introdução ao laboratório de micro de alimentos e metodos para contagem de microrganismos em...
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Introdução ao laboratório e Métodos de contagem de microrganismos
em alimentos
Uelinton M. Pinto
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
Avaliações
• Conteúdo programático das aulas práticas – ainda em preparação
• 2 provas práticas no horário da aula (15% cada)
• Relatórios (5% extra, 5% a menos para quem não entregar) – cada relatório deverá ser entregue no prazo máximo de uma semana após a aula.
Normas de segurança no laboratório
• Não comer, beber ou fumar dentro do laboratório;
• Usar sempre o jaleco;
• Não pipetar material tóxico ou infeccioso com a boca. Usar
pipetadores;
• As placas de contagem de bactérias não podem ser
consideradas inofensivas. Muitos patogênicos
desenvolvem-se bem nos meios de cultura comumente
utilizados no laboratório.
• Não cheirar os meios de cultura inoculados
Normas de segurança
• As lâminas e lamínulas usadas devem ser
colocadas em recipiente com desinfetante;
• Lavar as mãos com freqüência, usando solução desinfetante, com água corrente e sabão,
especialmente antes e após o trabalho laboratorial;
• Limpar a mesa de trabalho, antes e depois de
cada sessão de trabalho, usando desinfetante;
Normas para coleta de amostras
• As amostras para exame microbiológico deverão ser enviadas separadamente das destinadas aos exames físico-químicos;
• As amostras devem estar em sua embalagem original. Quando não for possível, aceita-se o fracionamento em condições assépticas;
• As amostras deverão ser acondicionadas em recipientes limpos, estéreis e sem perfurações, rachaduras, etc. Quantidade mínima de 500 g de amostra ou colher várias amostras para atingir o mínimo. Cuidados especiais com respeito ao lote, data de fabricação. Enlatados - ~mínimode duas latas.
Normas para armazenamento e transporte de amostras
• Alguns produtos podem ser transportados a temperatura ambiente outros devem ser refrigerados (recipientes isotérmicos com gelo). Cuidado para não haver contato entre a amostra e a água de degelo.
• Produtos congelados – não podem descongelar até a chegada ao laboratório.
• Tempo entre coleta e chegada ao laboratório deve ser o menor possível. Ex.: leite pasteurizado menos que 24 horas, respeitando-se o prazo de validade do produto.
• Amostras em embalagens lacradas. Necessário para evitar a substituição ou adulteração da amostra entre o ponto de colheita e o laboratório.
Normas para armazenamento e transporte de amostras
• Após o recebimento: • Amostras refrigeradas perecíveis deverão ser
analisadas em um período máximo de 12 horas; • amostras congeladas deverão ser mantidas a no
mínimo -18°C, por período máximo de 7 dias.• Amostras não perecíveis deverão ser estocadas em
lugar fresco e protegidas da umidade, e analisadas em um prazo máximo de 3 dias.
• Manter registros de recebimento, números de protocolo, datas de liberação e outros registros que se fizerem necessários.
O cotidiano no laboratório• Organização! • Tempo máximo entre diluição e
inoculação – 20 min• Limpar e desinfetar a superfície de
trabalho antes e depois do trabalho diário;
• Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado, antes de iniciar a análise.
• O material utilizado deve receber a seguinte seqüência de tratamento: � esterilização, lavagem, secagem, embalagem; esterilização e armazenamento ;
• Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados;
O cotidiano no laboratório O cotidiano no laboratórioNormas de higiene e ordem pessoais
• Manter no laboratório exclusivamente os materiais
necessários aos trabalhos de análise;
• Se for portador de algum ferimento nas mãos, não
participar dos trabalhos de análise. No caso de
necessidade extrema, utilizar luvas, procedendo
também a sanificação das mesmas;
• Lavar e usar sanificantes nas mãos ao entrar, sempre
que for necessário e ao sair do laboratório;
O cotidiano no laboratório
Normas de higiene e ordem pessoais
• Evitar tocar o corpo e especialmente os olhos, boca,
nariz com as mãos durante os trabalhos no laboratório;
• Não umedecer etiquetas ou outro material do
laboratório com a língua;
• Em casos de acidente com ferimentos e cortes, proceder
imediatamente a lavagem e a desinfecção;
O cotidiano no laboratório
Resumo das condições de esterilização:
a) Via seca: 170 °C por 2 a 3 horas (estufa de esterilização): placas de Petri, pipetas, vidraria em geral.
b) Via úmida: 121 °C por 15 min. (autoclave): solução de diluição, meios de cultura, etc.
c) Antibióticos, vitaminas: filtração
Qual a importância de se determinar o número de microrganismos em um
alimento?
1. Qualidade e segurança alimentar2. Avaliação dos processos de produção
3. Alimentos funcionais (probióticos)
Métodos de contagem e detecção de microrganismos em alimentos Que tipos de organismos são
comumente enumerados em alimentos?
Bactérias “totais aeróbias”
Bactérias psicrotróficas
Bactérias anaeróbiasStaphylococcus aureus
Fungos e leverduras
Coliformes totais e termotolerantes
Como estes microrganismos sãoenumerados?
Métodos convencionais (culturais, clássicos)
Métodos rápidos
Atividade metabólica
Métodos turbidimétricos
Uma outra maneira de classificar estes métodos
Métodos de contagem de
bactérias
Totais
Viáveis
Diretos
Indiretos
Diretos
Indiretos
Contagens Microscópicas
Contagens eletrônicas
Determinação de biomassa
Determinação de impedância
Radiometria
Luminescência dos genes lux
Contagem em placas
Determinação do NMP
Cont. em membrana filtrante
Atividade metabólica
Contagens Microscópicas
Contagens eletrônicas
Determinação de impedância
Radiometria
Luminescência dos genes lux
Métodos turbidimétricos
Determinação de biomassa
Contagem em placas
Determinação do NMP
Cont. em membrana filtrante
Contagem emplacas
Como recuperar microrganismosdos alimentos?
Stomacher
Contagem em placas
Análises MicrobiológicasPreparo da amostra
Amostra
+
Diluente
Homogenato
25g : 225mLDiluente
DiluiDilui çção seriadaão seriada
Contagem em placas
PlaqueamentoPlaqueamento PlaqueamentoPlaqueamento
Contagem das colônias após incubação
10-2
10-3
10-4
UFC= Num. colonias X (1/dil)Alíquota
Entre 30 e 300
MMéétodos de todos de plaqueamentoplaqueamento
Contagem em placasModificações para fazer o processo
mais rápido
Spiral plater
Spiral plater
UFC/mL
Técnica de microcotas
UFC/mL
20 µl
Petrifilm (3M)
1 ml de diluente contendo a amostra
Reidratação
Incubação Atividade metabólica
Contagens Microscópicas
Contagens eletrônicas
Determinação de impedância
Radiometria
Luminescência dos genes lux
Métodos turbidimétricos
Determinação de biomassa
Contagem em placas
Determinação do NMP
Cont. em membrana filtrante
Método do númeromais provável (NMP)
– metodologia:• teste presuntivo• teste confirmativo• teste completo
10 ml por tubo
0,1 ml por tubo
1 ml por tubo
incubação a 35ºC/24-48 h:formação de gás: NMP
Amostra dealimento
Teste Presuntivo – Caldo Lactosado LST
Tubo contendo caldo lactosado
resultado negativo
Tubo contendo caldo lactosado
resultado positivo
TESTE PRESUNTIVO PARA A PRESENÇA DE COLIFORMES
Análises MicrobiológicasNúmero Mais Provável
Coliformes Caldo LST 35.5
oC/48 h
Presuntivo Confirmativo
Coliformes Totais Caldo BVB35.5
oC/48 h
• Confirmativo de Coliforme Termotolerante
Número Mais Provável
Coliformes Caldo EC45
oC/48 h
Atividade metabólica
Contagens Microscópicas
Contagens eletrônicas
Determinação de impedância
Radiometria
Luminescência dos genes lux
Métodos turbidimétricos
Determinação de biomassa
Contagem em placas
Determinação do NMP
Cont. em membrana filtrante
Amostra a ser filtrada
Membrana filtrante que retém células
Saída para vácuo
Membrana transferida para meio de cultura
Incubação Colônias
Filtração para concentrar a amostra
Contagem em membrana filtrante
Contagem de colônias em placas –Filtração (concentração da amostra)
Colônias coliformes em uma membrana filtrante
Atividade metabólica
Contagens Microscópicas
Contagens eletrônicas
Determinação de impedância
Radiometria
Luminescência dos genes lux
Métodos turbidimétricos
Determinação de biomassa
Contagem em placas
Determinação do NMP
Cont. em membrana filtrante
Contagem do nContagem do n úúmero de cmero de c éélulas totaislulas totais
Detalhe da região central da lâmina
Câmara de Neubauer: lâmina escavada
Contagens Microscópicas
Contagem do nContagem do n úúmero de cmero de c éélulas totaislulas totais MMéétodo rtodo r áápido que permite detectar baixas populapido que permite detectar baixas popula ççõesões
Alimento
Membrana
Contagens Microscópicas – com membrana
Homogenato FiltraçãoTritonX,Tripsina
Laranja de acridinaSecagem
Contagem em microscópio de
epi-fluorescência
No células/g= No médio X No de campos X fator do microscópio
Atividade metabólica
Contagens Microscópicas
Contagens eletrônicas
Determinação de impedância
Radiometria
Luminescência dos genes lux
Métodos turbidimétricos
Determinação de biomassa
Contagem em placas
Determinação do NMP
Cont. em membrana filtrante
Contagens eletrônica – CITOMETRIA DE MASSA
Contagens eletrônica – CITOMETRIA DE MASSA
Atividade metabólica
Contagens Microscópicas
Contagens eletrônicas
Determinação de impedância
Radiometria
Luminescência dos genes lux
Métodos turbidimétricos
Determinação de biomassa
Contagem em placas
Determinação do NMP
Cont. em membrana filtrante
IMPEDÂNCIA – método rápido, porém envolvecultivo
Impedância= atual resistência elétrica à corrente di reta
Meio de cultura estéril – produtos de baixa condutib ilidade
Crescimento microbiano
Inocula alíquota de amostra de alimento (diluição apropriada)
Produtos de alta condutibilidade
Impedância diminui –detecção
automática
IMPEDÂNCIA – método rápido, porém envolvecultivo
Quanto mais rápido for a detecção de mudanças de impedância do meio, maior a contaminação do produto .
Maior contaminação – detecção rápidaMenor contaminação – detecção lenta
A detecção acontece quando há 10 7 células/g
Vários sistemas comerciais disponíveis – detecção de diversos tipos de microrganismos
IMPEDÂNCIA – método rápido, porém envolvecultivo
Rapid Automated Bacterial lmpedanceTechnique (RABIT)
BacTrac 4300 RAPID MICROBIOLOGICAL ANALYZER
Ribeiro et al., 2003
Detecção indireta do crescimento microbiano porimpedância
Ribeiro et al., 2003
Atividade metabólica
Contagens Microscópicas
Contagens eletrônicas
Determinação de impedância
Radiometria
Luminescência dos genes lux
Métodos turbidimétricos
Determinação de biomassa
Contagem em placas
Determinação do NMP
Cont. em membrana filtrante
Método indireto –detecção de CO2
radioativo por exemplo.
Luminescência dos genes lux de Vibrio fisheri
lux genes
Infecta o fago no homogenado (alimento) para detecta r a bactéria de interesse
Engenharia genética do fago específico
Fago multiplica ���� LUZLUZAtividade metabólica
Contagens Microscópicas
Contagens eletrônicas
Determinação de impedância
Radiometria
Luminescência dos genes lux
Métodos turbidimétricos
Determinação de biomassa
Contagem em placas
Determinação do NMP
Cont. em membrana filtrante
Atividade metabólica
Redução de corante - Azul de metileno/resazurina em leite
Método muito simples – quanto mais rápido a reduçãodos corantes, maior a contaminação do produto
Não é um método preciso, mas determina de forma muito rápida, simples e barata a qualidademicrobiológica de um produto
Nossas futuras aulas práticas
• Determinar o efeito de diversos fatores, encontrados pelos
micro-organismos nos alimentos, no crescimento
microbiano.
• Contagem de microrganismos em alimentos.
• Contagem total de aeróbios em placa (spread plate e
microgotas);
• Contagem de psicrotróficos;
• Determinação de coliformes totais e termotolerantes;
• Isolamento de patógenos de alimentos
Avaliação
Responder às seguintes perguntas para a próxima aul a:
1 – Por que enumerar micro-organismos em alimentos?
2 – Que tipo de micro-organismos seriam enumerados d e
um alimento refrigerado?
3 – Qual a principal desvantagem de se enumerar micr o-
organismos pelos métodos tradicionais?
4 – Qual é o objetivo de se utilizar membranas para a s
contagens de micro-organismos em microscópio?
Material para consulta
1. Jay, J.M. Microbiologia de Alimentos/ James M. Jay ; trad. Eduardo Cesar Tondo [et al.] 6.ed. – Porto Alegre: Artmed, 2005.
2. FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microbiologia de Alimentos. São Paulo, Atheneu, 2008.
3. APHA. Compendium of Methods for theMicrobiologica Examination of Foods. 2001.