Universidade Estadual de CampinasFaculdade de Ciências MédicasDepartamento de Farmacologia

Estudo de Bioequivalência de duas

formulações de pantoprazol em

voluntários sadios de ambos os sexos

Aluna: Maria Carla Petrellis

Orientador: Prof. Dr. Gilberto De Nucci

2004

Bioequivalência - Considerações

Adoção de uma

política de

medicamentos

genéricos

• Produção

• Garantia de Qualidade

• Prescrição

• Dispensação e uso

É parte fundamental das diretrizes

para promoção do uso racional de

medicamentos em nosso País

Medicamento Genérico: na concepção da OMS,

“ produto farmacêutico intercambiável”

• deve apresentar a mesma segurança e eficácia

do medicamento de referência

• produzido após a expiração da proteção patentá-

ria ou outros direitos de exclusividade pela DCI

(Denominação Comun Internacional), ou seja não

apresenta marca

Medicamentos Bioequivalentes (F.D.A):

• na mesma dose molar,

• a mesma indicação terapêutica

• nas mesmas condições experimentais,

(mesma via de administração)

São equivalentes farmacêuticos ou alternativas

farmacêuticas que , ao serem administrados:

Não apresentam

diferenças estatísticas

significantes quanto:

• à velocidade de absorção

• à extensão de absorção

Parâmetros para determinar a Parâmetros para determinar a

BioequivalênciaBioequivalência

• ASC (0-t) = Área sob a curva de concentração sangüínea vs tempo

• Cmax = Pico de concentração plasmática do fármaco

• t(max) = Tempo para atingir o pico da concentração máxima

A etapa crítica no Estudo de Bioequivalência

é o desenvolvimento e validação de ensaios

bioanalíticos

Consiste na realização de experimentos

Encontrar condições necessárias

para a quantificação do analito em questão

Validação de Métodos Bioanalíticos

• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(CLAE, LC-MS/MS)

• Cromatografia Gasosa (CG, CG-MS/MS)

• Métodos Imunológicos (RIA, EMIT e ELISA)

Metodologias

Parâmetros da Validação Bioanalítica

Especificidade - Seletividade

Especificidade: o método produz uma única resposta

analítica para um único analito

Seletividade: a habilidade de uma técnica analítica

em distinguir e quantificar, ou não, uma droga em

relação a outras resposta de diferentes componentes

presentes nos fluidos biológicos

Linearidade*

Habilidade de se obter resultados diretamente

proporcionais à concentração do analito na amostra

*International Conference of Harmonization - ICH, Guideline for Validation of Analytical Procedure Methodology, 1996;

Comissionof European Communities – Comittee for Proprietary Medicinal Products 111/5626/94 final draft, 1994;

Buick et al., 1990.

Fatores na avaliação de curva de calibração:

• Precisão e exatidão menor ou igual a 15% nas

determinações nominais da curva de calibração,

exceto para as concentrações do LOQ

• Precisão e exatidão menor ou igual a 20% nas

determinações nominais do LOQ

• quatro das seis concentrações nominais devem

estar de acordo com critérios acima mencionados,

incluindo os pontos do LOQ e os pontos de

calibração de menor concentração.

• Valor de coeficiente de correlação linear ou igual ou

maior que 0.95

Precisão

Grau de concordância entre os resultados de

análises individuais, quando o procedimento

analítico é aplicado em diversas vezes em uma

mesma amostra analítica, em idênticas condições

experimentais.

Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Causon, R. 1997; Brittain, 1998; Relatório final da ISO

(International Organization for Standardization), 1990/1991; Hartmann et al., 1994; Shan et al.,

1992; Buick et al.,1990; USPXX 1990; Brooks, 1985 Buick et

al., 1990

• Repetibilidade (Precisão intra-ensaio): Habilida-

dade de repetições da metodologia empregada nas

mesmas condições laboratoriais, considerando um

único dia de análise

• Reprodutibilidade (Precisão inter-ensaio):

Habilidade de repetições da mesma metodologia

aplicada sob diferentes condições laboratoriais,

em subseqüentes ocasiões que podem variar

semanas ou até meses

Exatidão

É definida como o grau de concordância

entre os valores individuais encontrados em relação

aos valores reais ou nominais

* Causon, R. 1997; Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Brittain,1998 e Mehta, 1989.

• Um único dia “ Exatidão Intra-ensaio”

• Dias diferentes “Exatidão Inter-ensaio”

Limite de Quantificação (LQ)

Representa a mais baixa concentração de

um composto de investigação que atende os re-

quisitos para precisão e exatidão do ensaio ana-

lítico

A recuperação avalia a eficiência da extração

e sua variabilidade. Embora recuperações próximas

de 100% sejam desejáveis, baixas recuperações po-

dem ser utilizadas (50-60%) se forem precisas, exa-

tas e reprodutíveis.

Recuperação

Estabilidade

Deve ser considerada durante a fase do

desenvolvimento analítico

Critérios de Aceitabilidade

• Precisão: Os CV% do inter-day para os QCs é

15%, e 20% para o LOQ QC, avaliados em um

mínimo de 3 lotes.

• Exatidão: A média dos valores do inter-day

devem ser menores que 15% do valor nominal

dos QCs, e não desviar mais que 20% para

LOQ QC.

• Sensibilidade: O menor ponto da curva de

calibração aceitável como limite de quantificação

(LOQ) do método é aquele com CV% 20%

(inter-day).

Pantoprazol

POTENTE INIBIDOR DE LONGA DURAÇÃO DA BOMBA ÁCIDA DA POTENTE INIBIDOR DE LONGA DURAÇÃO DA BOMBA ÁCIDA DA

SUPERFÍCIE DAS CÉLULAS PARIETAIS GÁSTRICASSUPERFÍCIE DAS CÉLULAS PARIETAIS GÁSTRICAS

Objetivos

• Avaliar a bioequivalência de duas formulações

de pantoprazol baseada na comparação dos

valores obtidos dos parâmetros farmacocinéticos

de cada formulação calculados a partir de medida

das concentrações plasmáticas de pantoprazol

• Validar a metodologia analítica por LC-MS/MS

empregada na quantificação das concentrações

de pantoprazol em amostras de plasma humano

Protocolo do Estudo

Seleção dos Voluntários

• Vinte e dois voluntários sadios de ambos os sexos

• Idade entre 18 e 45 anos (média= 30 ± 1 ano)

• Peso Corporal entre 55 e 100 kg (média 77,5 ± 10,1 kg)

• Entrevista e exames clínicos pré-estudo

• Assinatura do Termo de Consentimento Livre Esclarecido

do estudo

• Protocolo Clínico Aprovado pela Comissão de Ética da

Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Federal do

Ceará

Protocolo Clínico

• Delineamento aleatório cruzado, aberto de dois períodos,

com intervalos de 15 dias entre as doses de pantoprazol

• Hospitalização por 24 horas na Unidade de Farmacologia

Clínica

• Internação seguida de dieta padrão até 23:00 hs

• Jejum após 23:00hs, e início do estudo clínico às 7:00hs,

dose única por via oral de 40 mg de pantoprazol

• Dieta padrão às 12:00 e às 18:00 hs

• Restrições: alimentos contendo xantinas

Coleta das amostras

• Amostras de sangue foram coletadas através de escalpe

em veia superficial do antebraço do voluntário

• Os intervalos de coleta: antes (zero), 0.25, 0.5,0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 5.0, 6.0, 8.0 e 12.0 horas

•As amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a

4000rpm

•Obtenção do soro e armazenamento na temperatura de

- 20°C

Protocolo Analítico

• Princípio do Método:

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de fase-

reversa , acoplada a espectrometria de massa (LCMS/MS)

Extração Líquido-Líquido com emprego de

dietileter:diclorometano (70:30v/v) como solvente extrator

PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÕES

Pantoprazol

• Solução estoque de Pantoprazol (1.0 mg/mL)

em metanol:água (50:50)

• Concentração final de 10 g/mL

Carbamazepina (P.I)

• Solução estoque de carbamazepina (1.0 mg/mL)

em metanol:água (50:50)

•concentrações finais de 100 g/mL e 1 g/mL

PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E AMOSTRAS DE CONTROLE DE QUALIDADE (C.Q)

• contaminação de plasma humano controle

• emprego da solução padrão de pantoprazol (10 g/mL)

• obtenção dos seguintes pontos da curva de calibração:

Branco, Branco + PI, 35, 50, 70, 100, 200, 500 e 1000 ng/mL

Curva de calibração

Controle de qualidade:

• contaminação de plasma humano controle

• emprego da solução padrão de pantoprazol (10 g mL)

• obtenção dos seguintes níveis de concentração:

CQA – 120 ng/mL

CQB – 800 ng/mL

CQC – 600 ng/mL (fator de diluição 1:5)

• temperatura de armazenamento - 20 °C

EXTRAÇÃO DE AMOSTRAS

• 0.5 mL de amostras de plasma: voluntários, pontos

de da curva de calibração, controle de qualidade em

tubos de ensaio

• 0.05 mL de carbamazepina (1 g/mL)

• breve agitação, repouso por 5 minutos

• 4 mL de dietileter-diclorometano (70:30), em

seguida vigorosa agitação por 30 segundos, seguido

centrifugação

• obtenção da fase orgânica e transferência para tubos

de ensaio revestidos de silicone

• evaporação em banho- maria (37°C) sob fluxo

constante de nitrogênio

• reconstituição das amostras analíticas com 200 L

de fase móvel, em seguida breve agitação

• acondicionamento das amostras analíticas em vials

do injetor automático para posterior análise

CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E ESPECTROMETRIA DE MASSA

Sistema de Cromatografia:

• Cromatografia Líquida Alta Eficiência de fase - reversa

• Bomba binária

Column Chromatography:

• Coluna analítica de fase-reversa :Genesis 4 m C8;

150x4.6 mm diâmetro interno na temperatura de 40 °C

Fase Móvel: 80% Acetonitrila – 0.1% ácido trifluoroacé-

tico(TFA) – 20% Água Deionizada

Fluxo constante: 0.9 mL/min por gradiente isocrático

–

Eluente: 100 L/min analisado no detector MS/MS

Injetor Automático: alíquotas de 40 L/min na tempera-

tura 10 °C

Tempo de Eluição: 4 minutos

Tempo de Retenção: Pantoprazol (1.86 min) e Carbama-

zepina (2.2 min)

Detector: O Espectrômetro de massa do tipo Quatro II

equipado com “ atmospheric pressure ionization (API)

electrspray” , operando de modo positivo (MS+)

• Pantoprazol : 366.1 > 91.50 , 50V e 35 eV

• Carbamazepina: 236.89 > 194.09 , 25V e 15 eV

Resultados

Validação Analítica

normal blank plasma lot-0101687446

1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80Time0

100

%

3999BT008 Sm (Mn, 2x20) MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50

1261.37

Figura 1 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Branco (MRM

of two channels; ES+ 366.10 91.50)

lipemic blank plasma lot-gdn200799

1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80Time0

100

%

3999BT010 Sm (Mn, 2x20) MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50

126

Figura 2 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Lipêmico (MRM of

two channels; ES+ 366.10 91.50)

hemolized blank plasma lot-gdn200799

1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80Time0

100

%

3999BT014 Sm (Mn, 2x20) MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50

51.01.35

Figura 3 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Hemolisado (MRM of

two channels; ES+ 366.10 91.50)

std 35 ng/ml Analyte / IntStd

1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20Time0

100

%

0

100

%

3999rv275 Sm (Mn, 2x20) MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50

1.20e31.83

3999rv275 Sm (Mn, 2x20) MRM of 2 Channels ES+ 236.89 > 194.09

2.18e3Area

2.22;754

Figura 4 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Limite de Quantificação

pantoprazol (35ng/mL), (MRM of two channels; ES+ 366.10 91.50). (B)

Padrão interno carbamazepina (50ng/mL), (MRM of two channels; ES+

236.89 194.09)

a

b

vol- 01 1st phase 5h

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

39990126 MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50

8.88e31.89

1.811.770.11 0.551.00

2.012.25 2.74 3.47

39990126 MRM of 2 Channels ES+ 236.89 > 194.09

1.39e52.20

39990126 MRM of 2 Channels ES+ TIC

1.41e52.20

1.87

Figura 5 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Amostra de um voluntário

coletada 5 horas após administração da formulação teste (40 mg de panto-

prazol), (MRM: 366.10 91.50). (B) Plasma contaminado com o padrão

interno carbamazepina (50 ng/mL), (MRM: 236.89 194.09).(C)Concentração

plasmática máxima (99 ng/mL), pantoprazol), (MRM: 366.10 91.50) e seu

padrão interno, carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89 194.09)

a

b

c

Figura 6 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Amostra de um voluntário

coletada 3 horas após administração da formulação padrão (40mg de panto-

prazol), (MRM: 366.10 91.50). (B) Plasma contaminado com o padrão

interno carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89 194.09).(C)Concentração

plasmática máxima (145 ng/mL), pantoprazol), (MRM: 366.10 91.50) e seu

padrão interno, carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89 194.09)

vol- 01 2nd phase 3h

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

39990154 MRM of 2 Channels ES+ 366.10 > 91.50

9.74e31.87

0.840.57 1.26

1.942.03 3.032.36 3.153.45

39990154 MRM of 2 Channels ES+ 236.89 > 194.09

1.25e52.17

39990154 MRM of 2 Channels ES+ TIC

1.27e52.17

1.87

a

b

c

vol- 01 1st phase 1h:30min

240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360m/z0

100

%

39990115 1 (0.033) MRM of 2 Channels ES+ 1.43e3236.9

366.1

Pantoprazole in MP Inf 10uL/mL Cone 50 + TFA 0.01% msms 35

125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450m/z0

100

%

test12 1 (0.527) Daughters of 366ES+ 5.11e6x2

151.874

336.211293.036215.939

185.033 262.249 366.109

a

b

Figura 7 – Espectro de massa: (A) Espectro do pantoprazol adquirido em

Q1, energia do cone = 50v. (B) Espectro dos produtos de íons do panto-

prazol adquirido em Q2 após colisão induzido dissociação, energia do

cone = 50v e energia de colisão – 35eV

a

b

Figura 8 - Espectro de massa da carbamazepina: (A) Q1= 25v (B) Q2 = 25v / 15eV

CARBAMAZEPINE

150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250m/z0

100

%

0

100

%

Scan ES1.64e8236.9

236.7

190.9150.1153.9 192.9

211.5

237.0

237.9

CARBAMAZEPINE Daughters 236.9ES1.99e7194.2

192.2

237.2

Compound 1 name: pantoprazol Coefficient of Determination: 0.991042 Calibration curve: 0.00395875 * x + 0.0187051 Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

0.0 200.0 400.0 600.0 800.0 1000.0 ng/ml 0

4.13

Response

Figura 9 – Curva de calibração obtida após a contaminação de plasma

humano com pantoprazol (35 – 1000 ng/mL) e carbamazepina (50 ng/mL)

Validação do Inter- Ensaio da Curva de Calibração

Concentração (ng/mL-1)

35

50

70

100

200

500

1000

r2

Lote 1 32.3 59.2 70.8 92.4 140.8 505.1 1022.0 0.9900 Lote 2 33.2 43.8 75.4 105.3 213.4 497.6 946.2 0.9940 Lote 3 34.2 50.7 68.4 120.9 220.8 528.7 972.9 0.9962 Lote 4 29.8 41.5 66.3 111.7 227.0 526.4 934.2 0.9920 Média 32.8 49.8 70.0 105.2 200.5 515.8 975.9 0.99305 DP 3.7 10.7 6.2 14.8 37.4 33.2 62.5 0.00266 DPR (%) 11.2 21.5 9.0 14.1 18.6 6.4 6.4 EP (%) -6.2 -0.2 0.00 5.2 0.2 3.1 -2.4

Tabela 1- Validação da Curva de Calibração

Validação dos Controles de Qualidade

Inter - Ensaio

Intra - Ensaio

Concentração (ng/mL-1)

120

800 3000*

120 800 3000*

n 34 39 34 7 8 7 Média 122.8 756.2 564.2 117.6 765.7 595.1 DP 18.4 112.2 82.9 10.1 73.5 65.2 DPR (%) 14.9 14.8 14.6 8.6 9.6 10.9 EP (%) 2.3 -5.4 -5.9 -1.9 -4.2 -0.8

Tabela 2- Validação dos Controles de Qualidade

*Controle de Qualidade 3000ng/mL foi diluído na proporção de 1:5 para quantificação

Parâmetros Farmacocinéticos

Concentração Média

0 2 4 6 8 10 12

0

75

150

225

300

375

450

PantoprazolPantozol

Tempo (h)

C (

ng

/mL

)

Figura 10- Concentrações plasmáticas (médias aritméticas EP) de

pantoprazol em função do tempo para as duas formulações de pantoprazol

(40mg) administradas em 22 voluntários sadios de ambos os sexos.

Parâmetros Pantoprazol Pantozol

ASC[0-12](ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC

949.9

726.2 – 1242.6

908.7

683.5 – 1208.1

ASC[0-](ng.h.mL 1)

Média Geométrica 90% IC

971.2

755.6 – 1247.3

1071.1

831.0 – 1380.0

Cmax (ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC

524.2

416.8 – 659.1

525.2

400.1 – 689.5

Cmax / ASC[0-12] (ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC

0.6

0.5 – 0.7

0.6

0.6 – 0.7

Parâmetros Pantoprazol Pantozol

t1/2 (h) Média Geométrica 90% IC

0.949

0.797 – 1130.0

0.882

0.725 – 1073.0

Ke (h 1) Média Geométrica 90% IC

0.729

0.614 – 0.867

0.775

0.642 – 0.936

tmax (h) Mediana Faixa

2.3

1.0 – 5.0

2.5

1.0 – 5.0

Tabela 3 – Parâmetros farmacocinéticos de pantoprazol obtidos após a

administração de cada uma das formulações de pantoprazol (40mg) nos 22

voluntários.

Parâmetros % das razões Pantoprazol/Pantozol

Paramétrico Não

Paramétrico

ASC[0-12](ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC

105.5

95.2 – 116.8

104.3

93.9 – 117.7

ASC[0-](ng.h.mL 1)

Média Geométrica 90% IC

102.6

91.5 – 115.1

102.0

89.1 – 114.8

Cmax (ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC

99.8

88.2 – 112.8

98.9

88.3 – 114.2

Cmax / ASC[0-12] (ng.h.mL 1) Média Geométrica 90% IC

105.6

99.7 – 111.9

105.4

97.9 – 112.4

Parâmetros % das razões Pantoprazol/Pantozol

Paramétrico Não

Paramétrico

t1/2 (h) Media Geométrica 90% IC

108.5

89.9 – 130.8

106.1

96.6 – 118.3

Ke (h 1) Média Geométrica 90% IC

107.0

89.4 – 128.0

105.5

93.4 – 118.0

tmax (h) Média Geométrica 90% IC

-0.542b

-1.057-0.027c

-5.00

-1.25 – 0.00

Tabela 4 – Análise estatística das razões individuais teste/referência da ASC 0-12h, ASC0-, Cmax, e das diferenças teste – referência de Tmax entre ambas as formulações de pantoprazol bMédia Aritmética das diferenças individuaisc90% das diferenças individuais

Conclusão