Diagnóstico Laboratorial da Salmonella spp. ?· Manual Técnico de Diagnóstico Laboratorial da Salmonella…

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  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da

    Salmonella spp.

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    MINISTRIO DA SADE

    Braslia DF2011

    Disque Sade

    0800.61.1997

    Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade

    www.saude.gov.br/bvs

    Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade

    www.saude.gov.br/svs

    Ministrio daSade

    Secretaria deVigilncia em Sade

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da

    Salmonella spp.

    MINISTRIO DA SADESecretaria de Vigilncia em SadeDepartamento de Apoio Gesto de Vigilncia em Sade

    Braslia DF2011

    Diagnstico Laboratorial do Gnero Salmonella

    Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

  • 2011 Ministrio da Sade.Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea tcnica. A coleo institucional do Ministrio da Sade pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade: http://www.saude.gov.br/bvs

    Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

    Tiragem: 1 edio 2011 1.000 exemplares

    Elaborao, distribuio e informaes:MINISTRIO DA SADE Secretaria de Vigilncia em SadeDepartamento de Apoio Gesto de Vigilncia em Sade Coordenao-Geral de Laboratrios de Sade Pblica Setor Comercial Sul, Quadra 4, Bloco A, Edifcio Principal, 3 andarCEP: 70304-000, Braslia DFE-mail: svs@saude.gov.brHome page: www.saude.gov.br/svs

    CoordenaoLcia Helena Berto CGLAB/SVS/MS

    Equipe de elaboraoEsta publicao foi elaborada por um grupo de profssio-nais pesquisadores, tcnicos de bancada do Laboratrio de Referncia Nacional de Enteroinfeces Bacterianas do Instituto Oswaldo Cruz IOC/Fundao Oswaldo Cruz Fiocruz/RJ e do Instituto Adolfo Lutz IAL/SP.

    Equipe de Reviso Tcnica:Dalia dos Prazeres RodriguesMiyoko Jakabi

    Equipe de Elaborao:

    Laboratrio de Referncia Nacional de Enteroin-feces Bacterianas/IOC/Fiocruz

    Dalia dos Prazeres RodriguesEliane Moura Falavina dos ReisNorma dos Santos LzaroRenata Garcia Costa

    Instituto Adolfo Lutz

    Miyoko JakabiHarumi Sakuma

    Produo Editorial:

    Capa: NJOBS Comunicao (Eduardo Grisoni) Projeto grfico: NJOBS Comunicao (Eduardo Grisoni) Diagramao: NJOBS Comunicao (Marlia Assis) Reviso: NJOBS Comunicao (Ana Cristina Vilela e Fernanda Gomes)Normalizao: NJOBS Comunicao (Ana Cristina Vilela e Fernanda Gomes) e Editora MS (Mrcia Cristina Tomaz de Aquino)

    Impresso no Brasil / Printed in Brazil

    Ficha Catalogrfica_____________________________________________________________________________________________________________

    Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade.Manual tcnico de diagnstico laboratorial de Salmonella spp.: diagnstico laboratorial do gnero Salmonella /

    Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade, Fundao Oswaldo Cruz. Laboratrio de Referncia Nacional de Enteroinfeces Bacterianas, Instituto Adolfo Lutz. Braslia : Ministrio da Sade, 2011.

    60 p. : il. (Srie A. Normas e manuais tcnicos)

    ISBN 978-85-334-1792-2

    1. Anlise bacteriolgica. 2. Diagnstico. 3. Intoxicao alimentar. I. Fundao Oswaldo Cruz. II. Laboratrio de Referncia Nacional de Enteroinfeces Bacterianas (Brasil). III. Instituto Adolfo Lutz. IV. Ttulo. V. Srie.

    CDU 616-074:613.2.099_____________________________________________________________________________________________________________

    Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2011/0096

    Ttulos para indexao:Em ingls: Technical manual of laboratorial diagnostic from Salmonella spp.: laboratorial diagnosis of Salmonella genre.Em espanhol: Manual tcnico de diagnstico de laboratorio de Salmonella spp.: diagnstico de laboratorio del gnero Salmonella.

  • QUADROS

    Quadro 1 Distribuio do nmero de sorovares de acordo com espcie e subespcie de Salmonella

    Quadro 2 Caracterizao fenotpica das espcies e subespcies de Salmonella spp.

    Quadro 3 Diferenciao bioqumica entre S. Typhi, S. Paratyphi A e sorovares de S. enterica subsp. enterica mais frequentes

    Quadro 4 Procedimentos de isolamento de Salmonella spp. aprovados por diferentes rgos reguladores

    Quadro 5 Confirmao de Salmonella spp. em alimentos ISO 6579:2007

    Quadro 6 Avaliao de Salmonella spp. em alimentos MLG/FSIS, 2004

    Quadro 7 Caractersticas dos meios de enriquecimento seletivos

    Quadro 8 Caractersticas dos meios seletivos indicadores

    Quadro 9 Caractersticas diferenciais dos meios TSI, KIA, MIO, MILi e LIA

    Quadro 10 Reaes nos meios de triagem TSI e KIA

    Quadro 11 Reaes no gar Lisina-Ferro LIA

    Quadro 12 Reaes observadas no meio de Costa e Vernin CV

    Quadro 13 Interpretao do meio EPM

    Quadro 14 Caractersticas bioqumicas de Salmonella spp.

    Quadro 15 Percentuais de positividade de Salmonella spp. nas provas bioqumicas

    Quadro 16 Caractersticas bioqumicas diferenciais de Salmonella spp., Proteus spp. , Citrobacter spp. e Edwardsiella tarda

    Quadro 17 Diferenciao bioqumica entre S. enterica subespcie enterica, Citrobacter spp. e Edwardsiella tarda

    Quadro 18 Diferenciao entre Citrobacter freundii e Salmonella arizonae e S. diarizonae

    Quadro 19 Diferenciao entre Salmonella Paratyphi C e S. Choleraesuis

    Quadro 20 Durao mxima de meios de cultura: envase em placas de Petri

    Quadro 21 Durao mxima de meios de cultura: envase em tubos

    Quadro 22 Durao mxima de meios de cultura: meio lquido em tubos

  • 4

    Sumrio

    1 Taxonomia 5

    2 Caractersticas Gerais 7

    3 Habitat 9

    4 Ecologia 10

    5 Caractersticas Clnicas e Patogenia 11

    6 Epidemiologia 14

    7 Diagnstico Laboratorial 16

    8 Aspectos Gerais Antgenos das Enterobactrias 40

    9 Caracterizao Antignica de Salmonella spp. 42

    10 Meios de Cultura 45

    11 Figuras 47

    Referncias 52

    Anexo 55

  • 5

    1 Taxonomia

    A designao do gnero Salmonella foi adotada em 1900, por Lignires, em homenagem a Daniel Salmon, o qual isolou o microrganismo conhecido como Salmonella enterica sorovar Choleraesuis de sunos. Sua nomenclatura teve como orientao inicial informaes relacionadas s condies clnicas ou ao hospedeiro do qual o microrganismo era isolado.

    Entretanto, a diversidade inicial de sorovares que apresentavam etiologia no especfica de um determinado hospedeiro levou, inicialmente, designao do mesmo sorovar em hospedeiros distintos, em locais diferentes. A partir de 1920, um grupo de microbiologistas, liderados por Fritz Kauffmann, em Copenhagen, e por Philip Bruce White, em Londres, unificou a taxonomia, tendo seu trabalho reconhecido pelo subcomit de Salmonella da Sociedade Internacional de Microbiologia, em 1933, como esquema de Kauffmann-White. A partir de ento, sua nomenclatura passou por algumas modificaes, tendo por base a utilizao de mtodos clssicos e de mtodos moleculares, como AFLP e sequenciamento 16S rRNA, MLEE e AFLP.

    Na atualidade, o gnero est constitudo de duas espcies geneticamente distintas: S. enterica e S. bongori, sendo que a primeira est dividida em seis subespcies, que receberam as seguintes denominaes: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica.

    Na forma da redao da nomenclatura atual, de acordo com as modificaes taxonmicas estabelecidas, os sorotipos ou sorovares no so mais considerados espcies, razo pela qual os sorovares da subespcie enterica devem ser designados da seguinte maneira: Salmonella typhimurium: Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium ou, de maneira mais simples e objetiva, Salmonella sorovar Typhimurium ou ainda Salmonella Typhimurium. Portanto, na nomenclatura atual, os sorovares Typhimurium, Agona, Enteritidis, entre outros, no indicam uma espcie, motivo pelo qual o sorovar no deve ser escrito em itlico ou sublinhado.

    Salmonella o gnero de maior relevncia na famlia Enterobacteriaceae, embora sua relao filogentica seja, de certo modo, conjuntural. Dependendo do mtodo empregado, S. enterica mais relacionada com Citrobacter spp. do que com Escherichia coli (homologia de DNA) ou em sentido inverso, quando empregado mtodo de avaliao de grandes fragmentos (23S rRNA).

    Em geral, acredita-se que Salmonella e E. coli descenderam de um ancestral comum h 160-180 milhes de anos, durante o perodo tercirio, em paralelo com os invertebrados. Ao longo da avaliao, E. coli e a maioria das cepas de Salmonella difsica se adaptaram aos mamferos e, de modo semelhante, os sorovares monofsicos permaneceram adaptados aos rpteis.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

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    Em cada subespcie so reconhecidos diferentes nmeros de sorovares tendo por base a caracterizao de seus antgenos somticos (O) e flagelares (H). Entre as espcies, a subespcie S.enterica apresenta maior nmero de sorovares, sendo responsvel por 99% dos isolamentos, usualmente de animais de sangue quente. Em 2002, foram includos 18 novos sorovares, sendo 12 pertencentes a S.enterica subespcie enterica, 2 subespcie salamae, 2 diarizonae, 1 houtenae e 1 S.bongori. Atualmente so reconhecidos cerca de 2500 sorovares includos em duas espcies S.enterica e S.bongori, cuja distribuio editada por Grimont e Weill (2007) apresentada no Quadro 1.

    Quadro 1 - Distribuio do numero de sorovares de acordo com espcie e subespcie de Salmonella

    Espcies/Subespcies Sorovares

    Salmonella enterica subsp. enterica 1.490

    Salmonella enterica subsp. salamae 500

    Salmonella enterica subsp. arizonae 94

    Salmonella enterica subsp. diarizonae 320

    Salmonella enterica subsp. houtenae 72

    Salmonella enterica subsp. indica 12

    Salmonella bongori 22

    Em 2004, uma nova espcie foi proposta, Salmonella subterranea, isolada em sedimento subterrneo de solo com baixo pH na Oak Ridge, Tennessee. Essa amostra apresentou forte inter-relao com S. bongori, por meio de sequenciamento 16S rRNA, alm de algumas caractersticas metablicas, como indol positivo, H2S e lisina descarboxilase negativa, pigmento amarelo e um flagelo lateral. A amostra-tipo proposta ATCC BAA-86.

  • 7

    2 Caractersticas Gerais

    As salmonelas pertencem famlia Enterobacteriaceae, sendo que, morfologicamente, so bastonetes Gram negativos, geralmente mveis, capazes de formar cido e, na maioria das vezes, gs a partir da glicose, com exceo de S. Typhi, S. Pullorum e S. Gallinarum ( 5% produzem gs). Tambm fermentam arabinose, maltose, manitol, manose, ramnose, sorbitol, trealose, xilose e dulcitol. A maioria das salmonelas de interesse clnico no fermenta lactose, contudo, muitas cepas podem adquirir essa caracterstica por meio de transferncia plasmidial. So oxidase negativa, catalase positivo, indol, Voges-Proskauer VP, Vermelho de Metila VM, malonato e ureia negativa. Produzem gs sulfdrico a partir da reduo do enxofre por ao da enzima cistena desulfidrase. Apresentam ainda como caractersticas metablicas a capacidade de descarboxilao dos aminocidos lisina e ornitina, reduo de nitrato a nitrito e utilizao do citrato como nica fonte de carbono, podendo ocorrer variaes em funo do sorovar e/ou da subespcie. Por exemplo, S. Arizonae no fermenta o dulcitol, mas frequentemente malonato positivo. S. Pullorum no fermenta o dulcitol e S. Gallinarum no descarboxila ornitina, sendo ambas imveis. S. Typhi, S. Pullorum e S. Gallinarum no produzem gs a partir da fermentao da glicose.

    A diferenciao fenotpica das espcies e subespcies de Salmonella est apresentada no quadro 2 e a caracterizao bioqumica entre S. Typhi, S. Paratyphi A e Salmonella enterica subespcie enterica (predominantes em isolamentos de fontes humanas e animais) esto descritas no quadro 3.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

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    Quadro 2 - Caracterizao fenotpica das espcies e subespcies de Salmonella spp.

    Espcies S. enterica subsp.

    S. bongori S. subterraneaSubespcies

    ente

    rica

    sala

    mae

    ariz

    onae

    diar

    izon

    ae

    hout

    enae

    indi

    ca

    Caractersticas

    Dulcitol + + - - - d + +ONPG (2h) - - + + - d + +Malonato - + + + - - - -Gelatinase - + + + + - + -Sorbitol + + + + + - + -Crescimento KCN - - - - + - + +L(+) Tartarato(a) + - - - - - - +(e)

    Galacturonato - + - + + + + NDg-glutamyl transferase + (b) - + + + + + NDb-glucuronidase D D - + - d - NDMucato + + + - (70%) - + + NDSalicina - - - - + - - ND

    Lactose - - - (75%) + (75%) - d - -

    Lise-fago O1 + + - + - + D ND

    Habitat normal animais Sangue quente Sangue frio e meio ambiente ?

    Notas: (a): d-tartarato; (b): S. Typhimurium (d), S. Dublin (-); +: 90% reaes positivas; 90% reaes negativas; d: diferentes reaes (sorovares); (e): crescimento sem produo de cido.

    Quadro 3 - Diferenciao bioqumica entre S. Typhi, S. Paratyphi A e sorovares de S. enterica subsp. enterica mais frequentes

    S. Typhi S. Paratyphi A S. enterica subsp. enterica

    Glicose (gs) - + +cido:

    Dulcitol +/- + +Arabinose -/ + + +

    Descarboxilao: Lisina + - +Ornitina - + +

    Dehidrolao da Arginina +/- + +Produo de H2S +* - / (+) +Citrato de Simmons - - +

    Notas: +: positivo; - : negativo; (+) 75% positivo aps 48 horas; *: fraco

  • 9

    3 Habitat

    O habitat natural das salmonelas pode ser dividido em trs categorias, com base na especificidade do hospedeiro e padro clnico por ele determinado: altamente adaptadas ao homem, incluindo S. Typhi e S. Paratyphi A, B e C, agentes da febre entrica (febres tifoide e paratifoide); altamente adaptadas aos animais, representadas por S. Dublin (bovinos), S. Choleraesuis e S. Typhisuis (sunos), S. Abortusequi (equinos), S. Pullorum e S. Gallinarum (aves), responsveis pelo paratifo dos animais. Entretanto, em determinadas situaes (idade jovem, pacientes com doenas crnicas, idosos, imunocomprometidos), os sorovares S. Dublin e S. Choleraesuis podem determinar no homem um quadro septicmico, isto , mais grave do que o causado por S. Typhi.

    A terceira categoria inclui a maioria dos sorovares que atingem indiferentemente o homem e os animais, designadas salmonelas zoonticas, as quais so responsveis por quadro de gastrenterite (enterocolite) ou por doenas de transmisso alimentar. Sua distribuio mundial, sendo os alimentos os principais veculos de sua transmisso. So responsveis por significantes ndices de morbidade e mortalidade, tanto nos pases emergentes quanto nos desenvolvidos, determinando pequenos e grandes surtos, envolvendo, principalmente, o consumo de alimentos de origem animal, como ovos, aves, carnes e produtos lcteos.

  • 10

    4 Ecologia

    A Salmonella spp. eliminada em grande nmero nas fezes, contaminando o solo e a gua. A sobrevida no meio ambiente pode ser muito longa, em particular na matria orgnica. Pode permanecer vivel no material fecal por longo perodo (anos), particularmente em fezes secas, podendo resistir mais de 28 meses nas fezes de aves, 30 meses no estrume bovino, 280 dias no solo cultivado e 120 dias na pastagem, sendo ainda encontrada em efluentes de gua de esgoto, como resultado de contaminao fecal.

    Os produtos agrcolas no processados, como hortalias e frutas, e os alimentos de origem animal, como as carnes cruas, o leite e os ovos so veculos frequentes de salmonelas. A contaminao de origem fecal geralmente a fonte para os produtos agrcolas, pela exposio gua contaminada; para o leite e os ovos, por meio da exposio direta; e para a carne, usualmente durante as operaes de abate.

    Em comparao com outros bastonetes Gram negativos, as salmonelas so relativamente resistentes a vrios fatores ambientais. A adaptabilidade fisiolgica de Salmonella demonstrada por sua habilidade para proliferar em valores de pH entre 7.0 e 7.5 (extremos 3.8 e 9.5), temperatura de 35oC a 43oC (extremos 5oC a 46oC) e uma atividade hdrica (> 0,94), ocorrendo variaes entre sorovares e/ou cepas. Nos produtos secos, como o chocolate, o cacau em p, as especiarias ou o leite em p, e em produtos congelados, como os sorvetes, o normal a sobrevivncia por perodos de tempo prolongados. A bactria sensvel ao calor, no sobrevivendo temperatura superior a 70oC. No entanto, a termorresistncia pode incrementar-se com menor coeficiente de atividade de gua.

    A inativao ocorre rapidamente em temperatura de pasteurizao em alimentos com atividade de gua 0,95 a qual, quando inferior, aumenta a termorresistncia. Essa associao entre tolerncia ao sal e cido resistncia so interdependentes. Certos processos como salmoura ( 9,0%) e defumao tm efeito limitado na sobrevivncia das salmonelas, pois elas podem sobreviver por vrios meses na salmoura com cerca de 20% de sal e em produtos de elevados teores proteicos ou de gordura. Como exemplos, podem ser citados a carne seca defumada e o pescado, nos quais as salmonelas apresentam capacidade de sobrevivncia de vrias semanas a meses. A relativa resistncia que esses microrganismos apresentam dessecao, congelamento, salmoura e defumao explica por que sobrevivem em muitas classes de alimentos. O efeito bactericida das condies cidas varia de acordo com a natureza do cido utilizado

    no processo, sendo que os cidos actico e propinico so mais inibitrios que os cidos ltico e ctrico.

  • 11

    A dose infectante varia de 105 a 108 clulas, porm, em pacientes imunocomprometidos, tm sido observadas doses 103 para alguns sorovares envolvidos em surtos de doenas de transmisso alimentar DTA. A manifestao clnica inclui quadros entricos agudos ou crnicos, alm de localizao extraintestinal, como infeces septicmicas, osteomielite, artrite, hepatite etc.

    Os microrganismos penetram por via oral, invadindo a mucosa intestinal, com disseminao para a submucosa, resultando em enterocolite aguda. Normalmente, o quadro diarreico moderado, sem a presena de sangue, entretanto, em alguns quadros clnicos, pode ocorrer perda de pequeno volume de fezes associado a tenesmo e sangue.

    Seu transporte, atravs do sistema retculo endotelial, aliado capacidade de multiplicao no interior dos macrfagos, possibilita sua manuteno e disseminao no organismo. Indivduos subnutridos ou com deficincias do sistema imune podem apresentar infeces de extrema gravidade, como a incidncia de bacteremia em pacientes aidticos, dos quais 20% a 60% relatam infeco gastrintestinal prvia.

    Sua virulncia multifatorial, incluindo mobilidade, habilidade de penetrar e replicar nas clulas epiteliais, resistncia ao do complemento, produo de entero, cito e endotoxina, sendo desconhecido o exato papel de cada um, para a manifestao da doena. Em alguns sorovares, a virulncia mediada por um plasmdio, em uma regio do operon de 8Kb que contm os genes spvR ABCD, cuja origem ainda desconhecida. A relao entre a presena desse plasmdio de virulncia e sorovar j se encontra bem estabelecida em S. Dublin, S. Gallinarum e S. Choleraesuis.

    Em pacientes imunodeprimidos, a salmonelose pode ser assintomtica ou ainda determinar diarreia autolimitada em 95% dos casos. As infeces clnicas humanas determinadas por Salmonella spp. apresentam quatro sndromes clnicas distintas: gastrenterite, febre entrica, septicemia com ou sem infeces localizadas e determinam o estado de portador assintomtico. Entre a totalidade de sorovares, S. Enteritidis e S. Typhimurium so os sorovares de maior prevalncia em casos de septicemia e infeces localizadas.

    5 Caractersticas Clnicas e Patogenia

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

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    Infeces gastrintestinais

    O quadro clnico humano pode variar com fezes diarreicas de caractersticas aquosas, semelhante diarreia colrica, a fezes consistentes com sangue oculto, ou visvel, e muco. O quadro diarreico regride, usualmente, de trs a quatro dias. Pode ocorrer febre (39C) em cerca de 50% dos casos, normalmente de curta durao (dois dias), clicas abdominais leves a intensas quando houver invaso dos linfonodos (linfadenite mesentrica), que podem mimetizar apendicite. Desenvolvimento de sndrome de clon irritado SCI, que se caracteriza por diarreia branda persistente seguida de quadro agudo de gastrenterite.

    Em pacientes portadores de SCI, h persistncia como portador assintomtico em 31% aps cinco anos. Em pacientes hospitalizados, portadores de cncer, o quadro reincide, ocasionando pneumonia semelhante quela ocasionada por Pneumocystis, e Salmonella. permanecendo presente nas fezes aps cessarem os sintomas, com uma mdia de excreo durante o perodo de cinco semanas. O estgio de portador persiste por at nove semanas em 90% dos adultos, sendo, em crianas < 5 anos, inferior a sete semanas. A frequncia desse estgio entre manipuladores de alimentos usualmente reduzida (0,5%). Entre esses profissionais, normas de educao e higiene no manuseio de alimentos representam os principais aspectos para minimizar o risco de transmisso alimentar.

    Bacteremia

    A febre entrica usualmente determinada por S. Typhi, S. Paratyphi A e C e S. Sendai, entretanto pode ser determinada por outros sorovares. Sua frequncia mais elevada entre pacientes do sexo masculino, acometendo de 1% a 4% dos pacientes imunodeprimidos (especialmente doenas do sistema reticuloendotelial, linfoma, leucemia, cncer, lpus sistmico e outras doenas vasculares). O risco de desenvolvimento de bacteremia entre pacientes portadores do vrus da imunodeficincia adquirida HIV de 20 a 100 vezes maior do que na populao normal. Entre esses, somente 20% dos pacientes apresentam quadro posterior diarreico.

    Usualmente, a bacteremia apresenta elevada prevalncia em adultos, os quais tm como histrico o uso prvio de drogas imunossupressoras. Entre esses pacientes, a complicao subsequente usualmente a pneumonia, sendo responsvel por elevados ndices de letalidade entre idosos.

    Infeces do Sistema Nervoso Central

    As infeces incluem meningites, abscessos, empiema subdural. A presena de diarreia e de outros sintomas gastrentricos so apontados em 50% dos casos. Embora a bacteremia seja comum em pacientes portadores do vrus da imunodeficincia adquirida, complicaes do sistema nervoso central raramente so apontadas. A maior prevalncia dessas infeces ocorre entre pacientes de longo perodo de hospitalizao, drenagem cirrgica e terapia antimicrobiana prolongada.

    Os sorovares de maior prevalncia em bacteremia e nas infeces do sistema nervoso central so S. Typhimurium e S. Enteritidis.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

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    Infeces em outros stios

    As infeces variam de bacteriria ao comprometimento de juntas (mais comuns), ossos e tecidos e endocardites (< 1% a 0.1%). Podem ocorrer no bao e no trato genital, assim como em complicaes pulmonares. No trato urinrio, h maior prevalncia em mulheres, das quais 50% apresentam quadro diarreico. Os principais fatores de risco so imunossupresso, cistite, pielonefrite e abscesso renal, entretanto a maioria dos casos ocorre em pacientes sem fatores de risco conhecidos.

    A Salmonella tambm reconhecida por ocasionar leses endovasculares e osteomielite, acometendo 7% a 10% dos pacientes > 50 anos.

    Em pacientes que apresentam como fatores de risco diabetes, infeco por HIV (vrus da imunodeficincia adquirida) e aterosclerose (composta especialmente por lipdios e tecido fibroso que se formam nas paredes dos vasos), a presena de Salmonella observada nas placas aterosclerticas, tendo em vista a propriedade de se multiplicar nos fagcitos dessas placas.

    Entre as complicaes da gastrenterite, podem ser citadas a rabdomilise (leso do msculo esqueltico, usualmente acompanhado de falha renal), a osteomielite, que pode levar ao aparecimento de aneurisma abdominal artico, com elevado ndice de mortalidade, a linfadenite mesentrica, a apendicite, a peritonite, a colecistite, a pericardite, a pleuropneumonia e a insuficincia renal, que tm sido amplamente apontadas como infeces extraintestinais determinadas por Salmonella spp.

    Artrite reativa, artrite inflamatria e a sndrome de Reiter (ocorrncia simultnea de uretrite e/ou cervicite, conjuntivite e artrite) tm sido reportadas por uma ampla variedade de enteropatgenos, incluindo Salmonella spp. A incidncia de artrite reativa e de sndrome de Reiter em surtos varia de 6% a 29% e 3%, respectivamente. Estudos recentes apontam que pacientes com o marcador imunogentico HLA-B27 apresentam elevada probabilidade de desenvolver a sndrome de Reiter. A antibioticoterapia no efetiva para o tratamento de artrite reativa.

  • 14

    6 Epidemiologia

    A salmonelose considerada a zoonose mais difundida do mundo. Como o ciclo de transmisso de salmonela envolve praticamente todos os vertebrados e sua veiculao est associada ingesto de alimentos, seu controle representa um desafio para a sade pblica, tendo em vista a emergncia de novos sorovares e a reemergncia de outros em determinadas reas, tanto nos pases emergentes quanto nos industrializados.

    O fator epidemiolgico mais destacado nos animais o estado de portador, no qual a falta de sintomas e as dificuldades tcnicas para sua deteco antes ou durante a inspeo dos produtos de origem animal os convertem em fonte contnua de contaminao do meio ambiente e, portanto, dos alimentos.

    Considerando que a principal via de transmisso de Salmonella spp. est na cadeia alimentar, sua presena em animais, criados com objetivo comercial, aponta esse microrganismo como o mais incidente e relevante agente etiolgico de enteroinfeces. Isso ocasiona perdas de milhes de dlares para a indstria, particularmente de bovinos, sunos e aves, tanto para o mercado interno quanto para exportao, sendo que, em alguns pases, a rigidez na inspeo representa necessidade constante de qualidade.

    Particularmente nas aves, a transmisso de Salmonella spp. pode ser do tipo vertical ou horizontal. Por sculos, o consumo de ovos sem coco era uma prtica comum do homem, porm, na atualidade, diferentes surtos, determinados pelo sorovar S. Enteritidis e, mais recentemente, por outros sorovares (S. Heidelberg, S. Agona e S. Virchow), levaram ao reconhecimento de sua capacidade de transmisso transovariana, levando disseminao, para o homem, por meio de alimentos que so utilizados sem a devida coco, como tortas, maioneses, omeletes etc. (WHITE; FEDORKA-CRAY; CHILLER, 2006).

    A transmisso horizontal envolve todos os sorovares, os quais apresentam caractersticas ubquas. Pode ocorrer pelo meio ambiente, em que roedores assumem o papel de portadores assintomticos, por longos perodos (> 10 meses), disseminando tais microrganismos entre diferentes reas. Outra via, a qual ainda objeto de especulao, est representada pelas raes. Embora, na literatura nacional, entre as dcadas de 1980 e 1990, seja apontada ausncia dos sorovares adaptados s aves em matrias-primas de origem animal, algumas medidas tm sido adotadas pelos criadores, no sentido de minimizar possveis contaminaes, tendo em vista a impossibilidade de sua eliminao total (BACK et al. 2006).

    Os produtos agrcolas no processados, como hortalias e frutas, e os alimentos de origem animal, como carnes cruas, leite e ovos, so veculos frequentes de salmonelas. A contaminao de origem fecal geralmente a fonte para os produtos agrcolas, pela exposio gua contaminada;

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    para leite e ovos, a contaminao se d por meio da exposio direta e para a carne, usualmente ocorre durante as operaes de abate (ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD, 1988).

    Os animais ocupam o ponto central na epidemiologia das salmonelas entricas, representando uma fonte de infeco de grande importncia sanitria, porm de difcil controle. Com exceo dos poucos sorovares adaptados espcie humana, no h dvida de que o homem contrai a infeco, cuja manifestao clnica gastrentrica, usualmente resultante do consumo de alimentos de origem animal.

    Soma-se, nesse contexto, o aumento da resistncia de Salmonella spp. aos antimicrobianos, com o percentual elevando-se de 17% na dcada de 1970 para 31% ao final dos anos 1980, incluindo-se a resistncia s fluoroquinolonas. Tal fato vem culminando, neste sculo, com o aparecimento, em diferentes pases, de cepas produtoras de diferentes tipos de beta-lactamases.

    A incidncia de resistncia bacteriana a antimicrobianos representa risco sade humana e animal. Esse tema de extrema importncia tem sido objeto de ateno de instituies como a Organizao Mundial da Sade OMS, o Escritrio Internacional de Epizootias OIE e o Codex Alimentarius, que vm discutindo solues globais para o problema. Tal fato tem por base sua distribuio mundial, sendo detectada na maioria das espcies animais utilizada para consumo humano, alm de animais silvestres e domsticos.

    Embora a terapia antimicrobiana no seja recomendada na maioria das infeces diarreicas, esse procedimento indicado nas infeces invasivas e ocorre, na prtica, muitas vezes de modo indiscriminado, resultando no aumento de amostras resistentes aos antimicrobianos, podendo representar grave problema, especialmente nos pases emergentes.

    Como resultados, podem ser citadas diferentes situaes, como a resistncia, no sudeste da sia, de 50% de Salmonella Typhi ao cloranfenicol, tetraciclina e ampicilina, com o uso de fluoroquinolonas, excetuando-se crianas, para as quais esta substituda pela ceftriaxone.

    O uso de antimicrobianos na teraputica tambm requer o conhecimento ou suspeita quanto ao agente infeccioso e seu perfil de sensibilidade. Contempla um regime posolgico, cuja dosagem e durao possibilitam o controle do processo infeccioso, reduzindo-se riscos de desenvolvimento de resistncia bacteriana.

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    7 Diagnstico Laboratorial

    Espcimes clnicos

    SangueO hemocultivo reveste um interesse especial no caso de febre tifoide e paratifoide, porm

    no constantemente positivo. Os percentuais de positividade, na ausncia de tratamento prvio com antibiticos, so de 90% durante a primeira semana de evoluo, de 75% na segunda, de 40% na terceira e de 10% na quarta semana.

    Os hemocultivos so negativos nas infeces transmitidas por meio dos alimentos (infeces gastrintestinais), determinadas pela maioria dos sorovares, podendo causar septicemia em indivduos imunocomprometidos.

    1. Principais cuidados para coleta

    A coleta deve ser realizada antes da utilizao de antimicrobianos devendo-se efetuar a desinfeco da superfcie dos frascos de cultivo (lcool 70GL) e assepsia do stio de puno (lcool 70GL ou soluo iodada) em movimentos concntricos do centro para a extremidade.

    2. Volume para cultura

    Nos adultos, o volume dever ser de duas coletas de 10mL com intervalo de uma hora, os quais so inoculados em dois frascos de meio de cultura (inocular 10mL/100mL de meio enriquecido, acrescido de anticoagulante SPS Polianetolsulfonato sdico). Para crianas, mantendo a proporo (1mL/10mL de meio enriquecido, acrescido de SPS), devem ser tomados volumes variveis de acordo com o peso (< 1,5kg a < 4kg 1mL; 4kg a 13kg 3mL; 13kg a 25kg 10mL; > 25kg 20mL).

    No processamento das amostras de sangue por hemocultura tradicional, os frascos devem ser incubados a 35C e avaliados por sete dias e deve ser empregada, paralelamente, semeadura direta em meio seletivo-indicador. A partir do crescimento de colnias com morfologia tpica, dever ser efetuado o isolamento e subsequente identificao bioqumica e antignica. No caso de recebimento de sangue coagulado, dilacerar o cogulo, por meio de uma pipeta e, em sequncia, semear em meio de enriquecimento e, paralelamente, em meio seletivo-indicador.

    Fezes

    A procura de uma metodologia ideal para o isolamento de Salmonella spp. tem sido constante entre os pesquisadores, o que tem trazido melhorias na especificidade e na sensibilidade, bem como simplicidade e rapidez na execuo dos exames bacteriolgicos.

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    Numerosos mtodos e tcnicas clssicas e moleculares vm sendo descritos, visando ao isolamento de diferentes sorovares de Salmonella spp. procedentes de distintas fontes de infeco.

    Nas amostras clnicas, se um espcime apropriadamente obtido na fase aguda da doena, no necessria a utilizao de meios de enriquecimento, tendo em vista a presena de grande nmero de clulas. Contudo, na forma crnica ou mesmo na identificao de portadores, indicada a utilizao de meios de enriquecimento e de meios seletivos para facilitar seu isolamento.

    1. Aspectos relevantes para a coleta

    As fezes devem ser coletadas durante a fase aguda, antes de iniciar o tratamento com antibiticos. Em pacientes com infeco ativa, do mesmo modo que para crianas ou indivduos com dificuldade de obteno de amostras, deve ser priorizada a utilizao de swabs retais. Em pacientes com suspeita de febre tifoide, a pesquisa de Salmonella Typhi nas fezes indicada a partir da segunda semana da doena, assim como na fase de convalescena e na deteco de portadores.

    2. Fezes de emisso espontnea

    Essas amostras devem ser coletadas em pequenos recipientes, de vidro ou polietileno, de boca larga, limpos e/ou esterilizados. O material dever ser analisado at duas horas aps a coleta, quando mantido temperatura ambiente. Deve ser colhida de 0,5g a 2g de fezes e, quando da presena de sangue ou de muco, essa deve ser a poro selecionada para a avaliao laboratorial. Evitar a coleta de espcimes fecais a partir das roupas do paciente, da superfcie de camas e/ou cho.

    3. Espcimes retais

    Umedecer o swab em soluo fisiolgica ou em gua destilada esterilizada e introduzir na ampola retal do paciente ou comunicante, comprimindo-o em movimentos rotatrios suaves por toda a extenso dessa regio. O processamento laboratorial deve ser efetuado at duas horas aps a coleta e, caso no seja possvel, introduzir o swab retal ou fecal impregnado de fezes no meio de conservao Cary e Blair. Nessa condio, as salmonelas sobrevivem por uma a duas semanas em temperatura de refrigerao.

    4. Coleta de fezes em papel-filtro:

    Podem ser utilizadas tiras de papel-filtro, tipo xarope ou mata-borro, com dimenses de 2,5cm de largura por 6,0cm de comprimento. As fezes diarreicas ou suspensas em gua devem ser espalhadas em dois teros de uma das superfcies do papel, com auxlio de um fragmento de madeira (palito individual) ou de qualquer outro material semelhante, disponvel no momento. Em sequncia, devem ser acondicionadas em invlucros plsticos aps dessecar naturalmente. Sob essas condies, a Salmonella se mantm vivel por um perodo aproximado de 30 dias.

    5. Transporte:

    So utilizados contineres plsticos ou isopor para transporte das amostras e manuteno por curto perodo de tempo (> 2h < 4h). Estas so acondicionadas em embalagens de plstico ou de papel e colocadas no interior da caixa de transporte, sendo que as fichas contendo as informaes clnicas e/ou epidemiolgicas so mantidas parte dos espcimes clnicos. Para reutilizao dos contineres para transporte, dever ser efetuada a desinfeco, utilizando-se soluo de hipoclorito de sdio (100ppm).

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    Exame direto de fezes avaliao presuntiva

    uma ferramenta para orientar o profissional de laboratrio na metodologia a ser adotada. Os resultados podem ser individualizados da seguinte forma: a presena de picitos e clulas mononucleares indicam processo inflamatrio; a presena de polimorfonucleares indicativa de sndrome disenteriforme ou colite determinada por patgenos invasivos; e a presena de clulas mononucleares predomina em pacientes com febre tifoide.

    1. Metodologia

    Utilizar soluo de azul de metileno de Loeffler, misturada em igual quantidade com as fezes; essa mistura deve ser colocada sobre lmina, coberta por lamnula e examinada com microscpio tico (objetiva de 10x e 40x).

    FLUXOGRAMAIsolamento de Salmonella spp. em espcimes fecais

    Fezes (suspenso)

    EnriquecimentoSemeadura Direta

    gar EMBgar MacConkey

    Caldo Selenito CistinaCaldo Tetrationato Kauffmann

    Caldo Rappaport Vassiliadis*

    18h/24h-37C 18h/24h-37C*18h/24h-43C

    gar Hektoen e/ougar SS e/ou

    gar XLD e/ou

    gar Verde Brilhante

    Isolamento 5 -10 colnias:Meio de Triagem

    Caracterizao bioqumica

    Swab fecal/retal

    gar Sulfito Bismuto e/ou

    Identicao antignica

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    Espcimes oriundos de outros stios orgnicosOs procedimentos de rotina empregados na anlise microbiolgica dos diferentes espcimes

    clnicos tambm podem ser utilizados no isolamento de Salmonella spp. A morfologia colonial fornece as primeiras informaes para a sua identificao.

    importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e observar as caractersticas das colnias. Por exemplo, semeadura em gar Sangue e em gar MacConkey pode apontar morfologia semelhante ou, ainda, tamanhos distintos.

    Um dos aspectos mais importantes na anlise de amostras oriundas de diferentes stios orgnicos a coleta e o transporte at o laboratrio.

    Fluidos orgnicos e secrees: em sua maioria, os lquidos (pleural, asctico, biliar, de articulaes e outros) so coletados por procedimento mdico, devendo ser transportados imediatamente ao laboratrio e processados dentro da rotina de diagnstico de diferentes grupos microbianos.

    Espcimes oriundos de infeces sistmicas e localizadas: em pacientes com spsis aguda, meningite, osteomielite, artrite ou pneumonia devem ser coletadas duas amostras (10mL a 20mL por amostra) de punes venosas distintas, antes da antibioticoterapia, com intervalos de cinco a 15 minutos entre as punes.

    Urina: a coleta deve ser feita pela manh, preferencialmente da primeira mico do dia, ou ento aps reteno vesical de duas a trs horas. A coleta deve seguir normas de assepsia rigorosa prvia dos genitais com gua e sabo neutro, posterior secagem e coleta do jato intermedirio espontneo.

    Lquor: a coleta deve ser realizada por equipe mdica especializada, sendo recomendado que o paciente esteja em jejum. O transporte da amostra para o laboratrio deve ser feito imediatamente e, quando tiverem sido coletados dois ou mais tubos, o laboratrio dever utilizar o tubo que contiver menos sangue, o que facilita o isolamento bacteriano.

    Salmonella spp. em alimentosA salmonelose uma das zoonoses mais complexas em sua epidemiologia e controle, cujos

    padres diferem de uma regio para outra. Isso se deve a diferenas nos hbitos alimentares, prticas de elaborao de alimentos, criao de animais e padres de higiene e saneamento. Seu controle um trabalho rduo, tendo em vista a emergncia de novos sorovares e a reemergncia de outros em determinadas reas, tanto nos pases emergentes quanto naqueles industrializados (ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD, 1988).

    Qualquer alimento que contenha Salmonella spp. um risco potencial para o consumidor, cuja veiculao facilitada, na atualidade, pela mudana nos hbitos alimentares da populao. A necessidade, cada vez maior, de elevar a produo/oferta de alimentos leva ao aumento dos fatores de risco, resultantes de falhas quanto ao manuseio, transporte muitas vezes em condies inadequadas, aliados ausncia de critrios bsicos de higiene e saneamento, os quais favorecem a disseminao.

    Nos produtos secos, como chocolate, cacau em p, especiarias ou leite em p, e em produtos congelados como os sorvetes, o normal a sobrevivncia por perodos de tempo prolongados. Esse microrganismo

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    sensvel ao calor e no sobrevive temperatura > 70oC, no entanto, a termorresistncia pode ser suplementada com menor coeficiente de atividade de gua, como inativao que ocorre rapidamente em temperatura de pasteurizao em alimentos com atividade de gua 0,95.

    A associao entre tolerncia ao sal e cido resistncia so interdependentes. Certos processos como salmoura ( 9,0%) e defumao tm efeito limitado na sobrevivncia das salmonelas, podendo resistir por vrios meses na salmoura com cerca de 20% de sal, em produtos de elevado teor proteico ou de gordura. So exemplos a carne seca defumada e o pescado, em que tm capacidade de manter-se vivos por vrias semanas a meses. A relativa resistncia que esses microrganismos apresentam dessecao, ao congelamento, salmoura e defumao explica por que permanecem em muitas classes de alimentos. O efeito bactericida das condies cidas varia de acordo com a natureza do cido utilizado no processo, sendo que os cidos actico e propinico so mais inibitrios que os cidos ltico e ctrico.

    Deve ser salientado que, em alimentos com elevado teor lipdico, como ovos e chocolate, as salmonelas ficam dentro dos glbulos de gordura, protegidas, no sendo afetadas pelas enzimas digestivas ou pela acidez gstrica, fato que reduz a dose infectante (FORSYTHE, 2002).

    Nos alimentos, o isolamento de Salmonella spp. representa um problema para os bacteriologistas em funo do reduzido nmero de microrganismos presentes, associados a uma microbiota mista e numerosa, aliada ainda complexa composio de alguns tipos de alimentos.

    Desse modo, a anlise de alimentos para deteco de Salmonella spp. requer mtodos diferentes daqueles utilizados em laboratrios clnicos. A metodologia convencional recomendada por diferentes rgos regulamentadores segue basicamente quatro etapas, que podem ser aplicadas a qualquer tipo de alimento, embora apresentem algumas variaes na seleo de meios de cultura e na forma de preparao das amostras.

    FLUXOGRAMA PARA ISOLAMENTO E IDENTIFICAO EM ALIMENTOS

    Pr-enriquecimento25g ou 25mL da amostra + 225mL de meio

    Enriquecimento seletivo

    0,1mL do cultivo + 10mL de RV

    1mL do cultivo + 10mL do caldo TT

    Isolamento em meio seletivo HE e XLD

    TSI, LIA e Ureia

    Caracterizao antignica

    35 1C/18h-24h

    42 0,2C/24h

    35 1C/24h

    35 1C/24h

    35 1C/24h

    Identicao Presuntiva

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    Caractersticas dos meios de cultura usualmente empregados

    Pr-enriquecimento

    As salmonelas podem estar presentes nos alimentos em pequenas quantidades e, geralmente, sofrem os efeitos resultantes do processamento e do armazenamento. Necessitam, portanto, de pr-enriquecimento em meios no seletivos para sua recuperao. Os danos s salmonelas resultam na perda ou na alterao das funes celulares, o que as tornam suscetveis a agentes seletivos, que refletem na incapacidade de formar colnias em meios mnimos salinos, entretanto, so visualizadas em meios complexos.

    Microrganismos que sofreram danos estruturais no so capazes de proliferar ou sobreviver em meios contendo agentes seletivos (concentraes crescentes de sal, lauril sulfato, desoxicolato, sais biliares, detergentes e antibiticos). O dano s reversvel se as clulas forem expostas s condies favorveis de desenvolvimento em um meio no seletivo e rico em nutrientes. Essa recuperao pode ser conseguida utilizando-se vrios meios, como gua peptonada tamponada, caldo lactosado, gua destilada verde brilhante, caldo tripticase de soja, entre outros (Quadro 4).

    A gua peptonada a 1,0% tamponada e o caldo lactosado so comumente usados, mas outros meios, tais como triptona de soja e caldo nutriente, podem ser empregados. O caldo lactosado pode, eventualmente, ser inconveniente como pr-enriquecimento quando utilizado em amostras que contm populao elevada de microrganismos fermentadores da lactose, pois a subsequente reduo do pH do meio pode limitar a multiplicao das salmonelas, em particular das clulas com danos estruturais, embora a literatura aponte que a Salmonella spp. se multiplica em uma faixa ampla de pH (pH 3.8 a 9.5).

    Quadro 4 - Procedimentos de isolamento de Salmonella aprovados por diferentes rgos reguladores

    Mtodo(a) Meios de Pr-enriquecimento(a) Meios de Enriquecimento(a) Meios Seletivo-

    Indicadores

    ISO 6579 (2007)

    APT(b) 37C 1 / 182h(c)

    RVS 41,5 1C / 24h 3hMKTT 37C1C / 24h 3C

    XLD - 37C 1 / 243h2C opcional(e)

    BAM/FDA(f) (2006)

    CL 35C2 / 242h(c)

    RV 42C 0,2 / 242hTT 35C 2 / 242h ou 42C 0,2 / 242h(d)

    HE 35C 0,2 / 242hSB 35C 2 / 242hXLD 35C 2 / 242h

    MLG/FSIS (2004)

    APA 35C 2 / 1824h

    RV ou RVS 42C0,5 / 222hTTH 42C 0,5 / 222h

    VB 35C 0,2/18-24hXLT4 ou DM-LIA 35C2 / 18-24h

    APHA(f) (2001)CL 35C2 / 242h(c)

    SC 37C1C / 24h3CTT 37C1C / 24h3C

    SS 35C 2 / 242hBS 35C 2 / 242hHE 35C 2 / 242h

    Notas: (a) ISO International Standartization Organization; BAM/FDA Bacteriological Analytical Manual da Food and Drug Admistration on-line; e MLG/FSIS Microbiological Laboratory Guidebook on-line da Food Safety And Inspection Service, United States Department of Agriculture.

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    (b) APT gua Peptonada Tamponada; CL Caldo lactosado; SC Caldo Selenito Cistina; RVS Caldo Rappaport Vassiliadis Soja; MKTT Caldo Tetrationato de Kauffmann com novobiocina; RV Caldo Rappaport Vassiliadis modificado; TT Caldo Tetrationato; TTH Caldo Tetrationato de Hajna; XLD gar Xilose Lisina Desoxicolato; HE gar Entrico Hektoen; SS gar Salmonella-Shigella; SB gar Sulfito de Bismuto; DM-LIA gar Lisina Ferro duplamente modificado; VBS gar Verde Brilhante Sulfa; e XLT4 gar Xilose Lisina Tergitol 4.(c) Existem algumas variaes apontadas na descrio do procedimento tcnico. (d) Alimentos com carga microbiana reduzida, incubar a 35C, e com carga microbiana elevada a incubao

    dever ser a 43C. (e) Selecionar meio seletivo indicador adequado para o isolamento de cepas lactose positiva e dos sorovares

    S. Typhi e S. Paratyphi. Podem ser empregados o gar Verde Brilhante VB e o gar Sulfito de Bismuto SB.(f) FDA e APHA, alm do caldo lactosado, para uso geral, recomendam a utilizao de: gua destilada verde

    brilhante, para leite em p e misturas lcteas; leite em p desnatado verde brilhante, para chocolates, balas

    e confeitos; caldo triptcase de soja para condimentos; caldo nutriente, para glacs e coberturas similares.

    Quadro 5 - Confirmao de Salmonella spp. em alimentos ISO 6579:2007

    Testes bioqumicos Autoaglutinao Testes antignicos Interpretao

    Tpicos1 No Poli O, H ou Vi positivosConfirmado como Salmonella spp.

    Tpicos1 No Todos negativos

    Pode ser Salmonella spp.2Tpicos1 Sim No se aplica

    Atpicos No/Sim Poli O, H ou Vi positivos

    Atpicos No/Sim Todos negativos No confirmado como Salmonella spp.

    Notas: 1Resultados tpicos: TSI com bisel alcalino; acidez na profundidade; H2S; lisina descarboxilase positiva;

    urease, -galactosidade , VP e indol negativos. 2 As cepas devem ser enviadas ao Laboratrio de Referncia Nacional para a confirmao definitiva.

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    Quadro 6 - Avaliao de Salmonella spp. em alimentos

    gar TSI gar LIAAglutinao

    AoPoli O Poli H

    Base cida/pice alcalino com H2S

    Base e pice alcalino com H2S

    + + Continuar

    Base cida/pice alcalino com H2S

    Base e pice alcalino com H2S

    + - Continuar

    Base cida/pice alcalino sem H2S

    Base e pice alcalino sem H2S

    +(?) - Continuar

    Base cida/pice alcalino sem H2S

    Base e pice alcalino sem H2S

    + + Continuar*

    Base cida/pice alcalino sem H2S

    Base e pice alcalino sem H2S

    Descartar

    Base cida/pice alcalino com H2S

    Base cida e pice alcalino com/sem H2S

    +(?) Continuar

    Base e pice cidos sem H2S

    Base alcalina ou cida e pice sem H2S

    Descartar

    Base e pice cidos com H2S

    Base e pice alcalinos com H2S

    +(?) Continuar**

    Sem alterao de cor nos meios de cultura Descartar

    Fonte: (USDA, 2004)

    Nota: *S. Typhisuis pode ser encontrada em sunos.

    **S. enterica subesp. arizonae ou diarizonae.

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    Enriquecimento Seletivo

    O enriquecimento seletivo determina aumento contnuo de Salmonella, restringindo a proliferao da microbiota acompanhante. Devido utilizao dos diferentes agentes inibitrios adicionados aos meios, estes tambm diferem em sua seletividade e aplicao especfica.

    Diferentes tipos de inibidores tm sido propostos para enriquecimento seletivo de salmonelas, sendo a bile, o tetrationato, o selenito e corantes, como o verde brilhante e o verde malaquita, os mais usados. Esses inibidores so incorporados aos meios, isolados ou em combinao. Particularmente para produtos gordurosos como leite de coco e coco ralado, utilizar Tween-80, Triton X ou Tergitol 7.

    A seletividade melhorada pela incubao a 41C-43C. Nessa etapa, recomenda-se a utilizao de dois diferentes meios, devido variao de resistncia da Salmonella spp. aos agentes seletivos. Os meios comumente usados so: caldo Rappaport Vassiliadis modificado RV ou Rappaport Vassiliadis Soja RVS e diversas formulaes do caldo tetrationato TT. Entretanto, o primeiro no deve ser utilizado, caso haja suspeita de S. Typhi.

    Para amostras clnicas, podem ser utilizados diferentes meios de enriquecimento, destacando-se o Caldo Tetrationato, o Caldo Tetrationato Verde Brilhante, o Caldo Selenito, o Caldo Gram Negativo, o Caldo Cloreto de Magnsio Verde Malaquita, o Caldo Rappaport Vassiliadis e variaes desses.

    As principais caractersticas dos meios de enriquecimento seletivos mais empregados esto descritas na Quadro 7.

    1. Caldo Tetrationato

    A seletividade do caldo tetrationato depende de sua capacidade de restringir a multiplicao de coliformes. Sorovares de Salmonella (exceto S. Choleraesuis, S. Typhisuis, S. Gallinarum e S. Pullorum) possuem a enzima tetrationato-redutase e, consequentemente, so capazes de multiplicar-se no meio. Porm, o desenvolvimento excessivo de Proteus spp., que tambm produz essa enzima, pode interferir na deteco de Salmonella spp. Nesse caso, o caldo tetrationato verde brilhante, segundo Muller-Kauffmann, contendo verde brilhante e bile, inibe a multiplicao de espcies de Proteus

    2. Caldo Rappaport

    O Caldo Cloreto De Magnsio Verde Malaquita (Caldo Rappaport) vem demonstrando eficcia na deteco de Salmonella spp. A associao do cloreto de magnsio com um corante bacteriosttico (verde malaquita) constituiu-se no meio de enriquecimento para a maioria dos sorovares de Salmonella spp., com exceo de S. Typhi. Posteriormente, uma modificao desse meio, resultante da diminuio da concentrao de verde malaquita, com temperatura de 43oC para incubao, o qual foi denominado meio de Rappaport Vassiliadis, vem evidenciando maior eficincia quando da utilizao de pequenas quantidades de inculo, bem como por ter maior capacidade de inibio dos microrganismos competitivos.

    3. Caldo Selenito

    Esse meio vem sendo recomendado para o enriquecimento de Salmonella spp. em espcimes fecais, especialmente para o isolamento de S. Typhi e S. Paratyphi B, sendo tambm til para a deteco de outros sorovares de Salmonella spp., mesmo quando os microrganismos esto presentes em pequeno nmero. A adio de cistina melhora a qualidade do meio de cultura.

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    4. Caldo Gram negativo Caldo GN

    Esse meio utilizado para o enriquecimento seletivo de bactrias Gram negativas, particularmente Shigella spp. e Salmonella spp., a partir de todo tipo de espcimes clnicos. Devido concentrao relativamente baixa de desoxicolato, menos inibidor de Escherichia coli e de outros coliformes, enquanto a maior concentrao de manitol em relao glicose limita o crescimento de espcies de Proteus e favorece o de Salmonella spp. e Shigella spp., que so fermentadores do manitol.

    Quadro 7 - Caractersticas dos meios de enriquecimento seletivos

    Meios Indicao Substncias inibidorasBactrias inibidas

    Bactrias favorecidas

    Caldo SelenitoEspcimes clnicos

    Selenito de sdio

    Coliformes S. Typhisuis, S. Choleraesuis, S. Gallinarum, S. Pullorum

    Salmonella spp.

    Caldo GNEspcimes clnicos

    Citrato desoxicolato de sdio

    Gram positivos, coliformes, Proteus spp.

    Maioria das enterobactrias

    Caldo RappaportEspcimes clnicos Alimentos

    Cloreto de magnsio verde malaquita

    Gram positivos, coliformes S. Typhi Shigella

    Salmonella spp.

    Caldo Tetrationato

    Espcimes clnicos Alimentos

    Sais biliares Iodo

    Gram positivos, coliformes, S. Typhi, S. Paratyphi, S. Pullorum, S. Gallinarum, S.Typhisuis, S. Choleraesuis,

    Salmonella spp.

    Meios seletivos-indicadores

    No esquema de diagnstico das enterobactrias, os meios seletivos indicadores, de natureza slida, desempenham funo primordial para o isolamento de diferentes membros dessa famlia.

    Todos esses meios objetivam a diferenciao de Salmonella spp. de outras bactrias, em funo de suas propriedades inibitrias e do aspecto macroscpico das colnias (Quadro 8).

    Esses meios so comumente baseados na incapacidade da maioria das salmonelas em fermentar a lactose e, em alguns casos, outros substratos, tais como a sacarose e a salicina, bem como a capacidade de produo de sulfeto de hidrognio.

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    Vrios meios, tais como o gar Verde Brilhante, o gar Entrico de Hektoen, o gar Xilose Lisina Desoxicolato, o gar Salmonella-Shigella e o gar Sulfito de Bismuto, so indicados nos procedimentos aprovados por diferentes rgos reguladores para o isolamento de salmonela a partir de alimentos.

    Como algumas cepas de salmonela podem produzir reduzida quantidade de gs sulfdrico H2S, muitas vezes no detectado nos meios seletivos, ou ainda perder a capacidade de produzir esse gs, particularmente na anlise de alimentos, importante que o segundo ou terceiro meio de isolamento no seja baseado nessas duas caractersticas. Uma dessas opes o gar Verde Brilhante BG gar, que se baseia na fermentao da lactose, mas no na produo de H2S, e o gar Bismuto Sulfito BS gar, que se baseia na produo de H2S, mas no fermenta a lactose.

    O gar Sulfito de Bismuto particularmente recomendado para o isolamento de S. Typhi, entretanto no deve ser utilizado se foi preparado em perodo superior a 24-36 horas.

    Por outro lado, esse meio inibe o crescimento de outros sorovares de Salmonella spp., a menos que seja refrigerado a 4oC por, no mnimo, 24 horas antes de sua utilizao.

    Mais recentemente, novos meios de cultura que incorporam substncias cromognicas em sua frmula esto disponveis no mercado, os quais, por serem seletivos e indicadores, permitem a diferenciao de Salmonella spp. de outras bactrias, pelo desenvolvimento de cores caractersticas para cada gnero/grupo bacteriano. Dentre os meios cromognicos, podem ser citados: gar Rambach, Cromocen SC, CHROMagar Salmonella, Colorex Salmonella.

    O gar Rambach vem sendo utilizado para identificar Salmonella spp. em gneros alimentcios e amostras clnicas, permitindo a diferenciao com membros do gnero Proteus e outras bactrias entricas. Alm de um composto cromognico que indica a presena de b-galactosidase, prpria dos coliformes, possibilita a identificao de Salmonella spp. por formar cido a partir do propilenoglicol que, em combinao com um indicador de pH, resulta em uma colorao vermelho carmim, caracterstica de suas colnias.

    A presena de fragmentos de -galactosidase, caracterstica dos coliformes, evidenciada pelo desenvolvimento de colnias azul-esverdeadas ou violeta-azuladas. Outras enterobactrias ou bactrias Gram negativas, como Proteus., Pseudomonas, Shigella. S. Typhi e S. Paratyphi A apresentam colnias incolores.

    Cromocen SC um meio para a deteco, isolamento, diferenciao e/ou contagem de Salmonella (exceto S. Typhi), coliformes totais e de outras bactrias Gram negativas. O meio se baseia na combinao de uma reao cromognica para detectar a atividade -galactosidase e uma reao bioqumica de degradao de fontes de carbono que produzem diminuio do pH, com a consequente alterao de cor do indicador includo na formulao. A Salmonella (exceto S. Typhi) apresenta colnias com centro vermelho e bordas mais claras; coliformes (exceto Klebsiella spp. e Citrobacter spp.), colnias verde-azuladas; e Klebsiella spp. e Citrobacter spp. colnias violeta. As colnias incolores ou com pigmentao prpria correspondem a outras bactrias Gram negativas.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    27

    CHROMagar Salmonella um meio seletivo e diferencial para o isolamento e a identificao presuntiva de Salmonella spp. de outras bactrias coliformes e no coliformes em amostras fecais e de alimento. Colnias de Salmonella, incluindo S. Typhi caracterizam-se pela cor prpura, e outras espcies bacterianas so inibidas, incolores ou azuis.

    Colorex Salmonella um meio cromognico para isolamento e diferenciao de Salmonella spp., incluindo S. Typhi, diretamente de espcimes clnicos e de alimento. Apresenta, em sua composio, mistura cromognica especial que permite diferenciar Salmonella spp. de outras bactrias, com base na cor e na morfologia das colnias, alm de inibir bactrias Gram positivas. Colnias de Salmonella spp. se apresentam na cor prpura; E.coli e outros coliformes, na cor azul-esverdeada, enquanto os microrganismos incapazes de hidrolisar o composto cromognico so incolores.

    Nos espcimes clnicos, a recuperao de mltiplos sorovares de Salmonella spp. requer dois ou mais meios seletivos indicadores e a escolha de um deles, ou do esquema a ser utilizado para o isolamento e identificao desse microrganismo, , em grande parte, questo de preferncia pessoal. Portanto, na escolha do meio de cultura, deve ser levado em considerao o espcime a ser analisado e os sorovares usualmente detectados.

    importante lembrar que a interao dos meios de enriquecimento e seletivos com a temperatura e tempo de incubao so fundamentais para melhor isolamento dessa bactria.

    A prevalncia de Salmonella spp. no ambiente e em alimentos e a necessidade de reduo do intervalo de tempo das anlises laboratoriais tm levado busca e ao consequente uso de procedimentos analticos mais rpidos. Entretanto, esses devem ser equivalentes, em sensibilidade e em especificidade, aos mtodos clssicos, podendo ser citados: testes bioqumicos miniaturizados, mtodos baseados em anticorpos, hibridizao de DNA e variaes do mtodo de PCR.

    Apesar de vrios desses mtodos serem considerados rpidos, a maioria dos sistemas de deteco de Salmonella spp. ainda recorre ao cultivo para recuperar clulas que sofreram danos estruturais e ampliar a populao de Salmonella spp. em meios lquidos. Dessa forma, os procedimentos de pr-enriquecimento e/ou enriquecimento seletivo, devem ser empregados em conjunto com os mtodos rpidos.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

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  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    29

    Identificao Bioqumica Presuntiva (Meios de Triagem)

    Uma vez selecionadas colnias sugestivas nos meios indicadores seletivos, estas sero transferidas para meios de triagem, tais como gar ferro triplo acar gar TSI, gar dois acares ferro (Kligler KIA), gar Lisina Ferro LIA, meio de Costa e Vernin CV, meio IAL (modificao do meio de Rugai e Arajo), gar Motilidade-Indol-Lisina MILi, gar Motilidade-Indol-Ornitina MIO e meio EPM Escola Paulista de Medicina.

    As caractersticas diferenciais dos meios de triagem mais utilizados esto descritas nos quadros 9, 10, 11, 12 e 13. Esses meios podem ser empregados de forma isolada ou em associao e possibilitam caracterizao bioqumica presuntiva, indicando os testes bioqumicos complementares necessrios para sua identificao.

    1. gar ferro-acar triplo (gar TSI)

    Esse meio utilizado para diferenciao de bastonetes Gram negativos com base na fermentao e produo de gs dos carboidratos: glicose, lactose e sacarose e produo de sulfeto de hidrognio. Permite verificar a fermentao da glicose por meio do aparecimento de colorao amarela na base e a produo de gs, indicada pela formao de bolhas ou rachaduras no meio. A mesma colorao tambm observada na poro superior do tubo quando ocorre fermentao da lactose e/ou sacarose. Quando esses dois acares no so fermentados, o pice permanece com a cor original (mbar). A produo de H2S indicada pela cor negra na base da poro central do tubo. Microrganismos como Proteus mirabilis, Edwardsiella tarda, Citrobacter freundii e Salmonella spp. podem apresentar perfil de comportamento semelhante.

    gar ferro - dois acares (Kligler Iron gar KIA)

    Esse meio apresenta as mesmas indicaes, leitura e interpretao do gar TSI, porm com diferena na sua formulao por no conter sacarose.

    gar Lisina-Ferro LIA

    Esse meio de cultura usualmente empregado em associao com outro meio de triagem para identificao presuntiva de enterobactrias, visando ofertar maior nmero de informaes para a identificao presuntiva. A descarboxilao da lisina evidenciada pela colorao prpura (alcalina) da base e, quando esta no ocorre, a cor amarela aponta somente a fermentao da glicose. A desaminao da lisina visualizada no pice (vermelho-cobreado) e a produo de H2S (negro), usualmente, da base at a poro central do tubo.

    Meio de Costa e Vernin CV

    Esse meio uma modificao do meio de Monteverde, apresentando camada inferior semisslida e outra slida, permitindo avaliar as seguintes reaes: indol (tampo de algodo ou tira

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    30

    de papel de filtro embebida no reativo), fermentao da lactose e sacarose, produo de gs, hidrlise da ureia, produo de H2S, formado na interface do meio semisslido e slido, e mobilidade.

    O ataque lactose ou sacarose, ou a ambas, com a produo de cido, torna o meio vermelho. A presena de um anel negro na base da camada slida indica produo de H2S; a turvao difusa ou no da parte semisslida revela a mobilidade; a colorao azul, distribuda por todo o meio, identifica as bactrias produtoras de urease. Alm desses testes, o aparecimento de uma colorao rsea ou vermelha na tira de papel de filtro ou no algodo caracteriza as bactrias produtoras de indol.

    Meio IAL (PESSOA; SILVA, 1972)

    Elaborado para triagem de enterobactrias, permite a leitura das seguintes provas bioqumicas: indol (tampo de algodo ou tira de papel de filtro embebida no reativo), fermentao da sacarose e da glicose, produo de gs, desaminao da fenilalanina, hidrlise da ureia, produo de H2S, descarboxilao da lisina e mobilidade.

    Meios MIO Motilidade-Indol-Ornitina e Meio MILi Motilidade-Indol-Lisina

    Esses meios evidenciam a descarboxilao dos aminocidos ornitina ou lisina, a mobilidade e a produo de indol. A mobilidade interpretada pela difuso do microrganismo na zona da inoculao; a descarboxilao da ornitina ou lisina evidenciada pela colorao prpura (alcalina) da base, que neutraliza o cido (amarelo), formado pela fermentao da glicose. A produo de indol observada pela formao de um anel vermelho aps acrescentar 2 a 4 gotas do reativo de Kovacs superfcie do meio.

    Meio EPM

    O meio EPM uma modificao do meio de Rugai e Arajo, evidenciando a produo de gs por fermentao da glicose, produo de H2S, hidrlise da ureia e desaminao do triptofano.

    Quadro 9 - Caractersticas diferenciais dos meios TSI , KIA, MIO, MILi e LIA

    TSI e KIA MIO/MILi LIA

    Fontes de aminocidos (desaminao)

    Peptona Extrato de carne Extrato de levedura

    Peptona Extrato de levedura ornitina ou lisina

    Peptona Extrato de levedura lisina

    Aminocidos (descarboxilao) No Ornitina ou lisina Lisina

    Fermentao de carboidratos

    lac+sac+glic = TSIlac+ glic = KIA Glicose (0,1%) Glicose (0.1%)

    Indicador de pHVermelho de fenol: cido = amarelo alcalino = vermelho

    Bromocresol prpura: cido = amarelo alcalino = prpura

    Bromocresol prpura: cido = amarelo alcalino = prpura

    (continua)

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    31

    TSI e KIA MIO/MILi LIA

    Fonte para produo de H2S

    Tiossulfato de sdio No Tiossulfato de sdio

    Indicador da produo de H2S

    Sulfato ferroso No Citrato frrico amoniacal

    Quadro 10 - Reaes nos meios de triagem TSI e KIA*

    Leitura Interpretao Diagnstico presuntivo

    Reao cida (amarelo) e gs na profundidade Reao cida na superfcie Ausncia de H2S

    Fermentao da glicoseFermentao da lactose e/ou sacarose, com produo de gs

    Escherichia, Klebsiella EnterobacterProvidencia, Serratia

    Reao cida e gs na profundidade Superfcie alcalina (vermelha) Presena de H2S

    Fermentao da glicose sem ataque lactose e/ou sacarose

    Salmonella,EdwardsiellaCitrobacter, Proteus

    Reao cida sem gs na profundidade, superfcie alcalina Ausncia de H2S

    Fermentao da glicoseNenhuma ao sobre a lactose e a sacarose

    Shigella, SalmonellaProteus, Providencia, Serratia, Yersinia

    Meio inteiramente cido com gs Presena de H2S

    Fermentao da glicose com gs Fermentao da glicose e/ou da sacarose

    Citrobacter, Proteus

    Meio inteiramente cido, sem gs Ausncia de H2S

    Fermentao da glicose com formao de cidoFermentao da lactose e/ou sacarose

    Escherichia coli,Serratia

    Nota: *Para a interpretao do gar Kligler (KIA) no considerar a fermentao sobre a sacarose.

    Quadro 11 - Reaes no gar Lisina Ferro LIA

    Microrganismos Base pice H2S

    Salmonella Prpura Prpura +

    Proteus, Morganella Amarelo Prpura avermelhado +/-

    Providencia Amarelo Prpura avermelhado -

    Citrobacter Amarelo Prpura +

    Escherichia Amarelo/ Prpura Prpura -

    Shigella Amarelo Prpura -

    Klebsiella Prpura Prpura -

    Exceo: S. Paratyphi A = base amarela/ pice prpura

    (continuao)

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    32

    Quadro 12 - Reaes observadas no meio de Costa e Vernin CV

    Leitura Microrganismos

    Meio inalterado, com certa alcalinidade no pice (esverdeado ou azulado). Presena de H2S; ausncia de gs; mvel ou imvel

    Salmonella spp.Edwardsiella tardaCitrobacter freundii

    Reaes idnticas s acima citadas, sem H2S Certos sorovares de Salmonella

    Meio inalterado no prazo de 24h, podendo se acidificar em perodos mais longos (fermentao lenta); ausncia de H2S; mvel ou imvel

    Shigella spp.Providencia sp.

    Meio inteiramente azul, com produo ou no de H2S; dificuldade na leitura da mobilidade Proteus sp.

    Camada slida azul (superfcie) e amarelo-azulado na poro semisslida (base), indicando ao sobre a sacarose. Presena de H2S

    Proteus vulgaris

    Meio totalmente vermelho, por vezes podendo apresentar reas amareladas (reduo); grande produo de gs. Ausncia de H2S. Mobilidade presente ou no. pice do meio slido com discreta alcalinidade na Tribo Klebsielleae

    Escherichia, EnterobacterKlebsiella e Serratia(sem gs)

    Meio com discreta acidez na profundidade, ligeira alcalinizao na superfcie. Presena de H2S, mvel

    Citrobacter freundii

    Meio inalterado com 24h; pequena alcalinizao na superfcie, acentuando-se aps 48h. Forte tonalidade azul-esverdeada na superfcie. Ausncia ou discreto crescimento no meio semisslido

    Pseudomonas

    Quadro 13 - Interpretao do meio EPM

    Base

    Produo de gs Formao de bolhas ou rachaduras no meio

    Produo de H2SPresena de pigmento negro de qualquer intensidade

    Hidrlise da ureia Colorao azul-esverdeada (fraca) na base indica prova positiva

    Superfcie Desaminao do triptofano Reao positiva: verde-escuro ou acastanhado Reao negativa: superfcie inalterada

    Caracterizao bioqumica complementar

    Embora seja possvel uma identificao preliminar, com base na morfologia colonial e nas reaes bioqumicas, nos diferentes meios indicadores seletivos e de triagem, a identificao de membros da famlia Enterobacteriaceae requer a utilizao de provas bioqumicas complementares. Entre as provas preliminares, destacam-se a deteco da enzima citocromo-oxidase e a reduo do nitrato a nitrito, caractersticas intrnsecas da famlia. Alm dessas, dispe-se de uma variedade de provas diferenciais complementares, as quais permitem avaliar as caractersticas metablicas, contribuindo para a identificao posterior dos gneros/espcies.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    33

    Essas caractersticas so: fermentao de carboidratos, reao de vermelho de metila VM, utilizao de citrato, produo de acetona VP, indol, urease, sulfeto de hidrognio H2S, descarboxilao de aminocidos e mobilidade.

    As principais caractersticas bioqumicas e diferenciais de Salmonella spp. esto descritas nos quadros 14, 15, 16, 17, 18 e 19.

    1. Citocromo-Oxidase

    Os citocromos so hemoprotenas que contm ferro e funcionam como a ltima ligao da cadeia respiratria aerbica, transferindo eltrons (hidrognio) ao oxignio com a formao de gua. O sistema citocromo encontrado nos organismos aerbios ou microaerbios e anaerbios facultativos. Portanto, o teste da oxidase importante na identificao de microrganismos que no possuem a enzima ou so anaerbios obrigatrios. O teste muito til em estudos preliminares para diferenciao de Enterobacteriaceae (negativas, exceto Plesiomonas shigelloides) de outras famlias como Aeromonadaceae, Pseudomonadaceae e Vibrionaceae, positivas nesse teste.

    A prova de citocromo-oxidase utiliza certos reativos corantes, como o dicloridrato de p-fenilenodiamina ou oxalato de p-amino-dimetil-anilina, que atuam como aceptores artificiais de eltrons, substituindo o oxignio. Esses so incolores no estado reduzido, mas na presena da enzima e do oxignio atmosfrico se oxidam, formando produto de tonalidade azul ou rosa, respectivamente.

    2. Reduo de Nitratos

    A capacidade de um microrganismo reduzir nitrato a nitrito uma caracterstica importante utilizada na identificao e na diferenciao de espcies de muitos grupos de microrganismos. Todas as enterobactrias, exceto certos biotipos de Panthoea agglomerans e Erwinia, reduzem nitratos. Os microrganismos que reduzem nitratos tm a capacidade de retirar oxignio destes para formar nitritos e outros produtos de reduo.

    A presena de nitritos no meio teste evidenciada pela cor vermelha aps adio do reativo de Griess-Ilosvay, composto de duas solues: soluo A (cido sulfanlico 0,8g, cido actico 30mL, gua destilada 75mL) e soluo B (alfa-naftilamina 0,5g, cido actico 30mL, gua destilada 75mL).

    3. Pesquisa da produo de indol

    O indol um dos produtos metablicos de degradao do aminocido triptofano. As bactrias que possuem a enzima triptofanase so capazes de hidrolisar e desaminar o triptofano com produo de indol, cido pirvico e amnia. A prova est baseada na formao de um complexo de cor vermelha quando o indol reage com o grupo aldedo do p-dimetilaminobenzaldedo (reativos de Kovacs ou Ehrlich).

    4. Prova do Vermelho de Metila VM

    uma anlise quantitativa de produo de cidos fortes (ltico, actico, frmico), a partir da glicose, por meio da via da fermentao cida mista. Como muitas espcies de enterobactrias podem

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    produzir quantidades suficientes de cidos fortes detectveis pelo indicador vermelho de metila, durante as fases iniciais da incubao, somente os organismos que podem manter esse pH baixo aps incubao prolongada (48h a 72h), superando o sistema estabilizador de pH do meio, que podem ser chamados de vermelho de metila positivos. Para reduzir o tempo de incubao e leitura do teste, pode ser empregada, como alternativa, a semeadura da cepa em 1mL do meio bsico, envasado em tubos 18x180, e aps o perodo de 24 horas, efetivada a adio do reativo conforme a metodologia original e leitura conclusiva.

    5. Prova de Voges-Proskauer VP

    O cido pirvico, composto principal formado pela degradao fermentativa da glicose, metabolizado por meio de vrias vias, de acordo com os sistemas enzimticos que possuem as diferentes bactrias. Uma dessas vias leva produo de acetona (acetil-metil-carbinol), um subproduto inativo. Os microrganismos do grupo Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia produzem acetona como principal subproduto do metabolismo da glicose e formam quantidades menores de cidos mistos. Na presena de oxignio atmosfrico e de hidrxido de potssio a 40%, a acetona convertida em diacetila e o alfa-naftol atua como catalisador para revelar um complexo de cor vermelha. Esse teste pode ser agilizado quanto execuo e leitura, efetuando semeadura da cepa em 1mL do meio bsico envasado em tubos 18x180 e, aps o perodo de 24 horas, efetivada a adio dos reativos (0,2mL de KOH 40% e 0,6mL de -naftol 5%), repouso por 30 minutos e leitura conclusiva.

    Mecanismo bioqumico dos testes de VM e VP

    Glicose

    cido pirvico

    Acetilmetilcarbinol(Acetona)

    Fermentao cida mistapH < 4,5

    (VM +)Butilenoglicol Diacetila KOH + O2

    Alfa-naol

    Complexo vermelho (VP +)

    6. Utilizao do citrato

    O citrato de sdio um sal de cido ctrico, composto orgnico simples, que constitui um dos metablitos do ciclo dos cidos tricarboxlicos (Ciclo de Krebs). Algumas bactrias podem obter energia

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    por via diferente da fermentao de carboidratos, utilizando citrato como nica fonte de carbono. A avaliao dessa caracterstica importante para identificao de certos gneros e espcies da famlia Enterobacteriaceae. Os meios de cultura empregados para detectar a utilizao de citrato so isentos de protenas e carboidratos como fontes de carbono.

    O meio de cultura tem como nica fonte de carbono o citrato de sdio, um nion, apresentando ainda fosfato de amnia como nica fonte de nitrognio. As bactrias capazes de utilizar o citrato tambm so capazes de extrair nitrognio do sal de amnio, levando alcalinizao do meio a partir da converso do NH3 em hidrxido de amnia (NH4OH). Como indicador, utilizado o azul de bromotimol, que nas reaes positivas (pH > 7.6) torna o meio de tonalidade azul.

    7. Hidrlise da Ureia

    A urease uma enzima presente em muitas espcies de microrganismos que podem hidrolisar a ureia. A ureia uma diamina do cido carbnico; todas as aminas so facilmente hidrolisadas com liberao de amnia e de dixido de carbono. A amnia reage em soluo para formar carbonato de amnio, resultando na alcalinizao e aumento do pH do meio.

    Podem ser utilizados dois meios para a deteco de urease, o caldo ureia de Stuart e o gar Ureia de Christensen. O primeiro tamponado com sais de fosfato a um pH 6,8, sendo indicado para identificao de microrganismos produtores de grandes quantidades de amnia para superar o sistema e elevar o pH do meio para produzir uma viragem do indicador (> 8.0), sendo seletivo para espcies de Proteus. O gar Ureia de Christensen possui um sistema tampo muito mais fraco, permitindo detectar produes menores de amnia, sendo, portanto, apropriado para a anlise de bactrias que apresentam formao reduzida de urease ativa.

    8. Produo de sulfeto de hidrognio H2S

    Capacidade de certas espcies bacterianas para liberar enxofre na forma de H2S a partir de aminocidos ou de outros compostos. A produo de H2S pode ser detectada em um sistema analtico se as seguintes condies estiverem presentes: liberao de sulfeto a partir da cistena ou do tiossulfato por ao enzimtica bacteriana; acoplamento do sulfeto com o on hidrognio para formar H2S; deteco do H2S pelos sais de metais pesados, tais como ferro, bismuto ou chumbo, na forma de sulfeto de metal pesado, um precipitado negro.

    H2S + metal pesado = sulfeto = precipitado negro9. Descarboxilases

    As descarboxilases representam um grupo de enzimas substrato especficas, capazes de atuar sobre a poro carboxila dos aminocidos, formando aminas de reao alcalina. Lisina, arginina e ornitina so os trs aminocidos habitualmente avaliados na identificao das enterobactrias cuja descarboxilao resulta na liberao das seguintes aminas especficas:

    Lisina cadaverina

    Ornitina putrescina

    Arginina citrulina

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    Na converso de arginina para citrulina intervm uma dehidrolase, ao invs de uma descarboxilase, visto que, na primeira etapa, o NH2 retirado da arginina. Em sequncia, a citrulina transformada em ornitina que, em seguida, sofre descarboxilao para formar putrescina.

    Durante os perodos iniciais da incubao, o meio torna-se amarelo devido fermentao da glicose presente. Se o aminocido for descarboxilado, formam-se aminas alcalinas e o meio volta cor prpura original.

    10. Fenilalanina desaminase

    A fenilalanina um aminocido que, por desaminao, forma um cetocido, o cido fenilpirvico. Entre os membros da famlia Enterobacteriaceae, somente espcies dos gneros Proteus, Morganella e Providencia possuem a enzima desaminase, necessria para essa converso.

    O teste da fenilalanina baseado na deteco de cido fenilpirvico, o qual liberado no meio, aps o crescimento do organismo teste. Sua presena visualizada pela adio de uma soluo de cloreto frrico a 10%, quando aparece uma cor verde.

    Fenilalanina desaminao __ cido fenil pirvico ____________ precipitado verde (piruvato)Cloreto frrico 10%

    11. Fermentao de carboidratos

    So extensivamente empregadas nos meios de cultura como fonte de energia para a bactria e, mais particularmente, para diferenciao de gneros e identificao de espcies. A fermentao um processo metablico de oxidao-reduo que tem lugar em um ambiente anaerbico, no qual um substrato orgnico serve como aceptor final de hidrognio (eltron) ao invs do oxignio. Nos sistemas de provas bacteriolgicas, esse processo detectado por observao da mudana de cor dos indicadores de pH quando os produtos cidos so formados. A fermentao dos carboidratos produz cido e gs ou somente cido, sendo que a produo de gs (dixido de carbono e hidrognio) se detecta pelo acmulo de gs em um tubo de vidro (tubo de Durham) invertido no meio. A fermentao de substratos orgnicos, tais como carboidratos, resultam em produtos finais reduzidos e oxidados.

    Quadro 14 - Caractersticas bioqumicas de Salmonella spp.

    Meios Reaes

    Ureia Reao negativa

    LDC Lisina descarboxilase

    Positivo: Reao alcalina (cor prpura do meio) e amarelo no meio controle (exceto S. Paratyphi)

    ODC Ornitina descarboxilase

    Positivo: Reao alcalina (cor prpura do meio) e amarelo no meio controle (exceto S. Gallinarum ODC negativo)

    VM Vermelho de metila Colorao vermelha do meio aps adio do reagente

    (continua)

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    37

    Meios Reaes

    VP Voges-Proskauer Meio sem alterao aps adio dos reagentes

    Fenilalanina desaminase Meio inalterado aps colocao do reagente

    Utilizao do citrato Positivo: Reao alcalina cor azul do meio

    SIM

    Indol Negativo anel amarelo aps colocao do reagente Kovacs

    H2SPresena de pigmento negro de qualquer intensidade ou somente na picada (cepas imveis)

    Motilidade Crescimento ao longo da picada (imvel) ou turvao do meio (mvel)

    Fermentao de acares

    Glicose Positivo (reao cida) com/sem gs no tubo de Durhan

    Lactose Negativo/Positivo

    Manitol Positivo

    Sacarose Negativo

    Quadro 15 - Percentuais de positividade de Salmonella spp. nas provas bioqumicas

    Meios de cultura Reao positiva ou negativa Percentual de Salmonella que apresenta essa reao1

    TSI glicose (cido) + 100

    TSI glicose (gs) + 91,9 2

    TSI lactose - 99,2 3

    TSI sacarose - 99,5

    TSI H2S + 91,6

    LIA + 98

    SIM (H2S) + 97

    SIM (indol) - 98,9

    SIM (motilidade) + 97

    Hidrlise da ureia - 99

    Lisina descarboxilase + 94,6

    Ornitina descarboxilase + 97

    Reao de Voges-Proskauer - 100

    Reao do Indol - 98,9

    Notas: 1 Esses percentuais indicam incidncia de cepas com reaes marcadas como + ou -.2 S.Typhi anaerognica. 3 Salmonella enterica subespcie arizonae: reaes +/ para lactose, -galactosidase positiva; Salmonella enterica subespcie salamae: reao para lactose e -galactosidase.

    (continuao)

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    Quadro 16 - Caractersticas bioqumicas diferenciais de Salmonella spp.,Proteus sp., Citrobacter sp. e Edwardsiella tarda

    Citr

    obac

    ter f

    reun

    dii

    Ciro

    bact

    er d

    iver

    sus

    Citr

    obac

    ter

    amal

    onat

    icus

    Edw

    ards

    iella

    tard

    a

    Prot

    eus m

    irab

    ilis

    Prot

    eus v

    ulga

    rsis

    Salm

    onel

    la sp

    p.

    Salm

    onel

    la T

    yphi

    Glicose (gs) +/- + + + + +/- + -

    Fermentao

    Manitol + + + - - - + +

    Lactose +/- +/- -/+ - - - - -

    Sacarose +/- -/+ -/+ - -/+ + - -

    Dulcitol -/+ -/+ - - - - + -

    ONPG +/- + + - - - - -

    Vermelho metila + + + + + + + +

    Voges-Proskauer - - - - +/- - - -

    Indol -/+ + + + - + - -

    Citrato Simmons +/- + + - +/- -/+ + -

    Acetato -/+ +/- +/- - -/+ -/+ + -

    Malonato -/+ + - - - - - -

    H2S +/- - -/+ + + + + +

    Mobilidade +/- + + + + + + +

    Hidrlise ureia -/+ +/- +/- - + + - -

    Fenilalanina desaminase - - - - + + - -

    Lisina descarboxilase - - - + - - + +

    Arginina dehidrolase +/- +/- +/- - - - +/- -

    Ornitina descarboxilase - + + + + - + -

    KCN +/- - + - + + - -

    Nota: + : positivo; - : negativo.

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    Quadro 17 - Diferenciao bioqumica entre S. enterica subespcie enterica, Citrobacter sp. e Edwardsiella tarda

    S. entericasub. enterica

    Citrobacterfreundii

    Citrobacterdiversus

    Edwardsiellatarda

    Descarboxilao:

    Lisina + - - +

    Ornitina + [-] + [+]

    Indol - - + +

    CitratoSimmons

    + + + -

    H 2S +/ [+] - +

    Urease - +/- +/-

    KCN - + + -

    ONPG - + - -

    Notas: + : positivo; - : negativo; [+]: 76 a 89% positivo; [-]: 11 a 25% negativo.

    Quadro 18 - Diferenciao entre Citrobacter freundii e Salmonella arizonae e S. diarizonae

    LDC1 Glicerol Malonato ODC2 Gelatinase

    Citrobacter freundii - + - - -

    Salmonella arizonae + - + + + (lenta)

    Salmonella diarizonae + - + + + (lenta)

    Notas: 1Lisina descarboxilase. 2Ornitina descarboxilase.

    Quadro 19 - Diferenciao entre Salmonella Paratyphi C e S. Choleraesuis

    Dulcitol H2S Mucato

    S. Paratyphi C (Vi + ou Vi-) + + -

    S. Choleraesuis - - -

    S. Choleraesuis var. Kunzendorf - + -

    Nota: S. Paratyphi C adaptada ao homem e S. Choleraesuis possui caracterstica ubiquitria.

  • 40

    Antgenos comuns: todas as espcies da famlia Enterobacteriaceae apresentam um antgeno comum, tambm designado de antgeno de Kunin. Sua presena usualmente no avaliada, tendo em vista que no representa um critrio relevante para a diferenciao entre gneros ou espcies.

    Antgeno de parede ou antgeno O Ohne: composio lipopolissacardica (hexosamina 3.5% a 4.5%; complexo fosfolipdico 20% a 30%; polissacardeos 60%). termoestvel (1hora/100oC), no sendo destrudo pelo lcool etlico a 50oGL. Esse antgeno composto de trs partes:

    poro lipdica, responsvel pela toxicidade e caractersticas pirognicas; poro basal ou core; polissacardeo, caracterstico da especificidade somtica das formas lisas (S).

    constitudo de cadeias repetitivas, cujo arranjo espacial confere natureza definida. Esta, aliada ao tipo de ligao, determina a especificidade dos antgenos O.

    Cepas em fase lisa (S Smooth) apresentam colnias com superfcies homogneas, brilhantes e bordos regulares indicativos de antgeno O completo. A ocorrncia de mutao que afete sua poro basal, ou na sntese de sua cadeia, resulta na perda da especificidade do antgeno. So designadas rugosas R (Rough) de superfcie e bordos irregulares. So autoaglutinveis em soluo salina, facilmente fagocitveis e sensveis ao do complemento e, como consequncia, perdem sua capacidade patognica.

    No procedimento laboratorial para a confirmao antignica, a aglutinao das clulas bacterianas (somtica ou antgeno O) pelo antissoro especfico apresenta como caracterstica a formao de grnulos finos no dissociveis pela agitao, tendo em vista que a reao ocorre pela inter-relao das paredes das clulas bacterianas.

    Antgeno flagelar ou antgeno H (Hauch): est presente nas enterobactrias mveis e sua composio proteica, designada flagelina. As diferenas antignicas surgem devido a variaes na estrutura primria (contendo aminocidos) das diferentes molculas de flagelina.

    A estrutura flagelar possui como caracterstica importante a termolabilidade, podendo ser destrudo a 100oC por uma hora, bem como aps ao lenta do lcool 50oGL, sendo resistente soluo de formol a 0,5%.

    8 Aspectos Gerais Antgenos das Enterobactrias

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    41

    A aglutinao flagelar apresenta como caracterstica a formao de grumos espessos que se dissociam rapidamente por meio de agitao. Esta ocorre em tempo mais rpido do que aglutinao somtica, devido ao elevado nmero existente na clula, quando comparado aglutinao somtica (entre as clulas bacterianas).

    O arranjo espacial e as caractersticas intrnsecas ao gnero possibilitam a produo de dois tipos de flagelos distintos. Em uma populao bacteriana de uma cepa de Salmonella spp., que produza dois tipos distintos de flagelo, a frequncia de variao de clulas que apresentam um dos tipos ou fases na ordem de 104.

    Antgeno de superfcie ou envoltrio Vi (Flix e Pitt): apresenta sua localizao espacial externa, a qual impede a deteco do antgeno somtico. Usualmente, encontra-se presente em cepas de S. Typhi isoladas de pacientes, podendo tambm ser detectados em S. Paratyphi C e S. Dublin. So termolbeis, podendo ser destrudos pelo aquecimento da suspenso a 100oC/10 a 15 minutos. Apresenta como relevncia a possibilidade de uso como ferramenta epidemiolgica por meio de um conjunto de preparados fgicos.

  • 42

    A sorotipificao constitui importante ferramenta epidemiolgica complementar na identificao de Salmonella spp., permitindo determinar a prevalncia/emergncia ou apontar tendncias de um sorovar em distintas zonas geogrficas, bem como identificar surtos, conhecer as fontes de infeco e vias de transmisso. A distribuio dos sorovares esto catalogadas no esquema de Kauffmann e White (POPPOF; MINOR, 2001) e envolve a identificao dos antgenos somticos e flagelares.

    Esquema de Kauffmann-WhiteBaseado nos componentes antignicos somticos O e flagelares H, foi estabelecido o esquema

    denominado Kauffmann-White, que contm informaes quanto s espcies, subespcies e apresenta listadas as frmulas antignicas de todos os sorovares. Sua editorao efetuada pelo Centro Colaborador para Referncia e Pesquisa em Salmonella da Organizao Mundial de Sade (Instituto Pasteur-Paris), sendo revisado anualmente quanto caracterizao de novos sorovares. A editorao completa dessa listagem efetivada a cada cinco anos.

    Apresenta-se sob a forma de tabela, contendo o conjunto das caractersticas antignicas. Compreende na primeira coluna a estrutura somtica, cujos sorovares que possuem tais caractersticas so identificados por letras maisculas. Ex.: grupo A (O:2), grupo B (O:4), grupo C1 (O:6,7), grupo C2 (O:6,8,20), grupo D1 (O:9), grupo E1 (O:3,10), grupo E2 (O:3,15), grupo E4 (O:1,3,19) etc.

    A segunda e a terceira colunas apresentam suas estruturas flagelares, indicadas por letras minsculas e nmeros,fase 1, e a fase 2, representada por nmeros arbicos, alm de letras minsculas.

    Em relao aos antgenos O e H, alguns aspectos devem ser considerados:

    1. Antgeno O de Salmonella spp.:

    O grupo antignico identificado por alguns fatores, como: O:4, O:9. Outros tm pouco ou nenhum valor discriminatrio e se apresentam normalmente associados, por exemplo: O:12, com O:2, O:4 e O:9; S. Paratyphi A (O:1,2,12), S. Typhimurium (O:1,4,5,12) e S. Enteritidis (O:1,9,12).

    Determinados antgenos surgem como consequncia de uma modificao da estrutura, por exemplo: O:1 resulta da insero de uma cadeia de galactose no polissacardeo e O:5, de uma reao de acetilao, presente nas unidades repetidas do polissacardeo, responsvel pela especificidade, por exemplo: O:4,12 como o caso do sorovar S. Typhimurium O:1,4,5,12.

    9 Caracterizao Antignica de Salmonella spp.

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    43

    2. Antgenos H de Salmonella spp.:

    Os fatores antignicos H de Salmonella so representados por letras minsculas nas fases especficas (H1), como i em S. Typhimurium e z10 em S. Hadar, ou associadas, q, m, f, g, h etc. A outra fase, definida como no especfica ou H2, representada por nmeros arbicos, como 1,2; 1,5; 1,6; 1,7, alm de letras minsculas e.n, x, z4, z6 etc.

    Identificao antignicaDeterminadas caractersticas bioqumicas especficas podem ser observadas em alguns

    sorovares, como S. Typhi: ausncia de gs em glicose, produo reduzida de H2S, lisina descarboxilase positiva, ornitina descarboxilase e utilizao do citrato de Simmons negativas; S. Paratyphi A: produo de gs em glicose, ornitina descarboxilase positiva, produo de H2S, lisina descarboxilase e citrato de Simmons negativas. Entretanto, a confirmao do sorovar somente poder ser dada por meio da identificao antignica conclusiva.

    Principais cuidados para a execuo do teste Nunca utilizar crescimento a partir de meios de cultura que contenham carboidratos. Semear, preferentemente, a cepa em tubo 13x100, contendo gar nutriente inclinado,

    envasado com bisel longo (4cm a 5cm). Preparar suspenso utilizando soluo salina (0.85% NaCl). A suspenso dever apresentar turbidez semelhante ao tubo 3 da escala de MacFarland.

    Usualmente, o volume de soluo salina adicionada de aproximadamente 1,5mL. Realizar o teste somente a partir de cultivos recentes (mximo de 18 a 24 horas de

    crescimento a 37C). Em amostras com antgeno de envoltrio, efetuar a retirada, por meio do aquecimento da

    suspenso em (100C por 15 minutos). Observar se a suspenso apresenta-se homognea antes de realizar o teste, certificando-se

    de que esteja em sua forma lisa. Cepas que apresentarem grumos que se depositam aps um perodo em repouso so

    consideradas autoaglutinveis e devem ser submetidas a um reisolamento para tentativa de isolamento de cepas lisas. Estas devero ser reavaliadas e, caso persista o perfil de autoaglutinao, encaminhadas ao laboratrio de referncia.

    Execuo do teste de soroaglutinao rpida Semear a cepa isolada em gar nutriente inclinado e incubar 37oC/18h-24h. Preparar suspenso, adicionando soluo salina (0,85g% NaCl). Homogeneizar a suspenso. Observar a homogeneidade da suspenso e, no caso de dvidas, observar ausncia de

    aglutinao em lmina e dar prosseguimento para a confirmao do gnero Salmonella. Em uma lmina de vidro, adicionar uma gota (10l) de antissoro polivalente OH ou

    antissoro polivalente somtico e uma gota da suspenso bacteriana, homogeneizando com o auxlio de uma ala de platina ou com um palito de madeira.

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    44

    Impelir movimentos rotatrios e observar, at o perodo de um minuto, em caixa de Huddleson, a presena de aglutinao (grumos).

    Repetir o procedimento, empregando antissoros polivalentes flagelares. No diagnstico de S. Typhi, empregar inicialmente o antissoro Vi para caracterizao do

    antgeno de envoltrio. Caso a reao seja positiva, aquecer a suspenso em (100oC/15 minutos) reavaliar com antissoro Vi e, caso no seja observada aglutinao, confirmar a estrutura somtica por meio do antissoro OD. Para identificao conclusiva de S. Typhi, efetivar a caracterizao do antgeno flagelar Hd.

    Todas as cepas de Salmonella spp. devem ser encaminhadas para o Laboratrio de Referncia Nacional (IOC/Fiocruz) para identificao antignica conclusiva e realizao de ensaios complementares.

    Variaes que afetam a Tipagem Antignica em Salmonella spp.

    1. Variao Capsular V-W: fenotpica

    Impede aglutinao somtica. Utilizada em avaliao epidemiolgica (lisotipia em S.Typhi).

    2. Variao da Estrutura Somtica S-R: genotpica

    de natureza genotpica. Determina alteraes quanto morfologia colonial. Usualmente, apresenta ausncia de estabilidade em soluo salina.

    3. Variao Flagelar OH-O: fenotpica

    Permite a formao de grandes flocos que se dissolvem com agitao. Importante na caracterizao conclusiva dos sorovares de Salmonella spp. Quando da perda de uma de suas fases, podem ser, na maioria das vezes, recuperados,

    utilizando o meio de Craigie (gar semisslido 0,5%):

    Ilustrao 1 - Induo de fase: semeadura em meio de Craigie

    Semear a cepa

    Adicionar antissoro de fase

    conhecida

    Repicar cepa e caracterizar a fase

    desconhecida

    4. Variaes Mediadas por Fagos

    Presena de fagos temperados: grupos A, B, D de Salmonella spp. Converso lisognica: frao 12 (Salmonella spp.)

  • 45

    1. Principais aspectos quanto manuteno e estocagem:

    Somente devem ser recebidos meios de cultura, adquiridos por meio de compra, cujo prazo de validade seja seis meses da data de recebimento.

    Apertar todas as tampas dos frascos. Observar prazo mximo de estocagem. Registrar o quantitativo em estoque, recepo e sada. Nenhum meio de cultura pode ser utilizado aps a data de vencimento. A revalidao somente pode ser efetuada pelo fabricante. Os meios de cultura preparos devem ser estocados sob proteo da luz solar. A manuteno deve, preferencialmente, ser efetuada sob refrigerao a 4C.

    2. Preparo dos meios de cultura:

    Na re-hidratao ou preparo devem ser seguidas, obrigatoriamente, as instrues do fabricante.

    Preparar a quantidade mnima, suficiente para o uso. Observar o tempo de validade de meios preparados, estocados sob condies adequadas.

    Quadro 20 - Durao mxima de meios de cultura Meio slido envase em placas de Petri

    Meio de cultura 4C 4C Embalagem plstica

    gar sangue 15 dias 50 dias

    gar EMB 15 dias 60 dias

    gar MacConkey 15 dias 60 dias

    gar SS 6 dias 10 dias

    gar XLD 5 dias 10 dias

    gar Hektoen 5 dias 10 dias

    gar Verde Brilhante 2 dias 4 dias

    gar Sulfito Bismuto 24 horas 24 horas

    10 Meios de Cultura

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    Quadro 21 - Durao mxima de meios de cultura Meio slido envase em tubos

    Meio de culturaBucha de algodo

    4C No semanas

    Bucha de algodo TA

    No semanas

    Fechamento hermticoplstico

    4C No meses

    gar LIA 1-2 1-2 3-6gar TSI 1-2 2-4 3-6gar KIA 3-4 2-4 2-4gar Mller Hinton 1-2 2-4 3-6gar Nutriente 3-4 1-2 2-4gar Ureia 3-4 1-2 2-4gar Citrato 3-4 1-2 2-4gar Fenilalanina 3-4 1-2 2-4

    Quadro 22 - Durao mxima de meios de cultura Meio lquido - envase em tubos

    Meio de cultura

    Bucha de algodo

    4CNo semanas

    Bucha de algodo

    TANo semanas

    Fechamento hermtico

    Plstico 4CNo meses

    Lacre de alumnio

    TANo meses

    C. Mller Hinton 3-4 1-2 2-4 3-6C. Infuso Corao 3-4 1-2 2-4 3-6C. Tripticase Soja 3-4 1-2 2-4 3-6C. Peptonado 3-4 1-2 2-4 3-6C. Nitrato 3-4 1-2 2-4 3-6C. Selenito 3-4 1-2 2-4 3-6Meio-fermentao carboidratos 3-4 1-2 2-4 3-6

    3. Controle de qualidade dos meios de cultura

    Controlar o pH de cada partida de meio. Efetuar teste de esterilidade. Realizar teste de desempenho: inocular uma ala do crescimento da cepa padro e incubar

    nas condies de rotina at obter turvao correspondente ao tubo 0.5 da escala de MacFarland.

    Anotar e registrar resultados em cada lote, como o exemplo a seguir.

    Ilustrao 2 - Ficha de registro das caractersticas de qualidade dos meios de cultura

    Data Controle

    Data - Lote Fabricao

    Data Vencimento pH

    Desempenho+/-

    Esterilidade+/- Responsvel

    Meio de cultura: ______________________________________Cepas para controle: Positivo: ___________________________

    Negativo: __________________________

  • 47

    Figura 1 - Invaso de Salmonella Typhimurium em cultura de clulas

    Figura 2- Fotomicrografia de Salmonella Enteritidis

    Figura 3 - Crescimento de Salmonella spp. em Agar Sangue

    11 Figuras

    Fonte disponvel em:

    Fonte disponvel em:

    Fonte disponvel em:

    http://science.nasa.gov/science-news/science-at-nasa/2003/01dec_yeast/http://science.nasa.gov/science-news/science-at-nasa/2003/01dec_yeast/http://www.healthhype.com/tag/salmonellahttp://www.path.cam.ac.uk/partIB_pract/P16/

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    48

    Figure 4- Crescimento de Salmonella spp. em Agar Desoxicolato CitratoColnias

    Figura 5 - gar Mac Conkey morfologia colonial de Salmonella spp.

    Figura 6 - gar XLD morfologia colonial de Salmonella spp.

    Figura 7 - gar Entrico Hektoen morfologia colonial de Salmonella spp.

    Fonte disponvel em:

    Fonte disponvel em:

    Fonte disponvel em:

    Fonte disponvel em:

    http://www.biotechlearn.org.nz/media/images/news_images/salmonella_sample

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    49

    Figura 8 - gar Eosina- Azul de Metileno!

    Figura 9 - gar Salmonella-Shigella gar SS colonias de Salmonella spp.

    Figura 10 - TSI gar ferro trs acares

    Figura 11 - LIA gar Lisina Ferro

    Fonte: (KONEMAN; SOMMERS,1989)

    Fonte disponvel em:

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    50

    Figura 12 - Reao do Vermelho de Metila VM

    Figura 13 - Positivo: Reao de Voges-Proskauer VP

    Figura 14 - Utilizao do Citrato de Simmons

    Figura 15 - Descarboxilao de aminocidos (Moeller)

    Fonte disponvel em:

    Fonte disponvel em:

    Fonte disponvel em:

    Fonte disponvel em:

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    51

    Figura 16 - Utilizao do Malonato

    Figura 17 - Utilizao da ureia- ;gar Ureia de Christensen

    Figura 18 - Meio SIM (H2S; Indol; Mobilidade)

    Fonte disponvel em:

    Fonte disponvel em:

    Fonte disponvel em: Notas: 1: no inoculado; 2: H2S - Indol + Mobilidade+; 3:H2S - Indol Mobilidade-; 4: H2S + Indol Mobilidade+.

    1 2 3 4

  • 52

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  • 55

    Anexo

    Meios de cultura e reagentes: para o preparo dos meios de cultura desidratados, reagentes e solues comercializados e no discriminados a seguir, obedecer s recomendaes dos fabricantes.

    Meios de Pr-enriquecimento

    gua Peptonada 1% Tamponada (pH 7,2)

    Peptona 10,0gCloreto de sdio 5,0gFosfato de sdio dibsico 3,5gFosfato de potssio monobsico 1,5ggua destilada 1000mL

    Suspender e dissolver os componentes em gua destilada, esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos.

    pH final: 7,2 0,2 a 2C

    Caldo Tetrationato

    Polipeptona 5gSais biliares 1gCarbonato de clcio 10gTiossulfato de sdio (penta-hidratado) 30ggua destilada 1000mL

    Suspender os componentes em gua destilada e dissolver por aquecimento at a ebulio. Distribuir alquotas de 10mL em tubos de ensaio de 16mmx160mm previamente esterilizados. No autoclavar. Estocar por at duas semanas a 5C-10C.

    pH final 8,4 0,2 a 25C.

    No momento da utilizao do meio, adicionar para cada 10mL de caldo tetrationato, 0,2mL de soluo de iodo-iodeto de potssio e 0,1mL de soluo de verde brilhante a 0,1%.

    O meio no dever ser estocado aps o acrscimo das solues anteriormente descritas.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    56

    Caldo Rappaport-Vassiliadis

    Meio BaseTriptona 5gCloreto de sdio 8gFosfato monobsico de potssio 1,6ggua destilada 1.000mL

    O meio base dever ser preparado no dia de sua utilizao.

    Soluo de Cloreto de MagnsioCloreto de magnsio hexa-hidratado 400ggua destilada 1.000mL

    Estocar em frasco escuro, temperatura ambiente, por at um ano.

    Soluo de Verde Malaquita OxalatoVerde malaquita oxalato 0,4 ggua destilada 1.000 mL

    Estocar em frasco escuro, temperatura ambiente, por at seis meses.

    Preparo e distribuio final do meioPara o preparo do meio completo, acrescentar para cada 1.000mL do meio base: 100mL de

    soluo de cloreto de magnsio e 10mL de soluo de verde malaquita oxalato. Dispensar alquotas de 10mL em tubos de 16mm x 160mm. Autoclavar a 115C por 15 minutos. Estocar o meio completo em refrigerador e utilizar em at um ms aps o preparo.

    pH final 5,5 0,2 a 25C

    Meios de Triagem

    Meio de Triagem de Costa e Vernin CV

    A - Base semisslidaPeptona 20gCloreto de sdio 5gSoluo de Azul de Timol 3mLIndicador de Andrade 10mLgar-gar. 5ggua destilada 1.000mL

    Adicionar todos os elementos gua e aquecer at dissolver completamente o gar. Ajustar o pH a 7,3 ou a 7,4. Distribuir quantidades exatas do meio em bales e esterilizar a 121C por 15 minutos.

    B - Base SlidaPeptona (Bacto) 1gTriptona ou tripticase 5g

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    57

    Tiossulfato de sdio 0,2gSulfato ferroso amoniacal 0,2gSoluo de azul de timol 3mLIndicador de Andrade 10mLgar 20ggua destilada 1.000mL

    Adicionar os componentes em gua destilada e aquecer em banho-maria fervente at a completa dissoluo. Ajustar o pH a 7,3 ou a 7,4. Distribuir quantidades exatas do meio em bales e esterilizar a 121C por 15 minutos.

    Preparo e distribuio final do meioFundir as bases e resfriar entre 50C a 60C, aproximadamente. Adicionar, a cada um deles, na

    proporo de 5mL por 100mL de meio, a soluo de ureia e acares. Distribuir, inicialmente, o gar semisslido em volume de 2,5mL em tubos esterilizados de 13mm de dimetro com altura varivel. Deixar solidificar, temperatura ambiente, por cerca de 30 minutos e acrescentar, em seguida, volume idntico, por tubo, da base slida. Inclinar os tubos, de modo a deixar uma base de 2cm a 3cm de altura, aproximadamente.

    Soluo de azul de timol

    Azul de timol 1,6gNaOH 0,1N 34,4mLgua destilada 65,6mL

    Indicador de AndradeFucsina cida 0,5gHidrxido de Sdio N 16mLgua destilada 100mL

    Dissolver a fucsina em gua destilada e adicionar o hidrxido.

    Soluo de Ureia e acaresUreia 20gLactose 30gSacarose 30ggua destilada 100mL

    Dissolver a mistura por aquecimento brando em banho-maria e esterilizar por filtrao. Conservar em geladeira.

    A semeadura executada com auxlio de agulha, introduzindo-a at o tero superior da metade da camada semisslida e sob a forma de estrias, na superfcie da parte slida. Neste meio, poder ser pesquisada a produo de indol, fixando no tampo, aps a inoculao, uma tira de papel de filtro, embebida no reativo para pesquisa de indol ou ento impregnando o prprio algodo (hidrfilo) na sua base interna, com esse reativo. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    58

    Meio de Triagem IAL (PESSOA; SILVA, 1972)

    Base (Meio de Rugai)Triptona (Difco) 10gExtrato de carne (Difco) 2gCloreto de sdio (Merck) 5gFosfato dissdico (Synth) 2gL-triptofano (Nuclear) 1gAzul de bromotimol (Inlab) soluo alcolica 1,5% 2mLgar (Difco) 11ggua destilada 1.000mL

    Dissolver todos os ingredientes, com exceo do gar e do indicador. Ajustar o pH em 7,40,2, acrescentar o gar, fundir, filtrar e adicionar o indicador. Esterilizar 121C por 15 minutos.

    LisinaExtrato de levedura (Oxoid) 3gGlicose (Synth) 0,5gNitrato de potssio (Merck) 0,5gL-lisina (Ajinomoto) 5ggar (Difco) 4gPrpura de bromocresol(Merck) soluo alcolica 1,6% 1,25mLgua destilada 1.000mL

    Dissolver todos os ingredientes, acertar o pH em 6,40,2, acrescentar o gar e aquecer at completa fuso.

    VascarCera de carnaba (tipo flor) 10gVaselina lquida 90mL

    Reativo de indolp-dimetil aminobenzoaldedo 1gcido arcrbico 2ggua destilada 1.000mL

    Dissolver o p-dimetil aminobenzoaldedo no lcool, adicionar o cido ortofosfrico e gua.

    Soluo substratoCitrato de ferro amoniacal 2gTiossulfato de sdio 2gSacarose 80gGlicose 10gUreia 40ggua destilada 85mL

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    59

    Colocar todos os reagentes em um frasco esterilizado de 200mL, fechar e aquecer a 65C sob agitao frequente at completa dissoluo. Deixar o frasco imerso por uma hora a essa temperatura. Fundir 800mL de Rugai, esfriar a aproximadamente 65C e acrescentar 14mL de substrato.

    Adicionar, em tubos de 12mmx120mm, quantidade de vascar (soluo 3) suficiente para formar um anel de 1mm de espessura. Distribuir 1,5mL do meio Lisina (soluo 2) e esterilizar a 121C por 15 minutos. Deixar os tubos na posio vertical para formao do menisco vedatrio do vascar e adicionar 3mL do meio de Rugai (soluo 1) com o substrato (soluo 5). Colocar o tampo de algodo no reativo do indol (soluo 4). Deixar inclinado de tal maneira que a base seja de aproximadamente um tero da altura do pice.

    Meio Bsico para Fermentao de Carboidratos

    Peptona 10gExtrato de carne 3gCloreto de sdio 5gIndicador de Andrade 10mLgua destilada 1.000mL

    Ajustar pH a 7.2. Distribuir em volumes de 3mL a 5mL e esterilizar a 121C por 15 minutos. Os carboidratos glicose, lactose, sacarose e manitol so incorporados ao meio, na concentrao final de 1,0%, os demais carboidratos so geralmente utilizados a 0,5%.

    A glicose, manitol, dulcitol, salicina, adonitol e inositol podem ser includos ao meio bsico e esterilizados a 121C por 15 minutos, pois resistem a esse processo. No entanto, lactose, sacarose, celobiose, arabinose, ramnose e xilose devem ser esterilizados parte, principalmente sob a forma de solues a 10% ou a 20%, recorrendo-se, para tanto, aos processos fsicos, como a filtrao ou o aquecimento a 121C por 10 minutos, seguido de resfriamento brusco. A presena de cido no meio, em decorrncia do metabolismo da bactria, revelada pela viragem do indicador de Andrade para uma colorao avermelhada.

    Caldo Ureia

    Extrato de levedura 0,1gFosfato de sdio dibsico 9,5gFosfato de potssio monobsico 9,1gUreia bacteriolgica 20gVermelho de fenol 0,01ggua destilada 1000mL

    Suspender os componentes em gua destilada e homogeneizar at a total dissoluo. Esterilizar por filtrao. Distribuir alquotas de 3mL em tubos de ensaio de 13X100mm.

    pH final 6,8 0,2 a 25C.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp

    60

    Meio para Manuteno e Envio de Cepas

    gar nutriente fosfatado** *Extrato de carne 3g*Peptona 10g*Cloreto de Sdio (NaCl) 3gFosfato dibsico de sdio (12 H2O) 2g*gar-gar 15 ggua destilada 1.000mL

    Ajustar o pH 7.2-7.4. Distribuir em tubos de hemlise, em volumes de 3mL a 4mL/tubo e esterilizar a 121oC por 15 minutos. Deixar solidificar em posio discretamente inclinada (bisel curto). A semeadura do meio deve ser realizada por duas a trs picadas, at a profundidade, e por estrias, na superfcie. Substituir o tampo de algodo dos tubos por rolhas de borracha ou por silicone previamente esterilizadas. Empregar as condies normais de tempo e de temperatura de incubao. Para manuteno por longo perodo, as cepas repicadas devem ser mantidas ao abrigo da luz.

    * A formulao citada poder ser substituda por meio comercializado (gar nutriente), desde que mantidas as concentraes anteriormente mencionadas, efetuando-se adio somente da(s) droga(s) no existente(s) na formulao bsica.

    ** Essa formulao poder ser utilizada para manuteno e envio de cepas das famlias Vibrionaceae e Aeromonadaceae. Para o preparo do meio, devem ser adicionados 10g de cloreto de sdio (NaCl), em substituio ao peso indicado na formulao acima.

    Solues e Reagentes

    Soluo de iodo-iodeto de potssio

    Iodeto de potssio 5gIodo ressublimado 6ggua destilada estril 20mL

    Dissolver o iodeto de potssio em 5mL de gua destilada estril. Adicionar o iodo e dissolver por agitao. Diluir para um volume final de 20mL.

    Soluo de verde brilhante a 0,1%Corante verde brilhante 0,1g gua destilada estril 100mL

    Dissolver o corante em gua esterilizada

    Soluo salina a 0,85%Cloreto de sdio 8,5ggua destilada 1.000mL

    Dissolver o cloreto de sdio em gua destilada. Autoclavar a 121C por 15 minutos. Resfriar temperatura ambiente.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da

    Salmonella spp.

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    MINISTRIO DA SADE

    Braslia DF2011

    Disque Sade

    0800.61.1997

    Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade

    www.saude.gov.br/bvs

    Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade

    www.saude.gov.br/svs

    Ministrio daSade

    Secretaria deVigilncia em Sade

    ISBN 978-85-334-1792-2

    TaxonomiaCaractersticasGeraisHabitatEcologiaCaractersticas Clnicas e Patogenia Epidemiologia Diagnstico Laboratorial Aspectos Gerais Antgenos das EnterobactriasCaracterizao Antignica de Salmonella spp.Meios de CulturaFigurasRefernciasAnexo

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