salmonella pasantia modulo i 2

8/2/2019 Salmonella Pasantia Modulo I 2

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Cronograma de actividades - Modulo I

Lunes 8/8: presentacin de patgenos

siembra en medios de enriquecimiento

Martes 9/8: E. coliO157:H7 IMS y siembra en medios

Salmonellarepique en caldos selectivos

Mircoles 10/8: E. coliO157:H7 lectura de placas

y aislamiento en TSA

Extraccin para PCR real time

Salmonellarepique en medios slidos


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Cronograma de actividades - Modulo I -

Jueves 11/8: Bioqumicas /ltex /aglutinacin

Curso de calidad : 5 S

Viernes 12/8: PCR: - preparacin de master mix

- carga de capilares

- corridalectura de las bioqumicas

Interpretacin

Informe de resultados

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INVESTIGACION DE SALMONELLA spp.

MODULO 1

Med. Vet. Mara Noel OliveraServicio de Microbiologa

INAL-ANMAT


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GENERALIDADES

Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos G-, no esporulados, oxidasa

muchos son mviles por flagelos pertricos Anaerobios facultativos

T crecimiento amplio 7-48 C y pH 4-8

Caractersticas

Son bacterias ubicuas

Principal reservorio intestino de animales

Alta capacidad de supervivencia en el ambiente

Viabilidad y capacidad infectiva en agua (sem) y suelos (aos)

Capacidad de infectar al hombre y los animales (portadores)


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Alimentos implicados

Alimentos de origen animal (huevos, carne, leche, pescado, marisco)

Subproductos de origen animal (ovo productos y lcteos no

pasteurizados) Alimentos sanos que se contaminan por otro alimento contaminado opor manipulador


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Cules son los sntomas de la salmonelosis?1. diarrea grave o leve,2. fiebre3. vmitos.4. Sntomas adicionales pueden incluir escalofros, dolor de cabeza,

nausea.

Desaparecen a los 4 a 7 das

Periodo de incubacin: entre 8 a 72 horas

AutolimitanteRiesgosa para poblacin suceptible: nios, embarazadas, ancianos e

inmunocomprometidos


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Prevencin

Muere por calentamiento a 70C cocinar los alimentos

Contaminacin cruzada

higiene de losutensilios/manipuladores/orden

entre los alimentos crudos y cocidos


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EEUU brote en julio 2011------ por papayas de origenmexicano carne molida de pavo

MADRID brote en marzo 2011---- en formula en polvo paralactantes


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ISO 6579 : 2002

Mtodo horizontal para la deteccin deSalmonella spp.


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Salmonella: microorganismos con colonias tpicas en medios decultivos selectivos que poseen caractersticas bioqumicas yserolgicas especificas.

OBJETIVO: determinar presencia o ausencia de Salmonellaen unvolumen de alimento utilizando las pruebas en concordancia con elStandard Internacional.

ISO 6579:2002


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1- Enriquecimiento no selectivo:

X g de la muestra + 9 X ml de BPW (diluc. 1/10) Incubar a 37C +/- 1C,18 hs. +/- 2 hs.

Chocolates y productos con chocolates: agregar al BPW 50 g/l de casena o 100 g/l

de leche en polvo descremada estril. Alimentos cidos: BPW doble concentracin

Procedimiento

ISO 6579:2002


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2. Enriquecimiento selectivo:

- transferir 0.1 ml de BPW en 10 ml de caldo RVS.Incubar a 41,5C+/- 1C, 24 +/- 3 hs.

- transferir 1 ml de BPW en 10 ml de caldo MKTTn.Incubar a 37C+/- 1C, 24 +/- 3 hs.

ISO 6579:2002


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3. Estriado y aislamiento en placa:

A partir de RSV y MKTTn sembrar un ansada por agotamiento en superficieen agar XLD y en el segundo agar elegido . Incubar a 37C +/- 1C, 24 +/- 3 hs.

ISO 6579:2002


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4. Aislamiento en agar nutritivo:

Seleccionar colonias tpicas y estriar en agar nutritivo.Incubar a 37C+/- 1C, 24 +/- 3 hs. de cada medio selectivo al menos unacolonia tpica o sospechosa de Salmonella y 4 colonias ms si laprimera es negativa

ISO 6579:2002


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5. Confirmacin:

Pruebas bioqumicas en tubos o kits comerciales- TSI- LDC- Urea--Galactosidasa- VP

- Indol

Serologa:- Antigenos O, Vi y H

ISO 6579:2002


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ISO 6579:2002


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6. Confirmacin definitiva:Una vez identificada la cepa como Salmonella spp. enviar al centro de referenciapara su tipificacin.

7. Informe de resultados:Indicar presencia o ausencia de Salmonella spp. en la cantidad de muestra analizada(por gramos o mililitros para muestras lquidas)

ISO 6579:2002


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Bacteriological Analytical Manual (BAM)

Captulo 5

Versin: Diciembre 2007

Investigacin de Salmonella


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Preparacin de la suspensin inicial:

BAM-FDA

Alimento Medio de enriquecimiento

Yema de huevo en polvo, lechefluda , preparados a base depolvos ( tortas , galletitas, ej)

Caldo lactosado estril

Huevo con cscara Caldo TSB + sulfato ferroso

Leche en polvoAgua destilada estril+ verde

brillante

Especias Caldo TSB


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1. Enriquecimiento:

25 g de muestra + 225 ml de diluyente (dilucin 1/10)

Ajustar el pH 6.8 / 0.2

Homogeneizar: 2 minutos

2. Incubacin

Incubar a 35C+/- 1C durante 24h +/- 2 h

BAM-FDA


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1ml en 10ml de Caldo Selenito (CS) y1ml en 10ml de Caldo Tetrationato (TTB)

Otros Alimentos

0.1ml en 10ml de caldo Rappaport-Vassilliadis (RV) y

1ml en TTB

3.Enriquecimiento selectivo

Alimentos sospechosos de contener S. Typhi

BAM-FDA


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Caldo selenito y caldo TT ---------24 -/+2 hs a 35C

Alimentos con baja carga microbiana

Caldo RV --------24-/+ 2hs a 42 -/+ 0.2C Caldo TT ---------24-/+2hs a 35 -/+ 2.0C

Alimentos con alta carga microbiana

Caldo RV --------24-/+ 2hs a 42 -/+ 0.2C Caldo TT ---------24-/+2hs a 43 -/+0.2C

Incubacin del enriquecimiento selectivo

Alimentos sospechosos de contener S. Typhi

BAM-FDA


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4.Aislamiento en medios slidos

Pasar un ansada de TT / RV / SC

agar Sulfito Bismuto (BS)

agar Xilosa Lisina Desoxycolato (XLD)

agar Hektoen (HE)

Incubacin de los medios slidos

24 hs-/+ 2hs a 35C

BAM-FDA


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5. a) Identificacin de colonias tpicas

Medio HE: colonias azul-verdosas con o sin centro negro , algunas cepas puedenoriginar colonias completamente negras

Medio XLD: colonias rosas con o sin centro negro.

Medio BS: colonias marrones o grises con o sin centro negro ( puede requerir

incubacin de 48 -/+ 2hs)

BAM-FDA


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5.b) Identificacin de colonias atpicas

Medio HE y XLD: colonias atpicas amarillas con o sin centro negro.

Medio BS: colonias atpicas verdes con poco o nada de ennegrecimiento del medio asu alrededor . No olvidar la incubacin adicional de 24 hs

En cualquiera de los casos elegir 2 colonias atpicas

BAM-FDA


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6.Pruebas presuntivas

Tomar colonias caractersticas y sembrar en:

TSI

LIA (anaerobiosis-4 cm fondo de tubo)

35C 24 -/+2hs

BAM-FDA


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7.Lectura de Pruebas presuntivas

Se consideran colonias sospechosas aquellas que:

TSI: reaccin cida abajo (amarillo)/alcalina arriba (rojo)

con o sin produccin de H2S

LIA: reaccin alcalina abajo (prpura)la mayora con H2S

BAM-FDA


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8.Confirmacin de colonias sospechosas:

ureasa (convencional/ test rpido)

Serologa flagelar (H) polivalente

Si urea es (-): -caldo lisina decarboxilasa

-caldo base prpura con 0.5% dulcitol

-caldo triptona ( triptofano)

Serologa somtica (O) polivalente

Pruebas bioqumicas adicionales

BAM-FDA


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9.Pruebas adicionales:

BAM-FDA

Pruebas Reaccin + Reaccin - SalmonellaGlucosa (TSI) amarillo rojo +

Lisina descarboxilasa (LIA) prpura amarillo +H2S (TSI y LIA) ennegrecimiento No ennegrecimiento +

Ureasa de color rojo-prpura ningn cambio de color -Caldo Lisina Descarboxilasa color prpura color amarillo +Caldo Dulcitol rojo de fenol color amarillo y / o gas no gas, sin cambiar de color +Prueba Voges-Proskauer color rosa a rojo ningn cambio de color -

Prueba citrato de Simmons azul verde variablePrueba del Indol color rojo en la superficie sin cambio de color en la

superficie-

Prueba polivalente flagelar aglutinacin sin aglutinacin +Prueba Polivalente somticas aglutinacin sin aglutinacin +Caldo Lactosa rojo de fenol color amarillo y / o gas sin gas, sin cambiar de color -


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10.Identificacin presuntiva:

Utilizar kits comerciales (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II, MICRO-ID)

Interpretacin de los resultados para su correcto informe:

kit comercial + serologa H y O positivas: presuntivo Salmonella descartar aquellos cepas que no corresponden segn criterio AOAC

En caso de no poder llegar a la confirmacin, enviar la cepa a un centro dereferencia

BAM-FDA


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ICMSF

International Commission on Microbiological Specifications for Foods

Deteccin de Salmonella spp. en alimentos
http://images.google.com.ar/imgres?imgurl=http://www.icmsf.iit.edu/graphics/design/logo_94.gif&imgrefurl=http://www.icmsf.iit.edu/main/articles_papers.html&usg=__cJ6MvnyxsoML0sVdgbDsR4rsI1A=&h=83&w=94&sz=3&hl=es&start=2&tbnid=1YVzGH7ELM71lM:&tbnh=71&tbnw=80&prev=/images?q=ICMSF&gbv=2&hl=es&sa=G


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Los mtodos para el aislamiento e identificacin pueden dividirse en 6 etapas:

1. Enriquecimiento no selectivo

2. Enriquecimiento selectivo

3. Siembra en medios selectivos y diferenciales

4. Caractersticas bioqumicas

5. Anlisis antignico en 2 fases: sueros polivalentes y monovalentes

6. Tipificacin por medio de bacterifagos

ICMSF


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1. Enriquecimiento no selectivo:

Objetivo recuperacin de aquellas Salmonellasquepudieron sufrir dao

Eleccin del medio adecuado: -Caldo Lactosado,

-Agua Peptonada tamponada,

-Agua destilada + verde brillante,

-AD con leche descremada + VB

-adicin de Tergitol 7

ICMSF


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X g de la muestra en 9 volmenes del medio de enriquecimiento (dil. 1/10)

Homogeneizar e incubar a 35-37 C por 18-24 hs

1. Enriquecimiento no selectivo:

ICMSF


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1. 1ml del pre-enriquecimiento en 10ml de Caldo Selenito Cistena (SC)Incubar en Bao Mara 43 C -/+ 0.05C 24 hs

2. 1ml del pre-enriquecimiento en 10ml de Caldo Tetrationato Verde Brillante(TVB)

Incubar 43C -/+ 0.05

C 24 hs

2.Enriquecimiento selectivo:

ICMSF


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3.Siembra en medios selectivos y diferenciales:

ICMSF

Sembrar cada uno de los tubos de SC y TVB en:

Agar Verde Brillante e incubar 24 hs a 35-37C

Agar Sulfito de Bismuto e incubar 48 hs a 35-37C

Queda a eleccin del laboratorio y se respetan las indicacionesdel fabricante


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Agar Verde Brillante: incoloras, rosa o fucsia o traslcidas a opacas, con el

medio que las rodea de color rosa a rojo.

Agar Sulfito de Bismuto: marrones o grises a negro, a veces con brillo metlico . Elmedio que las rodea puede ir cambiando desde marrn hasta negro con el tiempo .Pueden aparecer colonias atpicas de color verde con halo poco o nada oscurecido.

Caractersticas de las colonias

ICMSF


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4. Identificacin de Salmonella:

Se puede llegar a la identificacin mediante pruebas bioqumicas y

serolgicas con los sueros comerciales.

Se enva la muestra a un centro de referencia para su confirmacindefinitiva

bioqumica

Sembrar en TSI y Agar Lisina Hierro 2 ms colonias sospechosas decada uno de los 3 los medios selectivos.

Incubar 24 hs a 35-37C

ICMSF


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TSI tpico: c / alc con o sin H2STSI atpico : c / c porque fermentan la sacarosa y lactosa tambin.

Agar lisina hierro tpico: alcalino en todo el medio con o sin H2S

ICMSF


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Pruebas serolgicas:

Reaccin con el antisuero polivalente O ( somtico ):Diluir y ensayar los antisueros con cultivos testigos.

1. Depositar una pequea cantidad del cultivo sospechoso sobre el extremo de unportaobjetos.

2. Depositar una gota de Sn fisiolgica y emulsionar con el cultivo mediante unaaguja limpia.

3. Aadir una gota del antisuero polivalente O y mezclar.

4. Repetir la operacin sin el agregado del antisuero.

5. Balancear durante 1 min y observar sobre fondo oscuro si hubo o noaglutinacin.

(+) aquel cultivo que aglutina en la mezcla cultivo - sn. fisiolgica - antisuero(-) aquel cultivo que NO aglutina ensayar antisuero polivalente H.

ICMSF


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Reaccin con el antisuero polivalente H (flagelar )

1.Diluir y ensayar los antisueros con cultivos testigos

2.Aadir 5ml de Sn. Salina formolada al 0.6% a 5ml de un cultivo en caldo Hde 24hs.

3.Depositar 0.02ml del antisuero diluido en un tubo de ensayo adecuado y

aadir 1ml del caldo formolado.

4.Preparar un control negativo sustituyendo el antisuero por Sn salinaformolada.5.Incubar ambos tubos a 50C 1h en un bao de agua.

6.Balancear durante 1 min y observar sobre fondo oscuro si hubo o noaglutinacin.

(+) aquel cultivo que aglutina en la mezcla cultivo - sn. salina formolizada -antisuero y no hay aglutinacin en el control negativo.

(-) aquel cultivo que NO aglutina.

ICMSF


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Conclusiones:

la norma ISO permite adaptar la tcnica a los diferentes alimentos.Utiliza un medio como enriquecimiento ( BPW ), RV y MKTTn comocaldos selectivos y 2 medios slidos para el aislamiento.

El BAM separa a los alimentos, en cuanto a su paso deenriquecimiento, utilizando varios caldos y suplementos . Sugiere 3caldos selectivos que luego se pasan a 3 medios slidos.

La ICMSF divide en 6 etapas la identificacin sin exigencia en el

pre-enriquecimiento . Utiliza 2 caldos y 3 medios slidos selectivos.De los resultados del TSI y agar Lisina Hierro se puede realizar laserologa.


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MUCHAS GRACIAS!

Med. Vet. Mara Noel Olivera

[email protected]

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