0 estudo de bioequivalência com metodologias não tradicionais ( métodos não cromatográficos)...
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Estudo de Bioequivalência com Metodologias não Tradicionais
( Métodos Não Cromatográficos)
Luciano Miranda
Especialista Científico Imunoensaios
Abbott Laboratórios do Brasil Ltda
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Tecnologia Axsym FPIA x MEIA
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Centro de procesamento
Suporte para células matrix
Centro de suprimentos
Centro de controle do sistema
Centro de amostras
DESCRIÇÃO DO ANALISADOR AxSYM
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1. Manutenções:
15 minutos diarios
30 minutos semanal e mensal
Procedimentos extremamente simples
2. Software amigável e atualizado
3. Monitor com tela táctil
4. Capacidade de urgência real
Fácil de aprender, fácil de operar, plataforma ideal para aplicações de rotina e investigações
Fácil de aprender, fácil de operar, plataforma ideal para aplicações de rotina e investigações
FÁCIL DE UTILIZAR AxSYM
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• Lista de carregamento de amostras
• Revisão de resultados
• Reporte/seleção de resultados
• Transferencia de resultados por lote ou em tempo real
• Imprimir resultados do paciente
• Armazena e arquiva resultados
• Revisão de calibração
SISTEMA CENTRAL DE INFORMAÇÃO AxSYM
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Tecnologias AxSYM
MEIA: Inmunoensaio Enzimático por Micropartículas
•Ensaio desenhado para efetuar determinações de analitos de alto peso molecular (moléculas grandes)
•Ensaio Não Competitivo
FPIA: Imunoensaio de Polarização Fluorescente
•Esta tecnología foi desenhada para fazer determinações de moléculas pequenas.
•Todas as moléculas que se encontram dissolvidas em líquido, se encontram em rotação, e sua velocidade de rotação depende de seu tamanho
•Ensaio competitivo
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MEIA Tecnologia não competitiva
Os ensaios não competitivos tipo sandwich se adaptam para formatos de 1 passo, 2 passos e 3 passos
A concentração do analito é diretamente proporcional ao sinal de fluorescência medida
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Ensaios COMPETITIVOS DE UM PASSO
Análise competitiva homogênea - Desenhado para poder analizar moléculas muito pequenas (como é o caso das drogas, alguns esteróides, alguns aminoácidos como homocisteína)
• FPIA é uma análise competitiva
• Reativo = Contém o mesmo analito a medir marcado com “Fluoresceína”
• A reação se prende a uma solução, e o complexo não requer passo de lavado para separar o complexo
FPIA Tecnologia
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Ensaios FPIA de dois passos
Estão desenhados para melhorar a sensibilidade dos ensaios
Um primeiro passo se junta com o excesso de Anticorpos e permite suficiente tempo de incubação
Um segundo passo permite a união do antígeno marcado com as imunoglobulinas presentes
FPIA Tecnologia
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FPIA
O módulo óptico mede as trocas de polarização quando são expostos a luz polarizada
• As moléculas com traçador não unidas ao complexo não emitem luz polarizada
• As moléculas com traçador unidas ao complexo emitem luz polarizada
• Um sinal de luz elevada indica baixo nível de analito na amostra do paciente
FPIA Tecnologia
FPIA – Menos antígeno “marcado” unido é indicador de mais antígeno presente na amostra
A quantidade de antígeno presente na amostra é inversamente proporcional ao sinal de luz polarizada registrada
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A Fluorescência ocorre devido a um marcador fluorescente. A Fluorescência ocorre devido a um marcador fluorescente. Este absorve a energia da luz em 490 nm e libera essa energia em Este absorve a energia da luz em 490 nm e libera essa energia em um comprimento de onda mais alto (520 nm) como luz um comprimento de onda mais alto (520 nm) como luz fluorescente.fluorescente.
490 nm490 nm
Fonte de Fonte de LuzLuz
Ag ligado Ag ligado FluoresceínaFluoresceína
520 nm520 nm
Detector de Luz em Detector de Luz em 520 nm520 nm
FPIA Tecnologia
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Moléculas grandes rotacionam mais lentamente em solução do que moléculas Moléculas grandes rotacionam mais lentamente em solução do que moléculas pequenas. pequenas. Este princípio pode ser usado para distinção entre uma pequena molécula de Este princípio pode ser usado para distinção entre uma pequena molécula de antígeno-fluorescente (AgF), que possui rotação rápida, e os complexos maiores antígeno-fluorescente (AgF), que possui rotação rápida, e os complexos maiores Ac-AgF, que possuem uma rotação mais lenta em solução.Ac-AgF, que possuem uma rotação mais lenta em solução.
490490 nmnm
Ag ligado Ag ligado FluoresceínaFluoresceína
Luz “despolarizada”Luz “despolarizada”
Fonte de Fonte de LuzLuz
ComplexoComplexo Ac-AgFAc-AgF
Fonte de Fonte de LuzLuz
Luz polarizadaLuz polarizada
490 nm490 nm
FPIA Tecnologia
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Dterminação de Levotiroxina (T4 Total)
• O ensaio AxSYM T4 Total é utilizado como um auxiliar na avaliação e monitoramento de estado da tireóide;
• A tiroxina é um hormônio que contém iodo com aproximadamente 777 daltons onde é secretado pela glândula da tireóide;
• É responsável em nosso organismo em torno de 90% de iodo ligado à proteína em circulação;
• Valores elevados de determinações de T4 Total são encontrados em pacientes com hipertireoidismo;
• Servem para monitoramento de pacientes que fazem o tratamento desta patologia.
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AxSYM
Centro de Amostragem:
• Amostra, solução de pré-tratamento e tampão são pipetados em uma cavidade de reaction vessel;
• Alíquota é transferida para uma das cavidades da célula da reação;
• A solução de pré-tratamento remove o T4 dos sitios de ligação na TBG, pré-albumina e albumina;
• Esta reaction vessel é transferida para o centro de processamento onde são realizadas outras etapas com agulha específica para evitar contaminação.
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AxSYM
Centro de Processamento:
• Uma segunda alíquota da reação é trasnferida para uma das cavidades do traçador ( MUP );
• O analito T4 e o traçador marcado competem pelos receptores na molécula do anticorpo;
• A intensidade da luz fluorescente polarizada é determinada pelo ssistema óptico FPIA.
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Calibradores
Seis calibradores standard:
Concentração de T4 Total (µg/dl): 0; 3; 6; 12; 18 e 24.
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Controles
AxSYM T4 Total Controles (Nº 7A55-10)
3 frascos (8 mL cada) de Controles AxSYM T4 Total, contendo tiroxina preparada em soro humano processado não reativo para HBsAg, RNA do HIV-1 ou Antígeno do HIV-1, anti-HCV e anti-HIV-1/HIV-2, produzindo as seguintes faixas de concentrações:
Concentração de T4 Total Intervalo
Frasco μg/dL
Baixo 4,5 3,3 – 5,7
Médio 8,0 6,6 – 9,4
Alto 15,0 12,5 – 17,5
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Parâmetros do Ensaio1 Long Assay Name (English): Total_T4
6 Abbrev Assay Name (English): Total_T4
11 Assay Number: 245
12 Assay Version: *
13 Calibration Version: *
14 Assay File Revision: *
15 Assay Enabled >ON
17 Assay Type : FPIA
18 Standard Cal Reps >2
19 Master Cal Reps:>2
20 Cal Adjust Reps: 0
21 Cal A Concentration: 0.00
22 Cal B Concentration: 3.00
23 Cal C Concentration: 6.00
24 Cal D Concentration: 12.00
25 Cal E Concentration: 18.00
26 Cal F Concentration: 24.00
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Parâmetros do Ensaio
27 Master Calibrator 1 Concentration: 0.00
28 Master Calibrator 2 Concentration: 18.00
43 Default Dilution Protocol >UNDILUTED
44 Default Calibration Method >Standard Cal
45 Selected Result Concentration Units >μg/dL
46 Selected Result Decimal Places >2
62 Blank I-Max background intensity:*
63 Min tracer-Min background intensity: *
73 Low Limit-Normal/Therapeutic Range lower limit > 0.00
74 High Limit-Normal/Therapeutic Range upper limit > 0.00
75 Low Extreme Value > 0.00
76 High Extreme Value > 0,00
91 Low Range Undiluted: *
92 High Range Undiluted: *
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Sensibilidade
A sensibilidade do Ensaio AxSYM T4 Total foi calculada como sendo de 1,05 μg/dL (n = 65 execuções).
Essa sensibilidade é definida como a concentração a dois desvios-padrão no AxSYM T4 Total Calibrador A (0,0 μg/dL) e representa a mais baixa concentração determinável de T4 que pode ser diferenciada de zero.
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Especificidade
A especificidade do Ensaio AxSYM T4 Total foi determinada através do estudo da reação cruzada com a triiodotironina (T3). Ao se determinar a razão das concentrações de T4 para T3, que corresponde ao ponto médio.
