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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
DETECÇÃO MOLECULAR DE
Salmonella sp. EM AMOSTRAS AVÍCOLAS
Nadielly Xavier de Medeiros
Orientadora: Profª. Drª. Cíntia Silva Minafra e Rezende
GOIÂNIA 2013
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NADIELLY XAVIER DE MEDEIROS
DETECÇÃO MOLECULAR DE
Salmonella sp. EM AMOSTRAS AVÍCOLAS
Dissertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal à Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás Área de Concentração:
Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia
de Alimentos
Linha de Pesquisa:
Controle de qualidade de alimentos
Orientador:
Profª. Drª. Cíntia Silva Minafra e Rezende
- EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Albenones José de Mesquita –
EVZ/UFG
Prof. Dr. Cristiano Sales Prado –
EVZ/UFG
GOIÂNIA 2013
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“Todo mundo ama um dia, todo mundo chora, um
dia a gente chega, no outro vai embora. Cada um
de nós compõe a sua história, cada ser em si
carrega o dom de ser capaz e ser feliz...”
Almir Sater
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Ao meu pai, que acreditou nos meus sonhos,
que me permitiu viver e ao mesmo tempo
sonhar e lutar para alcançar meus objetivos.
Embora não presente fisicamente aqui hoje,
sei que em algum lugar está de alguma formar
compartilhando deste momento e da minha
felicidade pela conclusão de mais uma etapa na
minha vida.
Dedico
viii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida e saúde que me proporciona todos os dias.
À minha orientadora Profª. Drª. Cíntia Silva Minafra e Rezende por toda a
atenção, pelo apoio, dedicação, compreensão e amizade e por compartilhar o seu
conhecimento.
À Profª Dr. Sabrina Castilho Duarte e Thaís Miranda Silva Freitas pela ajuda no desenvolvimento deste experimento.
Às amigas do curso de pós-graduação, Aline Pedrosa de Oliveira, Janaina Costa Feistel e Marília Cristina Sola, pelos conselhos e pelos agradáveis e descontraídos momentos que passamos durante o curso.
Ao meu amigo e confidente Marcos Paulo Roque.
Aos colegas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água pela compreensão e auxílio.
A todos os professores e funcionários do curso de Mestrado em Ciências
Animal da Universidade Federal de Goiás.
À CAPES pelo apoio financeiro.
Aos meus pais e toda minha família, pelo amor e carinho e por terem
proporcionado a educação que foi a base de minha formação.
Às minhas amigas pela atenção e paciência durante todo o curso e
sempre.
A todos que de alguma maneira ajudaram a realizar este trabalho, muito
obrigada.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 4
2.1 Salmonella sp. .................................................................................................. 4
2.2 Salmonella sp. na avicultura ............................................................................. 4
2.3 Legislação ........................................................................................................ 5
2.4 Contaminação de lotes de frangos ................................................................... 6
2.5 Contaminação de carcaças .............................................................................. 8
2.6 Prevenção e controle da Salmonella ................................................................ 9
2.7 Diagnóstico molecular aplicado à avicultura ................................................... 10
2.7.1 PCR convencional ....................................................................................... 11
2.7.2 PCR em tempo real ..................................................................................... 12
2.7.3 Aplicações da técnica de PCR .................................................................... 13
2.8 Interferências na análise de PCR ................................................................... 14
3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 16
3.1 Amostragem e análises bacteriológicas convencionais.................................. 16
3.2 ELFA .............................................................................................................. 17
3.3 Extração do DNA ............................................................................................ 17
3.4 PCR convencional .......................................................................................... 18
3.5 PCR em tempo real ........................................................................................ 19
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 20
5 CONCLUSÕES ................................................................................................. 29
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 30
x
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Frequência de Salmonella sp. por identificação (isolamento bacteriano
convencional - IBC) e detecção de em caldo de pré-enriquecimento
congelado pelos ensaios VIDAS®-SLM, PCR em tempo real (PCR – rt)
e no PCR convencional (PCR – c) .....................................................20
TABELA 2 Compatibilidade entre presença (+) ou ausência (-) para os ensaios
VIDAS®-SLM, PCR em tempo real (PCR – rt) e PCR convencional
(PCR – c), em caldos positivos pelo IBC e seus respectivos
sorovares.............................................................................................21
TABELA 3 Caldos de pré-enriquecimento negativos ao isolamento bacteriano e
positivos no VIDAS-SLM, PCR em tempo real e/ou no PCR
convencional........................................................................................22
TABELA 4 Amostras positivas à PCR em tempo real separadas por
categoria..............................................................................................25
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
% Por cento
°C
μL
Graus Celsius
Microlitro
μm Micrômetro
CT Cycle Threshold
MgCl2 Cloreto de Magnésio
BGS Ágar verde brilhante com sulfa
XLT4 Ágar xilose lisina tergitol 4
dATP DesoxiAdenosina Trifosfatada
dCTP DesoxiCitidina Trifosfatada
dGTP DesoxiGuanosina Trifosfatada
DNA Ácido desoxirribonucleico
DNases Desoxirribonucleases
DTAs Doenças Transmitidas por Alimentos
dTTP DesoxiTimidina Trifosfatada
dNTP`s
ELFA
Desoxirribonucleotídeos trifosfatados
Enzimas ligadas a anticorpos fluorescentes
FRET Transferência de energia por ressonância de fluorescência
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
mg/mL
mM
pb
miligramas por mililitros
miliMolar
Pares de base
PCR
pH
Reação em Cadeia da Polimerase
Potencial hidrogeniônico
PNSA Programa Nacional de Sanidade Avícola
RIISPOA Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal
RV Rappaport-Vassiliadis
SE Salmonella Enteritidis
SG
S.I.F.
Salmonella Gallinarum
Serviço de Inspeção Federal
SP Salmonella Pullorum
ST Salmonella Typhimurium
TT Tetrationato
UBA União Brasileira de Avicultura
UFC Unidade Formadora de Colônia
UFC/mL Unidade Formadora de Colônia por mililitros
xii
RESUMO
Salmonella é reconhecida como agente etiológico de intoxicações alimentares e
classifica-se como um dos microrganismos de maior relevância à saúde pública,
bem como ao monitoramento dos plantéis avícolas. Esta bactéria está
amplamente distribuída no meio ambiente, e possui portadores assintomáticos, o
que, também, favorece sua disseminação durante etapas do processamento de
alimentos, transformando-se em grande problema para as agroindústrias. O
monitoramento de patógenos em abatedouros de aves demanda a aplicação de
metodologias rápidas e confiáveis. Com o intuito de investigar a presença de
Salmonella em abatedouros, objetivou-se avaliar suabes de depenadeiras e de
calhas de evisceração, carcaças, coração, fígado e moela de aves. As análises
laboratoriais foram desenvolvidas no Laboratório de Bacteriologia e Biologia
Molecular, do Setor de Medicina Veterinária Preventiva da Escola de Veterinária e
Zootecnia da Universidade Federal de Goiás e circunscreveram-se à investigação
laboratorial de caldos de pré-enriquecimento compostos por água peptonada a
1%, adicionados das amostras. Para tanto, após a inoculação das amostras os
caldos foram incubados pelo período de 18 a 24 horas e em seguida congelados
a temperatura de -18°C, para posteriormente, serem analisados. Os métodos
analíticos de eleição, para detecção de Salmonella sp., foram a reação em cadeia
pela polimerase (PCR) convencional e PCR em tempo real, havendo também
verificação para estudos prévios com isolamento bacteriano convencional e
VIDAS-SLM. Os genes alvo foram, respectivamente, iroB e bipA, associados à
virulência da bactéria e sua adaptação frente às situações de estresse. Moela foi
a categoria de amostra de maior percentual de contaminação (13,3%). Verificou-
se que a técnica de PCR em tempo real foi capaz de identificar maior número de
amostras positivas, 22 (7,3%) em comparação à PCR convencional que detectou
cinco (1,6%), no entanto, não houve equivalência à maioria dos resultados prévios
do isolamento bacteriano total. Conclui-se que a PCR em tempo real pode agilizar
o diagnóstico laboratorial, sendo feito pré-enriquecimento seletivo com aplicação
do meio de cultura de forma imediata e que Salmonella está presente em
alimentos de origem avícola e em instalações e equipamentos.
Palavras-chave: diagnóstico, frangos, PCR em tempo real, Salmonella sp.
xiii
ABSTRACT
Salmonella is recognized as an etiological agent of food poisoning and it is
classified as one of the most relevant microorganisms to public health, as well as
to the monitoring of poultry industry. Salmonella is widely spread in environment
and has asymptomatic transmitters, which also favors its spread during food
processing steps, becoming a considerable problem for the processing industry.
Monitoring pathogens in poultry slaughterhouses demands the application of fast
and reliable methodologies. In order to investigate the presence of Salmonella in
slaughterhouses, this study aimed to evaluate swabs of picking machines and
evisceration flume, carcasses, hearts, livers, and gizzards of poultry. Laboratory
tests were developed in the Laboratory of Bacteriology and Molecular Biology,
Department of Veterinary Preventive Medicine, Medicine Veterinary College and
Animal Science of the Universidade Federal de Goiás (Federal University of
Goiás), and circumscribed to the laboratory research of pre-enrichment broths
composed of peptone water to 1%, added to the samples. Therefore, after
inoculation of broth samples were incubated for a period of 18 to 24 hours, and
then frozen at -18 °C for a later analyzes. The analytical methods of choice for
detecting Salmonella sp. were conventional polymerase chain reaction (PCR) and
real-time PCR, there had been also check for previous studies with conventional
bacterial isolation and VIDAS - SLM. Target genes were, respectively, iroB and
bipA, associated to bacterial virulence and its adaptation face to stressful
situations. Gizzard was the sample category with the largest contamination
percentage (13.3%). The real-time PCR technique was able to identify a greater
number of positive samples, 22 (7.3%) compared to 5 (1.6%) by conventional
PCR; however, there was no equivalent to the most previous results of total
bacterial isolation. In conclusion, Real-time PCR can expedite the laboratory
diagnosis, being made selective enrichment with immediately pre-application of
the culture method, and salmonella is present in poultry source food, in
installations, and equipment.
Keywords: broiler, diagnostic, real-time PCR, Salmonella sp.
1
1 INTRODUÇÃO
A partir dos anos de 1970, quando se iniciaram as exportações
brasileiras de carne de frango, a avicultura industrial brasileira foi consolidada
como um segmento moderno fortemente estimulado por políticas públicas
(BELUSSO & HESPANHOL, 2010).
Em 2011, a produção de carne de frango chegou a 13,058 milhões de
toneladas, um crescimento de 6,8% em relação a 2010. Com este desempenho
o Brasil se aproxima da China, hoje o segundo maior produtor mundial, cuja
produção de 2011 teria somado 13,2 milhões de toneladas, abaixo apenas dos
Estados Unidos, com 16,757 milhões de toneladas. Do volume total de frangos
produzido pelo país, 69,8% foi destinado ao consumo interno e 30,2% para
exportações. Com isto, o consumo per capita de carne de frango atingiu 47,4
quilos por pessoa, um novo recorde para o setor (UBA, 2012).
No primeiro trimestre de 2012 foram abatidas 1,363 bilhão de cabeças
de frangos, representando aumento de 3,2% em relação ao trimestre
imediatamente anterior e de 4,3% frente ao mesmo período de 2011. Desde
2010, o abate de frangos tem sido crescente, no comparativo dos mesmos
trimestres de cada ano (IBGE, 2012).
As condições sanitárias constituem grandes barreiras para a
comercialização da carne de frango. As rígidas legislações visam a ausência
de microrganismos que podem colocar em risco a saúde do consumidor
(CARDOSO & TESSARI, 2008).
O perfil epidemiológico das Doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs)
no Brasil é pouco conhecido. São poucos os municípios e estados que dispõem
de estatísticas e dados sobre os agentes etiológicos mais comuns; alimentos
mais frequentemente implicados, população de maior risco e fatores
contribuintes. A incidência varia de acordo com diversos aspectos: educação,
condições socioeconômicas, saneamento, fatores ambientais, culturais e outros
(BRASIL, 2010).
A salmonelose é, no Brasil e no mundo, um desafio para a saúde
pública. Desde a década de 70, tem ocorrido um aumento acentuado e
2
contínuo do número de casos vinculados a determinados sorotipos (CARDOSO
& TESSARI, 2008).
Salmonella sp. está amplamente distribuída na natureza, os animais e o
homem são os principais reservatórios naturais. A existência de portadores
assintomáticos e permanência nos alimentos e no ambiente contribuem para
que este patógeno seja considerado como um dos principais agente envolvidos
em surtos de origem alimentar, portanto assume grande relevância na saúde
pública mundial (CARDOSO & TESSARI, 2008).
As aves são responsáveis pela maior disseminação da Salmonella,
agente causador da salmonelose, desse modo, é imprescindível que medidas
sanitárias sejam implantadas na criação. A alta disseminação desta bactéria na
avicultura e a ocorrência de surtos de enfermidades causam elevados prejuízos
econômicos, tanto para o governo quanto para a indústria produtora
(SHINOHARA et. al., 2008).
A transmissão transovariana e horizontal de Salmonella sp. em ovos
pode ser disseminado e persistir na indústria avícola. Este patógeno é
facilmente disseminado nas excretas de uma ave e permanece no ambiente,
isto pode infectar outras aves por muitos anos, caso não seja feito a
higienização correta do aviário (KOTTWITZ et al., 2008).
A presença de Salmonella sp. em produtos de frangos de abate e seus
derivados, demonstra a importância do controle da infecção dos animais ainda
na criação para conter a cadeia de transmissão da infecção (MOREIRA, 2002).
Sob esse contexto, programas foram criados pelo Ministério da Agricultura,
Pecuária e do Abastecimento (MAPA) para atestar a segurança no sistema de
criação da cadeia produtiva de carnes de aves (BRASIL, 2010).
Métodos moleculares estão sendo bastante utilizados para auxiliar no
monitoramento de agentes causadores de doenças dentro da cadeia de
produção de frangos. Dentre os métodos moleculares destaca-se a PCR
(PEREIRA & PETRECHEN, 2011).
Esta é uma técnica sensível e pode ser facilmente influenciada por
alguns fatores como forma de armazenamento das amostras, quantidades de
reagentes, degradação do DNA, dentre outros (FUJIMOTO et al., 2007; LIMA
et al., 2007; BUTLER, 2012).
3
Na amplificação de DNA utilizando a PCR tornou-se mais uma
alternativa para a detecção de bactérias patogênicas em alimentos. Esta
técnica pode auxiliar no controle de microrganismos causadores de DTAs pois
com ela é possível detectar e localizar os agentes patógenos.
Diante do exposto, objetivou-se com este estudo detectar Salmonella sp.
em alimentos avícolas como carcaças, fígados, corações, moelas e em suabe
de calha de evisceração e suabe de depenadeira.
4
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Salmonella sp.
O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae, foi assim
denominado em homenagem a Daniel E. Salmon, que caracterizou o agente do
paratifo suíno em 1885 (BRASIL, 2008).
Salmonelas são anaeróbias ou aeróbia facultativas, Gram-negativas,
oxidase-negativas, não-esporogênicas, são mesófilas, com temperatura ótima
de crescimento entre 35 e 37°C, possuem o crescimento ótimo em pH entre 6,5
e 7,5, têm a forma de bastonete e medem de 0,7-1,5x2,5 m, geralmente são
móveis com flagelos peritríquios, com exceções da Salmonella Pullorum e
Salmonella Gallinarum que são imóveis (FORSHELL & WIERUP, 2006).
O gênero Salmonella apresenta 2579 sorovares e consiste em duas
espécies, Salmonella enterica e Salmonella bongori. Salmonella enterica é
dividida em seis subespécies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae,
houtenae e indica (GRIMONT & WEILL, 2007).
2.2 Salmonella sp. na avicultura
A salmonelose aviária é considerada a doença bacteriana de maior
impacto na avicultura mundial por causar perdas econômicas e ser uma grande
ameaça à saúde pública. A carcaça do frango, os ovos e seus derivados são
considerados a maior fonte de infecção desse patógeno para o homem
(CARDOSO & TESSARI, 2008).
Dentre os vários sorotipos descritos de Salmonella, Salmonella
Pullorum (SP), agente causador da pulorose, Salmonella Gallinarum (SG),
causador do tifo aviário, a Salmonella Typhimurium (ST) e Salmonella
Enteritidis (SE), agentes causadores do paratifo aviário, são os principais
agentes de importância da avicultura (CARRASCO et al., 2011).
A pandemia de Salmonella Enteritidis em aves de plantéis avícolas se
deve pela erradicação de SG. A infecção em aves por Salmonella Enteritidis
5
possui um mecanismo de indução de resistência às outras salmonelas, pois
quando este sorovar está presente em um lote de aves, outros normalmente
encontrados desaparecem (SILVA & DUARTE, 2002).
As bactérias estão no trato intestinal das aves e a carne pode ser
contaminada facilmente em plantas de processamento caso o abate seja
inadequado e isto demonstra o quanto é importante fazer o controle da
contaminação dos animais ainda na criação para minimizar a disseminação
desta bactéria (CARDOSO & TESSARI, 2008).
A ingestão de alimento avícola contendo células viáveis de Salmonella
poderá desencadear uma infecção alimentar. As bactérias aderem à mucosa
do intestino humano e proliferam, colonizando-o. Em seguida, ocorre a invasão
da mucosa e penetração nos tecidos e a disseminação para outros órgãos. As
manifestações são por dores abdominais, vômito, diarreia e febre, os sintomas
aparecem 12 a 36 horas após o consumo do alimento (FIOCRUZ, 2008).
Para o controle efetivo de salmoneloses é fundamental conhecer o perfil
epidemiológico de Salmonella sp., entretanto esse perfil é influenciado por
vários fatores, como práticas de elaboração de alimentos, padrões de higiene e
saneamento, diferença entre hábitos alimentares e criação de animais
(CARRASCO et al., 2011).
2.3 Legislação
Os altos índices de produtividade no setor avícola consolidou o Brasil
como o maior produtor mundial de carne de frango. Este produto está presente
no cardápio dos principais países, sendo assim, deve-se preocupar com a
qualidade deste alimento. Os atuais elementos de inspeção sanitária instruídos
no controle de riscos na indústria, aliado ao monitoramento, realizado por
programa do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA),
atestam a segurança no sistema de criação da cadeia produtiva de carnes de
aves, inclusive no controle da presença de resíduos de medicamentos
veterinário e contaminantes, nos limites máximos estabelecidos (BRASIL,
2010).
6
A saúde animal também está relacionada à saúde pública, enfermidades
dos animais e controle dos riscos em toda a cadeia alimentar. Para garantir a
saúde animal devem-se adotar medidas de controle e erradicação das doenças
(BRASIL, 2009).
O MAPA é o órgão responsável pela inspeção técnica higiênico-sanitária
dos produtos de origem animal produzidos no Brasil. O Regulamento da
Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA) foi
instituído para os estabelecimentos com Serviço de Inspeção Federal (S.I.F.),
em 1952 (BRASIL, 1952). Em outra vertente, há o Programa Nacional de
Sanidade Avícola (PNSA), criado em 1994 pelo Departamento de Defesa
Animal do Ministério da Agricultura. Este programa leva em consideração a
importância da produção avícola nos mercados internos e externos e a
necessidade de normatização das ações de acompanhamento sanitário
relacionadas ao setor. Atua na execução de ações de vigilância, profilaxia,
controle e erradicação de doenças em aves como a salmonelose (BRASIL,
2009).
A Instituição Normativa nº 70 de 06 de outubro de 2003 estabelece o
Programa de redução de patógenos - Monitoramento microbiológico e controle
de Salmonella sp. em carcaças de frangos e perus, o qual visa constituir um
sistema de informações para avaliação da contaminação dos produtos
examinados, permitindo melhor eficiência das medidas de controle (BRASIL,
2003a).
2.4 Contaminação de lotes de frangos
Apenas uma ave contaminada nos primeiros dias de vida e dentro do
nascedouro pode ser o suficiente para veicular o patógeno para as outras aves
do lote e para lotes vizinhos, dificultando o controle do agente (SONCINI et al.,
2000).
Lotes de pintainhos recém-nascidos foram examinados por TESSARI et
al. (2003). Entre os 130 lotes analisados, 32 (24,62%) apresentaram resultado
positivo para Salmonella, isto demonstra um forte indício que tenha ocorrido
transmissão vertical.
7
ZACAN et al. (2000) verificaram 77% de lotes positivos para Salmonella
sp. e com isso os autores concluíram que a transmissão vertical ainda é um
grande fator da introdução da bactéria em granjas.
A presença de Salmonella foi investigada em amostras de mecônio
colhidas de 614 caixas de transporte, correspondentes a 12 lotes de pintainhas
com um dia de vida. Em quatro destes lotes (129 caixas) ocorreu o isolamento
de Salmonella, representando um percentual de 33,3 %. A avaliação da aves
no primeiro dia de vida, através da detecção de Salmonella na caixa de
transporte das aves, é um forte indício de que tenha ocorrido a transmissão
vertical. Os autores afirmaram que lotes positivos para esta bactéria no
primeiro dia de vida podem permanecer neste estado até a fase adulta e que
lotes de aves naturalmente infectadas por este patógeno podem produzir ovos
contaminados e que a susceptibilidade à Salmonella pode variar entre os lotes
de uma mesma variedade de ave comercial (GAMA, 2001).
Ao analisar forros de caixas de transporte e pintos de corte de um dia
em integrações de frangos de corte no Estado de Goiás, ROCHA et al. (2003)
Identificaram Salmonella sp. em 5,56% (1/18) dos lotes de pintos de um dia e
em 55,56% (10/18) dos lotes de forro de caixas de transporte. O lote positivo
em órgãos de pintos de um dia também foi positivo em forros de caixas de
transporte.
No Canadá, ARSENAULT et al (2007) analisaram 82 lotes de frangos de
corte, sendo 30 aves por lote. Os autores identificaram Salmonella em 21,2%
das carcaças analisadas.
Quando investigaram a presença de Salmonella em lotes de poedeiras
comerciais de oito empresas da região metropolitana de Fortaleza (Ceará),
SALLES et al (2008) concluíram que não houve transmissão vertical e que a
contaminação por este agente ocorreu após a chegada das pintainhas nas
granjas.
As diversas maneiras de transmissão deste patógeno dificulta a
identificação da origem da contaminação de um lote e também como ocorre a
disseminação bacteriana no plantel (MENDONÇA, 2011).
8
2.5 Contaminação de carcaças
Dados da incidência de Salmonella em carcaças de frangos têm sido
documentados em todo o mundo e denotam a importância e capilarizaçào
deste patógeno. Relatos da presença de Salmonella em cortes, carne ou
produtos derivados de carne de frango está disponível em menor número
quando comparado com os dados da presença deste microrganismo em
frangos vivos (BORSOI et al., 2010).
Ao analisarem 47.090 amostras de carcaças de frango relacionadas com
o programa América de redução de patógenos, WHITE et al. (2007) detectaram
Salmonella em 5.251 (11,2%), sendo que 124 (2,36%) eram Salmonella
Enteritidis.
MELDRUM & WILSON (2007) pesquisaram Salmonella em 877
carcaças de frangos de corte no Reino Unido e 4% destas amostras foram
positivas para esta bactéria.
No Brasil, durante o período de 1999 a 2008, foram notificados 2974
surtos de toxinfecções alimentares, sendo que Salmonella sp. esteve envolvido
em 1275 (42,9%) casos e Salmonella Enteritidis em 119 (4%). No mesmo
período, houveram 910 (22,8%) surtos relacionados com a ingestão de ovos
crus/ mal cozidos e 203 (5,1%) com carne de aves (BRASIL, 2008).
Analisaram-se 360 amostras de carcaças de frango congeladas
comercializadas no Estado de São Paulo e verificaram-se a presença de
Salmonella sp. em 7,2% das amostras (RISTORI et al., 2008).
Carcaças de frangos foram analisadas em diferentes fases de abate;
Antes do chuveiro de higienização, após a depenagem; após o chuveiro de
higienização; após a evisceração manual; após o chuveiro de lavagem final; na
saída do pré-resfriamento. Os pontos críticos foram após a evisceração manual
e após o chuveiro de lavagem final, isto pode ser devido à intensa
manipulação, à provável ineficiência das lavagens intermediárias e à
contaminação cruzada. Houve um declínio da contaminação na saída do pré-
resfriamento, provavelmente, isto ocorreu devido às baixas temperaturas da
água (4°C) e da carcaça (5°C a 10°C) e pela concentração de cloro (3,0 a 4,0
mg/mL) que são fortes inibidores bacterianos (VON RÜCKERT et al., 2009).
9
Das 260 carcaças analisadas por DUARTE et. al. (2009), 25(9,6%)
foram positivas para Salmonella, sendo que o sorovar Enteritidis foi o
predominante.
No estudo realizado por BORSOI et al. (2010), 180 carcaças de frangos
resfriadas foram analisadas. Os resultados desta pesquisa mostrou 12,2% de
ocorrência deste agente nas amostras.
2.6 Prevenção e controle da Salmonella
Os animais destinados à produção de carnes para consumo humano
podem atuar como hospedeiros assintomáticos de patógenos entéricos
importantes que representam risco de infecção para o homem, tornando um
desafio para a indústria o seu controle, redução ou eliminação (SHINOHARA,
2008).
A contaminação de ovos por SalmonellIa pode ser pela infecção do
tecido reprodutivo das galinhas de postura, conhecida como transmissão
vertical ou infecção transovariana; ou pela transmissão horizontal,
contaminação pela penetração da bactéria através da casca, quando entram
em contato com as fezes após a passagem pela cloaca e também ao entrar em
contato com qualquer material ou ambiente contaminado (STERZO et al.,
2008).
O nível de infecção de frangos de corte, ração, água, higienização do
ambiente, animais e materiais contaminados no aviário contribuem para o
aumento da prevalência de Salmonella (REITER et al., 2007), portanto, para o
controle desta DTA, a aquisição de lotes de aves livres do agente tem papel
fundamental, assim como a eliminação de roedores e a limpeza e desinfecção
do ambiente (SILVA & DUARTE, 2002).
A biossegurança no manejo sanitário de produtoras visa reduzir ao
máximo a possibilidade de entrada de patógenos nas instalações avícolas.
Portanto deve-se fazer o controle de pragas (insetos, répteis, moluscos, aves
diversas), controle de fluxo de materiais, pessoas e veículos e o controle de
resíduos como a cama. Programa preventivo para o controle de patógenos
10
também devem ser incluídos. Pode-se incluir medicações programadas,
exclusão competitiva e o uso de ácidos orgânicos (MICHELETTI, 2007).
Outra medida útil para reduzir a disseminação desta enfermidade é a
retirada das aves que morreram por esta doença do ambiente (SILVA &
DUARTE, 2002; SANT’ANA et al., 2008).
O emprego da limpeza e desinfecção do ambiente com o uso de
desinfetante também é um método muito utilizado, porém deve-se observar
que a presença da matéria orgânica pode reduzir a atividade antibacteriana
destes produtos (JAENISCH et al., 2010).
Mesmo com as medidas de biosseguridade preconizadas no intuito de
assegurar a sanidade dos plantéis avícolas, ainda ocorrem vários surtos de
Salmonelose no Brasil. Isso pode estar acontecendo devido a falta de
conscientização de pessoas ligadas ou não a áreas de produção animal em
relação à sanidade e devido a dificuldade de controle desta bacteriose
(STERZO et al., 2008).
O controle desta enfermidade é complexo, pois os padrões diferem de
uma região para outra e também devido a emergência de novos sorovares e a
reemergência de outros em determinadas áreas (BRASIL, 2008).
Para o monitoramento dentro dos sistemas de produção de frangos,
desde a granja até a industrialização dos produtos, os métodos moleculares
podem ser bastante úteis (MALDONADO, 2008).
2.7 Diagnóstico molecular aplicado à avicultura
A detecção de microrganismos em alimentos pela técnica de isolamento
convencional é confiável e eficiente, porém requerem vários dias para se obter
os resultados. As propriedades fenotípicas das bactérias podem não ser
expressas ou serem difíceis de serem observadas e também existe a
possibilidade de haver células viáveis e não-cultiváveis (MIGUEL, 2007).
Atualmente há necessidade de técnicas rápidas para detecção de
microrganismos, portanto, técnicas moleculares têm sido utilizadas como
triagem na microbiologia convencional (ANDRADE et al., 2010). Dentre os
11
métodos moleculares, destaca-se a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR),
por ser metodologia rápida, específica e sensível (MALORNY et al., 2009).
2.7.1 PCR convencional
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é capaz de identificar o
microrganismo a partir do seu material genético. O princípio deste método é
replicar uma sequência alvo de DNA específica. A enzima DNA polimerase é a
responsável pela amplificação e multiplicação da fita molde (MALORNY et al.,
2009).
Juntamente com o DNA a ser amplificado adicionam-se os seguintes
reagentes: a enzima termo-estável taq DNA-polimerase; dois oligonucleotídeos
iniciadores, também conhecidos como primers, desenhados para serem
complementares as sequências específicas da fita dupla e quatro
desoxirribonucleosídeos trifosfatados (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (SILVA et al.,
2011).
Inicialmente o ácido desoxirribonucléico (DNA) é submetido a
desnaturação, os iniciadores anelam-se à fita de DNA complementar e a taq
polimerase organiza os desoxirribonucleosídeos trifosfato (dNTPs) sintetizando
o fragmento da dupla fita desejado (MALORNY et al., 2009). Estas etapas
repetem por 30 ciclos, resultando em milhares sequências do material genético
desejado (KUMAR et al., 2008).
A reação ocorre em um equipamento denominado termociclador, é onde
ocorre a alternância de temperaturas por determinados períodos de tempo,
possibilitando a ocorrência de ciclos repetitivos de desnaturação e síntese do
DNA (GANDRA et al., 2008).
Os amplicons, produtos da PCR, são submetidos a eletroforese em gel
de agarose, é nesta etapa que se tem a separação desses produtos de
amplificação de acordo com a massa molecular. Os produtos são corados com
intercalantes de DNA, tais como SYBR® safe, brometo de etídio ou GelRedTM e
visualizados sob luz ultra-violeta (MALORNY et al., 2009).
12
2.7.2 PCR em tempo real
A reação de amplificação em tempo real permite o acompanhamento da
reação em tempo real, enquanto que na PCR convencional se obtém os
resultados somente no final da análise (CHEN et al., 2010).
A PCR em tempo real compreendem as etapas do PCR convencional
acrescido de fluoróforo esta molécula quando excitadas por uma fonte de luz
(laser), emitem uma fluorescência que é detectada por uma luz UV acoplada ao
termociclador (GANDRA et al., 2008).
O sistema Taq-Man utiliza uma sonda (oligonucleotídeo) para detectar
sequências específicas nos fragmentos de DNA. Esta sonda contém uma
molécula reporter fluorescente na extremidade 5’ e outra molécula quencher
(silenciador) na extremidade 3’. Quando intactas, a proximidade do quencher
absorve a fluorecência emitida pelo reporter por meio da transferência de
energia por ressonância de fluorescência conhecida como FRET “Fluorescence
Resonance Energy Transfer”. A sonda é clivada pela Taq DNA polimerase
enquanto o primer é estendido, então a molécula reporter separa da molécula
quencher e a luz é emitida com maior intensidade, quanto maior a
fluorescência maior será a quantidade de amplicon produzido (MACKAY,
2007).
O Cycle Threshold (CT) é o ponto que detecta o ciclo na qual a
fluorescência produzida pela reação cruza a linha Threshold. Este ponto
permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescência e é
proporcional a quantidade do produto da PCR (MACKAY, 2007).
O desenvolvimento destas tecnologias de amplificação de DNA abriu
enormes perspectivas para a análise de genes, diagnóstico de doenças
genéticas, resistência da bactéria ao antibiótico, assim como, detectar e
quantificar microrganismos em produtos derivados de aves de corte (DUFFY et
al., 2012; ÁLVAREZ-FERNÁNDEZ et al., 2013)
13
2.7.3 Aplicações da técnica de PCR
Ao analisar 50 amostras de carne de frango utilizando a técnica de PCR
convencional, RALL et al. (2009) detectaram a presença de Salmonella sp. em
27 amostras (54%).
VON RÜCKERT et al. (2009) avaliaram algumas das principais fases do
processo de abate de frango quanto a presença de Salmonella sp. em
carcaças. Os autores observaram que após o chuveiro de lavagem final foi o
ponto mais crítico, 30% de amostras positivas (27/90).
Em amostras de carne de frango e carne processada de frango, KANKI
et al. (2009) observaram que a PCR convencional não foi capaz de detectar
Salmonella na concentração de 10² UFC/mL, somente a partir de 10³ UFC/mL
que foi possível detectar este patógeno.
POSSEBON et al. (2012) relataram que o frio contínuo durante a
estocagem de carcaças de frango foi capaz de reduzir as células de
Salmonella. Quando se utilizou a PCR, 50,77% eram positivas na indústria e
quando estas mesmas amostras foram estocadas a frio a porcentagem reduziu
para 38,46%, decréscimo de 12,31%.
FAVIER et al. (2013) identificaram 17/115 amostras contendo cepas de
Salmonella em carne de frango, 2/62 em miúdos de frango, 0/100 em carcaças
de frango. Após a identificação com a PCR os autores também aplicaram uma
outra técnica molecular, PFGE e revelaram que houve semelhança do perfil
genético entre cada sorotipo de Salmonella.
Os resultados dos estudos de GARRIDO et al. (2013) demonstram alta
sensibilidade da técnica de PCR em tempo real, ao ser capaz de detectar 3
UFC de Salmonella em 25g de amostra de carne frango. CHEN et al. (2010)
contaminaram artificialmente, amostras de líquido de ovos e carne de frango e
relataram que o PCR em tempo real foi bastante sensível ao detectar 3
UFC/amostra e 5 UFC/amostra nos respectivos produtos.
14
2.8 Interferências na análise de PCR
Existem vários fatores que afetam a interpretação e comparação dos
resultados da PCR, como: a qualidade de todos os seus componentes,
incluindo DNA-molde originado do preparo da amostra para PCR; as condições
da reação; o sistema de detecção; o equipamento utilizado; o ambiente
(temperatura, umidade, limpeza química e microbiológica) e a prática do
analista (FREITAS et al., 2006).
A especificidade da análise é afetada por componentes não desejados, o
que resultam em falso-negativos. A contaminação cruzada entre diversas
etapas da PCR pode levar ao aparecimento de falsos positivos. Quando ocorre
a contaminação por amplicons do material já amplificado, esta contaminação
pode ser carreada na manipulação das amostras pelas luvas, pelas vidrarias,
pelos instrumentos e até mesmo pelos Kits (MALDONADO, 2008), por isso é
importante enfatizar o uso de materiais descartáveis em todas as etapas dos
procedimentos e atestar à negatividade da PCR em todos os controles
negativos (FUJIMOTO et al., 2007).
A concentração de magnésio elevada diminui a especificidade da reação
e favorece a formação de dímeros entre os iniciadores, baixas concentrações
desta substância aumentam a especificidade, mas diminuem o rendimento.
Especificamente, considerando a PCR em tempo real, o próprio programa já
analisa a probabilidade de concentração destes analitos selecionando o melhor
sistema analítico (MIGUEL, 2007).
Resultados falso-negativos tornam-se um perigo para a população,
enquanto que resultados falso-positivos requerem um esclarecimento dos
resultados presuntivos por intermédio de um novo teste na amostra (FREITAS
et al., 2006).
Pode ocorrer a associação dos iniciadores com sequências de DNA
semelhante com o DNA alvo e isto se traduzem em amplificações não
específicas que levam aos resultados falsos positivos. Os primers também
podem fazer ligações incompletas, deixando a região terminal do DNA molde
livre. Salienta-se o fato de que a ocorrência de ligações não específicas
aumenta quando se usam iniciadores degenerados (MIGUEL, 2007).
15
Substâncias inibidoras da Taq DNA polimerase podem gerar resultados
falso-negativo, portanto destaca-se a importância da lavagem exaustiva do
DNA para eliminar estas substâncias (LIMA et al., 2007).
Efeito estocástico, efeito estatístico de amostragem com baixo número
de cópias, pode causar variabilidade significante nos resultados dos ensaios. O
tamanho do DNA molde também interfere na eficiência da técnica. O
rendimento da reação diminui e aumenta-se o efeito estocástico se o tamanho
da cadeia da dupla hélice for superior a três mil pares de base. O tamanho
deve ser próximo de dois e três mil pares de base de comprimento (MIGUEL,
2007).
A presença de inibidores na amostra de DNA como azul de bromofenol,
heparina, detergentes iônicos, fenol, xilenocianol vetam a reação de PCR.
Alguns fatores podem impedir a clivagem do DNA sintetizado como o excesso
de glicerol na reação e os inibidores da atividade das enzimas de restrição,
como por exemplo, o sal em excesso na reação (SCHAEFER, 2006).
São muitos os fatores que podem causar a degradação do DNA. Ao
congelar e descongelar as amostras forma-se cristais de gelo que irão
fragmentar o DNA. Manusear a amostra à temperatura ambiente por muito
tempo também pode danificar o material genômico. Com a purificação
inadequada do DNA, algumas enzimas degradantes podem permanecer e
degradar a dupla hélice. Nucleases presentes na pele humana também podem
causar a degradação do produto da amplificação, portanto ressalta-se a
importância de se utilizar luvas para o preparo da reação (BUTLER, 2012).
A degradação do DNA pode ser devido a ação de DNases de origem
bacteriana e também pela presença de traços de fenol na amostra. Alguns
microrganismos têm a capacidade de produzir enzimas termoestáveis podendo
degradar os produtos da amplificação (VICTÓRIA, et al., 2011).
Presença de alguns componentes da matriz alimentar, tais como
lipídeos, sais e proteínas, interferem na otimização das reações de PCR,
obtendo-se resultados falsos negativos (MALORNY et al., 2009).
16
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostragem e análises bacteriológicas convencionais
As amostras foram compostas por carcaças (75), coração (45), moela
(45), fígado (45), suabes de calha de evisceração (45) e suabes de
depenadeira (45), sendo que todas as amostras foram obtidas em três
abatedouros de aves, localizados no estado de Goiás.
De cada carcaça foram retiradas 25 gramas de pele, às quais foram
adicionados 225 mL de água peptonada 1%.
Para as vísceras, a amostra foi pesada individualmente e calculada a
quantidade de água peptonada 1% a ser acrescentada para que fosse mantida
a proporção 1:10.
Os suabes, transportados em meio Cary Blair, foram transferidos para 9
mL de água peptonada 1% e incubados a 37ºC por 18 – 24 horas.
Após adição de água peptonada as amostras de carcaças e vísceras
foram homogeneizadas em equipamento próprio, por um minuto e incubadas a
37ºC por 18 – 24 horas.
Após o período de incubação seis alíquotas de 1mL da água peptonada
foram transferidas para tubos tipo eppendorf e mantidos sob temperatura de
congelamento, -18ºC, para posterior realização dos VIDAS e análises de PCR.
Simultaneamente uma alíquota de 1mL foi transferida para o caldo Tetrationato
(TT) e 0,1mL para o caldo Rappaport-Vassiliadis (RV), dando sequência ao
isolamento convencional bacteriano. As análises seguiram o disposto pelo
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2003b).
Após incubação dos caldos seletivos, uma alíquota de cada caldo foi
transferida para placas de Petri contendo ágar verde brilhante com sulfa (BGS)
e ágar xilose lisina tergitol 4 (XLT4). Realizou-se a semeadura em superfície
por esgotamento. As placas foram incubadas a 37°C, por 24 horas. Após este
período, três colônias suspeitas de Salmonella sp, incolores ou de cor rosada
no ágar BGS e amarelas com centro negro no ágar XLT4, foram repicadas para
ágar tríplice açúcar ferro (TSI) e incubadas a 35ºC, por 24 horas.
17
Dos tubos de ágar tríplice açúcar ferro (TSI) que apresentaram reações
compatíveis com as descritas para o gênero Salmonella sp, seguiu-se a
marcha analítica com as provas bioquímicas, teste da urease, teste de indol,
teste de vermelho de metila, teste do malonato e o teste lisina descarboxilase.
Após a leitura dos resultados apresentados pelas provas bioquímicas,
procedeu-se o teste sorológico. Isolados compatíveis com o gênero foram
semeados em ágar nutriente e encaminhados ao Laboratório de
Enterobactérias da Fundação Oswaldo Cruz, para sorotipificação.
3.2 ELFA
Para o ensaio de triagem com equipamento mini-VIDAS, as amostras
acondicionadas em água peptonada 1% e congeladas, foram mantidas em
temperatura ambiente por aproximadamente duas horas como tempo máximo.
Alíquotas de 1 mL foram transferidas para 10 mL do caldo SX2 e incubadas em
banho-maria a 41,5± 1ºC por 24 horas.
Após o período de incubação, dois mL do caldo SX2 foram transferidos
para tubo estéreis, foram aquecidos em banho-maria a 95 a 100ºC durante 15
minutos, em seguida arrefecidos, homogeneizados e alíquotas de 0,5mL foram
transferidas para os poços-amostra da barrete VIDAS® e analisadas no
equipamento mini-VIDAS®, pelo Kit VIDAS®-SLM (Mini-VIDAS®, BIOMÉRIEUX,
2010), com resultados expressos por positivo ou negativo.
3.3 Extração do DNA
A metodologia de extração do DNA seguiu uma adaptação do protocolo
descrito por FLÔRES et al.(2001).
As alíquotas de 1 mL da água peptonada 1% foram descongeladas, em
um recipiente e utilizadas para a extração do DNA genômico. Centrifugou-se a
alíquota, a 5000 rpm por 4 minutos, descartou-se o sobrenadante e suspendeu-
se o pellet em 1 mL de TE (10 mM TRIS, 1mM EDTA, pH 8), homogeneizou-se
no vórtex por 10 segundos, centrifugou-se duas vezes a 5000 rpm por 4
18
minutos, descartou-se o sobrenadante e suspendeu-se o pellet em 1 mL de TE,
homogeneizou-se em vortex por 10 segundos e incubou-se em banho-maria a
95°C por 10 minutos, em seguida centrifugou-se a 5000 rpm por 20 segundos.
Os sobrenadantes contendo o DNA foram mantidos congelados à -20°C
até a realização das análises.
3.4 PCR convencional
Foi estabelecido o volume de 50 µL para o mix de reação, composto por
35,75 µL de água ultra pura (DNase/RNase-Free Distilled Water – Invitrogen), 5
µL de Tampão para PCR 10X (PCR buffer 10x Invitrogen), 2,0 µL de Cloreto de
Magnésio (MgCl2) 50 mM (Invitrogen); 1 µL de dNTP 10 mM (Amersham
Biosciences); 0,5 µL (10 pM) do iniciador sense, 0,5 µL (10 pM) do iniciador
anti-sense, 0,25 µL de Taq 5 U/µL (Invitrogen) e 5 µL do eluato de DNA
genômico da amostra.
O processo de amplificação foi realizado em termociclador (Mastercycler
Personal, Eppdendorf) programado para um ciclo inicial (hot sart) de 94oC por 5
minutos, seguido de 30 ciclos repetidos de 94oC por 40 segundos, temperatura
de anelamento (Ta) de 55ºC por 40 segundos e 72oC por 1 minuto. A
programação era finalizada com 5 minutos a 72oC para maximizar o processo
de extensão. Foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores para o gene
iroB, primer 1 F: 5’-TGCGTATTCTGTTTGTCGGTCC-3’ e primer 2 R: 5’-
TACGTTCCCACCATTCTTCCC-3’, que delimitam um fragmento de 606 pares
de base (pb) (BÄUMLER et al., 1997).
Para a análise dos fragmentos, utilizou-se a técnica de eletroforese em
gel de agarose a 1,2% em cuba horizontal com tampão de corrida TBE 0,5X
(pH 8,0). O gel foi submetido à voltagem constante de 90V durante 60 minutos.
Em seguida, o gel foi corado por imersão em brometo de etídio durante
10 minutos e submerso em água por 5 minutos para a retirada do excesso do
brometo. Os resultados foram visualizados em transiluminador ultra-violeta. As
bandas foram comparadas com um padrão de peso molecular que possuía
fragmentos múltiplos de 100 pares de base. Cepa de Salmonella Enteritidis foi
utilizada como controle positivo e água ultra pura como controle negativo.
19
3.5 PCR em tempo real
Os reagentes utilizados foram 4,6 µL de água ultra pura; 10 µL de
TaqMan® master mix(1x); 1 µL da mistura de oligonucleotídeos iniciadores (50
ηg de cada oligonucleotídeo iniciador na concentração de 30mM); 0,4 µL na
concentração de 10mM da sonda alvo; 2 µL de IPC (10x); 0,4 µL de 50x
Exogenous e 2 µL de solução de DNA, totalizando 20 µL (CALVÓ et al., 2008).
A amplificação foi realizada em termociclador StepOne Plus (Applied
Biosystems) com as seguintes condições: 60ºC por 30 segundos (pré-PCR),
95ºC por 10 minutos (desnaturação inicial); 40 ciclos a 95ºC por 15 segundos
(desnaturação) e 60ºC por 1 minuto (anelamento/extensão); e 60°C por 30
segundos (pós-PCR). Foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores para o
gene bipA: SAL1410f F: 5’-GGTCTGCTGTACTCCACCTTCAG-3’ e SAL1494r
R: 5’-TTGGAGATCAGTACGCCGTTCT-3’ e a sonda foi a SAL1441pr 6FAM-
TTACGACGATATTCGTCCGGGTGAAGTC-TAMRA (CALVÓ et al., 2008).
Como usual ao ensaio, para atestar o bom desempenho da PCR, em
todas as reações realizadas, utilizou-se o reagente bloqueador de IPC
(negative control blocked IPC, Life®). Cepa de Salmonella Enteritidis foi
utilizada como controle positivo e água ultra pura como controle negativo.
20
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Do total de 300 alíquotas analisadas, detectou-se Salmonella sp. em
alíquotas classificadas como negativas e positivas ao isolamento bacteriano
convencional, como pode ser visto nas Tabelas 1 e 2.
TABELA 1 – Frequência de Salmonella sp. por identificação (isolamento
bacteriano convencional - IBC) e detecção de em caldo de pré-enriquecimento
congelado pelos ensaios VIDAS®-SLM, PCR em tempo real (PCR – rt) e no
PCR convencional (PCR – c)
Resultado IBC VIDAS®-SLM
PCR - c PCR - rt
Positivo 21/300 (7%) 18/300 (6%) 5/300 (1,7%) 22/300 (7,3%) Negativo 279/300 282/300 295/300 278/300
Observou-se variabilidade entre os ensaios para as respostas, o que
necessariamente não predispõe a definir qual o melhor ensaio e ressalta-se
não ser este o objetivo deste estudo. Os diferentes percentuais observados
denotam particularidades quanto à recuperação de bactérias em caldo de pré-
enriquecimento utilizado.
KANKI et al.(2009) avaliaram o efeito da preparação de amostras em
função do ensaio empregado para detecção de Salmonella sp. em carne de
aves, em água peptonada (caldo de pré-enriquecimento), no entanto eles
avaliaram ainda o uso de massagem manual, emprego de stomacher e
amostras em caldo sem o processo de homogeneização; os autores também
não congelaram os caldos. Eles identificaram que houve diferença entre
método de cultura e PCR convencional. Sendo que a homogeneização por
stomacher permitiu maior percentual de positividade para cultura, não sendo
observado correspondência ao ensaio por PCR. Os autores justificaram que o
uso de stomacher pode ter contribuído para maior exposição de componentes
presentes na amostra que inibiram a atividade da DNA polimerase, para caldos
com menor quantidade de Salmonella.
Para o presente estudo, todas as amostras de alimentos passaram pelo
processo de homogeneização por trituração como stomacher, o que não exclui
21
a possibilidade de haver interferentes próprios das amostras favorencendo a
divergência entre resultados por IBC e PCR convencional.
TABELA 2 – Compatibilidade entre presença (+) ou ausência (-) para os
ensaios VIDAS®-SLM, PCR em tempo real (PCR – rt) e PCR convencional
(PCR – c), em caldos positivos pelo IBC e seus respectivos sorovares
Amostra Positiva IBC
Sorovares /fórmula antigênica identificados*
VIDAS®-SLM
PCR - rt PCR - c
16/21 7/21 1/21
Carcaça Typhimurium - - -
Carcaça Infantis + - -
Carcaça Livingstone, Mbandaka + - +
Carcaça Saint Paul, Mbandaka, Typhimurium
+ - -
Carcaça Schwarzengrund - - -
Carcaça Enteritidis - - -
Carcaça Schwarzengrund + + -
Coração Anatum - - -
Coração Cerro + - -
Coração Cerro, Infantis, Livingstone + - -
Coração Typhimurium + + -
Moela Cerro, Infantis, Livingstone + - -
Moela Cerro + - -
Moela Cerro, Thyphimurium + - -
Moela Cerro + + -
Fígado Schwarzengrund + + -
Fígado Schwarzengrund - - -
Sb.ev** Schwarzengrund + + -
Sb. ev** Livingstone, Ohio + - -
Sb.dp*** Schwarzengrund, O:9,12 + + -
Sb.dp*** Typhimurium + + -
Percentuais compatíveis entre ensaios e IBC 76,2% 33,3% 4,8%
* sorotipificação feita pelo Laboratório Referência FIOCRUZ ** Sb.ev = suabe de evisceração; *** Sb.dp = suabe de depenadeira
22
Cabe ressaltar que o resultado do VIDAS®-SLM não determina o fim da
análise e sim que, frente ao resultado positivo, deve haver sequência analítica
para isolamento, no entanto, isso cabe às amostras consideradas positivas.
Portanto, convém esclarecer que o tempo demandado entre incubação e
resultado é relativamente curto, o que dá boa margem de segurança para
eventos de necessidade de rápida resposta, como para indústrias, por
exemplo.
TABELA 3 – Caldos de pré-enriquecimento negativos ao isolamento bacteriano
e positivos no VIDAS-SLM, PCR em tempo real e/ou no PCR convencional.
Código
amostra Categoria Resultados presença (+) ou ausência (-)
IBC VIDAS PCR rt PCR c
1 Carcaça - - + -
2 Coração - +* - +
3 Coração - - + -
4 Coração - - + +
5 Coração - - + -
6 Coração - - + -
7 Fígado - +* + +
8 Fígado - - + +
9 Fígado - - + -
10 Moela - - + -
11 Moela - - + -
12 Moela - - + -
13 Moela - - + -
14 Moela - - + -
15 Sb. ev** - - + -
16 Sb. dp*** - - + -
Total 16/279 2 (0,7%) 15 (5,4%) 4 (1,4%)
* ao final da sequência analítica, não houve associação ao gênero Salmonella
sp. frente à prova sorológica; ** Sb.ev = suabe de evisceração ; *** Sb.dp =
suabe de depenadeira
23
Observando as Tabelas 2 e 3, percebe-se pouca diferença percentual
entre IBC e VIDAS-SLM, assim, a aplicabilidade do método de triagem pode
satisfazer a necessidade de diagnóstico rápido da indústria e de órgãos de
fiscalização.
Sob outro parâmetro de avaliação, os métodos moleculares explicitaram
resultados com alta variabilidade quando tomou-se por apoio o IBC.
CASTAGNA et al. (2005) concluíram que o enriquecimento seletivo pode
contribuir significativamente para a detecção do bactéria alvo, quando
comparou a execução da PCR convencional em comparação ao isolamento
bacteriano convencional, porém não houve a descrição de congelamento
prévio como neste estudo, corroborando com as descrições de VIEIRA et al.
(2007) quando afirmaram que o congelamento para a estocagem das amostras
é um fator de interferência na integridade do DNA.
Por outro lado, a PCR em tempo real empregada, com seleção dos
primers e sonda preconizados por CALVÓ et al. (2008), vinculados ao gene
bipA, é considerada uma sequência específica, com ampla aplicação ao
gênero, porém com exclusão de alguns sorovares. Neste estudo, observou-se
ausência de reação para os sorovares Anatum, Infantis, Livingstone,
Mbandaka, Ohio e Saint Paul. Porém cabe esclarecer que pode ter ocorrido
uma associação de fatores, em que novamente ressurge o efeito negativo do
congelamento prévio e o fato de que os sorovares não constituem cepas
referência e sim isolados com procedência do campo, o que pode alterar a
eficiência da reação em comparação aos estudos de CALVÓ et al. (2008).
Além disso, deLIVRON & ROBINSON (2008) identificaram alta
capacidade de alteração do gene bipA, quando a bactéria está em condições
desfavoráveis no ambiente, pela expressiva associação a elementos proteicos
(ribossomos) que poderiam mascarar a reação; fato que pode ter ocorrido
neste estudo.
SANTOS et al. (2001) afirmaram que o pré-enriquecimento por água
peptonada a 1% combinado à extração de DNA por fenol clorofórmio,
potencializariam a detecção de Salmonella em carnes experimentalmente
contaminadas. No presente estudo, a água peptonada foi empregada, porém a
metodologia de extração foi divergente e o tempo decorrido entre o pré-
24
enriquecimento e a efetiva extração do DNA pode ter contribuído para a menor
qualidade da alíquota. Ainda, acredita-se que o congelamento aplicado aos
caldos, em particular, pode ter sido responsável pela dificuldade de
identificação do DNA de salmonelas presentes.
Por outro lado, KONGMUANG et al. (2008) descreveram que
interferentes podem alterar as reações de extração, o que permitiria a perda de
bactérias, durante os procedimentos. O protocolo empregado neste estudo é
considerado de boa aceitação. No entanto, é possível que outro método de
extração pudesse contribuir para resultados menos discordantes, baseando na
fase de enriquecimento seletivo prévio (TASKILA et al., 2012) e tratamento
adequado da amostra. Apesar de que alguns estudos apontam para utilização
de ensaios moleculares sem enriquecimento, como tendência.
ANDREATTI FILHO et al. (2011) mencionaram que a presença de
partículas das reações ou outras substâncias provenientes das amostras
podem interferir na obtenção do DNA. Os autores observaram que a
incorporação de detergentes melhorou significativamente a extração de
amostras de campo e consequentemente aumentou o percentual de
positividade.
Em 2013, JENSEN et al. publicaram um estudo em que a PCR em
tempo real não sobrepujou a sensibilidade de detecção frente ao isolamento
bacteriano convencional para amostras de fezes de bovinos. Este dado é
importante por tratar-se de amostras com alta contaminação e por
consequência de alta competição no meio, o que pode ter desfavorecido a
sensibilidade do método molecular pela rápida degradação do DNA alvo.
Situação similar de contaminantes acompanhantes pode ter ocorrido no atual
estudo. Pelo exposto, acredita-se que possivelmente os resultados
incompatíveis para detecção dos sorovares previamente identificados, também
podem estar relacionados à extração adotada neste estudo.
SOMMER et al. (2012) ao analisarem tempos de armazenamento
diferentes (tempo zero e sete dias), considerando os métodos de extração,
verificaram que amostras frescas relacionaram-se ao maior percentual de
positividade, em detrimento de amostras submetidas à secagem por sete dias.
25
Na presente pesquisa, Salmonella sp. foi detectada por PCR em tempo
real em 22 caldos (7,3%), havendo a presença da bactéria em todas as
categorias amostrais avaliadas (Tabela 4). Ainda assim, mesmo havendo a
fase de pré-enriquecimento como recomendado por WHYTE et al. (2002) e
SUO et al (2010) com o objetivo de favorecer a detecção, cabe salientar que
este método não demonstra viabilidade celular, valendo-se da detecção de
material genético, indicando que o agente está ou esteve presente no
substrato, podendo ou não estar viável quando da sua detecção.
TABELA 4: Amostras positivas à PCR em tempo real separadas por categoria
Categoria Nº de amostras positivas (%)
Moela 6/45 (13,3%)
Coração 5/45 (11,1%)
Fígado 4/45 (8,9%)
Carcaças 2/75 (2,7%)
Suabes de depenadeiras 3/45 (6,7%)
Suabes de calhas de evisceração 2/45 (4,4%)
TOTAL 22/300 (7,3%)
Por estes resultados, pode-se observar que o patógeno foi detectado em
todas as categorias de amostras, com expressiva presença em vísceras
comestíveis destinadas ao consumo humano, o que pode sugerir risco à saúde
do consumidor pelo fato de serem alimentos que não são submetidos à ação
de cozimento adequado.
Outro item relevante refere-se às depenadeiras que são equipamentos
de grande contato com todas as aves do lote e de lotes subsequentes. A
detecção da bactéria neste local permite conjecturar a provável disseminação
da bactéria entre carcaças, principalmente quando salienta-se a capacidade de
formação de biofilme bacteriano pelo gênero.
Quanto às calhas de evisceração, usualmente não há contato entre o
alimento destinado ao consumo e mesas, no entanto, há resíduos destinados à
26
graxaria e contato manual dos colaboradores. A presença de Salmonella neste
equipamento contribui para provável disseminação da bactéria no ambiente.
Pelas características do patógeno, considerando sua ecologia e os
procedimentos existentes no interior dos abatedouros quanto às operações de
abate, destinação de vísceras não comestíveis, resíduos, tratamento de
resíduos, higiene e desinfecção há grande probalidade do patógeno ser
eliminado. No entanto, é possível ocorrer recontaminação do ambiente de
abate, o que acentua a perpetuação de Salmonela sp. e compõe necessidade
de investigar periodicamente a presença da bactéria nas instalações.
Os recursos da biologia molecular são extremamente úteis ao
monitoramento dentro dos sistemas de produção, desde a granja até a
industrialização dos produtos, quando se tem por objetivo acompanhar a
ocorrência do agente e principalmente, quando se avalia o tempo decorrido
para análise e sua representatividade à indústria e órgãos de fiscalização.
Soma-se a este argumento, as descrições de MALDONADO (2008) quanto à
agilidade, elevada sensibilidade, capacidade da análise simultaneamente de
um grande número de amostras e o curto tempo de ensaio como grandes
vantagens para que a PCR, principalmente em tempo real, seja utilizada pelas
indústrias no rastreamento de patógenos presentes em todas as etapas e elos
da cadeia, como forma de estabelecer controle e minimizar riscos pela
exposição ao patógeno à saúde pública.
Segundo GRIMONT & WEILL (2007), em documento oficial do Instituto
Pasteur, novas fórmulas antigênicas de Salmonella e novos sorovares foram
identificados. Entre 2003 e 2007, relatou-se a caracterização de 70 novas
fórmulas antigênicas e a diversidade genética dos próprios sorovares
(considerando variações para fagotipos e ribotipos) conforme detalhamento de
GUIBOURDENCHE et al. (2010). Provavelmente isto esclarece a ausência de
reação para alguns sorovares identificados nos caldos avaliados, não
relacionados aos estudos de BÄUMLER et al. (1997) e CALVÓ et al. (2008).
Em amostras observou-se resultado negativo para o isolamento
bacteriano convencional e positivo para a PCR. De acordo com FLORESTA
(2006) isto pode ter acontecido devido ao fato das bactérias entrarem em
estado fisiológico denominado viável não cultivável (VNC), no qual as células
27
mantêm atividade metabólica, mas não são cultiváveis pelos métodos
tradicionais disponíveis.
O baixo numero de células também pode explicar tais alterações entre
resultados. MYINT et al. (2006) esclareceram que a associação de pré-
enriquecimento e enriquecimento seletivo acentuam a capacidade do ensaio
em detectar baixa quantidade de células do microrganismo alvo, quando
utilizada a PCR.
Outra hipótese deste acontecimento relaciona-se ao isolamento
bacteriano fundamentado nas propriedades fenotípicas do gênero bacteriano.
Cabe salientar que em ocasiões específicas, tais propriedades não se
expressam ou podem ter sua classificação dificultada (MARIN et al., 2006).
A água peptonada 1% obtida no pré-enriquecimento também foi utilizada
para a extração de DNA nos estudos realizados por SANTOS et al. (2001). Ao
inocularem artificialmente Salmonella sp. em carnes de frango, estes autores
observaram 100% de eficiência no método de análise, portanto este caldo não
foi um fator limitante. Para ÁVILA et al. (2012) este meio de cultura possibilita
o crescimento indiscriminado de outras bactérias presentes na amostra, o que
decorre em maior competitividade entre os microrganismos; tal fato pode ter
influenciado a detecção de Salmonella desta pesquisa. Além disso, DNA e
células de outros organismos (microbiota competitiva) também afetam a
sensibilidade e especificidade da PCR (MALDONADO, 2008).
RISTORI et al. (2008) relataram que a ocorrência e quantificação de
Salmonella nas aves podem variar de acordo com o manejo durante a criação,
condições de abate dos animais e posterior manipulação das carcaças.
Apesar de todos os esforços das indústrias avícolas no que diz respeito
à adoção de medidas de biossegurança e programas de garantia de qualidade,
não é possível eliminar patógenos durante a cadeia de processamento de
frangos e sim reduzir.
Porém, a redução dos níveis de contaminação da carne de frango é
importante para diminuir a prevalência de doenças veiculadas por alimentos,
além de garantir a qualidade e inocuidade dos produtos de frango aos
consumidores. Conforme GEORGIADIS et al. (2010), cabe considerar a
aplicação de recursos diagnósticos que permitam rapidez, sensibilidade e
28
especificidade analíticas, como ferramentas laboratoriais à segurança
alimentar.
29
5 CONCLUSÕES
Detectou-se Salmonella sp. em carcaças e vísceras comestíveis.
Salmonella sp. está presente em abatedouros de aves.
O ensaio de PCR em tempo real é um bom recurso diagnóstico para
análise de rotina relacionadas a alimentos e ao ambiente de abate.
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