TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Profa. Dra. Ruscaia Dias Teixeira Prof. Dr. Paulo Queiroz

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Avaliação da estrutura dos componentes do DNA

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

É um campo emergente na área de análises clínicas laboratoriais.

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Detecta Agentes infecciosos (Ex: HPV)

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Detecta alterações genéticas do próprio organismo

Auxilia no diagnóstico e prognóstico dessas doenças

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Identifica pessoas (criminosos ou cadáveres)

• Existem sequências que se repetem no nosso genoma.

• O número de repetições pode variar de pessoa para pessoa

• Ao reconhecer sítios com pedaços de DNA com variados números de

cópias em série, podemos distinguir duas pessoas .

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Determina paternidade ou graus de parentesco.

(filhos possuem metade dos alelos maternos e metade dos alelos do pai)

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Auxilia na determinação da terapia a ser utilizada

Tratamento com GH

Mutação no gene SHOX Mutação no gene GHR

Insensibilidade ao GH

TRATAMENTO DE BAIXA ESTATURA

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Avalia a suscetibilidade a doença

Gene APP

Síntese de PPA em cérebros normais

Beta – amilóide – clivagens anormais da PPA

Placas amielóides

Associado ao maior risco de desenvolvimento de

Alzheimer

Alzheimer

CONCEITOS IMPORTANTES

GENE

Splicing

MUTAÇÃO GÊNICA

Gene com sua função alterada, levando ao aparecimento de doenças.

Adição ou subtração de bases

Substituição de bases

ANEMIA FALCIFORME

ALELOS

Forma alternativa do mesmo gene

Ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos

cDNA

DNA sintetizado a partir de uma molécula de

mRNA, cujos íntrons já foram removidos,

numa reação catalisada pela enzima

transcriptase reversa.

PRIMERS

SÍTIOS DE RESTRIÇÃO

REPETIÇÕES EM TANDEM • Sequências curtas

• Idênticas ou similares

• em tandem (agrupadas) ou dispersas pelo genoma.

• em tandem: DNAs satélite

• No repetições: variam em cada indivíduo, tornando-os únicos.

• Formam uma espécie de “impressão digital” do DNA.

INDICAÇÃO DOS TESTES MOLECULARES

DIAGNÓSTICO

1. Doenças infecciosas

2. Doenças genéticas

3. Câncer

1. DOENÇAS INFECCIOSAS

• Detecção rápida de microrganismos de:

– Crescimento lento

• Mycobacterium kansaii – lesões pulmonares

– Não cultiváveis

• Treponema pallidum (bactéria agente da Sífilis)

• bacilo Mycobacterium leprae (micobactéria agente da lepra)

1. DOENÇAS INFECCIOSAS

Determinação de resistência antimicrobiana

Streptococcus pneumoniae X penicilina

1. DOENÇAS INFECCIOSAS

Monitoramento de doenças através da quantificação da

infecção.

2. DOENÇAS INFECCIOSAS

TESTES MOLECULARES MAIS COMUNS:

• Avaliação de carga viral para:

– HIV

– Hepatite C

2. GENÉTICA HUMANA

• Diagnóstico das doenças monogênicas:

– identificação do gene afetado

– mutação responsável pela doença

• Fibrose cística (gene CFTR – produção de muco e sucos gástricos)

• Síndrome de Marfan (gene Fibrilina – formação das fibras elásticas)

• Distrofia muscular de Duchene (gene distrofina – permeabilidade celular das

fibras musculares)

2. GENÉTICA HUMANA

Identificação de portadores heterozigotos

Genótipos :

Hb AS (heterozigoto de Hb S) - traço falciforme

Hb AA (padrão normal)

Hb SS (homozigose de Hb S) – anemia falciforme

Hb SC (dupla heterozigose de Hb S e Hb C) – doença

falciforme

Doenças falciforme

2. GENÉTICA HUMANA

Diagnóstico pré-natal

• líquido amniótico – descamações fetais

2. GENÉTICA HUMANA

Predisposição a doenças genéticas

Três alelos do gene APOE: ε2, ε3 e ε4.

Indivíduos com uma cópia do alelo ε4: risco 2X a 3X de desenvolver Alzheimer tardia.

Homozigotos ε4ε4: risco 6X

Apolipoproteina E

VLDL

2. GENÉTICA HUMANA

• TESTES MAIS COMUNS:

– Trombofilia hereditária (trombose)

– X Frágil (retardo mental)

– Microdeleção do Y (infertilidade masculina)

3. CÂNCER

CARCINOMA MEDULAR DA TIREÓIDE

– Detecção de mutações no proto-

oncogene RET (regulam o ciclo celular)

em uma criança com histórico familiar

– Permite a tireoidectomia profilática

– Elimina o risco de câncer tireoidiano

que pode ser fatal.

3. CÂNCER

POLIPOSE ADENOMATOSA FAMILIAR

– Mutações no gene APC determinam elevadíssimo risco de desenvolvimento de tumores colorretais malignos.

– Testes deste gene indicarão: • quais indivíduos da família necessitarão de monitoragem

• quais não terão de se preocupar

3. CÂNCER

Filha

Mãe Câncer de mama

BRCA1 mutante

50% Gene mutante 50% Gene normal

10% de risco 85% de risco

3. CÂNCER

LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA

Proteína quimérica ABL Atividade tirosina quinase

3. CÂNCER

LLC

• Identificação de pacientes com pior prognóstico.

– Portadores de translocação do braço longo do 13 - confere prognóstico

favorável e sobrevida de 11 anos

– Alterações envolvendo braço longo do 11 – confere sobrevida de 6,6

anos

– Portadores de deleção do braço curto do 17 - sobrevida de 2,5 anos

VANTAGENS E DESVANTAGENS DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR

VANTAGENS

1. BAIXA CONCENTRAÇÃO DO AGENTE

Identifica, caracteriza e quantifica

concentrações extremamente pequenas de

DNA/RNA de organismos patogênicos.

VANTAGENS

2. VERSATILIDADE DE AMOSTRAS:

• Sangue periférico

• Fluidos corporais (Líquor, derrame pleural, líquido pericárdico)

• Materiais obtidos através de punção (Medula óssea)

• Tecidos frescos

• Tecidos embebidos em parafina.

VANTAGENS

3. VIABILIDADE DO MICROORGANISMO

– MOMENTO DA COLETA

• INÍCIO DA INFECÇÃO

• FASE CRÔNICA

VANTAGENS

3. VIABILIDADE DO MICROORGANISMO

– CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE

• Material conservado - Temperatura ambiente

• Sob refrigeração (gelo seco ou reciclável)

VANTAGENS

4. TEMPO CURTO DE CRESCIMENTO DE

MICROORGANISMOS

– GENOTIPAGEM

– DIAGNÓSTICO RÁPIDO

– VERIFICAÇÃO DE RESISTÊNCIA A DROGAS

VANTAGENS

5. Alta especificidade

6. Diagnóstico rápido, abreviando e otimizando o tratamento.

7. Diagnóstico qualificado com aprimoramento no manejo da

doença.

8. Diagnóstico confiável

9. Diagnóstico com melhor reproducibilidade de resultados.

DESVANTAGENS

– CONTAMINAÇÃO DA AMOSTRA

– PRESENÇA DE INIBIDORES

– VIABILIDADE DOS AGENTES RNA: RNAse

– CUSTO

– PADRONIZAÇÃO

TÉCNICAS MOLECULARES

TÉCNICAS MOLELCULARES

1. Southern blot

2. Hibridização in situ

3. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

4. PCR

5. Fingerprinting

6. Eletroforese em campo pulsado (PFGE)

7. Microarranjos

8. Sequenciamento

1. SOUTHERN BLOT

• Emprega sondas de DNA com homologia à sequência do DNA-alvo em estudo.

HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

• Baseia-se no emparelhamento de 2

sequencias de DNA e uma RNA marcada

com Digoxigenina.

• Permite a visualização de uma sequência

nucleotídica especifica em células e

tecidos.

2. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

Passos da Hibridação in situ

1. Coleta do material biológico

2. Fixação e desidratação

3. Hibridação

4. Detecção da sonda por imunohistoquímica

5. Revelação com um substrato de fosfatase alcalina

SONDA

3. RFLP

• RFLP - Polimorfismo de comprimento de

fragmentos de restrição.

• Mutações podem alterar o DNA entre um

sítio de clivagem e outro.

• Isto gera diferentes formas (polimorfismos)

do mesmo trecho de DNA.

3. RFLP

• Raia 1: pessoa normal - dois fragmentos (alelos) do mesmo tamanho.

• Raia 2: Portador - um alelo sadio e o outro com a mutação.

• Raia 3: possui os dois alelos mutados.

4. PCR

• PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

• É uma técnica que amplifica uma sequência

específica de DNA,

• Objetivo: tornar a sequencia de DNA

abundante e disponível para diversas

técnicas de biologia molecular.

PCR Ciclos

• Desnaturação: 94°- 95°C

• Anelamento: 55°- 65°C

• Extensão: 72°

• Número de ciclos: 25-40

PCR - Desnaturação

A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C.

PCR - Anelamento

O anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.

PCR Primers

Os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da sequência-alvo.

PCR Taq DNA Polimerase

Amplifica o DNA a partir do anelamento com os

primers, na presença de Mg, a altas

temperaturas.

PCR Ciclos

PCR Requerimentos

• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM

• Tampão: pH 8.3-8.8

• dNTPs: 20-200µM • Primers: 0.1-0.5µM

• DNA Polimerase: 1-2.5 units

• DNA Alvo: 1 µg

Variações da PCR

a. RT-PCR,

b. nested PCR,

c. multiplex PCR,

d. RAPD-PCR

e. PCR real time.

µmicra

RT-PCR

• Utiliza uma enzima chamada transcriptase

reversa para converter uma amostra de

RNA em cDNA .

• Antes da etapa de amplificação por PCR,

• Permitindo estudo de vírus de RNA e

análises de expressão gênica.

Nested-PCR

É uma técnica na qual são realizados diversos ciclos de

amplificação com um grupo de primers

O produto dessa amplificação é re-amplificado, utilizando-se

outro grupo de primers dirigidos para uma seqüência que se

encontra dentro da seqüência amplificada pelo primeiro grupo

de primers.

Atualmente, raros são os estudos realizados utilizando esta

técnica.

MULTIPLEX PCR

• É uma reação de amplificação

• Detecta múltiplas sequências-alvo numa

mesma amostra.

• Vários pares de primers

• Desenvolvida para detecção simultânea de

vários patógenos.

Multiplex-PCR

• Vantagens :

– Diminuição da intensidade e do período de

trabalho laboratorial

– Redução do número de reagentes

– Redução dos custos

Multiplex-PCR

• Desvantagens desta técnica em relação ao PCR:

– Redução da sensibilidade de detecção

RAPD-PCR

“Random Amplified Polymorphic DNA”

Primer único e pequeno (usualmente de 10 a

15 bases), aleatório

Amplificação do DNA genômico em condições

de baixa estringência

Não sendo necessário o conhecimento prévio

da região de ligação do primer.

RAPD-PCR

• Quando submetidos à PCR, estes iniciadores arbitrários resultarão na amplificação de uma ou mais seqüências de DNA

• Gerando conjuntos de fragmentos que funcionam como marcadores genéticos

• O número e o tamanho destes fragmentos são à base de tipagem de um isolado bacteriano (DESTRO, 1995).

RAPD-PCR

• A principal vantagem do RAPD sobre o PCR tradicional é a possibilidade de detectar polimorfismos do DNA sem a necessidade de conhecimento prévio da seqüência de nucleotídeos de um gene relevante ou do DNA alvo (MASLOW et al, 1993).

PCR EM TEMPO REAL

• Permite que a amplificação e a detecção ocorram simultaneamente, num sistema fechado,

• Termociclador que possua sistema de monitoramento de emissão de fluorescência.

• Esta técnica é empregada para quantificação de amostras, como para testes de carga viral e monitoramento de doença residual mínima.

PCR em Tempo Real

Possui sistema tubular para detectar o acúmulo de

produtos de PCR

Composto de um termociclador com câmeras detectoras

refrigeradas para detecção de luz fluorescente, em que a

ressonância emitida é diretamente proporcional à

intensidade de fluorescência e por sua vez ao número de

produtos amplificados.

TÉCNICAS PARA DIAGNÓSTICO DE MUTAÇÕES

• Existem várias técnicas que usam o PCR.

• Algumas destas técnicas baseiam-se nas diferenças de mobilidade eletroforética de fragmentos com sequências de DNA selvagens e mutantes.

TÉCNICAS PARA DIAGNÓSTICO DE MUTAÇÕES

• Existem ainda outras técnicas que se baseiam na

clivagem de bases não pareadas em

heteroduplexes.

• Técnicas que utilizam a detecção de alterações na

proteína transcrita por um determinado

fragmento de DNA.

APLICAÇÕES DO PCR

1. Rápida amplificação de um gene específico ou de um

exon de um determinado gene como a primeira etapa

para rastreamento de mutações não caracterizadas:

– PCR para amplificações de exons específicos do DNA genômico

– RT-PCR para análise de transcritos

APLICAÇÕES DO PCR

2. Rápida genotipagem de regiões dos genes

que são polimórficas:

I. Digestão da região polimórfica com enzimas de restrição sítio

específica.

II. Flanqueamento de primers ao sítio de restrição polimórfico,

III. Amplificação da região do polimorfismo

APLICAÇÕES DO PCR

3. Diagnóstico de mutações conhecidas através

da discriminação alélica pelo tamanho

• Pequenas deleções ou inserções em alelos podem ser

detectadas por PCR.

• Exemplo: deleções no alelo mais comum que causa a fibrose

cística (DF508)

APLICAÇÕES DO PCR

4. Diagnóstico de mutações conhecidas através

da susceptibilidade a enzima de restrição:

• Mutações que mudam um sítio de restrição podem ser

detectadas, pela digestão do produto de PCR com a enzima

de restrição específica

5. Fingerprinting

• O “fingerprinting” é um método para caracterização e discriminação de microrganismos de origem alimentar (JAY,

2005).

• Cada vez mais utilizado para fazer inferências sobre níveis de variação genética dentro e entre populações naturais (LYNCH, 1990);

6. PFGE

• Eletroforese em Gel de Campo Pulsado

• Uma das técnicas mais utilizadas para análise epidemiológica da maioria das bactérias patogênicas.

• É um método derivado da eletroforese convencional do DNA, em gel de agarose, sendo a principal diferença a mudança repetida da orientação do campo elétrico.

PFGE

Imagem: http://pcrfilme.vilabol.uol.com.br/

PFGE

• Esta mudança provoca o re-arranjo da estrutura conformacional da molécula, permitindo a sua migração no gel.

• A técnica de PFGE revelou-se capaz de diferenciar cepas da bactéria obtidas a partir de diferentes municípios.

7. MICROARRANJOS

• São lâminas com uma alta densidade de

seqüências de DNA

• Permitem estudos de expressão gênica,

• Analisa uma grande quantidade de genes

ao mesmo tempo, utilizando sondas de

cDNA.

8. SEQUENCIAMENTO

• Detecta mutações em genes conhecidos.

• Permite analisar cada uma das bases de determinada sequência de DNA.

8. SEQUENCIAMENTO

Uso de algumas técnicas que buscam alterações

Após a identificação da região gênica que apresenta alguma alteração

Tal região é submetida ao sequenciamento para confirmação e determinação da mutação.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

• Possibilitou uma grande evolução nas análises de rotina de laboratórios clínicos e industriais.

• Organismos de cultivo difícil ou impossível tornaram-se passíveis de serem analisados.

• Exames citogenéticos convencionais estão sendo substituídos pela ferramenta molecular.

• Determinação de predisposição para certos tipos de câncer e doenças cardiovasculares têm se tornado realidade.

• Revolucionou a ciência e a prática da medicina e áreas correlatas

DESAFIOS

• Tornar as variadas técnicas de biologia

molecular, uma alternativa viável à rotina

laboratorial, principalmente em relação ao

custo e recursos humanos.

HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR

1953 Watson e Crick propuseram a

estrutura de dupla-hélice do DNA

1957 Arthur Kornberg isolou a

DNA polimerase 1958 Matthew Meselson &

Franklin Stahl: Replicação semi-conservativa do DNA

1971 David Baltimore & Howard

Temin demonstram a presença da RT em vírus

capaz de sintetizar DNAfd a partir de RNAfs

1975 Fred Sanger: Seqüenciamento de DNA baseado em terminação de cadeia por

incorporação de ddNTPs

1985 Kary Mullis: Permite obter (in vitro)

grandes quantidades de uma sequência

específica de DNA

1989 Descoberta da Taq

polimerase termoestável no

lago do “Yellowstone National Park”

1995 Haemophilus influenzae:

primeiro genoma seqüenciado 1998

C. elegans: Primeiro genoma completo

de um animal

2000 Rascunho do Genoma Humano

Imagens: Paola Cardarelli - XVI ENAAL

OBRIGADO!