Kit IQ-CheckSalmonella II Catálogo #: 357-8123

Guia do Usuário

Teste para detecção por PCR em tempo real de Salmonella spp.

Em amostras de alimento, ração animal e ambiente

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ÍNDICE

I. Introdução

II. A tecnologia de I-Check Salmonella II

III. Componentes do Kit

IV. Vida útil e armazenamento

V. Material necessário, mas não fornecido

VI. Precauções e recomendações

VII. Protocolo

A. Enriquecimento de amostra

B. Extração de DNA

C. PCR em tempo real

D. Análise de dados

VIII. Confirmação de resultados positivos

IX. Confirmação de colônias únicas usando I-Check

X. Realizações e validações de teste

XI. Referências

ANEXO: Guia de Cálculo de Mistura de PCR

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I. INTRODUÇÃO

Salmonellae são a causa mais frequente de intoxicação alimentar no mundo, apesar das muitas medidas de

prevenção tomadas para controlar estes organismos. Nos Estados Unidos e outros países industrializados, casos

declarados de salmonelose variam em torno de 70,000-100,000, no entanto, a real incidência de infecção por

Salmonella de origem alimentar é estimada como sendo muito maior, na ordem de 4-5 milhões de casos por ano.

Ovos, produtos lácteos, carne e aves são os alimentos mais comuns associados à transmissão deSalmonellae

(65% dos casos). Mais de 2000 sorotipos foram identificados, todos eles são potencialmente patogênicos ao

homem. Devido à baixa dose de infecção e à séria ameaça aos produtores e consumidores de alimento,

inúmeros países, hoje em dia, exigem ausência total de salmonela nos produtos alimentícios.

Frenquentemente, os métodos clássicos de cultura são longos e tediosos. Em comparação, o iQ-Check Salmonella II é um teste qualitativo simples e rápido, que permite a detecção de sequências de DNA específicas,

exclusivas para Salmonella spp. encontradas em amostras ambientais, de produtos alimentícios, e ração animal.

Usando a reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real, sequências específicas de DNA de Salmonella

spp. são amplificadas e detectadas de forma simultânea por meio de sondas fluorescentes. Até 94 amostras

podem ser processadas, com risco de contaminação minimizado e um procedimento fácil de usar. Os usuários

que pretendem usar este kit são pessoas treinadas de laboratório, que estão realizando testes para detectar

Salmonella spp.O uso deste teste permite a obtenção de resultados dentro de poucas horas após o

enriquecimento da amostra.

II. A TECNOLOGIA de iQ-Check Salmonella II

O kit iQ-Check Salmonella II é um teste baseado na amplificação do gene e detecção por PCR em tempo real. Reagentes de PCR prontos para uso contêm oligonucleotídeos (iniciadores e sondas) específicos para Salmonella

spp., bem como DNA polimerase e nucleotídeos. A detecção e análise de dados são otimizadas para uso com

um instrumento de PCR em tempo real Bio-Rad, tais como os sistemas Chromo4™, Mini option, CFX96™ ou

CFX96 Deep Well™

PCR é uma técnica poderosa usada para gerar muitas cópias do DNA-alvo. Durante a reação de PCR, diversos

ciclos de aquecimento e resfriamento possibilitam a desnaturação do DNA, por calor, seguida da ligação dos

iniciadores à região-alvo. A DNA polimerase usa, então, estes iniciadores e os deoxinucleotídeos trifosfato

(dNTPs) para ampliar o DNA, criando cópias do DNA-alvo. Estas cópias são chamadas de amplicons

(fragmentos amplificados).

Na PCR em tempo real, sondas específicas são usadas para detectar o DNA durante a amplificação, ao

hibridizar com os amplicons. Estas sondas são ligadas a um fluoróforo que fluoresce apenas quando hibridizado à sequência-alvo; FAM é o fluoróforo ligado à sonda que hibridiza à sequência específica de DNA de Salmonella spp. Na ausência do DNA-alvo, nenhuma fluorescência será detectada. À medida que aumenta a quantidade de

amplicons com cada rodada de amplificação, aumenta também a intensidade da fluorescência. Durante cada

ciclo de PCR, na etapa de anelamento, o módulo óptico ou detector mede esta fluorescência, enquanto o

software associado marca a intensidade da fluorescência versus o número de ciclos. Este método possibilita uma

determinação simples da presença, ou ausência, de Salmonella spp. em uma amostra.

Um “controle interno” de DNA sintético está incluído na mistura de reação. Este controle é amplificado com uma

sonda específica ao mesmo tempo que a sequência de DNA-alvo de Salmonella spp, e detectado por um

segundo fluoróforo. Isso permite a validação de qualquer resultado negativo.

Este teste permite a detecção de Salmonella spp. em todos as amostras de produtos alimentícios, ração animal e

ambiente, previamente enriquecidas por cultura em água de peptona tamponada. Isso inclui as quatros principais

etapas a seguir:

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III. COMPONENTES DO KIT

O Kit IQ-Check Salmonella II contém quantidade suficiente de reagentes para 96 testes.

ID de Referência Reagente Quantidade

FornecidaA Reagente de lise 1 frasco (20 ml)B Sondas fluorescentes

fluorescente

1 tubo (0.55 ml) C

amplificação

1 tubo (4.4 ml) D

de PCR

1 tubo (0.5 ml) E Controle Positivo

de PCR

1 tubo (0.25 ml)

IV. VIDA ÚTIL E ARMAZENAMENTO

Assim que recebido, o kit deve ser armazenado entre +2°C e +8°C. Reagentes armazenados nesta temperatura

podem ser usados até a data de validade indicada no tubo de reagente.

V. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO

Equipamentos

• Mastigador Stomacher® ou equivalente para homogeneizar as amostras de teste.

• Incubadora para enriquecimento microbiológico de amostra.

• Específico para extração em tubo de 1,5 ml tube

- Centrífuga de bancada (máx. 10,000-12,000 g).

- Termobloco seco (100°C ± 5°C).

• Específico para extração em placa de poço profundo

- Centrífuga com rotor para placas de 96 poços (máx 2,250 g).

- Termobloco seco (100°C ± 5°C).

- ou agitador-incubador para placas de poço profundo, tal como “Thermomixer” (Eppendorf)

• Aparelho agitador de tubos vórtex.

• Placa de agitação magnética.

• Específico para protocolo de extração Standard II

- Desruptor de Células, tal como “Desruptor Genie”* (Scientific Industries).

-DW40, Bio-Rad cat #: 359-0137.

• Micropipetas de 20 μl, 200 μl e 1000 μl.

• Pipetas combtip ou pipetas de repetição equivalentes.

• Sistema de PCR em tempo real Bio-Rad, por ex., sistemas Chromo4, MiniOpticon, CFX96 ou CFX96 Deep

Well.

Veja o guia de usuário do sistema de PCR em tempo real para os kits iQ-Check (Chromo4 #: 93269 - I™5 #:

93270 - I Cycler I™ #: 93271 - CFX96/CFX96 Deep

Well/MiniOpticon, #: 93893b).

* Entre em contato com a Bio-Rad para informação detalhada sobre os instrumentos recomendados por nosso

departamento técnico.

Nota: Recomendamos o uso de uma fonte de alimentação universal (UPS) com o termociclador.

ENRIQUECIMENTO EXTRAÇÃO DE DNA PCR EM TEMPO REAL ANÁLISE & INTERPRETAÇÃO DE DADOS

Controle Negativo Reagente de amplificação

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Suprimentos

• Meio de enriquecimento: água de peptona tamponada, (Por ex. Bio-Rad cat.#: 356-4684, 500 g; 355-4179,

frascos 225 mL x 6 ; 355-5789, bolsas 2.3 L x 5 ; 355-5790,bolsas 5 L x 2).

• Específico para amostras de ambiente de produção primária: suplemento para enriquecimento: Cápsula

RAPID ‘Salmonella, Bio-Rad cat. #: 356-4710, x100, Quantidade para 250 ml; 356-4709, x100, Quantidade

para 2.5 L, 356-4712, Quantidade para 100 testes.

• Bolsa Stomacher com filtro incorporado.

• Esponjas de ambiente.

• Swabs de ambiente.

• Caldo neutralizante para esponjas e swabs, tal como Dey-Engley (D/E).

• Específico para extração em tubo

- Tubos estéreis com tampa de rosca, cônicos, de 1,5 ml (Por ex. Bio-Rad cat. #: 224-0110).

• Específico para extração em placa de poço profundo

- Placa de poço profundo de 1 ml, Bio-Rad cat. #: 359-0132.

- Filme plástico de vedação, Bio-Rad cat #: 359-0139.

- Filme pré-perfurado de vedação, tal como “X-Pierce™ Sealing Films”, Bio-Rad cat #: 360-0040, apenas

para América do Norte; cat #. 359-3977, x100.

• Específico para protocolos de extração Standard II e Easy II.

- Beads (microesferas) de lise (reagente F) Bio-Rad cat. #: 357-8136.

- Ponteiras de abertura ampla de 200 μl.

• Ágar RAPID ‘Salmonella**, Bio-Rad cat #: 356-3961, placas de 90 mm x 20; 356-3962, placas de 90 mm x

100; 356-4705, 500 g.

** Pode ser usado fora do escopo de validação de AOAC-RI.

• Para placas de PCR, tubos, selos e tampas de vedação, veja o guia de usuário do sistema de PCR em

tempo real para os kits iQ-Check.

• Pipetas de 1 ml e 10 ml.

• Ponteiras com filtro, estéreis para micropipetas de 20 μl, 200 μl e 1000 μl.

• Ponteiras para pipetas Combitip ou pipetas de repetição equivalente, estéreis, pacote individual.

• Tubos de ensaio estéreis de 2 ml e 5 ml.

• Luvas sem pó.

• Água estéril destilada.

• Alvejante 5%.

• Agente de limpeza, tal como DNA AWAY® ou RNase AWAY®.

VI. PRECAUÇÕES E RECOMENDAÇÕES PARA OS MELHORES RESULTADOS

• Pessoal treinado adequadamente deve realizar este teste.

• Amostras de alimento e culturas de enriquecimento devem ser manejadas como material potencialmente

infeccioso e eliminadas de acordo com as regras e regulamentações locais.

• Todo material potencialmente infeccioso devem ser autoclavado antes do descarte.

• A qualidade dos resultados depende da conformidade estrita com a Boa Prática Laboratorial (por exemplo, a

norma EN ISO 7218), principalmente em relação à PCR:

- Os equipamentos de laboratório (pipetas, tubos, etc.) não devem circular de uma estação de trabalho para

outra.

- É fundamental o uso de um controle positivo e um controle negativo para cada série de reações de

amplificação.

- Não use reagente após a data de validade.

- Use o agitador vórtex para os reagentes do kit antes de usá-los para garantir a homogeneidade.

- Verifique periodicamente a exatidão e precisão das pipetas, bem como o funcionamento correto dos

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instrumentos.

- Troque as luvas com frequência, principalmente se suspeitar que estejam contaminadas.

- Limpe os espaços de trabalho com, pelo menos, alvejante 5%, e outro agente descontaminante tal como o

DNA AWAY®, periodicamente.

- Use luvas sem pó e evite impressões digitais e escrever nas tampas dos tubos. Ambos irão interferir na

aquisição de dados.

• Aconselha-se veemente seguir os requisitos gerais descritos na norma EN ISO 22174:2005 “Microbiologia de

alimento e ração animal – Reação em cadeia de polimerase (PCR) para detecção de patógenos em alimento -

Requisitos gerais e definições”.

VII. PROTOCOLO

Recomenda-se veemente a leitura de todo o protocolo antes de iniciar o teste.

As condições de enriquecimento estão detalhadas a seguir. A extração de DNA pode ser realizada de acordo

com quatro protocolos diferentes:

- Os protocolos Easy I e Easy II exigem um volume de amostra de 100 ul. Os protocolos Standard I e Standard

II exigem um volume de amostra de 1 ml.

- O Standard II e Easy II incluem uma etapa de trituração.

-

A tabela a seguir delineia os diferentes protocolos que podem ser usados, dependendo da aplicação e do

escopo da validação:

Escopo (matrizes) Enriquecimento Extração de DNA

Certificação método formato

Produtos alimentícios Ração animal, &

AmostrasAmbientais(1)

BPW 18h ± 2h

37°C ± 1°C Standard I Tubo VALIDAÇÃO NF

BPW 21h ± 1h

37°C ± 1°C Easy I

Tubo Poço profundo

VALIDAÇÃO NF

Carnes cruas BPW pré-aquecido

10h ± 2h 37°C± 1°C

Standard II Tubo

Poço profundo VALIDAÇÃO NF

Carne crua (2) BPW

21h ± 1h 37°C ± 1°C

Easy II Tubo

Poço profundo VALIDAÇÃO NF

Produtos de carneBPW

18h ± 2h 37°C± 1°C

Easy II Tubo

Poço profundo VALIDAÇÃO NF

Amostras de Produção Primária ambiental

Suplemento. BPW 19h ± 1h 41,5°C ± 1°C

+ BPW

5h ± 1h 37°C ± 1°C

Easy I Standard II

(3)

Tubo Poço profundo

VALIDAÇÃO NF

Produtos alimentícios selecionados e

Superfícies de ambiente

BPW 21h ± 1h

37°C± 1°C Easy I

Tubo Poço profundo

AOAC-RI

Carne moída crua (2) BPW pré-aquecido

10h ± 2h 36°C± 1°C

Standard II Tubo

Poço profundo AOAC-RI

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¹ Exceto amostras de ambiente de produção primária.

² Protocolo também usado ao detectar E.coli O157:H7 da mesma amostra de carne moída crua.

³ Neste protocolo, o reagente de lise usado é o reagente A apenas (sem o reagente F).

A. Um Enriquecimento de Amostra

O meio de enriquecimento deve estar em temperatura ambiente antes do uso.

Enriquecimento curto é sensível às condições de incubação. É necessário aquecer os caldos de enriquecimento

à temperatura de incubação antes do uso e respeitar estritamente as temperaturas indicadas.

A duração da preparação da amostra, o tempo entre o final do estágio de pré-aquecimento do caldo de

enriquecimento e o início

da fase de incubação da amostra de alimento não deve exceder 45 minutos. É recomendado o uso de uma

incubadora ventilada.

Homogenize n g de amostras em 9 x n ml de água de peptona tamponada (por exemplo 25 g em 225 ml ; no

escopo da marcação VALIDAÇÃO NF, respeitar as normas ISO 6887- 2 a 6 sobre preparação de amostra) em

uma bolsa stomacher com filtro incorporado.

Dentro do escopo de validação de AOAC para tamanhos maiores de amostra, homogenize 375g

em 1,125ml de água de peptona tamponada em uma bolsa stomacher com filtro incorporado. Observação: dentro

do escopo da marca de VALIDAÇÃO NF, porções de teste pesando mais que 25 g não foram testadas. Incube,

sem agitar, pelos tempos e temperaturas indicados na tabela acima.

Informação adicional:

1. Amostras de ambiente de produção primária

- Incube a amostra em água de peptona tamponada suplementada com Cápsula de RAPID ‘Salmonella

(consulte a tabela para condições de incubação).

- Após este primeiro enriquecimento, para cada amostra, dispense 900 ul de água de peptona tamponada

no tubo ou no poço de uma placa de poço profundo.

- Transfira 100 ul da amostra pré-enriquecida.

- Vede a placa de poço profundo e consulte a tabela para condições de incubação.

- Siga o protocolo Easy I ou Standard II para extração do DNA.

Nota: o Enriquecimento Primário pode ser armazenado entre +2°C e +8°C por 16 horas após o final da

incubação a 41,5°C, antes de proceder para o Enriquecimento Secundário.

2. Protocolo Standard I dito *Alternativo* (para todas as matrizes, exceto produção primária de ambiente).

No escopo do método certificado por VALIDAÇÃO NF, para amostras que apresentam inibição com uma

diluição 1/10 do extrato de DNA, é possível remover esta inibição ao usar o seguinte protocolo de

enriquecimento modificado:

- Homogenize n g de amostra em nove x n ml (por exemplo 25 g em 225 ml) de água de peptona

tamponada.

- Incube sem agitar por 18h ± 1 hora a 37°C.

- Agite a bolsa, amostre 20 ul da suspensão e adicione em 1 ml de água de peptona tamponada (aquecida a

37°C).

- Incube sem agitar por 4h ± 1 hora a 37°C.

- Siga o protocolo Standard I para o extrato de DNA.

3. Análises de superfície (no escopo da Validação de AOAC-RI)

- Umedeça previamente os swabs e esponjas com caldo Dey-Engley (DE).

- Para superfícies sendo analisadas com swabs, amostre uma área de 1” x 1” (2,54 cm x2,54 cm).

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- Para superfícies sendo analisadas com esponjas, amostre uma área de 4” x 4” (10,16 cm x 10,16 cm).

- Adicione esponjas ou swabs ao caldo de enriquecimento de água de peptona tamponada.

B. Extração de DNA

Recomendações gerais:

• Antes de iniciar o teste, ligue o termobloco para pré-aquecê-lo e configure-o em 95°C - 100°C.

• Em geral, evite agitar a bolsa de enriquecimento e coletar fragmentos grandes de restos de alimento. Para

amostras de alimento com um sobrenadante gorduroso, colete a amostra apenas abaixo desta camada.

• Abra os tubos e poços com cuidado para evitar qualquer contaminação cruzada possível.

• Resfrie a placa de poço profundo antes de pipetar diretamente pelo filme de vedação pré-perfurado.

• Pipete o reagente de lise enquanto está sendo agitado em velocidade média com a barra magnética contida

no frasco, para mantê-lo em suspensão.

• Para os protocolos Standard II e Easy II, o reagente de lise deve ser reconstituído:

- Coloque todo o conteúdo do reagente F (beads de lise) no reagente A (reagente de lise) com cuidado. - Use os produtos de consumo com uma ponteira ampla o suficiente para possibilitar a pipetagem do

reagente de lise homogeneizado.

- O reagente F (beads de lise) está incluído no kit iQ-Check E.coli O157:H7 ou pode ser

pedido separadamente.

- O reagente de lise misturado com as beads de lise (reagentes A + F) tem uma vida útil de 6 meses,

quando armazenado a 4°C.

Protocolo Standard I

1 - Colete 1 ml da amostra enriquecida decantada em um tubo.

2 - Centrifugue a 10,000-12,000 g por 5 minutos.

3 - Descarte todo o sobrenadante.

4 - Adicione 200 μl do reagente de lise (reagente A) à pellet.

5 - Suspenda o pellet pipetando o reagente para cima e para baixo no tubo.

6 - Agite no agitador de tubos vórtex em velocidade elevada.

7 - Coloque o tubo no termobloco a 95°C - 100°C por 10 a 15 minutos.

8 - Agite no agitador de tubos vórtex em velocidade elevada.

9 - Centrifugue a 10,000-12,000 g por 5 minutos.

Se decidir parar o procedimento temporariamente, este é o ponto de parada recomendado.

O sobrenadante pode ser armazenado por até 1 ano em -20°C. Antes de reutilizá-lo, sempre

descongele, homogenize, e então, centrifugue a 10,000-12,000 g por 5 minutos.

Protocolo Standard II (inclui uma etapa de trituração)

1 - Colete 1 ml da amostra enriquecida decantada em um tubo ou em um poço de uma placa de poço

profundo. Vede a placa de poço profundo com um filme plástico.

Nota: Agite a suspensão para homogeneizar a cultura, e então, permitir que qualquer resíduo decante antes

de coletar a amostra.

2 - Para os tubos, centrifugue a 10,000-12,000 g por 5 minutos, então, descarte o sobrenadante.

Para placas de poço profundo, centrifugue em 2,250 g por 20 minutos e descarte todo o sobrenadante

manualmente ou usando o DW40.

3 - Adicione 200 μL do reagente de lise homogeneizado (reagentes A + F) ao pellet e suspenda o pellet

pipetando o reagente para cima e para baixo. Feche os tubos ou vede a placa de poço profundo com o filme

de vedação pré-perfurado. Nota: Primeiro, agite levemente o reagente de lise com a mão para suspender as

microesferas (beads).

• Para amostras de produção primária, use o reagente A sem o reagente F.

4 - Coloque o tubo no Desruptor de Célula por 3 min ± 1min, ou a placa de poço profundo no agitador-incubador

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de placas a 1,300 rpm a 99°C.

5 - Incube no termobloco adequado a 95°C - 100°C por 10 a 15 minutos.

6 - Agite em vórtex os tubos em alta velocidade e centrifugue-os a 10,000-12,000 g por 5 minutos. Centrifugue

a placa de poço profundo em 2,250 g por 2 minutos.

Se decidir parar o procedimento temporariamente, este é o ponto de parada recomendado.

O sobrenadante pode ser armazenado por até 1 ano em -20°C. Antes de reutilizá-lo, sempre

descongele, homogenize, e então, centrifugue os tubos a 10,000-12,000 g por 5 minutos.

Protocolo Easy I

1- Coloque uma alíquota de 100 μl do reagente A de lise homogeneizado nos tubos ou poços de uma placa de

poço profundo.

2- Adicione 100 μl da amostra enriquecida, decantada.

Misture pipetando para cima e para baixo e feche o tubo com tampas ou vede a placa de poço profundo com

o filme de vedação pré-perfurado.

3- Incube em termobloco adequado a 95°C - 100°C por 10 a 15 minutos ou em um agitador-incubador de placa

por 15 a 20 minutos a 1,300 rpm.

4- Agite no agitador de tubos vórtex em velocidade elevada.

5- Se usar uma placa de poço profundo, deixe resfriar até a temperatura ambiente.

6- Centrifugue a 10,000-12,000 g por ao menos 2 minutos para os tubos.

Não é necessária a centrifugação para placa de poço profundo.

Se decidir parar o procedimento temporariamente, este é o ponto de parada recomendado.

O sobrenadante pode ser armazenado por até 1 ano em -20°C. Antes de reutilizá-lo, sempre

descongele, homogenize, e então, centrifugue os tubos a 10,000-12,000 g por 5 minutos.

Protocolo Easy II (inclui uma etapa de trituração)

1- Coloque uma alíquota de 100 μl do reagente de lise homogeneizado (reagentes A + F) nos poços de uma

placa de poço profundo.

Nota: Primeiro, agite levemente o reagente de lise com a mão para suspender as microesferas (beads).

2- Adicione 100 μl da amostra enriquecida, decantada.

Nota: agite a suspensão para homogeneizar a cultura, e então, permitir que qualquer resíduo decante antes

de coletar a amostra.

Misture a solução ao pipetar para cima e para baixo até homogeneizar.

Feche os tubos ou vede a placa de poço profundo com o filme de vedação pré-perfurado.

3- Coloque os tubos no Desruptor de Célula por 3 min ± 1min (tubos apenas).

4- Encube os tubos no termobloco a 95°C - 100°C por 10 a 15 minutos ou a placa de poço profundo no agitador-

incubador a 1,300 rpm, a 95°C - 100°C por 15 a 20 minutos.

5- Apenas para tubos, agite no agitador vórtex em velocidade alta, centrifugue a 10,000-12,000 g por 2 minutos

ao menos. Não é necessária a centrifugação para placa de poço profundo.

Se decidir parar o procedimento temporariamente, este é o ponto de parada recomendado.

O sobrenadante pode ser armazenado por até 1 ano em -20°C. Antes de reutilizá-lo, sempre

descongele, homogenize, e então, centrifugue os tubos a 10,000-12,000 g por 5 minutos.

C. PCR em tempo real

1. Configuração de instrumento e software

Para a configuração de instrumento e software, siga as instruções no guia de usuário do sistema de PCR em

tempo real para os kits iQ-Check.

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2. Preparação de mistura de PCR

2.1 Prepare uma mistura de PCR contendo a solução de amplificação (reagente C) e as sondas fluorescentes

(reagente B) dependendo do número de amostras e controles para analisar (ao menos um controle positivo

e um negativo devem ser incluídos em cada corrida de PCR). Use a tabela de pipetagem no Anexo para

encontrar os volumes corretos de uso para cada reagente.

2.2 Após a preparação, a mistura de PCR (reagente B + C) deve ser usada imediatamente ou ficar estável por 1

hora no máximo a 2°C - 8°C.

2.3 Pipete 45 μl desta mistura de PCR em cada poço de acordo com a configuração da sua placa.

2.4 Adicione 5 μl da amostra ou reagente D (controle negativo) ou reagente E (controle positivo). Não agite a

amostra no agitador de tubos antes de pipetar. Vede os poços da placa ou tiras (strips) de forma hermética

É importante evitar a formação de bolhas no fundo dos poços, pipete com cuidado. Como etapa opcional,

para eliminar as bolhas, centrifugue a placa de PCR vedada ou as tiras de PCR (giro rápido).

2.5 Coloque a placa ou tiras no termociclador. Certifique-se em colocar a placa corretamente: Poço A1 no canto

esquerdo superior. Feche o módulo de reação.

3. Início de PCR

Para iniciar a corrida de PCR, siga as instruções no guia de usuário do sistema de PCR em tempo real para os

kits iQ-Check.

D. Análise de Dados

Os dados podem ser analisados diretamente no final da corrida de PCR ou mais tarde ao abrir o arquivo de

dados armazenado. Siga as instruções no guia de usuário do sistema de PCR em tempo real correspondente

para os kits iQ-Check, para abrir os arquivos de dados e configurar os parâmetros de análise de dados.

1. Interpretação de Resultados

Uma vez que os parâmetros de análise de dados foram estabelecidos, os resultados são interpretados ao

analisar os valores Ct de cada amostra (o ciclo no qual a curva de amplificação cruza o limiar).

Também é possível usar o software I-Check Analysis (cat. # 359-3135) para uma interpretação automatizada e

geração de relatório de todos os dados (veja o guia de usuário do I-Check Analysis). Uma análise automatizada

completa está disponível com o Software Opticon Monitor™, para o sistema Chromo4 (veja o Guia de Usuário do

Chromo4 para os kits I-Check, #: 93269). O CFX Manager™ IDE possibilita uma análise automatizada completa

para o CFX96/CFX96 Deep Well e o Mini Optacon, #: 93893b.

1.1 Controles

Antes de interpretar os resultados da amostra, é necessário verificar os controles positivos e negativos.

Para que o experimento seja válido, os controles devem ter os seguintes resultados, conforme sumarizado na

tabela abaixo, caso contrário, a reação de PCR precisa ser repetida.

Detecção de Salmonella (FAM) Detecção de controle Interno

Controle Negativo Ct = N/A* 28 ≤ Ct ≤ 40

Controle Positivo 26 ≤ Ct ≤ 36 Não significativo

* O software indica um valor Ct de N/A (não aplicável) quando a fluorescência de uma amostra não se eleva, de

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forma significativa, acima do ruído de fundo, e portanto, não cruza o limiar.

Se os resultados dos controles negativo e positivo diferirem daqueles da tabela acima, é necessário repetir o

PCR.

1.2 Amostras

Uma amostra positiva para Salmonella deve ter um valor Ct ≥ 10 para o fluoróforo de FAM.

Se o valor Ct estiver abaixo de 10, verifique se como dados brutos, a curva é uma curva de amplificação regular

(com uma linha base reta, seguida de um rápido aumento da fluorescência, e então, uma diminuição). Se a curva

parece correta, pode ser considerada uma amostra positiva de Salmonella.

Se não houver nenhum valor Ct (Cq=N/A) para FAM, ou a curva não for uma curva típica de amplificação, o

controle interno para aquela amostra deve, então, ser analisado:

- Esta amostra é considerada como amostra negativa para Salmonella se não houver um valor Ct em FAM, e o

controle interno apresentar um Ct ≥ 28.

- Se o controle interno também não apresentar um valor Ct (Ct = N/A), provavelmente, isso indica uma inibição

da reação de PCR. A amostra precisa ser diluída (realize um diluição 1/10 na água estéril destilada, usando

10 μl de extrato de DNA, então, use 5 μl da diluição para amplificação), e a PCR repetida. Se a amostra ainda

apresentar inibição, então você pode realizar um novo enriquecimento (veja a seção a, informação adicional).

- Se o valor Ct para o controle interno for < 28, não é possível interpretar o resultado. Verifique se o limiar foi

colocado corretamente, ou se a curva como dados brutos é uma curva de amplificação regular. Se a curva

não apresentar uma forma característica, será necessário repetir o teste de PCR.

A interpretação dos resultados da amostra é sumarizada na tabela a seguir:

Detecção de Salmonella (FAM) Detecção de controle Interno Interpretação

Ct ≥ 10 Não significativo Positivo

Ct = N/A Ct ≥ 28 Negativo

Ct = N/A Ct = N/A Inibição**

** Quando ambos, detecção de controle interno e Salmonella, apresentarem um valor Ct = N/A, a amostra deve

ser testada novamente, porém diluída 1/10.

VIII. CONFIRMAÇÃO DE RESULTADOS POSITIVOS

No âmbito do método certificado por VALIDAÇÃO NF, todos os resultados positivos do iQ-Check precisam

ser confirmados em uma das duas formas:

A. Todas as amostras, porém amostras de produção primária

1. Usando testes padrão descritos nos métodos de padronização CEN ou ISO (incluindo a etapa de purificação)

Para o teste de confirmação, é necessário iniciar a partir do caldo de enriquecimento de água de peptona

tamponada após enriquecimento completo por 18 h ± 2 h a 37°C.

2. Usando qualquer outro método certificado por VALIDAÇÃO NF e baseado em um princípio diferente daquele usado no teste de PCR iQ-Check Salmonella II, por exemplo, o RAPID ‘Salmonella de meio cromogênico. O protocolo validado deste segundo método deve ser seguido por completo; a confirmação é realizada a partir do caldo de enriquecimento de água de peptona tamponada, se esta etapa for comum para ambos os

12 © Bio-Rad

métodos.

No caso de resultados que não estiverem de acordo, entre o iQ-Check Salmonella II e uma das opções de

confirmação listadas acima, o laboratório deve seguir as etapas necessárias para garantir a validade dos

resultados.

É possível armazenar a água peptonada tamponada enriquecida entre +2°C e +8°C por 72 horas, no

máximo, após a última incubação a 37°C.

B. Amostra de Produção Primária

Para amostras de ambiente de produção primária, a confirmação deve ser processada começando a partir do

Enriquecimento Primário com o seguimento do método MSRV indicado no anexo D da norma ISO 6579/A1, e

usando o meio de RAPID’ Salmonella para isolamento.

Resultados que não estiverem de acordo entre o iQ-Check Salmonella II e o método de confirmação descrito

acima são, possivelmente, devido à presença de Salmonella imóvel. Neste caso, recomendamos seguir o

protocolo de enriquecimento duplo do método de RAPID'Salmonella (consulte a ficha técnica do produto para

instruções de uso). Este protocolo inclui uma etapa de enriquecimento seletivo em meio RVS.

No escopo da certificação de VALIDAÇÃO NF, as bolsas de enriquecimento primário podem ser

armazenadas até 24 horas entre +2°C e +8°C antes de proceder para a confirmação.

No âmbito da validação de AOAC-RI, um resultado positivo de iQ-Check Salmonella II é considerado

positivo presuntivo e é recomendada sua confirmação de acordo com o método padrão USDA MLG

(disponível online em http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_03.pdf) ou método padrão FDA BAM (disponível

online em:

http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/

BacteriologicalAnalyticalManualBAM/UCM070149.HTM).

IX. CONFIRMAÇÃO DE COLÔNIAS ÚNICAS USANDO I-Check

O iQ-Check Salmonella II pode também ser usado para confirmar colônias isoladas únicas

de Salmonella em placas de ágar.

1. Pegue uma colônia isolada, de uma placa de ágar, seletiva ou não-seletiva, com um palito ou alça estéril, ou

outro consumível adaptado (por ex., ponteira de pipeta).

2. Suspenda a colônia em 100 μl de sal triptona ou água estéril destilada em um tubo da microcentrífuga.

Homogenize usando um agitador vórtex.

3. Use 5 μl da suspensão com 45 μl da mistura de PCR (veja a seção VII.C PCR em tempo real) se siga o resto do protocolo de iQ-Check Salmonella II para interpretação de dados e resultados.

X. REALIZAÇÕES E VALIDAÇÕES DO TESTE

iQ-Check Salmonella II é específico para o gênero Salmonella . Com este kit é possível detectar amostra de

1-10 UFC/25 g, de acordo com o enriquecimento recomendado.

VALIDAÇÃO NF IQ-Check Salmonella II é certificado por VALIDAÇÃO NF como método

© Bio-Rad 13

alternativo ao método de referência NF EN ISO 6579 (2002), para a detecção

de Salmonella spp. em todos os produtos para consumo humano e animal,

bem como amostras de ambiente. A validação seguiu o protocolo da norma NF

EN ISO 16140: 2003, e inclui o uso dos sistemas I Cycler I, Chromo4, iQ5,

MiniOpticon, CFX96 ou CFX96 Deep Well. Os softwares associados são

Optacon’s Monitor (V3.1 e subsequente), o software de sistema I Cycler I

Optical (V2.0 e subsequente), o software de sistema iQ5 Optical (V1.0 e

subsequente) e o CFX Manager IDE (V1.0 e subsequente). Número de

certificado: BRD 07/06 – 07/04. Válido até: consulte a certificação disponível no

website de Certificação AFNOR.

VALIDAÇÃO AOAC-RI

VALIDAÇÃO NORDVAL

IQ-Check Salmonella II (protocolo Easy I) é validado pelo Instituto de Pesquisa

AOAC sob o Programa do Método Testado por Desempenho para detecção de

Salmonella spp. em ovos (25g), frango cru moído (25g e 375g), bife cru (25g),

carne de porco crua (25g), espinafre fresco (25g), melão (25g), manteiga de

amendoim (25g), presunto cozido pronto para consumo (375g), superfície

ambientais selecionadas, ração animal úmida (25g) e ração animal seca (25g e

375g). Protocolo Standard II também é validado por AOAC-RI para detecção

simultânea de Salmonella spp. E E.coli O157:H7 em carne moída crua. Um

resultado positivo com o iQ-Check deve ser considerado presuntivo e é

recomendada sua confirmação pelos métodos padrão de referência. (Veja 3 e

4, seção XI).

Número de certificado: 010803.

IQ-Check Salmonella II é validado por NordVal para os protocolos Standard I e

Easy I (em microplacas), em alimento, ração e ambiente, e para os protocolos

Standard II Easy II (em microplacas) em, respectivamente, carne crua e bife

cru. Além disso, foi demonstrado que a confirmação não é necessária.

Número de certificado: 038 Válido até: consulte o certificado disponível no

website de NordVal:

http://www.nmkl.org/NordVal/NordValMetoder.htm

XI. REFERÊNCIAS

1 - Mires, I., Herman, N., Arica, N., and Pop off, M.Y.1995. Nucleotide sequence of image and image genes

involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enteritis subsp. Enteritis ser. Tophi. Research in

Microbiology. 146. 17-20.

2 - Norma NF EN ISO 6579. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the

detection of Salmonella spp. December 2002.

3 - United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service. Microbiology Laboratory

Guidebook – Chapter 4.03. Isolation and Identification of Salmonella from Meat, Poultry and Egg Products. 1

de outubro de 2004 Online em http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_03.pdf

4 - United States Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition. Bacteriological

Analytical Manual - Chapter 5. Salmonella. Junho 2006. Online em:

http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/

BacteriologicalAnalyticalManualBAM/UCM070149).

Nota ao comprador: licença limitada

O uso deste produto é abrangido por uma ou mais das seguintes reivindicações de patentes dos Estados Unidos

14 © Bio-Rad

e patente correspondentes fora dos Estados Unidos: 5,079,352, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155, 5,677,152

(apenas reinvidicações1 a 23) e 5,773,258 (apenas reinvidicações1 e 6), e reivindicações fora dos Estados

Unidos correspondentes à patente dos Estados Unidos No. 4,889,818. A compra deste produto inclui uma

imunidade limitada, não-transferível contra ações judiciais sob as reivindicações de patente anteriores para uso

somente desta quantidade de produto apenas em teste de Alimento, teste de Ambiente, e microbiologia

industrial, incluindo o relatório de resultados das atividades do comprador por uma taxa ou outra contraprestação

comercial, e para a pesquisa do próprio comprador. Nenhum direito sob qualquer reivindicação de patente (tais

como as reivindicações do Processo de 5’ Nuclease na Patente dos Estados Unidos Nos. 5,210,015 e 5,487,972)

é expressamente veiculado, de forma implícita, ou por impedimento. Informação adicional sobre licenças de

compra pode ser obtida ao entrar em contato com o Diretor de Concessão de Licença, Applied Biosystems, 850

Lincoln Centre Drive, Foster City,

California 94404, EUA.

ANEXO - Guia de Cálculo de Mistura de PCR

Para encontrar os volumes corretos para uso ao preparar a mistura de PCR, adicione o número total de amostras

e controles a ser analisado, e encontre os volumes correspondentes de reagente B e reagente C na tabela.

´Número total de amostras

& controles

Reagente B (μL) Reagente C (μL) ´Número total de

amostras & controles

Reagente B (μL) Reagente C (μL)

1 5 40 49 265 2100

2 11 86 50 270 2200

3 16 130 51 275 2200

4 22 173 52 281 2200

5 27 216 53 286 2300

6 32 259 54 292 2300

7 38 302 55 297 2400

8 43 346 56 302 2400

9 49 389 57 308 2500

10 54 432 58 313 2500

11 59 475 59 319 2500

12 65 518 60 324 2600

13 70 562 61 329 2600

14 76 605 62 335 2700

15 81 648 63 340 2700

16 86 691 64 346 2800

17 92 734 65 351 2800

18 97 778 66 356 2900

19 103 821 67 362 2900

20 108 864 68 367 2900

21 113 907 69 373 3000

22 119 950 70 378 3000

23 124 994 71 383 3100

24 130 1000 72 389 3100

25 135 1100 73 394 3200

26 140 1100 74 400 3200

27 146 1200 75 405 3200

28 151 1200 76 410 3300

29 157 1300 77 416 3300

30 162 1300 78 421 3400

31 167 1300 79 427 3400

32 173 1400 80 432 3500

33 178 1400 81 437 3500

34 184 1500 82 443 3500

35 189 1500 83 448 3600

36 194 1600 84 454 3600

37 200 1600 85 459 3700

38 205 1600 86 464 3700

© Bio-Rad 15

39 211 1700 87 470 3800

40 216 1700 88 475 3800

41 221 1800 89 481 3800

42 227 1800 90 486 3900

43 232 1900 91 491 3900

44 238 1900 92 497 4000

45 243 1900 93 502 4000

46 248 2000 94 508 4100

47 254 2000 95 513 4100

48 259 2100 96 518 4100

Estados Unidos, para assistência técnica, ligue para (800) 4BIORAD. Selecione a opção 2 para suporte técnico e

opção 2 novamente para Food Science Division. Para fazer um pedido, ligue para (800) 4BIORAD e aperte a

opção 1 para atendimento ao cliente. Pedidos também podem ser enviados por fax para o número (800) 879-

2289.

¶Bio-Rad Laboratories, Inc.

2000 Alfred Nobel Drive

Hercules, California 94547 - EUA

Ligação Gratuita: 1-(800) 424-6723

Fax(510) 741-5800

Rev. G - 02/2015

Código: 808463-BR