manual salmonella gss 2008 doc

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Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e

Laboratoriais

Norma dos Santos Lzaro, Eliane Moura Falavina dos Reis, Christiane Soares Pereira & Dalia dos Prazeres Rodrigues

Laboratrio de Referncia Nacional de Clera e outras Enteroinfeces Bacterianas Laboratrio de Enterobactrias

LRNCEB/LABENT

IOC/VPSRA/FIOCRUZ

Outubro/2008

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Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ LRNCEB/LABENT

Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

INDICE Pgina 1. Taxonomia ....................................................................................... 2. 2. Caractersticas Gerais ..................................................................... 4 3. Habitat ............................................................................................ 6 4. Caractersticas clnicas e patogenia ................................................ 6 5. Ecologia ........................................................................................... 10 6. Epidemiologia ................................................................................. 7. Diagnstico Laboratorial Coleta de Espcimes Clnicos .......... ... 7.1. Sangue............................................................................................ 7.2. Fezes ............................................................................................. 7.3. Transporte de espcimes clnicos .................................................

11 12 12 13 15

. Diagnstico Laboratorial de Salmonella spp. de Espcimes Fecais....... Esquema de Isolamento - Fluxograma................................................

8.1. Pr-Enriquecimento .......................................................................

16 17 18

8.2. Enriquecimento Seletivo ................................................................ 18 8.3. Meios Seletivos-Indicadores .......................................................... 20 7.4. Identificao Bioqumica Presuntiva (Meios de Triagem) .............. 25 8.5.Caracterizao Bioqumica Complementar ..................................... 31 9. Aspectos Gerais sobre os Antgenos das Enterobactrias .............. 41

10. Controle de Qualidade de Meios de Cultura, Reagentes e Equipamentos ................................................................................

47 11. Anexos ............................................................................................. 50 12. Bibliografia ....................................................................................... 54

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1. Taxonomia

A designao do gnero Salmonella foi adotada em 1900 por Lignires em homenagem a Daniel Salmon, o qual isolou o microrganismo conhecido como Salmonella enterica sorovar Choleraesuis de sunos. Sua nomenclatura teve como orientao inicial informaes relacionadas s condies clnicas ou ao hospedeiro do qual o microrganismo era isolado.

Entretanto, a diversidade inicial de sorovares que apresentavam etiologia no especfica de um determinado hospedeiro, levou inicialmente a designao do mesmo sorovar em hospedeiros distintos, em locais diferentes. A partir de 1920, um grupo de microbiologistas, liderados por Fritz Kauffmann em Copenhagen e por Philip Bruce White em Londres unificaram a taxonomia, tendo seu trabalho reconhecido pelo subcomit de Salmonella da Sociedade Internacional de Microbiologia em 1933, como esquema de Kauffmann-White. A partir de ento sua nomenclatura sofreu algumas modificaes tendo por base a utilizao de mtodos clssicos e mtodos moleculares, como AFLP, e seqenciamento 16S rRNA, MLEE, FAFLP. Na atualidade o gnero dividido em duas espcies e seis subespcies ou subgneros, S.enterica (subespcies enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica) e S.bongori. A forma de redao na nomenclatura atual como por ex. do sorovar Typhimurium, deve ser reportada como Salmonella enterica subespcie enterica sorovar Typhimurium. Contudo pode ser redigida de uma forma reduzida onde o nome do sorovar iniciado com letra maiscula, porm nunca itlico, como por exemplo, Salmonella sorovar Typhimurium ou Salmonella Typhimurium. Salmonella o gnero de maior relevncia na famlia Enterobacteriaceae, embora sua relao filogentica seja de certo modo conjuntural. Dependendo do mtodo empregado, S.enterica mais relacionada com Citrobacter do que com Escherichia coli (homologia de DNA) ou em sentido inverso quando empregado mtodo de avaliao de grandes fragmentos (23S rRNA).

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Em geral, acredita-se que Salmonella e E.coli descendam de um ancestral comum a 160-180 milhes de anos, durante o perodo tercirio, em paralelo com os invertebrados. E.coli e Salmonella difsica se adaptaram aos mamferos, enquanto sorovares monofsicos permaneceram adaptados aos repteis.

Em cada subespcie so reconhecidos diferentes nmeros de sorovares tendo por base a caracterizao de seus antgenos somticos (O) e flagelares (H), perfazendo atualmente >2.500 sorovares. Entre as espcies, a subespcie S.enterica apresenta maior nmero de sorovares, sendo responsvel por 99% dos isolamentos, usualmente de animais de sangue quente, cuja distribuio editada por Popoff M.Y. & Le Minor L., 2001 encontra-se apresentada na Tabela 1.

Em 2002, foram includos 18 novos sorovares, sendo 12 pertencentes a S.enterica subespcie enterica, 2 subespcie salamae, 2 diarizonae, 1 houtenae e 1 S. bongori.

Atualmente so reconhecidos cerca de 2510 sorovares includos em duas espcies S.enterica e S. bongori, como discriminados abaixo:

Salmonella enterica subsp. enterica 1490 sorovares Salmonella enterica subsp salamae - 500 Salmonella enterica subsp arizonae - 94 Salmonella enterica subsp diarizonae - 320 Salmonella enterica subsp houtenae 72 Salmonella entrica subsp. indica 12 Salmonella bongori 22

Em 2004 uma nova espcie foi proposta, tendo sido designada Salmonella subterranea. Seu isolamento foi efetuado em sedimento subterrneo, de solo com baixo pH na Oak Ridge, Tennessee. Esta amostra apresentou forte inter-relao com S.bongori, atravs de seqenciamento 16S rRNA alm de algumas caractersticas como indol positivo, H2S e lisina descarboxilase negativa, pigmento amarelo e um flagelo lateral. A amostra tipo proposta ATCC BAA-86.

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Tabela 1. Nomenclatura atual

2. Caractersticas Gerais

Pertencente a famlia Enterobacteriaceae, sendo que morfologicamente bastonetes Gram negativos, geralmente mveis, formam cido e, na maioria das vezes, gs a partir da glicose, excetuando-se os sorovares S. Typhi, S. Pullorum e S.Gallinarum (5% produzem gs). Tambm fermentam arabinose, maltose, manitol, manose, ramnose, sorbitol, trealose, xilose e dulcitol. A maioria das salmonelas de interesse clnico no fermenta lactose, contudo, muitas cepas podem adquirir esta caracterstica atravs de transferncia plasmidial. So oxidase negativo, catalase positivo, indol, Voges-Proskauer (VP), vermelho de metila (VM), malonato e uria negativos. Produzem gs sulfdrico a partir da reduo do enxofre por ao da enzima cistena desulfidrase. Apresentam ainda como caractersticas metablicas a capacidade de descarboxilar os aminocidos lisina e ornitina, reduzir nitratos a nitritos e utilizar o citrato como fonte nica de carbono. No entanto, ocorrem variaes em funo do sorovar e/ou subspcie. Por exemplo, S.Arizonae no fermenta o dulcitol, mas freqentemente malonato positivo. S. Pullorum no fermenta o dulcitol e S. Gallinarum no descarboxila ornitina e no produz gs a partir da fermentao da glicose. Somando-se a estas caractersticas, S. Pullorum e S. Gallinarum so imveis, enquanto as salmonelas paratficas so mveis.

As caractersticas bioqumicas que permitem diferenciar as distintas subespcies dentro da espcie enterica e as espcies S. bongori e S. subterranea so apresentadas na tabela 2.

Espcies S.enterica

S.bongori Subespcies enterica salamae arizonae diarizonae houtenae indica

ATCC no. 43971 43972 13314 43973 43974 43976 43975

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Tabela 2. Caractersticas diferenciais de espcies e subespcies de Salmonella spp.

a: d-tartarato; b: S.Typhimurium (d), S.Dublin (-); +: 90% reaes positivas; - : 90% reaes negativas; d: diferentes reaes(sorovares); e: crescimento sem produo de cido

Espcies S.enterica

S.bongori

S.subterranea

Subespcies

en

teri

ca

sala

ma

e

ari

zon

ae

dia

rizo

na

e

ho

ute

na

e

Ind

ica

Caractersticas

Dulcitol + + - - - d + +

ONPG(2h) - - + + - d + +

Malonato - + + + - - - -

Gelatinase - + + + + - + -

Sorbitol + + + + + - + -

Crescimento KCN - - - - + - + +

L(+)Tartarato(a) + - - - - - - +e

Galacturonato - + - + + + + ND -glutamyl transferase +(b) - + + + + + ND -glucuronidase D D - + - d - ND Mucato + + + - (70%) - + + ND

Salicina - - - - + - - ND

Lactose - - - (75%) + (75%) - d - -

Lise-fago O1 + + - + - + D ND Habitat normal animais Sangue

quente Sangue frio e meio ambiente ?

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Tabela 3. Diferenciao bioqumica entre S. Typhi, S. Paratyphi A e sorovares de S.enterica subsp. enterica mais freqentes.

+ : positivo; -: negativo; (+) 75% positivo aps 48 horas; *: fraco.

3. Habitat

O habitat natural das salmonelas pode ser dividido em 3 categorias com base na especificidade do hospedeiro e padro clnico por eles determinado: altamente adaptadas ao homem incluindo S. Typhi e S. Paratyphi A, B e C, agentes da febre entrica (febres tifide e paratifoide); altamente adaptadas aos animais representadas por S. Dublin (bovinos), S.Choleraesuis e S. Typhisuis (sunos), S.Pullorum e S.Gallinarum (aves), responsveis pelo paratifo dos animais. Entretanto, em determinadas situaes (idade jovem, pacientes com doenas crnicas, idosos, imunocomprometidos) os sorovares S.Dublin e S.Choleraesuis podem determinar no homem, um quadro septicmico, i.., mais grave do que o causado por S.Typhi.

A terceira categoria inclui a maioria dos sorovares que atingem indiferentemente o homem e animais, designadas salmonelas zoonticas, as quais so responsveis por quadro de gastrenterite (enterocolite) ou doenas de transmisso alimentar. Sua distribuio mundial, sendo os alimentos os principais

S. Typhi

S.Paratyphi A

S. enterica

subsp. enterica Glicose (gs)

-

+

+

cido:

Dulcitol

+/-

+

+

Arabinose

-/ +

+

+

Descarboxilao: Lisina

+

-

+

Ornitina

-

+

+

Dehidrolao Arginina

+/-

+

+

H2S

+*

- / (+)

+

Citrato de Simmons

-

-

+

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veculos de sua transmisso. So responsveis por significantes ndices de morbidade e mortalidade, tanto nos pases emergentes como desenvolvidos, determinando pequenos e grandes surtos envolvendo, principalmente, o consumo de alimentos de origem animal como ovos, aves, carnes e produtos lcteos.

4. Caractersticas clnicas e patogenia

A dose infectante varia de 105 a 108 clulas, porm em pacientes imunocomprometidos tm sido observadas doses 103 para alguns sorovares, envolvidos em surtos de doenas de transmisso alimentar (DTA). A manifestao clnica inclui quadros entricos agudos ou crnicos, alm de localizao extraintestinal, como infeces septicmicas, osteomielite, artrite, hepatite, etc. Os microrganismos penetram por via oral invadindo a mucosa intestinal, com disseminao para a submucosa, resultando em enterocolite aguda. Normalmente o quadro diarrico moderado, sem a presena de sangue, entretanto, em alguns quadros clnicos, pode ocorrer perda de pequeno volume de fezes associado a tenesmo e sangue. Seu transporte, atravs do sistema reticulo endotelial, aliado a capacidade de multiplicao no interior dos macrfagos, possibilitam sua manuteno e disseminao no organismo. Indivduos subnutridos ou com deficincias do sistema imune podem apresentar infeces de extrema gravidade, como por exemplo, incidncia de bacteremia em pacientes aidticos, dos quais 20 a 60% relatam infeco gastrintestinal prvia.

Sua virulncia multifatorial, incluindo mobilidade, habilidade de penetrar e replicar nas clulas epiteliais, resistncia ao do complemento, produo de entero, cito e endotoxina, sendo desconhecido o exato papel de cada um, para a manifestao da doena. Em alguns sorovares a virulncia mediada por um plasmdio, em uma regio do operon de 8Kb que contem os genes spvR ABCD, cuja origem ainda encontra-se desconhecida. A relao entre a presena deste plasmdio de virulncia e sorovar j se encontra bem estabelecida em S.Dublin, S.Gallinarum e S.Choleraesuis.

Em pacientes imunodeprimidos a salmonelose pode ser assintomtica ou ainda determinar diarria auto-limitada em 95% dos casos. As infeces clnicas

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humanas determinadas por Salmonella spp. apresentam quatro sndromes clnicas distintas: gastrenterite, febre entrica, septicemia com ou sem infeces localizadas e determinar o estado de portador assintomtico. Entre a totalidade de sorovares S.Enteritidis e S.Typhimurium so os sorovares de maior prevalncia em casos de septicemia e infeces localizadas.

4.1. Infeces gastrentricas: O quadro clinico humano pode variar com fezes diarricas de caractersticas

aquosas semelhante diarria colrica a consistentes com sangue oculto ou visvel e muco. O quadro diarrico regride usualmente de 3 a 4 dias. Pode ocorrer febre (39C) em cerca de 50% dos casos e normalmente de curta durao (dois dias), clicas abdominais leves a intensas quando ocorre invaso dos linfonodos (linfadenite mesentrica), podem mimetizar apendicite. Desenvolvimento de sndrome de clon irritado (SCI), que se caracteriza por diarria branda persistente seguida de quadro agudo de gastrenterite. Em pacientes portadores de SCI, a persistncia como portador assintomtico em 31% aps cinco anos. Em pacientes hospitalizados, portadores de cncer, o quadro reincide ocasionando quadro de pneumonia semelhante quele ocasionado por Pneumocystis. Salmonella permanece presente nas fezes aps cessarem os sintomas, com uma mdia de excreo durante o perodo de cinco semanas. O estgio de portador persiste por at nove semanas em 90% dos adultos, sendo em crianas

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desenvolvimento de bacteremia entre pacientes com HIV de 20-100 vezes maior do que na populao normal. Entre estes somente 20% dos pacientes apresentam quadro posterior diarrico.

Usualmente a bacteremia apresenta elevada prevalncia em adultos, os quais tem como histrico o uso prvio de drogas imunosupressoras. Entre estes pacientes, a complicao subseqente usualmente a pneumonia, sendo entre idosos a responsvel por elevados ndices de letalidade.

4.3. Infeces do Sistema Nervoso Central As infeces incluem meningites, ventriculite, abcessos, empiema subdural. A

presena de diarria e outros sintomas gastrentericos apontada em 50% dos casos. Embora a bacteremia seja comum em pacientes com AIDS, complicaes do sistema nervos central raramente so apontadas. A maior prevalncia destas infeces apontada entre pacientes de longo perodo de hospitalizao, drenagem cirrgica, terapia antimicrobiana prolongada, especialmente em pacientes com HIV.

Os sorovares de maior prevalncia em bacteremia e nas infeces do sistema nervoso central so S. Typhimuriume S.Enteritidis.

4.4. Infeces em outros stios Variam de bacteriuria ao comprometimento de juntas (mais comuns), de

ossos a tecidos e endocardites (50 anos.

Em pacientes que apresentam como fatores de risco a diabetes, Infeco por HIV e aterosclerose a presena de Salmonella observada em placas

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arterosclerticas, tendo em vista a propriedade de se multiplicar nos fagcitos encontradas nestas placas.

Entre as complicaes da gastrenterite podem ser citadas a rabdomiolise (injria do msculo esqueltico, usualmente acompanhado de falha renal; osteomielite que pode levar ao aparecimento de aneurisma abdominal artico, com elevado ndice de mortalidade, linfadenite mesentrica, apendicite, peritonite, colecistite, pericardite, pleutopneumonia, insuficincia renal, tm sido amplamente apontadas como infeces extra-intestinais determinadas por Salmonella.

Artrite reativa, artrite inflamatria e a sndrome de Reiter (ocorrncia simultnea de uretrite e/ou cervicite, conjuntivite e artrite) tem sido reportadas por uma ampla variedade de enteropatgenos incluindo Salmonella spp. A incidncia de artrite reativa e sndrome de Reiter em surtos variam de 6-29% e 3% respectivamente. Estudos recentes apontam entre pacientes com o marcador imunogentico HLA-B27 apresentam elevada probabilidade de desenvolver a sndrome de Reiter. A antibioticoterapia no efetiva para o tratamento de artrite reativa.

5. Ecologia

Salmonella spp. eliminada em grande nmero nas fezes contaminando o solo e gua. A sobrevida no meio ambiente pode ser muito longa, em particular na matria orgnica. Pode permanecer vivel no material fecal por longo perodo (anos), particularmente em fezes secas, podendo resistir mais de 28 meses nas fezes de aves, 30 meses no estrume bovino, 280 dias no solo cultivado e 120 dias na pastagem, sendo ainda encontrada em efluentes de gua de esgoto, como resultado de contaminao fecal.

Os produtos agrcolas no processados, como hortalias e frutas e os alimentos de origem animal, como as carnes cruas, o leite e os ovos, so veculos freqentes de salmonelas. A contaminao de origem fecal geralmente a fonte para os produtos agrcolas, pela exposio gua contaminada; para o leite e ovos, atravs da exposio direta e para a carne, usualmente durante as operaes de abate.

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A contaminao cruzada o fator principal no caso de alimentos elaborados como cereais, chocolate, doces, produtos a base de soja, produtos a base de ovos pasteurizados, leite em p, ingredientes de raes para animais (farinha de peixe, de penas e de ossos) e condimentos. A contaminao durante a elaborao ou preparo pode resultar do contato direto com alimentos antes de sua coco ou proveniente do meio ambiente, como no caso de superfcies contaminadas em cozinhas ou indstrias.

Comparando com outros bastonetes Gram negativos, as salmonelas so relativamente resistentes a vrios fatores ambientais. A adaptabilidade fisiolgica de Salmonella demonstrada por sua habilidade para proliferar em valores de pH entre 7.0 e 7.5 (extremos 3.8 9.5), temperatura de 35 - 43oC (extremos 5 a 46oC) e uma atividade hdrica (0,94), ocorrendo variaes entre sorovares e/ou cepas. Nos produtos secos como o chocolate, o cacau em p, as especiarias ou o leite em p e em produtos congelados como os sorvetes, o normal a sobrevivncia por perodos de tempo prolongados. A bactria sensvel ao calor, no sobrevivendo

temperatura superior a 700C, no entanto a termorresistncia pode incrementar-se com menor coeficiente de atividade de gua.

A inativao ocorre rapidamente em temperatura de pasteurizao em alimentos com atividade de gua 0,95 a qual quando inferior, aumenta a termorresistncia. Esta associao entre tolerncia ao sal e cido resistncia so interdependentes. Certos processos como salmoura (9,0%) e defumao tm efeito limitado na sobrevivncia das salmonelas, podendo sobreviver por vrios meses na salmoura com cerca de 20% de sal, em produtos de elevado teor protico ou de gordura. Como exemplos, podem ser citados a carne seca defumada e o pescado, onde apresentam capacidade de sobrevivncia de vrias semanas a meses. A relativa resistncia que estes microrganismos apresentam dessecao, congelamento, salmoura e defumao, explica porque sobrevivem em muitas classes de alimentos. O efeito bactericida das condies cidas varia de acordo com a natureza do cido utilizado no processo, onde os cidos actico e propinico so mais inibitrios que os cidos ltico e ctrico.

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6. Epidemiologia

A salmonelose uma das zoonoses mais complexas em sua epidemiologia e controle, cujos PA

dres diferem de uma regio para outra. Isto se deve a diferenas nos hbitos alimentares, prticas de elaborao de alimentos, criao de animais e padres de higiene e saneamento. O controle das salmoneloses representa um desafio para a Sade Pblica, tendo em vista a emergncia de novos sorovares e a reemergncia de outros em determinadas reas, tanto nos pases emergentes quanto naqueles industrializados.

O fator epidemiolgico mais destacado nos animais o estado de portador, onde a falta de sintomas e as dificuldades tcnicas para sua deteco antes ou durante a inspeo dos produtos de origem animal, os convertem em fonte contnua de contaminao do meio ambiente e, portanto, dos alimentos.

Qualquer alimento que contm Salmonella um risco potencial para o consumidor, cuja veiculao facilitada, na atualidade, pela mudana nos hbitos alimentares da populao. A necessidade cada vez mais intensa de produo/oferta de alimentos tem como fatores de risco, falhas quanto ao manuseio, transporte muitas vezes em condies inadequadas, aliados ausncia de critrios bsicos de higiene e saneamento, os quais favorecem a disseminao. Considerando que sua principal via de transmisso est na cadeia alimentar, sua presena em animais, criados com objetivo comercial, aponta este microrganismo como o mais incidente e relevante agente etiolgico de enteroinfeces. Isto resulta em milhes de dlares em perdas para a indstria, particularmente de bovinos, sunos e aves, tanto para o mercado interno quanto para exportao, onde em alguns pases, a rigidez na inspeo representa uma necessidade constante de qualidade.

Neste contexto, observa-se o aumento da resistncia de Salmonella spp. aos antimicrobianos, com o percentual se elevando de 17% na dcada de 70 para 31%

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no final dos anos 80 incluindo-se a resistncia as fluoroquinolonas. Tal fato vem culminando neste sculo com o aparecimento, em diferentes paises, de cepas produtoras de diferentes tipos de beta-lactamases.

A incidncia de resistncia bacteriana a antimicrobianos representa risco sade humana e animal. Este tema de extrema importncia tem sido objeto de ateno de instituies como a Organizao Mundial da Sade (OMS), Escritrio Internacional de Epizootias (OIE) e Codex Alimentarius, que vm discutindo solues globais para o problema. Tal fato tem por base sua distribuio mundial, sendo detectadas na maioria das espcies animais utilizados para consumo humano, alm de animais silvestres e domsticos.

77.. Diagnstico Laboratorial - Espcimes clnicos

7.1. Sangue O hemocultivo reveste um interesse especial no caso de febre tifide e

paratifide, porm no constantemente positivo. Os percentuais de positividade,

na ausncia de tratamento antibitico, so de 90% durante a primeira semana de evoluo, 75% na segunda, 40% na terceira e 10% na quarta semana. Os hemocultivos so negativos nas sndromes de infeces transmitidas por alimentos (infeces intestinais), no entanto, estes sorovares podem causar septicemia em indivduos imunocomprometidos.

Principais cuidados para coleta: A coleta deve ser efetuada antes da utilizao de antimicrobianos Efetuar a desinfeco da superfcie dos frascos de cultivo (lcool 70GL); Fazer a assepsia do stio de puno (lcool 70GL ou soluo iodada) em

movimentos concntricos do centro para a extremidade;

Volume para cultura: Adultos: 20mL, coletados com seringa, divididos em duas alquotas para inoculao em dois frascos de meio de cultura (inocular 10mL/100mL de meio enriquecido

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acrescido de anticoagulante SPS (Polianetolsulfonato sdico). Crianas: (inocular 1mL/10mL de meio enriquecido acrescido de SPS).

Processamento das amostras de sangue Todas as culturas de sangue (hemocultura) devem ser incubadas a 35C e

quando o hemocultivo por efetivado por metodologia tradicional, avaliado por 7 dias. Paralelamente pode ser empregada a semeadura direta em meio seletivo-indicador.

A partir do crescimento de colnias com morfologia tpica, dever ser efetuado o isolamento e subseqente identificao bioqumica e antignica.

Caso ocorra o recebimento de sangue coagulado, deve ser efetuada a dilacerao do cogulo, atravs de uma pipeta e em seqncia a semeadura em meio de enriquecimento e paralelamente em seletivo-indicador.

7.2. Fezes: Aspectos relevantes para a coleta

As fezes devem ser coletadas durante a fase aguda, antes de se iniciar o tratamento com antibiticos.

Swabs retais devem ser priorizados para pacientes com infeco ativa, do mesmo modo que para crianas ou indivduos com dificuldade de obteno de amostras.

Peso Volume total

25 kg 20 mL

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A pesquisa de Salmonella Typhi nas fezes indicada a partir da segunda semana da doena, assim como na convalescena e na deteco de portadores.

Fezes de emisso espontnea: Estas amostras devem ser colhidas em recipientes de boca larga, limpos e/ou

esterilizados, sendo mantidos sem processamento laboratorial por um perodo mximo de duas horas aps a coleta. Como amostra deve ser tomada de 0,5 a 2g de fezes e quando da presena de sangue ou muco, esta deve ser a poro selecionada para a avaliao laboratorial.

Evitar a coleta de espcimes fecais a partir das roupas do paciente, da superfcie de camas e/ou cho.

Espcimes retais: Umedecer o swab em soluo fisiolgica ou gua destilada esterilizada; Introduzir o swab na ampola retal do paciente ou comunicante, comprimindo-o

em movimentos rotatrios suaves, por toda a extenso da mesma;

Processar no perodo at duas horas e caso no seja possvel, introduzir o swab no meio de Cary & Blair. Neste meio de transporte o espcime pode ser conservado por at cinco dias em refrigerao.

Coleta de fezes em papel filtro.

Utilizar tiras de papel de filtro, tipo xarope ou mata-borro, com dimenses de 2,5cm de largura por 6,0cm de comprimento.

As fezes diarricas ou emocionadas em gua, devem ser espalhadas em 2/3 de uma das superfcies do papel, com auxlio de um fragmento de madeira (palito individual) ou de qualquer outro material semelhante, disponvel no momento.

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As tiras de papel de filtro devem ser acondicionadas em invlucros plsticos aps dessecar naturalmente. Sob estas condies, Salmonella se mantm vivel por um perodo aproximado de 30 dias.

7.3. Transporte de espcimes clnicos Utilizar na medida do possvel containeres plsticos ou de isopor para

manuteno por perodo curto (duas a quatro horas) de transporte das amostras;

Envolver os isolados ou espcimes clnicos com plstico ou papel e coloc-los em outra embalagem no interior da caixa de transporte;

Manter as fichas contendo as informaes clnicas e/ou epidemiolgicas parte de espcimes clnicos;

Para reutilizao dos containeres para transporte, efetuar a desinfeco utilizando soluo de hipoclorito de sdio (100 ppm);

Exame direto de fezes: avaliao presuntiva Presena de picitos e clulas mononucleares indicam processo inflamatrio. A presena de polimorfonucleares indicativa de sndrome disenteriforme ou

colite determinada por patgenos invasivos. Clulas mononucleares podem predominar em pacientes com febre tifide.

Metodologia: Utilizar soluo de azul de metileno de Loeffler, misturado em igual quantidade com as fezes, colocada sobre lmina, coberta por lamnula e examinar com microscpio tico (objetiva de 10X e 40X).

8. Diagnstico Laboratorial de Salmonella spp em Espcimes Fecais

A procura de uma metodologia ideal para o isolamento de Salmonella, tem sido uma constante entre os pesquisadores o que tem trazido melhorias na especificidade, sensibilidade, simplicidade e rapidez na execuo dos exames bacteriolgicos.

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Numerosos mtodos e tcnicas assegurando o isolamento de diferentes sorovares de Salmonella procedentes de distintas fontes, tm sido descritos. As frmulas incluem componentes que no s inibem o crescimento de certas espcies bacterianas, como tambm revelam uma variedade de caractersticas bioqumicas, que so importantes na identificao preliminar do microrganismo.

Particularmente, em relao aos alimentos, o isolamento de Salmonella representa um problema para os bacteriologistas em funo do baixo nmero de microrganismos presentes, associados a uma microbiota mista e numerosa, considerando-se ainda a complexa composio dos alimentos. Neste caso, as tcnicas de cultura convencionais envolvem as etapas subseqentes de pr-enriquecimento, enriquecimento seletivo e isolamento em meios seletivos -indicadores.

Por outro lado, no caso de espcimes clnicos, durante a fase aguda da doena, se um espcime apropriadamente obtido, procedimentos de enriquecimento no so requeridos pelo fato de que um grande nmero de clulas est presente. Contudo na forma crnica, ou mesmo, na identificao de portadores, caldos de enriquecimento seletivo e agar seletivo so necessrios.

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Esquema de Isolamento

Fezes (suspenso) Swab fecal/retal

Semeadura Direta Agar EMB

Agar MacConkey

Enriquecimento Caldo Selenito Cistina

Caldo Tetrationato Kauffmann Caldo Rappaport Vassiliadis*

Isolamento 5 -10 colnias: Meio de Triagem

Isolamento Agar Hektoen

Agar SS Agar XLD

Agar Sulfito Bismuto Agar Verde Brilhante

18/24h-37C *18/24h-43C

18/24h-37C

Caracterizao bioqumica

Identificao antignica

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8.1. Pr-Enriquecimento

Na etapa de pr-enriquecimento, o espcime enriquecido em um meio no seletivo para restaurar salmonelas injuriadas, a uma condio fisiolgica estvel. A gua peptonada a 1,0% tamponada e o caldo lactosado so comumente usados, mas outros meios tais como triptona de soja e caldo nutriente, podem ser empregados. O caldo lactosado pode eventualmente ser inconveniente como pr-enriquecimento quando utilizado em amostras que contm alta populao de microrganismos fermentadores da lactose, pois a subsequente reduo do pH do meio pode limitar a multiplicao de salmonelas, em particular das clulas injuriadas, no entanto a literatura aponta que Salmonella se multiplica a uma faixa ampla de pH (pH 3.8 9.5).

8.2. Enriquecimento Seletivo

O enriquecimento seletivo determina um aumento contnuo de Salmonella restringindo a proliferao de outras bactrias. Devido utilizao dos diferentes agentes inibitrios adicionados aos meios, estes tambm diferem em sua seletividade e aplicao especfica.

Diferentes tipos de inibidores tm sido propostos para enriquecimento seletivo de salmonelas, sendo a bile, o tetrationato, o selenito e corantes como o verde brilhante e o verde malaquita, os mais usados. Estes inibidores so incorporados aos meios, isolados ou em combinao.

Vrios meios de enriquecimento so conhecidos, destacando-se o Caldo Tetrationato, o Caldo Tetrationato-Verde Brilhante segundo MULLER-KAUFFMANN, Caldo Selenito, Caldo Gram-Negativo, Caldo Cloreto de Magnsio-Verde Malaquita segundo RAPPAPORT, o Caldo Rappaport-Vassiliadis, e variaes destes.

Caldo Tetrationato A seletividade do Caldo Tetrationato depende de sua capacidade de

restringir a multiplicao de coliformes. Sorovares de Salmonella (exceto

20



Choleraesuis, Typhisuis, Gallinarum e Pullorum) possuem a enzima tetrationato-redutase e, consequentemente, so capazes de multiplicar-se no meio. Porm, o desenvolvimento excessivo de Proteus, que tambm produz essa enzima, pode interferir na deteco de Salmonella. Neste caso, o Caldo Tetrationato - Verde Brilhante segundo Muller-Kauffmann contendo verde brilhante e bile, inibe a multiplicao de Proteus.

Caldo Selenito Um outro meio de enriquecimento, o Caldo Selenito vem sendo recomendado

para o enriquecimento de Salmonella em espcimes fecais, o qual vem sendo recomendado para o isolamento de S. Typhi e S. Paratyphi B, sendo tambm til para a deteco de outros sorovares de Salmonella, mesmo quando os microrganismos esto presentes em pequeno nmero. A adio de cistina melhora a qualidade do meio de cultura.

Caldo Rappaport. O Caldo Cloreto de Magnsio-Verde Malaquita (Caldo Rappaport) vem

demonstrando eficcia na deteco de Salmonella. A associao do cloreto de magnsio com um corante bacteriosttico (verde malaquita) veio a se constituir no meio de enriquecimento para a maioria dos sorovares de Salmonella, com exceo de S. Typhi. Posteriormente, uma modificao desse meio, resultante da diminuio da concentrao de verde malaquita e adotando-se a temperatura de 430C para incubao, o qual foi denominado meio de Rappaport-Vassiliadis, vem evidenciando maior eficincia quando da utilizao de pequenas quantidades de inculo, bem como por inibir totalmente os microrganismos competitivos.

Caldo Gram Negativo (Caldo GN) Este meio utilizado para o enriquecimento seletivo de bactrias Gram

negativas, particularmente Shigella e Salmonella, a partir de todo tipo de

21



espcimes clnicos. Devido concentrao relativamente baixa de desoxicolato, menos inibidor de Escherichia coli e outros coliformes, enquanto a maior concentrao de manitol em relao a glicose, limita o crescimento de Proteus e favorece o de Salmonella e Shigella, que so fermentadores do manitol.

Tabela 4. Caractersticas dos meios de enriquecimento seletivos

MEIOS

SUBSTNCIAS INIBIDORAS

BACTRIAS INIBIDAS

BACTRIAS FAVORECIDAS

Caldo

Selenito

Selenito de sdio

Coliformes

Salmonella sorovares Typhisuis, Choleraesuis,

Gallinarum, Pullorum

Salmonella spp.

Caldo GN

Citrato

Desoxicolato de sdio

Gram positivos,

Coliformes, Proteus

Maioria das

Enterobacteriaceae

Caldo

Rappaport

Cloreto de magnsio

Verde malaquita

Gram positivos, coliformes

S. Typhi Shigella

Salmonella spp.

Caldo

Tetrationato

Sais biliares

iodo

Gram positivos, coliformes

Salmonella sorovares Pullorum, Gallinarum,

Typhisuis, Choleraesuis, Typhi, Paratyphi

Salmonella spp.

8.3. Meios Seletivos-Indicadores

Alm dos meios de enriquecimento, tem-se a considerar no esquema de diagnstico das enterobactrias os chamados meios indicadores seletivos, de natureza slida, que desempenham uma funo primordial para o isolamento de diferentes membros desta famlia.

22



Todos estes meios contm um sistema diagnstico para permitir diferenciao de Salmonella com outras bactrias, em funo das diferenas em suas propriedades inibitrias e no aspecto macroscpico das colnias (Tabela 4).

Estes so comumente baseados na incapacidade da maioria das salmonelas para fermentar a lactose e, em alguns casos, outros substratos, tais como a sacarose e a salicina, bem como na capacidade de produo de sulfeto de hidrognio. Vrios meios, tais como o Agar Verde Brilhante, Agar Entrico Hektoen, Agar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), Agar Salmonella-Shigella (Agar SS) e Agar Sulfito de Bismuto, so amplamente usados nos mtodos padres para o isolamento de Salmonella. O Agar SS, XLD e Hektoen so relacionados mdia seletividade e incidncia de numerosas reaes falso-positivas, enquanto o Agar Sulfito de Bismuto e Verde Brilhante, apresentam alta seletividade. O Agar Sulfito de Bismuto altamente recomendado para o isolamento de S. Typhi, entretanto no deve ser utilizado se foi estocado por perodo superior a 2436 horas. Da mesma forma, tem demonstrado inibir outros sorovares de Salmonella a menos que seja refrigerado a 4oC por no mnimo 24 horas antes de uso. Meios de baixa seletividade tais como Agar Eosina Azul de Metileno e Agar MacConkey podero ser utilizados para o isolamento de Salmonella quando provenientes de material clnico, onde espera-se um maior nmero. Mais recentemente, novos meios de cultura que incorporam substncias cromognicas em sua frmula esto disponveis no mercado, os quais por serem seletivos e indicadores, permitem a diferenciao de Salmonella de outras bactrias, pelo desenvolvimento de cores caractersticas para cada gnero/grupo bacteriano. Dentre os meios cromognicos, destacam-se o Agar Rambach, Cromocen SC, CHROMagar Salmonella. O Agar Rambach vem sendo utilizado para identificar Salmonella em gneros alimentcios e amostras clnicas, permitindo a diferenciao com membros do gnero Proteus e outras bactrias entricas. Alm de um composto cromognico que indica a presena de -galactosidase, prpria dos coliformes, possibilita a

23



identificao de Salmonella por formar cido a partir do propilenoglicol que, em combinao com um indicador de pH, resulta em uma colorao vermelho carmin, caracterstica de suas colnias.

A presena de fragmentos de -galactosidase, caracterstica dos coliformes evidenciada pelo desenvolvimento de colnias azul-esverdeadas ou violeta-azuladas. Outras enterobactrias ou bactrias Gram-negativas, como por exemplo, Proteus, Pseudomonas, Shigella, S. Typhi e S. Paratyphi A apresentam colnias incolores.

CROMOCEN SC um meio para a deteco, isolamento, diferenciao e/ou contagem de Salmonella (exceto S. Typhi) e coliformes totais de outras bactrias Gram-negativas. O meio se baseia na combinao de uma reao cromognica para detectar a atividade -galactosidase e uma reao bioqumica de degradao de fontes de carbono que produzem uma diminuio do pH, com a conseqente alterao de cor do indicador includo na formulao. Salmonella (exceto S. Typhi) apresenta colnias com centro vermelho e bordas mais claras; coliformes (exceto Klebsiella e Citrobacter), colnias verde-azuladas e Klebsiella e Citrobacter, colnias violeta. As colnias incolores ou com pigmentao prpria, correspondem a outras bactrias Gram-negativas. CHROMagar Salmonella um meio seletivo e diferencial para o isolamento e identificao presuntiva de Salmonella spp. de outras bactrias coliformes e no coliformes em amostras fecais e de alimento. Colnias de Salmonella incluindo S. Typhi se caracterizam pela cor prpura, outras espcies bacterianas so inibidas, incolores ou azuis.

COLOREX Salmonella um meio cromognico para isolamento e diferenciao de Salmonella spp., incluindo S. Typhi, diretamente de espcimes clnicos e de alimento. Apresenta em sua composio uma mistura cromognica especial que permite diferenciar Salmonella de outras bactrias, com base na cor e morfologia das colnias alm de inibir bactrias Gram-positivas. Colnias de Salmonella se apresentam na cor prpura, E. coli e outros coliformes, azul-esverdeadas enquanto os microrganismos incapazes de hidrolizar o composto cromognico so incolores.

24



A recuperao de mltiplos sorovares de Salmonella em um espcime requer dois ou mais meios seletivos-indicadores, e a escolha de um deles, ou do esquema a ser utilizado para o isolamento e identificao deste microrganismo, , em grande parte, uma questo de preferncia pessoal. Portanto, na escolha do meio, deve-se levar em considerao o espcime a ser analisado e os sorovares usualmente detectados.

Salienta-se ainda que, a interao dos meios de enriquecimento e seletivos com a temperatura e tempo de incubao, seria fundamental para melhor isolamento desta bactria.

A prevalncia de Salmonella no ambiente natural e nos setores de alimentos tem realado a necessidade de procedimentos analticos mais rpidos e equivalentes em sensibilidade e especificidade, aos mtodos culturais comuns, os quais esto baseados em testes bioqumicos miniaturizados, novos meios de cultura, mtodos baseados em anticorpos e hibridizao de DNA . Apesar de vrios destes mtodos serem considerados rpidos, a maioria dos sistemas de deteco de Salmonella, ainda recorre aos mtodos culturais para ressuscitar clulas injuriadas e ampliar a populao de Salmonella em caldo de cultura. Desta forma, pr-enriquecimento, enriquecimento seletivo ou procedimentos ps-enriquecimento, ou alguma combinao destes, deve ser usada em conjunto com mtodos rpidos.

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8.4. Identificao Bioqumica Presuntiva (Meios de Triagem)

Uma vez selecionadas colnias sugestivas nos meios indicadores seletivos, estas sero transferidas para meios de triagem, tais como Agar Ferro-Acar Triplo (Agar TSI), Agar Ferro - Dois Aucares (Kligler KIA), Agar Lisina Ferro (LIA), Meio de Costa & Vernin (CV), Meio IAL (modificao do meio de Rugai e Arajo), Agar Motilidade-Indol-Lisina (MILi), Agar Motilidade-Indol-Ornitina (MIO) e Meio EPM, isolados ou em associao, os quais proporcionam uma caracterizao bioqumica presuntiva, indicando quais testes bioqumicos complementares so necessrios para identificar os microrganismos.

A associao do LIA, EPM, MIO ou Mili, com qualquer um dos demais meios de triagem indica a probabilidade de Salmonella que, aps complementao bioqumica ser submetida caracterizao antignica.

Agar Ferro - Acar Triplo (Agar TSI)

Este meio utilizado para diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentao de carboidratos (glicose - lactose - sacarose), produo de sulfeto de hidrognio e gs. Propicia a verificao da fermentao da glicose pela bactria, conferindo colorao amarela na base. Caso haja fermentao da lactose e/ou sacarose a colocao da parte superior do tubo ser o amarelo. Quando estes dois acares no so fermentados o pice permanece com a cor original (mbar). A produo de H2S indicada pela cor negra na base do tubo e a produo de gs, indicada pela formao de bolhas ou rachaduras no meio. Microrganismos como Proteus, Edwardsiella, Citrobacter e Salmonella podem apresentar o mesmo aspecto.

Agar Ferro - Dois Acares (Kligler Iron Agar - KIA)

Este meio apresenta as mesmas indicaes, leitura e interpretao do Agar TSI, porm com diferena na sua formulao por no conter sacarose.

24

27



Agar Lisina-Ferro (LIA)

um outro meio para identificao presuntiva de enterobactrias. A descarboxilao da lisina evidenciada pela colorao prpura (alcalina) da base que neutraliza o cido (amarelo) formado pela fermentao da glicose. A desaminao da lisina vista no pice (vermelho) e a produo de H2S (negro) na base do tubo.

Meio de Costa e Vernin (CV)

Este meio uma modificao do meio de Monteverde (Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 53:105,1955) e composto de uma camada semi-slida e outra slida, permitindo avaliar as seguintes reaes: indol (tampo de algodo), fermentao da lactose e sacarose, produo de gs, hidrlise da uria, produo de H2S o qual se forma na interface entre semi-slido e slido e motilidade. Permite identificao dos principais gneros de enterobactrias indicando a presena de bactrias no fermentadoras. O ataque lactose ou sacarose, ou ambas, com a produo de cido, torna o meio vermelho. A presena de um anel negro na base da camada slida indica produo de H2S; a turvao difusa ou no da parte semi-slida, revela a motilidade; a colorao azul, distribuda por todo o meio, identifica as bactrias produtoras de urease. Alm desses testes, o aparecimento de uma colorao rsea ou vermelha na tira de papel de filtro ou no algodo, caracteriza as bactrias produtoras de indol.

Meio IAL (INSTITUTO ADOLFO LUTZ)

Elaborado para triagem de enterobactrias; consiste de 9 provas em apenas um tubo de ensaio: indol (tampa), fermentao da sacarose e glicose, produo de gs, fenilalanina desaminase, hidrlise da uria, produo de H2S, descarboxilao da lisina e motilidade.

Este meio identifica os principais gneros de enterobactrias, indicando tambm a presena de bactrias no fermentadoras e Vibrio.

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Meio MIO (Motilidade- Indol Ornitina) Meio MILi (Motilidade Indol- Lisina)

Estes meios evidenciam a descarboxilao dos aminocidos ornitina ou lisina, a motilidade e a produo de indol. A motilidade interpretada pela difuso do microorganismo na zona da inoculao; a descarboxilao da ornitina ou lisina evidenciada pela colorao prpura (alcalina) da base, que neutraliza o cido (amarelo), formado pela fermentao da glicose. A produo de indol observada pela formao de um anel vermelho aps acrescentar 2-4 gotas do reativo de Kovacs superfcie do meio.

Meio EPM O meio EPM uma modificao do meio de Rugai e Arajo, evidenciando a produo de gs por fermentao da glicose, produo de H2S, hidrlise da uria e desaminao do triptofano.

Tabela 6. Caractersticas diferenciais entre Kligler Iron Agar, Triple Sugar Iron Agar e Lysine Iron Agar

Kligler Iron Agar Triple Sugar Iron Agar Lysine Iron Agar

29



Tabela 7. Caractersticas diferenciais de TSI , KIA, MIO, MILi e LIA

Fontes de aminocidos (desaminao)

peptona, extrato de carne

extrato de levedura


extrato de levedura

peptona extrato de levedura

lisina

aminocidos (descarboxilao) no no lisina

Fermentao de carboidratos

lactose (1%), glicose (0.1%)

lactose (1%), sacarose (1%) glicose (0.1%)

glicose (0.1%)

Indicador de pH vermelho de fenol cido = amarelo

alcalino = vermelho

vermelho de fenol cido = amarelo

alcalino = vermelho

bromocresol purpura:

acido = amarelo alcalino = prpura

Fonte para produo de H2S

tiossulfato de sdio tiossulfato de sdio tiossulfato de sdio

Indicador da produo de H2S

sulfato ferroso sulfato ferroso citrato de ferro amoniacal

TSI e KIA MIO/MILi LIA Fontes de aminocidos (desaminao)


extrato de levedura


ornitina ou lisina


lisina aminocidos (descarboxilao) no ornitina ou lisina lisina Fermentao de carboidratos

lac+sac+glic = TSI lac+ glic = KIA glicose (0,1%) glicose (0.1%)

Indicador de pH vermelho de fenol cido = amarelo

alcalino = vermelho





Fonte para produo de H2S tiossulfato de sdio no tiossulfato de sdio

Indicador de produo de H2S

sulfato ferroso no citrato de ferro amoniacal

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Tabela 8. Reaes nos meios de triagem TSI e KIA*

* Para a interpretao do Agar Kligler (KIA) no considerar a fermentao sobre a sacarose

Tabela 9. Reaes no Agar Lisina-Ferro (LIA)

LEITURA

INTERPRETAO

DIAGNSTICO PRESUNTIVO

Reao cida (amarelo) e gs na profundidade. Reao cida na superfcie. Ausncia de H2 S.

fermentao da glicose fermentao da lactose e/ou

sacarose, inclusive com produo de gs

Escherichia,Klebsiella Enterobacter

Providencia,Serratia

Reao cida e gs na profundidade. Superfcie alcalina (vermelha). Presena de H2S

fermentao da glicose sem ataque lactose e/ou sacarose

Salmonella, Edwardsiella

Citrobacter,Proteus

Reao cida sem gs na profundidade, superfcie alcalina. ausncia de H2S.

glicose fermentada apenas formando cido;

nenhuma ao sobre a lactose e sacarose

Shigella, Salmonella Proteus

Providencia,Serratia, Yersinia

Meio inteiramente cido com gs. Presena de H2S.

fermentao da glicose com gs; fermentao da glicose e/ou

sacarose

Citrobacter,Proteus

Meio inteiramente cido, sem gs. Ausncia de H2S

fermentao da glicose com formao de cido; fermentao da

lactose e/ou sacarose

Escherichia coli, Serratia

Microrganismos Base pice H2S

Salmonella Prpura Prpura + Proteus,Morganella Amarelo Prpura avermelhado +/-

Providencia Amarelo Prpura avermelhado - Citrobacter Amarelo Prpura + Escherichia Amarelo/ Prpura Prpura -

Shigella Amarelo Prpura - Klebsiella Prpura Prpura -

Exceo: S.Paratyphi A = base amarela/ pice prpura

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Tabela 10. Reaes observadas no meio de Costa e Vernin (CV)

Tabela 11. Interpretao do meio EPM

Base

Produo de gs

Formao de bolhas ou rachaduras no meio

Produo de H2S

Presena de pigmento negro de qualquer intensidade

Hidrlise da uria

Colorao azul-esverdeada (fraca) na base indica prova positiva

Superfcie

Desaminao do triptofano

Reao positiva: verde escuro ou acastanhado Reao negativa: superfcie inalterada

Leitura

Microrganismos

Meio inalterado, com certa alcalinidade no pice (esverdeado ou azulado). Presena de H2S; ausncia de gs; mvel ou imvel

Salmonella, Edwardsiella Citrobacter

Reaes idnticas s acima citadas, sem H2S Certos sorovares de Salmonella H2S

Meio inalterado no prazo de 24h, podendo se acidificar em perodos mais longos (fermentao lenta); ausncia de H2S; mvel ou imvel

Shigella Providencia

Meio inteiramente azul, com produo ou no de H2S; dificuldade na leitura da mobilidade.

Proteus

Camada slida azul e amarelo-azulado na poro semi-slida (ataque sacarose). Presena de H2S.

Proteus vulgaris

Meio totalmente vermelho, por vezes podendo apresentar reas amareladas (reduo); grande produo de gs. Ausncia de H2S. Mobilidade presente ou no. pice do meio slido com discreta alcalinidade na Tribo Klebsielleae.

Escherichia Enterobacter

Klebsiella Serratia (meio sem gs)

Meio com discreta acidez na profundidade, ligeira alcalinizao na superfcie. Presena de H2S, Mvel

Citrobacter

Meio inalterado com 24 h; pequena alcalinizao na superfcie, acentuando-se aps 48 h. Forte tonalidade azul-esverdeada na superfcie. Ausncia ou discreto crescimento no meio semi-slido.

Pseudomonas

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8.5. Caracterizao Bioqumica Complementar

Embora seja possvel uma identificao preliminar com base nas caractersticas das colnias e reaes bioqumicas, nos diferentes meios indicadores seletivos e de triagem, a identificao de membros da famlia Enterobacteriaceae requer a utilizao de provas bioqumicas complementares, Como provas preliminares destacam-se a deteco da produo de citocromo-oxidase e a reduo do nitrato para a incluso nesta famlia. Alm destas, dispe-se de uma variedade de provas diferenciais complementares, destacando-se entre outras, aquelas amplamente utilizadas em laboratrios clnicos, as quais permitem avaliar as caractersticas metablicas, contribuindo para a identificao posterior dos gneros/espcies.

Estas caractersticas so: fermentao de carboidratos, produo de indol, reao de vermelho de metila, produo de acetil-metil-carbinol, utilizao de citrato, produo de urease, descarboxilao de aminocidos, produo de sulfeto de hidrognio e motilidade.

Citocromo-Oxidase Os citocromos so hemoprotenas que contm ferro e funcionam como a ltima ligao da cadeia respiratria aerbica, transferindo eletrons (hidrognio) ao oxignio com a formao de gua. O sistema citocromo encontrado nos organismos aerbios ou microaerbios e anaerbios facultativos. Portanto, o teste da oxidase importante na identificao de microrganismos que no possuem a enzima ou so anaerbios obrigatrios. O teste muito til em estudos preliminares para diferenciao de Enterobacteriaceae (negativas, exceto Plesiomonas shigelloides) de outras enterobactrias como, por exemplo, Aeromonas, Pseudomonas e Vibrio (positivas). A prova de citocromo-oxidase utiliza certos reativos corantes, como o dicloridrato de p-fenilenodiamina ou oxalato de p-amino-dimetil-anilina, que atuam como aceptores artificiais de eletrons, substituindo o oxignio. Estes so incolores no estado reduzido, mas na presena de citocromo-oxidase e oxignio atmosfrico se oxidam formando um produto de tonalidade azul ou rosa, respectivamente.

33



Reduo de Nitratos A capacidade de um microrganismo reduzir nitrato a nitrito uma caracterstica importante utilizada na identificao e diferenciao de espcies de muitos grupos de microrganismos. Todas as enterobactrias, exceto certos biotipos de Panthoea agglomerans e Erwinia, reduzem nitratos. Os microrganismos que reduzem nitratos tm a capacidade de retirar oxignio destes para formar nitritos e outros produtos de reduo. A presena de nitritos no meio teste evidenciada pela cor vermelha aps adio de dois reagentes: soluo A (cido sulfanlico - 0,8g, cido actico 30 mL, gua destilada 75 mL) e soluo B (alfa-naftilamina 0,5g, cido actico 30 mL, gua destilada - 75mL).

Pesquisa da produo de indol Indol um dos produtos metablicos de degradao do aminocido triptofano. As bactrias que possuem a enzima triptofanase so capazes de

hidrolisar e desaminar o triptofano com produo de indol, cido pirvico e amnia. A prova est baseada na formao de um complexo de cor vermelha quando o indol reage com o grupo aldedo do p-dimetilaminobenzaldedo (reativos de Kovacs ou Ehrlich). Deve-se usar um meio rico em triptofano.

Prova do Vermelho de Metila Esta prova uma anlise quantitativa de produo de cidos fortes (ltico, actico, frmico) a partir da glicose atravs da via da fermentao cida mista. Visto que muitas espcies de enterobactrias podem produzir quantidades suficientes de cidos fortes detectveis pelo indicador vermelho de metila durante as fases iniciais da incubao, somente os organismos que podem manter este pH baixo aps incubao prolongada (48 a 72 h) superando o sistema estabilizador de pH do meio, que podem ser chamados de vermelho de metila positivos.

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Prova de Voges-Proskauer O cido pirvico, composto principal formado pela degradao fermentativa da glicose, metabolizado atravs de vrias vias, de acordo com os sistemas enzimticos que possuem as diferentes bactrias. Uma destas vias leva produo de acetona (acetil-metil-carbinol), um subproduto inativo. Os organismos tais como membros do grupo Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia produzem acetona como principal subproduto do metabolismo da glicose e formam quantidades menores de cidos mistos. Na presena de oxignio atmosfrico e de hidrxido de potssio a 40%, a acetona convertida em diacetila e o alfa-naftol atua como catalizador para revelar um complexo de cor vermelha.

Reaes no VM e VP

Glicose

cido pirvico

Acetilmetilcarbinol Fermentao cida mista (Acetona) pH < 4,4

VM + Butilenoglicol Diacetila KOH + Ar

Alfa-naftol

Complexo vermelho = VP +

Utilizao do Citrato O citrato de sdio um sal de cido ctrico, um composto orgnico simples

que constitui um dos metablitos do ciclo dos cidos tricarboxlicos (Ciclo de Krebs). Algumas bactrias podem obter energia por via diferente da fermentao de carboidratos, utilizando citrato como nica fonte de carbono. A avaliao desta caracterstica importante na identificao de muitos membros da famlia Enterobacteriaceae. Qualquer meio utilizado para detectar utilizao de citrato

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pelas bactrias deve ser isento de protenas e carboidratos como fontes de carbono. O meio contm citrato de sdio, um nion, como nica fonte de carbono e

fosfato de amnia como nica fonte de nitrognio. As bactrias capazes de utilizar o citrato tambm so capazes de extrair nitrognio do sal de amnio, levando alcalinizao do meio a partir da converso do NH3 em hidrxido de amnia (NH4OH). Como indicador utilizado o azul de bromotimol, que na presena de reao positiva ocorre a viragem para um pH acima de 7,6, sendo evidenciado pela tonalidade azul do meio.

Hidrlise da Uria A urease uma enzima presente em muitas espcies de microrganismos que

podem hidrolisar a uria. A uria uma diamina do cido carbnico; todas as aminas so facilmente hidrolisadas com liberao de amnia e dixido de carbono. A amnia reage em soluo para formar carbonato de amnio resultando na alcalinizao e aumento do pH do meio.

So utilizados dois meios para a deteco de urease, o Caldo Uria de Stuart e o Agar Uria de Christensen. O caldo de Stuart fortemente tamponado com sais de fosfato a um pH 6,8. O organismo em estudo deve produzir quantidades relativamente grandes de amnia para superar o sistema e elevar suficientemente o pH do meio para produzir uma viragem do indicador (acima de 8,0), sendo seletivo para espcies de Proteus. O Agar Uria de Christensen possui um sistema tampo muito mais fraco, permitindo detectar produes menores de amnia sendo, portanto apropriado para a anlise de bactrias que apresentam formao escassa de urease ativa.

Produo de sulfeto de hidrognio Capacidade de certas espcies de bactrias para liberar enxofre na forma de H2S a partir de aminocidos ou de outros compostos. A produo de H2S pode ser detectada em um sistema analtico se as seguintes condies estiverem presentes: liberao de sulfeto a partir da cistena ou do tiossulfato por ao enzimtica bacteriana; acoplamento do sulfeto com o on hidrognio para formar

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H2S; deteco do H2S pelos sais de metais pesados tais como ferro, bismuto ou chumbo, na forma de sulfeto de metal pesado, um precipitado negro.

H2S + metal pesado = sulfeto = precipitado negro

Descarboxilases As descarboxilases representam um grupo de enzimas substrato-especficas, capazes de atuar sobre a poro carboxla dos aminocidos, formando aminas de reao alcalina. Lisina, Arginina e Ornitina so os trs aminocidos habitualmente avaliados na identificao das enterobactrias e produzem as seguintes aminas especficas: Lisina cadaverina Ornitina putrescina Arginina citrulina Na converso de arginina para citrulina intervm uma desidrolase ao invs de uma descarboxilase, visto que na primeira etapa, o NH2 retirado da arginina. Em seqncia, a citrulina transformada em ornitina que em seguida sofre descarboxilao para formar putrescina. Durante os perodos iniciais da incubao o meio torna-se amarelo devido fermentao da pequena quantidade de glicose presente. Se o aminocido for descarboxilado, formam-se aminas alcalinas e o meio volta cor prpura original.

Fenilalanina desaminase A fenilalanina um aminocido que por desaminao forma um cetocido, o cido fenilpirvico. Entre os membros da famlia Enterobacteriaceae, somente espcies dos gneros Proteus, Morganella e Providencia possuem a enzima desaminase, necessria para esta converso. A prova da fenilalanina baseia-se na deteco de cido fenilpirvico no meio, aps o crescimento do organismo teste. A prova positiva quando aparece uma cor verde, visvel aps a adio de uma soluo de cloreto frrico a 10%.

Fenilalanina desaminao__ cido fenil pirvico Cloreto frrico 10%

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Fermentao de carboidratos Fermentao um processo metablico de oxidao - reduo que tem lugar em um ambiente anaerbico, no qual um substrato orgnico serve como aceptor de hidrognio (eltron) em lugar do oxignio. Nos sistemas de provas bacteriolgicas este processo detectado por observao da mudana de cor dos indicadores de pH quando os produtos cidos so formados. A fermentao dos carboidratos produz cido, ou cido e gs. A produo de gs (dixido de carbono e hidrognio) se detecta pelo acmulo de gs em um tubo de vidro (tubo de Duhram) invertido no meio.

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Tabela 12. Comportamento de Salmonella spp. nas diferentes provas bioqumicas

Meios Reaes

TSI/KIA Reao cida e gs na profundidade. Superfcie alcalina (vermelha). Presena de H2S Reao cida sem gs na profundidade, superfcie alcalina. Discreta produo

ou ausncia de H2S. LIA Base e pice cor prpura, presena de H2S (Exceo: S.Paratyphi A = base amarela/ pice prpura)

Reaes idnticas s acima citadas, sem H2S

CV Meio inalterado, com certa alcalinidade no pice (esverdeado ou azulado). Presena de H2S na interfase slida/semi-slida; ausncia de gs; mvel ou imvel

Reaes idnticas s acima citadas, sem H2S

URIA REAO NEGATIVA no h viragem do pH

Lisina Descarboxilase

LDC

Positivo:Reao alcalina (cor prpura do meio) e amarelo no meio controle. (exceo S. Paratyphi)

Ornitina Descarboxilase

ODC

Positivo: Reao alcalina (cor prpura do meio) e amarelo no meio controle (exceo S. Gallinarum ODC negativo)

Vermelho de Metila (VM)

Colorao vermelha do meio aps adio do reagente

Voges-Proskauer (VP)

Meio sem alterao aps adio dos reagentes

Fenilalanina desaminase

(FD)

Meio inalterado aps colocao do reagente

Utilizao do Citrato

Positivo: Reao alcalina cor azul do meio

Meio SIM Indol Negativo anel amarelo aps colocao do reagente Kovacs

H2S Presena de pigmento negro de qualquer intensidade ou somente na picada (cepas imveis) Motilidade Crescimento ao longo da picada (imvel) ou turvao do meio (mvel)

Fermentao de aucares Glicose Positivo (reao cida) com/sem gs no tubo de Durhan Lactose Negativo Manitol Positivo

Sacarose Negativo

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Tabela 13. Percentuais de positividade/negatividade nas provas bioqumicas para Salmonella spp.

Provas1

Reao Positiva ou negativa

Percentual de isolamento de Salmonella que

apresentam esta reao2 TSI glicose (cido) + 100 TSI glicose (gs) + 91,93

TSI lactose - 99,24

TSI sacarose - 99,5

TSI H2S + 91,6

LIA + 98

SIM (H2S) + 97 SIM (indol) - 98,9 SIM (motilidade) + 97 Hidrlise da uria - 99

Lisina descarboxilase + 94,65

Ornitina descarboxilase + 97

Reao de Voges-Proskauer - 100

Reao do Indol - 98,9 1.

Ewing, W.H. & Ball, M.M. The biochemical reactions of members of the genus Salmonella.NationalCommunicable Disease Center. Atlanta, Georgia,USA.1966. 2. Estes percentuais indicam que nem todas as cepas apresentam as reaes marcadas como + ou

_.

3. Salmonella Typhi anaerognica

4. Salmonella enterica susp.arizonae d reaes + ou para lactose, porm sempre -galactosidase

positiva; Salmonella enterica susp.salamae d reao para lactose e para -galactosidase.

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Tabela 14. Caractersiticas bioqumicas diferenciais de Salmonella spp. , Proteus spp., Citrobacter spp. e Edwardsiella tarda.

Citr

oba

cte

r fre

un

dii

Ciro

bact

er

diver

sus

Citr

oba

cte

r am

alo

nat

icu

s

Edw

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iella

tard

a

Pro

teu

s m

irabi

lis

Pro

teu

s vu

lgar

sis

Salm

on

ella

spp.

Salm

on

ella

Typh

i

Glicose (gs) +/- + + + + +/- + - Fermentao Manitol + + + - - - + +

Lactose +/- +/- -/+ - - - - - Sacarose +/- -/+ -/+ - -/+ + - -

Dulcitol -/+ -/+ - - - - + - ONPG +/- + + - - - - - Vermelho Metila + + + + + + + + Voges Proskauer

- - - - +/- - - -

Indol -/+ + + + - + - - Citrato Simmons

+/- + + - +/- -/+ + -

Acetato -/+ +/- +/- - -/+ -/+ + - Malonato -/+ + - - - - - - H2S +/- - -/+ + + + + + Mobilidade +/- + + + + + + + Hidrlise da uria

-/+ +/- +/- - + + - -

Fenilalanina desaminase

- - - - + + - -

Lisina descarboxilase

- - - + - - + +

Arginina dehidrolase

+/- +/- +/- - - - +/- -

Ornitina descarboxilase

- + + + + - + -

KCN +/- - + - + + - - + : positivo; - : negativo

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Tabela 15. Diferenciao bioqumica entre S. enterica subsp. enterica, Citrobacter sp. e Edwardsiella tarda

Tabela 16. Diferenciao entre Citrobacter freundii e Salmonella arizonae e S.diarizonae

LDC Glicerol Malonato ODC Gelatinase Citrobacter freundii - + - - - Salmonella arizonae + - + + + (lenta) Salmonella diarizonae + - + + + (lenta) LDC: lisina descarboxilase; ODC: ornitina descarboxilase

Tabela 17. Diferenciao entre Salmonella Paratyphi C e Salmonella Choleraesuis

Dulcitol H 2 S Mucato S. Paratyphi C (Vi + ou Vi-) + + - S.Choleraesuis - - - S.Choleraesuis var. Kunzendorf - + -

S. Paratyphi C essencialmente adaptada ao homem S.Choleraesuis possui caracterstica ubiquitria

S. enterica sub. enterica

Citrobacter freundii

Citrobacter diversus

Edwardsiella tarda

Descarboxilao: Lisina

+

-

-

+

Ornitina

+

[-]

+

[+]

Indol

-

-

+

+

Citrato Simmons

+

+

+

-

H2S

+/

[+]

-

+

Urease

-

+/-

+/-

-

KCN

-

+

+

-

ONPG

-

+

-

-

+ : positivo; - : negativo; [+] : 76 a 89% positivo; [-] : 11 a 25% negativo.

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9. Aspectos Gerais sobre os Antgenos das Enterobactrias

Antgenos comuns: Todas as espcies da famlia Enterobacteriaceae apresentam um antgeno comum, tambm designado de antgeno de Kunin. Sua presena usualmente no avaliada tendo em vista que no representa um critrio relevante para a diferenciao entre gneros ou espcies.

Antgeno de parede ou antgeno O (Ohne): composio lipopolissacaridica (hexosamina (3.5 a 4.5%), complexo fosfolipdico (20 a 30%), polissacardeos (60%). termoestvel (1hora a 100oC), no sendo destrudo pelo lcool etlico a 50oGL. A aglutinao das clulas bacterianas pelo antissoro especfico, apresenta como caractersticas ser lenta, formar grnulos finos no dissociveis pela agitao, tendo em vista que a reao ocorre pela interrelao entre a parede celular das clulas bacterianas. Este antgeno composto de trs partes:

Poro lipdica, a qual responsvel pela toxicidade e caractersticas pirognicas;

Poro basal ou core; Polissacardeo, caracterstico da especificidade somtica das formas lisas (S).

constitudo de cadeias repetitivas, cujo arranjo espacial confere natureza definida. Esta, aliada ao tipo de ligao, determinam a especificidade dos antgenos O .

Cepas em fase lisa (S-Smooth) apresentam colnias com superfcies homogneas, brilhantes, bordos regulares indicativos de antgeno O completo. A ocorrncia de mutao que afete sua poro basal, ou na sntese de sua cadeia resulta na perda da especificidade do antgeno. So designadas rugosas R (Rough) de superfcie e bordos irregulares. So autoaglutinveis em soluo salina, facilmente fagocitveis e sensveis a ao do complemento e como conseqncia, perdem sua capacidade patognica.

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Antgeno flagelar ou antgeno H (Hauch): Esto presentes nas enterobactrias mveis, sua composio protica, designada flagelina. As diferenas antignicas surgem devido a variaes na estrutura primria (contendo aminocidos) das diferentes molculas de flagelina.

A estrutura flagelar possui como uma caracterstica importante de termolabilidade podendo ser destrudos a 100oC, bem como aps ao lenta do lcool 50oGL, sendo resistentes soluo de formol a 0,5%.

Anticorpos flagelares se fixam aos flagelos, cuja aglutinao apresenta como caracterstica, a formao de grumos espessos que se dissociam rapidamente atravs de agitao. Esta ocorre em tempo mais rpido do que aglutinao somtica, devido ao nmero existente na clula se apresentar mais elevado, quando comparado aglutinao somtica (entre as clulas bacterianas).

O arranjo espacial e caractersticas intrnsecas ao gnero possibilitam a produo de dois tipos de flagelos distintos. Em uma populao bacteriana de uma cepa de Salmonella spp, que produza dois tipos distintos de flagelo, a freqncia de variao de clulas que apresentam um dos tipos ou fases na ordem de 104.

Antgeno de superfcie ou envoltrio Vi (Flix & Pitt): apresenta sua localizao espacial externa, a qual impede a deteco do antgeno somtico. Usualmente encontra-se presente em cepas de S.Typhi isoladas de pacientes, podendo tambm ser detectados em S.Paratyphi C e S. Dublin. So termolbeis podendo ser destrudos atravs do aquecimento da suspenso a 100oC por 10-15 minutos. Apresenta como relevncia, a possibilidade de uso como ferramenta epidemiolgica atravs de um conjunto de preparados fgicos.

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Caracterizao Antignica de Salmonella: A sorotipificao constitui uma importante ferramenta epidemiolgica complementar na identificao de Salmonella permitindo determinar a prevalncia/emergncia ou apontar tendncias de um sorovar em distintas zonas geogrficas, bem como identificar surtos, conhecer as fontes de infeco e vias de transmisso.

A identificao dos sorovares definida pelo esquema de Kauffmann & White, (Poppof & LeMinor, 2001) e envolve a identificao dos antgenos somticos e flagelares.

Esquema de Kauffmann-White

Baseado nos componentes antignicos somticos O e flagelares H foi estabelecido o esquema denominado Kauffmann-White, este contm informaes quanto as espcies, sub-espcies e apresenta listadas as frmulas antignicas de todos os sorovares. Sua editorao efetuada pelo Centro Colaborador para referncia e pesquisa em Salmonella da Organizao Mundial de Sade (Instituto Pasteur-Paris), sendo revisado anualmente quanto caracterizao de novos soravares e a editorao completa desta listagem efetivada a cada cinco anos.

Apresenta-se representado sob a forma de tabela, contendo o conjunto das caractersticas antignicas, compreende na 1a coluna a estrutura somtica, cujos sorovares que apresentam tais caractersticas so identificados por letras maisculas. Ex. grupo A(O:2), grupo B(O:4); grupo C1(O:6,7), grupo C2 (O:6,8,20), grupo D (O:9), grupo E1 (O:3,10), grupo E2 (O:3,15), grupo E4 (O:1,3,19),etc.

A 2a e 3a colunas apresentam suas estruturas flagelares, indicadas por letras minsculas (fase 1) e a fase 2, representada por nmeros arbicos, alm de letras minsculas.. Exemplos: S.Typhimurium: 1,4,[5],12: i : 1,2 S.Enteritidis: 1,9,12: g,m: - S.Typhi: 1,9,12,[Vi]: d: - S. Agona: 1,4,12:f,g,s:- S. Paratyphi: 1, 2,12:a:- S.Saintpaul: 1, 4, 5, 12:e,h:1,2

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Em relao aos antgenos O e H, alguns aspectos que devem ser considerados:

Antgeno O: Fatores que identificam o grupo antignico por exemplo, o fator O:4, o fator O:9. Aqueles que tem pouco ou nenhum valor discriminatrio estando associados a

outros fatores, por exemplo O:12, associado com O:2, O:4 e O:9 como ocorre com S. Paratyphi A (O:1,2,12), S.Typhimurium (O:1,4,5,12) e S. Enteritidis (O:1,9,12).

Aqueles que surgem como conseqncia de uma modificao da estrutura dos antgenos, por exemplo: O:5 resultante de uma reao de acetilao presente nas unidades repetidas do polissacardeo responsvel pela especificidade O:4,12; O:1 resulta da insero de uma cadeia de galactose no polissacardeo como o caso do sorovar S. Typhimurium O:1,4,5,12.

Antgenos H Alguns sorovares de Salmonella dispem de apenas uma fase flagelar,

i.e. monofsicas como S. Enteritidis (9,12:g,m:-), S.Typhi (9,12 [VI]:d:-), porm a grande maioria dos sorogrupos apresentam duas fases flagelares ou seja so cepas difsicas como por exemplo S.Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) e S.Hadar (6,8:z10:e,n,x) que expressam a fase 1 (antgenos i ou z10) e fase 2 (antgenos 1,2 e e,n,x respectivamente), contudo tambm so reconhecidas cepas desprovidas de flagelos (imveis).

Identificao antignica Alguns sorovares apresentam caractersticas bioqumicas, as quais

associadas ao quadro clnico do paciente possibilitam orientar com maior facilidade sua caracterizao, entretanto faz-se obrigatria em todos os casos a caracterizao antignica empregando os antissoros especficos.

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Ex. Salmonella Typhi: ausncia de gs em glicose, produo reduzida de H2S, lisina descarboxilase positiva, ornitina descarboxilase e uso do citrato de Simmons como fonte nica de carbono, negativas. Salmonella Paratyphi A: produo de gs em glicose, ornitina descarboxilase positiva, produo de H2S, lisina descarboxilase e uso do citrato de Simmons como fonte nica de carbono negativas.

Principais cuidados: Nunca utilizar crescimento a partir de meios de cultura que contenham

carboidratos; Semear preferentemente a cepa em tubo 13x100 contendo Agar Nutriente

inclinado, envasado com bizel longo (4 a 5 cm); Preparar uma suspenso utilizando soluo salina (0.85% NaCl); A suspenso dever apresentar turbidez correspondente ao tubo 3 da escala

de MacFarland. Usualmente o volume de soluo salina adicionada ao tubo contendo Agar nutriente inclinado aproximadamente 1,5mL.

Realizar o teste somente a partir de cultivos recentes (mximo de 18-24h de crescimento a 37C);

Para efetuar avaliao em amostras com antgeno de envoltrio, efetuar a retirada, atravs do aquecimento da suspenso em banho-maria (100C por 15 minutos);

Observar se a suspenso apresenta-se homognea antes de realizar o teste, certificando-se que esteja em sua forma lisa.

Execuo do teste de soroaglutinao rpida:

Semear a cepa isolada em agar nutriente inclinado; Incubar a 37o C por 18-24 horas; Preparar suspenso adicionando soluo salina (0,85%); Homogeneizar a suspenso;

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Em uma lmina de vidro adicionar uma gota (10l) de antissoro polivalente e uma gota da suspenso bacteriana, homogeneizando com o auxlio de uma ala utilizada dentro dos procedimentos de rotina;

Impelir movimentos rotatrios e observar at o perodo de um minuto em caixa de Huddleson a presena de aglutinao (grumos finos);

Em seqncia repetir o procedimento empregando antissoros somticos especficos (grumos finos - somticos);

Para a caracterizao dos antgenos flagelares (grumos espessos) necessrio que o laboratrio possua antissoros que permitam fazer a diferenciao entre sorovares com estrutura comum. Ex. Hg,m; Hg,p; Hg,q; Hg,m,s; Hf,g,s; Hg,z51; Hg,z62 , etc

Particularmente no diagnstico de Salmonella Typhi, empregar inicialmente o antissoro Vi para caracterizao do antgeno de envoltrio. Caso a reao seja positiva, aquecer a suspenso em banho-maria (15 minutos a 100oC) reavaliando com antissoro Vi. Caso no seja observada aglutinao, confirmar a estrutura somtica atravs do antissoro OD;

A identificao conclusiva de S.Typhi dever ser efetivada atravs da caracterizao do antgeno flagelar Hd;

Variaes que afetam a Tipagem Antignica em Salmonella spp.:

Variao Capsular (V-W): fenotpica Impede aglutinao somtica; Utilizada em avaliao epidemiolgica (lisotipia em Salmonella Typhi); Quando as cepas apresentarem aglutinao com antissoro Vi, a suspenso

bacteriana deve ser submetida ao aquecimento em banho-maria (100oC-15 minutos) e em seqncia reavaliadas para confirmar a eliminao desta estrutura.

Variao da estrutura somtica (S-R): genotpica Apresenta como caracterstica fundamental ser de natureza genotpica. Determina alteraes quanto morfologia colonial.

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Usualmente apresenta ausncia de estabilidade em soluo salina. Sua ocorrncia impede o diagnstico antignico tendo em vista que determina

reaes inespecficas ou cruzadas.

Variao flagelar (OH-O): fenotpica Permitem a formao de grandes flocos que se dissolvem com agitao; Importantes na caracterizao conclusiva dos sorovares de Salmonella spp; Apresentam natureza fenotpica. Quando da perda de uma de suas fases,

podem ser, na maioria das vezes, recuperados utilizando o meio de Craigie (agar semi-slido -0,5%):

Variaes mediadas por fagos: Presena de fagos temperados: grupos A, B, D de Salmonella spp. Converso lisognica: frao 12 (Salmonella spp.)

10. Controle de Qualidade de Meios de Cultura, Reagentes e Equipamentos.

1. Principais aspectos quanto manuteno: Somente devem ser recebidos meios de cultura, adquiridos atravs de

compra, cujo prazo de validade seja seis meses da data de recebimento; Apertar todas as tampas dos frascos; Observar prazo mximo de estocagem; Registrar quantitativo em estoque, recepo e sada; Nenhum meio de cultura pode ser utilizado aps a data de vencimento: a

revalidao somente pode ser efetuada pelo fabricante.

Semear a cepa

Adicionar antissoro de fase

conhecida

Repicar cepa e caracterizar fase

desconhecida

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2. Estocagem dos meios de cultura Proteger da luz solar e calor; Manter em rea com ventilao.

3. Preparo dos meios de cultura: Seguir obrigatoriamente as instrues do fabricante; Preparar a quantidade mnima, suficiente para o uso; Observar o tempo de validade de meios preparados, estocados sob

condies adequadas.

Durao mxima de meios de cultura

Meio de cultura 4C 4C Embalagem plstica

Agar sangue 15 dias 50 dias Agar

manual salmonella gss 2008 doc

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