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Métodos cromatográficos e espectrométricos usados em quimiotaxonomia, prospecção de metabólitos
bioativos e identificação rápida de fungos
Lucas M. de Abreu, DFP, UFLA
Setembro, 2011
V Simpósio Brasileiro de Microbiologia Aplicada
?
O
OH
O
O H
O H
O H
2
MetabMetabóólitos primlitos primáários e metabrios e metabóólitos secundlitos secundáários...rios...
substâncias com distribuição
generalizadasubstâncias com distribuição restrita
OH O
O
O
OO
O
O
O
O H
O
Dewick, 2001
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MetabMetabóólitos secundlitos secundáários produzidos por fungos rios produzidos por fungos
100 mil espécies de fungos descritas
25 mil metabólitos secundários descritos (2005)
10 mil spp. investigadas quanto ao metabolismo secundário
funções
competição, proteção
toxinas, antibióticos
controle metabolismo (sob certas condições)
comunicação
nenhuma ?
diversidade - aproximadamente...
Bérdy, 2005; Dewick, 2001
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usos - fármacos e seus precursores
O
N
O
OOH
S
N
H
H
O
O H
O
OSN
tiamulina - antibiótico de uso veterinário caspofungina - antifúngico
griseofulvina - antifúngico
penicilina G - antibiótico
MetabMetabóólitos secundlitos secundáários produzidos por fungos rios produzidos por fungos
Misiek & Hoffmeister, 2007
5
N
O
N
ON
O
N
ONH O
NH
ON
ONH
O
N
O
N
O
NH
O
OH
H
ciclosporina A - imunossupressor
ácido micofenólico - imunossupressor
lovastatina - inibidor da síntese do colesterol
ergotamina - vasoconstritor (enxaqueca)
usos - fármacos e seus precursores
MetabMetabóólitos secundlitos secundáários produzidos por fungos rios produzidos por fungos
Misiek & Hoffmeister, 2007
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perigos - micotoxinas
aflatoxina B1
toxina T2
ocratoxina A
patulina
citrinina
fumonisina B1
MetabMetabóólitos secundlitos secundáários produzidos por fungos rios produzidos por fungos
Bennett & Klich, 2003
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ProspecProspecçção quão quíímica de fungosmica de fungos
em geral desvinculada de um trabalho taxonômico
fontes de diversidade
solo (tradicional), plantas (endófitos e patógenos)
e ambiente marinho
escolha dos isolados aleatória ou baseada em resultados de bioensaios
frequente ocorrência de redundâncias
taxonômica e química
Larsen et al., 2005; Monaghan et al., 1995
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Fungos toxigênicos Fungos toxigênicos
métodos analíticos para detecção de toxinas em alimentos e fungos
contaminantes
taxonomia é importante: conhecendo-se as espécies e seus metabólitos
tem-se idéia do risco associado
Penicillium roqueforti Frisvad & Samson, 2004
Maturação de queijos - sem riscos
Contaminação de forragens e grãos - toxina PR
Toxina PRToxina PR
Nielsen et al., 2005
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EstratEstratéégiagia
obtenção de perfis de metabólitos produzidos
comparações entre perfis; uso de bancos de dados
caracterização parcial das substâncias presentes nos extratos
Prospecção química, análise toxicológica e quimiotaxonomia
Larsen et al., 2005; Smedsgaaard & Nielsen, 2005
avaliação dos metabólitos secundários produzidos por fungos cultivados em pequena escala
métodos analíticos - CLAE, CLAE-EM
RT, espectro UV, espectro de massas
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Primeira etapa Primeira etapa -- obtenobtençção de extratosão de extratos
cultivo dos isolados em meio(s) apropriado(s)
Penicillium brasilianum
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ObtenObtençção de extratosão de extratos
extração em micro-escala
Smedsgaard, 1997; Nielsen, 2009
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Cromatografia lCromatografia lííquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos quida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE(CLAE--DAD, HPLC) DAD, HPLC)
Nielsen, 2009
RT = 9,5 minRT = 10,8 minRT = 5,5 minRT = 6,9 min
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Fel 355
CLAECLAE--DADDAD
Alternariol
RT = 8,7 min RT = 11,5 min
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CLAECLAE--DAD acoplada DAD acoplada àà espectrometria de massas (EM)espectrometria de massas (EM)
metabólitos separados por CLAE são analisados por EM
EM - íons são separados de acordo com sua razão massa / carga (m/z)
espectrômetro de massas
Nielsen & Smedsgaard, 2003
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CLAECLAE--DADDAD--EMEM
espectrômetros de alta resolução - determinação de fórmulas moleculares
bancos de dados - identificação de metabólitos, desreplicação
Perfil de metabólitos secundários de Aspergillus fumigatus obtido por CLAE-EM. Adaptado de Frisvad et al., 2009
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Uso de perfis de metabUso de perfis de metabóólitos na desreplicalitos na desreplicaçção e descoberta de substânciasão e descoberta de substâncias
Triagem inteligente
obtenção de perfis de metabólitos em pequena escala e definição de
quimiotipos
CLAE-DAD, CLAE-DAD-EM
seleção de representantes de cada quimiotipo e desreplicação
espectros de massa, bancos de dados
condução de bioensaios
extratos brutos ou (micro) fracionados
cultivo em grande escala, purificação e elucidação estrutural
metabólitos alvo
Larsen et al., 2005; Smedsgaard & Nielsen, 2005
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novos análogos da mevastatina produzidos por Penicillium solitum
MevastatinaMevastatinaSolistatinaSolistatina Solistatinol
Espectros de absorção no UV dos metabólitos mevastatina, solistatina e solistatinol. Adaptado de Sørensen et al., 1999; Larsen et al., 2007
Triagem inteligente
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Alantripinona
N
N
O
NH
O
NH
O
Alantripinona
N
N
O
NH
O
NH
O
descoberta de análogos de metabólitos conhecidos - programa X-hitting
avalia arquivos gerados por CLAE-DAD em busca de espectros de
absorção no UV semelhantes ao de uma substância alvo
Lapatina A
NH
N
N
O
NHN
O
H
O
Lapatina A
NH
N
N
O
NHN
O
H
O
Lapatina BLapatina B
Comparação entre os espectros de absorção no UV da alantripinona (azul) com aqueles da lapatina A (esquerda) e lapatina B (direita). Adaptado de Hansen et al., 2005
Triagem inteligente
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Fracionamento de extratos por CLAE seguido de bioensaiosFracionamento de extratos por CLAE seguido de bioensaios
metabólitos eluídos são distribuídos em uma placa de microtitulação
o conteúdo dos poços é submetido a bioensaios (micro-escala)
os resultados de bioatividade são comparados com os cromatográficos
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[M+H]+
[M+NH4]+
Fórmula molecular:
C29H35NO8
Escoparasina A Fenocalasina B
Microfracionamento Microfracionamento
metabólitos citotóxicos produzidos por Libertella sp.
21Perfil por CLAE, atividade antibacteriana e citotóxica do extrato do fungo Gliocladium sp. Adaptado de Lang et al., 2006
4-ceto-clonostaquidiol
O O
O
O
OOH
4-ceto-clonostaquidiol
O O
O
O
OOH
Microfracionamento Microfracionamento
metabólitos bioativos produzidos por Gliocladium sp.
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objetivo
uso de metabólitos secundários como caracteres (marcadores) para
caracterização e identificação de fungos
hipótese
quimioconsistência - espécies diferentes produzem perfis de
metabólitos secundários distintos
Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia
Frisvad et al. 2008
gêneros mais estudados
Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaria,Trichoderma,
Stachybotrys, Xylaria, Hypoxylon
23Samson et al. 2004
abordagem descritiva - marcadores qu�micos para caracteriza��o de
esp�cies definidas; indica��o de poss�veis novos t�xons
P. roqueforti – produ��o de queijos; contamina��o de p�es, silagem e gr�os
Produz toxina PR, �cido micofen�lico, isofumigaclavina A e B, roquefortina C
P.carneum – contamina��o de carne, p�es, cerveja, queijos e silagem
P. paneum – contamina��o de
p�es, gr�os e silagem
Produz patulina, penitrem A, �cido micofen�lico, isofumigaclavina A e B, roquefortina C
Produz patulina, botriodiplodina, roquefortina C
Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia
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taxonomia numérica - classificação multivariada de isolados com base em
perfis de metabólitos
matrizes binárias isolados X metabólitos (RI) - índices de similaridades667 681 688 689 696 697 699 702 703 707 712 718 721 733 740 744 745
CML871_Coffee_MG 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0CML1316_Coffee_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0CML1501_Mango_MG 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0CML1506_Mango_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0CML1527_Cacao_BA 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0CML1928_Phoradendron_MG0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0CML1930_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0CML1932_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0CML1933_Tapirira_MG 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0CML1500_Mango_MG 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0CML1502_Mango_MG 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1CML1503_Mango_MG 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0CML1507_Mango_MG 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1CML1931_Tapirira_MG 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0CML1934_Phoradendron_MG0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0CML1936_Phoradendron_MG0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1CML1481_Mango_MG 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0CML1520_Cacao_AM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0CML1529_Cacao_BA 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0CML1530_Cacao_BA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0CML1939_Phoradendron_MG0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0CML1929_Tapirira_MG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia
25
taxonomia numérica
Overy et al. 2005
Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia
26
quimiotipos e filogenia
Quimiotaxonomia Quimiotaxonomia
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Penicillium polonicum
IdentificaIdentificaçção rão ráápida (e taxonomia) de fungospida (e taxonomia) de fungos
ESI - ionização de um grande número de metabólitos; de perfis de massa
Larsen et al., 2005
infusão direta do extrato bruto no espectrômetro de massas ( id-EM)
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idid--EMEMId-EM Filogenia
Larsen et al., 2005
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AnAnáálise de perfis de protelise de perfis de proteíínas por EMnas por EM
extratos brutos, micélio ou esporos analisados diretamente por EM
ionização de proteínas - MALDI
Glish & Vachet, 2009; Santos et al., 2009
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AnAnáálise de perfis de protelise de perfis de proteíínas por EMnas por EM
analisador de massas por tempo de vôo - TOF
Glish & Vachet, 2009; Santos et al., 2009
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AnAn��lise de perfis de protelise de perfis de prote��nas por EM nas por EM –– MALDIMALDI--TOFTOF
A. candidus
A. chevalieri
A. flavus
A. fumigatus
A. sydowii
A. terreus
A. ustus
A. versicolor
Hettick et al. 2008a
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AnAn��lise de perfis de protelise de perfis de prote��nas por EM nas por EM –– MALDIMALDI--TOFTOF
A - A. candidus
B - A. chevalieri
C - A. flavus
D - A. fumigatus
E - A. nidulans
F - A. niger
G - A. parasiticus
H - A. repens
I - A. sydowii
J - A. terreus
K - A. ustus
L - A. versicolor
Hettick et al. 2008a
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AnAn��lise de perfis de protelise de perfis de prote��nas por EM nas por EM –– MALDIMALDI--TOFTOF
P. aurantiogriseum
P. brevicompactum
P. citrinum
P. chrysogenum
P. purpurogenum
P. roqueforti
P. simplicissimum
P. variabile
Hettick et al. 2008b
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AnAn��lise de perfis de protelise de perfis de prote��nas por EM nas por EM –– MALDIMALDI--TOFTOF
A - P. aurantiogriseum
B - P. brevicompactum
C - P. citrinum
D - P. chrysogenum
E - P. expansum
F - P. fellutanum
G - P. jensenii
H - P. melinii
I - P. purpurogenum
J - P. roqueforti
K - P. simplicissimum
L - P. variabile
Hettick et al. 2008b
