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Candidatus Liberibacter asiaticus:
ONCE AÑOS DE DIAGNOSTICO
MOLECULAR EN CUBA.
Maritza Luis Pantoja1, Camilo Paredes1, Inés Peña1, Lochy Batista1, Lester Hernández-
Rodríguez1, Daylé López2, Victoria Zamora1 y Cyrelys Collazo Cordero1.
1-Departamento de fitopatología, Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Email:
2-Empresa Agroindustrial Ceballos. Ciego de Ávila. Cuba.
IINSTITUTO DE INVESTIGACIONES
EN FRUTICULTURA TROPICAL
2006 áreas urbanas de La Habana
Vector HLB D. Citri: presente en Cuba 1999
Candidatus Liberibacter asiaticus: ONCE AÑOS DE DIAGNOSTICO
MOLECULAR EN CUBA.
Huanglongbing: bacterias fastidiosas del Floema
Candidatus Liberibacter asiaticus, africanus y americanus y Candidatus Phytoplasma
grupo 16Sr I, 16SrII-A y 16SrIX
Diagnóstico molecular (diferentes variantes de PCR y secuenciación)
Cuba
Extracción de ADN
Colecta de hojas sintomáticas de todo el
país y de todas las sp cítricas cultivadas.
Colecta de D. citri (ninfas
y adultos)
PCR convencional y digestión
PCR dúplex
PCR anidada
Clonaje y secuenciación
Diagnostico e identificación
1160 pb
M 1 2 3 4 5 6 7
PCR convencional con los cebadores OI1/OA1/OI2c
(Jagoueix, et al., 1996).
Candidatus Liberibacter asiaticus y africanus
(Jagoueix, et al., 1996).
Enzima Xba I a
partir del producto
de 1160pb
Ca. L. af Ca. L. as
640pb y 520 pb520 pb, 506 pb y 130 pb
M C+ C+ 1 2 3 4
520 pb
640 pb
130 pb
506 pb
520 pb
Digestión enzimática Xba I
2006-2007: 293 muestras 166+ Ca. L. as
Prospección por todo el país menos incidencia en región oriental
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1027pb
703pb
PCR convencional con los cebadores rplA2/rplJ5 (Hocquellet
et al., 1999)
Candidatus Liberibacter asiaticus y africanus
2007-2013: 931 muestras 580 + Ca. L. as
PCR convencional dúplex con los cebadores rplA2/rplJ5
(Hocquellet et al., 1999) y GB1/GB3 (Teixeira et al.,2005).
Candidatus Liberibacter asiaticus, africanus y americanus
M H2O C- C+ am C+ af C+as 1 2 3 4 5 6 M
703pb669pb
1127pb
2009-2015: (pesquisa por todo el país buscando las tres sp de Ca L.
631 muestras 528 + Ca. L. asValidación: eficiencia, sensibilidad y especificidad diag. 98%
PCR Anidada para
Candidatus
Phytoplasmas con
los cebadores
(P1/P7 (Smart et
al., 1996) - fU5/rU3
(Lorenz et al., 1995) )
: 104 muestras
negativas
Ca.L.as/Guangdong/China/DQ432005
Ca.L.as/Cuba/CH1140/FJ544941
Ca.L.as/Belize/GU061003
Ca.L.as/USA/Florida/EU130554
Ca.L.as/Bahamas/Nassau/EU130553
Ca.L.as/USA/DQ471900
Ca.L.as/Brazil/DQ471901.1
Ca.L.as/Indonesia/West Timor/AB480091
Ca.L.am/Brazil/EU999028
19
9
18
0.005
• Porcentajes de identidad: 99 y 100% con aislados de Ca. L. asiaticus de Florida y Brasil
• Homogeneidad genética entre aislamientos de Ca. L. asiaticus de diferentes provincias
Caracterización molecular del agente causal del HLB
mediante clonaje y secuenciación
• Porcentajes de identidad: 99 y 100% con aislados de Ca. L. asiaticus de
Florida, Bahamas, Belize, Brasil, China e Indonesia.
• Homogeneidad genética entre aislamientos de Ca. L. asiaticus de las
tres regiones del país analizadas.
2008: 3 muestras de La Habana y
Artemisa.
2009: análisis de 8 muestras de La
región occidental central y oriental de
Cuba de 3 regiones del genoma:
ADNr 16S, región intergénica
16S/23S y operón rplKAJL
Primera reacción: Cebadores FD1/RP1 (Weisburg, et al.,1991)
PCR Anidada para Candidatus Liberibacter asiaticus
Segunda reacción: OI1/OI2C (Jagoueix, et al., 1996).
1160 pb
M H2O C- C+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2010-2017 ( 989 muestras 517+ Ca. L. as)Estandarizó: limite de detección 0,1ng/ul=110 bact/g de tejido.
Implementado para viveros, banco de germoplasma y lugares con baja
incidencia de la enfermedad , diagnostico en ninfas y adultos de D.Citri
PCR en tiempo real : utilizando un termociclador Rotor-Gene Q
de Quiagen
Cycle
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Flu
ore
scence
35
30
25
20
15
10
5
Sistema SYBR Green: Cebadores: Clas 16S F/Clas 16S R
2017: 14 muestras + Ca. L. as
Muestras analizadas de diferentes tipos de síntomas
utilizando las diferentes técnicas de PCR
2954 muestras
Porcentajes de coincidencia del MA/PCR+ con las diferentes
técnicas de PCR
Importancia del diagnostico y caracterización molecular de HLB en Cuba
Ca L asiaticus asociado a HLB. homogeneidad genética de aislados.
Ca L asiaticus en estadio ninfal 3 de D. citri .
Síntomas con valor diagnóstico.
Plantas saneadas por microinjerto de ápices caulinares.
Empresas cobren el seguro de sus plantaciones afectadas.
Certificar sistema nac. de produc. de material de propagación
Manejo de
Huanglongbing
1-Plantar material sano
Mantener el primer puntos del manejo de la enfermedad
Muchas Gracias
Equipo de trabajo y colaboradores