscaras são impressas em papel vegetal e posterior-mente transferidas para a superfície do CD. As máscaras de toner deli-mitam a área dos eletrodos, enquanto a área não protegida é facilmentecorroída com solução de KI/I

2. CDtrodos fabricados por este processo

têm sido aplicados para DA em sistemas de CE convencional52 e emmicro-escala46. A combinação das etapas de impressão direta e transfe-rência térmica também foi usada por do Lago e colaboradores55,56 paraa produção de microestruturas em vidro-toner.

INSTRUMENTAÇÃO

A simples confecção de canais utilizando as técnicas demicrofabricação, já detalhadas, está longe de configurar ummicrossistema de análise. Após a etapa de fabricação dos canais,vários aspectos devem ser levados em consideração para o funcio-namento do dispositivo. Como exemplos, podem-se citar as estraté-gias para a manipulação dos fluídos nos canais, para a injeção deamostra, detecção, dentre outras. De fato, um dos grandes desafios

Figura 5. Processo de replicação de dispositivos microfluídicos a partir de

um molde. (I) e (II) moldagem; (III) desmoldagem


na construção de microssistemas de análises reside justamente nacomunicação entre o ambiente microscópico e o mundo macros-cópico, com o qual o analista está habituado e para o qual a maioriados métodos de análises está estabelecida. É claro que algumas destasetapas podem ser implementadas no momento da confecção do dis-positivo, como, por exemplo, a deposição (integração) de eletrodospara detecção eletroquímica no canal. Idealmente, todas as etapasanalíticas e processos deveriam estar integradas no dispositivo, maspoucos exemplos de sistemas completos são encontrados na litera-tura no presente estágio de desenvolvimento.

A instrumentação necessária aos microssistemas de análisesenvolve, de maneira geral, um sistema responsável pelo bombea-mento dos fluídos pelos canais e um detector estrategicamenteposicionado. Dependendo do tipo de aplicação, outras operaçõespodem ser incorporadas. Bons exemplos são os μTAS para amplifi-cação de DNA utilizando PCR (“polymerase chain reaction”), ondeciclos de aquecimento podem ser desenvolvidos através da passa-gem de corrente elétrica sobre filmes condutores depositados sobreos substratos durante o processo de microfabricação.

De acordo com a complexidade das conexões entre os canais,os esquemas de mobilização dos fluídos podem envolver diversasconcepções e estratégias para o controle seletivo do fluxo, desde aintrodução de válvulas integradas57,58, ou simplesmente usar umabomba pneumática posicionada externamente para a mobilizaçãodos fluídos59.

Bombeamento

A tecnologia de fabricação de micro-válvulas ou microssistemaseletromecânicos (MEMS) mais sofisticados pode ser empregadana integração de microbombas para a movimentação dos fluídos60.Basicamente, as microbombas integradas podem ser de dois tipos:dinâmicas (centrífuga, eletrodinâmica, eletrosmótica,magnetodinâmica, ultrassônica e outros efeitos especiais) ou dedeslocamento (diafragma, pistão, rotatória, aperiódica). A Figura6 mostra como uma bomba pode ser implementada a partir de duasválvulas e um elemento piezelétrico conectado a um diafragma. Adiferença de potencial aplicada ao piezelétrico pode ser controladapara causar a sucção do fluído para dentro da câmara (Figura 6a).A inversão do potencial causa a expansão do piezelétrico e expulsao fluído da câmara (Figura 6b). A referência 60 traz uma boa revi-são dos principais tipos de microbombas e inclui explicações so-bre os princípios de funcionamento. Uma variação desta estratégiavem sendo explorada através da integração de uma câmara difusoracom uma membrana acoplada a um cristal piezelétrico61. Nestecaso, o processo de fabricação é simplificado, pois dispensa a in-corporação das válvulas.

Válvulas de membranas finas elastoméricas (por exemplo, dePDMS) podem ser posicionadas em série sobre o microcanal e aci-onadas seqüencialmente, provocando o deslocamento dos fluídos,de maneira semelhante a uma bomba peristáltica62. De maneirageral, a introdução destas microbombas de deslocamento aumentasignificativamente o grau de complexidade dos dispositivos, o que

pode requerer um controle cuidadoso dos processos demicrofabricação.

Por não requerer etapas adicionais de microfabricação, obombeamento através do fluxo eletrosmótico (EOF) é uma das for-mas mais empregadas de manipulação dos fluídos em microcanais.O EOF está relacionado à distribuição não uniforme de íons nasregiões próximas às paredes dos canais, quando estas possuem ex-cesso de carga. A magnitude do EOF é dependente, portanto, dotipo do material utilizado como substrato e das propriedades dasolução que preenche os canais (pH, viscosidade, constantedielétrica e força iônica). Na prática, este tipo de mobilização dofluído favorece a aplicação do microssistema em separaçõeseletroforéticas, como por exemplo, eletroforese de zona (CZE) ouisotacoforese (ITP), eletrocromatografia (CEC) etc., uma vez que afonte de alta tensão já está disponível na integração da plataformamicrofluídica. Este tipo de mobilização do fluxo é muito interes-sante, pois é possível selecionar facilmente os canais por onde ofluxo deve passar pela aplicação do potencial nos reservatórioscorrespondentes a esses canais (Figuras 7a e 7b). Caso a aplicaçãonecessite de um fluxo livre do campo elétrico gerado na aplicaçãodo potencial, pode-se ainda utilizar o EOF gerado em um ou maiscanais auxiliares e acoplar este fluxo ao canal de interesse (Figura7c)63-66. Outras estratégias podem ser encontradas na literatura, comopor exemplo, a exploração do fenômeno de eletrocapilaridade domercúrio para criar um mecanismo de pistão em um capilaracoplado ao canal67 ou o deslocamento do fluído pela geração debolhas de maneira controlada em um microcanal68,69.

Introdução da amostra

O sistema de introdução da amostra é uma das etapas mais im-portantes do processamento analítico desenvolvido em dispositivosmicrofluídicos. Embora em sistemas convencionais a introdução daamostra seja realizada por ações eletrocinéticas e/ou hidrodinâmicas,em sistemas miniaturizados, devido à maior facilidade de implemen-tação, esta etapa se faz predominantemente por processos eletrociné-ticos70,71. No entanto, alguns artigos relacionados à injeção hidro-dinâmica em microchips podem ser encontrados na literatura57,72,73. Aimportância da introdução de amostra deve-se ao fato de que as ca-racterísticas da zona de amostra determinam a qualidade da separa-ção analítica. Além disso, para um estudo quantitativo há a necessi-dade de uma boa repetibilidade das injeções. O manuseioeletrocinético do fluído não requer componentes adicionais, além deeletrodos para aplicação de campo elétrico, eliminando, assim, a ne-cessidade de acoplar microbombas e microválvulas. Devido à simpli-cidade instrumental, a eletroforese capilar (CE) é o principal métodoFigura 6. Microbomba de membrana integrada. Adaptada da ref. 60

Figura 7. Bombeamento através do EOF. A direção do fluxo pode ser

facilmente controlada através do chaveamento do potencial aplicado aos

canais (a) e (b); através de uma junção porosa é possível obter o fluxo livreda influência do campo elétrico aplicado para o bombeamento (c). Na

representação assume-se que o EOF é catódico, ou seja, as paredes dos canais

apresentam carga negativa


de separação desenvolvido em micro-escala. Com relação à injeçãoeletrocinética, há basicamente três métodos freqüentemente utiliza-dos em microdispositivos. Estes métodos baseiam-se nos modos“unpinched”74, “pinched”75 e “gated’76.

No modo mais simples de injeção eletrocinética, “unpinched”, azona da amostra é determinada basicamente pela geometria dosmicrocanais que pode ser na forma de cruz, de um duplo-T, ou ainda,de um triplo-T. A diferença básica está no volume de amostra forma-do, determinado pela geometria dos microcanais. Para melhor com-preensão, a Figura 8 apresenta o esquema do controle eletrocinéticonos microcanais. Na Figura 8 é apresentado um esquema básico daconfiguração dos microcanais na geometria de uma cruz. Para reali-zar a injeção uma diferença de potencial é aplicada no canal de inje-ção durante 1-10 s, pelos eletrodos posicionados nos reservatórios daamostra (1) e de descarte da amostra (3) (Figura 8B). Neste curtoperíodo de tempo, a tendência é que o microcanal de injeção fiquecompletamente preenchido com a amostra (Figura 8C). Após com-pletar o preenchimento do microcanal de injeção, a etapa de separa-ção é iniciada pela aplicação de uma diferença de potencial no canalde separação nos eletrodos posicionados nos reservatórios do tampão(2) e de descarte do tampão (4), também denominado de reservatóriode detecção. Deste modo, a zona de amostra definida pela intersecçãodos canais (volume de amostra injetada = volume da intersecção doscanais) é transportada na direção do detector (Figura 8D) e as espéci-es são separadas de acordo com suas mobilidades eletroforéticas74.

Fontes de alta tensão

Diversas aplicações de microssistemas de análises requerem autilização de elevados campos elétricos, tanto para o simplesbombeamento dos fluídos, injeção de amostra ou a separaçãoeletroforética dos analitos. Tipicamente, duas ou três fontes capa-zes de fornecer até 4000 V são suficientes para a maioria das apli-cações, mas é possível utilizar uma única fonte através dochaveamento manual dos pontos de aplicação do potencial. Segun-do Jacobson e colaboradores77, a injeção eletrocinética de amostrasnos microcanais pode ser efetuada utilizando-se apenas uma fonte e

o chaveamento da alta tensão entre os reservatórios da amostra edo tampão. Neste caso, apenas três reservatórios foram suficientespara a implementação do microssistema.

Há disponíveis no mercado vários tipos de módulos miniatu-rizados para utilização nestes microssistemas78,79, incluindo móduloscom múltiplas saídas que podem ser controlados por computadoratravés de uma interface digital/analógica (D/A). Ainda, sistemascom múltiplas saídas podem ser facilmente construídos a partir demódulos miniaturizados individuais80.

Métodos de detecção

A redução dos sistemas de análise, com a conseqüente reduçãona quantidade de analito injetado, traz à luz uma nova realidade:como detectar as quantidades ínfimas de material? Como exem-plo, se a detecção por absorção de luz no ultravioleta-visível (UV-vis) for empregada em um microcanal de 50 µm para a detecção deuma espécie com absortividade molar de 1000 L mol-1 cm-1 (quepode ser considerada alta), na concentração 100 µmol L-1, aabsorbância medida será de apenas 5,0×10-6. Obviamente, o cami-nho óptico neste caso limita a magnitude do sinal observado. Mas,indiretamente, a quantidade reduzida de material requer que estra-tégias que apresentem baixos limites de detecção sejam emprega-das. Outro ponto a ser considerado é a possibilidade de integraçãodo detector ao microssistema, uma vez que essa é a idéia centraldos µTAS. Não é raro encontrar na literatura propostas demicrodispositivos de análise onde o detector ocupa um volumemuito maior que a parte microfluídica (por ex., ref. 20).

Encontra-se uma grande variedade de estratégias de detecçãoaplicadas a µTAS, sendo esta área foco de intensa atividade de pes-quisa. Basicamente, as estratégias de detecção podem ser dividi-das em ópticas, eletroquímicas e acopladas3,4,6,81-84. Aqui serão abor-dadas as mais comumente empregadas, mas outras estratégias dedetecção específicas, como, por exemplo, para contagem e classi-ficação de células, medidas de viscosidade, osmolaridade, sensoresde pressão e temperatura, entre outras, também podem ser encon-tradas na literatura6.

Detecção óptica

Estratégias de detecção baseadas na absorção de radiação naregião do UV-Vis e fluorescência são muito encontradas nos méto-dos instrumentais de análise. Em particular, a fluorescência temsido um dos métodos preferidos, principalmente quando a fonte deradiação de excitação é do tipo laser (LIF), devido aos baixos limi-tes de detecção conseguidos com esta técnica. Técnicas modernasde microscopia confocal têm sido utilizadas com sucesso paradetecção por fluorescência, por simplificarem significativamentea instrumentação e proporcionarem ótimos resultados. Há, inclusi-ve disponível comercialmente, um instrumento para processamentoparalelo de amostras de fragmentos de DNA e RNA, além de pro-teínas e células que opera com LIF e eletroforese85.

Devido ao reduzido caminho óptico, técnicas de absorçãomolecular encontram aplicações limitadas a amostras onde o analitoestá presente em concentrações relativamente altas. Uma estratégiaque pode ser facilmente implementada em μTAS é a construção decelas de reflexões múltiplas, através da introdução de camadas refle-toras. Outro aspecto interessante é a possibilidade de integração decomponentes do espectrofotômetro ou fluorímetro aos microssistemas.A utilização de diodos emissores de luz (LED) convencionais ou laser,além da recente introdução dos LED orgânicos (OLED), torna possí-vel a integração direta da fonte de radiação com os canais com amplafaixa de opções de comprimentos de onda. Além disso, vários traba-

Figura 8. Esquema de controle eletrocinético nos microdispositivos. (A),Configuração dos microcanais. 1, 2, 3 e 4 representam os reservatórios para

amostra, tampão, descarte da amostra e descarte do tampão, respectivamente.

I, II e III representam o canal de injeção, o canal de separação e o ponto dedetecção. (B), (C), ilustração do preenchimento do canal de injeção. (D),

separação analítica dos analitos de acordo com sua mobilidade eletroforética


lhos têm demonstrado a viabilidade de integração de guias de ondaaos microdispositivos. Por outro lado, não há muitos exemplos deintegração do elemento detector, como fotodiodos ou similares. Fi-bras ópticas também têm sido utilizadas no acoplamento do sistemade detecção óptico com os microcanais. Outras estratégias de detecçãoóptica têm sido aplicadas aos microssistemas de análise, comoabsorbância termo-óptica (lentes térmicas), ressonância plasmônicade superfície, quimiluminescência, infravermelho, Raman, índice derefração e emissão atômica4-6.

Detecção eletroquímica

Das técnicas de detecção conhecidas, a eletroquímica é a que pos-sui maior potencial para integração aos microssistemas fluídicos e,portanto, a que mais se aproxima do conceito de μTAS. Os sistemaseletroquímicos de detecção podem ser divididos em amperométricos,voltamétricos, potenciométricos e condutométricos86,87. Além destes,recentemente tem aumentado a aplicação da espectroscopia deimpedância eletroquímica como estratégia de detecção. De maneirageral, os detectores eletroquímicos apresentam baixos limites dedetecção e aplicação a uma grande variedade de analitos. A constru-ção dos detectores eletroquímicos envolve o posicionamento demicroeletrodos de trabalho e referência (em alguns casos podem sertambém utilizados eletrodos auxiliares). Etapas adicionais de deposi-ção dos eletrodos podem ser incorporadas ao processo demicrofabricação, o que facilita a incorporação do detector e aumentaconsideravelmente a reprodutibilidade do sistema. Outra vantagemassociada a este tipo de detecção relaciona-se ao fato de que na maio-ria das técnicas a resposta do detector deve-se a reações (ou equilíbri-os) na superfície do eletrodo, tornando o sistema de detecção indepen-dente do volume físico da célula de detecção (compare-se com a limi-tação do caminho óptico imposta nos detectores por absorção de radi-ação). A detecção amperométrica é uma das mais utilizadas, devidoaos baixos limites de detecção conseguidos, à facilidade e custo deimplementação e à boa seletividade86,87. Aplicações de detectorescondutométricos, principalmente sem contato com acoplamentocapacitivo88,89, têm crescido nos últimos anos.

Métodos acoplados

Em princípio, qualquer estratégia de detecção pode ser utiliza-da em microssistemas. Além da pequena quantidade de materialanalisado, outra limitação refere-se às baixas vazões encontradasnos microssistemas, que faz com que fluxos auxiliares sejam ne-cessários. O tamanho físico do detector é outro ponto de conside-ração: em muitos casos, o detector precisa ser dimensionado paraque o acoplamento possa ser efetuado. Levando em conta estesaspectos, é impressionante que técnicas como espectrometria demassas (MS) e ressonância magnética nuclear (RMN) tenham sidoutilizadas em microssistemas de análise4,5.

Devido aos ótimos limites de detecção e à possibilidade decaracterização estrutural, a MS encontra também grande aceitaçãoem microssistemas de análise. O acoplamento microchip-MS e asaplicações destes sistemas são áreas de intensa atividade de pes-quisa. Recentemente foi lançado no mercado um microssistemaespecialmente útil na análise de proteínas e estudos proteômicos,onde as etapas de tratamento da amostra ocorrem em ummicrossistema polimérico complexo. Os analitos são eluídoscromatograficamente e inseridos em um espectrômetro de massasatravés da ionização por “electrospray”90. No caso da RMN, novastecnologias de fabricação de micro-enrolamentos tornaram possí-vel a detecção direta em microcanais91. Mas apesar da RMN seruma ferramenta importante, capaz de fornecer informações estrutu-

rais, os limites de detecção alcançados por esta técnica não permi-tem sua aplicação em microssistemas para a determinação de espé-cies em baixas concentrações.

APLICAÇÕES

Entre as possíveis aplicações da microfluídica podem-se citartodas aquelas executadas em sistemas convencionais: separação debiomoléculas como proteínas, peptídeos, seqüenciamento de DNA,ensaios enzimáticos, imunoensaios, aminoácidos, aminas biogênicas,entre outros. Além disso, a versatilidade inerente à construção dosmicrodispositivos permite a execução de experimentos baseadosem imobilização de biomoléculas e análises integrando reaçõesquímicas em várias etapas92.

Análise genômica (DNA)

A primeira separação de DNA em um microdispositivo foi publicadapor Effenhauser e colaboradores93, em 1994. Desde então, esse tipo deanálise sofreu um desenvolvimento bastante rápido e se tornou umadas principais aplicações em sistemas microfluídicos94. Nos microchips,o efeito Joule desprezível durante a aplicação de altos campos elétri-cos e a amostragem de volumes reduzidos e bem definidos resultamem análises de DNA mais eficientes quando comparadas àquelas exe-cutadas em eletroforese capilar convencional ou em gel. Assim,seqüenciamentos de DNA, bem como rápidas e eficientes separaçõesde oligonucleotídeos, fragmentos de DNA e RNA, têm sido extensiva-mente realizadas nesses microssistemas95. A análise de DNA envolvevárias etapas: classificação e separação de células, digestão de célulase purificação do DNA, amplificação do DNA, separação eletroforéticae detecção. Encontram-se na literatura vários sistemas microfluídicosque possibilitam realizar uma, várias ou todas as etapas de uma análi-se genética96.

Classificação e separação de célulasÉ a primeira etapa da análise e pode ser considerada a prepara-

ção da amostra. Como as amostras biológicas são, na maioria dasvezes, de matriz muito complexa, é crucial que as células que con-têm o DNA de interesse sejam separadas do material biológico.Várias técnicas de separação e classificação de células têm sidodesenvolvidas em microdispositivos, incluindo separação por ati-vação com fluorescência ou magnetismo, separação mecânica e se-paração através de aplicação de campo elétrico97.

Os trabalhos que envolvem separação mecânica de células emmicrofluídica são, na maioria dos casos, baseados em filtração.Wilding e colaboradores98 usaram um microdispositivo contendouma série de filtros em formato de ponte, com 3 μm de largura, paraseparar células de glóbulos brancos de todo o material biológicocontido em amostras de sangue. Nesse sistema, através debombeamentro hidrodinâmico dos fluídos, as células foram sepa-radas e, em seguida, o DNA foi amplificado usando PCR na mesmaplataforma.

A grande diversidade das propriedades físicas dos diferentes ti-pos de partículas biológicas pode ser usada para o desenvolvimentode separadores de células. Células de glóbulos brancos, por ex., sãoextremamente aderentes, enquanto que células de glóbulos verme-lhos são muito pouco aderentes. Valendo-se dessa diferença de pro-priedades, Carlson e colaboradores99 usaram força hidrodinâmica parabombear amostras de sangue através de microcanais empacotadoscom fase porosa para separar células de glóbulos vermelhos de célu-las de glóbulos brancos. Enquanto as células de glóbulos vermelhosrapidamente penetravam e passavam pelos microcanais, o retarda-mento, e eventualmente a aderência, das células de glóbulos brancos


permitiram a separação. Além disso, o sistema também possibilitouo fracionamento de diferentes tipos de células de glóbulos brancos.

Entre os diferentes tipos de separadores de célula, aqueles base-ados em aplicação de campo elétrico são os mais convenientes parasistemas miniaturizados devido, principalmente, à relativa facilida-de de gerar e estruturar o campo elétrico no microdispositivo97. Comoa maior parte das células possui mobilidades eletroforéticas seme-lhantes, o emprego da eletroforese para separação de células é bas-tante limitado. Entretanto, a dieletroforese (DEP) tem sido empre-gada com sucesso na separação de vários tipos de células.

DEP é definida como um movimento lateral concedido a partí-culas não carregadas, como resultado da polarização induzida porcampos elétricos não uniformes. Utilizando as interações entre aspropriedades dielétricas intrínsecas das células e o campo AC apli-cado, DEP tem sido bastante usada como ferramenta de separaçãode células. Usando DEP, uma grande variedade de células, incluin-do bactérias, células cancerosas, células tronco e subpopulaçõesde leucócitos, foram separadas. Huang e colaboradores100 demons-traram um microchip para DEP, com microcanais construídos emacrílico, para separar diferentes simuladores de agentes de guerrabiológica denominados B. cereus, E. coli e L. monocytognens con-tidos em amostras de sangue. Cui e colaboradores101 desenvolve-ram dispositivos dieletroforéticos construídos em fotorresiste SU-8 formados por multicamadas, como guias para separação de dife-rentes tipos de células.

Digestão de células e purificação do DNAApós a separação das células de interesse, por meio de uma das

técnicas mencionadas anteriormente, sua digestão é a próxima etapada análise total. Vários grupos têm apresentado dispositivosmicrofluídicos, principalmente fabricados em materiais poliméricos,com propósito da digestão celular através de agentes químicos102-104,força mecânica105 ou pulsos elétricos106,107.

Métodos químicos são bastante comuns para digerir células.Como a membrana celular consiste em uma dupla camada lipídica,eletrólitos contendo surfactantes podem facilmente rompê-las. Vári-os microdispositivos foram desenvolvidos para a digestão químicacelular. Irimia e colaboradores103 construíram um microdispositivoem PDMS que integrava a captura e a digestão de uma única célulaem um volume de 50 pL. Nesse trabalho, a digestão celular foi rea-lizada com o uso de dodecil sulfato de sódio (SDS). Carlo e colabo-radores104 apresentaram um novo microdispositivo construído emPDMS para a digestão celular com íons hidróxido eletro-gerados insitu. Três diferentes tipos de células foram eficientemente digeridasusando esse método.

Um segundo método bastante comum empregado na digestão decélulas é a “lise” mecânica. Taylor e colaboradores105 desenvolveramum minissonicador construído em conjunção com um microdispositivopara PCR. Células provenientes de diferentes bacilos foram digeridasno minissonicador em menos de 30 s e, em seguida, o DNA provenien-te das mesmas passou para a etapa de amplificação.

A aplicação de pulsos elétricos para a digestão celular é conhe-cida também como eletroporação106,107. Lu e colaboradores106 desen-volveram um microdispositivo em SU-8 para digestão celular poreletroporação. Nesse sistema, com a aplicação de campos elétricosde 1 kV/cm e um potencial AC de 10 V, células cancerígenas foramdigeridas com o material genético pronto para análise subseqüente.

O isolamento do DNA altamente purificado é muito importan-te para a maioria das aplicações biotecnológicas subseqüentes, so-bretudo no que diz respeito ao desenvolvimento de novas aplica-ções terapêuticas. Dessa maneira, o desenvolvimento de métodosefetivos para a extração e purificação de DNA é bastante exploradona microfluídica. A maior parte dos procedimentos usados para ex-

tração de DNA depende da utilização de lisozima ou outras enzimaslipofílicas ou proteolíticas. Entretanto, várias bactérias são resis-tentes à ação da lisozima e, portanto, outros protocolos são neces-sários. A extração de DNA tem sido feita eficientemente com o usode um sistema tampão e extração em fase sólida108. A extração deDNA usando fases sólidas é baseada em interações iônicas entre oDNA e elementos catiônicos imobilizados ou não. Chung e cola-boradores109 construíram um microchip em PMMA com fase sóli-da imobilizada para uma extração eficiente de DNA em célulasdigeridas de E. coli. Quando o número de células usadas na extra-ção foi de 103 a 104 em 25 μL de amostra, a eficiência da extraçãofoi bem maior (100 a 1000 vezes) no microchip quando comparadaa outros métodos que usam fases sólidas não imobilizadas.

Amplificação do DNAAtualmente, o método usado para amplificação de DNA é a

PCR, que é uma metodologia in vitro que possibilita a reproduçãode milhares de cópias de um determinado fragmento de DNA. Atra-vés desta técnica, uma seqüência particular de interesse pode seramplificada, tornando-se majoritária na amostra de DNA. Destemodo, dois pequenos fragmentos de DNA, normalmente de 20 pa-res de bases (“primers”), são sintetizados in vitro. Estes primerssão complementares às extremidades da região de DNA que se pre-tende amplificar110.

A PCR é realizada através de vários ciclos que possuem trêsestágios de temperatura cada: desnaturação das duas fitas das mo-léculas de DNA a 95 ºC; hibridização dos “primers” às regiõescomplementares das moléculas de DNA que estão separadas a55 ºC e, extensão de um novo DNA, começando pelas regiões emdupla fita, local onde cada um dos “primers” se ligou ao molde daamostra de DNA a 72 ºC. Após isso, um novo ciclo é iniciado com atemperatura elevada a 95 ºC novamente. Ao final de 30-35 ciclos deamplificação existe, tipicamente, 1 milhão de cópias do segmentode DNA de interesse para cada molécula molde original da amostrainicial110.

Vários microdispositivos têm sido construídos para aplicaçãoem amplificação de DNA através da PCR94-96. Roper e colaborado-res110 publicaram recentemente um trabalho de revisão que apre-senta os avanços nessa área. Existem duas maneiras de executar aPCR em microchips. A mais comum delas é dependente do temporequerido para atingir as diferentes temperaturas do ciclo. Ou seja,a mistura que contém os componentes da PCR é mantida em estadoestacionário, enquanto a câmara de reação atinge as temperaturasrequeridas. Esse método requer uma otimização bastante cuidadosada taxa de transferência de calor para o sistema111. A segunda ma-neira é realizada em sistemas de fluxo contínuo, nos quais as tem-peraturas requeridas para o ciclo foram fixadas nas várias regiõesdo microdispositivo112.

Legendre e colaboradores111 desenvolveram um microdispositivoque integra as etapas de extração em fase sólida (SPE) e PCR na aná-lise de DNA. O processo de SPE foi realizado usando partículas desílica híbrida na fase sol-gel e a PCR em uma câmara de reação deapenas 1,6 μL aquecida através da radiação infravermelha. Omicrodispositivo, fabricado em vidro através da técnica fotolitográfica,permitiu a purificação e PCR de amostras contendo DNA de interesseem um tempo total de análise de 25 min. A Figura 9 apresenta o dese-nho do microdispositivo, bem como as representações. Todos osmicrocanais foram construídos com 200 μm de profundidade. O DNApurificado no canal da SPE, com 1,0 cm de comprimento e 140 μm delargura, foi eluído para a câmara de PCR juntamente com os reagentesadicionados para PCR adicionados através de um microcanal de 2,25cm de comprimento e 20 μm de largura. As restrições representadas nodesenho foram construídas para restringir o fluxo no canal de adição


dos reagentes e reter a fase sólida no canal da SPE. A eluição do DNAna fase sólida extratora, bem como a adição dos reagentes necessáriospara a PCR, foram feitas utilizando uma bomba seringa. O sistema deinfravermelho permitiu desenvolver os ciclos de aquecimento eresfriamento para a PCR com taxa de 10 oC/s. Essa taxa é 10 vezesmais rápida para aquecimento e 3 vezes mais rápida para resfriamento,quando comparada aos termo-cicladores convencionais.

Separação de DNAO uso da eletroforese para análise de DNA, também conhecida

como análise genética, pode ser dividido em categorias mais co-muns: seqüenciamento de DNA e genotipagem. Qualquer que sejao caso, a separação é feita por tamanho.

O seqüenciamento de DNA é uma análise que permite determinara ordem das bases nitrogenadas (ou nucleotídeos) adenina, guanina,timina e citosina, em um fragmento de DNA. Isso pode ser feito atravésda marcação de cada nucleotídeo com um marcador fluorescente ouradioativo diferente. As análises de genotipagem fundamentam carac-terizar diferenças genéticas entre genomas individuais. Essas diferen-ças são usadas para analisar herança de genes, identificar pessoas quepossuem variantes de genes (alelos) que predizem doenças e clara-mente identificar diferentes pessoas em aplicações forenses.

Emrich e colaboradores113 demonstraram todo o potencial damicrofluídica em análises genéticas simultâneas no desenvolvimentode um microdispositivo com arranjo de microcanais para análise si-multânea de 384 amostras. Após amplificação usando PCR e diges-tão enzimática, o DNA de 384 indivíduos foi seqüenciado usando umúnico microdispositivo. O sistema (Figura 10A), de 200 mm de diâ-metro, é constituído por quatro quadrantes com 24 quartetos demicrocanais distribuídos radialmente em volta de um reservatóriocentral anódico comum. Cada quarteto (Figura 10B) consiste em quatromicrocanais com reservatórios de amostras individuais e interligadosa um reservatório catódico em comum. As distâncias entre cada re-servatório de amostra e o respectivo reservatório catódico comumsão idênticas (Figura 10C). Os reservatórios possuem 1,5 mm de di-âmetro e a distância entre eles é de 1,2 mm. Cada amostra é adiciona-da no respectivo reservatório, seqüenciada no microcanal (60 μm delargura, 30 μm de profundidade e 8 cm de comprimento) preenchidocom poli(di)metilacrilamida (PDMA) e detectada com um sistemaconfocal de fluorescência induzida a laser. A aplicabilidade dessebioanalisador foi demonstrada na genotipagem de uma mutação co-mum do gene humano HFE em 384 indivíduos em apenas 325 s.

Sistemas integradosA integração das várias etapas da análise de DNA em um único

microdispositivo tem sido objeto de estudo de vários grupos depesquisa114-116. Nesse ponto, vários trabalhos poderiam ser citadosmas nos limitaremos a apenas dois, que são de grande destaque.Ferrance e colaboradores114, além do trabalho discutido anterior-mente de integração das etapas de purificação e PCR na análiseDNA111, também desenvolveram um microdispositivo que integraas etapas de PCR e separação dos fragmentos de DNA. O micro-dispositivo fabricado em vidro foi aplicado para diagnóstico demutação genética em pacientes com distrofia muscular deDuchenne. Após purificadas em outro microdispositivo de SPE, asamostras contendo o DNA de interesse foram introduzidas na câ-mara de PCR de apenas 630 nL e, em seguida, separadas em ummicrocanal (50 μm de profundidade) e detectadas por LIF.

Um microdispositivo fabricado em PC que integra todas as etapasde uma análise de DNA foi desenvolvido por Liu e colaboradores116,do laboratório de microfluídica da Motorola. A preparação da amos-tra, incluindo captura magnética, pré-concentração, purificação e di-gestão de células, PCR, separação e detecção de DNA, foi executadaem uma única plataforma. O bombeamento dos fluídos nos microcanaisfoi feito através do uso de microbombas termopneumáticas e, para re-gular o fluxo, microválvulas termicamente acionadas, construídas emparafina, foram acopladas ao sistema. Aplicações desse sistema foramdemonstradas para detecção de polimorfismo de nucleotídeos indivi-duais diretamente de amostras de sangue.

Análise proteômica (proteínas e peptídeos)

O método mais usado atualmente para analisar proteínas inclui

Figura 9. Microdispositivo usado para análises genéticas acoplando

purificação e PCR de DNA. (A) Mostra os componentes do microssistema:

entrada da amostra e reagentes, pontes restritoras de fluxo e da fase sólida daSPE, câmara de reação da PCR e acoplador térmico. (B) Fotografia do

microdispositivo construído em vidro; (B1) movimento dos fluídos na intersecção

dos microcanais e (B2) fase sólida da SPE. Reproduzido da ref. 111, com

permissão da American Chemical Society

Figura 10. (A) Microdispositivo (200 mm de diâmetro) com 384 microcanais

para análises genéticas simultâneas. Microcanais com 60 μm de largura, 30

μm de profundidade e 8 cm de comprimento. (B) Desenho expandido de apenasum microcanal mostrando reservatórios e ponto de detecção. (C) Reservatórios

para tampão de corrida (T) e amostras (A1 a A

4) em cada microcanal.

Reproduzido da ref. 113, com permissão da American Chemical Society


sua extração da célula, separação por eletroforese em gel (uni ou bi-dimensional), digestão das proteínas separadas e análise dos peptídeosresultantes por espectrometria de massas (MS). Essa tradicionalmetodologia, embora bastante útil e poderosa, exige muito tempo etrabalho laboratorial. Nesse contexto, os microdispositivos oferecemnovas oportunidades que não existem nas técnicas tradicionais deanálise proteômica: rapidez, análise simultânea de amostras e poten-cial para controle e automação das várias etapas da análise117.

A maior parte dos desenvolvimentos recentes em microfluídica apli-cada à análise proteômica está voltada para a combinação, em um únicomicrodispositivo, da separação por eletroforese uni ou multi-dimensionale detecção por MS. Uma vez que a espectrometria de massas é a técnicamais usada para análise e caracterização de proteínas, vários trabalhosvoltados ao acoplamento de microdispositivos com MS têm sido relata-dos26. Como o acoplamento microchip-MS já foi abordado anteriormen-te, os exemplos de aplicação que apresentaremos a seguir serão maisvoltados para eletroforese bidimensional (2D) em microdispositivos.

Os primeiros trabalhos envolvendo a análise de proteínas oupeptídeos em microdispositivos usando a eletroforese 2D foram pu-blicados por Ramsey e colaboradores118,119. Ambos os trabalhos inte-graram a cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) e eletroforesecapilar em zona (CZE), respectivamente, como primeira e segundadimensão da eletroforese em 2D. Amostras de digeridos protéicos(peptídeos) foram separadas em ambos os sistemas.

O trabalho mais recente envolvendo o uso de eletroforese 2D emmicrodispositivos para separação de proteínas foi publicado porShadpour e Soper120. Eletroforese capilar em gel usando dodecil sul-fato de sódio (SDS μ-CGE) e MEKC foram usadas como modos deseparação para eletroforese em microcanais para a primeira e para asegunda dimensão, respectivamente. O microdispositivo (Figura 11A)foi construído em PMMA usando a técnica de estampagem a quente,com microcanais de 20 μm de largura e 50 μm de profundidade.Como pode ser observada, a separação por SDS μ-CGE foi executa-da na primeira dimensão em um microcanal de 30 mm e a separaçãopor MEKC em um microcanal de 10 mm na segunda dimensão. Aseparação por SDS μ-CGE ocorre pela diferença de tamanho das pro-teínas, que possuem mobilidades diferentes através dos poros do gel,enquanto que a separação por MEKC ocorre pela diferença deinteração entre as proteínas e o surfactante SDS presente no tampãode corrida em concentração acima da micelar crítica.

A operação do microdispositivo é bastante interessante, primei-ramente os microcanais e reservatórios são preenchidos com as res-pectivas soluções: (A) amostra; (B) descarte amostra; (C) tampãopara SDS μ-CGE; (D) descarte da SDS μ-CGE; (E) tampão paraMEKC e (F) descarte da MEKC. Através da aplicação de um poten-cial entre os reservatórios (A) e (B), a amostra (uma mistura de 10proteínas) foi introduzida no canal de separação da SDS μ-CGE eseparadas por tamanho através da aplicação do campo entre os reser-vatórios (C) e (D). Os fluídos resultantes da separação por SDS m-CGE foram repetidamente introduzidos, em intervalos de 0,5 s (cha-mados pelos autores de ciclos), no microcanal da MEKC aplicando-se potenciais entre os reservatórios (E) e (F). A detecção através deLIF em dois pontos do microdispositivo, d

1 e d

2, monitorou as separa-

ções por SDS μ-CGE e CGE, respectivamente. A Figura 11B apre-senta um gráfico tridimensional resultante da análise das proteínasmostrando o número de ciclos (separação por SDS μ-CGE) versus otempo de migração da MEKC. O tempo total de corrida para MEKCde cada ciclo foi de 10 s e o tempo total da eletroforese em 2D foi deaproximadamente 12 min, com uma capacidade total de 1000 picos.

Outros trabalhos envolvendo a análise de proteínas ou peptídeosem microdispositivos usando a eletroforese 2D foram realizadosintegrando focalização isoelétrica capilar (CIEF) com CZE121 e SDS-CGE com CIEF122.

Ensaios enzimáticos

Enzimas podem converter em produtos, de maneira específica,102-105 moléculas de um substrato em um intervalo de tempo bastan-te pequeno. As propriedades catalíticas e seletivas têm conferido àsenzimas uma ampla utilização em Química Analítica. Os ensaiosenzimáticos são usados principalmente para dois propósitos distin-tos: determinar a atividade de uma enzima ou quantificar compostosque são substratos ou inibidores de uma reação enzimática123.

Em microfluídica, os ensaios enzimáticos são mais freqüentementeusados para derivação de analitos. Ou seja, uma espécie não detectávelé convertida em uma espécie detectável após sofrer uma reaçãoenzimática. Embora os primeiros experimentos de derivação/separa-ção em microdispositivos tenham sido conduzidos com uso de rea-ções químicas, o uso de reações enzimáticas também foi desenvolvidonesses sistemas, o que possibilitou a expansão do alcance e seletividadenas análises de diversas classes de compostos de interesse analítico124.

O desempenho de um ensaio enzimático “on-chip” depende doequilíbrio apropriado entre as condições de ocorrência da reaçãoenzimática, da separação eletroforética e da detecção. O pH apro-priado para ocorrência da reação enzimática pode, por exemplo,não ser o mais favorável para uma separação eficiente dos produ-tos. Assim, as condições devem ser ajustadas para que exista omelhor intercâmbio possível entre a alta taxa de conversãoenzimática e a eficiência de separação125.

Existem várias maneiras de conduzir um ensaio enzimáticousando eletroforese em microdispositivos. Os protocolos bio-analíticos podem ser primeiramente diferenciados pelo uso deenzimas solubilizadas ou imobilizadas. Devido à versatilidade eprincipalmente ao consumo reduzido de reagentes, os ensaiosenzimáticos em microdispositivos têm sido conduzidos preferenci-almente com o uso de enzimas solubilizadas. Nesse sentido, a rea-ção enzimática pode ocorrer antes, durante ou depois da separaçãoeletroforética124.

Figura 11. (A) Microdispositivo usado para eletroforese 2D de proteínas. O

microdispositivo foi construído usando estampagem a quente com

microcanais de 20 μm de largura e 50 μm de profundidade. Representações:d

1 e d

2, pontos de detecção LIF; (A) amostra; (B) descarte amostra; (C) tampão

para SDS μ-CGE; (D) descarte da SDS μ-CGE; (E) tampão para MEKC e

(F) descarte da MEKC. (B) Gráfico em 3D da análise mostrando o númerode ciclos versus o tempo de migração da MEKC. Conjunto de proteínas:

aglutinina (WG, 38 kDa), actina (AC, 43 kDa), ovalbumina (OV, 45 kDa),

proteína A (PA, 45 kDa), estreptavidina (ST, 53 kDa), albumina sérica bovina(BSA, 66 kDa), lectina helix pomatia (HPL, 70 kDa), transferrina (TR, 80

kDa), concanavalina A (CO, 104 kDa) e lectina-aglutinina de amendoim

(PNA, 110 kDa). Reproduzido da ref. 120, com permissão da AmericanChemical Society


Em todos os sistemas podem ser introduzidos misturadores paraque a reação enzimática seja mais eficiente. No módulo em que areação enzimática ocorre durante a separação eletroforética, a mes-ma ocorre no canal de separação de um microdispositivo conven-cional em cruz com a enzima presente no próprio eletrólito de cor-rida125. Nos módulos em que a reação ocorre antes ou depois daseparação eletroforética, microcanais adicionais são fabricados emjunção com os microcanais do microdispositivo convencional.

Os primeiros trabalhos envolvendo ensaios enzimáticos “on-chip” foram realizados por Ramsey e colaboradores125,126. Nessesensaios foram feitos estudos de inibição da atividade das enzimasβ-galactosidase (β-Gal)125 e AchE126 em microdispositivos construí-dos em vidro. Concentrações precisas de substrato, enzima e inibidorforam misturadas, em volumes da ordem de nanolitros, usandocontrole eletrocinético dos fluídos. Em ambos os sistemas, reali-zou-se a determinação das constantes de Michaelis-Menten bemcomo a análise química dos inibidores.

Wang e colaboradores127 publicaram recentemente um traba-lho, no qual um microdispositivo foi usado na determinação si-multânea de glicose e insulina através da integração de ensaiosenzimático e imunológico. A determinação simultânea de insulinae glicose e, conseqüentemente, a proporção insulina/glicose, é bas-tante relevante para o controle de diabetes e hipoglicemia. Comopode ser observado na Figura 12, o bio-ensaio foi realizado em ummicrodispositivo com reações químicas ocorrendo antes (“pre-column”) e depois (“post-column”) da separação eletroforética.

A operação do microdispositivo inicia-se com duas reações pré-coluna: insulina (antígeno) com a anti-insulina (anticorpo) derivadacom a enzima fosfatase alcalina e glicose (substrato) com glicosedesidrogenase (enzima) na presença do cofator NAD+. Essas reaçõespré-coluna são seguidas da separação eletroforética do anticorpo li-vre, do complexo insulina-anticorpo e do NADH formado na reaçãoenzimática. Após separação, em uma reação pós-coluna, a anti-insu-lina livre derivatizada com a enzima fosfatase alcalina recebe oreagente p-nitrofenil fosfato (p-NPP), formando o produto detectávelp-aminofenol. Os produtos finais das reações “on-chip”, NADH e p-aminofenol, foram monitorados amperometricamente usando comoeletrodo de trabalho (ET), eletrodos de carbono “screen-printed”.Finalmente, as concentrações quantificadas de NADH e p-aminofenolforam usadas para determinar as concentrações de glicose e insuli-na, respectivamente.

Análise de pequenas moléculas

Além das aplicações apresentadas anteriormente em análisesgenéticas, proteômicas e ensaios enzimáticos, a análise de moléculaspequenas como catecolaminas, aminoácidos, carboidratos, fenóis,fármacos em geral, pesticidas, enantiômeros, cátions, ânions, entreoutros, tem sido extensivamente estudada usando eletroforese emmicrodispositivos construídos no formato convencional em cruz. Vá-rios artigos de revisão podem ser encontrados na literatura92,123,128-130

e, a seguir, discutiremos somente alguns exemplos.Uma das classes de compostos mais estudadas em separações

eletroforéticas em microdispositivos são as catecolaminas. Essa clas-se de compostos desempenha um papel fundamental no sistemanervoso central atuando como neurotransmissores. Trabalhos quetêm como objetivo apresentar novas técnicas de microfabricação ousistemas de detecção geralmente apresentam separações decatecolaminas como compostos modelos131-133. A determinação si-multânea de dopamina, norepinefrina, L-DOPA, DOPAC e ácidoascórbico em amostras de plasma, foi realizada por Johirul e cola-boradores134 usando eletroforese de zona em microdispositivosconstruídos em vidro. Com detecção amperométrica utilizando ele-

trodos de carbono modificados com celulose-DNA, limites dedetecção em torno de 1 μmol L-1 foram obtidos nesse trabalho.

Aminoácidos constituem outra classe de compostos de granderelevância em bioquímica que também tem sido foco de extensa apli-cação da eletroforese em microdispositivos. Vários trabalhos têmsido desenvolvidos, sempre mostrando as potencialidades dos dife-rentes modos de separação e detecção135-139. Munro e colaboradores135

apresentaram uma eficiente separação de vários aminoácidos, inclu-indo lisina, prolina, leucina, histidina, treonina, alanina, serina, glicinae tirosina, em menos de 90 s, usando eletroforese de zona emmicrodispositivos de vidro. O modo de detecção usado foi LIF indi-reto, obtendo limites de detecção em torno de 30 μmol L-1. Outroexemplo da aplicação de microdispositivos na análise de amino áci-dos foi publicado por Throckmorton e colaboradores136 usandoeletrocromatografia como modo eletroforético de separação. Sepa-rações mais eficientes e bem mais rápidas, quando comparadas à CEconvencional, foram obtidas usando microdispositivos em vidro comfase estacionária polimérica e LIF como detecção. Trabalhos envol-vendo a separação de aminoácidos usando detecção amperométricanormal137, amperométrica pulsada138 e condutométrica sem contato139

foram propostos por diversos grupos.A análise de carboidratos também tem sido intensamente ex-

plorada usando eletroforese em microdispositivos. São as biomo-léculas mais abundantes da natureza, desempenham uma amplavariedade de funções e, dessa maneira, o desenvolvimento demetodologias para sua determinação é bastante importante. Váriostrabalhos já foram publicados usando diferentes modos de separa-ção e detecção. Entre os métodos de detecção usados para a análisede carboidratos em microdispositivos, a detecção por LIF e eletro-química são as mais comuns140.

Quando comparada à LIF, a grande vantagem do uso da detecçãoeletroquímica na análise de carboidratos está na não necessidadede derivação das moléculas de açúcar141-144. Garcia e Henry141 usa-ram amperometria pulsada em eletrodo de trabalho de ouro para adeterminação de açúcares em um microdispositivo construído emPDMS. Em condições otimizadas, obtiveram limites de detecçãoem torno de 1,2 μmol L-1. Nesse trabalho, para melhores resultadosde eficiência e detectabilidade, a separação e detecção foram reali-zadas em diferentes pHs. Usando amperometria normal, a detecçãode carboidratos somente é possível com o uso de eletrodos de co-

Figura 12. Microdispositivo usado para determinação simultânea de glicose

e insulina através de ensaios enzimático e imunológico. (T) tampão de corrida,

(ENZ) enzima glicose desidrogenase, (ANT) anti-insulina marcada comfosfatase alcalina, (GLI) glicose, (INS) insulina, (CR) câmara de reação, (p-

NPP) p-nitrofenil fosfato, (ET) eletrodo de trabalho, (CE) contra eletrodo e

(RE) eletrodo de referência. Reproduzido da ref. 127, com permissão daAmerican Chemical Society


bre142,143 e níquel144 em meio fortemente alcalino. Separações efici-entes de carboidratos, como glicose, galactose, frutose e sacarose,usando hidróxido de sódio como eletrólito de corrida emmicrodispositivos de vidro, foram obtidas usando esse tipo dedetecção por diferentes grupos de pesquisa. Limites de detecçãoda ordem de 20 μmol L-1 foram obtidos143.

Dang e colaboradores145 separaram misturas complexas deoligossacarídeos derivados de glicoproteínas usando eletroforesede zona em microdispositivos construídos em PMMA. Osoligossacarídeos provenientes das glicoproteínas fetuína, ribo-nuclease B e α

1-ácido glicoproteína foram separados em menos de

100 s em um microcanal de 30 mm e detectados por LIF. Usandodextrano clivado enzimaticamente como padrão, o propósito dasanálises foi mapear os tipos de oligossacarídeos presentes nasglicoproteínas digeridas com uma enzima específica. Trabalhos en-volvendo a determinação de carboidratos derivados de glicoproteínasusando microdispositivos com detecção por espectrometria de mas-sas146 e absorção no UV147 também foram desenvolvidos e podemser encontrados na literatura.

Finalmente, outra possibilidade de aplicação da eletroforeseem microdispositivos é a separação de compostos quirais. Esse tipode separação em CE ocorre pelo estabelecimento de um equilíbriodinâmico de interação entre os enantiômeros e um seletor quiraladicionado no eletrólito de separação. Entre os vários seletoresquirais já propostos para separações em CE, as ciclodextrinas sãoas mais comumente empregadas148. A seletividade nas interaçõescom o seletor quiral geralmente é bastante baixa devido a grandesemelhança entre os compostos. Em CE convencional esse tipo deanálise geralmente é feita em capilares com comprimentos gran-des e, em grande parte, na ausência de EOF. Assim, as separaçõesquirais em microdispositivos são um desafio bastante grande e rela-tivamente poucos trabalhos são encontrados na literatura149,150. Porex., Schwarz e Hauser149 desenvolveram um método para separa-ção de uma mistura de compostos isômeros, relevantes emneurociências, usando um microdispositivo construído em vidrono formato convencional em cruz.

Hutt e colaboradores150 separaram isômeros quirais de aminácidoscomo alanina, lisina, serina e valina usando como seletor quiral a γ-ciclodextrina. O microdispositivo, construído através de fotolitografiaem uma placa de vidro com dimensões de 10 × 10 cm, teve ummicrocanal de separação no formato de serpentina com 19 cm decomprimeto efetivo. Usando como eletrólito de corrida tampão car-bonato com SDS/γ-ciclodextrina e campo elétrico de separação de550 V cm-1 em 10 oC (para evitar efeito Joule), obtiveram a separaçãodos enantiômeros com boa resolução em apenas 4 min. A detecçãodos aminoácidos derivados foi feita através de LIF. Outros trabalhosde aplicações de microdispositivos em separações quirais foram de-senvolvidos e podem ser encontrados na literatura151-153.

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Este trabalho aborda o estado da arte referente aos micros-sistemas de análises químicas. De acordo com as abordagens apre-sentadas não há dúvidas sobre a viabilidade dos processos demicrofabricação, nem sobre a ampla aplicabilidade destesmicrodispositivos. Esta nova tendência pode ser aplicada a qual-quer laboratório químico, nas suas mais diferentes ramificações.

As vantagens relacionadas à confecção dos microchips (tempode fabricação, ampla variedade de materiais e custo por protótipo),usando diferentes tecnologias de microfabricação (convencionaisou alternativas), bem como ao manuseio de pequenos volumes (pL– nL), à possibilidade de integração de múltiplas etapas analíticasem um único substrato e, principalmente, à portabilidade são fato-

res que estimulam todos os pesquisadores atuantes nesta ramifica-ção científica. No entanto, os obstáculos que existem na interfaceentre os mundos macro e microscópio são os desafios a serem supe-rados, de modo a tornar estes dispositivos como ferramentas analí-ticas efetivas para análise no campo, ou no “point-of-care”.

Em resumo, pode-se concluir que os microchips químicos re-presentam uma nova realidade na Química Analítica em âmbitomundial. Um dos propósitos deste trabalho é divulgar esta novafronteira analítica para a comunidade científica nacional, com aperspectiva de que um número maior de pesquisadores possa con-tribuir para o progresso desta importante linha de pesquisa no país.

AGRADECIMENTOS

Ao apoio financeiro da FAPESP e do CNPq pela concessão dasbolsas de doutorado, de pesquisa e projetos de pesquisa.

REFERÊNCIAS

1. van den Berg, A.; Lammerink, T. S. J.; Top. Curr. Chem. 1998, 194, 21.2. Reyes, D. R.; Iossifidis, D.; Auroux, P. A.; Manz, A.; Anal. Chem. 2002,

74, 2623.3. Auroux, P. A.; Iossifidis, D.; Reyes, D. R.; Manz, A.; Anal.Chem. 2002,

74, 2637.4. Vilkner, T.; Janasek, D.; Manz, A.; Anal. Chem. 2004, 76, 3373.5. Dittrich, P. S.; Tachikawa, K.; Manz, A.; Anal. Chem. 2006, 78, 3887.6. Madou, M. J.; Fundamentals of Microfabrication, 2nd ed., CRC Press: New

York, 2002.7. Ehrfeld, W.; Electrochim. Acta 2003, 20, 2857.8. Wooley. A. T.; Lao, K.; Glazer, A. N.; Mathies, R. A.; Anal. Chem. 1998,

70, 684.9. Terry, S. C.; Jerman, J. H.; Angell, J. B.; IEEE Trans. Electron Devices

1979, ED-26, 1880.10. Manz, A.; Miyahara, Y.; Miura, J.; Watanabe, Y.; Miyagi, H.; Sato, K.; Sens.

Actuators, B 1990, 1, 249.11. Manz, A.; Graber, N.; Widmer, H. M.; Sens. Actuators, B 1990, 1, 244.12. Lab-on-a-chip: The Revolution in portable instrumentation, 3rd ed., Frost

& Sullivan Ed.: New York, 1999, p17. (http://www.frost.com/prod/servlet/frost-home.pag).

13. Gulliksen, A.; Solli, L.; Karlsen, F.; Rogne, H.; Hovig, E.; Nordstrom, T.Sirevág, R.; Anal. Chem. 2003, 76, 9.

14. Chen, Y.; Pépin, A.; Electrophoresis 2002, 22, 187.15. Meyerhofer, D.; J. Appl. Phys. 1978, 49, 3993.16. Ericson, C.; Holm, J.; Ericson, T.; Hjertén, S.; Anal. Chem. 2000, 72, 81.17. Lagally, E. T.; Simpson, P. C.; Mathies, R. A.; Sens. Actuators, B 2000,

63, 138.18. Xiong, L.; Regnier, F. E.; J. Chromatrogr., A 2001, 924, 165.19. Jacobson, S. C.; Hergenröder, R.; Koutny, L. B.; Warmack, R. J.; Ramsey,

J. M.; Anal. Chem. 1994, 66, 1107.20. He, B.; Tait, N.; Regnier, F.; Anal. Chem. 1998, 70, 3790.21. Coltro, W. K. T.; Piccin, E.; Fracassi da Silva, J. A.; do Lago, C. L.;

Carrilho, E.; Lab Chip 2007, 7, 931.22. Fintschenko, Y.; van den Berg, A.; J. Chromatogr., A 1998, 819, 3.23. Schultz, G. A.; Corso, T. N.; Prosser, S. J.; Zhang, S.; Anal. Chem. 2000,

72, 4058.24. Lao, A. I. K.; Lee, T. M. H.; Sing, I.-M.; Ip, N. Y.; Sens. Actuators, A 2000,

84, 11.25. Harrison, D. J.; Manz, A.; Fan, Z.; Ludi, H.; Widmer, H. M.; Anal. Chem.

1992, 64, 1926.26. Wang, H. Y.; Foote, R. S.; Jacobson, S. C.; Schneibel, J. H.; Ramsey, J.

M.; Sens. Actuators, B 1997, 45, 199.27. Mcdonald, J. C.; Whitesides, G. M.; Acc. Chem. Res. 2002, 35, 491.28. Becker, H.; Gartner, C.; Electrophoresis 2000, 21, 12.29. Becker, H.; Locascio, L. E.; Talanta 2002, 56, 223.30. Quist, A. P.; Pavlovic, E.; Oscarsson, S.; Anal. Bioanal. Chem. 2005, 381,

591.31. Martynova, L.; Locascio, L. E.; Gaitan, M.; Kramer, G. W.; Christensen, R.

G.; MacCrehan, W. A.; Anal. Chem. 1997, 69, 4783.32. McCormick, R. M.; Nelson, R. J.; Alonso-Amigo, M. G.; Benvegnu, D.

J.; Hooper, H. H.; Anal. Chem. 1997, 69, 2626.33. Xu, J.; Locascio, L.; Gaitan, M.; Lee, S. C.; Anal. Chem. 2000, 72, 1930.34. Duffy, D. C.; Mcdonald, J. C.; Schueller, O. J. A.; Whitesides, G. M.; Anal.

Chem. 1998, 70, 4974.


35. Yi, L.; Xiaodong, W.; Chong, L.; Zhifeng, L.; Denan, C.; Dehui, Y.;Microsyst. Technol. 2005, 11, 1272.

36. Xia, Y.; Whitesides, G. M.; Annu. Rev. Mater. Sci. 1998, 28, 153.37. Whitesides, G. M.; Ostuni, E.; Takayama, S.; Jiang, X.; Ingber, D. E.; Annu.

Rev. Biomed. Eng. 2001, 3, 335.38. Mcdonald, J. C.; Duffy, D. C.; Anderson, J. R.; Chiu, D. T.; Wu, H.;

Schueller, O. J. A.; Whitesides, G. M.; Electrophoresis 2000, 21, 27.39. Whitesides, G. M.; Sia, S. K.; Electrophoresis 2003, 24, 3563.40. Piccin, E.; Coltro, W. K. T.; Fracassi da Silva, J. A.; Mazo, L. H.; Claro-

Neto, S.; Carrilho, E.; J. Chromatogr., A 2007, doi:10.1016/j. chroma.2007.09.081.

41. Chen, G.; Bao, H. M.; Li, J. H.; Chen, D.; Microchim. Acta 2006, 153, 151.42. Velten, T.; Ruf, H. H.; Barrow, D.; Aspragathos, N.; Lazarou, P.; Jung, E.;

Malek, C. K.; Richter, M.; Kruckow, J.; IEEE Trans. Adv. Packag. 2005,28, 533.

43. Roberts, M. A.; Rossier, J. S.; Bercier, P.; Girault, H.; Anal. Chem. 1997,69, 2035.

44. Tan, A.M.; Rodgers, K.; Murrihy, J. P.; O’Mathuna, C.; Glennon, J. D.;Lab Chip 2001, 1, 7.

45. do Lago C. L.; da Silva, H. D. T.; Neves, C. A.; Fracassi da Silva, J. A.;Anal. Chem. 2003, 75, 3853.

46. Coltro, W. K. T.; Fracassi da Silva, J. A.; da Silva, H. D. T.; Richter, E.M.; Furlan, R.; Angnes, L.; do Lago C. L.; Mazo, L. H.; Carrilho, E.;Electrophoresis 2004, 25, 3832.

47. He, F. Y.; Liu, A. L.; Yuan, J. H.; Coltro,W. K. T.; Carrilho, E.; Xia, X. H.;Anal. Bioanal. Chem. 2005, 382, 192.

48. Liu, A. L.; He, F. Y.; Hu, Y. L.; Xia, X. H.; Talanta 2006, 68, 1303.49. Coltro, W. K. T.; Fracassi da Silva, J. A.; Carrilho, E.; Electrophoresis,

submetido.50. Liu, A. L.; He, F. Y.; Wang, K.; Zhou, T.; Lu, Y.; Xia, X. H.; Lab Chip

2005, 5, 974.51. Daniel, D.; Gutz, I. G. R.; Electrochem. Commun. 2003, 5, 782.52. Richter, E. M.; Fracassi da Silva, J. A.; Gutz, I. G. R.; do Lago, C. L.;

Angnes, L.; Electrophoresis 2004, 25, 2965.53. Daniel, D.; Gutz, I. G. R.; Talanta 2005, 68, 429.54. Bao, N.; Zhang, Q.; Xu, J. J.; Chen, H. Y.; J. Chromatogr., A 2005, 1089,

270.55. do Lago, C. L.; de Jesus, D. P.; da Silva, H. T. D.; Neves, C. A.; Fracassi

da Silva, J. A.; Electrophoresis 2004, 25, 3825.56. de Jesus, D. P.; Blanes, L.; do Lago, C. L.; Electrophoresis 2006, 27, 4935.57. Li, M. W.; Huynh, B. H.; Hulvey, M. K.; Lunte, S. M.; Martin, R. S.; Anal.

Chem. 2006, 78, 1042.58. Karling, J. M.; Monahan, J.; Marchiarullo, D. J.; Ferrance, J. P.; Landers,

J. P.; Anal. Chem. 2005, 77, 3637.59. Hisamoto, H.; Horiuchi, T.; Uchiyama, K.; Tokeshi, M.; Hibara, A.;

Kitamori, T.; Anal. Chem. 2001, 73, 5551.60. Laser, D. J.; Santiago, J. G.; J. Micromech. Microeng. 2004, 14, R35.61. Andersson, H.; van der Wijngaart, W.; Nilsson, P.; Enoksson, P.; Stemme,

G.; Sensors Actuators, B 2001, 72, 259.62. Unger, M. A.; Chou, H.-P.; Thorsen, T.; Scherer, A.; Quake, S. R.; Science

2000, 288, 7.63. Figeys, D.; Pinto, D.; Anal. Chem. 2000, 72, 330A.64. Culbertson, C. T.; Ramsey, R. S.; Ramsey, J. M.; Anal. Chem. 2000, 72,

2285.65. McKnight, T. E.; Culbertson, C. T.; Jacobson, S. C.; Ramsey, J. M.; Anal.

Chem. 2001, 73, 4045.66. Morf, W. E.; Guenat, O. T.; de Rooij, N. F.; Sensors Actuators, B 2001,

72, 266.67. Ni, J.; Zhong, C.-J.; Coldiron, S. J.; Porter, M. D.; Anal. Chem. 2001, 73, 103.68. Tas, N. R.; Berenschot, J. W.; Lammerink, T. S. J.; Elwenspoek, M.; van

den Berg, A.; Anal. Chem. 2002, 74, 2224.69. Yin, Z.; Prosperetti, A.; J. Micromech. Microeng. 2005, 15, 643.70. Chen, G.; Wang, J.; Analyst 2004, 129, 507.71. Fang, Q.; Anal. Bioanal. Chem. 2004, 378, 49.72. Backofen, U.; Matysik, F-M.; Lunte, C. E.; Anal. Chem. 2002, 74, 4054.73. Solignac, D.; Gijs, M. A. M.; Anal. Chem. 2003, 75, 1652.74. Martin, R. S.; Gawron, A. J.; Lunte, S. M.; Henry, C. S.; Anal. Chem. 2000,

72, 3196.75. Alarie, J. P.; Jacobson, J. C.; Ramsey, J. M.; Electrophoresis 2001, 22, 312.76. Jacobson, S. C.; Ramsey, J. M.; Electrophoresis 1995, 16, 481.77. Jacobson, S. C.; Ermakov, S. V.; Ramsey, J. M.; Anal. Chem. 1999, 71,

3273.78. http://www.emcohighvoltage.com, acessada em Abril 2006.79. http://www.matsusada.com, acessada em Abril 2006.80. Garcia, C. D.; Liu, Y.; Anderson, P.; Henry, C. S.; Lab Chip 2003, 3, 324.81. Mogensen, K. B.; Klank, H.; Kutter, J. P.; Electrophoresis 2004, 25, 3498.82. Viskari, P. J.; Landers, J. P.; Electrophoresis 2006, 27, 1797.

83. Pumera, M.; Merkoc, A.; Alegret, S.; Trends Anal. Chem. 2006, 25, 219.84. Wang, J.; Electroanalysis 2005, 17, 1133.85. http://www.chem.agilent.com/Scripts/PDS.ASP?lPage=51, acessada em

Setembro 2006.86. Lacher, N. A.; Garrison, K. E.; Martin, R. S.; Lunte, S. M.; Electrophoresis

2001, 22, 2526.87. Vandaveer, W. R.; Pasas-Farmer, S. A.; Fischer, D. J.; Frankenfeld, C. N.;

Lunte, S. M.; Electrophoresis 2004, 25, 3528.88. Brito-Neto, J. G. A.; Fracassi da Silva, J. A.; Blanes, L.; Lago, C. L.;

Electroanalysis 2005 17, 1198.89. Brito-Neto, J. G. A.; Fracassi da Silva, J. A.; Blanes, L.; Lago, C. L.;

Electroanalysis 2005 17, 1207.90. http://www.chem.agilent.com/Scripts/PDS.ASP?lpage=38308, acessada em

Setembro 2006.91. van Bentum, P. J. M.; Janssen, J. W. G.; Kentgens, A. P. M.; Analyst 2004,

129, 793.92. Bilitewski, U.; Genrich, M.; Kadow, S.; Mersal, G.; Anal. Bioanal. Chem.

2003, 377, 556.93. Effenhauser, C. S.; Paulus, A.; Manz, A.; Widmer, H. M.; Anal. Chem.

1994, 66, 2949.94. Liu, S.; Guttman, A.; Trends Anal. Chem. 2004, 23, 422.95. Khandurina, J.; Guttman, A.; J. Chromatogr., A 2002, 943, 159.96. Sun, Y.; Kwok, Y. C.; Anal. Chim. Acta 2006, 556, 80.97. Anderson, H.; van den Berg, A.; Sens. Actuators, B 2003, 92, 315.98. Wilding, P.; Kricka, L. J.; Cheng, J.; Hvichia, G.; Shoffner, M. A.; Fortina,

P.; Anal. Biochem. 1998, 257, 95.99. Carlson, R.; Gabel, C.; Chan, S.; Austin, R.; Phys. Rev. Lett. 1997, 79, 2149.

100. Huang, Y.; Yang, J. M.; Hopkins, P. J.; Kassegne, S.; Tirado, M.; Forster,A. H.; Reese, H.; Biomed. Microdev. 2003, 5, 217.

101. Cui, L.; Zhang, T.; Morgan, H.; J. Micromech. Microeng. 2002, 12, 7.102. Schilling, E.; Kamholz, A.; Yager, P.; Anal. Chem. 2002, 74, 798.103. Irimia, D.; Tompkins, R. G.; Toner, M.; Anal. Chem. 2004, 76, 6137.104. Carlo, D. D.; Zanetti, C. I.; Zhang, Y.; Hung, P.; Lee, L. P.; Lab Chip 2005,

5, 171.105. Taylor, M.; Belgrader, P.; Furman, B.; Pourahmadi, F.; Kovacs, G.;

Northrup, A.; Anal. Chem. 2001, 73, 492.106. Lu, H.; Schimidt, E. L.; Jensen, K. F.; Lab. Chip 2005, 5, 23.107. Fox, M. B.; Esveld, D. C.; Valero, A.; Luttge, R.; Mastwijk, H. C.; Bartels,

P. V.; van den Berg, A.; Boom, R. M.; Anal. Bioanal. Chem. 2006, 385, 474.108. Verpoorte, E.; Lab Chip 2003, 3, 60N.109. Chung, Y. C.; Jan, M. S.; Lin, Y. C.; Lin, Y. H.; Cheng, W. C.; Fan, C. Y.;

Lab Chip 2004, 4, 141.110. Roper, M. G.; Easley, C. J.; Landers, J. P.; Anal. Chem. 2005, 77, 3887.111. Legendre, L. A.; Bienvenue, J. M.; Roper, M. G.; Ferrance, J. P.; Landers,

J. M.; Anal. Chem. 2006, 78, 1444.112. Hashimoto, M.; Chen, P. C.; Mitchell, M. W.; Nikitopoulos, D. E.; Soper,

S. A.; Murphy, M. C.; Lab Chip 2004, 4, 638.113. Emrich, C. H.; Tian, H.; Medintz, I. L.; Mathies, R. A.; Anal. Chem. 2002,

74, 5076.114. Ferrance, J. P.; Wu, Q.; Giordano, B.; Hernandez, C.; Kwok, Y.; Snowb,

K.; Thibodeau, S.; Landers, J. P.; Anal. Chim. Acta 2003, 500, 223.115. Soper, S. A.; Ford, A. M.; Xu, Y. C.; Qi, S. Z.; McWhorter, S.; Lassiter,

S.; Patterson, D.; Bruch, R. C.; J. Chromatogr., A 1999, 853, 107.116. Liu, R. H.; Yang, J. N.; Lenigk, T.; Bonanno, J.; Grodzinski, P.; Anal. Chem.

2004, 76, 1824.117. Sung, W. C.; Makamba, H.; Chen, S.; Electrophoresis 2005, 26, 1783.118. Rocklin, R. D.; Ramsey, R. S.; Ramsey, J. M.; Anal. Chem. 2000, 72, 5244.119. Ramsey, J. D.; Jacobson, S. C.; Culbertson, C. T.; Ramsey, J. M.; Anal.

Chem. 2003, 75, 3758.120. Shadpour, H.; Soper, S. A.; Anal. Chem. 2006, 78, 3519.121. Herr, A. E.; Molho, J. I.; Drouvalakis, K. A.; Mikkelsen, J. C.; Utz, P. J.;

Santiago, J. G.; Kenny, T. W.; Anal. Chem. 2003, 75, 1180.122. Griebel, A.; Rund, S.; Schemed, F.; Doerner, W.; Konrad, R.; Hardt, S.; Lab

Chip 2004, 4, 18.123. Liu, Y.; Garcia, C. D.; Henry, C. S.; Analyst 2003, 128, 1002.124. Wang, J.; Electrophoresis 2002, 23, 713.125. Hadd, A. G.; Raymond, D. E.; Halliwell, J. W.; Jacobson, S. C.; Ramsey, J.

M.; Anal. Chem. 1997, 69, 3407.126. Hadd, A. G.; Jacobson, S. C.; Ramsey, J. M.; Anal.Chem. 1999, 71, 5206.127. Wang, J.; Ibáñes, A.; Chatrathi, M. P.; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8444.128. Gawron, A. J.; Martin, S.; Lunte, S. M.; Eur. J. Pharm. Sci. 2001, 14, 1.129. Willauer, H. D.; Collins, G. E.; Electrophoresis 2003, 24, 2193.130. Dolnik, V.; Liu, S.; J. Sep. Sci. 2005, 28, 1994.131. Osbourn, D. M.; Lunte, C. E.; Anal. Chem. 2003, 75, 2710.132. Baldwin, R. P.; Roussel, T. J.; Crain, M. M.; Bathlagunda, A.; Jackson, D.

J.; Gullapalli, J.; Conklin, J. A.; Pai, R.; Naber, J. F.; Walsh, K. M.; Keynton,R. S.; Anal. Chem. 2002, 74, 3690.


133. Muck, A.; Wang, J.; Jacobs, M.; Chen, G.; Chatrathi, M. P.; Jurka, V.;Výborný, Z.; Spillman, S. D.; Sridharan, G.; Schoning, M. J.; Anal. Chem.2004, 76, 2290.

134. Johirul, M.; Shiddiky, A.; Kim, R. E.; Shim, Y. B.; Electrophoresis 2005,26, 3043.

135. Munro, N. J.; Huang, Z.; Finegold, D. N.; Landers, J. P.; Anal. Chem. 2000,72, 2765.

136. Throckmorton, D. J.; Shepodd, T. J.; Singh, A. K.; Anal. Chem. 2002, 74,784.

137. Wang, J.; Chen, G.; Pumera, M.; Electroanalysis 2003, 15, 862.138. García, C. D.; Henry, C. S.; Anal. Chem. 2003, 75, 4778.139. Abad-Villar, E. M.; Kubán, P.; Hauser, P. C.; Electrophoresis 2005, 26,

3609.140. Suzuki, S.; Honda, S.; Electrophoresis 2003, 24, 3577.141. García, C. D.; Henry, C.; Anal. Chim. Acta 2004, 508, 1.142. Schwarz, M. A.; Galliker, B.; Fluri, K.; Kappes, T.; Hauser, P. C.; Analyst

2001, 126, 147.

143. Wang, J.; Chen, G.; Wang, M.; Chatrathi, M. P.; Analyst 2004, 129, 512.144. Wang, J.; Chen, G.; Chatrathi, M. P.; Electroanalysis 2004, 16, 1603.145. Dang, F.; Kakehi, K.; Nakajima, K.; Shinohara, Y.; Ishikawa, M.; Kaji, N.;

Tokeshi, M.; Baba, Y.; J. Chromatogr., A 2006, 1109, 138.146. Zamfir, A. D.; Bindila, L.; Lion, N.; Allen, M.; Girault, H. H.; Peter-

Katalinic, J.; Electrophoresis 2005, 26, 3650.147. Honda, S.; Suzuki, S.; Taga, A.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2003, 30, 1689.148. Belder, D.; Ludwig, M.; Electrophoresis 2003, 24, 2422.149. Schwarz, M. A.; Hauser, P. C.; Anal. Chem. 2003, 75, 4691.150. Hutt, L. D.; Glavin, D. P.; Bada, J. L.; Mathies, R. A.; Anal. Chem. 1999,

71, 4000.151. Rodríguez, I.; Jin, L. J.; Li, S. F. Y.; Electrophoresis 2000, 21, 211.152. Piehl, N.; Ludwig, M.; Belder, D.; Electrophoresis 2004, 25, 3848.153. Gao, Y.; Shen, Z.; Wang, H.; Dai, Z.; Lin, B.; Electrophoresis 2005, 26,

4774.

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