metodos de quantificação de microrganismos (1)

MTODOS PARA QUANTIFICAR O

CRESCIMENTO MICROBIANO

Instituto de Cincias e Tecnologia de Alimentos

Patrcia da Silva Malheiros

Investigar presena / ausncia de micro-organismos

Quantificar os micro-organismos de interesse

Identificar diferentes espcies microbianas presentes

Analise microbiolgica de alimentos:

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

QUANTIFICAO DIRETA:

Contagem em placas

Filtrao

Mtodo do nmero mais provvel

Contagem direta ao microscpio QUANTIFICAO INDIRETA:

Turbidimetria

Atividade metablica

Peso seco


QUANTIFICAO DIRETA

CONTAGEM EM PLACAS

- tcnica mais utilizada na determinao do tamanho da

populao bacteriana;

VANTAGEM: qualificao de clulas viveis

DESVANTAGEM: tempo

Diluio seriada

Diluentes:

soluo peptona 0,1%

soluo salina 0,85%

tampo fosfato pH 7,2

Inculo

original

Diluies

9 mL de

diluente em

cada tubo

Semeadura

meio de cultura

(45 50oC)

0,1 mL

Fonte: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. Microbiologia de Brock. 10 Ed. Editora Person, 624p., 2008.

Aps a incubao, a contagem das colnias efetuada

Inculo

original

Diluies

9 mL de

diluente em

cada tubo

Plaqueamento

Selecionar as placas com 25 a 250 colnias para contagem.

O nmero de Unidades Formadores de Colnias (UFC) por grama ou

mililitro da amostra ser o nmero de colnias contadas multiplicado

pelo inverso da diluio inoculada

O inverso da diluio 10-1 101, o inverso da 10-2 102 e assim por

diante...

Duas placas por diluio (duplicata) mdia aritmtica da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata.

Resultado final

Usar notao exponencial.

Usar uma casa decimal depois da vrgula.

Contagem das colnias e clculo dos

resultados

Ex: Plaqueamento em profundidade (1 mL)

http://www.youtube.com/watch?v=bCI-O9vCmHM

Diluio 10-3

85 colnias

65 colnias (duplicata)

Fonte: http://skylinecollege.net/case/biol240/pourplate.html


resultados

Resultado:

85 x 103 + 65 x 103 =

2

75 x 103 = 7,5 x 104 UFC/g

Ex: Plaqueamento em superfcie (0,1 mL)

Diluio 10-3 85 colnias

65 colnias (duplicata)

Fonte: http://skylinecollege.net/case/biol240/pourplate.html


resultados

Resultado:

85 x 103 + 65 x 103 =

2

75 x 103 = 7,5 x 105 UFC/g 10 x

AUTOMAO LABORATORIAL

Utilizado nas etapas da analise:

a . Pesagem- Por ex, atravs de um

aparelho chamado DILUTER -

ajustado que ao colocar a amostra,

pesa a alquota desejada, e j dilui

acrescentando o diluente

necessria para a diluio!


b . Homogeneizao- Uso do stomacher homogeneizador de pisto no mais os liquidificadores que cortam as clulas microbianas injuriando-as na anlise!!!


c. Semeadura Utilizao de um aparelho chamado spiral plater amostra semeada na placa, atravs de uma cnula, que verte o inculo, e a placa fica numa superfcie que gira.

http://www.youtube.com/watch?v=pRChN3QHuqo&hd=1

FILTRAO


QUANTIFICAO DIRETA

Fonte: Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiology: An Introduction. 960 p. 9th ed. Benjamin Cummings: California. 2006.

Clulas bacterianas na superfcie da membrana (poros)

Membrana filtrante colocada sobre o

meio de cultura e placa incubada.

MTODO DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP)

- utilizado para micro-

organismos que no

crescem bem em meio

slido.


QUANTIFICAO DIRETA

Diluio

Diluio

Diluio

10 mL de inculo

1 mL de inculo

0,1 mL de inculo

5 tubos positivos

3 tubos positivos

1 tubos positivos

CONTAGEM DIRETA AO MICROSCPIO

- um volume conhecido de suspenso bacteriana

colocado em uma rea definida da lmina de microscpio.

- a amostra pode ser corada ou analisada a fresco.

DESVANTAGENS: - no separa clulas mortas e vivas

- pode haver erros de contagem

- difcil contagem para bactrias mveis


QUANTIFICAO DIRETA

Fonte: Pelczar JR, Chan ECS, Krieg NR. N.R. Microbiologia. 1 Ed. Editora Makron Books, 556p. 2004.


QUANTIFICAO DIRETA

Sistemas prontos para uso:

Placas de Petrifilm-3M, Placas de Simplate e diversos

gares adicionados de substratos cromognicos ou

fluorognicos.

Petrifilme Anlise de Escherichia coli

6

3 2

4 5

1

ATIVIDADE METABLICA

- quantidade de um certo produto (como cido ou CO2)

diretamente proporcional ao nmero de clulas

bacterianas.


QUANTIFICAO INDIRETA

PESO SECO

- principalmente para fungos filamentosos

TURBIDIMETRIA

- monitoramento do crescimento bacteriano atravs da

turbidez;

- espectrofotmetro (660 nm).


QUANTIFICAO INDIRETA

- A quantidade de luz que atravessa o detector inversamente

proporcional ao n. de bactrias.

Fonte: Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiology: An Introduction. 960 p. 9th ed. Benjamin Cummings: California. 2006.

Origem de luz

Suspenso bacteriana

Percentagem de

luz transtmitida

Percentagem de

luz transtmitida

Branco Detector de luz

Espectrofotmetro

TCNICA ASSPTICA

- Cuidado com contaminaes!

TCNICA DE ESGOTAMENTO

- Obteno de colnias puras.

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